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M.A. BAHLAOUI
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SOMMAIRE
Introduction la Microbiologie Prparation et coloration des chantillons La taille, la forme et larrangement cellulaire Organisation de la cellule procaryote Rappels de la chimie des molcules organiques Les besoins nutritifs courants Les besoins en carbone, oxygne et hydrogne
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SOMMAIRE
Les types nutritionnels chez les micro-org. Les besoins en azote, phosphore et soufre Les facteurs de croissance Labsorption des nutriments par la cellule Les types de milieux de culture La morphologie et la croissance des colonies Lisolement des cultures pures
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SOMMAIRE
Micro-organismes et cosystmes aquatiques Lois dinteractions entre micro-organismes Les micro-organismes agents biogochimiques Micro-organismes et eaux naturelles Micro-organismes et eaux dalimentation Les tapes danalyse microbiologique des eaux Les mthodes de dnombrement bactrien
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SOMMAIRE
Les tapes de lidentification bactrienne Les pralables lidentification Les mthodes traditionnelles didentification Lidentification numrique Les bactries tmoins de contamination fcale La recherche et lidentification des germes totaux La recherche et lidentification des coliformes
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SOMMAIRE
La recherche et lidentification des streptocoques La recherche et lidentification des spores Les normes bactriologiques des eaux potables Linterprtation des rsultats danalyse Biodgradation des xnobiotiques Atelier : Systmatique bactrienne Synthse et clture
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GENERAL MICROBIOLOGY. H. G. Schlegel Sixth Edition. Cambridge University Press, 1986 MICROBIOLOGIE DES EAUX DALIMENTATION.
C. Haslay, H. Leclerc Tec. & Doc. Lavoisier, Paris, Londre, New York, 1993
Introduction
1- Quest ce que la microbiologie Qu
Etude dorganismes trop petits pour tre vus lil nu, cest--dire les micro-organismes On classe aujourdhui parmi les micro-organismes :
Les algues et les myctes Les protozoaires Les bactries Les virus
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Introduction
2- Bref historique de la microbiologie
Premires observations : La dcouverte des micro-organismes Premires tudes exprimentales : Le dbat sur la gnration spontane Bases scientifiques de la microbiologie : Origine bactrienne des maladies infectieuses Dcouverte du rle cologique des bactries : Leur effet sur la matire organique Importantes dcouvertes concernant les bactries : Le rgne de la biologie molcualire
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Introduction
2- Bref historique de la microbiologie
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Introduction
2- Bref historique de la microbiologie
Plus tard
Lazzaro spallanzani (1729 1799) Thodore schwann (1810 1882) Georges Friedrich Schroder et autres Origine arienne des contaminations
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Introduction
2- Bref historique de la microbiologie
Naissance de la thorie germinale Un organisme vivant ne peut provenir que dun organisme vivant
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Introduction
2- Bref historique de la microbiologie
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Introduction
2- Bref historique de la microbiologie
Koch (1882)
Lancement du bouillon nutritif et de la glose nutritive
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Introduction
2- Bref historique de la microbiologie
Maladie Charbon Blennorragie Fivre typhode Fi typho Malaria Tuberculose Cholra Chol Diphtrie Dipht Ttanos Diarrhe Diarrh Pneumonie Mningite Fivre ondulante Fi Gangrne gazeuse Gangr Peste Botulisme Dycentrie Dycent Syphilis M.A. BAHLAOUI Agent causant la maladie Bacillus anthracis Neisseria gonorrhoeae Salmonella typhi Plasmodium sp. Mycobacterium tuberculosis Vibrio cholerae Corynobacterium diphteriae Clostridium tetani Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis Brucella sp. Clostridium perfreingens Yersinia pestis Clostridium botulinum Shigella dycenteriae Treponema pallidium FSTM 2006 Scientifique responsable Koch / Pasteur Neisser Eberth Lawran Koch Koch Klebs et Loeffler Nicolaier Escherich Frankel Weischelbaum Bruce Welch et Nuttal Kitasato et Yersin Van Ermengem Shiga Schaudin et Hoffman Date 1876 1879 1880 1880 1882 1883 1883-84 18831885 1885 1886 1887 1887 1892 1894 1896 1898 1905 16
Introduction
2- Bref historique de la microbiologie
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Introduction
2- Bref historique de la microbiologie
Dcouverte du rle cologique des bactries : Leur effet sur la matire organique
Thodore Schwann (1837) Pasteur (entre 1847 et 1857)
La vie ne produit pas de corps symtrique
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Introduction
2- Bref historique de la microbiologie
Dcouverte du rle cologique des bactries : Leur effet sur la matire organique
Sergei Winogradsky (1856 1931)
Dcouverte de loxydation du fer, du soufre et de lammoniaque par les bactries du sol Dcouverte de lincorporation du CO2 par les bactries photosynthtiques Isolement des bactries anarobies du sol et des bactries fixatrices dazote
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2- Bref historique de la microbiologie
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Introduction
2- Bref historique de la microbiologie
Griffith (1928)
Dcouverte de la transformation
Existence de multiples moyens, trs rpandus qui rendent les bactries gntiquement solidaires par un change optimal de gnes qui se produit, de faon courante, dans la nature
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Introduction
3- Domaines et rles de la microbiologie Microbiologie mdicale
Maladies humaines et animales Identification de lagent responsable dune maladie infectieuse Identification de nouveau agents pathognes
Microbiologie agro-alimentaire
Maladies vgtales qui affectent les cultures dimportance alimentaire Transmission des maladies alimentaires (botulisme, salmonelloses) Augmenter la fertilit des sols
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Introduction
3- Domaines et rles de la microbiologie Microbiologie industrielle
Utilisation des micro-organismes pour produire des substances telles que des antibiotiques, des vaccins, des alcools et autres solvants, des vitamines, des acides amins, des enzymes etc
Ecologie bactrienne
Relations entre les bactries et leur environnement Fonctionnement des cycles biogochimiques
immunologie
Fonctionnement du systme immunitaire Mise au point de techniques de production et dutilisation des anticorps
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Introduction
4- Proprits fondamentales des micro-organismes Propri microCaractristiques distinctives des vgtaux et des animaux
Vgtaux
o Le plus souvent fixs o Sensibilit et motilit discrtes o Absorption de gaz et de substances dissoutes o Cellule habituellement avec paroi o Le plus souvent chlorophylliens et autotrophes
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Animaux
o Le plus souvent libres o Sensibilit et motilit prononcs o Ingestion daliments solides o Cellule le plus souvent sans paroi o Non chlorophylliens, non autotrophes
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Introduction
4- Proprits fondamentales des micro-organismes Propri micro-
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Introduction
4- Proprits fondamentales des micro-organismes Propri micro-
Organisation cellulaire
1838 (Schleiden et Schwann) : thorie cellulaire
la cellule est lunit fonctionnelle de tout tre vivant capable de fonctionner de manire autonome
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Introduction
4- Proprits fondamentales des micro-organismes Propri microPrincipales caractristiques distinctives des eucaryotes et des procaryotes Caractristiques Caract
Organisation cellulaire Organisation nuclaire nucl Organites spcialiss sp cialis Type dorganisation d Principaux reprsentants repr
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Eucaryotes
Complexe Noyau vrai Nombreux Unicellulaure Pluricellulaire Coenocytique Algues Myctes protozoaires
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Procaryotes
Simple Appareil nuclaire Rares Unicellulaire
Bactries
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Introduction
4- Proprits fondamentales des micro-organismes Propri microm mm m nm Ordre de grandeur
10-10 10-7 10-4 0,1 1
-4 -7 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
Chlamydomonas
Atomes
Puce
Mouche
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Introduction
4- Proprits fondamentales des micro-organismes Propri micro-
Flexibilit mtabolique
Trs grand nombre de substrats Plusieurs sources dnergie
Potentiel de reproduction
La plus part des bactries se divisent toutes les heures Escherichia coli : 20 minutes Vibrio parahaemolyticus : 10 minutes
Omniprsence et abondance
Les bactries sont ubiquistes La trs grande majorit est utile pour lhomme Intervention dans les cycles biogochimiques
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Distance De travail
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Lame porte-objet
Lame couvre-objet
Air
Huile
d=
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La fixation Procd par lequel les structures internes et externes des cellules et des organismes sont conserves et fixes sur place
Inactive les enzymes qui peuvent dtruire la morphologie cellulaire Durcit les structures cellulaires qui pourraient tre modifies par coloration
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Fixation chimique
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Les colorants et la coloration simple Les colorants ionisables se divisent en deux classes :
Les colorants basiques (cationiques)
Se fixent aux molcules charges ngativement comme les acides nucliques et les protines. Ex. : Bleu de mthylne, Fuchsine basique, Cristal violet, Safranine
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La coloration de GRAM Dveloppe en 1883 par le mdecin danois Christian Gram. Cest la mthode de coloration diffrentielle la plus utilise en microbiologie. Elle permet de diviser les bactries en deux grands groupes : les Gram positives et les Gram ngatives.
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La coloration acido-alcoolo-rsistante Chauffage avec un mlange de Fuchsine basique et de phnol, suivi dun lavage lalcool-acide
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La coloration des capsules Ralise par coloration ngative lencre de chine ou la ngrosine
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La coloration des spores Procd de Shaeffer-Fulton : les endospores sont dabord colores par chauffage des cellules bactriennes avec la safranine, ensuite les cellules sont laves et contre colores au vert de malachite
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La coloration des flagelles Les flagelles sont dabord paissit en les entourant de mordant comme lacide tannique ou lalun de potasse. Elles sont ensuite colores de fuchsine basique (mthode de Gray) ou de pararosaniline (mthode de Leifson)
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Les bactries de forme ronde sont des coques Groupes en chanettes. Ce sont alors en gnrale des streptocoques
STREPTOCOQUES (GRAM +)
Les streptocoques constituent un genre important dans lequel on trouve : Des espces pathognes comme Streptococcus pyogenes esp pathog agents, par exemple dangines rouges d Des espces non pathognes et utilises dans lindustrie laitire : esp pathog utilis laiti les streptocoques lactiques Des espces non pathognes peuplant la muqueuse buccale esp pathog
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Les bactries de forme ronde sont des coques Groupes en amas plus ou moins irrguliers. Ce sont alors des staphylocoques ou microcoques
STAPHYLOCOQUES ET MICROCOQUES (GRAM +)
Les staphylocoques possdent une espce pathogne : poss esp pathog Staphylococcus aureus (ou staphylocoque dor) agent de dor suppurations cutane (pus, anthrax) et de nombreuses autres cutan anthrax infections localises ou gnralises localis g ralis Les autres espces peuvent tre considres comme non esp consid pathognes habitent la peau (Staphylococcus epidermidis) ou le pathog (Staphylococcus epidermidis) cuir chevelu (Staphylococcus capitis). Les microcoques ne sont (Staphylococcus capitis). pas pathognes et peuplent la peau pathog
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Les bactries de forme ronde sont des coques Groupes en amas cubiques. Cest le cas des Sarcines
SARCINA (GRAM +)
Ces bactries, sans pouvoir pathogne, sont trs rpandue dans bact pathog tr r la nature
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Les bactries de forme ronde sont des coques Relies par deux : se sont des diplocoques
LE PNEUMOCOQUE (GRAM +)
Streptococcus pneumoniae est responsable chez lhomme de l pneumonies aigus, de mningites et dinfection de la sphre ORL aigu m d sph
NEISSERIA (GRAM -)
Le genre Neisseria comprends Deux espces pathognes : esp pathog Neisseria gonorrhoeae, agent dune maladie sexuellement gonorrhoeae, d transmissible : la blennorragie. Neisseria meningitidis, agent de redoutables mningites crbromeningitidis, m c brospinales - Des espces non pathognes qui peuplent notre pharynx esp pathog
-
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Les bactries de forme cylindrique sont des bacilles Tailles et groupements variables
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La membrane plasmique La membrane plasmique contient la fois des protines et des lipides en proportions variables. La plus part des lipides membranaires sont structurellement asymtriques, avec un cot polaire et un cot non polaire. Ils sont appels amphipatiques.
Le modle le mieux accept de la structure membranaire est le modle de la membrane en mosaque fluide de S. Jonathon Singer et Garth Nicholson
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Le cytoplasme
Dpourvu dorganites dlimits par une membrane Contient beaucoup deau (70 % de la masse bactrienne) Pas de structure dfinie au microscope lectronique et contient beaucoup de ribosomes La membrane plasmique et tout ce quelle contient = protoplaste
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COOH
Formule gnrale :
R CH NH2
Le carbone qui porte la fonction acide et la fonction amine est un carbone asymtrique. Il en rsulte deux possibilits disomrisation dsignes par les lettres L et D
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Glycine (Gly)
Alanine (Ala)
Valine (Val)
Leucine (Leu)
Isoleucine (Ile)
Phnylalanine (Phe)
Tryptophane (Trp)
Mthionine (Met)
Cystine (Cys)
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Serine (Ser)
Thronine (Thr)
Asparagine (Asn)
Glutamine (Gln)
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Lysine (Lys)
Arginine (Arg)
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4. SINGULIERS
Histidine (His)
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Proline (Pro)
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Les ribosomes
Structures faiblement lies la membrane plasmique Elments complexes (protines et ARN) Rle dans la synthse des protines Lgrement plus petits que les ribosomes des eucaryotes Appeles souvent ribosomes 70 S Elles mesurent 14 15 nm sur 20 nm ; PM = 2,7 Millions Formes de deux (2) sous units : 50 S et 30 S S = unit SVEDBERG (unit du coefficient de sdimentation)
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Le nuclode
Les cellules Eucaryotes : 2 ou plusieurs chromosomes dlimits par un noyau Les Procaryotes : pas de noyau Le chromosome procaryote est circulaire Le nuclode est visible au microscope optique aprs coloration de Feulgen Analyse du nuclode : 60 % dADN Peu dARN Faible quantit de protines Escherichia coli (2 6 mm); le cercle dADN : 1400 mm
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Le nuclode
De nombreuses bactries contiennent des plasmides en plus du chromosome Molcules circulaires ADN double brin Soit indpendant soit li au chromosome Peut tre transmis la descendance Pas ncessaire au dveloppement et la reproduction Peut porter des gnes avantageux Rsistance aux mdicaments Nouvelles possibilits mtaboliques Pathognicit Etc
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La structure du peptidoglycane
Enorme polymre constitu de plusieurs sous units lies entre elles Le polymre contient deux drivs de sucre : La N-actylglucosamine La N-actylmuramique (NAM) Et plusieurs acides amins diffrents Ossature constitue de lalternance de rsidus NAG et NAM Un ttapptide est li au groupe carboxyle de la NAM Les chanes du peptidoglycane sont lies par liaisons interpeptidiques Souvent le groupe carboxyle de la D-alanine terminal est li directement au groupe amine de lacide diaminopimlique
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Souvent plus pais que les fimbriae (9 10 nm de diamtre) Rle dans lappariement des bactries Site de fixation des virus bactrien
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Lendospore bactrienne
Structure spciale, rsistante et dormante Les endospores se dveloppent dans les cellules vgtatives de quelques genres bactriens : Bacillus, Clostridium (bacilles), Sporosarcina (coque) et autres Les endospores sont rsistantes la chaleur, aux UV, la dessiccation et aux substances chimiques Les endospores ont une grandes importance en microbiologie industrielle et mdicale Les endospores reprsentent le moyen de survie au manque deau et dlments nutritifs
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Conclusion
Le nombre de micro-organisme survivant un traitement strilisant dcrot exponentiellement avec le temps Ces rsultats et ces courbes permettent de dfinir le temps de rduction dcimale D.
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111 C : au temps 0 : N0 = 1012 (log N0 = 12) au temps 2 min : N = 1011 (log N = 11) donc D = 2 min
12 101 C : au temps 0 : N0 = 10 (log N0 = 12) au temps 20 min : N = 1011 (log N = 11) donc D = 20 min
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Consquences
Pour la plupart des spores : destruction efficace partir de 120 C On peut quantifier le traitement thermique T units de traitement = t minutes 121 C. t est appel valeur strilisatrice Elle sexprime sans units.
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Lendospore bactrienne
La spore peut tre subterminale, terminale ou centrale La spore est constitue de : Un exosporium : enveloppe dlicate Une tunique : responsable de la rsistance Un cortex : plus de la moiti du volume de la spore Une paroi de la spore : entoure le protoplaste Mcanisme de la rsistance des spores Stabilisation des composs comme lADN grce au complexe acide dipicolinique-calcium Dshydratation du protoplaste grce au cortex Stabilisation accrue des protines cellulaires chez les bactries adaptes une croissance des tempratures leves
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Les macrolments
Les lments majeurs : Carbone, Oxygne, Hydrogne, Azote, Soufre, Phosphore Se sont des constituants des glucides, lipides, protines et acides nucliques Requis des concentrations exprimes en g/l
Les lments mineurs Potassium, Calcium, Magsium et Fer Ils existent dans la cellule ltat de cations Requis des concentrations exprimes en mg/l
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Les oligolments
Manganse, Zinc, Cobalt, Molybdne, Nickel, et Cuivre Ils font partie des enzymes et des cofacteurs Ils aident la catalyse des ractions et au maintien de la structure des protines Requis des concentrations exprimes en g/l
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Prototrophe : micro-organisme qui requiert les mmes nutriments que la plupart des autres membres de son espce
Auxotrophe : mutant prototrophe qui a perdu la capacit de synthtiser un lment essentiel et auquel on doit fournir cet lment ou son prcurseur
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CO2 comme seule ou principale source de C. Molcules organiques prformes rduites Mol pr form r
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La diffusion facilite
Diffusion passive (= diffusion) Les molcules se dplacent dune rgion de concentration leve vers une rgion de concentration faible. Processus peu efficace et peu utilis. Diffusion facilite Processus mdi par des transporteurs membranaires appels permases. Cest une vritable diffusion, les mouvements des molcules travers la membrane est d au gradient de concentration et aucune nergie nest ncessaire.
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La diffusion facilite
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Le transport actif
Cest le transport de molcules contre un gradient de concentration grce lutilisation de lnergie mtabolique. Il ressemble au transport facilit (recours des protines de transport). Les transporteurs ont une spcificit vis vis des molcules. Dans les deux cas (transport passif et actif), des molcules similaires peuvent entrer en comptition avec la mme protine de transport.
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Le transport actif
Le transport actif se caractrise aussi par la saturation des transporteurs des concentrations leves en solut.
Le transport actif diffre de la diffusion facilite par son utilisation dnergie mtabolique et sa capacit concentrer des substances.
Les systmes de transports utilisent des protines spciales localises dans le priplasme des bactries Gram ngatives.
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Le transport actif
Deux sources dnergie sont utilises : LATP ou autres composs riches en nergie Escherichia coli : arabinose, maltose, galactose, ribose, glutamate, histidine, leucine) La force proton-motrice Exemple de systme de transport utilisant la force proton-motrice : la permase du lactose chez E. coli. La permase utilise le symport de protons pour transporter le lactose. Escherichia coli emploi ce systme pour importer des acides amins, des acides organiques (succinate, malate)
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Le transport actif
La force proton-motrice peut contribuer indirectement au transport + actif, souvent par la formation dun gradient dions sodium (Na ) Le gradient de sodium gnr, par le systme antiport de protons, conduit limportation de sucres et dacides amins Chez E. coli, les systmes de transport importent le mlobiose et lacide glutamique quand le sodium est en mme temps vhicul lintrieur de la cellule Les micro-organismes : diversit de systme de transport donc avantage comptitif supplmentaire
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Le transport actif
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La translocation du groupe
Processus au cours duquel une molcule est transfre dans la cellule toute en tant modifie chimiquement
Le plus connu est la phosphotransferase des sucres (PTS) dpendant du phosphonolpyruvate (PEP). Il transfert une varit de sucres dans les cellules procaryotes en les phosphorylant et en utilisant le PEP comme donneur de phosphate
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La translocation du groupe
Le PTS est trs complexe chez Escherichia coli et Salmonella typhimurium. Il est constitu par trois enzymes et une protine thermostable (HPr). Les enzymes II et III sont spcifiques et varient selon les PTS. Lenzyme I et HPr sont communes tous les PTS Les membres des genres Escherichia, Salmonella, Staphylococcus et dautres bactries anarobies facultatives ainsi que des bactries anarobies strictes (Clostridium) possdent des PTS. Escherichia coli et Salmonella typhimurium absorbent le glucose, le fructose, la lactose, le mannitol, le sorbitol et dautres sucres par la translocation du groupe
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La capture du fer
Presque tous les micro-organismes ont besoin du fer pour les cytochromes et de nombreux enzymes. La capture du fer est difficile car les ions ferriques (Fe ) et leurs drivs sont trs insolubles. Beaucoup de bactries et de myctes ont surmonts cette difficult en secrtant des sidrophores. Les sidrophores sont des petites molcules de faible poids molculaire qui complexes les ions ferriques et les fournissent la cellule Exemple de sidrophore : le ferrichrome
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TTC : ajout strilement (5 ml TTC 0,05 % /100 ml) Tergitol : ajout strilement (5 ml de Tergitol 7 0,2 % /100 ml
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Colonies
Jaunes avec halo jaunes Rouges ventuellement avec halo jaunes Rougetres avec halo bleutre
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Autres coliformes
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Quelques dfinitions
Culture pure : population de cellules identiques provenant dune seule cellule Colonie : Ensemble de micro-organismes se dveloppant sur (ou dans) une surface solide comme celle dun milieu de culture glos, souvent visible lil nu, mais pouvant tre microscopique.
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