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Cours Techniques de Contrôle Microbiologique
Cours Techniques de Contrôle Microbiologique
Département de Microbiologie
Cours
Réalisé par
HAICHOUR NORA
i
Listes des figures et des tableaux
Figure 1. Distribution des échantillons d’après l’ICMSF.......................................................................... 6
Figure 2. Ecouvillonnage ......................................................................................................................... 9
Figure 3. Broyeurs pour échantillons solides ........................................................................................ 11
Figure 4. Préparation des dilutions ....................................................................................................... 12
Figure 5. Cellule de Malassez ................................................................................................................ 14
Figure 6. Lecture de la cellule de Malassez ........................................................................................... 15
Figure 7. Filtration sur membrane ........................................................................................................ 17
Figure 8. Galeries d’identification ......................................................................................................... 23
Figure 9. Lames gélosées....................................................................................................................... 25
ii
Techniques de contrôle microbiologiques
Les fabrications dans les bio-industries supposent la maîtrise des développements microbiens, aussi
bien des souches de cultures utilisées en fermentation, si une telle étape intervient dans la fabrication,
que des microorganismes contaminants. En effet, un levain dont le taux de croissance serait trop faible
ne permet pas de réaliser des fermentations correctes. Par ailleurs des microorganismes contaminants
peuvent perturber, à des degrés divers, le déroulement de la fabrication et mettre en cause la qualité
et la conservation du produit final.
- la toxine est excrétée dans le produit (exotoxine). A partir d’une certaine quantité de toxine, le
produit est dangereux à consommer même si le microorganisme n’est plus vivant dans le produit. C’est
le cas de staphylocoques pathogènes ou de Clostridium botulinum ;
- la toxine n’est pas secrétée mais reste dans les cellules microbiennes (endotoxine). Pour que le
produit soit dangereux pour le consommateur, le microorganisme doit être présent et vivant. C’est le
cas des entérobactéries par exemple.
Les contrôles microbiologiques permettent donc d’éviter la présence de microorganismes dans les
produits afin de ne pas risquer une altération de la qualité hygiénique des produits finis ou au moins
détecter ces microorganismes s’ils sont présents dans les produits finis avant leur commercialisation.
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La bonne qualité microbiologique (hygiénique et marchande) est fonction de très nombreux facteurs ;
le microbiologiste se doit néanmoins de définir le plus rapidement possible la notion quantitative et
qualitative de flore normale de son produit ou de ses matières premières (microorganismes
«habituels» et tolérables) et d’une flore contaminante dont le seuil de tolérance sera défini en
fonction du risque que fait courir cette flore au consommateur.
2. Politique de contrôle
La politique de contrôle dans chaque usine doit être établie en faisant appel à la réflexion et au bon
sens pour éviter des pertes importantes dues à des interventions tardives. Le contrôle microbiologique
doit donc permettre de surveiller pas à pas les fabrications. Le contrôle microbiologique occupe une
place privilégiée dans les procédures de mise sous assurance-qualité. Il comporte quatre démarches
en interaction :
- L’évaluation (par exemple d’un niveau de qualité existant) ;
- La définition d’un objectif (amélioration de la qualité) ;
- La préparation (mise en place de moyens nécessaires pour atteindre l’objectif retenu) ;
- L’exécution (réalisation de la production à l’aide des dispositifs mis en place).
Le système HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point) ou encore ADPCM (Analyse des Dangers et
des Points Critiques pour leur Maîtrise) utilise une démarche où le contrôle microbiologique joue un
rôle essentiel. En effet, à chaque point critique, en se basant sur des critères microbiologiques, un
niveau seuil (défini) de contamination microbienne ne doit pas être dépassé.
Les normes sont des spécifications microbiologiques adoptées par la législation qui s’adressent au
produit fini et fixent les limites acceptables de présence de microorganismes donnés dans des produits
bien définis.
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FAO (Food and Agriculture Organisation)- L’OMS (Organisation mondiale de la Santé)- L'ISO
(Organisation Internationale de Normalisation)- Le comité technique 34 (CT34) concernant les produits
agroalimentaires- Le Codex alimentarius crée en 1963 par la FAO et l'OMS- Le CEN (Comité européen
de normalisation) ...
- Les contrôles préventifs sont effectués sur les matières premières et les différents adjuvants.
Dans le cas où le processus de fabrication fait intervenir une fermentation, des contrôles
microbiologiques sur le levain sont nécessaires.
- Les contrôles en cours de fabrication comprennent les contrôles microbiologiques sur le produit lui-
même mais aussi sur les facteurs ayant une influence sur la qualité du produit comme l’hygiène des
matériels, des locaux et du personnel. Le nombre des contrôles est défini suivant la longueur des
chaines de fabrication (durée) et les risques de contamination possible.
- Les contrôles des produits finis déterminent la qualité microbiologique du produit fini et sa
conformité aux normes officielles ou aux normes établies par l’usine.
- Les microorganismes responsables d’une altération de la qualité hygiénique, comme les germes de
contamination fécale (entérobactéries) ou les germes pathogènes de contamination de produits
manipulés (staphylocoques) sont moins systématiquement recherchés dans les produits faisant
intervenir une biotechnologie que dans les autres produits alimentaires. Certains produits par leurs
propriétés physico-chimiques (pH, activité d’eau, alcool) ne permettent pas le développement de ces
microorganismes. Cependant dans certains produits (les laits fermentés, les yaourts, les additifs
alimentaires ou les produits à usage pharmacologique), ces microorganismes et particulièrement les
coliformes doivent être recherchés notamment dans les produits finis.
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- Dans les biotechnologies mettant en œuvre un levain bactérien les contaminants les plus redoutés
sont les bactériophages. Il convient donc de contrôler les levains et de prendre des précautions contre
ces microorganismes en cours de fabrication.
- Obtenir un échantillon intègre afin d’assurer le maintien de l’état du produit tel qu’il
existe au moment de l’échantillonnage jusqu’à l’analyse. Toutes les mesures nécessaires doivent donc
être prises pour prévenir toute contamination, prolifération ou destruction microbienne durant la
manutention et l’entreposage des échantillons.
Comme pour tout échantillon soumis à des essais microbiologiques, lorsque des produits peuvent faire
l’objet d’une action légale (saisie, poursuite, confiscation ou élimination), la chaîne de froid et la chaîne
de possession doivent être respectées. Il doit être possible de démontrer que l’échantillon a été
conservé chambré, réfrigéré ou congelé, selon le cas, et qu’il n’y a pas eu d’interruption de la
possession à partir du prélèvement jusqu’à l’analyse.
3.1.1. Echantillonnage
Un échantillonnage représentatif est essentiel quand l’analyse a pour but de détecter la présence de
germes pathogènes ou de toxines qui peuvent être distribués de façon hétérogène dans l’aliment ou
quand la commercialisation d’un produit dépend de la qualité microbiologique en relation avec les
normes imposées par la législation.
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Il est nécessaire, en tout premier lieu, de tenir compte du contexte et d’établir le but
poursuivi lors du prélèvement des échantillons :
- Echantillon, une quantité de produit prélevé d’un lot et soumis à des essais en laboratoire. Un
échantillon peut consister en une ou plusieurs unités d’échantillonnage.
- Unité d’échantillonnage, portion ou contenant individuel de produit prélevé au hasard dans un lot.
Une unité d’échantillonnage peut correspondre à un échantillon.
- Cadre d’échantillonnage, le regroupement de toutes les unités qui nous intéressent, dans un
espace-temps bien défini. L’échantillon décrit la population dont il est issu pour une période de
temps et un espace précis.
Exemples :
- La vérification de la qualité de la glace comparée à la vérification de la potabilité de l’eau utilisée pour
produire la glace.
- La vérification de la qualité d’un sandwich au poulet comparée à la qualité du poulet cuit avant
manipulations.
- Le cadre d’échantillonnage des fromages fabriqués à Sétif durant l’année en cours ne représente pas
nécessairement la population de fromages fabriqués l’année précédente, de même qu’il ne représente
pas la population des fromages fabriqués en Algérie. Dans ce cas, il faut préciser que le cadre
d’échantillonnage est l’ensemble des fromages fabriqués pendant une année sur un territoire
particulier, à Sétif.
Les réglementations fixant des exigences obligent à prendre en considération une combinaison de
critères. Le but est de se faire une meilleure idée de la répartition de la contamination, et en même
temps d'intégrer une notion d'avertissement. Dans ce cas, les critères sont représentés par les lettres
n, M, m et c :
n étant le nombre d'échantillons individuels devant être prélevés (généralement 5, parfois 10) ;
5
M une valeur maximum absolue qui ne peut être dépassée par aucun des n échantillons analysés ;
m une valeur maximum relative qui est toujours inférieure à M. Le symbole m représente la limite
permettant de répartir les échantillons en 2 groupes : les acceptables (valeur ≤ m) et les inacceptables
(valeur ≥ m). Pour certains microorganismes dangereux m peut être égal à 0.
c le nombre d'échantillons parmi ces n qui peuvent dépasser la valeur m (mais qui doivent évidemment
toujours être inférieurs à M).
Exemple :
Il y a pour le nombre de staphylocoques dans le fromage au lait cru une exigence dont les valeurs sont
n = 5, M = 10000/g, m = 1000/g et c = 2. Cela signifie que 5 échantillons doivent être prélevés, qu'aucun
d'entre eux ne peut contenir plus de 10000 staphylocoques par gramme et que 2 échantillons au
maximum peuvent avoir une valeur comprise entre 1000/g et 10000/g. Pour les pathogènes, souvent
on ne mentionne que n et c=0, ce qui suppose implicitement que M = m = 0 (pathogène absent dans
tous les n échantillons).
Quand un microorganisme donné est toléré dans un aliment 3 catégories d’échantillons sont définies :
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- Plan d’échantillonnage à 2 classes
Ce plan donne des résultats permettant de déterminer 2 classes de contaminations. Ce type de plan
n’accepte aucune tolérance et correspond le plus souvent aux conclusions : absence dans (le résultat
est bon et le produit jugé satisfaisant) ou encore présence dans (le résultat est mauvais et le produit
est déclaré impropre à la consommation). Avec un plan d’échantillonnage à 2 classes (catégories 1, 3),
n représente le nombre d’échantillons examinés. Il existe deux possibilités pour ce type de plan :
Le symbole c représente le nombre d’échantillons tolérés au-delà de la valeur seuil, nombre qui permet
de juger le lot comme satisfaisant.
Pour la plupart des autres produits on a avec cette bactérie et d’autres microorganismes très
dangereux (Listeria, Brucella , etc ) : m = 0, n = 5 et c = 0.
Pour les viandes de boucherie conditionnées sous vide ou non, réfrigérées ou congelées on a pour la
Flore Aérobie Mésophile m = 5.104, n = 5 et c = 0.
La rigueur du plan dépend des valeurs de n et de c. Plus grand est n pour une valeur donnée de c,
meilleure sera la qualité des lots acceptés. A l’inverse, si pour une valeur donnée de n, c augmente, la
rigueur du plan diminue.
Avec un plan d’échantillonnage à 3 classes (catégories 1, 2, 3), il existe pour c un facteur de précision
supplémentaire qui est le nombre d’échantillons tolérés dont les charges microbiennes sont comprises
entre m et M. La présence d’échantillons entre m et M n’est pas souhaitable mais tolérée. Pour les
valeurs supérieures à M les lots ne peuvent pas être acceptés pour la commercialisation. Ce plan à 3
classes permet de déterminer par des calculs appropriés la probabilité selon laquelle un lot sera
accepté ou refusé en fonction du nombre d’échantillons défectueux qu’il contient. S’il n’y a pas
d’échantillon avec une valeur supérieure à M on est ramené au plan à 2 classes.
Le plan est choisi en fonction de l’estimation du risque pour la santé et du mode d’utilisation de
l’aliment. Les germes sont classés en fonction du risque qu’ils font courir au consommateur en :
- Germes entraînant un risque sévère (Clostridium botulinum, Salmonella typhi, S. paratyphi, Shigella
dysenteriae, Vibrio comma , Brucella melitensis, Listeria monocytogenes , Clostridium perfringens type
C, virus de l’hépatite A).
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- Germes entraînant un risque moyen sans grande diffusion (Bacillus cereus, Brucella abortus,
Clostridium perfringens, Salmonella arizonae, Francisella tularensis, Yersinia enterocolitica,
Pseudomonas aeruginosa , Campylobacter jejuni , etc...).
Le plan à 3 classes est le plus souvent adopté ; la valeur de m est déterminée par les résultats de
l’analyse de nombreux échantillons sur des lots jugés satisfaisants. La valeur de M est plus difficile à
fixer et est fonction du produit, de la bactérie recherchée et de la méthode employée.
Les valeurs de n et c sont choisies en fonction du niveau souhaité d’acceptabilité ou de rejet des lots.
Il est évident que plus n sera grand et plus c sera petit et meilleur sera le contrôle réalisé.
M : seuil limite au-delà duquel les résultats sont considérés comme non satisfaisants sans que le
produit soit dangereux. Les valeurs de M sont fixées à : M = 10 m quand les dénombrements sont
réalisés en milieux solides et M = 30 m pour des numérations en milieu liquide
Qualité du lot
Satisfaisante ou acceptable : aucun résultat ne dépasse M
Satisfaisante : les valeurs déterminées sont inférieures à : 3 m lors de numérations en milieu solide et
10 m en milieu liquide.
Acceptable : les valeurs déterminées sont comprises entre : 3 m et 10 m en milieu solide et 10 m et 30
m en milieu liquide avec le plan n = 5 et c = 2.
Non satisfaisant : des valeurs supérieures à M.
Par microscopie (après étalement d’un volume donné voisin de 10 µl de produit puis fixation et
coloration au bleu de méthylène par exemple) on compte sur 20 champs le nombre de germes
respectivement observés à partir de la boîte incubée (n) et de la boîte témoin (n’). n / n’ doit être
inférieur à 100.
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3.1.3. Conditions du prélèvement
Les conditions essentielles à respecter pour le prélèvement sont d’abord le respect des règles
d’asepsie (travail correct du microbiologiste) et la non modification des flores présentes dans le
produit. Dans la mesure du possible, les échantillons du produit à analyser doivent être amenés au
laboratoire dans leur conditionnement d’origine, ce qui évite certaines contaminations.
Si le produit se présente sous forme de grands volumes (réservoirs à lait etc...) s’assurer de la bonne
homogénéité de la répartition des micro-organismes ; une partie représentative du produit sera
prélevée stérilement. Il est parfois nécessaire de réaliser des prélèvements à divers niveaux de
l’aliment (surface, profondeur d’un aliment solide) ou après broyage et homogénéisation.
Les manipulations effectuées au cours du prélèvement ne doivent en aucun cas être à l’origine d’une
contamination : nécessité d’utiliser des instruments stériles et de travailler stérilement.
Certains instruments doivent être stérilisés sur les lieux du prélèvement. Le trempage dans l’alcool et
le flambage sont parfois insuffisants car la température atteinte n’est pas assez élevée. Il est nécessaire
d’utiliser des flacons propres, secs, étanches, à col large stérilisés au four Pasteur (30 minutes à 1 heure
à 170° - 180°C ou 2 heures à 160°C ce qui a pour but d'éviter le brunissement du coton) ou par
autoclavage à 121°C pendant 30 min ou encore à usage unique et stériles ; leur taille doit être adaptée
au volume de l’échantillon. Les récipients peuvent être en verre, en métal ou en matière plastique
(polyéthylène, polycarbonate, polypropylène). Les récipients de prélèvement doivent posséder un
système de fermeture hermétique. Le prélèvement d’un produit non emballé doit être réalisé dans la
zone de stérilité d’un bec bunsen ou d’un système équivalent.
- Ecouvillonnage, un écouvillon de coton hydrophile est immergé dans une solution stérile de Ringer
au 1/4 ou dans un bouillon tryptone-sel additionné de Tween (0,5‰). Le prélèvement est effectué par
frottement sur la surface du produit ; l’écouvillon est alors immergé dans 10 ml de Ringer au 1/4 ou 10
ml de bouillon tryptone-sel. L’analyse est réalisée à partir de la suspension ainsi obtenue (figure 2)
.
Figure 2. Ecouvillonnage
- Rinçage : cette méthode est utilisée dans le cas de récipients ou de tuyauteries ; un volume connu de
solution stérile est introduit dans le matériel à analyser. Après agitation, le liquide est récupéré et
soumis à l’analyse.
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- Méthode des empreintes : un ruban adhésif préalablement stérilisé par les UV est appliqué sur la
surface à étudier. Après quelques secondes de contact il est retiré et appliqué sur la surface d’un milieu
gélosé approprié. Après quelques heures de contact à la température d’incubation désirée il est retiré
et la boîte est incubée jusqu’à apparition des colonies.
- Méthode du cylindre : un cylindre creux de section connue est appliqué sur la surface à analyser ; on
y introduit alors quelques ml de diluant stérile et après quelques secondes de contact, le diluant est
retiré et analysé.
Les échantillons doivent être immédiatement réfrigérés (dans une glacière propre) s’ils ne sont pas
stables à température ambiante. Les échantillons dont la conservation est assurée à température
ambiante, tels les boîtes de conserve et les produits secs, peuvent être expédiés sans réfrigération.
Les échantillons sont alors transportés le plus rapidement possible au laboratoire en maintenant les
conditions initiales dans lesquelles se trouvait le produit. L’analyse devrait être réalisée dans l’heure
qui suit le prélèvement.
Pour un produit congelé s’assurer qu’il n’y ait pas de décongélation pendant le transport (ce produit
peut être gardé pendant 1 mois avant d’être analysé). La congélation d’un produit provoque une
diminution plus ou moins importante du nombre de germes qu’il contient. Il faut veiller à ce que la
température du produit prélevé soit au moins égale à -18°C, transporter le produit à cette température
et décongeler à l’air ambiant à température voisine de 20°C pendant un temps inférieur à 3 heures,
temps suffisant pour atteindre une texture qui permette le prélèvement.
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Figure 3. Broyeurs pour échantillons solides
Pour les produits liquides (ou semi-liquides) une agitation manuelle vigoureuse en présence de billes
de verre permet d’obtenir une homogénéité satisfaisante.
Broyage manuel au Potter ou en présence de sable stérile ou de billes de verre (mortier) ; ou broyage
avec un broyeur électrique à couteaux (figure 3). Au cours du broyage les germes doivent être
dispersés mais non détruits ; la température ne doit pas trop s’élever (le récipient peut être placé dans
de la glace). Le broyage s’effectue en général avec 10 volumes (ou 9) de diluant pour 1 “volume” de
produit (par exemple 10 g de produit et 100 ml (ou 90) de diluant stérile). Le diluant peut être de l’eau
distillée, de l’eau physiologique, du Ringer au 1/4 ou une solution tryptone-sel, etc.
Tryptone sel Ringer (solution mère) Eau physiologique Eau peptonée tamponnée
Tryptone (1g) NaCl (9g) NaCl (9g) Bacto peptone (20g)
NaCl (8.5g) KCl (0.42g) Eau distillée (1000ml) NaCl (5g)
Eau distillée CaCl2 (0.48g) Na2HPO4 (9g)
(1000ml) NaHCO3 (0.2g) KH2PO4 (1.5g)
pH = 7 Eau distillée (1000ml) Eau distillée (1000ml)
pH = 7.2
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Les dilutions nécessitent la présence de nombreux tubes à essais contenant le plus souvent 9 ml de
diluant stérile et de nombreuses pipettes stériles de 1 et 10 ml. Les pipettes peuvent être remplacées
par des systèmes de pipetage automatique munis de cônes à usage unique (figure 4).
Toutes les manipulations sont à effectuer avec toutes les précautions d’asepsie exigées en
microbiologie. L’introduction éventuelle d’un contaminant ou la contamination de l’opérateur ne
doivent jamais se produire.
Le récipient contenant le liquide à diluer est agité manuellement avec précaution pour éviter les
projections pendant une dizaine de secondes.
On prélève stérilement 1 ml de ce liquide (aspirer et refouler une fois avant le prélèvement) que l’on
introduit dans un tube contenant 9 ml de diluant stérile.
Le tube est agité par des mouvements de rotation ou au moyen d’un Vortex. On obtient ainsi une
dilution au 1/10.
Avec une nouvelle pipette de 1 ml on prélève 1 ml de cette dilution que l’on introduit dans un
nouveau tube de diluant de 9 ml ; on obtient une dilution au 1/100 et ainsi de suite jusqu’au niveau
de dilution recherché.
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3.5. La revivification
Les micro-organismes sont souvent «endommagés» mais non tués au cours des traitements
technologiques (déshydratation, chaleur, froid, etc.) appliqués aux produits alimentaires ou par suite
de leur vieillissement. Ces altérations se reflètent dans certaines de leurs propriétés physiologiques en
particulier au niveau de leur phase de latence qui est augmentée ou de leurs besoins nutritionnels ou
encore quant à leur sensibilité aux conditions de milieu défavorables (pH, sels biliaires, colorants, sels,
etc.). En général ces altérations sont réversibles et après leur disparition les bactéries récupèrent leurs
propriétés initiales, en particulier au niveau de leur croissance ou de leur pouvoir pathogène.
La nécessité de faciliter le «rétablissement» des cellules ayant subi des altérations sublétales, c’est-à-
dire leur «réanimation» ou encore leur revivification, s’impose avant de les soumettre à des milieux
sélectifs souvent peu favorables à la croissance du fait de la présence d’inhibiteurs. En effet, la
présence de cellules endommagées peut entraîner des variations dans les numérations ou porter à
croire qu’il n’y a pas ou peu de germes et donc pas ou aucun risque pour le consommateur. Ceci est
particulièrement important quand il s’agit de déterminer si des micro-organismes pathogènes ou
indicateurs sont présents ou non.
Bien que de nombreuses techniques de numération soient utilisables, il n’existe pas à l’heure actuelle
de technique parfaite. Certaines méthodes ne permettent pas de différentier les germes vivants des
germes morts, d’autres s’avèrent incapables de compter individuellement les cellules microbiennes
lorsque celles-ci sont associées (Staphylococcus, Streptococcus, mycélium, etc) et permettent
d’évaluer des unités formant colonies (UFC) ou des unités formant trouble (UFT)
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Figure 5. Cellule de Malassez
Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une chambre de
comptage de volume connu. C’est une lame épaisse en verre, comportant des rigoles et un quadrillage.
Lorsque la suspension cellulaire est trop concentrée, il est nécessaire de réaliser une dilution préalable
de façon à permettre le comptage des cellules au microscope.
Le volume de comptage est déterminé par la surface du quadrillage gravé sur la lame et la profondeur
de la chambre. Le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm3 = 10-6 dm3 (10-3 cm3
donc 1µl), Chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible, soit 0,01 mm3 = 10-8 dm3.
• Humecter les deux plateaux latéraux. Faire adhérer parfaitement la lamelle aux plateaux latéraux :
pour cela placer la lamelle sur ces plateaux, puis à l’aide des pouces posés sur la lamelle, exercer une
pression sur la lamelle tout en pratiquant un mouvement de va et vient jusqu’à perception d’une
résistance.
• Placer la cellule de comptage sur une surface plane. Homogénéiser la suspension cellulaire, et
prélever celle-ci à l’aide d’une pipette Pasteur. Remplir la chambre de comptage par capillarité, en
plaçant la pointe de la pipette légèrement inclinée près de la lamelle sur la plate-forme centrale
quadrillée. Le remplissage doit être fait en une seule fois, sans bulles d’air, et sans faire déborder le
liquide dans les rigoles. Laisser sédimenter les cellules sur le quadrillage quelques minutes, et passer à
la numération.
• Observer ensuite à l’objectif x40 pour réaliser le comptage (1 rectangle par champ).
• Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalité des 100 rectangles du quadrillage.
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Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage, compter seulement celles qui
chevauchent 2 arêtes du rectangle sur 4 (en pratique, on choisit de prendre en compte les cellules
chevauchant la ligne horizontale supérieure, et la ligne verticale droite).
• Après utilisation, la lame porte-objet et la lamelle planée sont immergées dans un bain d’eau de Javel
pendant 5 minutes, puis sont rincées avec de l’eau distillée et essuyées avec du papier (sans frotter,
en particulier au niveau du quadrillage).
Sur chaque boîte l’origine de l’analyse, le milieu utilisé et la dilution correspondante sont enregistrés
(sur le côté de façon à ne pas être gêné par la suite pour le comptage).
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4.2.2. Technique de numération en surface de la gélose
100 à 500 microlitres (pipette graduée ou mieux pipette automatique) du milieu à analyser sont
déposés à la surface de la gélose et immédiatement répartis de façon uniforme à la surface du milieu
au moyen d’un ensemenceur stérile du type pipette râteau. La pipette râteau est «stérilisée» entre
deux étalements par immersion dans de l’éthanol, l’éthanol adsorbé sur le verre étant ensuite
enflammé.
Après la période d’incubation nécessaire, procéder au comptage des colonies pour chaque boîte
contenant moins de 300 colonies. Dans le cas de microorganismes donnant des colonies de taille
élevée, la valeur 300 paraît très élevée. Il est possible que 2 unités microbiennes ou plus se retrouvent
à proximité immédiate lors de l'inoculation et donnent une seule grosse colonie.
Le calcul de la concentration en micro-organismes [N] présents dans l’échantillon essai est une
moyenne pondérée à partir des résultats de 2 dilutions successives.
Pour que le calcul soit valable, il est nécessaire de compter sur au moins une boîte contenant au moins
15 colonies.
• Σc la somme de toutes les colonies comptées sur toutes les boîtes retenues (et tel que au moins une
des boîtes comptées contenait au moins 15 colonies).
• V le volume inoculum appliqué à chaque boîte (généralement 1ml en masse et 0.1ml en surface)
• n1 le nombre de boites retenues à la première dilution (en général 2).
• n2 le nombre de boites retenues à la deuxième dilution (en général 2).
• d le taux de dilution de la première dilution retenue pour les comptages sur boîte.
Si aucune boîte ne contient au moins 15 colonies, faire la moyenne arithmétique des colonies
comptées sur les 2 boîtes de la plus petite dilution d et tenir compte de cette dilution. Bien préciser
dans l’expression du résultat qu’il s’agit alors d’une estimation en rédigeant ainsi : « nombre estimé
de micro-organismes par millilitre = ... ».
Le filtre est alors posé sur la surface d’un milieu gélosé, face portant les micro-organismes vers le haut.
Après incubation, les colonies formées à la surface du filtre sont comptées.
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Figure 7. Filtration sur membrane
Le choix des dilutions à tester : dépend de la population estimée, le but étant d’obtenir, pour une
analyse statistique optimale des résultats :
- une dilution contenant moins d’un microorganisme dans l’inoculum utilisé
- une dilution contenant plus d’un microorganisme dans l’inoculum utilisé
Le choix du nombre d’essais par dilution dépend de la précision souhaitée pour les résultats en fonction
de leur analyse statistique. En général trois tubes sont ensemencés par dilution, un ou deux tubes sont
ensemencés si une précision moins importante est suffisante, cinq tubes ou même plus sont
ensemencés si une précision plus importante est demandée.
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4.3.1. Dénombrement à un seul essai
Dans ce cas, 1 tube par dilution est ensemencé avec 1 ml d’inoculum. Exemple de résultats
obtenus (tableau 2) :
- il y a au moins un micro-organisme dans l’inoculum (1 ml) de la plus grande dilution (10-2) présentant
encore un trouble : la concentration est donc d’au moins 102 micro-organismes par ml de produit ou
de « suspension mère » non dilués ;
- il y a moins de un micro-organisme dans l’inoculum (1 ml) de la première dilution (10-3) ne présentant
plus de trouble : la concentration est donc strictement inférieure à 103 micro-organismes par ml de
produit ou de « suspension mère » non dilués.
Le résultat peut s’exprimer selon l’intervalle : 102 ≤ N micro-organismes/ml < 103. La concentration du
produit analysé est comprise entre 102 et 103 micro-organismes dans 1 ml.
- Chaque chiffre correspond au nombre de tubes « positifs » pour une dilution donnée ;
- Les trois chiffres correspondent à trois dilutions successives ;
- Le chiffre des centaines correspond à la plus faible dilution (donc à la plus forte concentration en
micro-organismes), celui des dizaines à la dilution intermédiaire et celui des unités à la plus grande
dilution.
Parmi les différentes combinaisons, celle correspondant au nombre le plus grand et, si possible,
inférieur à 330 est retenue (correspond à une meilleure répartition des micro-organismes dans les
dilutions).
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Exemple (tableau 3) : cinq dilutions ont été ensemencées à raison de trois essais par dilution ; trois
combinaisons (de trois chiffres) sont possibles avec les résultats obtenus. Parmi les trois combinaisons
de trois chiffres possibles (332 ; 321 ; 210), laquelle choisir ? Le nombre le plus élevé et inférieur à 330
est sélectionné ; dans cet exemple, il s’agit de 321. Si les dilutions sont insuffisantes, on peut utiliser
des nombres caractéristiques comme 333, 332 ou 331.
Le nombre caractéristique de la série est reporté dans une table statistique de Mac Grady (tableau 4).
On y lit le Nombre le Plus Probable (NPP) de microorganismes présents dans l’inoculum de la dilution
correspondant au chiffre des centaines du nombre caractéristique. Exemple : 321 correspond au NPP
de 15. Cela signifie qu’il y a statistiquement quinze bactéries dans l’inoculum de la dilution 10-(n+1).
Si le produit analysé est solide, on prépare une « suspension mère » de produit en introduisant « x » g
de produit dans « 9 x » ml de diluant. Cela correspond à une dilution au 1/10 du produit. Le nombre
de microorganismes par g de produit analysé est donc N x 10.
D’autres méthodes préconisent le nombre caractéristique le plus faible portant de préférence «0»
dans la colonne des unités (par exemple dans ce cas 210).
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5. Autres méthodes d’évaluation de flores microbiennes
5.1. Spectrophotométrie
Le trouble d’une suspension microbienne (bactéries, levures) est proportionnel à la biomasse présente
dans la suspension. Cette technique ne distingue pas la biomasse morte de la vivante, mais son intérêt
principal est sa rapidité et sa facilité d’application. La mesure peut se faire à l’aide d’un
spectrophotomètre en assimilant l’absorbance mesurée entre 600 et 650 nm à celle du trouble. Ce
principe est également celui de la méthode des étalons de Mac Farland (solutions troubles obtenues
traditionnellement par précipitation de sulfate de baryum). On peut comparer visuellement le trouble
d’une suspension microbienne à celui d’un étalon artificiel pour en estimer sa concentration. En effet,
le trouble développé par chaque étalon est assimilable à une concentration bactérienne selon le
tableau de correspondance suivant :
La spectrométrie de masse peut être utilisée dans les laboratoires de microbiologie comme une
alternative ou un complément aux techniques d’identification de bactéries. L’analyse nécessite une
colonie isolée, à partir de laquelle le spectre de masse obtenu est comparé avec la bibliothèque de
spectres de l’appareil. Une identification est alors proposée avec une indication du niveau de confiance
allant de 0 à 3. L’identification est correcte pour plus de 80% des isolats voire davantage. La lyse
incomplète des bactéries peut-être l’une des causes d’une non-identification. L’enrichissement
progressif de la bibliothèque de spectres contribue à réduire les erreurs d’identification de
microorganismes rares.
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5.4. Impédancemétrie
L'évaluation de la qualité bactériologique à l'aide des techniques normalisées pose souvent des
problèmes à l'industriel qui désire connaître rapidement la qualité de la matière première mise en
œuvre. L'impédance est une technique indirecte d'estimation d’une flore microbienne. Elle utilise les
modifications de conductance d'un milieu de culture, en raison de la croissance et du métabolisme de
la flore microbienne de l'échantillon. Ces modifications sont liées à la dégradation des substrats du
milieu en molécules plus petites, plus mobiles et d'une charge électrique plus élevée comme celle des
protéines en acides aminés ou des hydrates de carbone en lactate.
Généralement, cette production d'ions devient suffisante pour entraîner une modification significative
de la conductance du milieu (seuil de détection) lorsque le niveau de la population microbienne atteint
106 à 108 micro-organismes/ml. Le temps (ou nombre de doublements de la population) nécessaire
pour atteindre le seuil de détection sera d'autant plus grand que le niveau de germes initial sera faible.
Il existe une relation linéaire décroissante entre le temps de détection du changement de conductance
et le nombre initial de micro-organismes.
L’étude de la croissance s’effectue sur des milieux naturels, complexes ou synthétiques. Un milieu
électif facilite la croissance d’un microorganisme comparé à d’autres microorganismes. Un milieu
sélectif est utile en rajoutant des substances toxiques pour garder la bactérie à tester.
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L’examen macroscopique permet de voir comment la bactérie s’est développée sur son milieu de
culture (forme, aspect, couleur).
Les relations vis-à-vis de l’oxygène sont un critère pour différencier des bactéries. Les bactéries ont
besoin d’enzymes pour dégrader l’oxygène (peroxydases). Pour mettre en évidence les relations des
germes avec l’oxygène, un milieu gélosé en tube est ensemencé et permet d’avoir un gradient
d’oxygène du haut vers le bas.
- Aérobie strict : utilisation d’oxygène ;
- Aérobie facultatif : plusieurs types métaboliques, densité plus importante avec oxygène ;
- Anaérobie obligatoire : absence d’oxygène ;
- Anaérobie aérotolérant : oxygène ne favorise pas la croissance ;
- Micro-aérophiles : oxygène ne doit pas être trop important.
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Figure 8. Galeries d’identification
Pour cela il faut disposer d’anticorps pour constituer une sérothèque (des souches bactériennes sont
injectée à des lapins et vont produire des anticorps qui seront prélevés). La réaction antigène-anticorps
forme un précipité visible à l’œil nu. Plusieurs tests sont utilisés (test de l’anneau de précipitation, test
d’immunodiffusion d’Ouchterlony, réactions d’agglutination, marquage des anticorps pour faciliter la
visualisation, Méthode ELISA, …).
En plus de ces méthodes l’identification des microorganismes peut se faire en utilisant des approches
moléculaires.
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7. Réalisation du contrôle
La maîtrise de la qualité microbiologique (hygiénique obligatoire et marchande souhaitée par le
fabricant mais aussi le consommateur) passe par un ensemble de démarches qui vont du contrôle (des
matières premières brutes, en cours de transformation ou de produit fini) aux pratiques de bonnes
fabrications en passant par l’identification des principaux points critiques du système de production /
distribution, le plus souvent par une démarche HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point ou
système d'analyse des dangers et points critiques). Ces analyses prennent aujourd’hui largement place
dans la plupart des usines et des réseaux de distribution et permettent (par la réalisation de contrôles
judicieux, une bonne évaluation de la qualité et une mise en évidence d’éventuelles contaminations)
les actions correctives qui en découlent.
- Avec fermentation
Pour qu’une fermentation se déroule dans de bonnes conditions, il faut, théoriquement, ensemencer
le levain dans un milieu stérile, sauf dans des cas particuliers où la fermentation est conduite avec des
microorganismes indigènes.
Le contrôle des matières premières dans les industries de fermentation est ramené le plus souvent, à
un contrôle de stérilité ou à un contrôle de propreté microbiologique du milieu. En effet, si pour
certaines industries (antibiotiques, acides aminés,…), le milieu doit être stérile, pour d’autres, comme
la brasserie, un milieu faiblement contaminé peut être utilisé, mais il ne faut pas qu’il renferme de
microorganismes spécifiquement dangereux pour cette industrie.
- Sans fermentation
Dans le cas de bio-industries ne mettant pas en œuvre une fermentation (technologie enzymatique),
la qualité microbiologique doit être maintenue à l’aide des facteurs physico-chimiques habituels : pH,
activité de l’eau (Aw), température. Au niveau des matières premières, les contrôles microbiologiques
consistent à rechercher les microorganismes potentiellement dangereux.
Pour ces contrôles, les techniques microscopiques sont les plus utilisées :
- La technique du compte-cellule permet de faire une numération approximative des cellules de levain
et donc permet de vérifier son développement. Les techniques de coloration (gram, bleu de
méthylène) permettent d’évaluer une contamination bactérienne dans le cas de levains à champignons
(levures ou moisissures) mais aussi dans le cas des levains bactériens par les différences de formes ou
de Gram des contaminants par rapport aux bactéries du levain.
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- La technique d’immunofluorescence peut être utilisée pour la recherche de contaminations
bactériennes dans les moûts de fermentation.
- la cytométrie de flux permet de détecter plusieurs types de microorganismes séparément (ex, des
bactéries et des levures). Cela peut être appliqué au suivi de fermentation en culture pure (détection
de contaminants) ou en culture mixte (évaluation simultanée du développement de chaque
population).
- les méthodes de culture peuvent être utilisées quand un délai de réponse est toléré.
- Dans les industries utilisant des cultures aérées, des contrôles sur l’efficacité des systèmes de
filtration stérilisante de l’air sont nécessaires.
- Dans les industries ne présentant pas une étape de fermentation, les paramètres de transformation
(s’ils sont bien maitrisés) ne permettent que quelques développements microbiens. Au cours de ces
processus, le contrôle microbiologique porte sur la recherche de germes dangereux.
Pour le contrôle de dispositifs moins accessibles (robinet, canules, …), il est recommandé d’utiliser la
technique d’écouvillonnage : l’écouvillon imprégné de liquide stérile est frotté sur le dispositif à
contrôler puis immergé et agité dans un liquide stérile. L’analyse de ce liquide est effectuée par des
techniques classiques et donne des indications sur le niveau de contamination et la nature des germes
présents.
La technique d’ATP métrie est bien adaptée au contrôle des traitements de nettoyage-désinfection.
Dans ce cas, un écouvillonnage est effectué sur le matériel ou la surface à contrôler. L’ATP est ensuite
mesuré sur la solution de rinçage de l’écouvillon.
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Cette valeur représente aussi bien l’ATP microbien que l’ATP de cellules animales ou végétales et est
donc un indice de propreté de la surface contrôlée.
- l’air renferme des particules (poussières) sur lesquelles les microbes (levures et moisissures le plus
souvent à l’état de spores et aussi des bactéries) sont adsorbés. Selon leur concentration (nombre de
microorganismes/unité de volume d’air), ils représentent un risque plus ou moins élevé de
contamination secondaire.
Il est donc intéressant de faire des contrôles microbiologiques sur l’air ambiant. La technique la plus
simple consiste à déposer des boites de Pétri contenant un milieu gélosé, ouvertes aux endroits à
contrôler. Cette technique, si elle est appliquée à des intervalles de temps réguliers, de suivre une
évolution et donc mettre en évidence une augmentation de la charge microbienne de l’air. En outre, il
existe des appareils utilisés pour le contrôle de l’air de façon plus rationnelle.
Toutes les techniques de contrôle de la désinfection du matériel et de l’air ambiant ne conduisent pas
à des valeurs absolues. Il convient donc de standardiser les délais opératoires pour que les résultats
aient une signification relative et donnent une idée de l’évolution de la qualité microbiologique des
matériels et des locaux.
En effet, dans certains cas, le contrôle est ramené à une recherche de quelques microorganismes
dangereux pour le produit mais dans d’autres cas, le produit devant être stérile (produits destinés
aux injections intraveineuses, par exemple) les contrôles sont beaucoup plus nombreux et sévères.
Par ailleurs, il existe pour certains produits des normes ou des critères de qualité microbiologique :
les contrôles porteront alors sur ces paramètres.
L’analyse microbiologique traditionnelle des produits finis est quand même indispensable car elle
permet avec une certaine inertie d’éviter, dans le cas où des produits dangereux ou non conformes
seraient fabriqués, leur commercialisation ou leur consommation. Ce type de contrôle souvent
pratiqué par des laboratoires officiels (Contrôle et Répression des Fraudes) n’est pas préventif et ne
permet pas de maîtriser la qualité microbiologique des produits fabriqués. Utilisé seul, il se révèle sans
grand intérêt et souvent même inutile si sa mise en œuvre est longue et sans suite.
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En conclusion
Les techniques microbiologiques classiques sont longues et demandent un délai de réponse trop
important pour être utilisées couramment pour un contrôle de la fabrication.
Les méthodes mises en œuvre doivent être simples, donner une réponse suffisamment rapide pour
qu’une correction soit éventuellement possible dans la fabrication, et doivent être peu coûteuses, de
façon à pouvoir multiplier les contrôles et mieux surveiller la fabrication, sans alourdir excessivement
les coûts de production.
Quand un grand nombre d’échantillons doit être analysé, la méthode peut être automatisée avec un
système d’analyse d’image ; appareil permettant la préparation d’échantillon (filtration sur membrane
et marquage à l’acridine) et le comptage automatique des bactéries marquées sur la membrane. Il est
plus particulièrement destiné au contrôle de la qualité des laits.
L’observation microscopique est, en particulier, utilisable dans toutes les biotechnologies faisant
intervenir une phase de fermentation : cette étape peut alors être contrôlée efficacement par la
recherche des contaminants sur des préparations microscopiques, à l’aide d’anticorps spécifiques ou
des sondes nucléiques couplés à des fluorochromes.
La cytométrie en flux permet d’obtenir un résultat très rapide puisque le comptage des
microorganismes est effectué en une minute après un marquage de 10 à 15 minutes. La sensibilité de
la méthode est de l’ordre de 102 à 103/ml pour des levures et de 104/ml à 5.104/ml pour des bactéries,
dépendant de la présence de particules autofluorescentes dans le milieu. Son utilisation est simple.
Pour les contrôles en cours de fabrication, les techniques microbiologiques classiques peuvent,
quelquefois être efficacement remplacées par des contrôles physico-chimiques liés à la présence de
contaminants comme le pH.
Si les méthodes par culture doivent être employées, il faut les automatiser pour accélérer les lectures.
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