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CAHIER 2 - Inmunoanalyse
CAHIER 2 - Inmunoanalyse
BIOFORMA
230 bd raspail 75014 Paris
La nouvelle forme de publication des Annales du Contrle National de Qualit couples un cahier de
Formation met laccent sur laspect ducatif du contrle de qualit. Ce deuxime numro est consacr
limmunoanalyse apparue dans les laboratoires danalyses mdicales privs depuis une dizaine
dannes seulement et dont la place actuelle est de plus en plus importante.
Le prsent fascicule concerne la onzime opration de Contrle Nationale en immunoanalyse,
organise en juin 1994 sous lautorit de lAgence du Mdicament par convention avec Bioforma.
A lore dune priode au cours de laquelle des modifications dans lorganisation du Contrle
National vont intervenir, il nous a paru intressant, dans un premier chapitre, de faire le bilan et de
soumettre quelques rflexions sur plus dune dcennie de fonctionnement dans le domaine de
limmunoanalyse.
Lapparition dans les laboratoires de nouvelles techniques ncessite, de la part des biologistes, une
priode de familiarisation avec les difficults analytiques ou linterprtation. Cest pourquoi, on
trouvera ensuite un rappel sur les critres qui permettent dapprcier la qualit dun immunodosage et
une mise au point gnrale sur les piges et problmes rencontrs dans ce domaine de la biologie, de
ltape pranalytique au rendu du rsultat en passant par le marqueur et la mesure du signal en
immunoanalyse.
Le dernier chapitre comporte ltat de lart des pratiques biologiques en France et ltat des
connaissances sur certains analytes dont le dosage prsente des volutions techniques et/ou pose des
problmes de standardisation. Nous avons choisi dvoquer dans ce numro deux marqueurs tumoraux,
lantigne carbohydrate 19-9 (CA 19-9) et lantigne spcifique de la prostate (PSA), et deux hormones
glycoprotiques, lhormone chorionique gonadotrope (hCG) et lhormone thyrostimulante (TSH).
Agence du Mdicament
143-147, boulevard Anatole France
93285 Saint-Denis Cedex
Bioforma
Fonds dAssurance Formation
4, rue Pasquier 75008 Paris
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
L I S T E D E S A U T E U R S
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Lutilisation de limmunoanalyse en routine remonte au dbut des annes 1970. Il sagissait alors de dosages
utilisant des radioisotopes, pratiqus par un petit nombre de laboratoires spcialiss en raison de la lgislation
franaise relative la dtention et la manipulation des produits radioactifs. Actuellement les laboratoires
autoriss pratiquer ce type de dosages sont au nombre de cent vingt cent cinquante et se caractrisant encore
par des mthodes qui se prtent mal une automatisation complte. Trs rapidement, les biologistes concerns ont
ressenti le besoin dune valuation externe de la qualit. Cest pourquoi, ds 1977, un tel programme leur a t
propos dans le cadre dune association rgie par la loi de 1901 et gre par les biologistes bnvoles : le centre
lyonnais dtudes pour la PROmotion de la BIOlogie et du contrle de QUALit (PROBIOQUAL). Une grande
majorit (80 90%) dentre eux y adhre de manire volontaire depuis cette poque.
Les techniques dimmunoanalyse avec marqueur non radioactif sont apparues au dbut des annes 1980 sous
forme de trousses de ractifs prts lemploi, utilises dabord manuellement puis sur automates. La nomenclature
des actes de biologie mdicale a fait lobjet des modifications ncessaires an avril 1985 et une large diffusion de
limmunoanalyse tous les laboratoires publics ou privs franais en a rsult.
Le laboratoire National de la Sant, devenu depuis un service de lAgence du Mdicament, a alors dcid de
mettre en uvre, en "hormonologie" plasmatique , un contrle de qualit externe semblable celui qui
fonctionnait dj dans dautres secteurs de la biologie mdicale. Lexcution technique en a t confie, par arrt
ministriel du 1er fvrier 1983, renouvel le 23 novembre 1988, lassociation PROBIOQUAL en raison de
lexprience quelle avait acquise dans ce domaine depuis plusieurs annes. Les lignes qui suivent sont consacres
la description des caractristiques, aux problmes rencontrs et au bilan du contrle de qualit obligatoire en
"hormonologie plasmatique", instaur en 1984.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
TSH pour les hormones glycoprotiques, cortisol et estradiol pour les hormones strodiennes, T4 libre pour les
hormones thyrodiennes ainsi que ferritine et IgE totales. En raison du faible nombre de trousses disponibles
(tableau II des Annales du Contrle Nationale de Qualit, n 2, Avril 1995), les dosages de CA 15-3, CA19-9,
CA125, B2-microglobuline, progestrone et testostrone sont moins rpandus. Enfin dans lvaluation de la
fonction thyrodienne, la mesure de la forme libre, a en grande partie, remplac celle de lhormone totale pour T4.
Le dosage de T3 suit une tendance analogue avec un dcalage dans le temps.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
V. RENSEIGNEMENTS OBTENUS
Les objectifs du contrle de qualit externe sont doubles :
court terme, il consiste estimer les composants systmatique et alatoire de lerreur entre les
laboratoires et les mthodes et suivre leur volution au cours du temps,
plus long terme, il contribue lharmonisation des rsultats entre laboratoires par lamlioration des
mthodes cest--dire la standardisation des dosages. Il permet, alors, au biologiste de sassurer que les
rsultats quil rend sont conformes ceux des autres laboratoires utilisant ou non la mme mthode. En
outre, la consquence long terme du contrle est de faciliter linterprtation des rsultats par le
clinicien.
Les principaux enseignements tirs du contrle national en immunoanalyse remplissent les objectifs fixs plus
haut.
En premier lieu, lexploitation statistique toutes techniques confondues fournit une estimation de la variabilit
totale qui dpend du niveau de concentration. Celle-ci comporte deux composantes : lune, systmatique, qui
correspond aux carts entre les valeurs moyennes des diffrentes trousses et lautre, alatoire, qui dpend de la
dispersion des valeurs obtenues par les utilisateurs dune mme trousse. Lexploitation statistique par technique
permet de dterminer cette dernire. Le coefficient de variation (CV) obtenu est un indice de robustesse de la
trousse : un CV faible signifie que les valeurs obtenues restent trs proches malgr les diffrences dutilisation qui
existent dun laboratoire lautre. La srie des CV fournis par les principales trousses peut tre reprsente par la
valeur centrale ou CV mdian qui indique la reproductibilit atteinte par la moiti des trousses disponibles. Ainsi,
en comparant la valeur du CV refltant la variabilit totale avec celle du CV mdian, on dispose dun moyen
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
simple pour sparer la part de la dispersion globale des valeurs qui revient aux carts entre trousses de celle qui
doit tre attribue leur robustesse : une grande diffrence entre les deux CV signe la prsence de discordances
importantes entre trousses. Il existe une mthode statistique, lanalyse de variance avec dcomposition de la
variance totale, qui permet destimer rigoureusement les deux composantes prcdentes. Cependant, son
application ncessite des hypothses et un schma exprimental souvent peu compatibles avec lorganisation
pratique du contrle de qualit externe.
De cette manire, on apprcie ltat de lart des dosages et on met en vidence ceux dont la standardisation nest
pas satisfaisante comme cest le cas par exemple, actuellement, des dosages de TSH ou estradiol au niveau des
basses concentrations et des dosages de CA 19-9 OU PSA.
Lvolution, au cours du temps, de la qualit est galement intressante considrer. Une diminution notable de la
variabilit des immunodosages est intervenue au tout dbut des annes 1990. Celle-ci concide avec la
familiarisation des biologistes aux problmes poss par ce nouveau type de dosages (talonnage, piges
mthodologiques, interprtation).
Les autres informations utiles, tires des oprations de contrle national et difficiles obtenir par dautres moyens,
concernent la "popularit des trousses", cest--dire la connaissance des trousses effectivement utilises dans les
laboratoires des participants.
Pour terminer, insistons sur lun des points forts du contrle national franais qui est envi par les organisateurs du
contrle externe dautres pays : il sagit du nombre trs important de participants qui permet dobtenir de bonnes
estimations sur ltat de lart des immunodosages, sur la "popularit" et la qualit des trousses mme sil introduit
une lourdeur certaine au niveau de lorganisation.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
CRITERES DE QUALITE
EN IMMUNOANALYSE
R. COHEN, A.C. RENARD
Les critres de qualit des immunodosages ne sont pas a priori trs diffrents de ceux utiliss dans les autres
domaines de la biologie clinique (voir cahier de formation de biochimie). Pourtant la matrise de la raction Ag-Ac
et de la mesure du signal pose des problmes nouveaux : en particulier, les courbes de calibrage (signal en fonction
de la concentration) sont loin dtre toujours linaires. Nous passerons en revue les critres de qualit classiques
(prcision, limite de dtection, justesse, spcificit) en insistant sur leurs particularits lorsquils sont appliqus
limmunoanalyse. Ce chapitre a pour but de donner les lments permettant le choix du meilleur ractif.
Concrtement lheure actuelle, ce choix est li le plus souvent celui de lautomate en raison du grand nombre
de "systmes ferms". Toutefois, lutilisation des ractifs dans les meilleures conditions passe par la
comprhension du mcanisme et la connaissance des points critiques dun immunodosage.
I. ERREUR DE MESURE
Chaque rsultat de mesure est entach dune erreur qui sexprime par la diffrence entre la valeur trouve et la
valeur "vraie" que lon cherche estimer. Cette erreur dite totale peut tre dcompose en deux termes : lerreur
systmatique et lerreur alatoire (Figure 1).
Figure 1 : Densit de probabilit P(x) des valeurs x de concentration obtenues au cours dun dosage.
Composantes systmatique et alatoire de lerreur totale.
xV
xj
x
ej
ej - e
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
DANS UN LABORATOIRE
DANS UN GROUPE
DE LABORATOIRES
D'UNE SERIE
A LAUTRE
UTILISANT LA
MME METHODE
CONTROLE DE QUALITE
INTRALABORATOIRE
UTILISANT DES
METH. DIFFERENTES
CONTROLE DE QUALITE
INTERLABORATOIRE
La Figure 2 reprsente les diffrents niveaux derreur et le domaine dapplication du contrle de qualit intra- ou
inter-laboratoire. Les principales erreurs surviennent diffrents niveaux qui sont, par ordre croissant
dimportance : la srie de dosages, le laboratoire effectuant plusieurs sries dans le temps, le groupe de
laboratoires utilisant la mme technique et enfin le groupe de laboratoires utilisant des techniques diffrentes.
On comprend bien que les erreurs soient peu importantes au sein dune srie de dosages dans laquelle les
conditions sont strictement contrles (ractifs, oprateur, temps dincubation identiques). En revanche, au cours
du temps les ractifs voluent, le manipulateur peut changer ce qui augmente la dispersion des rsultats rendus par
un laboratoire. Lorsque le patient se dplace et que le clinicien se trouve face des rsultats provenant de
laboratoires diffrents mais utilisant la mme technique, ce sont alors lexprience et lquipement du laboratoire
qui interviennent. Enfin, lorsque les rsultats sont obtenus par des laboratoires qui ont adopt des techniques
diffrentes, la variabilit est, en grande partie, lie aux caractristiques des ractifs notamment de ltalon et des
anticorps.
En rsum, il existe une hirarchie des erreurs. A chaque niveau, se retrouvent la fois erreurs alatoires et
systmatiques qui en se combinant concourent, toute deux, la variabilit cest--dire lerreur alatoire du niveau
suprieur.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
spcimen. La prcision est dautant meilleure que lerreur alatoire est faible. Elle est fonction de deux
paramtres : lerreur (reprsente par lcart type) faite sur la mesure du signal et la pente de la courbe de
calibrage. De plus, sa dfinition sous-entend quelle dpend de la concentration mesurer, phnomne
particulirement vrai dans le domaine des immunodosages, et des conditions de rptition des mesures. Cest
pourquoi, on est amen affiner cette notion et proposer diffrentes expressions pour la prcision. On parle de
rptabilit, de reproductibilit intra- ou inter-laboratoire lorsque la rptition des mesures est effectue
respectivement dans la mme srie de dosage, dans le mme laboratoire ou entre laboratoires diffrents.
Pour apprcier la prcision, il suffit par consquent de rpter les mesures sur le mme spcimen et de calculer
lcart type ou le coefficient de variation de la distribution des valeurs exprimentales. Il est, cependant, ncessaire
deffectuer cette opration plusieurs niveaux de concentration. Un procd pour apprcier, trs commode et
rpandu en immunoanalyse, consiste tablir le profil de prcision cest--dire la courbe reprsentative de
lvolution de lcart type ou du coefficient de variation en fonction de la concentration. Celui-ci peut reprsenter
nimporte lequel des niveaux de prcision dfinis prcdemment. Nous dcrirons les tapes conduisant son
obtention ainsi que ses applications en prenant comme exemple la courbe montrant la variation de la rptabilit
selon le niveau de concentration. Pour lobtenir il faut passer par les tapes indiques sur la Figure 3 :
calcul par une simple rgression linaire, diffrents, niveaux de signal, de lcart type sR exprim en
valeur de signal,
calcul, diffrents niveaux de concentration, de lcart type exprim en concentration sc partir de sR et
de la pente dy/dC de la courbe de calibrage :
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Figure 3 : Etapes conduisant la confection dun profil de prcision pour un immunodosage par dfaut (partie gauche) ou par
excs (partie droite) danticorps.
Les valeurs couramment obtenues pour les diffrentes formes de prcision lorsquon les exprime en coefficient de
variation sont, dans le cas des immunodosages : infrieures 5% pour la rptabilit, comprises entre 5 et 10%
pour la reproductibilit intralaboratoire et suprieures 10% pour la reproductibilit interlaboratoire. Les valeurs
les plus leves sont observes transitoirement lorsquapparaissent des techniques prsentant des caractristiques
nouvelles
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
(meilleure spcificit par exemple des techniques immunomtriques par rapport aux techniques par comptition)
ou bien pour des dosages dont la standardisation est mauvaise comme cest le cas actuellement (1994) des dosages
destradiol, CA 19-9 et PSA. De plus, rappelons que les mthodes par excs danticorps fournissent le plus souvent
des coefficients de variation plus bas que les mthodes par dfaut danticorps.
III.2.Sensibilit, dtectabilit
Ces critres expriment, tous deux, laptitude dune mthode diffrencier les signaux fournis par deux spcimens
de concentrations voisines.
Il ne faut cependant pas les confondre : la sensibilit sadresse toutes les concentrations diffrentes de zro alors
que la dtectabilit intresse le domaine des concentrations faibles ou nulles. Dans ce dernier cas, ont dfini la
limite de dtection analytique comme la plus petite concentration fournissant un signal significativement
diffrent de celui dun blanc (chantillon identique en tous points au spcimen doser mais de concentration
nulle). La comparaison doit se faire en termes statistiques par un test appropri.
Modalits pratiques du calcul de la limite de dtection analytique :
La relation donnant la limite de dtection L peut scrire :
L = k.
dans laquelle k = t ( , v ) .
Sb
dy / dC
= k.sCO
C =0
1
1
+
nb ny
avec t(, v) : variable de Student pour un risque donn (ou risque de conclure tort la prsence de la
substance dans le liquide biologique) et v degrs de libert (correspondant lestimation de sCo).
nb,ny : nombre de rptitions du blanc et des spcimens respectivement, dans les conditions habituelles
dutilisation de la mthode
sb : cart type des signaux fournis par le blanc
et sCo : cart type, exprim en concentration, pour des mesures de concentration nulle.
Pour calculer la limite de dtection analytique, il faut par consquence
a) dterminer sCo : pour cela, deux conditions doivent tre respectes :
effectuer les rptitions sur un chantillon dpourvu de la substance doser mais le plus proche possible
dans sa nature et sa composition du liquide biologique utilis,
travailler, dans un premier temps, sur les valeurs de signal pour obtenir lcart type sb, puis dterminer
sCo en divisant par la pente lorigine de la courbe dtalonnage.
Pour les laboratoires qui effectuent les dosages en double, la meilleure mthode consiste dduire du profit de
prcision la valeur de sCo. Cette dernire est la limite de la fonction sC=f (C) lorsque la concentration tend vers
zro.
b) multiplier sCo par k ; le choix de la valeur de k doit se faire en fonction du protocole de dosage adopt en
routine (nb,ny) comme la relation exprimant k le montre. La valeur habituellement utilise comme limite de
dtection est de 3,0 sCo pour des dterminations en simple (nb=ny=1). Dans ce cas la variable de Student est gale
2,1 ce qui correspond un risque de conclure tort la prsence de la substance (risque ) de 1,7%. Pour une
valeur quivalente du risque , la limite de dtection est gale 2,1 sCo lorsque les dterminations sont effectues
en double (nb=ny=2).
Un autre moyen dvaluer la limite de dtection analytique, la mthode des dilutions limites , consiste diluer
progressivement un spcimen de faible concentration de manire dterminer partir de quel moment la rponse
devient incohrente. Lvaluation prcise est difficile et dpend, ici aussi, de la qualit du diluant.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
La spcificit dun dosage est son aptitude mesurer lanalyte dsir et seulement celui-ci, mme en prsence de
quantits importantes de substances dont la structure est proche.
Il est vident que cette qualit du dosage est directement lie la nature de limmunsrum ou des anticorps utiliss.
Les tests de spcificit sont lourds mettre en uvre et, pour cette raison, sont gnralement pratiqus par le
fabricant lors de la mise au point de la trousse. Il existe deux faons dvaluer la spcificit :
a) Dtermination des pourcentages de raction croise : cette mthode ne sapplique quaux dosages par
comptition car elle repose sur lvaluation de la concentration dplaant 50 % du traceur, difficile dfinir dans
le cas des dosages par excs danticorps. Elle consiste raliser des courbes de calibrage avec tous les
composs qui sont susceptibles dinterfrer dans le dosage (Figure 4). Linterprtation du pourcentage de
raction croise obtenu doit se faire en tenant compte des concentrations relatives de lanalyte et de la substance
interfrante.
Figure 4 : Dterminations des pourcentages de raction croise de la dsoxycorticostrone (DOC) et du cortisol dans
un immunodosage de progestrone
DOC (4,4 / 70) 100 = 6,3 %
Cortisol (4,4 / 2.104) 100 = 0,022 %
b) Dtermination de la plus petite concentration de substance interfrante fournissant un signal non nul : cest la
seule valuation possible pour une mthode "sandwich".
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
PIEGES ET PROBLEMES
EN IMMUNOANALYSE
A. BEAUDONNET-R. COHEN
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
PIEGES ET PROBLEMES
EN IMMUNOANALYSE
A. BEAUDONNET-R. COHEN
I. ANTICOAGULANTS
Certains anticoagulants peuvent tre dconseills par (suite dinterfrence avec lanalyte ou avec la mthodologie
utilise) :
- hparine qui perturbe la raction antigne-anticorps
- EDTA, fluorure de sodium et citrate lorsque la fluorescence en temps rsolu est utilise car ces
anticoagulants dissocient le chlate deuropium ; lEDTA peut aussi inhiber la raction enzymatique si le marqueur
utilis est la phosphatase alcaline.
Dune faon gnrale, il est prfrable dutiliser des tubes sans anticoagulant.
Lutilisation de gels sparateurs est viter, en particulier lors du dosage dhormones libres.
III. CONSERVATEURS
Lazide de sodium est un inhibiteur de la peroxydase et son utilisation est donc dconseille avec les dconseille
avec les techniques utilisant cette enzyme.
IV. CENTRIFUGATION
La centrifugation doit tre ralise le plus rapidement possible aprs le prlvement et doit tre suffisante pour
liminer tous les globules rouges et toutes les particules en suspension dont la prsence peut perturber les
diffrentes ractions (I).
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Lhyperlipidmie peut aussi tre nfaste en perturbant la raction antigne-anticorps et en modifiant les conditions
de pipetage par augmentation de la viscosit du milieu. Lhyperlipidmie modifie galement les coefficients
dextraction de certains strodes lorsquune extraction pralable est ncessaire. Les prlvements seront donc
raliss de prfrence sur un sujet jeun depuis au moins 8 heures.
V.3. Srum ictrique
Les fabricants indiquent en gnral la concentration de bilirubine en dessous de laquelle, aucune interfrence na
t note.
HEURES
DACROPHASES
AMPLITUDE DE VARIATION
leve (>50%)
modres (10-50%)
Cortisol
Prolactine
8 14 h
22 8 h
leve
leve
Testostrone
67h
leve
20 23 h
leve
variables
modres
12 h
modre
HORMONE
Hormone thyrostimulante
(TSH)
Hormone folliculostimulante
(FSH)
Hormone lutinisante (LH)
Estradiol
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
I. ETALON
La validit dun immunodosage repose sur labsolue identit de structure entre la molcule talon et la molcule
doser. Les problmes poss par la prparation des solutions talons sont diffrents selon la structure des analytes :
analytes de faible masse molaire et de structure chimique bien dfinie et analytes de masse molaire leve et de
structure complexe.
I.1. Analytes de faible masse molaire et de structure bien dfinie
Cest le cas des hormones strodiennes et thyrodiennes. Ces hormones existent sous forme purifie et les
prparations issues de diffrents lots seront identiques.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Actuellement, pour un certain nombre danalytes, les fabricants calibrent leurs talons par rapport aux diffrents IS
ou IRP, par exemple :
- LH : 2me IS 80/552 ou 1er IRP 68/40
- Prolactine : 1er IRP 75/504, 2me IS 83/562, 3me IRP 84/500
Dans le cas du dosage de lhCG la rfrence par rapport au 2me IS 61/6 est pratiquement abandonne.
En ce qui concerne la ferritine, la plupart des fabricants calibrent leurs trousses partir de ltalon 80/602 prpar
partir de ferritine de foie humain. Dans le cas de lAFP, la majorit des trousses et calibre par rapport la 1re
IRP 72/225 prpare partir de "pool" de srums provenant de sang de cordon.
II. ANTICORPS
Le dveloppement des anticorps monoclonaux issus des travaux de KOHLER et MILSTEIN (5) associ la mise
en uvre de dosages de type immunomtrique a permis damliorer la spcificit, la prcision et la limite de
dtection de nombreux dosages.
II.1. Avantages
Les anticorps monoclonaux permettent lobtention de ractifs homognes de lot lot.
Par ailleurs, lutilisation danticorps monoclonaux dans des systmes immunomtriques a permis notamment :
- La mise au point de dosages spcifiques dhormones prsentant une grande similitude de structure : hCGFSH-LH-TSH,
- Le dosage spcifique de lACE sans interfrence avec les autres glycoprotines de structure proche : NCA
(non specific cross reacting antigen), BGP1 (biliary glycoprotein 1), NFA1 (normal ftal antigen 1),
- La mise au point de dosages prsentant une limite de dtection trs basse : TSH (permettant la
discrimination entre sujets euthyrodiens et hyperthyrodiens),
- La dcouverte dantignes associs des tumeurs, dont le dosage est trs utile au suivi de certaines
tumeurs : antignes carbohydrates tels que CA 15-3 et cancer du sein, CA 125 et cancer de lovaire, CA 19-9 et
cancers digestifs par exemple.
II.2. Inconvnients
Les anticorps monoclonaux prsentant nanmoins certains inconvnients lis leur manque daffinit et leur
"surspcificit".
- Affinit
Laffinit dun anticorps monoclonal est en gnral infrieure celle dun anticorps polyclonal. Ce manque
daffinit ne pose pas de problme avec les systmes immunomtriques o lon est en excs danticorps. par
contre, dans le cas des dosages par comptition, cette baisse daffinit est un inconvnient et les anticorps
polyclonaux sont en gnral utiliss avec ce type de mthodologie.
- " Surspcificit "
Un anticorps monoclonal est spcifique dun pitope et non de la molcule entire. Selon le cas, cette
"surspcificit" se traduira par une sur-estimation ou une sous-estimation des rsultats.
Si lpitope reconnu est prsent sur une molcule diffrente, on pourra avoir des ractions croises importantes.
Inversement, le dosage de molcules complexes et htrognes (hormones glycoprotiques, marqueurs tumoraux)
pourra tre en dfaut si lpitope reconnu nest plus exprim ou si les pitopes prsents ne sont pas reconnus par
les anticorps utiliss (formes molculaires variables).
Plusieurs exemples peuvent tre cits :
hCG scrte sous forme de sous-units libres au cours de certaines tumeurs, formes non reconnues par
les systmes immunologiques dosant spcifiquement lhCG dimre,
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
ACE dont la structure antignique peut tre variable selon la tumeur lorigine de sa scrtion,
prolactine dont la forme molculaire principale est monomrique ("little prolactin"), mais qui circule
galement sous forme dimrique ("big prolactin") et polymrique ("big-big prolactin"), formes glycosyles
ou non dactivit biologique diffrente (6),
LH, hormone glycoprotique prsentant une microhtrognit lie aux chanes glycosyles et pour
laquelle une quinzaine disoformes a t dcrite (7). Certaines formes de LH scrtes chez des femmes
endocrinologiquement normales ne sont pas dtectes par certains systmes immunologiques et on parle de
LH "invisible" (8)
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
I. ANTICORPS HETEROPHILES
I.1. Dfinition
Les anticorps htrophiles sont des anticorps prsents dans certains srums et qui sont dirigs contre les
immunoglobulines animales du ractif. Ces anticorps pourront interfrer au cours des diffrentes tapes
immunologiques, en particulier dans les techniques immunomtriques lorsque les deux anticorps ractifs ont la
mme origine animale. On peut noter galement une interfrence dans les techniques par comptition (12).
I.2. Origine
Lorigine de ces anticorps est multiple. Ils peuvent apparatre :
- aprs immunisation par vaccins prpars sur tissu animaux,
- par suite de contacts frquents avec les animaux,
- au cours de maladies auto-immunes (facteurs rhumatodes des affections rhumatismales et du lupus
rythmateux),
- par suite dinjection danticorps monoclonaux de souris dans le cadre dimmunoscintigraphies et
dimmunothrapies.
Enfin, dans un certain nombre de cas, on ne trouve pas dexplication leur prsence.
I.3. Caractristiques
Ces anticorps peuvent tre dirigs contre les diffrents motifs antigniques de limmunoglobuline : motifs
isotypiques, allotypiques et idiotypiques. Actuellement, les anticorps htrophiles lorigine des interfrences les
plus souvent dcrites sont des anticorps anti-isotypes dirigs contre la partie constante des immunoglobulines
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
(fragment Fc) et des anticorps anti-idiotypes dirigs contre la partie hypervariable de limmunoglobuline. Ces
anticorps sont de classe IgG et/ou IgM.
I.4. Problmes poss par la prsence des anticorps htrophiles.
- Avec les techniques immunomtriques, ces anticorps vont tre le plus souvent lorigine dune surestimation des rsultats en se fixant dune part sur lanticorps de capture et dautre part sur lanticorps traceur,
simulant ainsi la prsence de lantigne (13-14). Plus rarement, ces anticorps peuvent aussi tre lorigine dune
sous-estimation des rsultats (cas dIgM anti-immunoglobulines animales qui, par suite dencombrement strique,
empchent la fixation de lantigne sur lanticorps spcifique).
- Avec les techniques par comptition, bien que moins souvent signal, ce type dinterfrence peut
nanmoins exister (cas dIgM anti-IgG animales qui par suite dencombrement strique empchent la fixation du
traceur sur lantisrum).
I.5. Solutions pour liminer ou minimiser ces interfrences
Plusieurs solutions sont possibles :
- laddition de srum animal provenant de la mme espce que celle ayant fournie les anticorps ractifs
permet de neutraliser les anti-immunoglobulines (13-14) ; cependant, la concentration dimmunoglobulines
neutralisantes peut tre suffisante pour certains spcimens et insuffisante pour dautres ; par ailleurs, il et difficile
de neutraliser compltement les anticorps de classe IgM,
- lutilisation de fragments F(ab) 2 comme anticorps de capture ou traceur au lieu de lanticorps complet,
ce qui vite la fixation des anticorps htrophiles dirigs contre le fragment Fc, mais nvite pas la fixation des
anticorps anti-idiotypes (15),
- lutilisation de techniques en 2 temps ; les anticorps htrophiles se fixent sur deux molcules danticorps
de capture et ne sont plus disponibles pour lier lanticorps traceur ajout au cours de la deuxime raction
immunologique (15).
I.6. Cas particuliers des patients soumis une immunoscintigraphie ou une immunothrapie
Linjection danticorps monoclonaux de souris (ou de leur fragments) entrane lapparition danticorps anti-souris
(HAMA ou Human Anti-Mouse Antibodies) une concentration telle quils ne sont plus "neutralisantes" par les
solutions prcdentes (16).
Les techniques immunomtriques avec deux anticorps monoclonaux de souris sont particulirement "sensibles"
la prsence danticorps anti-isotypes. Par consquent, tous les analytes doss ainsi sont concerns (ACE-AFPPSA-ferritine-hCG-antignes carbohydrates-etc.).
Llimination des "HAMA" ncessite un traitement pralable du srum avant immunodosage, traitement par le
polythylne glycol 130 g/l ou chauffage du srum 90C dans le cas de lACE (17).
La prsence danticorps anti-idiotypes pertubant fortement le dosage du CA 125 a t dcrite chez des patientes
ayant subi plusieurs immunoscintigraphies (avec injection danticorps OC 125) pour surveillance post-opratoire
dun cancer de lovaire. Dans ce cas, les anticorps anti-idiotypes se comportent comme le CA 125 en se fixant sur
les anticorps anti-OC 125 du ractif. Ces anticorps anti-idiotypes peuvent tre limins par chromatographie
daffinit pralable sur protine A (18).
23
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
La frquence de ces auto-anticorps est denviron 1/1000 dans la population gnrale est plus importante dans les
pathologies auto-immunes.
Mcanisme daction
Linterfrence observe (positive ou ngative) dpendra de la mthode de sparation des formes libres et lies.
- Avec les techniques de type ELISA en une seule tape, ces auto-anticorps en se fixant sur lhormone
marque diminuent la disponibilit du traceur pour lantisrum, entranant une augmentation artefactuelle des
hormones libres.
- Avec certaines techniques radioimmunologiques, o le complexe analyte-immunoglobuline anti-analyte est
retrouve avec la fraction lie, on observe une diminution des valeurs.
Les techniques en deux temps (immunoextraction de lhormone libre, suivie de lavages, puis de laddition du
marqueur), ou les techniques reposant sur le principe dune comptition vis--vis danticorps marqus sont moins
"sensibles" la prsence de ces auto-anticorps (20-21-22).
Mise en vidence
Ces auto-anticorps sont mis en vidence par la mesure du pourcentage des hormones T3 ou T4 radioactives
prcipites par le polythylne glycol 20%.
II.2. Anti-TSH
Les anticorps anti-TSH (synthtiss la suite de lintroduction de TSH dans lorganisme dans un but
thrapeutique) se fixent sur la TSH doser et inhibent la fixation de lanalyte sur les anticorps ractifs. On aura
une sous-estimation des rsultats avec les techniques immunomtrique.
- 17 estradiol micronis et dosage direct de lestradiol, par suite de ractions croises avec les mtabolites
24
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
- Cortisol
Le dosage direct de la cortisolmie est surestim :
en cas de forte augmentation des prcurseurs (17 hydroxy-progestrone, 11 dsoxycortisol) qui
prsentent des ractions croises avec les antisrums anti-cortisol ; ces situations se rencontrent lors de
dficit enzymatique des surrnales, en particulier dficit en 21 hydroxylase et au cours du test la
mtopirone
en cas daccumulation des strodes conjugus et non conjugus, au cours de linsuffisance rnale
chronique (25).
- Testostrone, le dosage direct sera surestim chez la femme en raison des ractions croises en gnral
importantes avec la dihydrotestostrone (qui reprsente environ 50% de la concentration en testostrone). Le
dosage direct est galement surestim chez lhomme trait par la dihydrotestostrone.
25
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
INTRODUCTION
Au cours des deux dernires dcennies on a assist un essor considrable de limmunoanalyse, avec un
largissement sans cesse croissant de son champ dapplication et une diffusion de plus en plus grande dans les
laboratoires danalyses. Cet essor a t favoris principalement par lapparition des anticorps monoclonaux et par
lutilisation des marqueurs non radioactifs encore appels marqueurs froids.
Limmunoanalyse regroupe un ensemble de mthodes danalyse chimique dans lesquelles la spcificit de
dtection dune espce molculaire est due sa liaison in vitro avec un ou plusieurs anticorps spcifiques. Afin de
quantifier la formation du complexe antigne-anticorps, la plupart des techniques courantes emploient un
marqueur. Dune manire gnrale, ont peut dfinir un marqueur pour immunodosage comme tant une entit
(atome, molcule, ion, ) lie chimiquement un antigne ou un anticorps et dlivrant un signal, direct ou
indirect, quantitativement mesurable.
Les techniques dimmunodosages, comme toute technique danalyse, peuvent tre values au moyen dun certain
nombre de critres de qualit : prcision, exactitude, dtectabilit (ou limite de dtection). A ces critres
statistiques classiques bien dfinis, il faut ajouter dautres caractristiques importantes : tendue de la gamme de
concentration accessible (dynamique du dosage) et praticabilit (degr dautomatisation, temps danalyse,
conservation des ractifs,).
Quelle est linfluence du marqueur et de son signal sur la qualit globale dun immunodosage ? Cest la question
laquelle tente de rpondre les lignes qui suivent.
LES MARQUEURS
Les principaux marqueurs utiliss en immunoanalyse courante sont :
- les radiolments dans les techniques RIA (radioimmunoassay) et IRMA (immunoradiometric assay),
- les enzymes dans les techniques EIA (enzymoimmunoassay) et IEMA (immunoenzymometric assay),
- les fluorophores dans les techniques FIA (fluoroimmunoassay) et IFMA (immunofluorometric assay),
- les molcules chimiluminescentes dans les techniques CLIA (chemiluminoimmunoassay) et ICMA
(immunochemiluminometric assay).
Les fluorophores et les molcules chimiluminescentes sont souvent regroups sous la dnomination plus gnrale
de luminophores, cest--dire groupements chimiques susceptibles dmettre un signal luminescent sous leffet
dune excitation approprie, lumineuse dans le premier cas, chimique dans le second cas.
Outre la distinction habituelle entre mthodes de comptition et mthodes immunomtriques deux anticorps, il
existe un autre niveau de classification des immunodosages faisant intervenir la ncessit ou non dune sparation
physique des formes libre et lie avant la mesure du signal. Pour cette raison, on parle dimmunodosages en phase
htrogne et dimmunodosages en phase homogne, ces derniers ne pouvant tre mis en uvre que si le marqueur
dlivre un signal modul par la formation du complexe antigne-anticoprs.
28
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Les marqueurs peuvent galement tre classs selon leur nature chimique. Il peut sagir datomes (125I, 3H), dions
(Eu3+, 57Co3+), de molcules organiques de faible masse molaire (fluorescine, ester dacridinium, ) ou de
molcules de masse molaire leve (enzymes).
Les diffrents marqueurs pour immunoanalyse doivent possder un certain nombre de qualits gnrales. En
premier lieu, leur liaison chimique une molcule dantigne (traceur) ou danticorps (anticorps de rvlation)
doit perturber le moins possible la formation du complexe antigne-anticorps. De plus, le signal physique mis doit
avoir une intensit (par unit de concentration de marqueur) leve, proprit dont dpendent troitement la
prcision des mesures et la limite de dtection du marqueur. Enfin, la spcificit du signal est une proprit
essentielle garantissant un faible bruit de fond des mesures, donc contribuant galement une bonne dtectabilit.
Outre les trois qualits cites prcdemment, il est souhaitable quun marqueur soit dtectable quantitativement sur
une large gamme de concentration, cest--dire que son signal possde une grande dynamique ; cette proprit est
lie la fois la nature du signal physique lui-mme et lappareil de mesure pouvant prsenter un niveau de
saturation.
La figure 1 met en vidence les critres de qualit caractrisant la dtection intrinsque des marqueurs (ou des
molcules marques), sans prendre en compte les autres sources de variabilit des immunodosages. La sensibilit
dS/dC est constante dans toute la zone de proportionnalit et diminue au voisinage de la zone de saturation.
Lerreur C sur la concentration dpend la fois de la variabilit du signal exprime ici par S et de la sensibilit
dS/dC, puisque C = S.(dS/dC)-1. La limite de dtection LD, o concentration minimale dtectable, dpend la
fois de lincertitude ks0 sur le bruit de fond S0 et de la sensibilit lorigine (dS/dC)0 : LD = ks0 (dS/dC)0-1. Le
signal minimum net dtectable est estim en multipliant lcart type s0 sur le bruit de fond par le coefficient k
ncessaire pour considrer que la mesure effectue est significativement suprieure S0.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
S = signal
C = concentration en molcules marques
dS/dC = sensibilit
LD = limite de dtection
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Le signal radioactif
En immunoanalyse, les deux principaux radiolments marqueurs tant liode 125 et le tritium, le signal consiste
donc soit en une mission de photons X et , soit en une mission de particules : ces deux types dmission sont
aisment dtectables au moyen de spectromtres appropris. On utilise parfois le Cobalt 57 metteur dans le cas
des dosages simultans.
Le Signal physique lui-mme est un signal direct (directement mis par le marqueur), spontan (ne faisant pas
intervenir une source dnergie externe) et trs spcifique (les rayonnements parasites ou les contaminations tant
exceptionnels) ; son mission est indpendante du milieu, lactivit (amplitude du signal physique) tant seulement
proportionnelle au nombre de molcules marques. Dautre part, la dtection de ce signal est une dtection
numrique (comptage dimpulsions), donc facilement corrige du bruit de fond rsiduel.
Le tableau suivant indique les limites de dtection (LD) des espces marques avec de liode 125 et avec du
tritium.
2000 Ci / mmol
BF = 35 cpm
t min
LD 10-18 mol
100 Ci / mmol
BF = 25 cpm
t min
Par rapport aux autres marqueurs, en particulier les enzymes, le marqueur radioactif prsente aussi lavantage dun
faible encombrement strique.
Malgr ces proprits trs favorables, il existe certains inconvnients dans lutilisation des molcules
radiomarques : dune part, le temps dacquisition du signal doit tre suffisamment long pour obtenir une prcision
et une limite de dtection satisfaisantes, dautre part le phnomne de dcroissance radioactive, et ventuellement
la radiolyse, limitent la dure de conservation des molcules marques.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Figure 3 :
Emission du signal fluorescent.
(a) mission directe
(F* = fluorophore)
(b) mission indirecte
(E = enzyme)
(a)
(b)
Dans le cas du marquage fluorescent, le signal lumineux mis par le marqueur est un signal direct, provoqu par
une excitation photonique. Lamplitude SF du signal reu par le dtecteur peut sexprimer sous la forme :
SF = k.0..Q.N
o k est un facteur gomtrique, o le flux excitateur, labsorptivit molaire du fluorophore, Q le rendement
quantique du fluorophore et N le nombre de molcules marques.
Par rapport au signal radioactif, on constate lexistence de deux causes de variabilit supplmentaires : o nest
jamais parfaitement constant puisque toutes les sources lumineuses excitatrices sont susceptibles de fluctuation, Q
dpend de la composition du milieu. En outre se pose le problme de la spcificit du signal et de la slectivit de
sa dtection en raison de linterfrence possible de fluorescences parasites et de rayonnements diffuss ; ce
problme ne peut tre rsolu dans le cas des fluorophores classiques comme la fluorescine et la
mthylombellifrone. Seul lemploi des chlates deuropium a permis, grce la technique de fluorimtrie pulse,
de saffranchir la fois des rayonnements parasites et du bruit interne du dtecteur, avec pour consquence une
limite de dtection trs favorable (environ 10-18 mol). Les principaux avantages du marquage fluorescent sont : un
temps dacquisition du signal trs bref et une dynamique de dtection pouvant atteindre cinq ordres de grandeur.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Figure 4 :
Mode dmission du signal
chimiluminescent.
(a) mission directe par le
marqueur (L*)
(b) mission indirecte grce
un marqueur enzymatique (E)
Dans le premier cas on a affaire un signal direct, provoqu par une raction chimique. Lamplitude du signal SCL
reu par le dtecteur un instant t aprs linjection du ractif peut sexprimer sous la forme :
SCL = k.Q. dN
dt
dN
k, Q et N ayant la mme signification que prcdemment, dt tant la vitesse de raction chimique.
Il existe diffrentes causes de variabilit de SCL : le rendement quantique et la vitesse de raction dpendent de la
composition du milieu ; le volume de ractif et linstant du dbut de la dtection ne peuvent tre parfaitement
reproductibles. En revanche la spcificit de lmission, donc la slectivit de la dtection, est meilleure que celle
du signal fluorescent puisquil ny a pas de source de lumire parasite. Il faut galement noter que le bruit interne
du dtecteur peut tre en grande partie supprim lorsquon emploie la technique du comptage de photons grce
laquelle la limite de dtection atteint dans certains cas 10-19 mol.
Les avantages du marquage chimiluminescent sont les mmes que ceux du marquage fluorescent en ce qui
concerne le temps dacquisition du signal et la dynamique de dtection. Linconvnient majeur en est la fugacit
de lmission qui a pour consquence limpossibilit de vrifier une mesure effectue sur un tube.
Le tableau suivant prsente les principaux marqueurs chimiluminescents (en marquage direct) ainsi que les
ractions de chimiluminescence.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
OH
Aminophtalate + hv
ESTERS DACRIDINIUM
Ester dacridinium + H2O2
N-Mthylacridone + hv
OH
Le signal enzymatique
Les marqueurs enzymatiques nmettent pas un signal physique direct, ils sont dtects par lintermdiaire dun
substrat spcifique en excs qui est transform en un produit mettant un signal physique dont lamplitude est
proportionnelle la quantit du marqueur enzymatique et au temps dincubation. Le signal enzymatique est donc
un signal indirect, soit dmission lorsque le produit form est fluorescent ou chimiluminescent, soit dabsorption
lorsque le produit form est dtect par une mesure dabsorbance une longueur donde caractristique (Figures 5
et 6).
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Lorsquon procde des mesures fluorimtriques ou luminomtriques, on retrouve les causes de variabilit cites
prcdemment auxquelles sajoute la variabilit de la raction enzymatique elle-mme. Quant aux mesures
photomtriques dabsorption les plus frquemment employes, elles souffrent en plus dun certain manque de
spcificit (influence des bulles, imperfections des tubes de mesure, ) et dune dynamique rduite.
Cependant, malgr ces inconvnients, le marquage enzymatique est le seul offrir la possibilit damplification du
signal par simple augmentation du temps dincubation de ltage de rvlation.
Le tableau suivant prsente les principales enzymes utilises en immunoanalyse ainsi que les modes de dtection
possibles (photomtrie dabsorption, fluorimtrie, luminomtrie).
Fluo.
C.L.
Phosphatase alcaline
-D-Galactosidase (GAL)
Les deux enzymes les plus employes sont la peroxydase de raifort qui peut tre rvle par mesure photomtrique
dabsorption et par chimiluminomtrie et la phosphatase alcaline qui offre les trois possibilits de dtection :
absorption, fluorescence et chimiluminescence.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Signalons que la malate dshydrognase est utilise dans les mthodes de comptition en phase homogne.
Cette liste nest pas exhaustive, on peut citer galement le lysozyme, lactylcholine-estrase,
Trois exemples de rvlation du signal enzymatique sont prsents ci-aprs.
Premier exemple : rvlation photomtrique dabsorption de la PEROXYDASE au moyen dun ractif contenant
de lo.phnylnediamine et H2O2
Le mesure dabsorbance est effectue 492 nm, aprs 30 minutes dincubation.
Ractif
PEROXYDASE
H2O2
o.phnylnediamine
Produit
o.nitrophnol
[mesure de A 492
nm]
La dynamique de la mesure couvre environ trois ordres de grandeur (de 2.10-3 u. dabsorbance jusqu 2). La
limite de dtection de la peroxydase peut tre estime 10-17 mol par cette mthode de rvlation.
Deuxime exemple : rvlation fluorimtrique de la phosphatase alcaline au moyen dun substrat fluorigne, le
mthyl ombellifryl phosphate non fluorescent qui est transform en mthyl ombellifrone fluorescente.
Ractif
PHOSPHATASE ALCALINE
Mthylombellifryl
phosphate
Produit
Mthylombellifrone
Exc. 364 nm
Dt. 448 nm
La dynamique de mesure est plus grande que par photomtrie dabsorption : au moins quatre ordres de grandeur.
La limite de dtection de la phosphatase alcaline peut tre estime une valeur infrieure 10-17 mol.
Troisime exemple : rvlation chimiluminomtrique de la phosphatase alcaline au moyen dun Phnyl Phosphate
Dioxtane substitu, lAMPPD (adamantyl mthoxyphnylphosphate dioxtane) qui est stable chimiquement.
Aprs action de la phosphatase alcaline, le produit form est un dioxtane instable qui se dcompose en formant
une espce excite. Par transfert dnergie, lnergie dexcitation de cette espce est communique des molcules
de fluorescine prsentes dans le milieu de rvlation.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
PH. ALCALINE
OMe
OMe
AMPPD stable
OPO3Na2
instable
OMe
Fluorescine
hv
Avec ce systme la limite de dtection atteinte est de lordre de 10-21 mol de phosphatase alcaline. Par comptage de
photons, la dynamique de mesure peut atteindre cinq ordres de grandeur.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Seuls sont cits ici les automates les plus utiliss par les participants lopration de contrle de qualit national
qui a eu lieu en juin 1994.
Systmes utilisant un signal dabsorption
Automate
Marqueur
Chromogne
PAL
HRP
HRP
HRP
PAL
BNPP
ABTS
OPD
TMB
PNPP
Marqueur
- ABBOTT "TDX"
- BEHRING DIAGNOSTIC "Opus"
- KABI PHARMACIA "Autodelfia"
Fluorescine
Rhodamine
Eu3+
Marqueur
PAL
PAL
PAL
PAL
PAL
Fluorigne
4MUP
4MUP
4MUP
4MUP
4MUP
Marqueur
Ester dacridinium
Ester dacridinium
Acridinium acyl
sulfonamide
Abrviations employes dans le tableau ci-dessus : PAL phosphatase alcaline, PNPP paranitrophnyl phosphate,
HRP peroxydase de raifort, ABTS azino-di-[thylbenzothiazolinyl sulfonate], OPD orthophnylnediamine, TMB
tetramthylbenzidine, 4MUP 4-mthylombellifryl phosphate.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
DISCUSSION
Si lon compare les qualits intrinsques des signaux des diffrents marqueurs, il apparat que la plus faible
variabilit dans les mesures est obtenue avec le signal radioactif, que les meilleures limites de dtection des
espces marques sont atteintes grce au signal chimiluminescent (direct ou enzymatique), que la plus grande
dynamique de mesure est obtenue avec le signal fluorescent rsolu en temps et avec le signal chimiluminescent.
Lensemble des trois critres prcdents est prendre en considration pour les dosages immunomtriques deux
anticorps, mais il est bien vident que pour les mthodes de comptition cest le premier critre qui prvaut. Donc,
dans la mesure o la limite de dtection du marqueur et la dynamique de son signal ne sont pas des facteurs
limitants, le critre "variabilit" est sans aucun doute le plus important, ce qui situe le marqueur radioactif en
position privilgie.
Cependant un immunodosage ne se rsume pas la seule tape de dtection dune espce marque, il fait
intervenir des tapes immunochimiques pralables, si bien que les critres de qualit habituellement dtermins
pour valuer un dosage sont lis sa variabilit totale qui est la somme de la variabilit immunochimique, de la
variabilit dmission du signal et de la variabilit de mesure de ce signal.
La qualit globale propre dun systme dimmunoanalyse, en faisant abstraction de linfluence de loprateur,
dpend donc de trois facteurs principaux : le systme immunologique, la phase solide (sauf pour les mthodes en
phase homogne) et le marqueur ainsi que son systme de dtection. En consquence, la nature du signal nest
quun paramtre parmi dautres, et lexamen attentif des rsultats du contrle de qualit semble indiquer que le
marqueur nest probablement pas llment prpondrant entranant la plus ou moins bonne qualit dune
technique. Dans cet expos, on a fait volontairement abstraction des conditions opratoires qui jouent cependant
un rle capital dans la qualit des dosages : en particulier le travail en tubes simples induit une variabilit des
rsultats plus grande que si les mesures sont effectues sur "doublets".
Dans ltat actuel des techniques dimmunoanalyse, il est impossible daffirmer quune mthode est meilleure
quune autre partir de la seule prise en compte de la nature du marqueur et de son signal.
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ANALYTES
CA 19-9
PSA
hCG - hCG
TSH
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
I. INTERT PHYSIOPATHOLOGIQUE
En 1979, Koprowski et al. (1) ont mis en vidence un antigne dnomm antigne carbohydrate 19-9 (CA 19-9) ou
GICA (gastrointestinal carbohydrate antigen) grce lutilisation dun anticorps monoclonal obtenu partir dune
ligne cellulaire provenant dun carcinome colorectal humain (SW 1116).
Le CA 19-9 est prsent dans de nombreux tissus ftaux et dans diffrents tissus sains de ladulte : pithliums
glandulaires du pancras, foie, voies biliaires, estomac, poumons, canaux des glandes salivaires et la prostate (2).
Lantigne est dtectable dans le srum, le lait, le plasma sminal, les sucs gastrique et pancratique ainsi que dans
la salive.
Le CA 19-9 srique augmente chez les patients atteints de tumeurs du tractus digestif (voies biliaires, foie,
estomac, intestin) et en particulier chez les patients atteints de carcinome du pancras.
Dans les cancers du pancras, le dosage de cet antigne associ aux techniques dimagerie est une aide au
diagnostic. Le CA 19-9 a une valeur pronostique et son principal intrt rside dans la surveillance thrapeutique
et la mise en vidence de rcidives.
Dans les cancers colorectaux, les cancers des voies biliaires et de lestomac, la frquence de positivit du CA 19-9
est moindre. Son dosage est galement utile dans le suivi de ces tumeurs. Une augmentation du CA 19-9 peut tre
galement observe dans les cancers de lovaire et broncho-pulmonaire.
Le CA 19-9 nest pas un marqueur spcifique du cancer, en effet, il peut tre lev au cours de maladies bnignes
digestives (pancratites, hpatites aigus ou chroniques, lithiases biliaires) ainsi quau cours de la mucoviscidose
et du diabte.
II. STRUCTURE
Le dterminant antignique reconnu par lanticorps monoclonal est un oligosaccharide (lacto-N-fucopentaose II
sialyl) port de manire rptitive, soit par un ganglioside la surface des membranes cellulaires, soit par une
protine de type mucine dans le srum (3). Cet pitope glucidique fait partie de la classe des carbohydrates du
groupe sanguin Lewis.
Les premiers travaux de Koprowski indiquent que la glycoprotine portant ce dterminant antignique a une masse
molaire de 35 000 g.mol-1. Plus rcemment, Klug et al. (4) ont extrait de surnageants de cultures cellulaires de
carcinome colorectal des molcules exprimant lpitope CA 19-9 de masse molaire de 210 000 g.mol-1. Ces
molcules peuvent sagrger en donnant des polymres de masse molaire trs leve de 600 000 2 000 000 g.mol1
.
41
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Lors de lenqute du contrle national de qualit (juin 1994), mille soixante six laboratoires ont rendu un rsultat
de CA 19-9. Les techniques avec dtection dun signal photomtrique, fluorescent et radioactif sont utilises par
respectivement 47%, 46% et 4,5% des participants (2,5% des techniques ntant pas codes ou insuffisamment
reprsentes).
III.2. Anticorps
Toutes les trousses de dosage utilisent le mme anticorps monoclonal comme anticorps de capture et comme
anticorps marqu. Cet anticorps est dnomm 1116-NS-19.9.
III.3. Etalon
Actuellement, il nexiste pas dtalon international de rfrence.
Les talons sont prpars partir dantigne isol extrait de surnageants de cultures cellulaires provenant dun
adnocarcinome colorectal. Cet antigne est ensuite dilu dans un "pool" de srums humains, ou dans un mlange
de protines humaines et animales.
Les rsultats de CA 19-9 sont exprims en units arbitraires (U/ml ou kU/l), une unit correspondant 0,8 ng de
glycoprotine portant le dterminant antignique.
III.4. Causes derreurs
- Effet crochet
Lorsque la concentration en antigne est trs leve et trs suprieure celle du dernier point de la gamme
dtalonnage, on peut observer une diminution de la valeur du signal et par consquent un rsultat faussement
abaiss. Les concentrations de CA 19-9 peuvent tre trs leves, en particulier en cas de cancers du pancras et
peuvent atteindre 300 000 kU/l (6). Il est donc important de connatre la concentration partir de laquelle leffet
crochet peut apparatre avec la technique utilise, cette concentration devant tre dtermine pour chaque
technique.
- Anticorps htrophiles
La prsence danticorps anti-souris (HAMA) dans lchantillon peut tre lorigine de rsultats errons (en
gnral surestims) avec les techniques immunomtriques utilisant des anticorps monoclonaux.
42
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Enfin, lors de cette enqute, 77,5% des laboratoires utilisaient des ractifs adapts sur automates.
43
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
VIII. LEGISLATION
La lgislation actuelle impose une double dtermination du CA 19-9 :
- soit avec reprise du srum prcdent (dure maximale de conservation sous forme congele de deux
mois)
- soit dans deux sries de dosage diffrentes,
- soit dans la mme srie sur deux dilutions diffrentes du mme srum.
IX. CONCLUSION
Le CA 19-9 est un antigne dfini par un anticorps monoclonal dont laugmentation srique est frquente au cours
des cancers du pancras et du tractus digestif. Cest au cours des cancers du pancras que la frquence de positivit
est la plus grande et que les valeurs de CA 19-9 les plus leves sont observes. Des augmentations importantes
sont galement notes lors des lithiases du choldoque compliques dangiocholite. Dans les autres pathologies
bnignes, les valeurs de CA 19-9 sont en gnral faiblement ou modrment augmentes.
Comme pour les autres marqueurs tumoraux, en raison de la variabilit inter techniques observe actuellement, il
est indispensable que le suivi dun mme patient soit effectu avec la mme mthodologie.
45
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
I. INTERET PHYSIOPATHOLOGIQUE
Le PSA (Antigne spcifique de la prostate) a t isol et purifi par YANG (1) en 1979 partir de tissu
prostatique humain.
Le PSA est une glycoprotine scrte par les cellules pithliales de la prostate et, un trs faible niveau de
concentration, par les glandes pri-vsicales et pri-urtrales. Il est excrt dans le liquide sminal, la circulation
sanguine et lurine. Le PSA est une protase dont le rle physiologique est le clivage dune protine implique
dans la liqufaction du sperme aprs ljaculation.
Jusqu prsent, le PSA tait considr comme presque exclusivement spcifique du tissu prostatique, augmentant
lors des pathologies bnignes (prostatites-hypertrophies bnignes ou adnomes) et au cours des cancers. Cependant
des tudes rcentes montrant la prsence de PSA dans des cellules cancreuses du sein (scrtion associe la
prsence de rcepteurs aux strodes) et dans le lait maternel remettent en question cette spcificit tissulaire (2).
Des tudes complmentaires sont nanmoins ncessaires pour prciser le rle et lintrt clinique de ce PSA extraprostatique.
Par contre, lutilit du PSA en pathologie prostatique est bien documente.
I.1. PSA et diagnostic prcoce de cancer
Associ dautres examens, et en particulier au toucher rectal, la dtermination du PSA srique permet
daugmenter le nombre de cancers diagnostiqus un stade prcoce.
I.2. PSA et dtermination du stade
Le PSA ne permet pas, lui seul, de dterminer le stade du cancer bien que sa concentration augmente avec celuici. En effet, il existe une grande dispersion des valeurs pour un stade donn (3) et par ailleurs, plus un cancer est
indiffrenci, moins il scrte de PSA (4).
I.3. PSA et surveillance des cancers traits
Le principal intrt du PSA est la surveillance du traitement du cancer de la prostate (prostatectomie radicale
hormonothrapie ou radiothrapie). Le PSA permet dvaluer lefficacit du traitement, de surveiller une rmission
et un dpistage prcoce des rcidives.
48
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
En ce qui concerne la structure antignique, cinq pitopes ont t dcrits sur la molcule de PSA libre. La liaison
du PSA avec les antiprotases masque partiellement ou compltement ces pitopes. En effet, trois de ces cinq
pitopes sont masqus pour le PSA-ACT et les cinq pitopes sont situs lintrieur de la molcule dalpha 2
macroglobuline et ne sont pas accessibles aux anticorps. Seules les formes de PSA libre et lie lACT seront
donc doses immunologiquement. LACT se fixe toujours sur les mmes pitopes du PSA pour des raisons de
charge et de structure.
Les proportions des formes libre et lie lACT varient selon les situations physiopathologiques, avec une
prdominance de la forme libre au cours de ladnome et une prdominance de la forme PSA-ACT dans les
cancers (5-6).
49
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
III.3. Anticorps
Une seule trousse drive de la technique Yang est de type comptitif et utilise un anticorps polyclonal. Toutes les
autres trousses sont bases sur le principe de l'immunomtrie utilisant un couple d'anticorps : deux monoclonaux
ou un monoclonal plus un polyconal.
Plusieurs tudes (8-9) ont montr que les diffrents anticorps reconnaissaient de faon trs variable les formes
libre et complexe : reconnaissance quimolaire ou reconnaissance prfrentielle de la forme libre par rapport la
forme lie l'ACT.
III.4. Limite de dtection
Les limites de dtection sont de l'ordre de 0,10-0,20 g/l pour les techniques immunomtriques. Certaines trousses
prsentent une limite de dtection plus faible (infrieure 0,10 g/l) et sont qualifies d'ultrasensibles.
III.5. Causes d'erreurs
- Effet crochet
La concentration de PSA peut tre trs leve (suprieur 10 000 g/l), en particulier au cours des cancers de la
prostate avec mtastases. Il est donc ncessaire de connatre la concentration partir de laquelle l'effet crochet peut
apparatre avec la technique utilise.
- Anticorps htrophiles
La prsence d'anticorps htrophiles, en particulier d'anticorps anti-souris (HAMA) peut tre l'origine de rsultats
errons (en gnral surestims) avec les techniques immunomtriques utilisant des anticorps monoclonaux.
50
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
PSA
Figure 1:
1 :Moyennes
Moyennesdes
desdiffrentes
diffrents trousses
trousses exprimes
exprimes en
en %
% de
de la
la moyenne
moyenne gnrale.
gnrale
PSA
CV Tr %
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
(16-17). Nanmoins, ont ne sait pas encore si la mise en route d'un traitement plus prcoce aura un ventuel
retentissement sur la survie du malade.
- En cas d'hormonothrapie (traitement anti-andrognique) ou de radiothrapie, la diminution et le retour la
normale du PSA indiquent une bonne rponse au traitement et constituent un critre pronostique. En effet, en
l'absence de normalisation du PSA, les risques de rechute sont importants.
VII. LEGISLATION
La lgislation actuelle impose une double dtermination du PSA :
- soit avec reprise du srum prcdent (dure maximale de conservation sous forme congele de deux
mois),
- soit dans deux sries de dosage diffrentes,
- soit dans la mme srie sur deux dilutions diffrentes du mme srum.
VIII. CONCLUSION
Bien que des tudes rcentes remettent en question la spcificit du PSA pour le tissu prostatique, cet antigne
reste le marquer le plus fiable dans le cadre d'une pathologie prostatique.
En raison de l'importance des variations intertechniques constates actuellement, il est indispensable que le suivi
d'un patient soit effectu avec la mme mthodologie. Par ailleurs, l'interprtation des rsultats doit tre effectue
en fonction des valeurs de rfrence propres chaque trousse et chaque tranche d'ge.
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54
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
I. INTERET PHYSIOPATHOLOGIQUE
L'hCG (hormone chorionique gonadotrope) est une hormone synthtise par les cellules trophoblastiques du
placenta ds le 6me jour de la fcondation (1).
Le rle physiologique essentiel de l'hCG est de stimuler le corps jaune permettant ainsi la synthse de la
progestrone et des strognes en dbut de grossesse. L'hCG aurait galement d'autres rles permettant d'expliquer
la faible quantit d'hCG d'origine hypophysaire trouve chez des individus normaux (2)
I.1. hCG et grossesse
*Diagnostic de grossesse
L'hCG srique permet un diagnostic prcoce de grossesse ds la premire semaine suivant la fcondation. La
concentration double en 36-48 heures en dbut de grossesse, est maximale entre la 8me et la 10me semaine, puis
diminue au 2me et 3me trimestre de grossesse jusqu' environ 10% de la valeur maximale.
*Grossesses pathologiques
En cas de grossesse extra-utrine (GEU), les valeurs sont beaucoup plus basses et voluent vers une stabilisation
ou une rgression. De mme des valeurs basses d'hCG se rencontrent lors des grossesses arrtes.
En cas de grossesse molaire, les concentrations d'hCG sont trs leves. La courbe de diminution de l'hCG
permettra ensuite la surveillance post-molaire (l'hCG devant se ngativer dans les six semaines suivant l'vacuation
de la mle).
I.2 hCG et trisomie 21 (Syndrome de Down)
Chez la femme enceinte, l'augmentation de l'hCG srique (couple l'ge maternel et l'ge gestationnel) est un
signe d'appel biologique permettant de dfinir une population risque de trisomie ftale (3). Une amniocentse
sera alors ralise pour dterminer le caryotype ftal.
La dtermination spcifique des sous-units libres semblerait plus discriminante que celle de l'hCG (4).
I.3. hCG et tumeurs
L'hCG est scrte par une grande varit de tumeurs : tumeurs trophoblastiques placentaires, tumeurs germinales
de l'ovaire et du testicule, tumeurs non trophoblastiques (ovaire - pancras - clon - poumons - vessie). Les dosages
de l'hCG et sous-units libres sont utiles au diagnostic diffrentiel entre grossesse normale, mle et tumeur
trophoblastique et au suivi des tumeurs trophoblastiques. Ces dosages permettent galement le diagnostic et le
suivi des tumeurs germinales du testicule, Rcemment, l'intrt du dosage des sous-units libres dans le
diagnostic et suivi des tumeurs de la vessie a t montr (5).
55
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
56
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Cependant, des discordances plus ou moins importantes sont observes entre les rsultats obtenus avec les
diffrentes trousses de dosage. Ces discordances sont dues en grande partie la spcificit des anticorps utiliss et
la combinaison de ces anticorps.
En effet, d'aprs la carte pitopique dcrite par SCHWARZ et al. (9), il existe neuf sites antigniques sur la
molcule d'hCG dont trois sont situs sur la sous-unit , quatre sur la sous-unit et deux sur l'hCG dimre.
Du choix et de la combinaison des anticorps dpendront la reconnaissance des diffrentes formes molculaires :
hCG clive + hCG non clive, hCG non clive uniquement, hCG + sous-units libres, sous-units libres
uniquement, hCG sans fragment -C terminal (10).
Les mthodes avec anticorps reconnaissant l'hCG + les sous-units libres reconnaissent de faon trs variable les
sous-units libres et les discordances intertechniques peuvent tre trs importantes dans ce cas (11-12).
III.3. Etalons
Il existe plusieurs prparations internationales de rfrence :
* 2me IS (61/6), prparation impure d'hCG contenant aussi des sous-units et libres et de la LH ; cette
prparation tait destine au dosage biologique de l'hCG et n'est plus disponible depuis 1987.
* 1er IRP et 3me IS (75/537), prparations purifies contenant essentiellement de l'hCG ; ces prparations
sont destines au dosage immunologique de l'hCG.
Ces deux talons sont titrs par des mthodes biologiques et les titres sont exprims en UI/l.
La trs grande majorit des trousses est talonne actuellement par rapport au 1er IRP/3me IS.
* 1er IRP (75/551) contenant des sous-units libres pour dosage spcifique des sous-units libres ; dans
ce cas, l'unit qui correspond une masse donne de l'talon est dfinie arbitrairement, cas les sous-units sont
dpourvues d'activit biologique.
III.4. Causes d'erreurs
- Effet crochet
Lorsque la concentration en antigne est trs leve et trs suprieure celle du dernier point de la gamme
d'talonnage, ont peut observer une diminution de la valeur du signal et par consquent un rsultat faussement
abaiss. Les concentrations d'hCG peuvent tre trs leves, en particulier en cas de mle hydratiforme
(suprieures 106 UI/l). Il est donc important de connatre la concentration partir de laquelle l'effet crochet peut
apparatre avec la technique utilise, cette concentration devant tre dtermine pour chaque technique.
- Anticorps htrophiles
La prsence d'anticorps anti-souris (HAMA) peut tre l'origine de rsultats errons (en gnral surestims) avec
les techniques immunomtriques utilisant des anticorps monoclonaux.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
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Les concentrations attendues en fonction de l'ge gestationnel sont indiques dans le tableau ci-dessus. Des
variations individuelles importantes sont observes.
AGE DE LA GROSSESSE
10me jour
1.5 2 semaines
2 3 semaines
3 4 semaines
4 6 semaines
6 9 semaines
2me trimestre
3me trimestre
10
40 200
100 1 000
500 10 000
60 000 200 000
100 000 300 000
3 000 50 000
1 000 50 000
60
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VII. CONCLUSION
La prsente d'hCG en dehors de la grossesse est toujours anormale ( l'exception des faibles concentrations
rencontres chez les sujets de plus de 45 ans).
La diversit des formes molculaires d'hCG immunoractives et leur variation en fonction des situations
physiopathologiques impose la connaissance prcise de la spcificit des anticorps utiliss et du contexte clinique.
Lorsque le dosage est demand dans le cadre d'un diagnostic ou d'un suivi de tumeurs, il est indispensable d'utiliser
des techniques permettant la reconnaissance de l'hCG et des sous-units libres qui peuvent tre scrtes
simultanment ou isolment. L'utilisation de techniques spcifiques des sous-units libres plus sensibles peut
tre utile dans certains cas. Enfin, il est indispensable d'utiliser toujours la mme technique pour le suivi d'un
mme malade, compte-tenu des diffrences intertechniques existantes.
61
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
HORMONE THYREOSTIMULANTE
(TSH)
R. COHEN, A. BEAUDONNET, A.C. RENARD
I. RAPPELS PHYSIOLOGIQUES
L'hormone thyrostimulante (TSH) ou thyrotrophine fait partie d'une famille de glycoprotines, comprenant en
outre les gonadotrophines hypophysaires (FSH et LH) et la gonadotrophine chorionique (hCG). Elles drivent
vraisemblablement d'un mme gne ancestral et sont constitues de deux chanes polypeptidiques, dnommes
sous-units alpha et bta, et de glucides reprsentant 15 30% de la masse molaire totale. La sous-unit alpha est
identique pour ces quatre hormones, alors que les sous-units bta diffrent et sont spcifiques de chaque hormone,
laquelle elles confrent l'activit biologique et immunologique (1).
La masse molaire de la TSH est d'environ 28 000 g.mol-1. La chane , comprenant 112 acides amins, est runie
la chane par des liaisons non covalentes. La combinaison de deux sous-units est indispensable l'action
hormonale ; in vivo, au pH physiologique, il n'y a pas de dissociation. La TSH comprend trois units
oligosaccharidiques branches sur les deux chanes (2), dont la prsente augmente la solubilit de l'hormone ; elles
n'interviennent pas dans l'interaction avec le rcepteur mais sont essentielles pour stimuler la production d'AMP
cyclique.
Grce l'outil que constituent les anticorps monoclonaux, une carte pitopique de la molcule a pu tre tablie :
deux pitopes sont situs sur la chane , six sur la chane et quatre autres n'apparaissent qu'en prsence des deux
sous-units lies (3). C'est en slectionnant les anticorps les mieux adapts que les immunodosages trs spcifiques
que l'on connat actuellement ont pu tre mis au point.
La TSH produite par l'hypophyse circule sous forme libre dans le plasma. Chez l'homme, la demi-vie de la TSH est
d'environ 60 minutes. Les principaux sites d'inactivation de l'hormone sont le foie et le rein.
La TSH est le principal facteur contrlant la synthse des hormones thyrodiennes. L'administration de TSH
conduit une augmentation de taille et de vascularisation de la glande, de synthse et de scrtion des hormones.
La TSH circulante se lie des rcepteurs spcifiques membranaires de nature glycoprotique. La fixation de la
TSH son rcepteur dclenche l'activation de l'adnylcyclase et la production d'AMP cyclique qui constitue le
mdiateur intracellulaire de la plupart des effets de la TSH.
La scrtion de la TSH est soumise l'effet inhibiteur des hormones thyrodiennes. Le rtrocontrle hypophysaire
de la scrtion de TSH par les hormones thyrodiennes constitue le principal facteur de rgulation. De faibles
variations des concentrations de T4 et/ou de T3 provoquent une adaptation immdiate de l'excrtion de TSH et
plus long terme de sa synthse. Ce sont surtout les formes libres de T4 et de T3 circulantes qui interviennent dans le
rtrocontrle.
La scrtion de TSH est soumise l'effet stimulant de la TRH (Thyrotropin Releasing Hormone). Premier peptide
hypothalamique de stimulation hypophysaire isol et caractris, TRH est un tripeptide, largement produit dans le
systme nerveux central mais aussi le pancras, le tractus digestif. TRH se lie rcepteurs membranaires prsents
sur les cellules thyrotropes et aussi sur les cellules prolactiniques et les cellules somatotropes des tumeurs
productrices d'hormone de croissance. L'administration de TRH entrane une rponse scrtoire de TSH qui
apparat ds la cinquime minute et qui est maximum entre la quinzime et la trentime minute.
63
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
D'autres facteurs interviennent dans la rgulation de la scrtion de TSH. Les dopaminergiques ont un effet
inhibiteur tonique qui s'exerce au niveau hypophysaire. Le contrle noradrnergique de la TSH s'exerce par
l'intermdiaire de l'hypothalamus et la production de TRH. Il intervient particulirement lors de l'exposition au
froid qui augmente la TSH et les hormones thyrodienne. La somatostatine (SRIH), en administration aigu,
diminue la TSH. Les strodes sexuels influencent surtout les rponses de TSH TRH qui sont plus importantes
chez la femme que chez l'homme. L'effet inhibiteur des glucocorticodes s'exprime la fois aux niveaux
hypophysaire et hypothalamique. Ils induisent une rduction de la TSH basale, des pics nocturnes de TSH et de
rponse de TSH TRH.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Causes d'abolition des pics nocturnes de TSH (et rduction des rponses de TSH TRH)
hyperthyrodies frustes
hypothyrodies centrales
tats dpressifs
insuffisance rnale
corticothrapie
maladies gnrales non thyrodiennes
Causes d'lvation de la TSH
hypothyrodies protothyrodiennes
adnome thyrotrope
syndrome de rsistance aux hormones thyrodiennes
pic scrtoire de la priode nonatale
certaines hypothyrodies d'origine hypothalamo-hypophysaire
insuffisance surrnale
prise d'amiodarone
anticorps htrophiles
Causes d'abaissement de la TSH
hyperthyrodies protothyrodiennes actuelles et rcentes
grossesse
certaines hypothyrodies d'origine hypothalamo-hypophysaire
imprgnation rcente et massive par la dopamine ou les glucocorticodes
Tableau I : variations physiopathologiques de la TSH (d'aprs (4))
L'avnement de la technologie des anticorps monoclonaux et son application aux immunodosages par excs
d'anticorps vers 1985, a conduit au dveloppement d'une deuxime gnration de dosages de TSH possdant une
dtectabilit meilleur d'un ordre de grandeur (c'est--dire d'un facteur 10) que les dosages radioimmunologiques.
Grce eux, il tait possible pour la premire fois de discriminer les sujets euthyrodiens de ceux atteints d'une
hyperthyrodie franche (7). En 1990, est apparue une troisime gnration de dosages dont la limite de dtection
tait plus basse de deux ordres de grandeur (100 fois) que les dosages par comptition initiaux. Ceux-ci ont permis
de confirmer que la scrtion de TSH dans l'hyperthyrodie franche est compltement abolie ou, tout le moins,
que les niveaux de TSH sriques sont indtectables (infrieurs 0,01 mUI/L) mme avec les techniques de
troisime gnration.
Les progrs technologiques prcdents ont modifi la place du dosage de TSH dans l'exploration thyrodienne. Le
niveau de TSH srique est actuellement considr comme le marqueur de l'action biologique des hormones
thyrodiennes sur les tissus (en l'occurrence l'hypophyse) le plus sensible et le plus facilement accessible. Ces
progrs ont galement permis la description de diffrents degrs de dysfonctions thyrodiennes. Enfin, avec
remplacement des dosages de premire gnration par ceux de deuxime et troisime gnrations, le statut du
dosage de TSH est pass d'un test de confirmation de l'hypothyrodie primaire un test de premire intention dans
un grand nombre de situations.
Principe et classification des dosages immunomtriques de TSH
Les dosages immunomtriques et notamment leur variante "sandwich" ont complment vinc les immunodosages
par comptition en raison de leur meilleure sensibilit potentielle. Un anticorps monoclonal antiTSH, fix sur une
phase solide, est utilis pour extraire la TSH d'un spcimen en prsente d'anticorps mono- ou polyclonaux
marqus. Aprs incubation et sparation des formes libre et lie, la phase solide fournit un signal radioactif,
enzymatique, fluorescent ou chimiluminescent, directement proportionnel la concentration de TSH prsente dans
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
le spcimen. Les immunodosages de TSH sont habituellement calibrs par rapport la seconde prparation
internationale de rfrence (2nd IRP MRC 80/558).
La classification des dosages de TSH est fonde sur leur limite de dtection fonctionnelle. Elle est reconnue par
l'"American Thyroid Association" qui prconise de ne plus utiliser la limite de dtection analytique (8). Cette
dernire prsente, en effet, l'inconvnient majeur de ne pas correspondre la ralit clinique car son estimation
prend en compte uniquement la variabilit intrasrie et nglige les facteurs de fluctuation d'une srie l'autre que
sont, par exemple, le vieillissement des ractifs, le changement de lots ou de manipulateur, les facteurs lis
l'instrumentation ou son environnement. La limite de dtection fonctionnelle doit tre dtermine partir d'un
profil de prcision tabli grce des mesures spcimens, rptes dans diffrentes sries. Celles-ci doivent tre
ralises par des techniciens diffrents, des jours diffrents et l'aide de lots de ractifs diffrents afin de se
placer dans les conditions les plus proches de celles qui correspondent aux soins des patients.
La limite de dtection fonctionnelle est dfinie comme la concentration (la plus basse) mesure avec un CV intersries de 20%. Celui-ci est dtermin l'aide du profil de prcision tabli selon les indications prcdentes. En
pratique, la limite de dtection fonctionnelle est cinq dix fois suprieure la limite de dtection analytique (9).
A partir de ce critre objectif, il est possible de classer les dosages de TSH en plusieurs "gnrations", le passage
d'une "gnration" la suivante correspondant au gain d'un ordre de grandeur en limite de dtection
fonctionnelle (6):
Gnration du dosage de TSH
Premire
Deuxime
Troisime
Quatrime
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Figure 1 : volution de la "popularit" des techniques adoptes par les participants aux oprations de
contrle national sur la priode 1985-1994. Les techniques sont classes dans les grands groupes suivants :
E
F
H
L
M
R
marque enzymatique et mesure spectrophotomtrique (Biotrol 7000, CIS Pack, Cobas Core, ES, SRI, EIA manuelle)
marque enzymatique et mesure de fluorescence (AIA, Axsym, IMx, Opus, Stratus, Vidas)
marque enzymatique et mesure de luminescence (Amerlite, Access)
marque chimique et mesure de luminescence (Magic Lite, ACS 180, Berilux)
marque chimique et mesure de fluorescence (Delfia)
marque radioisotopique
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
Figure 2 : CV tronqus toutes techniques confondues, observs pour huit spcimens classs en fonction
de leur concentration et analyss entre 1985 et 1994 dans le cadre du contrle national.
Au total, entre juin 1985 et juin 1994, quinze spcimens de contrle ont t distribus. Dans la figure 3, tous les
spcimens qui possdent sensiblement la mme concentration de TSH ont t regroups de manire montrer
l'volution de la variabilit totale du dosage au cours de cette priode. On constate une diminution du CV quel
que soit le niveau de concentration, l'exception des valeurs basses pour lesquelles le nombre de spcimens est
insuffisant. Ailleurs dans le domaine de mesure, les valeurs basses pour lesquelles le nombre de spcimens est
insuffisant. Ailleurs dans le domaine de mesure, les valeurs de CV se situent couramment entre 10 et 20 %.
Figure 3 : volution du CV toutes techniques confondues, sur la priode 1985-1994, pour des spcimens de contrle de
concentrations en TSH voisines.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
En ce qui concerne, prsent, les rsultats de l'opration de juin 1994 (spcimens TP18 et TP19), la figure 4
rcapitule les moyennes exprimes en pourcentage de la moyenne gnrale, et la figure 5 les CV obtenus avec les
principales trousses.
Pour le spcimen TP 19, dont la concentration (5,10 mUI/L) est dans la zone limite des sujets eu- et
hypothyrodiens, les valeurs fournies par les trousses les plus utilises sont, pour la plupart comprises entre 80 et
120% de la moyenne gnrale et les CV interlaboratoires sont pratiquement tous infrieurs 10%.
En revanche, la situation est moins satisfaisante pour le spcimen TP 18, particulirement intressant en raison de
sa concentration en TSH (0,12 mUI/L) qui correspond parfaitement la limite de dtection fonctionnelle d'un
dosage de deuxime gnration. Les carts entre trousses sont importants puisque les valeurs moyennes fluctuent
entre 40 et 170% de la moyenne gnrale. Les valeurs les plus basses, obtenues avec les trousses Q4 et P4, peuvent
s'expliquer par la moindre reconnaissance de la TSH prsente dans le spcimen de contrle par rapport celle
prsente dans l'talon de la trousse, en raison de l'htrognit molculaire. Le mme phnomne se produit avec
les spcimens de patients dont la scrtion de TSH n'a pas subi de stimulation par TRH et n'est pas retrouv sur les
spcimens obtenus aprs injection de TRH (13).
Figure 4 : moyennes de TSH des trousses les plus utilises, exprimes en pourcentage de la moyenne
gnrale, au cours de l'opration de contrle national de juin 1994.
Figure 5 : reproductibilit (CV) interlaboratoire des trousses les plus utilises au cours de l'opration de contrle
national de juin 1994.
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Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
L'examen des CV interlaboratoires permet de se faire une ide de l'appartenance des trousses telle ou telle
gnration de dosages de TSH, mme si leur classification repose sur les CV inter-sries (intralaboratoires). Les
trousses qui fournissent des CV infrieurs ou lgrement suprieurs 20% (SA, AA, DB, SI, QE) sont soit des
trousses de troisime gnration, soit des trousses de deuxime gnration robustes. Les autres trousses, prsentes
comme appartenant la deuxime voire la troisime gnration, peuvent tre considres, au vu de leur CV
interlaboratoire, comme des techniques de deuxime gnration qui ont des performances de premire gnration
dans certains laboratoires en raison des conditions de leur utilisation. Les remarques qui prcdent mritent,
cependant, d'tre tempres pour deux raisons. Tout d'abord, le CV doit tre interprt en fonction de la valeur
moyenne fournie par chaque trousse dans un domaine o son volution est brutale. Ensuite, ces observations
dcoulent d'un seul spcimen de contrle dont la matrice a subi des traitements et, par consquent, peut diffrer de
celle des spcimens de patients.
V. ETAPE PREANALYTIQUE
Les dosages peuvent tre raliss sur srum ou plasma. L'interfrence des anticoagulants doit tre tudie pour
chaque systme. Le spcimen peut tre conserv pendant 24 h aprs le prlvement + 4 C ou plus longtemps 20 C. Il est prfrable d'viter les conglations et dconglations successives.
<70
<30
<10
0,20 4,0
mUI/L
mUI/L
mUI/L
mUI/L
0,15 4,0
mUI/L
- adulte
70
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
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71
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
SOMMAIRE
PREFACE ..
p. 1
p. 2
CHAPITRE 1
- Le Contrle de Qualit National en immunoanalyse. Rflexions aprs onze annes de
fonctionnement .......
p. 3
CHAPITRE 2
- Critres de qualit en immunoanalyse ......
p. 7
p. 16
p. 28
p. 3
CHAPITRE 3
- Antigne carbohydrate 19-9 (CA 19-9) ....
p. 41
p. 48
p. 55
p. 63
72
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
CA H I E R D E
Formation
Biologie mdicale
N 15 : DPISTAGE
DE LA TRISOMIE 21
N 16 : IMMUNO-ALLERGIE (2)
N 17 : VIRUS DES HPATITES
A (VHA) et E (VHE)
N 18 : DOSAGE DES MDICAMENTS
N 18 : TOME II
N 19 : VAGINITES ET VAGINOSES
N 20 : HMOSTASE ET THROMBOSE
N 21 : VIRUS DES HPATITES
B (VHB), DELTA (VDH),
C (VHC), AUTRES
N 22 : SYNDROME
DES ANTI-PHOSPHOLIPIDES
N 23 : PARASITES SANGUINS
N 24 : BIOCHIMIE PEDIATRIQUE
N 25 : LES MOISISSURES
DINTRT MDICAL
BIO F ORM A est la structure nationale qui gre et organise la form ation continue conventionnelle des directeurs et
directeurs adjoints de L.a.b.m. privs.
Cette form ation continue est finance par les trois Caisses N ationales de lAssurance M aladie (C.N.A.M.T.S.,
C.C.M.S.A., et C.A.N.A.M.) dans le cadre de la convention passe entre elles et les trois syndicats de biologistes.
(S.d.B., S.N.M.B., et S.L.B.C.).
A ce titre, BIO F ORM A dite des cahiers de form ation co m m e celui-ci.
Ces ouvrages sont distribus chaque laboratoire danalyse de biologie m dicale, privs et hospitaliers, aux
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sur le site Internet www.bioforma.net partir de 2002.
Ces livres ne sont pas en vente dans le co m m erce et le tirage est de 6 500 exe m plaires.
ISSN : 1293-2892
ISBN : 2-913-633-35-8
Dpt lgal : septembre 2002