Immunopharmacologie et immunotoxicologie

ISSN: 0892-3973 (imprimé) 1532-2513 (en ligne) Page d'accueil du journal: http://www.tandfonline.com/loi/iipi20

La cardamonine inhibe la production de cytokines pro-inflammatoires

et supprime la voie NO dans les PBMC de patients atteints du
syndrome de Sjögren primaire

Sarah Benchabane, Houda Belguendouz, Nassima Behairi, Amina Arroul- Lammali,

Abdelhalim Boudjelida, Pierre Youinou et Chafia Touil-boukoffa

Pour citer cet article: Sarah Benchabane, Houda Belguendouz, Nassima Behairi, Amina Arroul- Lammali, Abdelhalim
Boudjelida, Pierre Youinou & Chafia Touil-boukoffa (2018): La cardamonine inhibe la production de cytokines
pro-inflammatoires et supprime la voie NO chez les PBMC de patients atteints du syndrome de Sjögren primaire et
immunitaire Immunotoxicologie, DOI:
10.1080 / 08923973.2017.1418881

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Publié en ligne: 5 janvier 2018.

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 IMMUNOPHARMACOLOGIE ET IMMUNOTOXICOLOGIE, 2017
https://doi.org/10.1080/08923973.2017.1418881

ARTICLE ORIGINAL

La cardamonine inhibe la production de cytokines pro-inflammatoires et supprime la voie NO dans les PBMC
de patients atteints de Sjo primaire € gren ' syndrome de s

Sarah Benchabane une , Houda Belguendouz une , Nassima Behairi une , Amina Arroul-Lammali une , Abdelhalim Boudjelida b ,
Pierre Youinou c et Chafia Touil-boukoffa une
une Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, Groupe Cyokines et NO Synthases, Faculté des Sciences Biologiques, Université des Sciences et Technologies Houari
Boumediene (USTHB), Alger, Algérie; b Service de médecine interne, hôpital Maillot, Alger, Algérie; c Laboratoire d'Excellence (Labex) IGO, et INSERM ERI29, Université Européenne
de Bretagne, Brest, France

ABSTRAIT HISTORIQUE DE L'ARTICLE

Sjo primaire € gren ' Le syndrome s (pSS) est une maladie auto-immune systémique avec une physiopathologie complexe affectant principalement les Reçu le 3 juillet 2017 Révisé le 19
glandes exocrines, conduisant à une fonction de sécrétion compromise. Des études récentes impliquent que de nombreux médiateurs inflammatoires, tels octobre 2017 Accepté le 18

que les cytokines pro-inflammatoires et l'oxyde nitrique, sont essentiels dans le développement et la perpétuation des manifestations systémiques du SSP. novembre 2017

Dans la présente étude, nous visions à

enquêter sur le ex vivo effet immunomodulateur de la cardamonine (C 16 H 14 O 4), sur les cytokines pro-inflammatoires, le TNF- une, Expression de
MOTS CLÉS
l'IL-6 et de l'oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) pendant la pSS. Dans ce but,
Sj primaire € ogren ' syndrome de s;
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des cellules mononucléées du sang périphérique isolées de patients pSS et de témoins sains ont été cultivées avec différentes concentrations de cardamonine; immunomodu-
cardamonine. Les niveaux de cytokines ont été mesurés par ELISA et la production de NO a été évaluée en utilisant la méthode de Griess. lation; IL-6; TNF- une; oxyde nitrique
Expression de l'oxyde nitrique synthase inductible et NF- j L'activité B a été analysée par coloration par immunofluorescence. Nos résultats suggèrent synthase inductible
que la cardamonine inhibe le TNF- une,
Production d'IL-6 et de NO et régule à la baisse l'expression d'iNOS et NF- j Activation B. Collectivement, nos résultats mettent en évidence ex vivo effets
immunomodulateurs de la cardamonine sur la production de cytokines pro-inflammatoires et la voie NO chez les patients atteints de SSp. Par
conséquent, la cardamonine est un candidat potentiel pour contrôler l'inflammation au cours de la pSS.

introduction par facteur nucléaire j B (NF- j B) activation 8 - dix . NF- j B est un élément clé des
cascades de signalisation pro-inflammatoires intracellulaires qui contrôlent
Sjo€ gren ' syndrome de s (SS), est une maladie auto-immune systémique qui affecte
l'expression des gènes liés à l'inflammation 11 .
principalement les glandes exocrines (SS primaire [pSS]), et affecte moins souvent les
tissus conjonctifs, connus sous le nom de SS secondaire (sSS). Ce syndrome est
Il n'y a actuellement aucun traitement efficace disponible pour
caractérisé par une infiltration de cellules immunitaires des glandes salivaires et / ou
pSS. Plusieurs tentatives d'utilisation de thérapies biologiques ont conduit à des
lacrymales, entraînant un dysfonctionnement des glandes exocrines, une destruction
résultats incohérents 12 - 14 . Le traitement actuel de la SS repose sur le traitement de ses
tissulaire et un dysfonctionnement chronique. 1 . Les manifestations cliniques de la SS
symptômes et est associé à plusieurs effets secondaires, notamment une toxicité
sont larges, car les patients peuvent présenter des combinaisons variables de
gastro-intestinale et rénale. En l'absence de traitement efficace, l'utilisation d'agents
manifestations extra-glandulaires systémiques, telles que neuropathie périphérique,
naturels, efficaces et moins toxiques a augmenté dans le monde entier. Il est
arthralgie, maladie pulmonaire, entre autres. Comme cela est courant dans de
nécessaire de développer de nouvelles options thérapeutiques avec une faible toxicité
nombreuses maladies auto-immunes, la SS primaire est une maladie complexe. Pour
et des effets secondaires minimes. Des rapports antérieurs ont démontré que la
tenter de dégager les facteurs en jeu, plusieurs hypothèses non testées ont été
cardamonine possède diverses activités biologiques, notamment des effets
proposées pour mieux comprendre la physiopathologie du pSS 2 . En effet, l'interaction anti-inflammatoires, antiallergiques, antioxydants, antimicrobiens et anticancéreux. 15 - 17 .
entre les facteurs génétiques, environnementaux et hormonaux joue tous un rôle dans le La cardamonine possède ses propriétés anti-inflammatoires in vitro et in vivo par une
déclenchement des réponses auto-immunes, l'hyperactivité des lymphocytes B et T, la régulation à la baisse de NF- j B p65 activation et suppression de I-kappa-B alpha (I j B)
production d'auto-anticorps et la destruction progressive des organes cibles. 3 , 4 . L'augmentation
la phosphorylation 18 - 20 .
de la sécrétion de multiples cytokines pro-inflammatoires et médiateurs
pro-inflammatoires, y compris l'oxyde nitrique (NO) de radicaux libres à courte durée de
vie généré par l'oxyde nitrique synthase inductible activé (iNOS), initie et / ou perpétue Nos travaux antérieurs ont démontré que le déséquilibre du NO et des cytokines
les lésions auto-immunes 5 - 7 . contribuait au maintien des processus inflammatoires pendant le pSS 21 . Par conséquent,
dans la présente étude, nous avons d'abord cherché à évaluer les effets
anti-inflammatoires et immunomodulateurs de la cardamonine sur le TNF- une, Production
d'IL-6 et de NO dans les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir de
L'expression d'iNOS est régulée transcriptionnellement, en particulier pSS

CONTACT Chafia Touil-boukoffa touilboukoffa@yahoo.fr Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, Groupe Cyokines et NO Synthases, Faculté de
Sciences biologiques, Université des Sciences et Technologie Houari Boumediene (USTHB), Alger, Algérie
2017 Informa UK Limited, exerçant sous le nom de Taylor & Francis Group
 2 S. BENCHABANE ET AL.

les patients. Ensuite, dans un effort pour évaluer les effets anti-inflammatoires de la
cardamonine rapportés ci-dessus, nous avons testé son effet sur l'expression d'iNOS et
NF- j Activité B.
matériaux et méthodes
Patients et contrôles
Le service de médecine interne de l'hôpital de Maillot a recruté 32 patients (29
femmes, 3 hommes) répondant à la version révisée américaine de 2002 - Critères
de classification européens pour pSS 22 .
Aux fins d'uniformité, les patients atteints de SS ont été exclus. Les caractéristiques
cliniques des patients sont résumées dans Tableau 1 . Les troubles extraglandulaires
les plus fréquents étaient les atteintes articulaires (18 cas) et Raynaud ' syndrome de
s (16 cas). Tous les patients ont reçu des stéroïdes à une faible dose de 5 mg / j.
Les 18 donneurs sains (15 femmes, 3 hommes) étaient constitués de volontaires
sains d'âge et de sexe appariés aux patients. Tous les participants ont donné leur
consentement éclairé pour la présente étude conformément aux directives du groupe
de travail local sur l'éthique de l'Agence nationale de recherche thématique en
sciences de la santé ATRSS.
Préparation et culture des cellules mononucléées du sang périphérique
Les cellules mononucléées du sang périphérique ont été séparées par centrifugation en
gradient de densité (2800 tr / min, 15 min) sur FicollHypaque 1.077 (Sigma-Aldrich), et
lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS, pH 7,4)
(1500 tr / min, 5 min). La viabilité cellulaire a été estimée à> 96% avec 0,2% de bleu
trypan
test d'exclusion de colorant. Les PBMC fraîchement isolés ont été remis en suspension
à une concentration finale de 10 6 cellules viables / ml dans un milieu complet composé
de RPMI-1640 supplémenté avec 5% de FCS inactivé par la chaleur, de pénicilline (100
UI / ml) et de streptomycine (100 l g / mL). Les cultures de PBMC ont ensuite été
laissées non traitées (référence) ou traitées avec différentes concentrations de
cardamonine (20, 50 ou 70 l M). Il a été confirmé que les concentrations de cardamonine
n'avaient aucun effet cytotoxique sur les cellules. Les cultures de PBMC ont été
réalisées en triple et les cultures non traitées ont été incluses comme témoins négatifs.
De plus, les PBMC
ont été incubés dans des conditions standard (37 C, 5% CO 2).
Les cellules ont ensuite été récoltées pour la viabilité et l'immunocoloration

Analyse. Les surnageants de culture ont été utilisés pour l'analyse des niveaux de NO et de
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cytokines.

Médicament et réactifs Dosages de cytokines

Cardamonine ou 2 0, 4 0- dihydroxy-6 0- méthoxychalcone (C 16 H 14 O 4,
MW270.28), avec une pureté de 98% (en utilisant HPLC), Roswell Park
Le milieu Memorial Institute 1640 (RPMI-1640), le sérum de veau fœtal inactivé par
la chaleur (FCS), la L-glutamine, la pénicilline, la streptomycine, la
N-1-naphtyl-éthylène diamine (Griess A) et le sulfanilamide (Griess B) ont tous été
achetés auprès de SigmaAldrich (Saint-Louis, MO). La solution mère de
cardamonine a été diluée immédiatement avant utilisation à la concentration
désirée avec RPMI-1640 supplémenté avec de la glutamine (2 mM), du FCS
inactivé par la chaleur à 5%, de la pénicilline (100 UI / ml) et de la streptomycine
(100 l g / mL). L'anticorps anti-iNOS a été acheté auprès de Santa Cruz
Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-NF- j B (p65) et l'anticorps secondaire d'IgG
anti-lapin de chèvre conjugué à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ont été
achetés auprès de Life Technologies (Camarillo, CA). IL-6 humain et TNF- une Les
kits ELISA ont été obtenus auprès d'Invitrogen (Carlsbad, CA) et d'IBL International
(Flughafenstrasse, Hambourg,
respectivement.
Les taux sériques d'IL-6 et de TNF- une ( sensibilité: 2 et 1 pg / mL,
respectivement) ont été déterminées à l'aide de l'ELISA commercial
selon à le fabricants ' instructions
(Invitrogen pour IL-6 et IBL International pour TNF- une). Les concentrations d'IL-6 et de
TNF- une en conséquence ont été calculés en utilisant des courbes standard.
Mesure de la production d'oxyde nitrique dans les surnageants de culture
La méthode de Griess modifiée a été utilisée pour déterminer le NO 2
niveaux dans les surnageants de culture. NON 2 est un produit aval stable de NO,
tel que décrit par Touil-Boukoffa 23 . Brièvement,
100 l L de surnageant de PBMC cultivées a été mélangé avec 50 l L de 5% de
sulfanilamide, 0,5% de dichlorhydrate de naphtyléthylènediamine et 20% de HCl.
Le mélange a été incubé dans l'obscurité pendant 20 min et les densités optiques
Allemagne),
ont ensuite été déterminées en utilisant un spectrophotomètre à 543 nm. La
concentration de nitrite a été déterminée par rapport à la courbe standard
construite en utilisant du nitrite de sodium.

Tableau 1. Caractéristiques cliniques des patients atteints du syndrome de Sjögren primaire (pSS) et des témoins sains (Hc).

Immunocoloration par fluorescence

pSS ( n ¼ 32) HC ( n ¼ 18)

Le genre Après l'incubation, les PBMC traitées et non traitées à la cardamonine ont été récoltées,
Femmes 29 15
lavées deux fois dans du PBS et fixées sur des lames de verre propres en utilisant du
Hommes 3 3
Âge paraformaldéhyde à 4%. Les lames ont été rincées trois fois avec 0,5% de PBS-Tween,
Âge moyen au début de la maladie (années) 47,87 ± 12,35 ans 42,16 ± 13,34 ans perméabilisées avec
0,1% Triton-X 100 pendant 30 min, et bloqué en utilisant du lait (5% de lait en poudre sans
Caractéristiques cliniques (%) 32 (100%)
Xérostomie et / ou xérophtalmie 22 (68,75%) matière grasse dans du PBS) pendant 2 h. Les lames ont ensuite été rincées et incubées
Manifestation extraglandulaire 10 (31,25%) pendant une nuit à 4 ° C dans une chambre humide avec un anticorps primaire antiiNOS
Vas culite cutanée 16 (50%)
(1:50) ou un anticorps anti-NF-kB p65 (1: 100). Les cellules ont été lavées trois fois avec du
Manifestation articulaire 18 (56,25%)
Neuropathie périphérique 6 (18,75%) PBS et incubées pendant 2 h avec l'anticorps secondaire de chèvre anti-lapin.
Moyenne numérique ± écart type, pourcentage.
 IMMUNOPHARMACOLOGIE ET IMMUNOTOXICOLOGIE 3

pour iNOS (1: 1000) et anticorps anti-souris pour NF-kB p65 conjugué avec FITC (1:
1000) dans une chambre humide sombre. Pour déterminer la localisation de NF- j B, les
noyaux ont été marqués avec DAPI; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (Sigma-Aldrich,
France). Les lames ont été montées avec 90% de glycérol dans du PBS puis observées
sous un microscope à fluorescence (Axioskop 2; Zeiss, Oberkochen, Allemagne). En
tant que contrôle négatif, les anticorps primaires ont été omis; aucune coloration n'a été
détectée. Les images ont été prises à l'aide d'un appareil photo numérique (Powershot
A640; Canon, Tokyo, Japon).

Analyses statistiques

Tous les résultats ont été exprimés en moyenne ± écart-type (ET) et analysés avec le
logiciel Graph-Pad Prism 6.01 (GraphPad Inc., La Jolla, CA). Des comparaisons
statistiques entre deux groupes ont été effectuées à l'aide de Student ' s t- test, et
ANOVA suivi par le Fisher ' s LSD post hoc test a été évalué pour des comparaisons
multiples (patients / contrôles, cellules stimulées / non stimulées). L'analyse
quantitative de la fluorescence a été réalisée à l'aide de l'image J.Les résultats ont
Figure 1. Effets de l'administration de cardamonine sur la production d'IL-6 par les PBMC de patients pSS et de
témoins sains. Les niveaux d'IL-6 ont été mesurés par ELISA dans les surnageants de cultures de PBMC de
patients pSS ( n ¼ 32) ou des témoins sains ( n ¼ 18) en présence ou en l'absence de 50 l M de cardamonine. Les
données sont présentées comme des moyennes ± SD ( p. 05,
p. 001). Traitement à la cardamonine nettement
diminution de la production d'IL-6 chez les patients pSS ( p . 001).

été considérés comme significatifs lorsque le p les valeurs étaient de 0,05.

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Résultats

Effet de la cardamonine sur la viabilité des PBMC

Le test d'exclusion du colorant bleu Trypan a été utilisé pour évaluer l'effet de la
cardamonine sur la viabilité cellulaire. La viabilité cellulaire des PBMC après 20 h de
traitement avec la cardamonine ne différait pas de celle des cellules non traitées. Ces
observations suggèrent que des concentrations de cardamonine comprises entre 20 et 70 l M
n'avait aucun effet cytotoxique sur les PBMC (données non présentées).

Effets de la cardamonine sur la production d'IL-6 in vitro

Nous étions également intéressés à examiner si la cardamonine pouvait affecter la

production d'IL-6, une cytokine qui peut réguler à la hausse l'expression d'iNOS. Les
niveaux d'IL-6 ont été évalués par ELISA en utilisant des surnageants de PBMC de
patients pSS et de contrôles après incubation avec 50 l M cardamonine ( Figure 1 ).
Fait intéressant, la cardamonine atténue la production d'IL-6. En effet, le traitement à
la cardamonine a extrêmement diminué in vitro Libération d'IL-6 chez les patients
pSS ([IL-6] cardamonine (50 l M) ¼
Figure 2. Effets de l'administration de cardamonine sur le TNF- une production par PBMC à partir de patients
pSS et de témoins sains. TNF- une les taux ont été déterminés par ELISA dans les surnageants de PBMC
traités et non traités par pSS obtenus de patients pSS ( n ¼ 32) et de témoins sains ( n ¼ 18). Les résultats sont
présentés sous forme de moyennes ± ET ( p. 05,
p. 01 p. 001). Traitement à la cardamonine signifi-
une diminution significative du TNF- une production chez les patients pSS ( p. 01).

patients après un traitement par cardamonine ([TNF- une] cardamonine (50 l M) ¼ 9,72 ± 4,86
50,53 ± 13,26 pg / mL par rapport à la valeur initiale de [IL-6] ¼ 67,00 ± 13,52 pg / ml;
pg / mL contre [TNF- une] ligne de base ¼ 13,70 ±
p. 001), par rapport aux témoins dans lesquels l'effet était moins prononcé ([IL-6]
6,57 pg / ml; p. 01) a été observée. Les témoins sains ont également montré une
cardamonine (50 l M) ¼ 15,42 ± 5,69 pg / mL par rapport à la valeur initiale de [IL-6] ¼ 20,68
diminution similaire après un traitement par cardamonine ([TNF- une] cardamonine
± 6,17 pg / ml; p. 05). De plus, nos résultats ont montré des niveaux de base nettement
(50 l M) ¼ 3,61 ± 1,53 pg / mL contre [TNF- une] ligne de base ¼ 4,94 ± 1,77 pg / ml; p.
plus élevés d'IL-6 chez les patients pSS (67,00 ± 13,52 pg / mL) par rapport aux
05) ( Figure 2 ). De plus, nos résultats ont montré une différence statistiquement
témoins sains (20,68 ± 6,17 pg / mL; p. 001).
significative dans le in vitro niveaux de base de TNF- une entre patients pSS ([TNF- une]
¼ 13,70 ± 6,57 pg / mL) et des témoins sains [TNF- une] ¼ 4,94 ± 1,77 pg / ml; p. 001).

Effets de la cardamonine sur le TNF- une production in vitro

Puisque la surproduction de cytokines pro-inflammatoires est

nocifs et entraînent de nombreuses maladies inflammatoires, inhibent PAS de production par les PBMC de patients pSS
des facteurs pro-inflammatoires ont été considérés comme
candidats anti-inflammatoires. Une diminution significative de To test in vitro AUCUNE production dans le pSS, les nitrites résiduels étaient du TNF- une production dans des
surnageants de PBMC à partir de pSS mesurés dans des surnageants de culture de PBMC par Griess ' s méthode.
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Figure 3. AUCUNE production dans le surnageant de culture des patients pSS et des témoins sains. [UNE]. PBMC (10 6 cellules / mL) de patients pSS ( n ¼ 32) ou des témoins sains ( n ¼ 18) ont été cultivées dans des conditions non stimulées pendant 20
h. Les niveaux de nitrite ont été mesurés par une méthode de Griess modifiée dans les surnageants de culture. Les valeurs représentent la moyenne ± écart-type. (
p. 001). Effet du traitement à la cardamonine sur in vitro AUCUNE production chez les témoins sains [B] et les patients pSS [C]. PBMC (10 6 cellules / mL) provenant de
contrôles ( n ¼ 18); et patients pSS ( n ¼ 32) ont été traités ou non à la cardamonine (20, 50 ou 70 l M). Après 20 h d'incubation, les concentrations de nitrites ont été mesurées dans les surnageants de culture pour la production de NO en utilisant une méthode
de Griess modifiée. Le traitement à la cardamonine a considérablement réduit la production de NO par les PBMC des patients atteints de SSp. Les valeurs représentent la moyenne ± écart-type. ( p. 05, p. 01,
p. 001).

Une augmentation significative de la production de NO par les PBMC obtenues de
patients atteints de SSp par rapport aux témoins sains respectivement (22,17 ± 8,22
pg / mL vs 14,39 ± 1,31 pg / mL; <0,001) ( Figure 3 (A) ) a été observé.
Effet de la cardamonine sur la production de NO par les PBMC des patients atteints de SSp
De plus, la concentration de NO dans les surnageants de PBMC non traités de
patients pSS était de 22,17 ± 8,22 l M, qui a significativement diminué à 18,06 ±
6,87 l M ( p <. 05),
14,85 ± 6,52 l M ( p <. 001) et 17,99 ± 6,13 l M ( p <. 005) après 20 h de traitement
avec 20, 50 et 70 l M de cardamonine, respectivement. Fait intéressant, dans les
deux PBMC obtenus à partir de patients atteints de SSp et de témoins sains, 50 l M
de cardamonine a induit la plus grande diminution significative de la production de
NO

Compte tenu des niveaux élevés de nitrites produits par les PBMC des patients
atteints de SSp, nous avons étudié la in vitro effet immunomodulateur de la
cardamonine sur la production de NO. Les PBMC de patients pSS et de témoins sains
ont été traités avec différentes concentrations de cardamonine (20, 50, 70 l M) pendant
20 h. Le surnageant a ensuite été collecté et le NO a été évalué à l'aide de Griess ' s
méthode. Comme représenté sur la Figure 3 (B), (C) , toutes les concentrations de
cardamonine exercent un effet immunomodulateur sur la production de NO dans les
PBMC de patients atteints de SSp et de témoins sains. Les concentrations de nitrites
libérés dans les surnageants de PBMC de témoins sains étaient significativement plus
élevées dans les cellules non traitées (14,39 ± 1,31 l M) par rapport à ceux traités avec
20 l M (13,03 ± 1,56, p <. 05), 50 l M (10,93 ± 1,71,
( p <. 001).
Effet de la cardamonine sur l'expression d'iNOS par les PBMC
L'effet du traitement à la cardamonine sur l'expression d'iNOS a ensuite été étudié.
Les PBMC de patients pSS et de témoins sains ont été cultivées avec ou sans 50 l M
de cardamonine pendant 20 h. Une diminution significative de l'expression d'iNOS
par les PBMC traités avec 50 l M de cardamonine a été observée à la fois chez les
patients pSS et les témoins sains, par rapport aux cellules non traitées. En effet,
une réduction considérable de l'intensité de fluorescence est observée ( Figure 4 ).
Nos résultats suggèrent que la cardamonine supprime l'expression d'iNOS dans
les PBMC des patients pSS.

p <. 001) et 70 l M cardamonine (12,86 ± 2,02, p <. 05).

 IMMUNOPHARMACOLOGIE ET IMMUNOTOXICOLOGIE 5
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Graphique 4. La cardamonine régule à la baisse l'expression d'iNOS chez les patients pSS et les témoins sains. Les PBMC ont été isolés de témoins sains ( n ¼ 3) et les patients pSS ( n ¼ 3) et ont été cultivées pendant 20 h sans ou
avec 50 l M cardamonine. Après incubation, les cellules ont été récoltées et fixées. L'expression d'iNOS a été analysée par immunofluorescence comme décrit ci-dessus. PBMC de témoins sains traités avec 50 l La cardamonine M a
également été marquée avec du DAPI pour la visualisation des noyaux et la localisation des cellules. (A) Des images représentatives ont montré des zones choisies arbitrairement (grossissement 400) d'expériences réalisées en
double. (B) Une expression élevée d'iNOS a été détectée dans les cellules non traitées des patients par rapport aux témoins (
p <. 001). Le traitement à la cardamonine régule nettement à la baisse l'expression d'iNOS dans les PBMC
des deux patients pSS ( p <. 001) et des témoins sains ( p <. 05) par rapport aux cellules non traitées.

Effet de la cardamonine sur NF- j Activité B Discussion

Puisque l'expression des facteurs pro-inflammatoires est souvent contrôlée par la NF- j B, La surproduction de cytokines et / ou de médiateurs pro-inflammatoires peut être
nous avons testé si la cardamonine régule le NF- j Voie de signalisation B. NF- j On
pense généralement que B est exprimé de manière constitutive et situé dans le
cytoplasme en tant que complexe avec des membres de I j B inhibiteur de la famille de
protéines. Lors de l'activation cellulaire, les sous-unités de NF- j B se déplacent vers le
noyau. Dans la présente étude, la coloration par immunofluorescence a été utilisée
pour déterminer la localisation nucléaire de p65, l'un des NF- j Sous-unités B.
Les PBMC de patients pSS et de témoins sains ont été cultivées avec ou
sans 50 l M de cardamonine pendant 20 h. Nous avons observé une forte
localisation de la sous-unité p65 dans le noyau des PBMC pSS. Cependant, p65
était presque complètement cytoplasmique dans les PBMC de témoins sains.
De plus, nos résultats démontrent que la localisation nucléaire p65 dans les
PBMC pSS était significativement réduite avec 50 l M cardamonine ( Figure 5 ).
Par conséquent, il est possible que l'effet immunomodulateur de la cardamonine
soit médié par l'inhibition de la NF- j Voie de signalisation B.
nocive et entraîner diverses maladies inflammatoires. Les inhibiteurs de facteurs
pro-inflammatoires, les médicaments ciblant, inhibant ou régulant sélectivement
certaines voies sont des candidats intéressants dans la lutte contre l'inflammation
incontrôlée. Les chalcones ont attiré l'attention de nombreux chercheurs en tant
qu'agents prometteurs dans la régulation des maladies associées à l'inflammation.
De nombreuses études ont démontré des améliorations de l'inflammation dans de
nombreux modèles expérimentaux de maladie après un prétraitement à la
cardamonine 24 - 26 .
En corroborant ces études précédentes, en utilisant des PBMC de patients atteints
de SSp, nous avons démontré la in vitro effet immunomodulateur de la cardamonine et
rapportent sa capacité à diminuer significativement le TNF- une, Production d'IL-6 et de
NO ainsi que suppression de l'expression d'iNOS par NF- j B. Dans nos conditions
expérimentales, 50 l M de cardamonine n'a montré aucun effet cytotoxique sur les
PBMC. D'autres travaux ont rapporté que cette concentration identique ou beaucoup
plus élevée de cardamonine inhibait significativement la production de NO et conduisait
à une diminution significative de la
 6 S. BENCHABANE ET AL.
Figure 5. Effet de la cardamonine sur NF- j Activité B chez les patients pSS. PBMC de contrôles sains ( n ¼ 3) et les patients pSS ( n ¼ 3) ont été incubés pendant 20 h. sans ou avec 50 l M de cardamonine. Localisation de NF- j B p65 a
été visualisé par microscopie à fluorescence après coloration par immunofluorescence avec NF- j Anticorps B p65. Les cellules ont été marquées avec DAPI pour la visualisation des noyaux. Toutes les conditions ont été exécutées
en double.
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quantité de p65 dans le noyau 18 , 27 . Il a également été indiqué que la cardamonine
induisait de légères lésions à une concentration maximale de 90 l M dans les cellules
HEK293. Cependant, aucune cytotoxicité détectable n'a été induite par la
cardamonine dans les 30 l M. Ainsi, il a été rapporté que la cardamonine possède une
large fenêtre de sécurité entre son activité pharmaceutique et sa cytotoxicité 6 .
De plus, la cardamonine a montré une cytotoxicité préférentielle contre les cellules
cancéreuses pancréatiques humaines PANC-1 dans un milieu pauvre en nutriments
supérieur à 256 l M 28 .
Ici, nous avons d'abord cherché à étudier l'effet de la cardamonine sur le TNF- unepro-inflammatoires et de médiateurs qui recrutent des cellules immunitaires
et production d'IL-6 in vitro. On pense que la production accrue de ces cytokines
pro-inflammatoires est un facteur important dans la physiopathologie du pSS.
Plusieurs études ont attribué un rôle central aux cytokines pro-inflammatoires, y
compris le TNF- une et IL-6, dans pSS 29 , 30 . TNF- une est un médiateur
pro-inflammatoire important impliqué dans la pathogenèse de plusieurs maladies
inflammatoires via l'induction d'IL-6, IL1 b et l'activation des cellules T. Fait
intéressant, nos données actuelles démontrent clairement que la cardamonine a
significativement diminué l'IL-6 et le TNF- une niveaux dans les PBMC ( Figures 1 et
2 , respectivement). Ces résultats prouvent que la cardamonine exerce des actions
anti-inflammatoires in vitro. Une autre étude menée récemment, et utilisant un
modèle expérimental de polyarthrite rhumatoïde, a montré que la cardamonine
supprimait de manière significative les taux plasmatiques de TNF- une, IL-1 b et
IL-6 26 . De même, un prétraitement à la cardamonine a sauvé les souris C57BL / 6
de la mortalité induite par les lipopolysaccharides (LPS) en conjonction avec une
diminution des taux sériques de TNF- une 20 . En outre, il a été décrit que les
niveaux d'IL-6 diminuaient chez les sujets à haut risque de maladie
cardiovasculaire après consommation de polyphénols. 31 . Ces résultats, ainsi que
nos données actuelles, nous ont amenés à proposer que la cardamonine médie
ses effets anti-inflammatoires par la régulation du TNF- une et IL-6. Cependant, le
mécanisme complet de la régulation de l'activité inflammatoire accrue par la
cardamonine reste incertain; un candidat possible est la régulation de l'expression
d'iNOS.
Conformément aux études précédentes, nous rapportons in vitro
implication de l'oxyde nitrique dans le pSS, soutenant son
rôle 21 , 32 , 33 . Notre groupe a rapporté que les niveaux de NO coïncident avec la
gravité de l'inflammation 21 . L'oxyde nitrique est l'un des radicaux libres réactifs les
plus puissants, sa surproduction et son interaction avec les anions superoxydes
génèrent des peroxynitrites, qui renforcent le stress oxydatif et contribuent à
endommager les tissus. L'augmentation de la production de NO dans le
surnageant des PBMC cultivées de patients pSS indique la présence de
monocytes / macrophages activés, reflétant l'état inflammatoire du pSS. Ces
cellules participent activement à l'inflammation chronique par l'activation de
plusieurs voies de transduction du signal déclenchant la sécrétion de cytokines
supplémentaires vers les sites d'infection 34 . En effet, ces cellules jouent un rôle
clé dans l'initiation de la réponse inflammatoire, principalement par la production
de TNF- une, IL-6 et médiateurs pro-inflammatoires comme NO et prostaglandine
E2. Il est bien établi que dans l'inflammation chronique, la synthèse de NO est
régulée à la hausse, principalement en raison de l'expression accrue d'iNOS. Ce
processus est principalement induit dans les monocytes / macrophages par des
cytokines pro-inflammatoires et des DAMP bactériens 35 , 36 .
Dans ce rapport, nous visions à tester l'effet suppressif de la cardamonine in vitro sur
PAS de production. Nos données indiquent que la cardamonine supprime de manière
significative la production de NO dans les PBMC des patients atteints de SSp ( Figure 3
(B) ). L'effet inhibiteur de la cardamonine sur la production de NO nous a incités à tester
davantage l'effet de la cardamonine sur l'expression d'iNOS. Nous démontrons que la
cardamonine supprimait significativement l'expression d'iNOS ( Figure 4 ). Par
conséquent, nous suggérons que l'effet inhibiteur sous-jacent de la cardamonine sur la
production de NO est dû à la régulation négative d'iNOS. Cependant, des études plus
approfondies, avec des cohortes plus importantes, sont nécessaires pour clarifier le
mécanisme exact par lequel la cardamonine exerce son effet régulateur sur la voie du
NO. Dans une autre étude, il a été rapporté que la cardamonine a démontré une
activité inhibitrice modérée contre l'activité enzymatique de la lipoxygénase, une autre
enzyme clé impliquée dans la réponse inflammatoire. 18 . Cependant, la façon dont la
cardamonine a atténué la production de NO reste à être pleinement
 IMMUNOPHARMACOLOGIE ET IMMUNOTOXICOLOGIE 7

élucidé. Il a été suggéré que la cardamonine peut exercer son effet inhibiteur via un Conclusions
mécanisme redox 37 . D'autres découvertes ont rapporté des effets anti-oxydants de la
Collectivement, nos résultats fournissent la première preuve que la cardamonine a
cardamonine en raison de ses propriétés de piégeage 18 . La régulation de la
des effets anti-inflammatoires potentiels dans le pSS. Le mécanisme d'action
synthèse de NO par iNOS dans les macrophages est d'abord supprimée par des
sous-jacent de la cardamonine implique très probablement la régulation de
molécules de récepteurs cellulaires telles que les récepteurs de type Toll et CD14.
Le CD14 est le récepteur du LPS et joue un rôle essentiel dans les réponses
l'expression d'iNOS et / ou d'IL-6 et de TNF- une production. De plus, il semble

pro-inflammatoires des monocytes et des macrophages par l'activation du NF- j Voie étroitement lié à la NF- j Suppression de la signalisation B. La suppression de ces

B 38 . Certaines études ont montré que les polyphénols sont capables de supprimer médiateurs pro-inflammatoires serait bénéfique dans la gestion des maladies

les mécanismes épigénétiques, y compris la méthylation de l'ADN et les inflammatoires. Pris ensemble, nos résultats mettent en évidence l'effet

modifications d'histones. De plus, la modulation épigénétique par les polyphénols immunomodulateur de la cardamonine dans le pSS. Par conséquent, la

affecte également l'expression des miARN participant à de nombreux processus cardamonine est un candidat précieux dans l'intervention de la NF- j Inflammation
biologiques. Une étude a démontré que les polyphénols de différentes sources sont pathologique B-dépendante.
capables de réguler la fonction immunitaire 39 .

Remerciements

NF- j B est l'un des régulateurs les plus importants de l'expression des gènes Les auteurs tiennent à remercier tous les patients et volontaires sains impliqués dans ce travail. Ils

pro-inflammatoires. La région du promoteur du gène iNOS contient des sites de remercient également le Dr Amri Manel, le Dr Toumi Ryma et le Dr Rafa Hayet.

liaison pour NF- j B. Nous avons donc étudié les effets de la cardamonine sur NF- j
Signalisation B. NF- j B est nécessaire pour la transcription de nombreuses
cytokines pro-inflammatoires, et a été largement considéré comme une cible
Déclaration de divulgation
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thérapeutique pour diverses conditions inflammatoires. La forme la plus

Les auteurs ne signalent aucun conflit d'intérêts.
abondante de NF- j B dans les cellules est l'hétérodimère p50 / p65, qui est
normalement séquestré dans le cytoplasme, lié à la protéine inhibitrice I j B une. Suite
à divers stimuli, tels que exogènes (LPS) ou endogènes (IFN- c, et TNF- une) inducteurs,
Financement
je j B une est rapidement phosphorylé par IKK, ubiquitiné, puis dégradé,
Ce travail a été soutenu financièrement par l'Agence thématique de recherche en développement des
permettant à NF- j B p50 / p65 à transloquer vers le noyau 40 .
sciences de la santé ATRSS, projet n ° 1601/09/2009.

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réguler l'expression des cytokines pro-inflammatoires et des médiateurs, il est

4.
donc fort possible que la suppression de NF- j L'activation B décrite dans nos
travaux est le mécanisme par lequel la cardamonine inhibe le TNF- une, IL-6 et
5.
PAS de production. La libération de ces médiateurs pro-inflammatoires est
principalement régulée par les taux de transcription de la cytokine. Étant donné
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médiée par les cytokines 44 . Nos résultats sont en outre étayés par des études
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cardamonine bloque la dégradation de la NF- j B dans l'œdème de la patte
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production par la cardamonine peut être due à l'inhibition de NF- j Translocation
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