Produire des biocarburants à partir de micro-

algues : quels enjeux pour la recherche ?

Gilles Peltier

Institut de Biologie Environnementale et Biotechnologie

CEA, CNRS, Université Aix Marseille

CEA Cadarache

gilles.peltier@cea.fr
 Les biocarburants de 2ème et 3ème générations

Un enjeu pour la société et pour la recherche

2G
Biomasse Pilotes
ligno-cellulosique Démonstrateurs

hydrogène

3G hydrogène
Micro-organismes Recherche
photosynthétiques biodiésel
Micro-organismes photosynthétiques
 Les micro-algues et les cyanobactéries

… une biodiversité à peine explorée :

30 000 espèces décrites
200 000 à 1 million estimées

40 à 50% de la photosynthèse terrestre

À l’origine de la formation du pétrole
Biomasse plantes supérieures ν biomasse algale

N, P, S,… Protéines
Lignine
Amidon
amidon
Hémicellulose CO2
Lipides
lipides
H2
Cellulose
hydrogène
Hydrogène
H2O

O2

Algue (%, poids Protéines Carbohydrates Lipides ARN /

sec) ADN

Scenedesmus 50-56 10-17 12-14 3-6

obliquus
Chlamydomonas 48 17 21 -
rheinhardii
Chlorella vulgaris 51-58 12-17 14-22 4-5
Culture en bassins ouverts

Earthrise Algae Farm,

Calipatria, California,
USA, Culture en bassins
ouverts sur 22 ha
 Les différents systèmes de culture de microalgues
- Bassins (raceway ponds) ouverts ou fermés (sous serre)
- Photobioréacteurs tubulaires
- Sac plastiques

Parry Nutraceuticals Ltd., Spirulina Ponds, India

Vue futuriste d’une ferme de microalgues cultivées en

photobioréacteurs (Solix biofuels Colorado, USA) Photobioréacteur tubulaire solaire
Photobioréacteur plan pour la
(Algatech, désert du Negev, Israël)
production de chlorelles (O.Pulz,
Allemagne)
Culture de microalgues pour la production de composés HVA

D’après M. Tredici, EABA Meeting, Florence, 2009

 Production de microalgues : avantages et inconvénients

Avantages
- Productivité surfacique élevée
- Composition de la biomasse flexible
- Peu de compétition avec la production
alimentaire
- Peu de compétition avec les ressources
en eau
- Recyclage de déchets urbains (N, P, S,..)
ou industriels (CO2)
Inconvénients
- Recours aux conditions de carence pour
induire l’accumulation de produits riches
en énergie
- Pas d’amélioration génétique
(adaptation aux systèmes de cultures)
- Systèmes de cultures et de récolte
coûteux

Plantes C4
Microalgues Plantes C3
(sorgho, maïs,…)

Productivité maximale (T.ha-1.an-1) 150-180 60 30

Productivité observée (T.ha-1.an-1)

Photobioréacteurs 50-70
10-30 10-15
Champ

150 T.ha-1.an-1 = 40 g. m-2.s-1 (sur 365 jours) D’après « EPOBIO project » University of York – Sept 2007
Des microalgues pour la production de biocarburants ?

• Production d’hydrogène
• Production de lipides et de biodiesel

Fixation CO2 H+ H2
du CO2
Rubisco

H2ase
H2/H+
Amidon
NADPH

Fd
QA FNR
Cyt
PQ b6/f
PS II PS I
Pc
H2O O2
 Les limites thermodynamiques

3 ATP CO2
Cycle Photosynthétique de 2 NADPH
Réduction du Carbone ATP/NADPH ratio : 1,5 2 NADPH ATP ADP+Pi
ATP (1) H+ Fd H+
RuBP 1 CO2 QA FNR
RuP Rubisco
Cyt
Calvin cycle 3-PGA (2) PQ b6/f
PS II PS I
Pc
Triose-P ATP (2)
NADPH (2) 2 H2O 2H+ + O2 H+ H+

8 Photons

Photons PAR 217 KJ. mole-1 en moyenne

1 mole fixed CO2 est équivalent à 475 KJ (1/6 mole glucose)
Conversion théorique maximale du PAR en énergie chimique (biomasse) :
475 KJ / (217 x 8 KJ ) = 27%
PAR (Photosynthetic Active Radiation) : ~ 45% de l’énergie solaire
Conversion photosynthétique maximale : 27% x 45% = 12 %
Production d’hydrogène: mécanismes et verrous biologiques
Un verrou : la sensibilité de l’hydrogénase à l’O2
Deux stratégies de recherche :
1. séparer dans le temps productions d’O2 et d’H2
2. rendre l’hydrogénase insensible à l’O2
4
Control
H2
3
O2

2 ν
hν

Concentration (µM)
1

0
DCMU
3

2
ν
hν

O2 1

0
0 2 4 6
Temps (min)
 Production d’H2 en réponse à une carence en soufre (Melis et al., 2000)

Carence en soufre

Phase 1 (0 to 40h)
Aérobiose

Chute du PSII
& accumulation d’amidon

0,16 Phase 2 (40 to 120h)

Hydrogène (mL.L-1 de culture)

Amidon
H2
60 25 Anaérobiose
Amidon (mg.mL-1)

0,12 50 20

Oxygène (%)
40
0,08 15
O2 30 Activation hydrogénase
10
0,04 20
10 5

0,00 0 0
0 24 48 72 96
Temps (H)
120 144 168
H+ H2
 S’affranchir de la carence et stimuler la voie indirecte de production d’H2
4
Control
H2
3
O2

2 ν
hν

Concentration (µM)
1
Contrôler le stockage
et le déstockage de
0
l’amidon
DCMU
3

2
ν
hν

0
0 2 4 6
Temps (min)
Contrôler l’activité du
Photosystème II
Identifier les voies
métaboliques et leurs
étapes limitantes
 Quelle enzyme est impliquée dans la réduction des PQs ?

A la différence des plantes supérieures, les

chloroplastes de Chlamydomonas ne possèdent
pas de complexe NAD(P)H
déshydrogénase (NDH-1) de type I

CO2
fixation

Starch

6 NDH-2 dans le génome de Chlamydomonas

 Nda2: une déshydrogénase chloroplastique de type II NAD(P)H
T M C S
100

75

50

37

Jans et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2008) Collaboration F. Franck & C. Remacle, Liège
Desplats et al. J. Biol. Chem. (2009)
 Développement d’approches génétiques

Mise en place de deux cribles

- Déstockage de l’amidon
- Régulation de la photosynthèse CO2
fixation

Starch

Thermal dissipation

Photochemistry

Fluorescence
 Crible de mutants basé sur la fluorescence de la chlorophylle

Constitution d’une banque Croissance photoautotrophe sur

de mutants d’insertion milieu sélectif (paromomycine)
(15,000 mutants)
AphVIII

F/Fo

Modulated Actinic Modulated

Enregistrement des transitoires de light light light
Time
fluorescence de la chlorophylle sur des (s)
colonies isolées
 Crible de mutants basé sur la fluorescence de la chlorophylle

0.20 WT

chlorophyll fluorescence (r.u.)

0.15

204D1
F/Fo

0.10

0.05

Modulated Actinic Modulated

light light light 0.00
Time
(s) 0 60 120 180 240 300 360

time (s)

I High steady state 2 mutants

Fluorescence 7A2, 9H4
II High Fo 3 mutants
94E4, 113A3, 220B2
III Fluorescence induction 3 mutants
(Kausky effect)(+/-) 204D1,216A3,125D1
IV Dark reduction of PQ (+/-) 7 mutants
216E1,79H5, 119B1, 220C2,
133G6, 74G3, 228F1
Isolement d’un mutant affecté dans le gène PGRL1
DalCorso et al. (2008) Cell 132: 273-285

b APHVIII

+842

PGRL1 exon 1 2 3 Chr 7

c rl1 d rl1 e WT 1
pgrL1 WTT pgrL1 ppgrL1
grl
T T
WT
W pg W pg W

Pgrl1

Actin1
APHVIII
Southern PGRL1
Immuno-détection
AphVIII RT-PCR

- Insertion unique de la cassette de résistance à la paromomycine

- Co-ségrégation parfaite entre phénotype et résistance à la
paromomycine
 Activité réduite du transfert cyclique des électrons chez pgrL1

100
a
80
WT
60
pgrL1
ETR

40

20

0
0 200 400 600 800 1000

Light intensity (µE.m-2.s-1)

WT pgrL1
Transfert cyclique/ aérobiose (s-1) 31.4 +/- 1.85 18.8 +/- 1.33
Transfert cyclique/ anaérobiose (s-1) 46 +/- 3.61 22 +/- 2.05

Tolleter et al. (2010) à soumettre

pgrL1 est affecté dans le transfert cyclique d’électrons

Photosynthetic
Starch CO2
fixation
CO2
x Rubisco
ATP
H2 2 H+
y
H2ase
NAD(P)H H+ ADP + Pi
NAD(P)H
PGR5
Fd FNR
QA
Nda2 PGRL1

PQ(H2) Cyt b6
f
PS II PS I
Pc
2 H2O O2+ 4 H+ H+
2 H+
 Forte stimulation de la production d’ H2 chez pgrL1

initial speed total production

A B
0.16 1.0

cumulative H2 production (µmol/L/µg chloro)

H2 production (µmol/L/min/µg chlorophlyll)
0.8 a b 0.14

pgrL1 0.12
0.8

pgrL1
0.10

+FCCP 0.6
H (µmol.L .µg chlorophylle)

+ FCCP
0.6 control 0.08

0.4
0.06

0.04
-1 -1

0.4 WT 0.2
0.02

WT 0.00 0.0
WT PGRL1 WT PGRL1
WT pgrL1 WT pgrL1
0.2
2

0.0

Tolleter et al. (2010) à soumettre

0 5 10 5 10 15

time (min) time (min)

 Stimulation de la production d’H2 en carence en soufre

a c

2 / 10H 10-9 cells)

2500

pgrL1 pgrL1 200

2000

µmol H2/109 cells

9 cells
150

2
1500

Voie directe H2 production (µmol.

µmol H
100
Voie indirecte
1000
WT
∗ WT 50
500 + DCMU
0 0
b d
80 80

70 70

starch (µg/106 cells/mL)

Starch (µg / 106 cells/mL)

60 60
starch (µg 10-6 cells)

50 50

40
WT 40

30 WT 30

20 20

10
pgrL1 10
pgrL1
0 0
0 2 5 5 0 7 5 1 0 01 2 51 5 01 7 5 0 25 50 75 100125150

t im e ( h ) t im e ( h )

Tolleter et al. (2010) à soumettre

 En anaérobiose le gradient de protons limite le flux d’électrons

Photosynthetic
Starch CO2
fixation
CO2
x Rubisco
ATP
H2 2 H+
y
H2ase
NAD(P)H H+ ADP + Pi
NAD(P)H
PGR5
Fd FNR
QA
Nda2 PGRL1

PQ(H2) Cyt b6
f
PS II PS I
Pc
2 H2O O2+ 4 H+ H+
2 H+

Chez le WT le flux d’électrons est limité par le gradient de protons

Chez pgrL1 le flux d’électrons est dirigé vers l’hydrogénase
Criblage d’une banque d’insertion
Chochois et al. (2010) Int J Hydrogen Energy

Transformation de C. reinhardtii par plasmide portant la cassette

AphVIII, qui confère la résistance à la paromomycine

Sélection et repiquage de 15,000 transformants

Transfert sur filtre et criblage

 Principe du crible

Mutants
recherchés
µg amidon / Cellule
Milieu Carencé +
Lumière

WT Milieu Minimal non carencé +

Obscurité

Temps (h)
120h 48h

WT
 Vers un contrôle génétique de la production d’H2

Caractérisation des voies d’entré s

d’électrons dans la chaîne
Fixation de CO2 photosynthétique
Amidon CO2 Jans et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Mise en évidence d’une Desplats et al. (2009) J. Biol. Chem.
kinase contrôlant la x Rubisco Brevet international (2005)
dégradation de l’amidon H2 2 H+
y NAD(P)H ATP
H2ase
ADP + Pi
NAD(P)H
Rôle de l’amidon dans la Fd FNR
PGR5? PGRL1
production d’H2 QA
Nda2
Dauvillée et al. (2006) Plant J.
Chochois et al. (2009) Plant Physiol. PQ(H2) Cyt b6
f
PS II PS I
Pc
2 H2O O2+ 4 H+ H+
2 H+

Rôle du gradient de protons

Régulation de l’activité du PSII via et la production d’H2
des interrupteurs génétiques

Surzycki et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

Production d’hydrogène: mécanismes et verrous biologiques
Un verrou : la sensibilité de l’hydrogénase à l’O2
Deux stratégies de recherche :
1. séparer dans le temps productions d’O2 et d’H2
2. rendre l’hydrogénase insensible à l’O2
4
Control
H2
3
O2

2 ν
hν

Concentration (µM)
1

0
DCMU
3

2
ν
hν

O2 1

0
0 2 4 6
Temps (min)
Mécanismes de résistance à l’O2 des hydrogénases à NiFe

Site actif H+ e-
à Fe ou
NiFe
H+
e- e- e- e-
Centres
Fe-S

O2
H2 O2 Canaux
hydrophobes
H2
d’accès aux gaz

Baffert et al. (2008) Angewandte Chemie Int. Ed.

Leroux et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Dementin et al. (2009) JACS
Brevet 2007
 Réduction de la sensibilité à l’O2 d’hydrogénases

H+
e-

Clusters
Site Actif Fe-S
à Fe ou NiFe

O2
H2
O2 H2
Collaboration M. Rousset CNRS Marseille
ANR HYLIOX, DIVHYDO, EngineeringH2Cyano
 Réduction de la sensibilité à l’O2 d’une hydrogénase à NiFe

V74 M74

Activité catalytique
Tolérante à l’O2
inactivée par l’O2

L122 M122
120
O2 10 µM
H/D exchange rate (relative)

100 WT
MM
80 M Canal hydrophobe
60

40
Restriction du canal hydrophobe limitant
20
l’accès de l’O2 au site actif
0
0 2 4 6 8 10 12 Introduction d’un résidu soufré facilitant la
Time (min)
réactivation de l’enzyme
Brevet 2007
Leroux et al. PNAS 2008
Dementin et al. JACS 2009
 Crible haut-débit d’H2ases issues de la biodiversité bactérienne
Chémochromie Echanges H2

8.0e-10

6.0e-10 H2
HD
4.0e-10 D2
O2
2.0e-10

current
2.0e-11

1.0e-11

0.0
0 500 1000 1500 2000 2500

time

Purification et séquençage Spectrométrie de masse

TCAGTCACGTATTCTCCTCACCATCAGGTAGATGGCGCTCTCCTGAT
GAATATCGTGCAGCATGCTGAGCAGGGTTTTGCTCCACGCCTGCTG
CTCGGGGGATTGCACAGCAAGTGCCGCATCAAACGCGTTTGCAAGC
ATCGCGATATGGTTACTGTCGATAACGATTTCGCCGTACTTCGGCAC
ACCTTCCATCTTGCGCCGCGCGGTGCTCCCCGACTCCAGCGTGCC Caractérisation
GATCCACGCCAGGTATTCTTGCCACGGGCAACTTAACGC …
cinétique de
l’interaction avec l’O2

Cristallographie

Détermination de la
structure 3D
 Des microalgues pour la production de biocarburants ?

N, P, S,… Protéines

Amidon
amidon
CO2
Lipides
lipides
H2

hydrogène
Hydrogène
H2O

O2

Une souche de C. reinhardtii accumule

jusqu’à 50% de lipides

• Production d’hydrogène
• Production de lipides et de biodiesel
 Contenu énergétique des formes de Carbone organique

Contenu énergétique (kCal/gm)

Glucose
Hydrates de (CHOH)n
Carbone

Réduction du carbone
Protéines

Triacylglycérols

Acide oléique
0 2 4 6 8 10 CH3(CH2)nCOOH
kCal/gm

Les huiles produites par les microalgues représentent la forme la plus

réduite de carbone disponible en quantité dans la nature
 Potentiel pour la production de biodiesel et verrous

Neocholoris oleoabundans Chlamydomonas reinhardtii

Certaines microalgues accumulent jusqu’à 60% de leur

poids sec en lipides

Microalgues Plantes C4 Plantes C3

Productivité maximale (T.ha-1.an-1) 150-180 60 30
Rendement photosynthétique ~6 - 7.5 % ~2.5 % ~1.25 %
Productivité observée (T.ha-1.an-1)
Photobioréacteurs 50-70
10-30 10-15
Champ
Productivité en lipides potentielle Verrous
75-90
(T. ha-1.an-1) Biologigues
Productivité en lipides observée
15-20 3 1.5
(T. ha-1.an-1)
Verrous
Coûts de production ($.kg-1) 0.4 - 40 0.04 0.04 Technologiques
 Domestiquer les microalgues pour nos besoins en énergie

Téosinte 7,000 à 10,000 ans Maïs

Huile Génomique, génétique

Amidon
Biotechnologie
 Structure des corps lipidiques de plantes

Oléosines

Phospholipides
(PC, PE)
(1-2%)
1 µm
TAGs (98%)
Sunflower cotyledon oil bodies under TEM
(PhD Thesis, Fred Beisson)

Quelle structure pour les

corps lipidiques de
microalgues ?
Quelles protéines ?

Gouttelettes lipidiques de microalgues

Analyse protéomique des gouttelettes lipidiques

ose
se
2M ucro

ucr
es
tal

es
s
s to

de

td
6M

ien
ne

Gr e
ien

xan
t éi

ad
Cl
ée
ad
Pro

Na

He
Ur
Gr
28 kDa protein

238 protéines identifiées

Acyl lipid metabolism

Lipases/hydrolases
Sterol synthesis
Lipid trafficking
Photosystems
RasGTPase
Others
 Voie de biosynthèse des TAGs identifiées par protéomique

Fixed Carbon ‘Prokaryotic’

pathway:
De novo FA
phospholipid and
synthesis Désaturation des
galactolipid
Acetyl-CoA
acides gras: FAD2 (1)
ACCase
Malonyl-CoA
ACP, MCT FAS Acyl-ACP
Malonyl-ACP PLAM Biosynthèse des
KASI, II, III FAT
Traffic RE- stérols/ergostérols : 4
FFA
chloroplastes protéines identifiées
LACS (39) TGD1(1), TGD2 (1),
TGD3 (9), ALA1 (23)
Acyl-CoA

Betaine lipid
G3P LPA PA DAG synthase (126)
GPAT (9) LPAAT (3)
Lipase (24) DGTS
Hydrolases (9) Lipase (24)
PE LPE
Protéine TAG LPEAT (33)
structurale
de 28 kDa ?
Elucider les mécanismes d’accumulation des TAG

Approche gène candidat : validation de gènes candidats identifiés par

protéomique (protéine de structure candidate, voies de
biosynthèse…)
Knock-down (miRNA)
Activité enzymatique
Sur-expression et/ou expression inductible (gènes régulateurs)

Approche génétique : criblage de mutants affectés dans le contenu en

TAG
Mutants n’accumulant pas ou peu de TAG
Mutants accumulant des TAGs en l’absence de carence
Mutants présentant des profils d’acides gras modifiés (désaturases)
Criblage haut-débit de souches par cytométrie en flux

G
Spectre d’émission (exc. 480nm) :

red
TA
Lipides neutres (580nm)

le
de

Ni
n

re
tio

ho
la

op
mu

or
cu

Flu
Ac

Fluorescence chlorophylle
Fluorescence chlorophylle

Fluorescence Nile red Fluorescence Nile red

Souche non-accumulatrice Souche accumulatrice

 Emergence d’une approche intégrée: Biologie des systèmes
ANR ALGOMICS

Métabolome
Transcriptome Protéome
Banque de mutants de microalgues
pour criblage

Obtention de mutants
-conversion photosynthétique
-stockage de l’énergie (lipides, hydrates de
carbone)

Caractérisation par des approches combinées

-physiologie, transcriptomique, protéomique,
métabolomique Cultures en chémostats
-modélisation

Identification des points de contrôle métaboliques

Stratégies d’optimisation (sur-expression,

inactivation de gènes, nouvelle mutagénèse dirigée,…)

Modélisation de réseau métabolique

 Mécanismes et verrous biologiques

N, P, S,…

Voies de biosynthèse et
dynamique des réserves
(amidon, lipides)
Perception et signalisation
de la carence minérale
(N, P, S,…)

Oil bodies (RE)

CO2 Grains d’amidon

Optimisation de la Mécanismes de protection

photosynthèse pour le contre les stress abiotiques
stockage (stress oxydant)

Résistance des H2ases à l’O2

H2O
Thylacoïdes
O2
 Des verrous biologiques et technologiques

Sélection et Systèmes de culture Récolte Extraction

Salinalgue
optimisation de composés
souches d’intérêt
- Centrifugation
- Optimisation de - CO2
la productivité de - Filtration supercritique
composés d’intérêt tangentielle
- Solvants
- Adaptation aux - Floculation
- Techniques
contraintes des
- Décantation séparatives
systèmes de
culture
Valorisation
énergétique
biomasse
résiduelle
- Méthanisation

- Production
Fermentalg
éthanol ou H2

R&D Biotechnologique Technologique

 Des marchés existants aux biocarburants : les verrous

Sélection et 104 Biohydrogène

performances
Biodiesel
Volume de marché (M€)

des souches
(autotrophie)
103

- Sensibilité des H2ases à l’O2

Biodiesel - Collecte/Stockage H2
102 (hétérotrophie) - Filière aval (PAC, etc)

Produits
HVA : - Performances souches
10 EPA/DHA - Performances, coûts des
pigments, photobioréacteurs
protéines,… - Gestion flux (lumière, T°,
…)

Effort de recherche ( M€ x h. ans)

 Laboratoire de Bioénergétique et Biotechnologie des Bactéries et
Microalgues (LB3M)

Chercheurs & ingénieurs Techniciens

BEISSON Frédéric ADRIANO Jean-Marc
BILLON Emmanuelle AUROY Pascaline
CARRIER Patrick BEYLY Audrey Collaborations
COURNAC Laurent CARDETTINI Véronique Steven BALL, Université de Lille
CUINE Stéphan Post-docs Fabrice FRANCK, Université de Liège
GUEDENEY Geneviève TOLLETER Dimitri Jean-David ROCHAIX, Université Genève
LI Yonghua SCHULZ-RAFFELT Miriam Marc ROUSSET CNRS, Marseille
MIRABELLA Boris
Thèses
PELTIER Gilles
CANO Mélissa
PUPPO Rémy
CHOCHOIS Vincent
RICHAUD Pierre
NGUYEN Thi Hoa Mai
SAHUT Claire
VERDIER Gaëtan

DIVHYDO (2006-2009) FP7 SOLAR-H2 HELIOBIOTEC CPER (2007-2013)

SHAMASH(2006-2009) FP6 SOLAR-H
HYLIOX (2008-2011)
ALGOMICS (2009-2012)
 HélioBiotec
PLATE-FORME DE RECHERCHE PARTENARIALE
BIOTECHNOLOGIES ET BIOENERGIES
CPER 2007-2013

- parc de photo-bioréacteurs instrumentés,

- plateau technique de spectrométrie de masse (analyse des gaz et traçage
isotopique),
- ensemble de techniques séparatives : GC-MS, HP-TLC, UPLC-MS-MS
(lipidomique),
- méthodes biophysiques (fluorescence, changements d’absorption) pour la
caractérisation de souches et le criblage haut débit,
- cytomètre en flux, lecteurs de microplaques pour le criblage haut débit,
- chambres climatiques en conditions contrôlées pour la culture de microalgues,
- plus de 500 souches cryo-conservées,
- robot de cristallisation, qPCR,…
 Propriétés des huiles et composition en acides gras

Mol%
40,0

30,0
Huile = triglycérides (TAGs)
20,0

glycérol
10,0

0,0

)
, 7 1 3)

, 9 1 5)
18 (9, 12)
16 (7, 0)

18 (5, 9 )
16 :0

0
16 :2(7 )

)
16 7)
16 9)

18 (9)
13

15
:3 12
t

18 (11
:
16 (3
,1
16

18
(

(
:1

:1

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0,

2,
,

,
,
18 (9,
:1

:4 10

:4 12
:1
18
,1

,1
:2
(4

(5
:3

:3
Application biodiesel :
peu d’insaturations (résistance à l’oxydation)

3 acides gras