Agence fédérale

pour la Sécurité
de la Chaîne alimentaire

Administration des Laboratoires

MET-LFSAL-003

DETERMINATION DE LA TENEUR EN PROTEINES

BRUTES
(Aliments des animaux – crème glacée (non accrédité))

Version 10
Date d’application 2012-06-27

Rédaction par : Marianne Aubry, Responsable technique

Révision par : Responsable qualité LFSAL ; 2012-06-27

Autorisation de publication par : Patrick Genot Manager LFSAL ; 2012-06-28

Gestion et localisation de la Responsable qualité LFSAL; Serveur du LFSAL

version valide :

Destinataires : Collaborateurs de la section Chimie humide

Mots clefs : Aliments des animaux, Protéines, PBT, qualité

substantielle, crème glacée

LAB23 I-MET003–Protéine brute-v09 05/08/2011

 DETERMINATION DE LA TENEUR EN PROTEINES BRUTES

Aperçu des modifications*

Révision Motif de la révision Partie du

par/date* texte/portée de
la révision
EVRARD M / Adaptation à la méthode Kjeltec Tout
15/06/2006
Aubry Adaptation du programme Kjeldhal 1 et nv template Tout
/03/02/2009
Aubry / Ajout de remarque et correction de la valeur de §10 et 11
03/03/2010 recouvrement du contrôle
MA/ Veille normative
04/08/2011 Mise à jour de la méthode
MA/ Adaptation suite à publication d’un nouveau dossier de
04/08/2011 validation

*
L’écart entre la date actuelle et celle de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans.

Les modifications par rapport à la version précédente sont reprises en rouge.

LAB 23 I-MET 003 Détermination de la PBT v10 - 2012-06-27 - 2/8

 DETERMINATION DE LA TENEUR EN PROTEINES BRUTES

TABLE DES MATIERES

1 OBJECTIF .......................................................................................................................... 4
2 CHAMP D’APPLICATION ................................................................................................. 4
3 DOCUMENTS LEGAUX ET NORMATIFS ........................................................................ 4
4 DEFINITIONS ET ABREVIATIONS ................................................................................... 4
5 PRINCIPE........................................................................................................................... 4
6 CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES ................................................................. 4
7 CONSIGNES DE SECURITE ET MESURES SPECIFIQUES ........................................... 5
8 REACTIFS.......................................................................................................................... 5
9 APPAREILS ....................................................................................................................... 5
10 METHODE.......................................................................................................................... 5
10.1 PRÉPARATION DE L’ÉCHANTILLON ................................................................................ 5
10.2 ETAPE D’ANALYSES..................................................................................................... 6
10.2.1 Prise d’essai ......................................................................................................... 6
10.2.2 Minéralisation ....................................................................................................... 6
10.2.3 Distillation et ti ration t .......................................................................................... 7
11 CONTROLE DE QUALITE ................................................................................................ 7
ERE
11.1 CONTROLE DE 1 LIGNE ............................................................................................ 7
EME EME
11.2 CONTROLE DE 2 ET 3 LIGNE................................................................................. 7
11.3 CONTROLES SUPPLEMENTAIRE .................................................................................... 7
12 CALCUL ET RAPPORTAGE............................................................................................. 8
13 REFERENCE AUX PROCEDURES, INSTRUCTIONS, DOCUMENTS, FORMULAIRES
OU LISTES Y AFFERENTS ...................................................................................................... 8
13.1 PROCEDURES............................................................................................................. 8
13.2 LISTE ......................................................................................................................... 8
13.3 FORMULAIRES ............................................................................................................ 8

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 DETERMINATION DE LA TENEUR EN PROTEINES BRUTES

1 Objectif

Décrire la méthode de dosage de l’Azote selon la méthode de Kjeldahl en vue du calcul

conventionnel de la teneur en protéines brutes dans les aliments pour animaux.

2 Champ d’application

Cette procédure s’applique à toutes les analyses d’azote pour lesquelles il n’y a pas
nécessité de distinguer entre azote protéique et azote non protéique.

3 Documents légaux et normatifs

Méthode dérivées de :

Norme/Fil conducteur Clauses

NBN EN ISO 5983-1 :2005 et -2 :2009 – Aliments des animaux -

Dérivé de la norme
Détermination en azote et calcul de la teneur en protéines brutes
ISO 1871 : 2009 - Ligne directrice pour la détermination de l’azote
Norme
par méthode Kjedhal

4 Définitions et abréviations

Terme Origine de la définition Définition

Pas d’application

Abréviation Origine Signification

PBT - Protéines Brutes

5 Principe

Minéralisation de la matière organique par l’acide sulfurique en présence d’un catalyseur,

alcalinisation des produits de la réaction, distillation et titrage de l’ammoniac libéré.
L’azote Kjeldahl de l’échantillon est d’abord transformé en ammoniaque par digestion acide
dans un batch de minéralisation. L’addition d’une base forte permet de libérer l’ammoniac qui
est alors entraîné par de la vapeur d’eau puis ensuite piégé dans une solution d’acide
borique. L’ammoniaque est alors dosé par une solution d’acide sulfurique de titre connu. Le
point d’équivalence est repéré par le changement de coloration d’un indicateur.
La teneur en protéines brutes du produit est obtenue en multipliant la valeur obtenue lors de
la détermination de la teneur en azote par le facteur 6,25 dans le cas des aliments pour
animaux et 6,38 pour les produits laitiers.

6 Caractéristiques de performances
Voir données du dossier de validation

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7 Consignes de sécurité et mesures spécifiques

- Suivre les instructions de sécurité spécifiées sur les fiches de sécurité des réactifs et
dans le log book de l'appareil.
- Toutes les manipulations de solvants se font sous hotte.

8 Réactifs
- Eau déminéralisée (R144)
- Sulfate de sodium anhydre (R025)
- Acide borique 1 % avec indicateur (R442)
- Acide sulfurique concentré (H2SO4, 95 %, (R001)
- Acide sulfurique 0.5 N (R122)
- Hydroxyde de sodium 40 % (R460)
- Hydroxyde de sodium 32 % (R431)
- Catalyseur : Kjeltabs Cx R007 (5.0 g K2SO4 + 0.5g CuSO4.5H2O )
- Saccharose (R006)
- Anti-mousse siliconé (R414)
- Bleu de bromothymol (R074)
- Tryptophane à minimum 98.5 %(R461)
- Sulfate d’ammonium, pureté > 99.5 % (R030)

9 Appareils
- Kjeltec 2400 FOSS : unité de distillation et de titration munie d’un passeur automatique
-4
- Balance analytique à 10 g
- Unité de minéralisation FOSS avec programmateur
- Tubes de minéralisation de 250 ml et portoirs
- Distributeur d’acide sulfurique réglé sur 12 ml

10 Méthode

10.1 Préparation de l’échantillon

L’échantillon est préparé suivant les directives de la procédure « LAB23 P011 Préparation
des échantillons »

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10.2 Etape d’analyses

10.2.1 PRISE D’ESSAI

Remarque : Prévoir un tube vide en début de rack pour effectuer les rinçages
Dans des tubes à minéralisation, introduire une prise d’essai d’environ exactement 1g (pour
les échantillons à haute teneur en protéines (>30% prendre une prise d’essai de 0,5g), deux
pastilles de catalyseur Kjeltabs et 12,5 ml d’acide sulfurique concentré (R001) en
commençant par le blanc (réactif sans échantillon).
Placer les tubes dans un rack et compléter celui-ci à l’aide de tubes à minéralisation vide.
10.2.2 MINÉRALISATION

Allumer le bloc de minéralisation et l’ascenseur associé

Vérifier la validité des solutions du scrubber :
Le flacon de gauche est remplit à son niveau minimum d’eau distillée ; le flacon de droite
est rempli avec un mélange 50/50 NaOH 32% (R431) / Eau distillée sans dépasser le
niveau maximum ; quelques gouttes de bleu de bromothymol (R074) (bleu) indiquent que
le pH de la solution est basique (remplacer la solution si l’indicateur a viré au jaune).
Retirer le support de protection des calottes d’aspiration.
Placer le réflecteur sur la partie avant du rack et déposer celui-ci sur les bras latéraux de
l’ascenseur au-dessus du bloc de minéralisation.
Vérifier à l’aide du bouton poussoir de l’ascenseur que les tubes rentrent sans frottement
dans les encoches prévues à cet effet. Relever les tubes.
Vérifier le programme sur le contrôleur :

N° programme Temps Température

1 1 min 30°C
2 1h10 420°C (Montée en T°)
3 1h00 420°C (Attaque)
4 0h00 10°C (mode STOP)

Mettre la minéralisation en route en actionnant la fonction RUN du contrôleur. Le scrubber se

mettra automatiquement en fonctionnement.
La minéralisation terminée, laissé reposer au moins 45 minutes avant de distiller.
Replacer le support de protection des calottes d’aspiration.

Remarque
- S’il y a des particules noires dans le minéralisateur ou sur les parois du tube, stopper la
minéralisation, laisser refroidir et avec une pissette d’eau distillée, faire tomber les
particules dans l’acide puis redémarrer la distillation en déduisant le temps écoulé. Si
ces particules sont constatées la minéralisation terminée, reminéraliser le ou les tubes
en question.
- S’il y a présence d’éclaboussure ou de mousse, utiliser 3 à 4 gouttes d’anti-mousse
(R414) ou diminuer la prise d’essai.
- S’il y a présence de cristallisation dans le tube, cela est du à une perte d’acide due à un
système d’extraction trop performant ; réduire alors le débit de l’extracteur (scrubber)
jusqu’à disparition des fumées blanches

LAB 23 I-MET 003 Détermination de la PBT v10 - 2012-06-27 - 6/8

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- Lorsqu’un échantillon a une structure grasse, il peut-être nécessaire d’effectuer un

dégraissage avant d’extraire l’azote afin de faciliter la phase de minéralisation de celui-
ci.

10.2.3 DISTILLATION ET TI RATION T

Pour l’utilisation correcte du kjeltec, se référer à sa SOP et au manuel de l’utilisateur.

Vérifier les niveaux des réactifs et des waste avant de débuter l’essai.
Insérer le ou les racks de minéralisation dans le passeur (attention à la position A, B ou C).
Encoder les données relatives aux échantillons dans la séquence d’analyse en utilisant le
programme " Kjeldalh 1 " :
- 30 ml d’acide borique
- 60 ml d’eau
- 50 ml de soude
- mode « délai »
- temps : 2 sec
- distillation : « volume »
- vidange : « oui »
Effectuer des rinçages manuels en utilisant le tube vide, et laisser agir la "vapeur active" 10
minutes environ afin que le système se mette à température.

Remarque
Si le système indique à l’écran la mention " générateur de vapeur trop faible ", introduire
maximum 0,5 g de sulfate de sodium (R025) dans le bidon de réserve d’eau
déminéralisée.
Terminer chaque séquence par 3 rinçages automatiques.

11 Contrôle de qualité

ère
11.1 Contrôle de 1 ligne
L’analyse est suivie par une carte de contrôle de type Shewhart. Tout écart de la carte doit
être signalé au responsable technique ou à son remplaçant qui décidera des actions
correctives à prendre.

ème ème
11.2 Contrôle de 2 et 3 ligne
Ces contrôles sont exécutés suivant les directives de la procédure LAB23 P020 Gestion des
controle qualité

11.3 Contrôles supplémentaires

Minéralisation
Au minimum six fois par an en cas d’écart par rapport à la carte de contrôle, il est nécessaire
de vérifier la performance de minéralisation, pour cela, analyser 0,5g de tryptophane
(préalablement séché à environ 103°C pendant une heure) dans les même conditions que
l’analyse décrite ci-dessus. Le résultat en azote doit correspondre à 13,51 % 0,30 %. En
cas d’écart observé, le signaler au responsable technique ou à son remplaçant qui décidera
des actions correctives à prendre.

LAB 23 I-MET 003 Détermination de la PBT v10 - 2012-06-27 - 7/8

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Distillation
En cas de soupçon d’anomalie concernant la partie distillation (sans la minéralisation) de
l’analyse, une vérification peut-être effectuée en dosant dans les conditions de l’analyse, une
quantité connue de sulfate d’ammonium. Le rendement en azote doit-être compris entre 99 et
101 %
12 Calcul et rapportage

H 2SO4 + 2NH 3 (NH 4 ) 2 SO4

La teneur en azote ammoniacal se calcul comme suit (Calcul effectuer par l’appareil)

(V1 V0 ) * T * 0,014 *100

N (%)
m
où
V0 : volume d’acide versé pour le blanc
V1 : volume d’acide versé pour l’échantillon
T : titre de l’acide sulfurique (0,5 Mol/l)
m : prise d’essai de l’échantillon

Dans le cas d’un échantillon préséché, tenir compte de la perte d’humidité

msec
N (%)telquel N*
mhum
où
msec : masse de l’échantillon après séchage
Mhum : masse de l’échantillon avant séchage

La teneur en protéines brutes du produit est obtenue en multipliant la valeur obtenue lors de
la détermination de la teneur en azote par le facteur conventionnel 6,25 pour les aliments
pour animaux et (6,38 pour les produits laitiers).

L’incertitude de mesure sur l’analyse est reprise dans la liste L010-01 : Liste des incertitudes
de mesure section Chimie humide –Aliment

13 Référence aux procédures, instructions, documents, formulaires ou

listes y afférents

13.1 Procédures
LAB23 P018 : Création et suivi des cartes de contrôle qualité
LAB23 P020 : Gestion des contrôles qualité
LAB23 P011 Préparation des échantillons

13.2 Liste
LAB L010-01 : Liste des incertitudes de mesure section Chimie humide - Aliment

13.3 Formulaires

LAB23 F543-CH01 Feuille de travail chimie humide

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