Incertitude Microbio

AFNOR
Membres de la Commission T90D
Lille, le 17 février 2006

Vos Réf. : -
Nos Réf. : C/PG/PG/06021475
Objet : Projet de norme « incertitude de mesure » version du 17/02/06
Chère Madame, Cher Monsieur,
En vue de notre réunion du mardi 21 mars 2006, je vous prie de trouver la dernière version de
notre projet de norme relative à l’estimation de l’incertitude de mesure dans le domaine de l’analyse
microbiologique de l’eau.
Comme vous pourrez le constater, la rédaction du document avance rapidement.
Certes, certaines parties restent à rédiger et d’autres à améliorer (notamment l’annexe C), mais
l’ensemble prend forme.
D’ici le 21 mars, des modifications et compléments seront encore apportés. Je vous les
communiquerai dès que possible.
Je vous souhaite bonne lecture et vous invite à faire parvenir vos questions éventuelles à
Madame Thomas.
Le Directeur d’AGLAE,
Philippe Guarini
PS : Les numéros de page indiqués dans le sommaire ne sont pas justes (ne pas en tenir compte); la
numérotation des annexes ne démarre pas sur « A » (en revanche, les renvois dans le texte sont justes).
1/1
Association Générale des Laboratoires d’Analyse de l’Environnement

Organisme accrédité d’Essais Interlaboratoires dans le domaine de l’analyse de l’environnement
(Portées communiquées sur demande)
Association loi 1901 à but non lucratif, déclarée en Préfecture du Nord (59) n° 5/28900,
e
et parue au J.O. du 13 /4/1994 (126 année n°15) – SIRET 397 997 594 00023 - APE 743B.
Adresse postale : 24, boulevard Jean-Baptiste Lebas 59000 LILLE

Tél : 03 20 16 91 40 Fax : 03 20 16 91 40 @ : aglae@nordnet.fr
Eaux – Microbiologie
Qualité de l'eau
Protocole d'estimation de l'incertitude de mesure associée

à un résultat d'analyse pour les méthodes de
dénombrement microbiologiques
Correspondance A la date de publication du présent document, il n'existe pas de travaux

européens ou internationaux traitant de ce même sujet.
Analyse Le présent document fournit un protocole pour estimer l'incertitude de mesure

associée à un résultat d'analyse microbiologique.
Ce document ne s'applique pas à l'évaluation de l’incertitude de mesure pour
les méthodes de dénombrement indirect (notamment les méthodes dites
« rapides ») ni pour les méthodes de recherche qualitative (présence/absence).
Descripteurs Thésaurus International Technique: eau, essai des eaux, analyse

microbiologique, test statistique
Modifications
Corrections
Avant-propos national
Références aux normes françaises

La correspondance entre les normes mentionnées à l’article «Références normatives» et les normes
françaises identiques est la suivante :
ISO/TR 13843:2000 : FD ENV ISO 13843 (indice de classement : T 90-460)

ISO 3534-1 : NF ISO 3534-1 (indice de classement : X 06-002-1)
ISO 5725-1 : NF ISO 5725-1 (indice de classement : X 06-041-1)
ISO/TS 21748:2004 : FD ISO/TS 21748 (indice de classement : X 06-067)
Norme incertitude microbio. - version du 17/02/06 1/37

Sommaire
Page
Introduction 3/
1 Domaine d'application 4/
2 Références normatives 4/
3 Définitions et symboles 4/
3.1 Définitions d’ordre général 4/
3.2 Définitions répondant plus spécifiquement aux besoins de la présente norme 6/
3.3 Définitions et symboles statistiques 6/
4 Considérations préliminaires 8/
4.1 Méthode microbiologique validée 8/
4.2 Méthode sous contrôle qualité 8/
4.3 Pré-requis pour l’application de la présente norme 9/
5 Méthodologie 9/
5.1 Rédaction d’un dossier d’estimation de l’incertitude 9/
5.2 Identifier et décrire la méthode de dénombrement 10/
5.3 Lister les facteurs sources de variabilité 10/
5.4 Réaliser l’approche quantitative de l’incertitude de mesure 11/
6 Mise en œuvre pratique de l’approche globale 14/
6.1 Recherche de l’expression de CV Poisson2 14/
6.2 Exploitation des cartes de contrôle 15/
6.3 Collecte des données disponibles auprès des organisateurs d’essais interlaboratoires 20/
6.4
Annexe C Principaux paramètres microbiologiques de l’analyse de l’environnement

Annexe D Exemple de dossier d’estimation de l’incertitude
Annexe E Table des fractiles de la loi du χ2 : χ ddl

2
;p
Bibliographie

Avant propos
La microbiologie de l’environnement est une microbiologie quantitative : pour la prévention

d’épidémies en particulier, le problème n’est pas uniquement de savoir s’il y a présence de germes
dans l’eau, mais de savoir combien ; ceci pour évaluer les risques et prendre les décisions appropriées
par comparaison entre le résultat et une limite réglementaire.
La pertinence de cette comparaison nécessite que l’incertitude soit prise en compte.
La norme NF EN ISO/CEI 17025 demande d’ailleurs d’évaluer l’incertitude de mesure dans les
laboratoires d’analyses. Mais cette question ne concerne pas que les laboratoires. C’est l’affaire de
tous les intervenants et un accord entre client et fournisseur est nécessaire.
Ainsi, tout donneur d’ordre devrait clairement spécifier ses attentes dans ce domaine.
Un autre intervenant, le législateur, doit préciser explicitement s’il a inclus l’incertitude de mesure
dans le facteur de sécurité qui détermine la valeur réglementaire, auquel cas il n’y a plus lieu de le
reprendre en compte au moment de la décision de gestion. C’est encore plus clair si le législateur écrit
« en aucun cas le résultat de dénombrement ne doit dépasser n germes dans les x ml analysés ».
Le caractère particulaire des microorganismes et leur répartition aléatoire même dans des eaux
parfaitement homogénéisées, obligent à des considérations statistiques et limitent inexorablement la
précision des dénombrements.
Aussi, de manière à réduire l’incertitude le client devra parfois envisager de faire réaliser plusieurs
mesures. En effet, dans certains cas l’estimation statistique ne permet pas de prendre de décision parce
que la différence avec la valeur réglementaire n’est pas significative. La réalisation de mesures
répétées ou de séries de mesures permet alors d’affiner l’estimation de la concentration microbienne.
Dans d’autres cas, c’est un biais, ou écart à la valeur vraie, qui est redouté (par exemple interférence
de certains éléments de la microflore de l’échantillon sur le mesurande) et là encore des mesures
répétées sont nécessaires, mais en modifiant la méthode ou en associant plusieurs laboratoires.
A l’incertitude au sens restreint (précision), s’ajoute enfin une incertitude (au sens commun) qui peut
être largement prépondérante et consiste en biais. En effet, les microorganismes présentent dans les
eaux différents états physiologiques (cultivables, stressés, revivifiables, … surtout dans les eaux
oligotrophes ou désinfectées) qu’il faut distinguer sous peine de biais importants.

Introduction
L’objet de la présente norme est de fixer la démarche à suivre pour procéder à l’évaluation de
l’incertitude de mesure dans le domaine de l’analyse microbiologique de l’eau.
Avant de décrire les modalités du travail à accomplir, il convient de rappeler plusieurs points :
Tout d’abord, l’analyse microbiologique classique se démarque de l’analyse chimique par le
fait qu’il s’agit d’un dénombrement.
Il en résulte que la représentation de la dispersion des données dans ce domaine nécessite
d’utiliser des lois statistiques spécifiques, différentes de celles appliquées en chimie : loi de
Poisson et loi binomiale négative au lieu de la loi normale.
Par ailleurs, l’analyse microbiologique pour les besoins du contrôle sanitaire ou de la police
des eaux s’inscrit dans un contexte réglementaire où les limites de qualité sont le plus
souvent du type « absence de germes dans la prise d’essai analysée ».
Tout l’enjeu de traiter cette question de l’incertitude de mesure réside donc le plus souvent
dans l’évaluation d’une limite de détection objective.
Enfin, connaître l’incertitude de mesure c’est pouvoir substituer a priori à un résultat
observé l’intervalle de confiance sur lequel la valeur vraie du paramètre a toutes les chances
de se trouver (au seuil de confiance de 95% ou 99% généralement).
Il s’agit donc de ne pas s’en tenir à connaître la fidélité du dénombrement (étroitesse de
l’accord de mesures répétées sur un même matériau) ainsi que ses fluctuations sur la gamme
de travail de la méthode, mais bien d’en déduire les limites de confiance liées à l’observation
d’un résultat donné. Ceci intégrant autant que faire se peut les biais et l’état physiologique
des microorganismes ciblés par l’analyse.
Compte tenu de ces éléments, seule la méthodologie décrite dans la norme ISO/TR 13843:2000
permet aujourd’hui d’apporter une réponse complète et constructive à la problématique posée.
La présente norme s’appuie donc largement sur ce texte normatif, en particulier pour l’exploitation
statistique des données expérimentales.

1. Domaine d'application
Les définitions et procédures de travail décrites dans le présent document s’appliquent à toute méthode
de dénombrement de microorganismes dans les eaux, qu’elle soit de type énumératif (comptage de
colonies sur boîtes de Petri) ou de type quantique (technique dite du «Nombre le Plus Probable»).
Elles peuvent également être appliquées à d’autres méthodes de comptage d’entités discrètes ; ceci
dans le domaine de l’analyse microbiologique de l’environnement, voire d’autres secteurs d’activité.
En revanche, la présente norme ne s’applique pas aux méthodes de recherche (résultat qualitatif, du
type « présence/absence »). Elle ne s’applique pas d’emblée aux méthodes indirectes (ATP-métrie,
PCR, impédance-métrie, …).
2. Références normatives
Ce document comporte par référence datée ou non datée des dispositions d'autres publications. Pour
les références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition
du document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 3534-1, Statistique – Vocabulaire et symboles – Partie 1: Probabilité et termes statistiques

généraux.
ISO 5725-1, Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure. Partie 1: Principes
généraux et définitions.
NF X07-001, Normes fondamentales – Vocabulaire international des termes fondamentaux et

généraux de métrologie.
ISO/TR 13843:2000, Qualité de l'eau – Lignes directrices pour la validation des méthodes
microbiologiques.
ISO/TS 21748:2004, Lignes directrices relatives à l’utilisation d’estimations de la répétabilité, de la

reproductibilité et de la justesse dans l’évaluation de l’incertitude de mesure.
3. Définitions et symboles
Pour les besoins du présent document, les définitions et symboles suivants s'appliquent.
3.1 Définitions d’ordre général
3.1.1 Mesurande
Grandeur particulière soumise à un mesurage.
[NF X07-001]
NOTE 1 Dans le cadre d’une analyse microbiologique, le mesurande est le germe ou l’ensemble de germes
ciblé (par exemple Pseudomonas aeruginosa ou les entérocoques intestinaux).
3.1.2 Exactitude d’un mesurage

Etroitesse de l’accord entre le résultat et la valeur de référence acceptée.
NOTE 2 Le terme «exactitude», appliqué à un ensemble de résultats d’essai, implique une combinaison de
composantes aléatoires et une erreur systématique commune ou une composante de biais.

[ISO 3534-1]
NOTE 3 A défaut de valeur théorique ou établie sur des principes scientifiques (SI), en microbiologie la
valeur de référence acceptée peut-être :
- une valeur assignée arbitraire, éventuellement certifiée, fondée sur les travaux expérimentaux d’une
organisation nationale ou internationale ;
- une valeur de consensus, éventuellement certifiée, fondée sur un travail expérimental en collaboration et
placé sous les auspices d’un groupe scientifique ou technique identifié ;
- l’espérance mathématique de la quantité mesurée, c’est-à-dire la moyenne observée d’une population
spécifiée de mesures, choisie pour sa représentativité.
3.1.3 Fidélité
Etroitesse d'accord entre les résultats d'essais indépendants obtenus sous des conditions stipulées.
NOTE 4 La fidélité dépend uniquement de la distribution des erreurs aléatoires et n'a aucune relation avec la
valeur vraie ou la valeur spécifiée.
[ISO 3534-1]
3.1.4 Répétabilité
Etroitesse de l’accord entre les résultats des mesurages successifs de la même quantité, effectués dans
les mêmes conditions de mesurage.
[ISO/TR 13843:2000]
3.1.5 Reproductibilité
Etroitesse de l’accord entre les résultats des mesurages de la même quantité, effectués dans des
conditions de mesurage variables.
[ISO/TR 13843:2000]
3.1.6 Justesse
Etroitesse de l'accord entre la valeur moyenne obtenue à partir d'une large série de résultats d'essai et
une valeur de référence acceptée.
[ISO 3534-1]
3.1.7 Biais
Différence entre l'espérance mathématique des résultats d'essais et la valeur de référence acceptée.
NOTE 5 Le biais est une erreur systématique totale par opposition à l'erreur aléatoire. Il peut y avoir une ou
plusieurs composantes d'erreurs systématiques qui contribuent au biais. Une différence systématique importante
par rapport à la valeur de référence acceptée est reflétée par une grande valeur du biais.
[ISO 3534-1]
3.1.8 Incertitude de mesure

Paramètre, associé au résultat d'un mesurage, qui caractérise la dispersion des valeurs qui pourraient
raisonnablement être attribuées au mesurande.
[NF X07-001]

3.2 Définitions répondant plus spécifiquement aux besoins de la présente norme
3.2.1 Méthode microbiologique validée

Méthode d'analyse microbiologique dont les caractéristiques de performance ont été vérifiées selon les
lignes directrices de caractérisation et validation décrites dans la norme ISO/TR 13843:2000.
3.2.2 Résultat d’une analyse microbiologique

Valeur la plus probable de la charge microbienne du matériau soumis à analyse, résultant de la mise en
œuvre d’une analyse microbiologique validée sur un échantillon représentatif.
NOTE 6 Le résultat d’une analyse microbiologique s’exprime en nombre de germes par unité de volume ; par
exemple, 1.200 Legionella pneumophila par litre. Il en résulte qu’il n’est aucunement absurde d’avoir un résultat
présentant des chiffres après la virgule. Sans considération sur la significativité des chiffres après la virgule, 12,3
germes par 100 millilitres (par exemple) est rigoureusement égal à 123 germes par litre.
3.2.3 Prise d'essai

Volume d’échantillon sur lequel on procède à un dénombrement élémentaire ou une recherche
élémentaire du germe ciblé.
NOTE 7 Le résultat d’une recherche élémentaire est binaire : présence / absence du germe ciblé dans la prise
d’essai considérée. Le résultat d’un dénombrement élémentaire est un entier naturel : 0, 1, 2, … germes ciblés
dans la prise d’essai considérée.
3.2.4 Méthode de dénombrement de type énumératif ou méthode énumérative

Méthode d'estimation de la charge bactérienne par ensemencement d’une ou plusieurs prises d’essais
sur milieux gélosés (dénombrements élémentaires).
Les prises d’essais de l’échantillon analysé sont ensemencées sur milieux gélosés ; soit directement
par incorporation (inoculum mélangé au milieu gélosé en surfusion) ou par étalement (en surface d’un
milieu gélosé solidifié) ; soit indirectement après une étape de concentration (filtration sur membrane
par exemple).
Après incubation, les colonies développées sont comptabilisées pour déterminer le résultat d’analyse.
3.2.5 Méthode de dénombrement de type quantique ou méthode quantique

Méthode d'estimation de la charge bactérienne par ensemencement de plusieurs prises d’essais de
l’échantillon analysé ; ceci sur milieu de culture liquide (recherches élémentaires).
Après incubation, les cultures positives sont comptabilisées. La détermination de la charge bactérienne
du matériau passe par le calcul du nombre le plus probable (NPP). [1] et [2]
3.2.6 Série analytique

Ensemble de mesures successives réalisées sur une même chaîne analytique, et dans des conditions
suffisamment stables pour que l’on puisse les considérer comme des conditions de répétabilité.
3.2.7 Limite de détection

Limite supérieure de l’intervalle de confiance du résultat nul (absence des germes ciblés lors de
l’analyse).
NOTE 8 La limite inférieure est évidemment l’absence totale des germes ciblés dans le matériau testé.
3.3 Définitions et symboles statistiques
3.3.1 Moyenne arithmétique m

Soient n valeurs notées xi, i variant de 1 à n : x1, x2, x3, …, xn. La moyenne arithmétique de ces n
valeurs se calcule de la façon suivante :

n
∑x i
m= i =1
3.3.2 Variance s2 (et écart-type s)

Soient n valeurs notées xi, i variant de 1 à n : x1, x2, x3, …, xn. La variance de dispersion de ces n
valeurs se calcule de la façon suivante :
n
∑ (x i − m) 2
s2 = i =1
( s= s2 )
n −1
3.3.3 Distribution de Poisson

Distribution entièrement aléatoire des nombres de particules lors de l'échantillonnage d'une suspension
parfaitement homogénéisée.
[ISO/TR 13843:2000]
NOTE 9 La loi de Poisson se caractérise par une moyenne arithmétique égale à la variance.
Soient n valeurs distribuées selon une loi de Poisson de paramètre µ. A condition que n soit suffisamment grand,
on peut vérifier que :
m = s2 = µ
Le dénombrement répété n fois d’une suspension microbienne idéalement homogénéisée contenant µ germes par
prise d’essai, génère un ensemble de n valeurs vérifiant l’équation ci-dessus. Ceci à condition que l’exactitude du
dénombrement soit absolue.
[10]
3.3.4 Distribution binomiale négative

Distribution statistique particulière «surdispersée » des comptages.
[ISO/TR 13843:2000]
NOTE 10 La loi binomiale négative présente une variance supérieure à la moyenne arithmétique.
s2 > m
Elle représente efficacement la distribution de dénombrements répétés plus dispersés que prévu par la loi de
Poisson.
[10]
3.3.5 Surdispersion
Variation excédentaire du caractère aléatoire de Poisson.
NOTE 11 Elle est détectée qualitativement par l'indice de dispersion k et mesurée quantitativement lors de
l'estimation du paramètre u (facteur de surdispersion) de la distribution binomiale négative.
[ISO/TR 13843:2000]
3.3.6 Indice de dispersion k

Soit un ensemble de n résultats provenant du dénombrement répété d’une suspension bactérienne.
L’indice de dispersion k de cet ensemble de résultats se calcule de la façon suivante :
s2
k=
m

Si k n’est pas significativement différent de 1, la distribution des résultats est généralement bien
représentée par une loi de Poisson. Si k est significativement supérieur à 1, alors il faut passer à une loi
binomiale négative.
NOTE 12 Il peut s’avérer que k soit significativement inférieur à 1. Cette situation est anormale ; elle
témoigne le plus souvent d’un défaut de justesse dans la méthode de dénombrement : rendement du milieu de
culture utilisé insuffisant, généralement.
3.3.7 Coefficient de variation CV

Ecart-type relatif.
Pour un caractère non négatif, rapport de l’écart-type à la moyenne.
[ISO 3534-1]
s
CV =
m
3.3.8 Facteur de surdispersion u

Incertitude aléatoire supplémentaire de la détermination excédentaire de la distribution de Poisson,
mesurée en termes d’écart-type relatif.
[ISO/TR 13843:2000]
Par extension, le facteur de surdispersion u2 est l’incertitude aléatoire supplémentaire de la

détermination excédentaire de la distribution de Poisson, mesurée en termes d’écart-type relatif au
carré.
Soit un ensemble de n résultats provenant du dénombrement répété d’une suspension bactérienne.

L’indice de dispersion k de cette série de données est significativement supérieur à 1. Le facteur de
surdispersion u est défini par l’équation suivante :
s2 1 1
CV 2 = 2
= k ⋅ = + u2
m m m
NOTE 13 Il en résulte que la variance de la loi binomiale négative à utiliser pour représenter la distribution
des n valeurs obtenues est donnée par :
s 2 = m + m2 ⋅ u 2
4. Considérations préliminaires
L’estimation de l’incertitude de mesure associée à un résultat d’analyse pour les méthodes de

dénombrement microbiologiques n’a de signification que pour les méthodes microbiologiques
validées placées sous contrôle qualité.
4.1 Méthode microbiologique validée
Au sens de la norme ISO/TR 13843:2000, « la validation est un processus qui permet de démontrer
qu’une méthode remplit la fonction à laquelle elle est destinée : détecter ou quantifier un microbe ou
un groupe microbien donné avec la fidélité et l’exactitude requises ».
Deux types de validation sont prescrits :

- une validation primaire, décrite dans la norme ISO/TR 13843:2000 comme un « processus
exploratoire dont l’objectif est de déterminer les limites opérationnelles et les caractéristiques
de performance d’une méthode nouvelle, modifiée ou insuffisamment détaillée » ;

- une validation secondaire, dont le principal objectif est « de réunir les informations permettant
de démontrer que le laboratoire est en mesure de répondre aux spécifications déterminées lors
de la validation primaire » ; toujours selon la norme ISO/TR 13843:2000.
En pratique, toute méthode normalisée est censée avoir subi une validation primaire attestant de sa
fiabilité.
En revanche, une validation secondaire s’impose à tout laboratoire désireux de réaliser l’analyse d’un
nouveau paramètre microbiologique. Il s’agit de prouver que le laboratoire a su s’emparer de la
méthode (sur le plan technique) et qu’il produit des résultats satisfaisants.
4.2 Méthode sous contrôle qualité
La permanence de la qualité des résultats produits est, après la validation de la méthode de

dénombrement, la seconde préoccupation à laquelle tout laboratoire d’analyses doit s’attacher.
En effet, avant de produire des résultats il convient d’avoir résolu les problèmes principaux d’erreur
systématique. Mais il convient aussi de s’être prémuni contre toute dérive éventuelle, ainsi que contre
toute source d’erreur cachée.
Pour cela le laboratoire doit mettre en place un contrôle de qualité analytique opérationnel,
comprenant :
- un contrôle interne (cartes de contrôle, contrôle des consommables, habilitation du personnel,
…) ;
- un contrôle externe (essais interlaboratoires).
De nombreux documents traitent du contrôle de la qualité analytique des méthodes microbiologiques

([ISO/TR 13843:2000], [3], [4], [5], [6], …). Aussi, ces considérations essentielles ne sont-elles pas
reprises dans le présent document ; exception faite des cartes de contrôle, desquelles on peut tirer des
informations pertinentes pour l’estimation de l’incertitude de mesure.
4.3 Pré-requis pour l’application de la présente norme
Préalablement à toute tentative d’évaluation de l’incertitude de mesure conformément à la présente

norme, il est considéré que les laboratoires disposent d’un programme d'assurance de la qualité interne
et externe, et qu’ils mettent en œuvre une méthode satisfaisant aux exigences de validité spécifiées
dans la norme ISO/TR 13843:2000.
5. Méthodologie
Trois ou quatre étapes successives doivent être réalisées pour estimer efficacement l’incertitude de
mesure associée à un résultat d’analyse pour une méthode de dénombrement microbiologique :
- identifier la méthode et la décrire ;
- cerner les facteurs sources de variabilité ;
- évaluer quantitativement l’incertitude par une approche « globale » ;
- le cas échéant procéder par une approche « incertitude combinée ».
Chacune de ces étapes doit être documentée dans un dossier d’estimation de l’incertitude.
5.1 Rédaction d’un dossier d’estimation de l’incertitude
Toute estimation de l’incertitude de mesure dans le domaine couvert par la présente norme doit faire
l’objet d’un dossier détaillé.
Celui-ci doit être rédigé dans le double objectif :

- d’assurer la traçabilité de la démarche dans le système d’assurance qualité du laboratoire ;
- mais aussi de servir de support de communication de l’information.
En effet, les valeurs d’incertitude obtenues par application de la présente norme ne portent pas
individuellement sur les différents résultats produits par le laboratoire. Elles ne doivent donc pas être
portées sur les bulletins d’analyses.
Plus modestement, les valeurs d’incertitude obtenues visent à relativiser la portée de l’analyse
considérée ; ceci essentiellement pour des besoins de gestion de risque (risque sanitaire par exemple).
L’information doit être tenue à disposition des clients ; ceci sous une forme simple et explicite.
5.2 Identifier et décrire la méthode de dénombrement
Dans un premier temps, il convient de documenter le dossier avec une identification précise de la
méthode considérée et une description complète du processus de dénombrement.
L’identification de la méthode est simple lorsqu’elle est normalisée : il suffit de porter les références
de la norme dans le dossier, ainsi que l’option appliquée lorsque la norme comporte des variantes ;
sans oublier de préciser la version (année).
Lorsqu’une modification mineure est apportée à une méthode normalisée, la méthode peut être
identifiée par les références de la norme, immédiatement suivies par une mention explicite renvoyant à
un descriptif des modifications apportées.
En revanche, lorsque la modification est majeure l’identification de la méthode ne doit plus faire
directement référence à la norme.
Concernant la description du processus de dénombrement, il est vivement conseillé de procéder sous

forme d’un schéma.
Il est en particulier nécessaire, lors de ce travail, de faire ressortir les dénombrements et/ou recherches
élémentaires définis dans le paragraphe 3.2.3 (prise d’essai), ainsi que les échantillonnages de colonies
pour confirmation.
5.3 Lister les facteurs sources de variabilité
Sur la base du descriptif de la méthode de dénombrement défini dans le paragraphe 5.2 ci-dessus, il
faut dans un second temps dresser une liste la plus complète possible des sources d’erreur.
5.3.1 Variabilité inhérente à la méthode
La première source de variabilité provient de la distribution entièrement aléatoire des nombres de

particules lors de l’aliquotage (l'échantillonnage) de suspensions parfaitement homogénéisées.
EXEMPLE 1 Lorsque l’on prélève un volume de 5 millilitres d’un matériau contenant en moyenne 3
germes pour 5 millilitres, on « n’attrape pas à tous les coups » exactement 3 germes dans les 5 millilitres
prélevés. Le hasard peut faire que l’on en attrape 2, 5, 1, …, voire aucun ; ceci même si le matériau est
idéalement homogénéisé.
De la structure du plan de prises d’essais décrit dans la méthode découle donc directement une
variabilité ; laquelle est inévitable, incontournable et incompressible.
5.3.2 Variabilité induite par l’effet de facteurs analytiques
De nombreux facteurs différents peuvent contribuer à la variabilité des résultats d’une méthode de
dénombrement, parmi lesquels :
- le technicien ;
- l’équipement ;
- les consommables ;
- l’environnement.

La variabilité induite par ces facteurs sources d’erreur s’ajoute à la variabilité inhérente à la méthode,
décrite dans le paragraphe 5.3.1 ci-dessus.
Parmi les sources de variations prises en compte dans le présent document, on peut distinguer deux
groupes :
- celles qui peuvent être négligées à condition d’être contenues dans les spécifications
normatives de la méthode (exemple : durée d’incubation, valeur de pH, …) ;
- celles dont il faut mesurer l’influence, avec deux catégories :
• les sources contrôlables ou maîtrisables (exemple: milieux de culture) ;
• les sources non maîtrisables (exemple: présence de microflore interférente, état
physiologique des microorganismes dénombrés).
Chacun des facteurs ci-dessus peut être source d’erreur aléatoire et d’erreur systématique.
5.3.3 Sources de variabilité à ne pas considérer
Pour les besoins de la présente norme, certaines sources de variabilité ne doivent pas être prises en
compte dans le bilan ; ce sont :
- les erreurs (aléatoires et/ou systématiques) liées à l’échantillonnage sur le terrain (plan
d’échantillonnage et prélèvement) ;
- l’influence du transport et de la conservation des échantillons (durée, température, …).
De façon plus générale, ce sont toutes les sources de variabilité générées par les étapes antérieures à
l’analyse de l’échantillon dans le laboratoire. Leur impact sur le résultat de mesure peut être important,
mais elles ne sont pas du ressort des analystes.
5.4 Réaliser l’approche quantitative de l’incertitude de mesure
Enfin, il faut passer à la quantification.
5.4.1 Deux approches possibles
La variabilité générée par chacun des facteurs portés au bilan des sources d’erreur est quantifiée par un
coefficient de variation au carré CV2 (voir paragraphe 3.3.7).
La variabilité totale (sur le résultat de dénombrement) est la somme des CV2 des différentes sources
d’erreur.
[ISO/TR 13843:2000] et [7]

et surtout, voir les nombreuses références bibliographiques que ces 2 documents contiennent
Sur le plan mathématique, on peut écrire le modèle linéaire simple (additif) suivant :
∑ CV
2 2
CV totale = source
2
où CV totale représente la dispersion des résultats de dénombrements
2
les CV source représentent la variabilité générée par chacune des sources
d’erreur portées au bilan
L’incertitude de mesure ainsi évaluée est qualifiée d’incertitude combinée.

Elle présente l’avantage majeur de faire prendre conscience de l’ampleur de l’effet des différents
facteurs analytiques étudiés par rapport à l’incertitude inhérente à la méthode (voir paragraphe 5.3.1).
Mais elle peut parfois paraître lourde à mettre en œuvre ; pas toujours à juste titre d’ailleurs.

C’est pourquoi, dans le cadre du présent document, dans un premier temps une approche moins
méthodique visant à globaliser la variabilité induite par l’effet des facteurs analytiques (voir
paragraphe 5.3.2) a été privilégiée. C’est l’approche globale.
[8] et [9]
Le modèle linéaire simple ci-dessus devient alors :

∑ CV
2 2 2
CV totale = CV Poisson + facteur
2
où CV Poisson représente la dispersion inhérente à la méthode
2
les CV facteur représentent la variabilité induite par chacun des facteurs
analytiques sources d’erreur
∑ CV
2
Comme on ne décompose pas facteur dans l’approche globale, on peut l’écrire sous forme
∑ CV
2 2
d’un facteur de surdispersion en posant facteur = u analyse .
D’où :
2 2 2
CV totale = CV Poisson + u analyse
2
où CV Poisson représente la dispersion inhérente à la méthode
2
u analyse représente la surdispersion due à l'effet combiné de tous les facteurs
analytiques
2
NOTE 14 Le terme u analyse est réputé indépendant du niveau de concentration ([ISO/TR 13843:2000]) ;
fait largement vérifié en pratique.
NOTE 15 Pour les besoins de la présente norme, l’incertitude combinée est réservée aux méthodes pour
lesquelles l’approche globale s’est révélée infructueuse (dispersion des résultats en double population ou
résultats anormalement dispersés). Elle peut également s’avérer très utile pour traiter indépendamment un facteur
dont on sait qu’il est peu ou pas représenté dans le cadre de l’approche globale ; exemple typique :
l’échantillonnage des colonies pour confirmation.
5.4.2 Principe de l’approche globale
2
Il s’agit de quantifier les 2 termes composant CV totale :
2
- d’une part CV Poisson , dont la quantification est une démarche purement calculatoire ;
2
- d’autre part u analyse , dont la quantification découle de l’exploitation de séries de
mesures répétées (essais de fidélité - voir paragraphe 3.1.3).
2
Pour la quantification de u analyse , il faut s’attendre à des valeurs d’autant plus élevées que l’on fait
varier les conditions de déroulement des analyses répétées. Comme il est classiquement admis, on
retient 3 niveaux de fidélité :
2
- u r la surdispersion quantifiée dans des conditions de répétabilité (en pratique, mesures
répétées au sein d’une même série analytique) ;

2
- u R' la surdispersion quantifiée dans des conditions de reproductibilité intralaboratoire
(en pratique, mesures répétées au sein d’un même laboratoire, mais sur des séries
analytiques différentes) ;
2
- uR la surdispersion quantifiée dans des conditions de reproductibilité interlaboratoires
(en pratique, mesures répétées par des laboratoires différents).
On note également :
2
- uA la composante résiduelle intra série analytique, c’est à dire l’erreur de mesure (qui
s’ajoute à la loi de Poisson) à l’intérieur d’une même série analytique ;
2
- uB la composante « série analytique » du biais, c’est à dire l’erreur de mesure d’une
série analytique à l’autre ;
2
- uC la composante « laboratoire » du biais, c’est à dire l’erreur de mesure d’un
laboratoire à l’autre.
Ainsi :
2 2
ur = u A
2 2 2
u R' = u A + u B
2 2 2 2
u R = u A + u B + uC
2
Bref, l’approche globale repose sur le calcul de CV Poisson et la quantification des composantes
2 2 2
globales d’erreur u A , u B et u C .
5.4.3 Données dont il faut disposer pour mettre en œuvre l’approche globale
Il découle du principe de l’approche globale décrit ci-dessus (paragraphe 5.4.2) que le laboratoire doit
disposer de séries de résultats de mesures répétées pour pouvoir évaluer les différentes composantes
globales d’erreur :
- mesures répétées dans des conditions de répétabilité (au sein d’une même série
analytique) ;
- mesures répétées dans des conditions de reproductibilité intralaboratoire (réparties sur des
séries analytiques différentes).
Ces séries de données sont d’emblée disponibles au travers du contrôle interne de qualité (cartes de
contrôle).
Il en découle également que le laboratoire doit disposer de séries de résultats de mesures répétées dans
des conditions de reproductibilité interlaboratoires.
Là aussi, ces séries de données sont d’emblée disponibles au travers du contrôle externe de qualité
(essais d’aptitude).
Toutefois, toutes les données disponibles ne sont pas forcément utilisables.
En effet, il est essentiel de veiller à utiliser des données suffisamment représentatives de la diversité
rencontrée en routine. En particulier, les séries produites sur un matériau fraîchement dopé par une
unique culture pure du germe ciblé en phase exponentielle de croissance présentent peu d’intérêt et
doivent être écartées.
L’idéal serait de disposer de données produites sur des matériaux naturels (naturellement contaminés)
d’une complexité moyenne pour la classe de matrices considérée (en termes de microflore interférente

et d’état physiologique des bactéries). Mais malheureusement, de telles données sont rares. Et pour
cause, les matériaux intéressants sont presque toujours peu stables et présentent des difficultés
d’approvisionnement.
Dans ce contexte, il faut autant que possible ne retenir que les données établies à partir :
- de matériaux naturels, s’il y en a ;
- de matériaux de référence (éventuellement certifiés) ; il en existe, disponibles sur le
marché, qui représentent assez bien le stress des germes présents dans les eaux de
réseaux ;
- de matrices naturelles dont les caractéristiques (mesurande et flore interférente) auront le
cas échéant été ajustées :
• abaissement éventuel de la charge microbienne par chloration puis neutralisation au
thiosulfate de sodium ;
• dopage par des mélanges de cultures pures stressées.
6. Mise en œuvre pratique de l’approche globale
Avant de se lancer dans l’exploitation des données disponibles retenues comme décrit dans le
paragraphe ci-dessus (5.4.3), il faut identifier le type de technique de dénombrement de la méthode
dont on cherche à évaluer l’incertitude de mesure : énumérative ou quantique ?
Les définitions des paragraphes 3.2.4 et 3.2.5 permettent de faire cette distinction.
En parallèle, il faut aussi répertorier les valeurs réglementaires du paramètre. C’est en effet autour de
ces valeurs que l’incertitude de mesure doit être évaluée (pas ailleurs).
L’annexe C rassemble ces éléments pour les principaux paramètres microbiologiques de l’analyse de
l’environnement.
Puis, il s’agit de remplir le tableau suivant :

origine de l’estimation
contrôle externe (essais d’aptitude)
contrôle interne du information
laboratoire information générale
spécifique au
sur la profession
laboratoire
2 1
CV Poisson
2 2 2 3 4
ur = u A
2 2 2 5 6 7
u R' = u A + u B
2 2 2 2 8 9
uR = u A + uB + uC
Tableau 1
Les cases 6 et 7 sont à remplir uniquement si l’information est accessible.
2
6.1 Recherche de l’expression de CV Poisson
(pour remplir la case 1 du Tableau 1)
La variabilité inhérente à la méthode ne dépend que de l’agencement des recherches / dénombrements

élémentaires prévus par le protocole de mesure. Elle ne dépend aucunement de l’origine des données
expérimentales rassemblées pour estimer l’incertitude.

2
C’est pourquoi la ligne CV Poisson du Tableau 1 à remplir ne contient qu’une case.
2
Le calcul de CV Poisson est simple pour les techniques énumératives réduites à un dénombrement
élémentaire. Il peut être plus compliqué lorsque plusieurs dénombrements élémentaires sont réalisés
(dénombrement des Legionella par la norme NF T 90-431:2003 par exemple).
Pour les techniques quantiques, il peut être nécessaire de faire appel à un statisticien.
En tout état de cause, la procédure de validation décrite dans la norme ISO/TR 13843:2000 nécessite
de faire ce calcul. Toute méthode normalisée devra donc, à terme, fournir l’expression de
2
CV Poisson . Il suffira au laboratoire de la reporter dans la case 1 du Tableau 1 à remplir.
En attendant, l’annexe C pallie à l’absence éventuelle de cette information dans les normes antérieures
à la parution du présent document.
6.2 Exploitation des cartes de contrôle

(pour remplir les cases 2 et 5 du Tableau 1)
De son système de contrôle interne de qualité, le laboratoire doit extraire un nombre suffisant de
2 2
données pour calculer u r et u R ' .
6.2.1 Extraire un nombre suffisant de données
Toute carte de contrôle repose sur l’analyse régulière d’un matériau de référence dont la stabilité et
l’homogénéité sont suffisantes durant toute la période d’utilisation.
NOTE 16 Il appartient au laboratoire de pouvoir produire la preuve de la qualité du matériau de référence qu’il
utilise : attestation du fabricant (de préférence couverte par une certification ISO 9000 dans le respect du guide
ISO 34) pour les matériaux achetés dans le commerce ; preuve expérimentale pour les matériaux fabriqués en
interne.
Les mesures doivent être répétées p fois (p>1) au sein de chaque série analytique (voir paragraphe
3.2.6) mise en œuvre ; on note q le nombre de séries analytiques.
Bien entendu, dans l’historique d’un laboratoire les lots de matériaux de référence se succèdent. Ils
présentent forcément des niveaux de charge bactérienne différents.
Ceci ne perturbe en rien l’exploitation que l’on peut faire des données. Il faut juste éviter de conserver
les groupes de données situées à un niveau de concentration trop faible, là où la variabilité inhérente à
la méthode l’emporte trop largement sur la variabilité induite par l’effet global des facteurs
analytiques.
Pour les méthodes énumératives réduites à un dénombrement élémentaire, un nombre suffisant de

données correspond à p ⋅ q = 80 , avec de préférence p au moins égal à 4. Le niveau de charge
bactérienne en dessous duquel il faut éviter de descendre est 15 à 20 en moyenne par prise d’essai.
Rappelons qu’une méthode énumérative réduite à un dénombrement élémentaire correspond, par
définition (voir paragraphe 3.2.4), à l’ensemencement d’une unique prise d’essai de l’échantillon sur
milieu gélosé. Le dénombrement d’E. coli, des entérocoques intestinaux, des germes revivifiables à
22°C ou à 36°C sur eaux propres sont des exemples de méthodes énumératives réduites à un
dénombrement élémentaire.
2 2
6.2.2 Calculer u r et u R ' dans le cas d’une méthode énumérative
réduite à un dénombrement élémentaire

L’annexe D est un exemple numérique complet de l’ensemble de la démarche d’exploitation des cartes
de contrôle en vue d’estimer l’incertitude de mesure pour un dénombrement basé sur une technique
énumérative réduite à un dénombrement élémentaire.
Le traitement statistique débute par l’agencement des données en un tableau à q lignes et p colonnes :
Matériau de Séries analytiques
Mesures répétées au sein de chaque série analytique
référence successives
MR réf xxx - lot xxx série 1 x11 x12 x1p
MR réf xxx - lot xxx série 2 x21 x22 x2p
MR réf xxx - lot xxx série q xq1 xq2 xqp

Tableau 2
xij est la jème mesure répétée de la ième série analytique
2
6.2.2.1 Calcul du facteur de surdispersion pour chaque série analytique ( u ri )
La première étape du traitement est de tester si globalement les mesures répétées au sein d’une même
série analytique présentent une dispersion réduite à la variabilité inhérente à la méthode de
dénombrement. En l’occurrence, il faut établir si les mesures répétées disposées en ligne dans le
Tableau 2 suivent la loi de Poisson.
Pour cela on applique le test T1 de Cochran (voir [11]).
Il faut d’abord calculer pour chaque série i (chaque ligne du Tableau 2) la statistique
2
 x 
p
 x ij − i . 
 p  p
T1 i = ∑
j =1
xi. où x i . = ∑ x ij
j =1
p
Le degré de liberté correspondant à cette statistique est ddl = p-1 .
On compare chaque valeur observée T1 i à la loi du χ2 à p-1 degrés de liberté ( χ

2
p −1 ).
Les limites théoriques sont :
- limite inférieure à 1% : χ p2 −1; 0 , 005 ;
- limite inférieure à 5% : χ 2
p − 1 ; 0 , 025 ;
- limite supérieure à 5% : χ p2 −1; 0 , 975 ;
- limite supérieure à 1% : χ 2
p − 1 ; 0 , 995 .
L’annexe E fournit ces limites théoriques.
Selon la position du T1 i par rapport aux limites théoriques, on détermine pour chaque série analytique
la significativité de l’écart de la dispersion observée à la dispersion prévue par la loi de Poisson :
Conclusion sur l’écart de la dispersion A noter
Position de T1 i par rapport aux
observée par rapport à la dispersion prévue dans le
limites théoriques par la loi de poisson Tableau 2
Dispersion très significativement inférieure à
cas 1 T1 i < χ 2
p − 1 ; 0 , 005 celle attendue d’après la loi de Poisson
<<

Dispersion significativement inférieure à celle
cas 2 χ p2 −1; 0 , 005 < T1 i < χ p2 −1 ; 0 , 025 attendue d’après la loi de Poisson
<
Dispersion non significativement différente de
cas 3 χ p2 −1 ; 0 , 025 < T1 i < χ p2 −1; 0 , 975 celle attendue d’après la loi de Poisson
o
Dispersion significativement supérieure à celle
cas 4 χ p2 −1; 0 , 975 < T1 i < χ p2 −1 ; 0 , 995 attendue d’après la loi de Poisson
>
Dispersion très significativement supérieure à
cas 5 χ p2 −1 ; 0 , 995 < T1 i celle attendue d’après la loi de Poisson
>>
Tableau 3
Il reste à compléter le Tableau 2 en ajoutant pour chaque série analytique la valeur de l’indice de
dispersion :
T1 i
ki =
p −1
Puis le facteur de surdispersion :
2 p
u ri = ⋅ ( k i − 1)
x i.
2
6.2.2.2 Identification et traitement des u ri anormaux
2
Si l’un des u ri du Tableau 2 apparaît singulier (très différent des autres), il peut s’agir d’une donnée
anormale. Il convient alors d’investiguer pour tenter de trouver une explication technique (événement
particulier survenu dans la série analytique).
Si aucune explication n’est trouvée, il faut conserver la série analytique pour la suite du traitement. Si
une explication est trouvée, il peut être justifié d’éliminer la série (toute la ligne du Tableau 2).
2
Les séries analytiques (lignes du Tableau 2) aboutissant à un u ri < 0 et dont la dispersion apparaît
significativement, voire très significativement, inférieure à cette prévue par la loi de Poisson (cas 1 et
2 du Tableau 3) font partie de ces séries singulières.
2
En effet, si k i < 1 , on aboutit à une incohérence : u ri <0.
Il faut alors s’attarder sur le niveau de signification de la statistique T1 i .
• Si χ p2 −1 ; 0 , 025 < T1 i < χ p2 −1; 0 , 975 (cas 3 du Tableau 3), en réalité ki n’est pas
significativement différent de 1. Il est alors parfaitement légitime de conserver la série pour la
2
suite des calculs, ainsi que la valeur u ri telle qu’elle est (négative) ; simplement, elle n’est pas
significativement différente de 0 : la dispersion est réduite à la loi de Poisson.
• En revanche, si χ p2 −1; 0 , 005 < T1 i < χ p2 −1 ; 0 , 025 (cas 2 du Tableau 3) voire T1 i < χ
2
p − 1 ; 0 , 005
(cas 1 du Tableau 3), alors k i est réellement inférieur à 1. Ceci constitue une anomalie
caractérisée qu’il faut corriger : le rendement du milieu de culture employé n’est probablement
pas ce qu’il devrait être (rendement peu satisfaisant qui devrait par ailleurs transparaître au
travers des résultats du contrôle externe de qualité : z-scores systématiquement bas). Si cette
situation est ponctuelle (pas plus d’un écart significatif sur 20), la série concernée peut être
simplement écartée même en l’absence de justification technique. En revanche, si la situation
est récurrente (présence d’un écart très significatif ou plus d’un écart significatif sur 20), alors
l’estimation de l’incertitude de mesure doit être remise à plus tard ; il convient d’abord de
solutionner l’anomalie et vérifier l’efficacité de l’action corrective.
2
6.2.2.3 Calcul de la valeur de u r à reporter dans le Tableau 1

Enfin, on calcule la statistique T1 complète, sans les éventuelles séries écartées :
q
T1 = ∑T
i =1
1i
Le degré de liberté correspondant à cette statistique est ddl = q.(p-1) .
On compare cette valeur observée T1 à la loi du χ2 à q.(p-1) degrés de liberté ( χ q ⋅( p −1 ) ).

2
Les limites théoriques fournies par l’annexe E sont :

- limite inférieure à 1% : χ q2.( p −1 ); 0 , 005 ;
- limite inférieure à 5% : χ 2
q ⋅( p − 1 ); 0 , 025 ;
- limite supérieure à 5% : χ q2⋅( p −1 ); 0 , 975 ;
- limite supérieure à 1% : χ q2⋅( p −1 ); 0 , 995 .
Selon la position de T1 par rapport aux limites théoriques, on détermine la significativité globale de
l’écart de la dispersion observée avec la dispersion prévue par la loi de Poisson :
Conclusion sur l’écart de la dispersion
Position de T1 par rapport aux limites Notation
observée par rapport à la dispersion
théoriques à apposer
prévue par la loi de poisson
cas 1 T1 < χ q2.( p −1 ); 0 , 005 celle attendue d’après la loi de Poisson
<<
Dispersion significativement inférieure à
cas 2 χ q2.( p −1 ); 0 , 005 < T1 < χ q2⋅( p −1 ); 0 , 025 celle attendue d’après la loi de Poisson
<
Dispersion non significativement différente
cas 3 χ q2⋅( p −1 ); 0 , 025 < T1 < χ q2⋅( p −1 ); 0 , 975 de celle attendue d’après la loi de Poisson
o
Dispersion significativement supérieure à
cas 4 χ q2⋅( p −1 ); 0 , 975 < T1 < χ q2⋅( p −1 ); 0 , 995 celle attendue d’après la loi de Poisson
>
Dispersion très significativement supérieure
cas 5 χ q2⋅( p −1 ); 0 , 995 < T1 à celle attendue d’après la loi de Poisson
>>
Tableau 4
2
Reste à calculer le facteur global de surdispersion u r .
L’indice de dispersion est :
T1
k1 =
q ⋅ ( p − 1)
2
Le facteur de surdispersion u r est :
q⋅p q
∑
2
ur = ⋅ ( k 1 − 1) où x .. = xi.
x .. i =1
2
Reporter la valeur u r ainsi calculée dans la case 2 du Tableau 1.
2
6.2.2.4 Calcul de la valeur de u R ' à reporter dans le Tableau 1
2
Il faut ensuite passer au calcul de u R ' , sur le même principe.

On calcule la statistique :
2
 x 
q
 x i . − .. 
 q  q
T2 = ∑i =1
x .. où x .. = ∑ xi.
i =1
q
Le degré de liberté correspondant à cette statistique est ddl = q-1 .
On compare cette valeur observée T 2 à la loi du χ2 à q-1 degrés de liberté ( χ q −1 ).

2
Les limites théoriques fournies par l’annexe E sont :

- limite inférieure à 1% : χ q2−1 ; 0 , 005 ;
- limite inférieure à 5% : χ q2−1 ; 0 , 025 ;
- limite supérieure à 5% : χ q2−1 ; 0 , 975 ;
- limite supérieure à 1% : χ q2−1 ; 0 , 995 .
Selon la position de T 2 par rapport aux limites théoriques, on détermine la significativité globale de
l’écart de la dispersion observée avec la dispersion prévue par la loi de Poisson :
Conclusion sur l’écart de la dispersion
Position de T1 par rapport aux limites
observée par rapport à la dispersion Notation
théoriques prévue par la loi de poisson
cas 1 T 2 < χ q2−1 ; 0 , 005 celle attendue d’après la loi de Poisson
<<
Dispersion significativement inférieure à
cas 2 χ q2−1 ; 0 , 005 < T 2 < χ q2−1 ; 0 , 025 celle attendue d’après la loi de Poisson
<
Dispersion non significativement différente
cas 3 χ q2−1 ; 0 , 025 < T 2 < χ q2−1 ; 0 , 975 de celle attendue d’après la loi de Poisson
o
Dispersion significativement supérieure à
cas 4 χ q2−1 ; 0 , 975 < T 2 < χ q2−1 ; 0 , 995 celle attendue d’après la loi de Poisson
>
Dispersion très significativement supérieure
cas 5 χ q2−1 ; 0 , 995 < T 2 à celle attendue d’après la loi de Poisson
>>
Tableau 5
On calcule enfin l’indice de dispersion :

T2
k2 =
q −1
2
On le transforme ensuite en facteur de surdispersion u R ' :
2 q
u R' = q
⋅ ( k 2 − 1)
∑
i =1
xi.
Comme précédemment, des séries singulières peuvent venir interférer dans l’estimation. Il convient de
statuer sur les situations particulières, et le cas échéant éliminer des séries si cela est techniquement
justifié.
2
NOTE 17 La représentation graphique des séries i, avec en abscisse x i. et en ordonnées u ri peut
permettre de repérer les données singulières. En effet, les séries doivent apparaître sous forme d’un nuage de
points, les séries singulières étant isolées.

2
Reporter finalement la valeur de u R ' ainsi calculée dans le Tableau 1, case 5.
6.2.2.5 Ajustement des calculs pour traiter ensemble des groupes de contrôle différents
Si plusieurs ensembles de séries analytiques sont disponibles, obtenus sur des matériaux de référence
2 2
différents, il faut moyenner les estimations de u r et u R ' .
Pour cela, vérifier au préalable l’homogénéité des valeurs en les positionnant sur en graphique avec en
x ..
abscisse (qui n’est autre que le niveau de charge du matériau, en nombre de germes moyen
q⋅p
2 2 2 2
par prise d’essai) et en ordonnée u r et u R ' . Si les différentes valeurs de u r d’un côté et u R '
2
de l’autre sont cohérentes, moyenner séparément les différentes valeurs de u r et les différentes
2
valeurs de u R ' (moyenne arithmétique).
2 2
Il y a cohérence si les points (séparément pour u r et u R ' ) forment un nuage horizontal sans point
isolé. Si un point se révèle isolé, il faut investiguer pour tenter d’en trouver la raison technique (il peut,
2
le cas échéant être éliminé). Par ailleurs, il faut que le nuage de points relatif à u R ' soit plus haut (ou
2
au moins confondu) avec le nuage de u r .
2
Reporter la moyenne arithmétique des u r dans la case 2 du Tableau 1 et la moyenne arithmétique
2
des u R ' dans la case 5.
2 2
6.2.3 Calculer u r et u R ' dans le cas d’une méthode quantique
- à rédiger -
6.3 Collecte des données disponibles auprès des organisateurs d’essais interlaboratoires
Le document ISO/TS 21748:2004 traite de l’utilisation d’estimations de la répétabilité, de la

reproductibilité et de la justesse dans l’évaluation de l’incertitude de mesure. La procédure définie
consiste à :
a) Obtenir des estimations de la répétabilité, de la reproductibilité et de la justesse de la méthode
utilisée, à partir d’informations publiées sur cette méthode.
b) Déterminer si le biais de laboratoire relatif aux mesurages se situe dans les limites de celui
attendu selon les informations obtenues en a).
c) Déterminer si la fidélité obtenue par des mesurages actuels se situe dans les limites de celle
attendue selon les estimations de répétabilité et de reproductibilité obtenues en a).
d) Identifier toute influence sur le mesurage qui n’a pas été couverte de manière adéquate dans
les études dont il est fait référence en a) et quantifier la variance qui pourrait découler de ces
effets, en tenant compte des coefficients de sensibilité et des incertitudes dans les grandeurs
d’influence.
e) Lorsque le biais et la fidélité sont sous contrôle comme démontré aux étapes b) et c), combiner
l’estimation de la reproductibilité ( a) ) avec l’incertitude associée à la justesse donnée ( a) et
b) ) et les effets d’influences supplémentaires ( d) ) pour former une estimation de l’incertitude
composée.

[ISO/TS 21748:2004]
Resituée dans le contexte de la présente norme, les spécifications du document ISO/TS 21748:2004
continuent de s’appliquer malgré les difficultés rencontrées avec la justesse. Les estimations de
répétabilité et de reproductibilité (en termes de facteur de surdispersion u2) proviennent des essais
interlaboratoires.
Les organisateurs d’essais d’aptitudes sont à même de produire des estimations du facteur de
2
surdispersion dans des conditions de répétabilité ( u r ) et de reproductibilité interlaboratoires
2
( u R ).
En revanche, ils ne sont pas toujours en mesure d’effectuer une approche de la composante « série
2
analytique » du biais ( u B ).
En effet, comme déjà indiqué dans le paragraphe 5.4.3 les essais interlaboratoires doivent
préférentiellement porter sur des matériaux aussi proches que possible des échantillons analysés en
routine. Il en résulte que des problèmes de stabilité limitent considérablement la possibilité de différer
les analyses. Pas question donc, dans la plupart des cas, de demander aux laboratoires participants de
procéder sur des séries analytiques différentes.
Néanmoins, il serait particulièrement intéressant que les organismes d’essais interlaboratoires
2
s’attachent ponctuellement à évaluer u R ' ; ceci par exemple grâce à des matériaux de référence.
2 2 2 2 2
Ces valeurs de u r , u R , voire u R ' sont à reporter dans le Tableau 1 : u r dans la case 4, u R
2
dans la case 9, et u R ' (si accessible) dans la case 7. Elles s’appliquent à l’ensemble des laboratoires
ayant participé aux essais.
2 2
Mais les organismes d’essais d’aptitudes sont aussi capables de produire des valeurs de u r et u R
2
(voire u R ' ) spécifiquement corrigées pour les différents participants.
En effet, suite à une série d’essais interlaboratoires, il est possible de dire pour chaque participant s’il
présente une performance analytique meilleure que l’ensemble des autres laboratoires, pouvant ainsi se
prévaloir d’une incertitude de mesure plus faible.
2 2
Ces valeurs personnalisées sont à reporter dans le Tableau 1 : case 3 pour u r , case 8 pour u R , et
2
case 6 pour un éventuel u R ' .
6.3.1 Conditions à respecter pour pouvoir se saisir de données fournies par un organisateur
d’essais interlaboratoires
Des spécificités techniques du document ISO/TS 21748:2004 et des particularités de l’analyse

microbiologique de l’environnement, il découle que plusieurs conditions doivent être respectées pour
que le laboratoire puisse se saisir des données qui lui sont fournies par un organisateur d’essais
interlaboratoires.
En premier lieu, le laboratoire doit s’assurer de la qualité des données fournies. En d’autres termes, il
doit vérifier que l’organisme considéré dispose des compétences requises en statistiques et en
microbiologie de l’eau et de l’environnement. Le laboratoire doit pouvoir produire les preuves de cette
compétence.
Il est entendu qu’un certificat d’accréditation accompagné d’une portée intégrant le paramètre
considéré sur la matrice considérée est une preuve nécessaire.

En second lieu, le laboratoire doit justifier de la participation régulière au réseau d’essais animé par
l’organisme considéré ; ceci depuis suffisamment longtemps. Concrètement, au moins 6 essais doivent
avoir été réalisés durant les deux dernières années.
A défaut, le laboratoire doit prouver que ses performances actuelles sur des matériaux voisins de ceux
mis en œuvre par l’organisme considéré sont dans les limites attendues selon les estimations de
répétabilité et de reproductibilité obtenues auprès de l’organisme.
Enfin, le laboratoire doit ne pas avoir présenté d’anomalie dans ses performances analytiques ; ceci en
terme d’erreur systématique (composante « laboratoire » du biais), mais aussi en termes d’erreur
aléatoire (répétabilité, voire reproductibilité intralaboratoire).
Si c’est le cas, les anomalies doivent rester ponctuelles et avoir fait l’objet d’une action corrective
efficace soldée.
6.3.2 Collecte des données relatives à l’ensemble de la profession

(pour remplir les cases 4, 7 et 9 du Tableau 1)
2 2 2
Les valeurs de u r , u R , voire u R ' doivent être fournies par l’organisateur d’essais
interlaboratoires avec un minimum d’informations sur les conditions dans lesquelles chaque essai a été
réalisé :
- date ;
- nombre de participants ;
- nature et composition du matériau mis en œuvre (mesurande et flore interférente si elle a
été caractérisée) ;
- niveaux de charge (du mesurande et de la flore interférente si elle a été caractérisée) ;
- commentaires issus du traitement statistique, comme par exemple l’observation d’écarts
entre milieux de culture.
Il faut éviter de conserver les données établies sur des essais présentant un trop petit nombre de
participants. En pratique, 30 laboratoires paraît être un minimum ; néanmoins, les essais regroupant
moins de 30 participants peuvent être conservés s’ils restent largement minoritaires, et à condition que
le nombre de participants ne descende tout de même pas en dessous de 20.
2 2 2
Il convient tout d’abord de représenter les diverses valeurs de u r , u R , voire u R ' sous forme
2
graphique : en abscisse, le niveaux de charge du mesurande ; en ordonnée u . Ceci permet de visualiser
les données et d’identifier les éventuelles singularités.
Mais aucune donnée ne doit être éliminée sans raison valable. Outre les conditions posées pour les
besoins de la présente norme, sur la nature des matériaux (voir paragraphe 5.4.3) d’une part, sur le
nombre de participants aux essais (voir ci-dessus) d’autre part, seule une réserve de l’organisme
d’essais interlaboratoires sur la fiabilité de la donnée est une raison recevable.
Reste à calculer la moyenne arithmétique des u2.
2
Reporter la moyenne arithmétique des u r dans la case 4 du Tableau 1, la moyenne arithmétique des
2 2
u R dans la case 9, et la moyenne arithmétique des u R ' (si accessible) dans la case 7.
NOTE 18 Les organismes d’essais interlaboratoires sont les mieux placés pour réaliser cette synthèse. En
effet, ils détiennent toutes les informations nécessaires et sont plus à même que tout autre d’apprécier la portée
des valeurs découlant de cette approche ; en particulier eu égard au point d) de la procédure spécifiée dans le
document ISO/TS 21748:2004, portant sur les facteurs non pris en compte de manière adéquate.
6.3.3 Collecte des données spécifiques au laboratoire

(pour remplir les cases 3, 6 et 8 du Tableau 1)
A suivre

ANNEXE C
Principaux paramètres microbiologiques de l’analyse de l’environnement
Les limites de qualité, valeurs guides et valeurs limites impératives citées dans le tableau ci-dessous
proviennent du décret n°2003-461 du 21 mai 2003 relatif à certaines dispositions réglementaires du
code de la santé publique.
Paramètre Méthode Application Technique CV Poisson

2 Nécessité Limites
d’un ou
repiquage de références
colonies de qualité
pour
confirmation
E. coli NF EN Contrôle énumérative 1 oui absence
ISO 9308- sanitaire des où λ dans les
1: 2000 eaux de λ 100 ml
(filtration distribution est la charge analysés
sur microbienne
membrane) par 100 ml
- essai
standard
sur 100 ml
-
E. coli NF EN Contrôle énumérative 1 oui absence
ISO 9308- sanitaire des où λ dans les
1: 2000 eaux λ 250 ml
(filtration embouteillées est la charge analysés
sur microbienne
membrane) par 250 ml
- essai
standard
sur 250 ml
-
A compléter

ANNEXE D
Exemple de dossier d’estimation de l’incertitude - à améliorer et compléter -
Un laboratoire s’intéresse à l’incertitude de mesure associée aux résultats du dénombrement des

Escherichia coli. La méthode de référence (essai standard) décrite dans la norme NF EN ISO 9308-1:
2000 est appliquée.
D1. Identification et description de la méthode de dénombrement

NF EN ISO 9308-1 : 2000 (T90-414)
Recherche et dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes
Partie 1: méthode par filtration sur membrane
Option considérée : essai standard appliqué sur 100 ml dans le cadre du contrôle sanitaire des eaux de
distribution, ou sur 250 ml dans le cadre du contrôle sanitaire des eaux embouteillées.
Il s’agit d’une technique énumérative réduite à un dénombrement élémentaire.
Les valeurs réglementaires appliquées sont :

- absence d’E. coli dans les 100 ml analysés pour les eaux de distribution ;
- absence d’E. coli dans les 250 ml analysés pour les eaux embouteillées.
Description de l’essai standard (détecte E. coli et coliformes)
Filtration sur membrane de 100ml

(ou 250ml pour eau embouteillée)
Membrane placée sur une gélose de

différenciation (TTC)
Incubation
Comptage des colonies typiques (coloration jaune)
Repiquage pour 2 essais de confirmation : toutes
les colonies typiques ou au moins 10
Essai oxydase Essai indole
Coloration bleu/violet foncé ⇒ réaction Coloration rouge ⇒ réaction positive

positive (production d’oxydase) (production d’indole)

Compter colonies ayant :
Réaction négative à l’essai oxydase → coliformes
Réaction négative à l’essai oxydase et positives à l’indole → E. coli
D2. Facteurs sources de variabilité
Liste à établir
D3. Réalisation de l’approche quantitative de l’incertitude de mesure
2 1
CV Poisson = où λ est la charge microbienne (par 100 ml ou par 250 ml selon le cas
λ
considéré).
spécifique au
sur la profession
laboratoire
2 2 1
CV Poisson CV Poisson = où λ est la charge microbienne
λ
2 2 2 3 4
ur = u A
2 2 2 5 6 7
u R' = u A + u B
2 2 2 2 8 9
uR = u A + uB + uC
Dans les archives du laboratoire, 13 groupes de contrôle étaient disponibles pour le paramètre
Escherichia coli. Chaque groupe a été réalisé sur un matériau de référence différent (MR 1 à 13). Des
mesures répétées (en nombre variable) ont été réalisées au sein de chaque série analytique (Série 1 à
…).
Les résultats de 3 groupes de contrôle ont été isolés pour illustrer les calculs.
1er groupe de contrôle

Le tableau ci-dessous présente les comptages obtenus pour le matériau de référence 1 (MR1). 8
mesures ont été répétées et 20 séries réalisées.
Pour chaque série parallèle, xi et T1 i sont calculés (selon 6.2.2.1) :
Série Mesures répétées (duplicats) xi T1 i

1 2 3 4 5 6 7 8
1 31 30 31 29 36 30 33 33 253 1,1344
2 62 52 50 38 37 36 51 32 358 17,0168
3 50 44 50 40 58 52 41 35 370 8,5946
4 41 30 46 45 40 33 30 29 294 9,4558

5 51 45 76 60 62 56 46 40 436 17,1743
6 48 35 67 62 29 29 58 52 380 32,8842
7 48 46 55 41 48 34 56 43 371 7,8895
8 56 54 55 48 49 41 56 47 406 4,0099
9 64 63 55 45 37 34 44 35 377 21,9602
10 34 33 47 38 43 39 58 52 344 12,6512
11 46 43 50 39 51 46 53 46 374 3,0695
12 51 48 77 76 63 58 52 34 459 25,5839
13 37 30 41 39 33 31 37 34 282 2,9929
14 46 31 51 36 47 44 38 31 324 9,9259
15 38 35 49 30 50 39 39 39 319 7,8464
16 35 29 50 43 30 29 40 31 287 11,7317
17 49 41 38 35 31 29 32 30 285 9,0912
18 54 50 33 32 37 30 38 29 303 16,0231
19 54 46 38 37 46 40 45 45 351 4,8063
20 38 35 47 46 40 31 35 35 307 5,8339
Chaque valeur de T1 i est comparée à la loi du χ2 à 7 degrés de liberté ( χ 7 ).

2
p 0,005 0,025 0,975 0,995

χ 2
7 0,98926 1,68987 16,01276 20,27774
On détermine ainsi pour chaque série analytique la significativité de l’écart de la dispersion observée à
la dispersion prévue par la loi de Poisson. Dans ce cas, la première série de donnée présente une
dispersion significativement inférieure à celle attendue d’après la loi de Poisson. Comme indiqué dans
le paragraphe 6.2.2.2, le laboratoire doit corriger une anomalie. Cette situation étant ponctuelle (un
seul écart significatif sur 20 séries), la première série peut être simplement écartée même en l’absence
de justification technique.
2
Pour chaque série (de 2 à 20), l’indice de dispersion ( ki ) et le facteur de surdispersion ( u ri ) sont
calculés.
q
La statistique T1 est ensuite calculée selon T1 = ∑T
i =1
1i .
Dans cet exemple : T1 =228,541
T1 est comparée à la loi du χ 2

à 19.(8-1) degrés de liberté ( χ 133 ).
2
p 0,005 0,025 0,975 0,995

χ 2
133 94,74595 102,96818 166,81623 178,75508
T1 présente une dispersion très significativement supérieure à celle attendue d’après la loi de Poisson.
L’indice de dispersion est alors:
T1 228 , 541
k1 = = = 1, 718
q ⋅ ( p − 1) 19 .( 8 − 1)
Le facteur de surdispersion est :
2 q⋅p 19 . 8
ur = ⋅ ( k 1 − 1) = .( 1, 718 − 1) = 0 , 016
x .. 6627
La statistique T2 est alors calculée (selon paragraphe 6.2.2.4).

T2 =135,271

T 2 est comparée à la loi du χ 2
à 19-1 soit 18 degrés de liberté ( χ 18 ).
2
p 0,005 0,025 0,975 0,995

χ 2
18 6,2648 8,23075 31,52638 37,15645
T2 présente une dispersion très significativement supérieure à celle attendue d’après la loi de Poisson.
On calcule enfin l’indice de dispersion :

T2 135 , 271
k2 = = = 7 , 515
q −1 19 − 1
2
On le transforme ensuite en facteur de surdispersion u R ' :
2 q 19
u R' = q
⋅ ( k 2 − 1) = .( 7 , 515 − 1) = 0 , 019
6627
∑
i =1
xi.
2ème groupe de contrôle

De même que précédemment, xi et T1 i sont calculés pour chaque série parallèle (selon 6.2.2.1) :

1 2 3 4 5
21 66 51 61 66 65 309 2,6343
22 57 45 40 52 46 240 3,6250
23 76 59 60 78 60 333 5,4535
24 62 59 58 69 59 307 1,3225
25 36 37 48 43 41 205 2,2927
26 43 62 49 53 44 251 4,7570
27 54 45 41 32 47 219 6,0000
28 34 33 32 39 28 166 1,8916
29 54 55 59 49 55 272 0,9412
30 46 42 56 44 57 245 4,0000
31 63 56 57 47 63 286 3,0210
32 44 59 49 55 40 247 4,8826
33 70 66 47 63 67 313 5,2588
34 41 40 56 63 50 250 7,7200
35 60 50 72 66 75 323 6,1796
36 50 63 65 56 12*
37 31 46 39 35 33 184 3,8261
38 52 51 60 53 80 296 9,9797
39 65 50 53 53 57 278 2,4317
40 60 52 57 49 46 264 2,4773
41 60 55 69 61 71 316 2,7975
42 59 43 63 56 73 294 8,1088
43 46 40 50 52 48 236 1,7966
44 48 54 65 66 47 280 5,8929
* Donnée techniquement suspecte. La série analytique 36 est de ce fait exclue du traitement.

Chaque valeur de T1 i est comparée à la loi du χ2 à 4 degrés de liberté ( χ 4 ). Pour les 23 séries
2
analytiques retenues, la dispersion est non significativement différente de celle attendue d’après la loi
de Poisson.
En procédant selon le paragraphe 6.2.2 (même calculs que pour le 1er groupe de contrôle), on obtient
les indices de dispersion, les facteurs de surdispersion et les statistiques T1 et T 2 en considérant les
23 séries analytiques.
T1 k1 ur
2
T2 k2 u R'
2
97,290 1,058 0,001 165,346 7,516 0,025

à 23.(5-1) degrés de liberté ( χ 92 ) : T1 présente une dispersion non
2
significativement différente de celle attendue d’après la loi de Poisson.

à 23-1 soit 22 degrés de liberté ( χ 22 ) : T2 présente une dispersion
2
très significativement supérieure à celle attendue d’après la loi de Poisson.
3ème groupe de contrôle

Pour chaque série parallèle, xi et T1 i sont calculés (selon 6.2.2.1) :

1 2 3 4 5 6
45 10 17 12 10 11 17 77 4,2727
46 19 19 16 21 19 15 109 1,3670
47 18 17 12 21 23 17 108 4,0000
48 24 22 22 30 12 27 137 8,2701
49 11 12 12 11 12 10 68 0,2941
50 13 0 20 18 14 11 76 19,5263
51 12 12 12 16 14 14 80 1,0000
52 20 24 17 13 12 17 103 5,7573
53 19 24 21 30 16 16 126 6,8571
54 21 15 20 16 11 23 106 5,6226
55 14 25 27 21 17 15 119 7,3025
56 16 17 14 18 14 13 92 1,2609
57 24 15 15 15 13 16 98 4,6122
58 14 7 12 20 15 12 80 6,8500
59 12 8 7 12 11 10 60 2,2000
60 21 10 17 10 13 19 90 7,3333
61 17 7 5 18 3 13 63 19,3810
62 15 14 19 10 21 8 87 8,6552
45 10 17 12 10 11 17 77 4,2727
46 19 19 16 21 19 15 109 1,3670
Chaque valeur de T1 i est comparée à la loi du χ2 à 5 degrés de liberté ( χ 5 ).

2
Pour la série 49, le niveau de charge bactérienne par prise d’essai est plutôt faible (le paragraphe 6.2.1
précise qu’il faut éviter de descendre à 15-20 micro-organismes en moyenne) et
surtout T1 i < χ 5 ; 0 , 005 .
2

Comme expliqué dans le paragraphe 6.2.2.2, ceci constitue une anomalie caractérisée qu’il faut
corriger : le rendement du milieu de culture employé n’est probablement pas ce qu’il devrait être.
L’estimation de l’incertitude de mesure doit être remise à plus tard ; il convient d’abord de solutionner
l’anomalie et de vérifier l’efficacité de l’action corrective.
On suppose dans la suite de l’exemple que l’anomalie a été résolue.

Les indices de dispersion, les facteurs de surdispersion et les statistiques T1 et T 2 sont calculés avec
les 17 séries retenues.
T1 k1 ur
2
T2 k2 u R'
2
114,268 1,344 0,022 77,466 4,842 0,041

à 17.(6-1) degrés de liberté ( χ 85 ) : T1 présente une dispersion
2
significativement supérieure à celle attendue d’après la loi de Poisson.

à 17-1 soit 16 degrés de liberté ( χ 16 ) : T2 présente une dispersion
2
très significativement supérieure à celle attendue d’après la loi de Poisson.
Exploitation des groupes de contrôle obtenus sur des matériaux de référence différents
Les facteurs de dispersion pour les 13 groupes de contrôle du paramètre Escherichia coli obtenus sont
présentés ci-dessous (3 premiers groupes calculés précédemment) :
MR m u r2 uR'2
1 43,599 0,016 0,019
2 53,165 0,001 0,025
3 15,794 0,022 0,041
4 43,828 0,001 0,022
5 52,878 0,016 0,021
6 22,767 0,014 0,031
7 11,683 0,018 0,025
8 35,301 0,014 0,052
9 24,411 0,008 0,041
10 65,834 0,014 0,040
11 17,080 0,019 0,035
12 53,303 0,014 0,043
13 35,772 0,009 0,031
x ..
Les valeurs du niveau de charge ( m =
2 2
) sont placées en abscisse et u r et u R ' en
q⋅p
ordonnée.

0,060
0,050
Facteur de surdispersion 0,040
ur2
0,030
uR'2
0,020
0,010
0,000
0 20 40 60 80
Niveau de charge du matériau (m)
2 2
Les différentes valeurs de u r d’un côté et u R ' de l’autre forment des nuages de points sans points
2
isolés, on peut moyenner séparément les différentes valeurs de u r et les différentes valeurs de
2 2 2
u R ' . De plus, le nuage de points relatif à u R ' est plus haut que le nuage de u r .
On obtient :
2
u r =0,013
2
u R ' =0,033
spécifique au
sur la profession
laboratoire
2 1
= λ est la charge microbienne
2
CV Poisson CV Poisson où
λ
2 2 3 4
ur = u A 0,013
2 2 2 6 7
u R' = u A + u B 0,033
2 2 2 2 8 9
uR = u A + uB + uC
Le laboratoire participe aux essais d’aptitude organisés par l’Association Générale des Laboratoires
d’Analyses de l’Environnement (A.G.L.A.E.) depuis 5 années, au rythme de 4 essais par an. Il s’est
adressé à cet organisme pour avoir des estimations du facteur de surdispersion dans des conditions de
répétabilité et dans des conditions de reproductibilité (l’information n’étant pas disponible dans des
conditions de reproductibilité intralaboratoire).
2
Un dossier complet a été retourné par l’organisme - dossier à insérer ; compléter avec u r - . Il est
2
établi que selon l’état physiologique des germes présents, u R varie :

2
- sur une eau dopée : u R = 0 , 015
2
- sur pastilles Bioréférence : u R = 0 , 344
spécifique au
sur la profession
laboratoire
2 1
= λ est la charge microbienne
2
CV Poisson CV Poisson où
λ
2 2 3
ur = u A 0,013 à compléter
2 2 2 6 7
u R' = u A + u B 0,033
2 2 2 2 8
uR = u A + uB + uC 0,344
Pour information, mais doit être rédigé : passage aux limites de détections
u r = 0 ,113
u R ' = 0 ,181
Les valeurs réglementaires du paramètre Escherichia coli en utilisant cette méthode sont des seuils
d’absence :
- 0 / 100ml pour les eaux de distribution et eaux de piscine,
- 0 / 250ml pour les eaux vendues en bouteille.
L’incertitude de mesure autour du seuil d’absence va être intéressante, il vaut mieux l’exprimer sous
forme d’une limite de détection.
Dans l’exemple traité, la dispersion n’est donc pas réduite à la loi de Poisson.
En conditions de répétabilité intralaboratoire et avec une probabilité de 95% (p0 = 0,05), on obtient :
0 , 05 − 0 , 013 − 1
LD = = 3 , 054
0 , 013
En conditions de reproductibilité intralaboratoire et avec une probabilité de 95% (p0 = 0,05), on

obtient :
0 , 05 − 0 , 033 − 1
LD = = 3 ,148
0 , 033
L’incertitude au niveau intralaboratoire doit être exprimée par la limite de détection 3,054 E. coli par
100 ml en moyenne en conditions de répétabilité, ou LD = 3,148 E. coli par 100 ml en moyenne en
conditions de reproductibilité.
Elle signifie que seules les charges bactériennes supérieures à 3,054 par 100 ml en moyenne (ou 3,148
selon l’usage) peuvent raisonnablement être considérées comme détectées à coup sûr. Inversement,

tout résultat négatif (présence non détectée) doit être considérée a priori comme une charge inférieure
à 3,054 E. coli en moyenne par 100 ml.
Attention : ne pas repiquer toutes les colonies typiques pour confirmation conduit à des valeurs de LD
plus élevées.
Remarque : l’incertitude de mesure obtenue est proche de celle attendue avec la dispersion de Poisson
uniquement.

ANNEXE E
Table des fractiles de la loi du χ2 : χ ddl

2
;p
ddl p=0,005 p=0,025 p=0,975 p=0,995 ddl p=0,005 p=0,025 p=0,975 p=0,995
1 0,00004 0,00098 5,02389 7,87944 51 28,73471 33,16179 72,61599 80,74666
2 0,01003 0,05064 7,37776 10,59663 52 29,48116 33,96813 73,80986 82,00083
3 0,07172 0,21580 9,34840 12,83816 53 30,23003 34,77633 75,00186 83,25255
4 0,20699 0,48442 11,14329 14,86026 54 30,98125 35,58634 76,19205 84,50190
5 0,41174 0,83121 12,83250 16,74960 55 31,73476 36,39811 77,38047 85,74895
6 0,67573 1,23734 14,44938 18,54758 56 32,49049 37,21159 78,56716 86,99376
7 0,98926 1,68987 16,01276 20,27774 57 33,24838 38,02674 79,75219 88,23638
8 1,34441 2,17973 17,53455 21,95495 58 34,00838 38,84351 80,93559 89,47687
9 1,73493 2,70039 19,02277 23,58935 59 34,77043 39,66186 82,11741 90,71529
10 2,15586 3,24697 20,48318 25,18818 60 35,53449 40,48175 83,29768 91,95170
11 2,60322 3,81575 21,92005 26,75685 61 36,30050 41,30314 84,47644 93,18614
12 3,07382 4,40379 23,33666 28,29952 62 37,06842 42,12599 85,65373 94,41865
13 3,56503 5,00875 24,73560 29,81947 63 37,83819 42,95028 86,82959 95,64930
14 4,07467 5,62873 26,11895 31,31935 64 38,60978 43,77595 88,00405 96,87811
15 4,60092 6,26214 27,48839 32,80132 65 39,38314 44,60299 89,17715 98,10514
16 5,14221 6,90766 28,84535 34,26719 66 40,15824 45,43136 90,34890 99,33043
17 5,69722 7,56419 30,19101 35,71847 67 40,93502 46,26103 91,51936 100,55401
18 6,26480 8,23075 31,52638 37,15645 68 41,71347 47,09198 92,68854 101,77592
19 6,84397 8,90652 32,85233 38,58226 69 42,49353 47,92416 93,85647 102,99621
20 7,43384 9,59078 34,16961 39,99685 70 43,27518 48,75757 95,02318 104,21490
21 8,03365 10,28290 35,47888 41,40106 71 44,05838 49,59216 96,18870 105,43203
22 8,64272 10,98232 36,78071 42,79565 72 44,84310 50,42792 97,35305 106,64763
23 9,26042 11,68855 38,07563 44,18128 73 45,62930 51,26481 98,51626 107,86174
24 9,88623 12,40115 39,36408 45,55851 74 46,41696 52,10283 99,67835 109,07438
25 10,51965 13,11972 40,64647 46,92789 75 47,20605 52,94194 100,83934 110,28558
26 11,16024 13,84391 41,92317 48,28988 76 47,99653 53,78212 101,99925 111,49538
27 11,80759 14,57338 43,19451 49,64492 77 48,78839 54,62336 103,15811 112,70380
28 12,46134 15,30786 44,46079 50,99338 78 49,58159 55,46563 104,31594 113,91087
29 13,12115 16,04707 45,72229 52,33562 79 50,37612 56,30890 105,47275 115,11661
30 13,78672 16,79077 46,97924 53,67196 80 51,17193 57,15317 106,62857 116,32106
31 14,45777 17,53874 48,23189 55,00270 81 51,96902 57,99842 107,78341 117,52422
32 15,13403 18,29076 49,48044 56,32811 82 52,76735 58,84462 108,93729 118,72613
33 15,81527 19,04666 50,72508 57,64845 83 53,56691 59,69175 110,09024 119,92682
34 16,50127 19,80625 51,96600 58,96393 84 54,36767 60,53981 111,24226 121,12629
35 17,19182 20,56938 53,20335 60,27477 85 55,16960 61,38878 112,39337 122,32458
36 17,88673 21,33588 54,43729 61,58118 86 55,97270 62,23863 113,54360 123,52170
37 18,58581 22,10563 55,66797 62,88334 87 56,77694 63,08935 114,69295 124,71768
38 19,28891 22,87848 56,89552 64,18141 88 57,58230 63,94094 115,84144 125,91254
39 19,99587 23,65432 58,12006 65,47557 89 58,38876 64,79336 116,98908 127,10628
40 20,70654 24,43304 59,34171 66,76596 90 59,19630 65,64662 118,13589 128,29894
41 21,42078 25,21452 60,56057 68,05273 91 60,00491 66,50069 119,28189 129,49053
42 22,13846 25,99866 61,77676 69,33600 92 60,81457 67,35556 120,42708 130,68107
43 22,85947 26,78537 62,99036 70,61590 93 61,62525 68,21123 121,57148 131,87058
44 23,58369 27,57457 64,20146 71,89255 94 62,43695 69,06767 122,71511 133,05906
45 24,31101 28,36615 65,41016 73,16606 95 63,24965 69,92487 123,85797 134,24655
46 25,04133 29,16005 66,61653 74,43654 96 64,06333 70,78282 125,00007 135,43305
47 25,77456 29,95620 67,82065 75,70407 97 64,87797 71,64152 126,14144 136,61858
48 26,51059 30,75451 69,02259 76,96877 98 65,69357 72,50094 127,28207 137,80315
49 27,24935 31,55492 70,22241 78,23071 99 66,51011 73,36108 128,42199 138,98678
50 27,99075 32,35736 71,42020 79,48998 100 67,32756 74,22193 129,56120 140,16949

ddl p=0,005 p=0,025 p=0,975 p=0,995 ddl p=0,005 p=0,025 p=0,975 p=0,995
105 71,42823 78,53640 135,24699 146,06960 460 385,62947 402,46773 521,31971 541,88024
110 75,55005 82,86705 140,91657 151,94848 470 394,78481 411,82479 531,96267 552,72497
115 79,69158 87,21279 146,57105 157,80759 480 403,94909 421,18866 542,59882 563,56076
120 83,85157 91,57264 152,21140 163,64818 490 413,12203 430,55913 553,22837 574,38789
125 88,02887 95,94573 157,83850 169,47142 500 422,30337 439,93600 563,85153 585,20662
130 92,22246 100,33126 163,45314 175,27834 510 431,49286 449,31907 574,46848 596,01720
135 96,43140 104,72852 169,05604 181,06986 520 440,69025 458,70816 585,07941 606,81986
140 100,65484 109,13687 174,64783 186,84684 530 449,89532 468,10311 595,68448 617,61485
145 104,89203 113,55571 180,22912 192,61005 540 459,10786 477,50374 606,28387 628,40237
150 109,14225 117,98452 185,80045 198,36021 550 468,32765 486,90989 616,87774 639,18263
155 113,40486 122,42278 191,36230 204,09794 560 477,55451 496,32143 627,46622 649,95582
160 117,67926 126,87005 196,91514 209,82387 570 486,78824 505,73819 638,04947 660,72215
165 121,96491 131,32591 202,45939 215,53852 580 496,02866 515,16006 648,62762 671,48177
170 126,26130 135,78996 207,99543 221,24242 590 505,27560 524,58689 659,20081 682,23488
175 130,56796 140,26186 213,52363 226,93603 600 514,52890 534,01856 669,76915 692,98163
180 134,88445 144,74126 219,04432 232,61980 610 523,78839 543,45495 680,33278 703,72218
185 139,21037 149,22785 224,55781 238,29413 620 533,05393 552,89594 690,89180 714,45668
190 143,54533 153,72135 230,06439 243,95940 630 542,32537 562,34143 701,44633 725,18529
195 147,88898 158,22148 235,56433 249,61596 640 551,60256 571,79130 711,99647 735,90813
200 152,24099 162,72798 241,05790 255,26416 650 560,88538 581,24546 722,54233 746,62535
205 156,60105 167,24063 246,54531 260,90429 660 570,17370 590,70380 733,08400 757,33707
210 160,96887 171,75920 252,02681 266,53666 670 579,46739 600,16623 743,62158 768,04341
215 165,34416 176,28347 257,50260 272,16155 680 588,76633 609,63266 754,15517 778,74451
220 169,72668 180,81325 262,97288 277,77920 690 598,07041 619,10300 764,68484 789,44047
225 174,11617 185,34835 268,43784 283,38987 700 607,37951 628,57716 775,21068 800,13140
230 178,51241 189,88859 273,89765 288,99379 710 616,69353 638,05508 785,73278 810,81741
235 182,91518 194,43381 279,35248 294,59118 720 626,01236 647,53665 796,25122 821,49861
240 187,32426 198,98385 284,80248 300,18224 730 635,33591 657,02182 806,76606 832,17509
245 191,73946 203,53857 290,24782 305,76717 740 644,66407 666,51050 817,27739 842,84696
250 196,16060 208,09780 295,68863 311,34616 750 653,99676 676,00263 827,78527 853,51430
260 205,02000 217,22932 306,55719 322,48702 760 663,33389 685,49813 838,28978 864,17720
270 213,90111 226,37741 317,40919 333,60613 770 672,67536 694,99694 848,79097 874,83576
280 222,80276 235,54115 328,24552 344,70469 780 682,02109 704,49900 859,28893 885,49006
290 231,72386 244,71971 339,06703 355,78380 790 691,37100 714,00424 869,78369 896,14017
300 240,66339 253,91233 349,87447 366,84445 800 700,72502 723,51261 880,27534 906,78618
310 249,62046 263,11831 360,66855 377,88755 810 710,08305 733,02403 890,76392 917,42817
320 258,59421 272,33701 371,44990 388,91396 820 719,44505 742,53847 901,24801 928,06620
330 267,58387 281,56784 382,21912 399,92445 830 728,81092 752,05586 911,73211 938,70036
340 276,58873 290,81025 392,97676 410,91974 840 738,18059 761,57615 922,21183 949,33070
350 285,60812 300,06373 403,72333 421,90048 850 747,55401 771,09929 932,68870 959,95731
360 294,64142 309,32781 414,45930 432,86732 860 756,93110 780,62522 943,16277 970,58023
370 303,68805 318,60205 425,18509 443,82080 870 766,31181 790,15391 953,63409 981,19955
380 312,74748 327,88604 435,90114 454,76149 880 775,69606 799,68530 964,10271 991,81532
390 321,81920 337,17940 446,60782 465,68987 890 785,08380 809,21934 974,56867 1002,42760
400 330,90275 346,48177 457,30548 476,60643 900 794,47497 818,75600 985,03203 1013,03645
410 339,99769 355,79282 467,99447 487,51159 910 803,86952 828,29522 995,49281 1023,64192
420 349,10360 365,11222 478,67510 498,40578 920 813,26738 837,83697 1005,95107 1034,24408
430 358,22008 374,43969 489,34766 509,28938 930 822,67170 847,38363 1016,40441 1044,83978
440 367,34678 383,77493 500,01245 520,16276 940 832,07603 856,93030 1026,85775 1055,43547
450 376,48336 393,11769 510,66971 531,02627 950 841,48035 866,47696 1037,31109 1066,03117

Bibliographie - compléter -
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Incertitude Microbio

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AFNOR

Membres de la Commission T90D

Lille, le 17 février 2006

Chère Madame, Cher Monsieur,

Comme vous pourrez le constater, la rédaction du document avance rapidement.

Association Générale des Laboratoires d’Analyse de l’Environnement

Adresse postale : 24, boulevard Jean-Baptiste Lebas 59000 LILLE

Protocole d'estimation de l'incertitude de mesure associée

Correspondance A la date de publication du présent document, il n'existe pas de travaux

Analyse Le présent document fournit un protocole pour estimer l'incertitude de mesure

Descripteurs Thésaurus International Technique: eau, essai des eaux, analyse

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3.1 Définitions d’ordre général

3.1.2 Exactitude d’un mesurage

Norme incertitude microbio. - version du 17/02/06 5/37

3.1.8 Incertitude de mesure

Norme incertitude microbio. - version du 17/02/06 6/37

3.2.1 Méthode microbiologique validée

3.2.2 Résultat d’une analyse microbiologique

3.2.3 Prise d'essai

3.2.4 Méthode de dénombrement de type énumératif ou méthode énumérative

3.2.5 Méthode de dénombrement de type quantique ou méthode quantique

3.2.6 Série analytique

3.2.7 Limite de détection

3.3 Définitions et symboles statistiques

3.3.1 Moyenne arithmétique m

Norme incertitude microbio. - version du 17/02/06 7/37

3.3.2 Variance s2 (et écart-type s)

3.3.3 Distribution de Poisson

3.3.4 Distribution binomiale négative

3.3.6 Indice de dispersion k

Norme incertitude microbio. - version du 17/02/06 8/37

3.3.7 Coefficient de variation CV

3.3.8 Facteur de surdispersion u

Par extension, le facteur de surdispersion u2 est l’incertitude aléatoire supplémentaire de la

Soit un ensemble de n résultats provenant du dénombrement répété d’une suspension bactérienne.

L’estimation de l’incertitude de mesure associée à un résultat d’analyse pour les méthodes de

4.1 Méthode microbiologique validée

Deux types de validation sont prescrits :

Norme incertitude microbio. - version du 17/02/06 9/37

4.2 Méthode sous contrôle qualité

La permanence de la qualité des résultats produits est, après la validation de la méthode de

De nombreux documents traitent du contrôle de la qualité analytique des méthodes microbiologiques

4.3 Pré-requis pour l’application de la présente norme

Préalablement à toute tentative d’évaluation de l’incertitude de mesure conformément à la présente

5.1 Rédaction d’un dossier d’estimation de l’incertitude

Norme incertitude microbio. - version du 17/02/06 10/37

5.2 Identifier et décrire la méthode de dénombrement

Concernant la description du processus de dénombrement, il est vivement conseillé de procéder sous

5.3 Lister les facteurs sources de variabilité

5.3.1 Variabilité inhérente à la méthode