HÔPITAL STE JOSEPHINE BAKHITA

13 B.P. 119 Agoé-Kové Route de Mission

Tové
Tel : 00228-70-47-06-62 Page : 1 / 6
PROCEDURE DE COLORATION DE Codification : PCGEFM
Date d’application. : JUIN 2022
GOUTTE EPAISSE ET FROTIS MINCE Version : 01

Création du document : JUIN 2022

Nom Fonction Date et Signature

Auteur(s)
BELEI Maguiliwè Anani TSL/ RSB

Vérificateur(s) ADAMA Ekoué Aziangnon TSL/RQ

Personne
validant le FOLLY Yao Anani TSL/RL
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Type de
Distribution à l’interne
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Réviser avant le : Mai 2024

Date du retrait : Juin 2024

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Date d’application. : JUIN 2022
GOUTTE EPAISSE ET FROTIS MINCE Version : 01

Table des matières

1- Objectifs et portée.......................................................................................................................3
2- Abréviations et définitions..........................................................................................................3
3- Champs d’action, Attribution des responsabilités.......................................................................3
4- Principe......................................................................................................................................3
5- Sécurité et environnement..........................................................................................................3
6- Échantillon :...............................................................................................................................4
7- Équipements et matériel.............................................................................................................4
8- Contrôle de la qualité..................................................................................................................4
9- Mode opératoire.........................................................................................................................4
10- Interférences...........................................................................................................................5
11- Références..............................................................................................................................5

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1- Objectifs et portée
Cette procédure vise à décrire les différentes étapes pour colorer les étalements sanguins à
partir du sang périphérique, recueilli par piqure du doigt ou par ponction veineuse, afin qu’ils
soient colorés, puis examiné au microscope pour détecter, identifier et quantifier les parasites
du paludisme.

2- Abréviations et définitions
CIQ : Contrôle Interne de Qualité
SL : Surveillant du laboratoire
RQ : Responsable Qualité
TSL : Technicien Supérieur de Laboratoire
RL : Responsable du Laboratoire
RSB : Responsable Bio - Sécurité
GE : Goutte Epaisse
FM : Frottis Mince
pH : potentiel d’Hydrogène

3- Champs d’action, Attribution des responsabilités

Champs d’action : Cette procédure est utilisée dans le diagnostic biologique du paludisme au
laboratoire d’analyse biologique afin de permettre une meilleure prise en charge du patient par
le clinicien.
Attribution des responsabilités : Les tâches à accomplir pour cette procédure sont indiqué
ci-dessous. Chacune d’elle doit être attribuer à une ou des personne(s) ayant été former pour
effectuer ces tâches en observant toute les indications de la procédure (préparation de l’eau
tamponnée, de la solution de travail ‘‘ le colorant ’’, coloration des étalements sanguin sur
lames.

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4- Principe
La coloration de la GE/FM utilise deux produits chimique le méthanol (pour fixer le frottis) et
le Giemsa (pour colorer le FM et la GE en mm temps).
Le méthanol permet de fixer tous les éléments figurés du sang sur le FM et le Giemsa colore
noyaux et cytoplasme des parasites et les éléments figurés du sang sur la FM.

5- Sécurité et environnement
- Utiliser les équipements de protection (Gant, blouse, lunettes)
- Rincer abondamment à l’eau en cas de contact avec la peau ou les yeux.
- Respect la procédure de tri et de gestion des déchets
Par mesure de sécurité, tous échantillon doit être traité comme potentiellement infectieux
6- Échantillon :
Etalement sanguin sur lame porte objet obtenu à partir de sang périphériques veineux ou capillaire

7- Équipements et matériel
Pour l’eau tamponnée
Fiole jaugée de 1l, bidon de 1l, eau distillée, comprimés pour préparer une solution tampon de pH 7.2
et pH – mètre.

Pour la solution de Giemsa

Papier filtre, solution mère de Giemsa, flacon gradué muni de bouchon de 100ml, seringue de 5 ou 10
ml, seringue de 60 ml, eau tamponnée de pH 7.2

Pour la solution Méthanol

Flacon gradué muni de bouchon de 30 ml, la Solution mère de Méthanol.

Pour la coloration des étalements sanguins

Grille de coloration pour lames porte objet, minuteur, pinces, pipette pasteur, portoir de séchage pour
lames.

8- Contrôle de la qualité
Utiliser le pH – mètre pour contrôler la variation du pH de l’eau tamponnée.

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Reprendre les étalements sanguins dans les cas suivants : Présence de poussière ou de saleté
sur les étalements, éléments perdu durant le processus de coloration ou de rinçage.

9- Mode opératoire
i. Préparation de l’eau tamponnée
L’eau tamponnée qui va servir à diluer la solution mère de Giemsa se prépare à partir des
comprimés que l’on retrouve dans le commerce et qui permette de préparer une solution de
pH 7,2. On procède comme suit pour diluer :
 Mesurer environ 900 ml d’eau distillée dans un fiole jaugée ou éprouvette graduée
 Ajouter un comprimé pour préparer une solution tampon de 7,2 et melangé zn
imprimant un mouvement de rotation
 Utiliser un pH mètre pour s’assurer que l’eau tamponnée à un pH acceptable (ph 7,2
±0,1)
 Compléter le volume de la solution de tampon jusqu’à 1l et conserver la solution à une
température comprise entre 2 et 8°C jusqu’à la prochaine utilisation

N.B  : Même conserver à une température de 2 et 8°C, la solution tampon peut être contaminé par des
algues ou des germes. Il faut donc vérifier la turbidité (qui indique la prolifération) de l’eau
tamponnée avant son utilisation pour colorer les étalements sanguins.

ii. Préparation de la solution de travail de Giemsa

La procédure ci-dessous décrit les étapes pour la solution de colorant à 10% qui doit être
utilisé avec la méthode de coloration dite ‘‘rapide’’ avec le colorant dilué à 10%

 A l’aide d’un entonnoir et du papier filtre, filtrer la solution mère de Giemsa dans un flacon
foncé ou opaque sec, conserver le flacon fermé avec son bouchon jusqu’ ce que le colorant
soit utilisé car l’humidité dégrade le colorant Giemsa.

Déterminer le volume de colorant dilué

Verser l’eau tamponnée (environ la moitiée du volume final) dans une éprouvette
graduée et ajouter le volume approprié de solution mère de colorant. Compléter le
d’eau tamponnée.
Remarque : S’assurer que les pipettes entrant en contact avec la solution mère de Giemsa
soient bien sèches car toute introduction d’humidité accélère la détérioration du colorant. Pour
que les dilutions soient précises, les volumes de la solution mère de colorant doivent être
mesurés avec des micropipettes, ou des pipettes sérologiques de 1-3 mL.

iii. Coloration des Lames

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Les lames sont colorées en recouvrant chaque lame séparément avec la solution de travail du
colorant. La durée de la coloration est généralement de 15-20 minutes, mais ce paramètre doit
être vérifié par des essais à chaque nouveau lot ou flacon de colorant. Remarque : Si l’on
colore plus de 10 lames en même temps, le minuteur devra être lancé après que la première
lame aura été recouverte de colorant. Après la coloration, il faut laver les lames avec l’eau
filtrée. Rincer chaque lame en la plongeant dans une cuve d’eau tamponnée jusqu’à ce que le
colorant soit éliminé. Laisser les lames sécher complètement, à l’abri de la poussière. Les
lames peuvent être lues dès qu’elles sont sèches ou bien conservées dans une boîte fermée
contenant un absorbeur d’humidité en grande quantité et placée dans un endroit sec et frais.

10- Interférences
Les éléments qui peuvent entraine une mauvaise coloration sont : L’hémoglobine, la
poussière, les moisissures, Solution mère de mauvaise qualité…
11- Références
- Guide Méthodologique de l’O.M.S. pour la détection, l’identification, et la quantification des
parasites de paludisme sur frottis sanguins ou gouttes épaisses colorée dans un environnement
de recherche.

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