Compte Rendu Du TP de Microbiologie Des Sols

UNIVERSITE MARIEN NGOUABI
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

DEPARTEMENT DES MASTERS
PARCOURS MASTER DE SCIENCES
BIOLOGIQUES
OPTION : BIOCHIMIE ET MICROBIOLOGIE
APPLIQUEE
COMPTE RENDU DU TP DE MICROBIOLOGIE

DES SOLS
Présenté par :
TATY MATONDO Arès Presley
Année académique 2023-2024
Groupe 1
Table des matières
I. INTRODUCTION .............................................................................................................. 1
II. MATERIEL ET METHODES ......................................................................................... 2
1. MATERIEL ..................................................................................................................... 2
2. METHODES ................................................................................................................... 2
2.1. Échantillonnage ........................................................................................................ 2
2.2. Préparation des milieux ............................................................................................ 3
2.3. Dénombrement ......................................................................................................... 5
2.4. Purification et conservation ......................................................................................... 7
2.5. Caractérisation phénotypique................................................................................... 8
2.5.1. L’étude microscopique : ....................................................................................... 8
2.5.2. Caractères biochimiques et physiologiques ......................................................... 9
2.6. Activité enzymatique ............................................................................................. 10
3.5. Activité microbienne .............................................................................................. 11
III. RESULTATS ET DISCUSSION ................................................................................... 12
1. Dénombrement .............................................................................................................. 12
2. Caractérisation phénotypique ........................................................................................ 12
2.1. L’étude macroscopique .......................................................................................... 12
2.2. L’étude microscopique ........................................................................................... 14
2.3. Caractères biochimiques et physiologiques ........................................................... 16
3. Activité enzymatique ..................................................................................................... 16
3.1. Mesure de la croissance bactérienne ...................................................................... 16
3.2. Mise en évidence de la production d’enzymes protéolytiques .............................. 17
3.3. Activités amylolytiques ......................................................................................... 18
3.4. Activités cellulolytiques ............................................................................................. 18
4. Activité microbienne ..................................................................................................... 18
COMPTE RENDU DU TP DE MICROBIOLOGI DU SOL
I. INTRODUCTION
Le mot sol se réfère à la matière extérieure lâche de la surface de la Terre, une couche
distincte de la roche qui se trouve en dessous. Les sols sont dynamiques et évoluent avec le
temps. Le sol est l'habitat d'une variété d'organismes, y compris les bactéries, champignons,
protozoaires, insectes, nématodes, des vers, et de nombreux autres animaux. Les virus sont
également présents dans les sols. Le sol se développe sur de longues périodes de temps grâce à
des interactions complexes entre les matériaux de base (roche, sable, matériaux de sédiments
glaciaires, et ainsi de suite), la topographie, le climat, et les organismes vivants. Cette
communauté biologique complexe contribue à la formation, l'entretien et, dans certains cas, la
dégradation des sols. En raison des changements dans la croissance des plantes, la température,
les précipitations, la perturbation et l'érosion, un sol qui a pris des centaines d'années pour se
former peut-être rapidement dégradé si cette communauté microbienne est activée. Par
exemple, ceci peut se produire si un sol marécageux est drainé, ce qui augmente l'accès de
l'oxygène à la matière organique accumulée. Dans la plupart des sols les principaux producteurs
de la matière organique sont les plantes vasculaires, bien que les algues, les cyanobactéries et
les bactéries photosynthétiques puissent également contribuer à ces processus, en particulier
dans les environnements désertiques. Les sols peuvent être divisés en deux grands groupes : les
sols minéraux sont issus de l'altération des roches et autres matériaux inorganiques, et les sols
organiques sont dérivés de la sédimentation dans les tourbières et les marais. La plupart des sols
sont un mélange de ces deux types. Bien que les sols minéraux prédominent dans la plupart des
environnements terrestres, il y a un intérêt croissant pour le rôle que jouent les sols organiques
dans le stockage du carbone.
1
Arès Presley TATY MATONDO M2 BMA/FST/UMG/2023-2024
II. MATERIEL ET METHODES

1. MATERIEL
Deux types de matériel ont été utilisé pour la réalisation de ce travail dont un matériel
biologique et un matériel de laboratoire
➢ Le matériel biologique (le sol) ;

➢ Le matériel de terrain (papier aluminium, flacons stériles, bouchons stériles, spatule
stériles) ;
➢ Le matériel de laboratoire.
Matériel courant de laboratoire (verrerie, balance analytique, agitateur chauffant
et autoclave).
Micropipettes et embouts stériles, pipette Pasteur ;
Incubateurs réglés à 37 °C, réfrigérateur réglé à 4 °C,
Microscope optique ;
Pissette : eau distillée, eau de javel et alcool.
Milieu de culture : PCA, Mossel, EMB, Sabouraud et LB
2. METHODES
2.1. Échantillonnage
Pour effectuer l’échantillonnage, nous avons utilisé un tube à essai stérile et une spatule
stérile avec lesquels nous avons prélevé une certaine quantité de sol. Après prélèvement, nous
avons hermétiquement fermé le tube avec du papier aluminium, codifié le tube puis transporté
au laboratoire pour la conservation au réfrigérateur à une température d’environ 4°C pendant
24h.
Figure 1: Coordonnées géographique du lieu

Figure 2: Coordonnées géographique et GPS
de prélèvement de l'échantillon de sol
du lieu de prélèvement de l'échantillon de sol
2
2.2. Préparation des milieux

Le jour suivant la conservation de l’échantillon, nous avons commencé par préparer les
milieux de cultures nécessaire à la croissance des microorganismes présents dans cet échantillon
de sol dont les milieux EMB, Sabouraud, Mossel et PCA.
➢ La gélose ou milieu EMB

C’est un milieu dans lequel ne poussent que les bacilles. La gélose EMB (de l’anglais
Eosin Methylen Blue) est un milieu de culture sélectif et différentiel employé en microbiologie
pour l’isolement et l’identification des bacilles Gram Négatifs (BGN). Ce milieu comporte un
indicateur qui détecte la consommation du Lactose et ou du saccharose. Il a été mis au point en
1918 par M. Levine pour faciliter la distinction entre Escherichia coli et d’autres BGN, en
particulier Klebsiella aérogènes.
La base nutritive se compose pour moitié de peptone et pour l’autre d’un mélange à
parts égales de deux disaccharides, le Lactose et le saccharose. Le Lactose est métabolisé par
les Entérobactéries dites fermentaires et le saccharose sert de glucide de secours pour
d’éventuels variants Lactose négatifs de ces bactéries.
Le bleu de méthylène est un inhibiteur qui limite la croissance des bactéries Gram
positives. L’éosine ici utilisé sous sa forme Y (yellowish, jaunâtre) viré au noir en milieu acide
ce qui permet de détecter l’acidité des produite par les bactéries qui fermentent le Lactose et ou
le saccharose. Lorsque le pH diminue suffisamment, les deux colorants interagissent en formant
un complexe violet très sombre aux reflets verts métalliques caractéristiques.
L’hydrogénophosphate de potassium (K2HPO4) sert de tampon pour amortir les

variations de pH dues à la fermentation des sucres. L’agar est l’agent gélifiant.
Composition du milieu EMB
Peptone Lactose Saccharose Hydrogénophosphate Eosine Bleu de Agar

(quelconque) de potassium Y méthylène
10 g 5g 5g 2g 400 mg 65 mg 13,5
3
➢ La gélose ou milieu Sabouraud

C’est un milieu spécifique qui est constitué du chloramphénicol qui est un antibiotique qui
inhibe toute autre prolifération bactérienne ne laissant pousser que les levures. Le milieu gélosé
Sabouraud est sélectif pour la culture fongique et principalement utilisé pour l’isolement des
dermatophytes, des levures et divers autres champignons pathogènes et non pathogènes.
La formule traditionnelle repose sur un pH bas (5,6) pour inhiber la croissance bactérienne.
Cependant, l’ajout d’antibiotiques au milieu acide pour inhiber les bactéries et est courant dans
les versions actuellement utilisées. De plus la concentration élevée en glucose offre un avantage
pour la croissance des champignons alors que la plupart des bactéries ne tolèrent pas la
concentration élevée en sucre.
➢ La gélose ou milieu Mossel

Le milieu Mossel est un milieu de culture sélectif utilisé pour le dénombrement de Bacillus
cereus dans les produits alimentaires et autres.
La Peptone et l’extrait de viande favorisent la croissance de Bacillus cereus.
Le chlorure le sodium maintient l'équilibre osmotique du milieu. Le D-mannitol est

présent sous forme de glucide fermentescible, le rouge de phénol est un indicateur coloré de
pH.
La polymyxine B est un agent sélectif qui inhibe la croissance des coliformes.
Composition en gramme pour un litre du milieu Mossel, pH 7,2

Rouge de phénol Peptone Extrait de viande Mannitol Chlorure de sodium Agar
0,025g 10g 1g 10g 10g 14g
➢ La gélose ou milieu PCA

La gélose PCA (Plate Count Agar) est un milieu recommandé pour le dénombrement
standardisé des bactéries aérobies dans l’eau, les produits laitiers et les aliments, les produits
cosmétiques ou pharmaceutiques.
Le milieu PCA est non sélectif et relativement riche en nutriments, la tryptone, les
facteurs vitaminiques de l'extrait de levure et le glucose utilisé comme source énergétique
favorisent la croissance de la plupart des bactéries.
4
Composition en gramme pour un litre du milieu PCA, pH 7
Tryptone Extrait autolytique de levure Glucose. Agar agar bactériologique

5,0 g 2,5 g 1,0 g 12,0 g
En ce qui concerne les étapes de la préparation d’un milieu de culture, il faut :
• Peser une quantité X grammes de poudre d’un milieu de culture donné sur papier
aluminium à l’aide d’une balance électronique de précision en utilisant une spatule ;
• Verser la poudre pensée dans un erlenmeyer ou un flacon gradué contenant un volume
précis d’eau distillée ;
• Etiqueter chaque milieu de culture afin d’éviter toute confusion ;
• Chauffer pour dissoudre si nécessaire en agitant (à ébullition en générale) à l’aide de
l’agitateur magnétique ;
• Stériliser les milieux dans l’autoclave à 121°C sur une plaque chauffante pendant 15
minutes ;
• Laisser refroidir légèrement le milieu pour faciliter la préhension pendant l’utilisation.
Après la préparation des milieux, nous sommes passé à l’étape de dénombrement.
2.3. Dénombrement
Après préparation des milieux, nous avons retiré le tube contenant notre échantillon de sol
au réfrigérateur pour procéder à notre analyse. L’étape de dénombrement est constituée de
plusieurs sous étapes dont les dilutions, l’ensemencement, la culture et le comptage des
colonies.
➢ La dilution
La dilution consiste en générale à diminuer la concentration d’une solution donnée mais dans
notre cas elle va consister à diminuer la concentration bactérienne contenue dans notre
échantillon de sol.
5
Nous avons utilisé pour cela 6 tubes à essais contenant chacun 9ml d’eau distillée avec
une numérotation des tubes allant de T0 à T5.
Pour effectuer ces dilutions en cascades, nous avons commencé par peser à l’aide d’une
balance à précision 1g de sol contenu dans le tube à essai d’origine que nous avons introduit
dans le tube T0 puis homogénéisé pour obtenir un mélange homogène. Après homogénéisation,
nous avons prélevé 1ml du surnageant du tube T1 pour effectuer les dilutions en cascades dans
les différents tubes. Dans le tube T5, nous avons également prélevé 1ml de solution que nous
avons ensuite jeté.
Figure 3: Dilutions décimales
NB : les dilutions en cascade se sont effectuées sous la hotte autour du bec benzène.
Après la dilution, nous avons ensemencé sur boîtes de pétri.
➢ Ensemencement
Les solutions contenues dans les tubes T1 et T2 ont été ensemencées sur milieu EMB et
Sabouraud en prélevant dans chaque tube 100 µl de solution tandis que les solutions contenues
dans les tubes T3 et T4 ont été ensemencées sur milieu Mossel et PCA en prélevant dans chaque
tube 100 µl de solution.
Nous avons ensemencé sur 8 boîtes dont 2 boîtes EMB, 2 boîtes Sabouraud, 2 boîtes Mossel
et 2 boîtes PCA pour multiplier les chances d’avoir une croissance bactérienne dans chaque
milieu.
6
➢ Culture à l’étuve
Après ensemencement, les boîtes ont été incubées pendant 24h à 37°C.
Figure 5 : Incubateur contenant des milieux de culture Figure 4: Incubateur vide
➢ Comptage des colonies

A la suite de l’incubation, nous avons effectué le comptage des colonies. La lecture sur
milieu Mossel et PCA s’est effectuée après 24h d’incubation alors que la lecture des milieux
EMB et Sabouraud s’est faite après 48h d’incubation.
2.4. Purification et conservation

A la suite du comptage des colonies sur Mossel, nous avons procédé à la purification de
ces colonies dans un nouveau milieux Mossel. Pour se faire nous avons commencé par diviser
notre nouvelle boîte contenant le Milieu Mossel en 4 cadrans. Nous avons ensuite à l’aide d’une
anse raclée quelques colonies de l’ancienne boîte une nous avons ensemencé par strie dans cette
nouvelle boîte.
7
Après avoir purifié nos colonies, nous avons procédé à la conservation dans un mélange de
LB liquide et de glycérol réparti dans des micro-tubes soit un total de 200µl de glycérol dans
800µl de LB liquide. Les échantillons ont ensuite été mis au réfrigérateur à une température
d’environ 4°C.
Figure 6: Milieu LB liquide
2.5. Caractérisation phénotypique

2.5.1. L’étude microscopique :
L’observation microscopique nous a permi de faire une étude morphologique des cellules d’une
espèce bactérienne.
✓ L’état frais :
Cet examen permet d’apprécier la forme et parfois la mobilité des germes étudiés.
Technique :
• À partir d’une culture sur milieu solide
• Déposer une gouttelette de liquide (milieu liquide ou eau distillée ou eau physiologique)
sur la lame.
• Prélever une trace de colonie et l’émulsionner dans le liquide.
• L'étalement doit se faire en couche mince, sur une Lame dégraissée.
• Laisser sécher à l'air.
8
• Fixer trois fois rapidement dans la flamme du bec Bunsen la face de la lame opposée à
l'étalement. Ne pas trop insister sous peine de carboniser le prélèvement. A ce stade les
germes ne sont plus considérés comme contaminants.
• Examen. Observer à l’objectif GX40 sans huile a immersion.
2.5.2. Caractères biochimiques et physiologiques

C’est un ensemble de techniques qui sont basés sur les connaissances du métabolisme
microbien et de la biochimie microbienne des microorganismes, ce qui permet d’identifier un
microorganisme inconnu et le placé dans un taxon connu « genre et espèce ». Les techniques
d’identification biochimiques utilisent plusieurs milieux de culture d’identification solides et
liquides contenant des substrats susceptibles à être dégradé par les bactéries et donc cela permet
de connaitre si la bactérie possède ou pas l’enzyme en question, et comme la plupart des
bactéries sont connues actuellement de point de vue métabolisme et potentiel enzymatique cela
permet de les identifiées en fonction de leurs enzymes.
✓ Test catalase
La catalase est une oxydoréductase qui catalyse la dismutation du peroxyde d'hydrogène en eau
et dioxygène.
• Principe :
En présence d'oxygène moléculaire, certaines réactions métaboliques conduisent à la formation
d'eau oxygénée.
2 H2O2 → O2 + 2 H2O.
• Technique
Sur une lame de verre propre, déposer une goutte de H2O2, (eau oxygénée), puis la mettre en
contact avec une colonie isolée, prélevée directement avec une pipette pasteur boutonnée ou
une anse plastique à usage unique. Lecture ; la présence d'une catalase se traduit, en quelques
secondes, par la formation de bulles d'oxygène (une effervescence (dû à un dégagement de
dioxygène) signe la présence d'une catalase). Si rien n'est observable, la bactérie ne possède pas
l'enzyme.
✓ Test de KOH (test de la potasse)
9
Nous avons effectué un test de KOH pour mettre en évidence les parois bactériennes afin de
déterminer l’appartenance d’une bactérie au gram positif ou négatif.
Technique :
✓ Émulsionner sur une lame stérile d’une colonie avec le réactif de KOH 3%
✓ Lecture :
✓ Lorsque la suspension présente un caractère visqueux et filant la bactérie est qualifiée
de gram négatif (KOH positif).
✓ L’absence du caractère visqueux et filant montre que l’isolat correspond à une bactérie
à Gram+ (KOH négatif) prouvant donc son insensibilité au KOH.
2.6. Activité enzymatique

2.6.1. Mesure de la croissance bactérienne
Une mesure directe est réalisée par le dépôt d’une cuve contenant la solution (milieu de culture
LB liquide et une colonie bactérienne) dans un compartiment du spectrophotomètre visible
(zuzi model 4211/50) avec une mesure d’absorbance calibré à 600 nm.
2.6.2. Mise en évidence de la production d’enzymes protéolytiques

Pour réaliser cette étude, nous avons :
• Peser 1 g de poudre d’agarose à 1%
• Mélanger avec 1 ml de PBS dans 100 ml concentré à 1N.
• Chauffer le mélange sur la plaque pendant 3 min jusqu’à dissolution complète de
l’agarose puis refroidi au bain marie (CLIFTON, Italie) à 40 °C.
• Ensuite, nous avons ajouté 10 ml de lait écrémé dans le mélange.
• Après homogénéisation, nous avons couléé la solution dans les boîtes de Pétri,
• Réaliser des puits dans la gélose à différente distance en utilisant un embout stérile tout
en évitant de perforer le fond du gel.
• Déposer un volume de 100 µL de la solution pure provenant de la culture over-night
sans centrifugation ou avec centrifugation dans le gel à 4 différents puits de la même
boîte de Pétri afin de mieux déterminer la moyenne des diamètres des halos pour chaque
isolat testé.
• Incuber les boîtes de Pétri à 37 °C pendant 12 à 16 h.
2.6.3. Activités amylolytiques

Pour ce faire nous avons commencé par :
10
• Dissoudre 1g d’amidon et 1,5g d’agar dans 100ml d’eau distillée ;

• Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes ;
• Couler les boites et préparer des puits dans le gel puis placer dans chaque puits 100 µl
de la suspension bactérienne après culture overnight puis placés les boites de pétrie à
l’étuve à 37°C pendant 48 heures.
3. Activités cellulolytiques
Pour cette activité, la réalisation s’est effectuée selon l’étape suivante :
• Peser 0,5g de cellulose et 1,5g d’agar dissoudre dans 100ml d’eau distillée ;
• Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes ;
• Couler les boites et préparer des puits dans le gel puis placer dans chaque puits 100 µl
de la suspension bactérienne après culture overnight puis placés les boites de pétrie à
l’étuve à 37°C pendant 48 heures.
3.5. Activité microbienne

La méthode utilisée pour évaluer la sensibilité antibactérienne des isolats est celle de la
réalisation des puits sur la gélose imbibée d’une souche pathogène.
• Étaler 1000 µl de la souche pathogène est uniformément à la surface de la gélose
Mueller-Hinton.
• Incuber ensuite les boites pendant 30 min à 37 °C,
• Réaliser des puits à 24 mm de distance entre les centres des puits voisins.
• Ensuite Déposer 100 µl d’une culture de 18 h de l’isolat (supposée être inhibitrice) dans
les puits.
• Une fois les boîtes séchées à température ambiante pendant 15 min,
• Incuber les boites à 37 °C pendant 24 h.
• L’ensemencement de la souche pathogène sur la gélose est précédé de la mesure du
standard 0,5 de Mc Farland, par le biais d’un spectrophotomètre avec une longueur
d’onde calibrée à 625 nm et validé par une mesure d’absorbance fixée entre 0,08 et 0,1.
11
III. RESULTATS ET DISCUSSION

1. Dénombrement
Tubes Tube Tube Tube Tube Tube Tube
T0(SM) T1(𝟏𝟎−𝟏 ) T2(𝟏𝟎−𝟐 ) T3(𝟏𝟎−𝟑 ) T4(𝟏𝟎−𝟒 ) T5(𝟏𝟎−𝟓 )
Milieux
EMB (48h) >150 118
Sabouraud 26 (24 3 (2 levures

(72h) levures et 2 et 1
moisissures) moisissure)
Mossel >150 >150
(24h)
PCA (24h) >300 >150
Figure 7: Résultat du nombre de colonie obtenu après comptage

N.B : L’échantillon contenant une grande concentration de bactéries, il n’a pas été possible de
calculer l’UFC.
2. Caractérisation phénotypique
2.1. L’étude macroscopique
Les résultats de l’étude macroscopique des colonies bactériennes des dans les différentes
boîtes ont été résumé dans le tableau ci-dessous :
Milieux de Boites Couleur des Forme des Relief des Contours des
culture clonies colonies colonies colonies
Mossel 1 Jaune Punctiforme Élevé Régulier

Rose Circulaire Plane Onduleux
2 Jaune Punctiforme Plane Régulier
Rose Punctiforme Semi élevé Régulier
EMB 1 Incolore Circulaire Plane Régulier
Violet Irrégulière Elevé Régulier
2 Incolore Circulaire Plane Régulier
Bleue Punctiforme Plane Régulier
Violet pâle Punctiforme Plane Régulier
Figure 8: Résultats macroscopiques des différentes colonies
12
➢ Les colonies du milieu Mossel

Les différences de couleurs entre les colonies se trouvant sur milieu Mossel sont dues à la
capacité des bactéries à dégrader ou pas le mannitol.
Pour ce faire, les colonies roses contiennent des bactéries incapables de dégradées le
mannitol : ces colonies sont dites mannitol -.
Par contre, les colonies jaunes contiennent des bactéries susceptibles de dégrader le
mannitol : dans ce cas ces colonies sont dites mannitol +
➢ Les colonies du milieu EMB

L’éosine et le bleu de méthylène contenus dans le milieu EMB inhibent la croissance des
bactéries Gram positif. La bonne corrélation entre ces deux colorants permet de distinguer les
Enterobacteriaceae fermentant le lactose de celles qui ne fermentent pas, sur la base du
microorganisme à absorber le colorant.
Les bactéries Gram négatives fermentant le lactose acidifient le milieu et dans des
conditions acides, les colorants produisent un complexe violet-foncé ou bleu-noir (ex E.
coli) qui est généralement associé à un éclat métallique vert. Cet éclat vert métallique est un
indicateur de la capacité vigoureuse de fermentation du lactose typique des coliformes
fécaux.
Les non fermenteurs de lactose tels que Shigella et Salmonella forment des colonies
transparentes, incolores ou ambrées qui se distinguent facilement des coliformes.
13
2.2. L’étude microscopique

Les résultats de l’étude microscopique des cellules bactériennes dans les différentes boîtes ont
été résumé dans le tableau ci-dessous :
Milieux Boites Couleurs des Formes des Arrangement des Mobilité des
colonies sur boîte cellules au cellules au cellules au
microscope microscope microscope
Jaune Coque Isolé +
1
Rose Coque Chainette -
Mossel
Jaune Bâtonnet Isolé -
2
Rose
Incolore Coque Isolé +
1
Violet Coque Isolé -
Incolore Coque Diplocoque -
EMB
2 Bleue Fins bâtonnet Isolé +
Bâtonnet Isolé -
Violet pâle
incurvé
Figure 9: Résultats de l’observation Microscopique des colonies
NB : le signe + pour indiquer la mobilité des cellules et le signe – pour indiquer l’immobilité
des cellules.
14
Les résultats de l’étude macroscopique et microscopique des colonies des moisissures et des levures et leurs cellules des dans les différentes
boîtes ont été résumés dans le tableau ci-dessous :
Macroscopie Microscopie
Couleur des Couleur

Milieu colonies à des colonies Forme des Arrangement des Mobilité des
Isolats et codes
Boîtes l’intérieur de à la surface cellules cellules cellules
la boîte de la boîte
Marron
Moisissure (5) Vert foncé
foncé
1
Moisissure (6) Blanche Marron clair
Présence des
mycéliums
Marron
Moisissure (1) Noire cloisonnés avec
Sabouraud foncé
spores arrondis
et transparents
2
Levure (2) Blanche Marron clair Coques, ovales Isolé Immobile
Levure (3) Blanche Marron clair Rondes Isolé Mobile
Levure (4) Blanche Marron clair Grosses Isolé
Figure 10: Résultats de la macroscopie et de la microscopie des colonies sur Sabouraud
15
2.3. Caractères biochimiques et physiologiques

Les résultats concernant les caractères biochimiques et physiologiques réalisés sur les
différentes colonies des différents milieux ont été résumés dans le tableau ci-dessous :
Test Biochimiques
Couleurs des
Milieux Boites Test de Type de
colonies Test de KOH
Catalase Gram
Jaune + + -
1
Rose - + +
Mossel
Jaune + + -
2
Rose - + +
Incolore + + -
1
Violet + - -
EMB Incolore + + -
2
Bleue + + -
Violet pâle - + +
Figure 11: Résultats des Tests Biochimiques
NB : le signe + pour indiquer que test positif et le signe – pour indiquer que le test est négatif.
3. Activité enzymatique
3.1. Mesure de la croissance bactérienne
La lecture de la DO s’est effectuée en trois mesures pour chacun des échantillons. Plus
l'échantillon est concentré, plus il absorbe la lumière. La croissance optimale se vérifie par une
valeur affichée sur le spectrophotomètre correspondant à un seuil fixé compris entre 0,5 et 1
reflétant la densité optique de l’isolat.
16
1,2
0,8
Densité optique
0,6
0,4
0,2
0
S1R S2R S3J S4J 2 4 6 5
différentes souches
3.2. Mise en évidence de la production d’enzymes protéolytiques

La présence de l’activité casinolytique est détectée par l’apparition d’un halo clair autour des
puits indiquant une hydrolyse de la caséine par des enzymes protéolytique produit par les
isolats. Par contre un résultat négatif se vérifie par l’absence de la zone d’hydrolyse autour de
la culture.
17
3.3. Activités amylolytiques

La révélation des halos s’est effectuée à l’aide du lugol pour plus de visibilité.
L’observation d’une zone translucide indique que la souche produit une enzyme amylase et le
diamètre de chacune des halos translucides a été mesuré à l’aide d’une règle graduée.
S2R
SSS
S1R
S4J SSS
SSS
S3J
SSS
3.4. Activités cellulolytiques

Après 48h d’incubation, nous avons mis dans chaque milieu une petite quantité de lugol
pour révéler s’il y a eu présence des halos ou pas caractéristique d’une activité cellulolytique
des bactéries contenues dans ces boîtes.
L’observation d’une zone translucide indique que la souche produit une enzyme amylase et le
diamètre de chacune des halos translucides a été mesuré à l’aide d’une règle graduée.
4. Activité microbienne
Après incubation des géloses imbibées d’une souche pathogène comme Staphylococcus et
Pseudomonas. La croissance de ces derniers s’est faite sans difficulté ce qui revient à dire que
l’isolat supposée être inhibitrice de ces deux pathogènes n’a pas été capable d’inhiber leurs
croissances.
18
Figure 13: absence d'halos autours des

puits du milieu MH imbibé des
Pseudomonas Figure 12: absence d'halos autours des puits du
milieu MH imbibé des Staphylococcus
19

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UNIVERSITE MARIEN NGOUABI

FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

COMPTE RENDU DU TP DE MICROBIOLOGIE

II. MATERIEL ET METHODES

➢ Le matériel biologique (le sol) ;

Figure 1: Coordonnées géographique du lieu

2.2. Préparation des milieux

➢ La gélose ou milieu EMB

L’hydrogénophosphate de potassium (K2HPO4) sert de tampon pour amortir les

Composition du milieu EMB

Peptone Lactose Saccharose Hydrogénophosphate Eosine Bleu de Agar

➢ La gélose ou milieu Sabouraud

➢ La gélose ou milieu Mossel

La Peptone et l’extrait de viande favorisent la croissance de Bacillus cereus.

Le chlorure le sodium maintient l'équilibre osmotique du milieu. Le D-mannitol est

La polymyxine B est un agent sélectif qui inhibe la croissance des coliformes.

Composition en gramme pour un litre du milieu Mossel, pH 7,2

➢ La gélose ou milieu PCA

Composition en gramme pour un litre du milieu PCA, pH 7

Tryptone Extrait autolytique de levure Glucose. Agar agar bactériologique

En ce qui concerne les étapes de la préparation d’un milieu de culture, il faut :

Après la préparation des milieux, nous sommes passé à l’étape de dénombrement.

Figure 3: Dilutions décimales

Après la dilution, nous avons ensemencé sur boîtes de pétri.

Figure 5 : Incubateur contenant des milieux de culture Figure 4: Incubateur vide

➢ Comptage des colonies

2.4. Purification et conservation

Figure 6: Milieu LB liquide

2.5. Caractérisation phénotypique

2.5.2. Caractères biochimiques et physiologiques

✓ Test de KOH (test de la potasse)

2.6. Activité enzymatique

2.6.2. Mise en évidence de la production d’enzymes protéolytiques

2.6.3. Activités amylolytiques

• Dissoudre 1g d’amidon et 1,5g d’agar dans 100ml d’eau distillée ;

3.5. Activité microbienne

III. RESULTATS ET DISCUSSION

Sabouraud 26 (24 3 (2 levures

Figure 7: Résultat du nombre de colonie obtenu après comptage

Mossel 1 Jaune Punctiforme Élevé Régulier

Figure 8: Résultats macroscopiques des différentes colonies

➢ Les colonies du milieu Mossel

➢ Les colonies du milieu EMB

2.2. L’étude microscopique

Figure 9: Résultats de l’observation Microscopique des colonies

Couleur des Couleur

Moisissure (6) Blanche Marron clair

Levure (2) Blanche Marron clair Coques, ovales Isolé Immobile

Levure (3) Blanche Marron clair Rondes Isolé Mobile

Levure (4) Blanche Marron clair Grosses Isolé

Figure 10: Résultats de la macroscopie et de la microscopie des colonies sur Sabouraud

2.3. Caractères biochimiques et physiologiques

Figure 11: Résultats des Tests Biochimiques

3.2. Mise en évidence de la production d’enzymes protéolytiques

3.3. Activités amylolytiques

3.4. Activités cellulolytiques

Figure 13: absence d'halos autours des

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