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p3315 Analyse Des Acides Nucléiques
p3315 Analyse Des Acides Nucléiques
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ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES _______________________________________________________________________________________________________
1. Techniques de préparation
(0)
Glossaire
des acides nucléiques Amorce (également appelée oligonucléotide ou primer) : courte
séquence nucléotidique (15 à 25 bases en général) s’appariant spé-
cifiquement à une séquence cible et permettant l’initiation de la
synthèse d’un brin complémentaire par une polymérase.
Un grand nombre de méthodes sont utilisées pour effectuer
l’extraction des acides nucléiques. Le choix de l’une ou l’autre de Carte de restriction : localisation des sites de clivage par une (des)
ces techniques va dépendre du type cellulaire utilisé (cellules de enzyme(s) de restriction au sein d’un fragment d’ADN.
mammifères, eucaryotes inférieurs, plantes, bactéries, virus...), du
matériel de départ (organe entier, tissu, culture cellulaire, sang...), DNases : enzymes digérant l’ADN.
du résultat escompté (pureté, temps de préparation...) et des Exon : segment d’ADN transcrit et conservé dans l’ARNm.
applications envisagées (PCR, RT-PCR, clonage, marquage d’une
sonde, Southern, Northern blot, protection à la RNase...). Gène : unité héréditaire de l’information correspondant à un seg-
ment d’ADN transcrit en ARN et codant le plus souvent un poly-
peptide.
Haplotype : succession des allèles de plusieurs gènes sur un sec-
1.1 ADN teur chromosomique de petite taille.
Hétéroduplexe : appariement de chaînes polynucléotidiques
Il existe de nombreuses méthodes permettant d’extraire l’ADN : complémentaires, de nature (ADN, ARN) ou d’origine différente
extraction saline, colonnes d’affinité, lysats leucocytaires [1]. (par exemple : deux allèles d’un même gène différant par une
modification nucléotidique).
L’extraction de l’ADN cellulaire de bonne qualité est souvent le
point de départ pour d’autres techniques de biologie moléculaire : Intron : séquence d’ADN transcrite et secondairement éliminée
Southern blot (§ 2.3), amplification par PCR (§ 2.5), construction de par épissage au cours de la maturation des ARN.
banques génomiques... En général, la qualité de l’extraction est Microsatellite : segment d’ADN contenant des répétitions en
appréciée par l’absence d’ARN, protéines, lipides et autres consti- tandem de courts motifs de 1 à 5 pb (le plus typique est le
tuants cellulaires qui pourraient interférer avec les enzymes de doublet (CA)n). Très nombreux et dispersés sur tout le génome, les
restriction, ligases, ADN polymérases. microsatellites sont le siège de variations du nombre de répéti-
tions, génératrices de polymorphismes multialléliques très infor-
La grande taille de l’ADN génomique des mammifères impose matifs, détectables par PCR. Environ 100 000 microsatellites sont
que la méthode d’extraction soit menée avec précaution afin de présents dans le génome humain.
minimiser les chocs mécaniques qui pourraient fragmenter l’ADN
génomique au cours de la préparation. Mutation : désigne n’importe quel changement intervenu dans la
séquence de l’ADN en rapport avec l’expression d’une maladie.
S’il ne concerne qu’une seule base, on parle de mutation ponc-
■ Choix, recueil et conservation du matériel biologique tuelle.
L’étude de l’ADN est menée à partir de tout tissu disponible, frais Polymorphisme : fait référence à l’existence simultanée dans la
ou congelé, y compris à partir de taches de sang séché après population, de génomes présentant des variations alléliques sans
recueil sur papier (« carte de Guthrie »), de frottis buccaux, de rapport direct avec l’expression d’une maladie quelconque.
cheveux mais également de prélèvement de placenta, cellules en
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) : abréviation
culture... Il faut souligner la difficulté et le caractère aléatoire de employée pour désigner les polymorphismes de restriction biallé-
l’extraction de l’ADN à partir de tissus inclus dans la paraffine, le liques de l’ADN.
formol ou le liquide de Bouin (étude post mortem sur des tissus
recueillis en anatomopathologie). Répétitions en tandem : multiples copies en série de la même
séquence.
Habituellement, l’ADN est extrait à partir de sang circulant
recueilli sur anticoagulant (EDTA si possible). Le sang peut alors Ribonucléases (RNases) : enzymes clivant les ARN.
être conservé deux ou trois jours à température ambiante ou éven- SNP (Single Nucleotide Polymorphism) : polymorphisme nucléoti-
tuellement plusieurs mois au congélateur avant extraction de dique biallélique de l’ADN présent tous les 1 000 pb environ.
l’ADN. La quantité de sang nécessaire à la réalisation de l’étude
moléculaire est fonction du type de méthode mise en œuvre. Si Sonde : séquence d’acide nucléique d’au moins 15 nucléotides,
quelques centaines de microlitres peuvent suffire lorsqu’il s’agit de homologue à une séquence d’ADN ou d’ARN, avec laquelle elle
réaliser des analyses par PCR, il faut par contre au moins 5 mL de s’hybride de façon stable et spécifique par réassociation entre
bases complémentaires.
sang pour la réalisation d’un Southern blot.
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[C ] (g · L–1) = (DO λ × facteur de dilution)/ελ De nombreux réactifs commercialisés pour l’extraction de l’ARN
dérivent de cette méthode. La présence d’ADN contaminant la
Pour l’ADN double brin, ε 260 = 20 L · g–1 · cm–1. La concentration préparation des ARN doit être éliminée. En effet, cette contamina-
d’une solution d’ADN est habituellement exprimée en µg /µL. tion peut présenter un problème pour la réalisation de différentes
techniques de biologie moléculaire comme par exemple la PCR où
La mesure de la densité optique à 280 nm permet de s’assurer
l’on pourrait observer une coamplification de l’ADNc et de frag-
de l’absence de contamination significative par les protéines. La
ments génomiques tels que des exons, des rétropseudogènes.
pureté de la solution est estimée par le rapport des absorbances
DO 260 /DO 280 . Un rapport compris entre 1,8 et 2 suggère une Un certain nombre de protocoles permettent de séparer ARN et
contamination protéique minimale. L’ADN purifié se conserve bien ADN en utilisant un gradient de chlorure de césium ou de trifluoro-
à 4 oC. Les successions de congélation-décongélation peuvent acétate de césium et nécessitent donc l’ultracentrifugation. Une
entraîner une dégradation de l’ADN et doivent être évitées. autre approche consiste à précipiter sélectivement l’ADN ou l’ARN
du mélange (éthanol, chlorure de lithium). Monstein et al. (1995)
ont proposé d’effectuer un traitement de l’ARN obtenu par la
1.2 ARN DNase (dénuée de RNase) ce qui nécessite une seconde extraction
phénol/chloroforme.
■ Choix, recueil et conservation du matériel biologique
■ Précipitation de l’ARN
L’ARN peut être recueilli à partir de cellules en culture, fibro-
blastes, lymphoblastes..., de tissus frais lymphocytes, hépatocytes, Comme pour l’ADN, elle est effectuée à l’aide d’éthanol ou d’iso-
cerveau, cœur... fraîchement isolés ou conservés par congélation à propanol. Le culot de précipité est lavé à l’éthanol 70 %. Après
– 80 oC ou dans l’azote liquide. Le facteur important pour obtenir séchage, le culot est repris dans de l’eau stérile (eau pour prépara-
une qualité optimale des ARN extraits est bien évidemment la qua- tion injectable). L’ARN est immédiatement congelé à – 80 oC pour
lité des ARN eux-mêmes présents avant l’extraction dans le tissu sa conservation.
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■ Dosage de l’ARN
La quantification de l’ARN s’effectue par mesure de l’absorbance MW 1 2 3 4 5 6 7
à 260 nm :
[C ] (g · L–1) = (DO 260 × facteur de dilution)/ε260
800 pb
Pour l’ARN, ε 260 = 25 L · g–1 · cm–1. La concentration d’une solu-
tion d’ARN est habituellement exprimée en µg /µL.
500 pb
D’autre part, il est possible de déterminer la pureté de la prépa-
ration d’ARN de deux façons :
— la détermination de l’absorbance de l’échantillon à 260 et
280 nm permettant de caractériser la contamination en protéine de 100 pb
l’échantillon. Un rapport des absorbances DO 260 /DO 280 > 1,8 cor-
respond à un ARN de bonne qualité ;
— l’électrophorèse en gel d’agarose permet une évaluation plus
directe de la qualité de l’ARN. Après électrophorèse puis coloration MW : marqueur de taille.
par le bromure d’éthydium, l’absence de coloration au niveau du
puits de dépôt (c’est-à-dire l’absence d’ADN) et la présence d’ARNr Le produit de PCR a été soumis à une électrophorèse en gel d’agarose
2 %. Le gel est étalonné avec un marqueur de poids moléculaires
28S et 18S doivent être observées. contenant des fragments de tailles connues ce qui permet de
L’ARN est conservé à – 80 oC. Le stockage à long terme de l’ARN déterminer la taille du produit de PCR.
peut nécessiter l’addition d’un inhibiteur de RNase (RNasin, inhibi-
teur isolé du pancréas de bovin).
Figure 1 – Vérification de la qualité de produits d’amplification
par PCR de 302 pb (colonnes 1 à 7)
4 200 à 800
5 80 à 500
8 60 à 400
2.2 Les enzymes
12 40 à 200
20 5 à 100
2.2.1 Enzymes de restriction
Agarose Taille des fragments à séparer
(%, poids/volume) (en kilobases, kb) Il s’agit d’endonucléases de restriction habituellement d’origine
bactérienne. Ces enzymes coupent l’ADN double brin par clivage
0,6 à 0,8 1 à 30 de deux fonctions phosphodiesters au niveau de séquences
0,9 à 1,2 0,5 à 10 nucléotidiques spécifiques (sites de restriction de 4 à 8 pb). Ces
1,2 à 1,5 0,2 à 5 sites correspondent le plus souvent à des palindromes, la
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MspI MspI
EcoRI HaeIII HpaII HpaII
*
5'-G 5'-GG 5'-CC 5'-CC
3'-CTTAA 3'-CC 3'-GG 3'-GG
*
5'-G AATT C-3' 5'-GG CC-3' 5'-C C GG-3' 5'-CC GG-3'
3'-C TTAA G-5' 3'-CC GG-5' 3'-GG CC-5' 3'-GG CC-5'
GG-3' GG-3'
AATTC-3' CC-3'
CC-5' CC-5'
G-5' GG-5'
Figure 2 – Clivage enzymatique à bout collant (EcoRI) ou à bout franc (HaeIII, MspI, HpaII). MspI clive le site de restriction CCGG quel que soit
l’état de méthylation (*) du dimère CpG, son isoschizomère HpaII ne coupe le site CCGG que si la cytosine n’est pas méthylée.
séquence étant identique sur les deux brins lorsqu’elle est lue dans exonucléasiques et permettent d’effectuer le marquage d’ADN en
le sens 5′ → 3′. À titre d’exemple, l’enzyme de restriction EcoRI 3′, la mutagénèse dirigée...
coupe l’ADN au niveau de la séquence GAATTC. La Taq ADN polymérase a été purifiée à partir de Thermus aqua-
Les enzymes de restriction peuvent générer deux types de ticus, eubactérie se développant dans les sources chaudes (80 oC).
coupure : les coupures à bouts francs (blunt ends ) : l’enzyme Il s’agit d’une ADN polymérase ADN dépendante présentant une
coupe au même niveau sur les deux brins d’ADN, ou les coupures activité exonucléase 5′ → 3′ mais dépourvue d’activité de relecture
à bouts collants (cohesive ends) décalés l’un par rapport à l’autre correctrice. Sa remarquable propriété de thermorésistance est à la
sur les deux brins (figure 2). base de son utilisation en PCR (§ 2.5).
Certaines enzymes sont sensibles aux méthylations observées Un certain nombre d’ADN polymérases thermostables ont été
au niveau de certaines cytosines précédant une guanine (dimères extraites d’autres bactéries thermophiles, chacune ayant une parti-
CpG). À titre d’exemple, MspI clive le site de restriction CCGG quel cularité la destinant à un usage particulier : Tli (Thermococcus
que soit l’état de méthylation du dimère CpG central. Son isoschi- litoralis ) et Pwo (Pyrococcus woesei ) ADN polymérases présentant
zomère (enzyme clivant la même séquence nucléotidique) HpaII ne une activité 3′ → 5′ exonucléasique, la Tth ADN polymérase (Ther-
coupe le site CCGG que si la cytosine n’est pas méthylée (figure 2). mus thermophilus ), présentant également une activité de trans-
criptase inverse. Des enzymes dérivant de la Taq polymérase sont
Les facteurs affectant l’activité enzymatique sont : la température également commercialisées, telles que l’AmpliTaq Gold (inactive
(en général, la température optimale est 37 oC), le pH, la force à température ambiante, éliminant ainsi les extensions d’amorces
ionique. hybridées de manière aspécifique) ou le fragment de Stoffel
Les enzymes de restriction sont utilisées pour établir des cartes (dépourvu d’activité exonucléase 5′ → 3′).
de restriction de gènes ou de régions chromosomiques, la réalisa-
■ ADN polymérases ARN dépendantes :
tion de Southern blot, le clonage de gènes, la caractérisation de
transcriptases inverses
mutations, l’étude de l’état de méthylation d’un gène...
Les transcriptases inverses sont codées par le gène pol de
différents rétrovirus.
2.2.2 Polymérases Elles permettent la synthèse d’un ADN complémentaire (ADNc)
■ ADN polymérases ADN dépendantes à partir d’une matrice constituée d’ARNm. Comme toutes les
polymérases, une transcriptase inverse fonctionne dans le sens
Ces enzymes catalysent la formation d’une chaîne d’ADN à par- 5′ → 3′ à partir de l’extrémité OH libre d’une amorce sur laquelle
tir d’une matrice d’ADN monobrin et de l’extrémité 3′OH libre d’un vient se fixer un désoxynucléotide par l’intermédiaire d’une liaison
oligonucléotide (ou amorce) d’environ 20 nucléotides en présence phosphodiester. Différents types d’amorces peuvent être utilisés :
de magnésium (Mg2+) et de dNTPs (déoxynucléotides triphos- oligo-dT s’hybridant sur la queue polyA des ARNm, random hexa-
phates : dATP, dGTP, dCTP et dTTP). mers (combinaisons aléatoires de 6 nucléotides) s’hybridant à dif-
Une ADN polymérase peut catalyser trois types de réactions férents niveaux des ARNm ou oligonucléotide spécifique de
enzymatiques : l’ARNm à étudier.
— activité ADN polymérase nécessitant une matrice ADN copiée ■ ARN polymérases ADN dépendantes
par extension d’une amorce ayant une extrémité 3′OH libre ; Ce sont des ARN polymérases capables d’initier la synthèse
— activité exonucléase 3′ → 5′ de relecture (proofreading ) ayant d’ARN à partir de promoteurs phagiques (T3, T7). Elles permettent
pour but d’éliminer toute base incorporée par erreur dans le brin la synthèse de grandes quantités d’ADNc à partir des séquences
d’ADN en cours de synthèse ; d’ADN liées à ces promoteurs pour des études, par exemple, de
— activité exonucléase 5′ → 3′ ayant pour but d’éliminer les maturation de l’ARNm.
nucléotides à partir de l’extrémité 5′ des ADN double brin.
Plusieurs ADN polymérases sont utilisées en biologie molécu-
laire selon les activités enzymatiques que l’on souhaite mettre à 2.2.3 Autres enzymes
profit.
■ ADN ligases
L’ADN polymérase I d’Escherichia coli présente les trois activités Les ligases assurent la formation d’une liaison phosphodiester
enzymatiques, en revanche le fragment de Klenow, issu de sa entre une extrémité 3′OH libre et une extrémité 5′phosphate de
protéolyse limitée, a perdu l’activité exonucléase 5′ → 3′. L’intro- deux nucléotides. L’ADN ligase d’Escherichia coli ne peut agir que
duction de deux mutations au sein de la séquence codant le frag- si les deux extrémités sont associées de manière cohésive. Elle
ment de Klenow a permis d’obtenir une enzyme dépourvue utilise comme cofacteur le nicotinamide dinucléotide (NAD+).
d’activité exonucléasique employée pour le marquage de sondes L’ADN ligase T4 extraite de bactéries infectées par le phage T4 est
(random priming ). capable d’effectuer des « ligations » entre deux ADN présentant
Les T4 et T7 ADN polymérases isolées à partir des bactériopha- des bouts francs ou des bouts collants. Elle utilise l’ATP comme
ges T4 et T7 présentent des activités polymérasiques et 3′ → 5′ cofacteur.
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Haut PM
Électrophorèse Dénaturation de la sonde double brin
des produits de
digestion
Bas PM
+
Hybridation de la sonde monobrin et
de l’ADN immobilisé sur la membrane
Dénaturation alcaline
9 kb
7 kb
une ADN polymérase ADN dépendante, la Taq polymérase en pré- pond à un rendement idéal de 100 % pour chaque réaction ce qui
sence de Mg2+ et des 4 dNTPs. La Taq polymérase, extraite de la est rarement le cas.
bactérie Thermus aquaticus, présente la particularité d’être ther- En fait, le rendement moyen des réactions d’élongation est de
mostable, de pouvoir fonctionner à haute température (72 oC) et de l’ordre de 50 %. Si l’on appelle X le facteur d’amplification, Y le
supporter le chauffage à 95 oC. Cette première étape double le nom- nombre de copies initiales de la séquence cible et R le rendement,
bre des séquences cibles. on a X = Y (1 + R )n. Chaque cycle dure environ 3,5 min, ce qui
Après cette élongation, le mélange est à nouveau chauffé à 95 oC signifie qu’une amplification peut être effectuée en 2 heures.
pour dénaturer à nouveau l’ADN, puis replacé dans des conditions Ce processus est aisément automatisable, et de nombreuses
d’hybridation. Les oligonucléotides vont à nouveau s’hybrider à machines effectuant les cycles de dénaturation /élongation en
leurs séquences complémentaires et l’ADN polymérase va recopier continu existent déjà. L’utilisation d’une ADN polymérase thermo-
l’ensemble des matrices à partir des amorces, dupliquant ainsi les stable (Taq polymérase) permet d’effectuer les amplifications en
deux séquences obtenues lors de l’étape précédente. Après ces chaîne, sans que l’enzyme soit dénaturée par les très hautes
deux premiers cycles, la séquence recherchée, encadrée par les températures atteintes lors de l’étape de dénaturation. Les élonga-
deux oligonucléotides, aura été synthétisée en quatre exemplaires. tions à température élevée augmentent également le rendement
Après n cycles, la concentration en séquence cible sera multi- de la réaction en supprimant la majorité des structures secondai-
pliée par 2 n. Ainsi, après 30 cycles, le facteur d’amplification sera res de l’ADN, réduisant ainsi d’autant les risques d’arrêt préma-
de 2 30. Cette valeur est cependant purement théorique, et corres- turé de l’ADN polymérase.
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5’ 3’
3’ 5’ ADN double brin
Dénaturation (95 °C)
5’ 3’
ADN simple brin
3’ 5’
3’ 5’
Élongation (72 °C)
5’ 3’
Synthèse de brins
complémentaires
3’ 5’
Dénaturation ( 95 °C)
Hybridation des oligonucléotides ( 55 °C) Cycle 2
Élongation (72 °C)
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’
3’
3’
3’
3’ 5’
Cycle 3
5’ 3’
3’
Cycle 2 à n
3’
3’
3’
3’ 5’
5’ 3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’ 5’
Cycle n
Les rectangles bleu pâle correspondent aux oligonucléotides hybridés lors de chaque cycle. Les fragments néoformés représentés en pointillé correspondent
aux fragments de taille attendue. Au dixième cycle, 98 % des molécules présentes ont une taille identique, déterminée par la position des oligonucléotides.
L’automatisation permet l’enchaînement de plus de 30 cycles en quelques heures.
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490 nm 520 nm
490 nm
Quenching
FAM TAMRA FAM
TAMRA
Polymérisation
Taq polymérase
Activité 5’-3’ exonucléasique
470 nm
470 nm 640 nm
530 nm FRET
FITC
FITC Red
Hybridation
Red
470 nm
530 nm
SG 470 nm
SG SG SG SG
SG
SG
Polymérisation
SG SG SG
a Chimie TaqMan®.
Cette technologie met à profit l’activité 5’→ 3’ exonucléasique de la Taq polymérase. Au cours de la PCR et lors de l’étape d’hybridation, la sonde
doublement marquée est non fluorescente (quenching de la fluorescence du fluorophore rapporteur, FAM, par le fluorophore quencher, TAMRA).
Lors de l’étape de polymérisation la sonde est dégradée par la Taq polymérase. Le fluorophore rapporteur libre émet alors un signal après excitation.
Ce signal de fluorescence est enregistré à la fin de l’étape de polymérisation.
b Sondes d’hybridation.
Lors de l’étape d’hybridation, les deux sondes sont fixées sur le brin matrice et sont séparées par une à trois pb. Après excitation, le fluorophore (FITC)
en 3’ de la première sonde émet une quantité d’énergie capable d’exciter le fluorophore (Red 640) en 5’ de la deuxième sonde.
L’émission du signal à 640 nm est enregistrée à la fin de l’étape d’hybridation.
Figure 5 – Représentation des différents types de fluorescence utilisés pour la PCR en temps réel
■ Il est également possible d’amplifier des séquences d’ARN par ■ Une fois les réactions d’amplification effectuées, il est néces-
RT-PCR en faisant précéder la réaction d’amplification proprement saire dans un premier temps de vérifier la qualité du produit
dite par une réaction de transcription inverse grâce à une transcrip- obtenu ce qui est facilement réalisable après électrophorèse en gel
tase inverse (ou Reverse Transcriptase, RT) qui transforme l’ARN, d’acrylamide ou d’agarose et coloration par le bromure d’éthydium
difficilement manipulable, en ADNc simple brin qui sera recopié au (figure 1, § 2.1). Il est également possible de détecter la séquence
cours du premier cycle d’amplification. On peut citer à titre d’exem- recherchée en utilisant des sondes radioactives ou des sondes
ple la mise en évidence de transcrits illégitimes qui ne peuvent être froides stables selon des technologies immuno-enzymatiques clas-
étudiés par aucune autre technique étant donné leur très faible siques.
niveau d’expression.
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2.7 Séquençage
Les méthodes chimiques de séquençage de l’ADN utilisant les
modifications chimiques spécifiques de base et le clivage secon-
daire de l’ADN ont longtemps été employées (technique de Maxam
Gilbert, 1977).
Actuellement, l’essentiel du séquençage de l’ADN est réalisé
Figure 6 – Principe du séquençage automatique de l’ADN
grâce à la technique enzymatique rapportée par Sanger en 1977. La
utilisant les ddNTPs fluorescents
matrice d’ADN permettant le séquençage est un ADN simple brin
généré à partir d’un produit PCR ou par clonage dans un vecteur adé-
quat (M13) d’un fragment d’ADN génomique ou d’ADNc. La Taq
polymérase réalise la synthèse d’un nouveau brin en présence d’un
oligonucléotide, de dNTPs, de didéoxynucléotides (ddNTPs) La réaction de séquençage est effectuée en utilisant une
analogues aux dNTPs normaux mais différents en ce qu’ils ne concentration en ddNTP nettement inférieure à celle de son ana-
possèdent pas de groupement hydroxyle en position C3′ du logue normal dNTP et la terminaison de chaîne survient au
déoxyribose. Les ddNTPs sont incorporés dans la chaîne d’ADN en hasard au niveau de toutes les positions contenant la base en
croissance en formant une liaison phosphodiester entre leur C5′ et le question. À la fin de la réaction, une collection de fragments
C3′ du nucléotide précédemment incorporé. Le ddNTP incorporé d’ADN de tailles différentes est obtenue avec une extrémité 5′
dépourvu d’hydroxyle en C3′ entraîne un arrêt de la synthèse de la commune (l’oligonucléotide) et une extrémité 3′ variable se ter-
chaîne. minant par un ddNTP.
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Les fragments qui diffèrent en taille, même par un seul nucléo- diffèrent selon que le gène a été ou non cloné, identifié, et que
tide peuvent être séparés par électrophorèse en gel de polyacryla- la mutation en cause est connue ou non. Néanmoins il y a une
mide dénaturant. condition préalable commune à toutes les stratégies : aucune
Les fragments de tailles différentes peuvent être détectés en exploration génomique ne peut être envisagée si la maladie n’a
utilisant des ddNTPs marqués ou des oligonucléotides marqués. pas été déjà solidement diagnostiquée.
Les méthodes traditionnelles de séquençage utilisaient un mar- Il existe deux types de méthodes d’analyse génotypique : les
quage par des radio-isotopes. Ces dernières années, une amélio- méthodes directes qui mettent en évidence la lésion génétique
ration majeure a eu lieu avec le développement de techniques elle-même et les méthodes indirectes qui utilisent des marqueurs
automatisées permettant le séquençage fluorescent de l’ADN. Ces polymorphes.
techniques utilisent des amorces ou des ddNTPs auxquels sont cou-
plées des molécules fluorescentes. Le marquage des 4 ddNTPs par
4 fluorophores différents permet de réaliser le séquençage en une
seule réaction. Les fragments d’extension sont donc marqués en 3.1 Diagnostic direct
3′ par incorporation de ddNTPs fluorescents (dye terminators ). Les
fragments d’extension sont séparés par électrophorèse sur gel de La mise en évidence d’une lésion génomique est de difficulté
polyacrylamide. En cours d’électrophorèse, des données brutes variable selon la nature du gène et le type de lésion. Dans tous les
sont générées dans l’appareil de séquençage semi-automatique cas, pour explorer directement un gène, il faut disposer d’une
par la détection en temps réel des fragments fluorescents résultant sonde clonée spécifique de ce gène (sonde d’ADN génomique
de la réaction de séquençage après excitation des fluorophores par cloné ou d’ADNc) ou en connaître la séquence normale, soit pour
un laser bichromatique. Les signaux de fluorescence sont ensuite synthétiser une oligosonde spécifique, soit pour amplifier par PCR
digitalisés puis transmis à une unité informatique qui permet le segment génomique où siège la lésion.
l’enregistrement, le traitement et enfin le stockage des données
brutes. Après traitement, les données de la séquence sont visua-
lisées ou imprimées sous forme d’électrophorégramme (figure 6). 3.1.1 Détection de mutations connues
■ Les différents types de mutations
La pathologie moléculaire d’un gène connu recouvre l’ensemble
3. Application à l’analyse des mécanismes qui peuvent conduire à l’extinction ou à la modi-
fication de son expression. Ces mécanismes vont dépendre de la
moléculaire : l’identification nature de la mutation de la séquence nucléotidique de ce gène
(figure 7). Ces mutations peuvent être classées de la façon sui-
des mutations vante.
● Mutations ponctuelles
Depuis l’avènement de la PCR, de nombreuses stratégies dia- Elles sont constituées par le remplacement d’un nucléotide par
gnostiques se sont développées dans le but d’identifier les muta- un autre. Leur effet dépend de leur localisation au sein du gène.
tions à l’origine de pathologies héréditaires. Ces stratégies Elles peuvent se produire :
Site d’initiation
de la traduction
Site d’initiation
de la transcription
Séquences en amont STOP Site de
ATG polyadénylation
CAAT TATA
5’ 3’
5’UTR 3’UTR
anomalie de la polyadénylation
mutation du codon stop
absence d’épissage
site 3’ alternatif d’épissage
site 5’ alternatif d’épissage
absence d’épissage
mutations faux sens, non sens, décalage du cadre de lecture, site alternatif d’épissage
anomalie de l’initiation de la traduction
modification quantitative de l’expression
Les exons sont représentés par des rectangles bleus et séparés par les introns.
Une partie du premier et du dernier exon est non codante : UTR (UnTranslated Region)
Figure 7 – Principales mutations ponctuelles pouvant toucher un gène et leurs conséquences (d’après [2])
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Autoradiographie Autoradiographie
Figure 9 – Principe de la détection d’une mutation ponctuelle par oligosonde de synthèse (méthode dite ASO) (d’après [2])
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■ Séquençage direct
■ Analyse du polymorphisme de conformation de l’ADN Lui seul permet l’identification de la mutation. Il peut bien
simple brin (SSCP : Single-Strand Conformational Poly- entendu être utilisé dans tous les cas de figure mais peut se
morphism) révéler particulièrement lourd pour des gènes de grande taille et
des pathologies présentant une hétérogénéité allélique impor-
Elle repose sur le principe suivant : lorsqu’un segment d’ADN tante.
double brin est dénaturé par la chaleur puis refroidi brutalement,
les brins restent séparés. Si on les soumet ensuite à une électro-
phorèse non dénaturante, chaque brin se renature sur lui-même et
prend une conformation spécifique dépendant de sa séquence
nucléotidique et conditionnant sa migration électrophorétique. Une 3.2 Diagnostic indirect, utilisation
variation de séquence aussi minime qu’une mutation ponctuelle de marqueurs polymorphes de l’ADN
peut se manifester par une différence de conformation et donc de
migration électrophorétique par rapport à une séquence de réfé-
rence. Le diagnostic indirect par analyse de liaison avec des marqueurs
Les techniques SSCP et DGGE sont capables de révéler une polymorphes est envisagé lorsque la mutation causale n’est pas
variation de séquence dans un produit d’amplification. En cas de connue et dans la mesure où l’on connaît précisément la localisa-
résultat positif, il faudra analyser la séquence pour positionner et tion chromosomique du gène en cause. La mise en œuvre de cette
identifier la mutation. méthode suppose l’existence d’une certitude diagnostique absolue
et l’absence d’hétérogénéité génique de la maladie.
■ Analyse des hétéroduplexes Le principe du diagnostic indirect consiste à distinguer le chro-
mosome porteur du gène pathologique de son homologue normal,
Certaines mutations, en particulier les microdélétions et les non plus par détection de la lésion génomique elle-même, mais
micro-insertions, génèrent après PCR des hétéroduplexes dont la par l’étude de marqueurs localisés au voisinage de celle-ci, à une
conformation est telle qu’ils deviennent visibles après électro- distance génétique faible et connue, voire à l’intérieur du gène en
phorèse en gel non dénaturant. Par ailleurs, il existe sur le marché question. Lorsque les distances génétiques entre gène et marqueur
des gels beaucoup plus discriminants que les simples gels d’acry- sont importantes, il existe un risque de recombinaison entre le site
lamide et qui permettent de séparer les hétéroduplexes dus à de polymorphe et le site muté.
simples mutations ponctuelles.
Cette méthode fait donc appel à des marqueurs génotypiques
■ Chromatographie liquide haute performance dénaturante tels que les polymorphismes de restriction (RFLP), les minisatel-
(DHPLC) lites, les microsatellites, les polymorphismes nucléotidiques
(Single Nucleotide Polymorphism, SNP). Ces marqueurs sont dif-
Les produits de PCR sont soumis à une chromatographie liquide férents d’un individu à l’autre et sont transmissibles à la descen-
haute performance dénaturante en phase inverse par formation de dance.
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D7S 518 c a c b
6,8 cM
D7S 501 a d c b
0,9 cM
D7S 2459 b c a b
E3 0,8 cM
D7S 692 b a b a
110 pb
102 pb
90 pb
c b a b
a b d b
b b c b
b a a a
Il s'agit du diagnostic prénatal de la maladie de Duchenne à l’aide Des marqueurs microsatellites liés au gène E3 (dihydrolipoamide
d’un microsatellite situé dans la région promotrice du gène de la déshydrogénase localisé en 7q31-32) ont été amplifiés à partir d’ADN
dystrophine. Le fœtus porte le même allèle (102 pb) que son provenant d’un sujet atteint de déficit en E3, de ses parents, et d’ADN
oncle maternel myopathe (d'après [2]). fœtal recueilli par biopsie de trophoblaste. La comparaison des
haplotypes parentaux avec celui du cas index permet de déduire la
a diagnostic prénatal de maladie génétique récessive liée au « phase génétique ». L’allèle muté est porté par le chromosome marqué
chromosome par méthode indirecte en gras. Dans la mesure où le fœtus a reçu le chromosome portant
l’allèle morbide de sa mère et le chromosome portant l’allèle sain de
son père, il est donc hétérozygote pour la maladie.
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