Filière Svi

Semestre : S5

Module:
BIOLOGIE MOLECULAIRE
Partie 2
TD 1 de Biologie
Moléculaire
Filière SVI – S5 Année Universitaire: 2021-2022
Pr El Hassouni M.
Exercice 1:
Soit un ADN linéaire :
----------------NNNNNNNNNNNNACGCCAAGCTTGGCTGCANNNNNNNNNNN---------
----------------NNNNNNNNNNNNTGCGGTTCGAACCGACGTNNNNNNNNNNN--------
Donner le résultat des expériences suivantes en indiquant la séquence des extrémités :
1) Digestion par NcoI
D’après l’énoncée, NcoI coupe entre les 2 C au niveau de la séquence palindromique :
CCATGG
Tout d’abord cherchons la séquence palindromique spécifique de NcoI dans le
fragment d’ADN
Pas de site de restriction NcoI donc pas de coupure

2) Digestion par Hind III

HindIII coupe entre 2 A au niveau de la séquence palindromique : AAGCTT

------NNNNNNNNNNNNACGCCAAGCTTGGCTGCANNNNNNNNNNN--------
------NNNNNNNNNNNNTGCGGTTCGAACCGACGTNNNNNNNNNNN--------

-------NNNNNNNNNNNNACGCCA AGCTTGGCTGCANNNNNNNNNNN
-------NNNNNNNNNNNNTGCGGTTCGA ACCGACGTNNNNNNNNNNN
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Pr El Hassouni M.
3) Digstion par Hind III + Nucléase S1
La digestion par HindIII génère donc 2 fragments de restriction trouvés en 2):
Fragments à extrémités cohésives
-------NNNNNNNNNNNNACGCCA AGCTTGGCTGCANNNNNNNNNNN
-------NNNNNNNNNNNNTGCGGTTCGA ACCGACGTNNNNNNNNNNN

La nucléase S1 hydrolyse l’ADN simple brin alors que le double brin est protégé
Les fragments obtenus sont donc:
-------NNNNNNNNNNNNACGCCA TGGCTGCANNNNNNNNNNN
-------NNNNNNNNNNNNTGCGGT ACCGACGTNNNNNNNNNNN
Ces fragments de restriction ont des extrémités à bout francs

4) Digstion par Hind III + S1 + ADN Ligase

L’ADN Ligase catalysent la formation des liaisons phosphodiester entre 2 fragments d’ADN.
Elle lie l’extrémité 5’ du 1er fragment avec l’extrémité 3’ du 2ème fragment
5’ 3’ 5’ 3’
--NNNNNNNNNNNNACGCCA TGGCTGCANNNNNNNNNNN
3’ --NNNNNNNNNNNNTGCGGT5’ 3’ ACCGACGTNNNNNNNNNNN 5’

5’--NNNNNNNNNNNNACGCCATGGCTGCANNNNNNNNNNN
3’--NNNNNNNNNNNNTGCGGT ACCGACGTNNNNNNNNNNN
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Pr El Hassouni M.
5) HindIII + S1 + ADN ligase Ensuite + HindIII
Le traitement par HindIII + S1 + Ligase génère le fragment obtenu en 4) suivant:
5’--NNNNNNNNNNNNACGCCATGGCTGCANNNNNNNNNNN
3’--NNNNNNNNNNNNTGCGGT ACCGACGTNNNNNNNNNNN
Le site de restriction HindIII (AAGCTT) n’existe plus dans le fragment ligué par la ligase ci-
dessus, Par conséquent il n’y a pas de de coupure par HindIII

6) HindIII + S1 + ADN ligase Ensuite + NcoI

Le site de restriction NcoI (CCATGG) existe dans le fragment obtenu en 4)
5’--NNNNNNNNNNNNACGCCATGGCTGCANNNNNNNNNNN
3’--NNNNNNNNNNNNTGCGGT ACCGACGTNNNNNNNNNNN

NNNNNNNNNNNNACGC CATGGCTGCANNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNTGCGGTAC CGACGTNNNNNNNNNNN

Le fragment de départ contenait un site HindIII et ne contenait pas de site NcoI

Après traitement par HindII + S1 + ligase on perd le site HindIII et on créée le
site NcoI
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Exercice 2:
Un fragment d'ADN linéaire est digéré par deux enzymes de restriction afin de
rechercher les sites de coupures de ces deux enzymes et de construire la carte de
restriction.
Le résultat de l’électrophorèse après des digestions simples et multiples est comme suit :
AD N l i n é a i re

1) Quelle est la taille du fragment d’ADN étudié?

Digestion par l'

Enzyme 1
et
Enzyme 1 Enzyme 2 Enzyme 2
-
10 kb Digestion par E1 génère 3 fragment de 8 ; 6 et 3 donc la
8 kb
7 kb taille du fragment est égale à 8+6+3 = 17 kb
6 kb
Egalement ,
3 kb

2 kb
Digestion par E2 donne 2 fragments dont la somme est
1 kb égal à 10+ 7 = 17 kb qui est donc la taille exact du
+ fragment d’ADN étudié.

2) Pour un fragment linéaire, le nombre de fragments de restriction obtenu

après une digestion est égal au « nombre des sites de restriction - 1 ».
Digestion par E1 génère 3 fragments de restriction et E2 génère 2 fragments
Donc
Site de coupure pour E 1 = 3 - 1 = 2 sites de restriction
Site de coupure pour E2 = 2 - 1 = 1 site de restriction
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Pr El Hassouni M.
3) Carte de restriction:

Enzyme 1 : génère 3 fragments (8 , 6 et 3 kb)

Il y a 3 possibilités de carte de restriction sans tenir compte de l’orientation

AD N l i n é a i re

3 E1 E1
6 8 Digestion par l'

Enzyme 1
et
(1) Enzyme 1 Enzyme 2 Enzyme 2
-
10 kb
8 kb

3 E1 E1 7 kb

8 6 (2)
6 kb

3 kb

2 kb

1 kb

6 E1 3 E1
8 (3)
+

Enzyme 2 (E2) donne 2 fragments de 10 et 7 kb.

Pour placer E2 sur la carte de restriction on doit analyser la digestion par

E1 et E2.

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Pr El Hassouni M.
 AD N l i n é a i re

Digestion par l'

E1 + E2 génèrent 4 fragments de 8 ; 6 ; 2 et 1 Kb. Enzyme 1

et
Enzyme 1 Enzyme 2 Enzyme 2
On constate que les fragments 8 et 6 sont ceux de E1 et sont -
10 kb
intacts alors que le fragment 3 kb de E1 est coupé en 8 kb
7 kb
2 fragments ( 2 et 1 kb) 6 kb

3 kb

Donc l’enzyme E2 coupe au niveau du fragment 3kb et 2 kb

1 kb
puisque elle génère 2 fragments de 10 et 7 donc le fragment
de 3kb de E1 doit être situé au milieu du fragment d’ADN +

Donc c’est la possibilité (3) qui est valable

E1
6 E1 E1
8
1 2

Le site E2 doit être placé de 1 kb du fragment de 6k ce qui génère 7 kb

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