Biofilms bactériens

par Thierry JOUENNE

Directeur de recherche au CNRS
FRE CNRS 3101 (Rouen)

1. Qu’est-ce qu’un biofilm ? ....................................................................... BIO 600 - 2

1.1 Où trouve-t-on les biofilms ?....................................................................... — 3
1.1.1 Dans le milieu naturel......................................................................... — 3
1.1.2 Dans le milieu industriel ..................................................................... — 3
1.1.3 Dans le monde médical ...................................................................... — 3
1.1.4 Biofilms à aspect positif ..................................................................... — 4
2. Comment se forme un biofilm ? .......................................................... — 5
2.1 Étapes 1 et 2 ................................................................................................. — 5
2.2 Étape 3 : adhésion irréversible.................................................................... — 5
2.3 Étape 4 : maturation..................................................................................... — 6
2.4 Étape 5 : détachement cellulaire ................................................................. — 6
3. Phénotype biofilm .................................................................................... — 6
3.1 Rôle de la gangue polymère ....................................................................... — 6
3.2 Émergence d’une physiologie « biofilm » ................................................. — 7
4. Moyens de lutte contre les biofilms ................................................... — 7
4.1 Moyens actuels ............................................................................................ — 7
4.2 Développement de surfaces antiadhésives ............................................... — 7
4.3 Élaboration de surfaces à revêtements antimicrobiens ........................... — 8
4.3.1 Incorporation d’espèces inorganiques et/ou chargées .................... — 8
4.3.2 Incorporation d’agents antimicrobiens ............................................. — 8
5. Conclusion .................................................................................................. — 8
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. BIO 600

a notion et la tradition des cultures en milieu liquide (aujourd’hui appelées

L planctoniques) ont constitué les fondements de la microbiologie pendant
plus de 60 ans.

Naissance de la microbiologie
C’est avec minutie qu’Anton van Leeuwenhoek (1632-1723), un horloger hol-
landais amateur de microscopie, s’attachait à décrire les « animalcules » qu’il
observait à l’aide de microscopes qu’il construisait lui-même. C’est avec l’un
de ces microscopes qu’il décrivit en 1863 les différentes morphologies bacté-
riennes connues à ce jour. C’est lui aussi qui observa pour la première fois, sur
des surfaces dentaires, ce que nous appelons aujourd’hui des biofilms.
5 - 2008

Longtemps, ces êtres microscopiques ont été supposés naître de la matière

non vivante grâce à une « force vitale ». Cette théorie de la génération spon-
tanée perdura jusqu’en 1861 lorsque Louis Pasteur (1822-1895) démontra que
les contaminations observées dans les bouillons nutritifs étaient dues à des
micro-organismes présents dans l’air ambiant. L’implication de ces micro-orga-
BIO 600

nismes dans les maladies, bien que supposée un siècle avant JC, ne fut
démontrée qu’en 1835 par Agostino Bassi (1773-1856) lorsqu’il découvrit que
la muscardine, maladie du ver à soie, était causée par un champignon qu’il
nomma Botrytis paradoxa (aujourd’hui Beauveria bassiana). Dès lors, on
oublia les miasmes et autres déséquilibres des quatre humeurs corporelles et
la microbiologie prit son envol.

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En 1876, le médecin allemand Robert Koch (1843-1910) publia ses travaux sur
Bacillus anthracis et développa les « postulats de Koch ». Le deuxième de ces
quatre postulats implique l’isolement du micro-organisme et la notion de culture
pure.
Mais ce sont les travaux de Claude E. Zobell (1904-1989) qui ont ouvert une
nouvelle ère dans le domaine de la microbiologie. Dès 1936, ce chercheur
(considéré comme le père de la microbiologie marine) démontra que les sur-
faces solides sont bénéfiques au développement des bactéries lors de leur
conservation dans un milieu nutritif dilué. En 1943, il montra que de très
faibles quantités de nutriments organiques s’adsorbent sur le verre et que
cette concentration de matière organique favorise la formation de « biofilms »
sur les surfaces [1].

Les biofilms
La mise en évidence de ces biofilms est longtemps restée anecdotique, en
partie parce que les méthodes d’observation n’étaient pas suffisamment per-
formantes. Il fallut attendre la microscopie électronique et les travaux de Jones
et col. [2] pour mettre en évidence que ces biofilms sont composés d’une très
grande variété d’organismes [2]. C’est sous l’impulsion de W.G. Characklis
(décédé en 1992) puis de J.W. Costerton (actuellement directeur du Centre sur
les biofilms à la Faculté dentaire de Californie du Sud) que l’étude des biofilms
a pris véritablement son essor. Dès 1973, Characklis mit en évidence que des
slimes microbiens provenant de circuits d’eaux industrielles étaient hautement
résistants aux désinfectants et, en particulier, au chlore [3]. En 1978, Costerton
et col. proposèrent les premières hypothèses sur les mécanismes impliqués
dans l’adhésion des micro-organismes [4]. Depuis, un nombre croissant
d’études ont été consacrées aux biofilms, aussi bien dans le domaine industriel
et environnement que dans le domaine médical, comme le montre la figure 1.

1400
Nombre de publications

1200

1000

800

600

400

200

0
1990 1995 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Année

Figure 1 – Évolution du nombre de publications par an dans lesquelles le mot « biofilm »

apparaît dans le titre, le résumé ou en mot clef (source PuMed, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

1. Qu’est-ce qu’un biofilm ?
Étymologiquement, le mot vient du grec « bios », la vie, et de
l’anglais « film » qui signifie pellicule. Un biofilm est donc, étymo-
logiquement parlant, « une pellicule de vie ». Dans la littérature
scientifique, on trouve de nombreuses définitions, plus ou moins
semblables. Le plus souvent, on définit un biofilm bactérien comme
un ensemble de microcolonies bactériennes engluées dans leurs
propres exopolymères (EPS pour ExtraPolymeric Substances ) et
adhérant à une surface inerte ou vivante. Ces EPS renferment majo-
ritairement des polysaccharides complexes macromoléculaires et,
en moindre mesure, des protéines, d’autres hydrates de carbone
comme par exemple l’acide uronique, ainsi que de petites quantités
de lipides et d’acides nucléiques [5]. L’unité structurale du biofilm
est la microcolonie (petit amas de cellules bactériennes
identiques) [6]. La composante bactérienne représente 10 à 25 % du
biofilm, les 75 à 90 % restants étant principalement composés par
la gangue polymère. Les bactéries au sein de la microcolonie sont
caractérisées par l’absence de mouvements browniens. Un biofilm

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peut être constitué d’une seule espèce bactérienne mais, le plus

souvent, plusieurs voire un grand nombre d’espèces coexistent au
sein de la structure. Le biofilm est parcouru par une multitude de
pores et canaux aqueux qui constituent un système circulatoire pri-
maire, assurant ainsi l’acheminement des nutriments jusqu’aux
bactéries et l’évacuation des produits de dégradation. Au sein des
biofilms, des gradients très marqués apparaissent. Ces gradients
d’oxygène, de substrats, de pH ou autre, conduisent au développe-
ment et à la juxtaposition de communautés bactériennes clairement
délimitées et différentes sur le plan physiologique, induisant des
processus biologiques et physico-chimiques multiples et une
complexité structurelle. Outre les bactéries, les champignons (Can-
dida albicans, par exemple), les microalgues et certains protozoai-
res sont capables de former des biofilms.

1.1 Où trouve-t-on les biofilms ?
Dans son article publié en 1943, Zobell mit en évidence qu’il y
avait plus de bactéries vivantes sur les surfaces d’un récipient que
dans le liquide qu’il contient [1]). Les microbiologistes admettent
aujourd’hui que la quasi-totalité des micro-organismes présents
dans leur environnement naturel (c’est-à-dire en dehors du labora-
toire), le sont sous la forme de biofilms, l’état planctonique n’étant
que transitoire, pour passer d’un biofilm à un autre.
1.1.1 Dans le milieu naturel
■ La formation de biofilms sur les plaques internes des échan-
geurs de chaleur industriels peut diminuer de 20 à 30 % leur capa-
cité de transfert thermique.
■ L’industrie navale doit aussi continuellement lutter contre la
formation de biosalissures sur les coques des navires et les struc-
tures portuaires, et contre la corrosion qui leur est associée, par
des revêtements antifouling (contre l’encrassement), toxiques,
souvent responsables de graves pollutions. Le Biocorys interré-
gional (programme de collaboration scientifique regroupant des
chercheurs et des ingénieurs d’universités et de centres techniques
de Normandie, Picardie et Île-de-France) a évalué le coût annuel
des conséquences de la biocorrosion entre 5 et 10 % de l’ensemble
des dégâts causés par la corrosion en général, lequel est chiffré
dans les pays industrialisés à 3-4 % du PIB, soit 27 milliards
d’euros pour la France (http://www.biocorys.utc.fr).
■ Dans le cas des aciers inoxydables en eaux naturelles, les méca-
nismes d’initiation de la corrosion induite par les bactéries et les
biofilms sont extrêmement complexes. La composition chimique
de la couche passive, la nature chimique du milieu, l’hétérogénéité
du biofilm, influent en effet sur l’initiation de la piqûre. Trois carac-
téristiques du biofilm jouent sur le comportement du matériau
selon les conditions d’aération [7] :
– en eaux aérées, ce sont les propriétés de catalyse des enzymes
présentes dans le biofilm qui conduisent à une augmentation des
vitesses de réactions cataboliques, donc du potentiel corrosif [8] ;
– en milieux anaérobies, les sulfures produits par les bactéries
sulfatoréductrices diminuent la stabilité de la couche passive et sa
reconstitution ;
– en milieu faiblement oxygéné et dans les biofilms âgés (matu-
res) où coexistent des zones aérobies et anaérobies, c’est le carac-
tère hétérogène du biofilm qui conduit à des corrosions
spectaculaires [9], la zone aérobie provoquant une augmentation
du potentiel de corrosion alors que le potentiel de rupture de la
couche passive est diminué dans les zones anaérobies où survi-
vent les bactéries sulfatoréductrices. La maîtrise du développe-
ment et des propriétés des biofilms est donc une des clefs de la
maîtrise des phénomènes de biocorrosion.
1.1.2 Dans le milieu industriel
■ Dans l’industrie agroalimentaire (IAA), on retrouve les biofilms
dans tous les secteurs (laiteries, brasseries, meuneries, sucreries,
Figure 2 – Biofilm de Legionella pneumophila formé sur de l’acier
inoxydable (photographie prise au microscope électronique à balayage
(UMR CNRS 6143, UMR CNRS 6522, Rouen))
malteries, salaisonneries...) et à tous les niveaux de la chaîne de
production. Toute installation industrielle fabriquant des produits à
humidité intermédiaire ou élevée est exposée à la formation de
biofilms. Tout équipement non stérilisé abrite des micro-orga-
nismes qui peuvent amorcer un processus de colonisation entre
deux procédures de nettoyage-désinfection, et ce en quelques
heures. Les contaminations d’aliments résultant de la présence de
biofilms en IAA ont un impact socioéconomique important. En
effet, chaque année, des toxi-infections alimentaires collectives
(TIAC) sont à l’origine de décès ou de maladies qu’il faut traiter
(frais d’hospitalisation, traitements médicaux).
■ Les industries de production et distribution d’eau potable sont
aussi particulièrement sensibilisées à ces problèmes, la formation
de biofilms sur les parois des canalisations pouvant être à l’origine
d’une détérioration de la qualité organoleptique et microbiolo-
gique de l’eau. La prolifération de biofilms à Legionella pneumo-
phila sur les tuyauteries des tours aéroréfrigérantes (figure 2),
employées pour la climatisation ou des réseaux de distribution
d’eau chaude constitue un risque sanitaire évident comme l’a
montré l’épidémie qui a sévi dans le nord de la France entre
novembre 2003 et janvier 2004.
1.1.3 Dans le monde médical
■ La plaque dentaire est un exemple bien connu de biofilm dans le
milieu médical. Elle est définie comme une gangue hétérogène
adhérant à la surface des dents ou logée dans l’espace gingivo-den-
taire. Elle est composée d’une communauté microbienne riche en
bactéries aérobies et anaérobies, enrobée d’une matrice intercellu-
laire d’origine microbienne et salivaire. Sa masse varie, selon
l’hygiène dentaire, de 5 à 200 mg. Elle contient de 108 à 109 unités
formant colonie (UFC)/mg et est composée de plus de 500 espèces
dont 300 ont été identifiées à ce jour. La plaque dentaire est un
exemple de collaboration métabolique entre espèces. Ainsi, des
bactéries anaérobies prospèrent lorsqu’elles sont physiquement
très proches d’organismes aérobies qui appauvrissent l’environne-
ment en oxygène.
■ Les biofilms ont pris une importance toute particulière en méde-
cine lorsqu’il a été montré qu’ils étaient impliqués dans 60 % des
infections nosocomiales et dans toutes les infections prothé-
tiques [10]. Des biofilms ont ainsi pu être observés sur des panse-
ments et des matériels de suture, dans des tubes de drainage, des
seringues, des cathéters, des pacemakers, des prothèses, dans les
solutions de stockage des lentilles de contact ou sur les verres de
contact, dans les systèmes de distributions d’eau et aussi sur les
murs (tableau 1). Il a été montré que 75 % des dispositifs
intra-utérins (DIU) retirés chez des patientes souffrant d’infections
du tractus génital supérieur sont recouverts d’un biofilm [11].
L’infection sévère à biofilm est souvent consécutive à un premier

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Tableau 1 – Liste partielle des infections

de matériel médical dues aux biofilms
Matériel médical Espèces bactériennes associées
Cathéters veineux
Staphylococcus epidermidis
centraux
Pacemakers Staphylococcus aureus
Prothèses
S. epidermidis, S. aureus
orthopédiques
Nombreuses bactéries
Sondes d’intubation
et champignons
Escherichia coli
Sondes urinaires
et autres Gram négatifs
Stérilets E. coli Figure 3 – Biofilm de Pseudomonas oryzihabitans formé
sur une particule d’argile (photographie prise au microscope
Sutures S. aureus et epidermidis électronique à balayage [UMR CNRS 6143, UMR CNRS 6522, Rouen])
Valves aortiques S. aureus
Pseudomonas aeruginosa, tairement l’espace interstitiel sous la surface du lit. En tant que
Verres de contact
S. epidermidis producteurs de biomasse et décomposeurs, ils constituent un
maillon vital de la chaîne alimentaire [12]. Des biofilms ont été
retrouvés dans des failles océaniques à 3 500 m de profondeur et à
Tableau 2 – Liste partielle des maladies – 0,7 oC [13] [14].
infectieuses associées à un biofilm Ils sont également un élément important de la flore des rhizos-
phères (régions du sol directement formées et influencées par les
Maladies infectieuses racines), les micro-organismes se développant à la surface des
à biofilms Espèces bactériennes associées particules minérales (figure 3) ou/et des racines.
(pathologies associées)
Enfin, la flore microbienne intestinale colonise le tractus intesti-
Bronchites chroniques Pseudomonas aeruginosa, nal sous la forme de biofilm et joue un rôle fondamental dans la
(mucoviscidose) P. cepacia, S. aureus santé humaine.
Caries dentaires Streptococcus
■ La production biotechnologigue par des cellules fixées et organi-
Proteus mirabilis, E. coli, sées en biofilms présente plusieurs avantages, notamment de pou-
Cystites, pyélonéphrites
P. aeruginosa, Enterococcus faecalis voir produire de grands volumes sur un long terme et d’éviter la
Endocardites Streptococci perte de temps induite par les redémarrages de production. Ainsi,
dès 1823, le procédé de fermentation dit allemand ou de Schuet-
Kératites P. aeruginosa
zenbach utilisa des copeaux de hêtre pour adsorber des micro-orga-
Mélioïdose Pseudomonas pseudomallei nismes (Acetobacter aceti ) et produire du vinaigre. Pasteur, quant
Péritonites E. coli, Bacteroides fragilis à lui, développa le premier système à cellules immobilisées, dans
le procédé « Pasteur » ou « Orléans » pour la production de vinaigre.
Prostatites E. coli, Staphylococci, Enterococci
Aujourd’hui, les bioréacteurs à cellules immobilisées sont légion et
leur utilisation très répandue. L’immobilisation des bactéries est réa-
lisée par rétention sur membrane, par attachement à des surfaces,
épisode infectieux et survient souvent chez des patients présentant par inclusion dans des matrices poreuses ou par encapsulation.
un « terrain » favorable (immunodéprimés, personnes âgées...).
L’instauration d’un biofilm (le plus souvent à P. aeruginosa) dans • La technologie des réacteurs à membrane consiste à coupler
les poumons des patients atteints de mucoviscidose est la pre- un fermenteur à une unité d’ultrafiltration ou de microfiltration.
mière cause de mortalité chez ces malades. Le tableau 2 regroupe Les cellules sont retenues dans le système de fermentation qui
les pathologies infectieuses susceptibles de favoriser une infection permet la diffusion des composés solubles de petite taille, selon la
sévère à biofilm. porosité de la membrane choisie. Le renouvellement continu du
milieu de culture permet de diminuer l’inhibition par les produits
du métabolisme bactérien. Dans ces systèmes, les densités cellu-
1.1.4 Biofilms à aspect positif laires obtenues sont 10 fois plus élevées qu’en fermentation classi-
que. Cependant, l’activité métabolique est inhibée lorsque la
À côté de ces effets nocifs, voire dangereux, les biofilms peu- biomasse devient très importante et la stabilité à long terme du
vent aussi avoir des aspects très utiles. procédé est limitée par l’encrassement des membranes.
■ Dans l’environnement, les biofilms sont principalement pluri- • L’immobilisation cellulaire par adsorption sur un support
espèces. On les retrouve sur tous les matériaux immergés dans les solide est basée sur l’affinité des bactéries pour les surfaces.
ruisseaux, les lacs et autres milieux aquatiques, où ils participent à L’adsorption est obtenue par la mise en contact du support et des
l’écosystème. Parmi les bactéries constituant le biofilm, bon nom- cellules pendant une période définie dans le bioréacteur. Dans ces
bre sont non cultivables. La métagénomique (synonyme de géno- systèmes, les difficultés liées à la diffusion de substrats et aux
mique environnementale), qui a pour objectif d’identifier les produits d’inhibition sont moindres. Le problème majeur réside
micro-organismes à ce jour non cultivables, est une approche nou- dans le détachement de tout ou partie du biofilm, ce qui aboutit à
velle et puissante pour analyser les génomes de ces micro-orga- des densités bactériennes plus faibles que celles obtenues dans les
nismes. Pour cela, la population microbienne est extraite, son ADN réacteurs à membranes.
est purifié et séquencé par les méthodes à haut débit. • Le procédé d’immobilisation le plus répandu consiste à inclure
Dans les cours d’eau les biofilms autotrophes, principalement un inoculum bactérien dans une matrice polymère (κ-carraghénane,
composés d’algues se développent sur le fond du lit tandis que les gomme de gellane, agarose, gélatine, alginate ou chitosane). Ces
biofilms hétérotrophes, à dominante bactérienne, occupent majori- polymères naturels sont facilement disponibles et largement acceptés

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comme additifs alimentaires dans l’industrie. Afin de réduire les pro-
blèmes liés aux limitations de transport de masse, les billes de gel
sont en général préférées aux films pour leur géométrie sphérique
augmentant la surface spécifique. Les applications de ce procédé avec
les bactéries lactiques font appel, en général, aux gels de
κ-carraghénane [15]. Utilisé seul, le κ-carraghénane produit un gel fra-
gile incapable de résister aux contraintes physiques liées à la crois-
sance bactérienne et aux forces de cisaillement. Un effet synergique
est observé avec la gomme de caroube [16]. L’addition d’ions K+
donne aussi des propriétés plus élastiques aux gels qui sont rhéolo-
giquement plus stables, du fait d’une interaction spécifique entre le
κ-carraghénane et les chaînes de galactomananes de la gomme de
caroube [17]. Une région à forte densité bactérienne est formée à la
périphérie des billes où les conditions de croissance sont plus favo-
rables. L’épaisseur et la concentration cellulaire de cette couche
dépendent de l’espèce bactérienne et des vitesses de diffusion dans
la couche cellulaire, ainsi que d’autres paramètres de fermentation
tels que le pH, la concentration en substrats, en produits, et la
température.
■ La promiscuité des cellules assure un métabolisme symbiotique
entre espèces [18] ; ainsi, certains biofilms mixtes dégradent les
polychlorobenzoates. Les biofilms sont donc utilisés par l’homme
pour assurer la protection de l’environnement. En effet, pour satis-
faire aux normes sur la qualité de l’eau, il est fait appel de plus en
plus à la filtration biologique afin d’éliminer la pollution carbonée,
azotée et phosphorée des eaux usées. D’autres applications
peuvent également être envisagées dans les prochaines années,
telles que le traitement des métaux lourds dans les effluents. Il a
été démontré que des biofilms plurimicrobiens sont capables
d’extraire les métaux lourds des rivières à des taux 17 fois plus
élevés que des co-cultures planctoniques [19].
■ Enfin, l’un des aspects les plus prometteurs de l’utilisation des
biofilms est l’application d’une flore positive ou neutre sur des sur-
faces, notamment en IAA, pour prévenir ou limiter leur colonisation
par des flores pathogènes ou d’altérations, ce qui minimiserait les
risques de (re)contamination des produits alimentaires. À ce stade,
la recherche et la demande du marché s’orientent plus vers la décou-
verte de nouveaux procédés ou molécules permettant une meilleure
implantation et sélection de ces biofilms positifs, tout en limitant
l’implantation de flores pathogènes ou d’altérations des aliments.
2. Comment se forme
un biofilm ?
La formation d’un biofilm se déroule en cinq grandes
étapes [20], représentées sur la figure 4 :
– étapes 1-2 : des bactéries planctoniques isolées évoluant libre-
ment dans un milieu liquide se fixent sur une surface (adhésion
réversible) et s’organisent en amas ;
– étape 3 : les bactéries s’ancrent de façon irréversible sur la sur-
face via des appendices cellulaires et les exopolymères ;
– étape 4 : le biofilm arrive à maturation, il est traversé par des
courants de liquides (nutriments, molécules signal...) ;
– étape 5 : en fin de maturation, un certain nombre de cellules
retournent à l’état planctonique et peuvent former plus loin un
nouveau biofilm.
2.1 Étapes 1 et 2
Avant que les bactéries ne viennent au contact du support, un
mélange complexe (encore mal caractérisé), composé de protéines,
de glycoprotéines et de nutriments organiques, forme un film de
conditionnement sur la surface (étape 1). Cette zone riche en nutri-
ments va favoriser la croissance bactérienne. L’attachement initial
(étape 2) des bactéries au support est aussi facilité par les forces
hydrodynamiques, le chimiotactisme et les propriétés physico-
chimiques de la surface du support et de la bactérie [21] [22]. Les
forces hydrodynamiques vont servir essentiellement au déplace-
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Étape 1 : adhésion réversible
Étape 2 : adhésion irréversible
Étape 3 : formation de microcolonies
Étape 4 : maturation
Étape 5 : retour à l’état planctonique (détachement)
Figure 4 – Différentes étapes dans la vie du biofilm
http://biology.binghamton.edu
ment de la bactérie dans le milieu et au rapprochement aléatoire de
la cellule vers le support. Les forces de cisaillement et les conditions
de flux vont influer sur la densité et l’épaisseur du biofilm. Le chi-
miotactisme va, quant à lui, permettre un rapprochement plus spé-
cifique entre la bactérie et la surface, via des récepteurs situés à la
surface de la paroi bactérienne. Enfin, des interactions non spécifi-
ques (électrostatiques, Van der Waals, énergie de surface et
acide-base de Lewis) vont exercer un jeu d’attraction-répulsion.
2.2 Étape 3 : adhésion irréversible
Différents appendices bactériens (curli, flagelles, pili) jouent un
rôle important dans la formation du biofilm. La première fonction
des flagelles est le rapprochement de la bactérie planctonique vers
le support (mécanisme de nage). O’Toole et Kolter [23] ont montré
qu’un mutant de P. aeruginosa défectif dans la formation du flagelle
adhère très difficilement au support. Une fois la surface atteinte, la
bactérie réduit drastiquement la synthèse des flagelles devenus inu-
tiles. Les pili (sorte de poils) sont également importants dans l’inte-
raction de la bactérie avec le support. Ainsi les pili dits de type IV,
présents au pôle de certaines bactéries à Gram négatif, sont impli-
qués dans un type particulier de mobilité appelée « twitching moti-
lity ». Ils permettent des mouvements à l’interface de surfaces
solides, mouvements basés sur la capacité de rétractation de ces
poils. Contrairement aux mutants dépourvus de flagelle, les
mutants sans pili de type IV peuvent former une monocouche cel-
lulaire mais sont incapables de former des microcolonies [23].
Pour des bactéries pathogènes comme P. aeruginosa, l’instaura-
tion d’un biofilm signifie l’instauration d’une infection chronique par
rapport à une infection aiguë caractérisée par la sécrétion de nom-
breuses toxines et facteurs cytotoxiques. Le choix de l’une ou l’autre
de ces stratégies de colonisation de l’hôte va dépendre des
conditions environnementales. Il est donc indispensable à la bacté-
rie d’évaluer ces conditions afin d’aboutir à l’expression des méca-
nismes de virulence les mieux adaptés pour échapper aux défenses
immunitaires de l’hôte. Les voies de signalisation qui déterminent
le choix du mode de virulence sont encore mal connues. Deux prin-
cipaux systèmes de vigilance permettent à la bactérie de percevoir
les variations environnementales et d’enclencher une réponse phy-
siologique adaptée. Il s’agit des systèmes de chimiotactisme et des
systèmes à deux composants. Les systèmes à deux composants
appelés aussi phosphorelais sont les systèmes les plus utilisés par
les bactéries pour détecter les modifications de leur environnement
(figure 5). Ces systèmes comportent, dans leur forme la plus simple,
deux protéines : un senseur qui détecte un ou plusieurs signaux
environnementaux et un régulateur de réponse qui est, dans la
majorité des cas, un régulateur transcriptionnel. Lorsqu’un signal
est perçu par le senseur, localisé le plus souvent au niveau de la
membrane interne, ce dernier va s’autophosphoryler et transférer
BIO 600 – 5
BIOFILMS BACTÉRIENS ______________________________________________________________________________________________________________
Transfert Phospho- Transfert
Signal d'information transfert d'information
Effet
P P
Protéine kinase senseur Protéine régulatrice
Sous l’action d’un signal environnemental, la protéine senseur
est activée via une phosphorylation, qui est ensuite transmise
à la seconde protéine (protéine régulatrice) qui devient donc
active. Cette activation induit une cascade d’événements géni-
ques conduisant à l’adaptation de la bactérie au stimulus.
Figure 5 – Représentation schématique des systèmes
à deux composants
son phosphate au régulateur de réponse par une interaction pro-
téine-protéine transitoire. Le régulateur, une fois activé, va réguler
l’expression des gènes cibles grâce à son domaine de fixation à
l’ADN. La majorité des régulateurs de réponse contrôle directement
l’expression des gènes en se fixant au niveau des régions promo-
trices de ces derniers. Néanmoins, tous les régulateurs de réponse
ne portent pas le motif de fixation à l’ADN et certains régulent
l’expression des gènes cibles par l’intermédiaire d’une activité enzy-
matique qui génère un composé chimique agissant comme second
messager intracellulaire, le diguanosyl monophosphate cyclique
(c-di-GMP). La concentration intracellulaire de c-di-GMP est
contrôlée par deux activités enzymatiques antagonistes : l’activité
diguanylate cyclase (DGC) et l’activité phosphodiestérase (PDE). Les
enzymes portant une activité DGC présentent une séquence en aci-
des aminés GGDEF conservée et sont impliquées dans la biosyn-
thèse du c-di-GMP. Au contraire les enzymes portant une activité
PDE présentent un motif conservé EAL et sont impliquées dans la
dégradation du c-di-GMP en GMP. Le taux de c-di-GMP intracellu-
laire semble être un indicateur cellulaire par lequel la bactérie va
choisir un mode de vie en biofilm ou planctonique [24].
À la fin de cette étape, la physiologie bactérienne s’oriente alors
vers un phénotype « biofilm » caractérisé en particulier par la sur-
production d’exopolymères qui vont « cimenter » le consortium
bactérien.
2.3 Étape 4 : maturation
La phase de maturation du biofilm se caractérise par une aug-
mentation de la taille de la structure via la multiplication cellulaire
et la synthèse importante des EPS. Le biofilm va alors acquérir une
structure tridimensionnelle comme, par exemple, celle dite en
champignon représentée sur la figure 4. Il a été montré chez
P. aeruginosa, que cette structuration du biofilm est sous le
contrôle des homosérines lactones (HSL), phéromones produites
par la bactérie et impliquées dans le système de communication
intercellulaire appelé « quorum sensing » [25]. Ce système est
basé sur la production de phéromones diffusibles (les HSL chez les
bactéries Gram négatif, des peptides chez les Gram positifs) qui
vont informer la bactérie sur la densité cellulaire dans son proche
environnement. Ces molécules diffusent à travers l’enveloppe bac-
térienne et, lorsque leur concentration atteint un seuil critique,
elles induisent l’activation d’un certain nombre de gènes ciblés.
2.4 Étape 5 : détachement cellulaire
Un cycle de croissance et de détachement cellulaire, baptisé
« sloughing » par les anglo-saxons, en référence à la mue des ser-
pents, s’établit ensuite. Le détachement des bactéries ou, plus géné-
ralement, d’un fragment de biofilm étant induit par une carence
nutritionnelle, il a été avancé qu’il devait permettre aux bactéries
de retrouver un environnement plus favorable [26]. Il a été montré
que ce détachement bactérien était précédé d’une nouvelle syn-
thèse de flagelles chez les bactéries et d’une réduction du nombre
de pili [27]. Les forces de cisaillement, la multiplication cellulaire et
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C
4,2 ±11,5 %
1,2 ± 2,3 %
1,0 ± 0,6 %
2,6 ± 2,6 %
10 10 s 5,1 ± 5,9 %
µm µm % bactéries mortes
F
99,2 ± 1,0 %
95,5 ± 5,1 %
65,9 ± 15,6 %
31,3 ± 9,9 %
10 10 s 19,6 ± 9,5 %
µm µm % bactéries mortes
s : substrat
A témoin non traité (vue du dessus)
B témoin non traité (vue saggitale)
D et E biofilm traité avec 1 mM de Cu pendant 12 h : D vue du dessus ;
E vue saggitale.
Les images ont été prises au microscope confocal à balayage laser après
coloration des bactéries par le kit LIVE/DEAD bacLight viability (Molecular
Probe) : les bactéries vivantes fluorescent en vert, les mortes en rouge.
C et F énumération des bactéries mortes et vivantes (exprimée en
pourcentage de cellules mortes en fonction de la biomasse totale dans
un biofilm non traité.
L’épaisseur moyenne des biofilms est de 10 µm.
Figure 6 – Biofilms de P. aeruginosa, formés sur des coupons
de polycarbonate et traités par le cuivre [28]
une dégradation enzymatique semblent contribuer favorablement à
la dispersion des micro-organismes. C’est cette capacité des bacté-
ries adhérentes à quitter le biofilm et à aller contaminer un autre
site qui fait des biofilms de véritables réservoirs de pathogènes.
3. Phénotype biofilm
Les bactéries au sein des biofilms possèdent des propriétés phy-
siques, chimiques, biologiques et phénotypiques extraordinaires,
par rapport aux mêmes bactéries cultivées en suspension. Elles pré-
sentent ainsi, par exemple, une résistance exceptionnelle aux agres-
sions externes et, en particulier, aux agents antibactériens comme
les antibiotiques, le chlore ou les métaux lourds [28] (figure 6).
L’âge du biofilm semble avoir son importance puisqu’il a été montré
qu’un biofilm mature est moins sensible aux antibiotiques qu’un
biofilm jeune [29]. Les mécanismes classiques de résistance (pom-
pes à efflux, enzymes, etc.) n’expliquent pas cette augmentation de
la résistance bien qu’y contribuant probablement.
Dans leur article publié en 2001, Stewart et Costerton [30] ont
avancé trois hypothèses pour expliquer cette résistance : un effet
de la gangue polymère, la création de microenvironnements au
sein des biofilms et enfin l’émergence d’un phénotype persistant
chez les bactéries immobilisées, la seconde étant étroitement
dépendante de la première.
3.1 Rôle de la gangue polymère
Par ses propriétés structurales et mécaniques, la gangue poly-
mère constitue le premier rempart face aux agents antimicrobiens.
Les EPS, de part leurs propriétés physico-chimiques, jouent le rôle
______________________________________________________________________________________________________________ BIOFILMS BACTÉRIENS
de barrière filtrante, soit par interaction avec le composé, soit par
piégeage. Le chlore, couramment utilisé comme désinfectant, pénè-
tre faiblement dans un biofilm mixte de Klebsiella pneumoniae et
P. aeruginosa [31]. Néanmoins, la limitation de la diffusion des inhi-
biteurs dans cette gangue ne peut pas expliquer à elle seule la for-
midable résistance des biofilms. Ainsi, par exemple, un antibiotique
tel que la vancomycine, qui diffuse correctement au sein du biofilm,
est tout aussi inefficace sur les bactéries qu’il contient [32]. Au sein
de cette gangue existent aussi des microenvironnements corres-
pondant à des zones carencées en nutriments, en oxygène ou pré-
sentant des valeurs locales de pH extrêmement basses. L’existence
de ces zones peut expliquer l’inefficacité de certains antibiotiques
comme les bétalactamines ou les aminosides, efficaces respective-
ment sur les bactéries en croissance et cultivées en aérobiose.
3.2 Émergence d’une physiologie
« biofilm »
Il est aujourd’hui admis que le phénotype « biofilm » reflète des
altérations de l’expression génique des bactéries adhérentes. Le
développement de nouvelles approches dites « postgénomiques »,
telles que les puces à ADN, la protéomique et l’hybridation sous-
tractive d’ADNc, ont permis aujourd’hui de commencer à dresser
un inventaire des différences d’expression génique chez les bacté-
ries organisées en biofilm et les bactéries en suspension ([33] [34]
et références citées).
Cependant, des différences notables ont été observées au niveau
quantitatif entre les approches protéomique (consistant à identifier
et quantifier les protéines exprimées par une cellule à un moment
donné) et transcriptomique (consistant à identifier et quantifier les
ARNm exprimés). Ainsi, alors que la protéomique suggère qu’un
grand nombre de protéines sont différemment exprimées chez les
bactéries des biofilms soit entre 15 et 50 % de modification du pro-
téome, les résultats obtenus par puces à ADN montrent qu’une faible
proportion du génome (entre 1 et 15 %) présente des modifications
significatives d’expression. Ces différences peuvent bien sûr s’expli-
quer par la faible corrélation entre la quantité d’ARNm et de protéine
mais pourraient aussi indiquer l’existence de protéines clefs qui ne
seraient pas encore identifiées parce que modifiées qualitativement
et non quantitativement, via des phosphorylations par exemple.
Peu de nouvelles voies de régulation associées à la vie en bio-
film ont été identifiées et aucune n’a été démontrée comme étant
spécifique ou nécessaire quel que soit le biofilm. Une des rares
exceptions concerne le gène pA1163 (ndvB ) de P. aeruginosa qui
est impliqué, non pas dans la formation des biofilms (le mutant
∆pA1163 et le sauvage produisent un biofilm identique), mais dans
la résistance des bactéries adhérentes à la tobramycine [35].
L’autre exception est le gène arr (pA2818 ), toujours de P. aerugi-
nosa, codant une phosphodiestérase de la membrane interne dont
le substrat est le c-di-GMP [36].
4. Moyens de lutte contre
les biofilms
4.1 Moyens actuels
Quel que soit le domaine, la lutte contre les biofilms pose tou-
jours de réels problèmes.
■ En milieu hospitalier, la règle générale est leur éradication. Pour
cela, la plupart des ustensiles utilisés sont à usage unique et stérile
lorsque cela est possible ou, dans le cas contraire, des normes
drastiques de décontamination sont mises en œuvre représentant
un impact économique important. Une expérience originale est
actuellement en cours à l’hôpital de Birmingham ; elle consiste à
remplacer tous les matériaux en acier inoxydable par des
matériaux en cuivre, métal dont on connaît les propriétés anti-
bactériennes depuis l’ancienne Égypte (voir l’article à l’adresse :
http://www.timesonline.co.uk/tol/news/uk/article1509513.ece).
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■ Au niveau de la lutte contre les salissures marines, des résultats
intéressants ont été obtenus avec des cocktails enzymatiques
constitués de protéases, de glycosidases et de lipases [37]. Des
hydrolases testées, les protéases dont la subtilisine sont les plus
efficaces. Un mélange d’amylases, lipases et protéases a égale-
ment montré une forte action synergique contre l’adhésion de
Pseudoalteromonas sp.
Une des meilleures solutions « anti-biofilms » est probablement
la prévention, consistant à limiter les capacités des matériaux à
être colonisés par les micro-organismes. La protection cathodique
en milieu marin est connue pour son effet inhibiteur vis-à-vis de la
biocorrosion [38]. En 2004 l’Ifremer a testé avec succès une
méthode antisalissure électrochimique basée sur la production de
chlore localisée au plus proche du capteur fonctionnant par élec-
trolyse de l’eau de mer. La méthode de protection par chloration
localisée s’est avérée très efficace sur les différents types d’instru-
ments testés. Ainsi, dans le cadre d’un partenariat CNRS-lfremer
(http://www.ifremer.fr/com/communiques/04-11-03-hublots-salissu-
res.htm), des hublots ont été protégés en les recouvrant d’un film
de dioxyde d’étain (SnO2) servant d’électrode transparente. Cette
dernière est polarisée à un potentiel permettant la production loca-
lisée d’eau de javel à partir de l’oxydation des ions chlorures
présents dans l’eau de mer. Une contre-électrode et une électrode
de référence complètent le dispositif.
■ En IAA, différents moyens de décontamination sont utilisés pour
prévenir la présence de biofilms. La plupart d’entre eux font inter-
venir des désinfectants chimiques (les antibiotiques étant peu utili-
sés). La bactérie L. pneumophila, quant à elle, est détruite à des
températures supérieures à 60 oC. Une technique pour éradiquer
les biofilms à légionelles consiste donc à monter la température
des circuits de manière à obtenir une eau chaude à 70 oC. Le
chlore et ses dérivés sont également utilisés, souvent en synergie
avec la chaleur. Un inconvénient majeur est que la corrosivité de
l’eau augmente avec la température et que le chlore pénètre mal
au sein des biofilms. En cas d’arrêt d’injection, la recolonisation du
circuit par les bactéries peut être très rapide.
L’ionisation, par contre, est une technologie largement plébisci-
tée. Elle consiste à enrichir l’eau en ions cuivre (Cu2+) et/ou argent
(Ag+) qui vont se lier aux cellules négativement chargées et entraî-
ner leur destruction.
Cette technique possède un certain nombre d’avantages :
– son efficacité est indépendante de la température ;
– l’ionisation a un effet bactéricide et algicide puissant (y
compris sur les biofilms) ;
– elle est facile à mettre en œuvre et a un faible coût d’entretien.
Un inconvénient est que la concentration des ions doit être
contrôlée et les électrodes nettoyées régulièrement.
■ Au niveau des matériaux, deux grandes stratégies sont actuelle-
ment proposées : le développement de surfaces antiadhésives et
l’élaboration de matériaux antibactériens.
4.2 Développement de surfaces
antiadhésives
La modification physique de la surface est le moyen le plus
simple pour réduire l’interaction de la bactérie avec un support.
Idéalement, la surface doit être la plus lisse possible, la rugosité
favorisant la colonisation microbienne. Cependant, la biocompa-
tibilité peut nécessiter un certain degré de rugosité pour faciliter,
par exemple, la colonisation par les ostéoblastes [39]. Une autre
propriété importante est le caractère hydrophile. Ainsi, de nom-
breux cathéters possédant un revêtement hydrophile antifouling
ont été proposés et sont actuellement commercialisés tels les
cathéters veineux centraux Hydrocath (en polyuréthane recouvert
d’un film de poly-(N-vinylpyrrolidone)).
La protection des surfaces peut aussi être obtenue par des modi-
fications physico-chimiques (traitement plasma, ozonation) ou par
greffage de têtes lipidiques comme la phosphorylcholine, son groupe
BIO 600 – 7
BIOFILMS BACTÉRIENS ______________________________________________________________________________________________________________
polaire (qui possède une forte affinité pour l’eau) limitant l’adhésion
irréversible des protéines sur la surface [40]. Une autre stratégie
consiste à élaborer des polymères mixtes ou copolymères possédant
une queue hydrophobe pouvant adhérer fortement à la surface et
une tête hydrophile limitant les interactions avec les protéines. C’est
le cas lorsque des monomères de méthacrylate sont utilisés pour
former différents types de polymères ou quand des copolymères
triséquencés type Pluronic® PE sont piégés dans un polymère tel
que la polyaniline [41]. Récemment, certaines études ont proposé
l’utilisation de poly(éthylèneoxyde) ou de poly(éthylèneglycol) (PEO
ou PEG). Ces polymères non chargés ne sont ni toxiques ni immu-
nogènes. Connus pour leur caractère hydrophile, ils sont capables
de former des brosses moléculaires flexibles. Une diminution signi-
ficative de l’adhésion bactérienne a également été obtenue avec des
hydrogels [42], polymères hydrophiles présentant une forte capacité
de gonflement. Lorsque la quantité d’eau dans l’hydrogel est
comprise entre 10 et 98 %, ce gonflement induit la formation d’un
film d’eau à la surface qui devient donc plus lisse. Insolubles dans
l’eau, ces hydrogels peuvent être utilisés dans les fluides biologiques.
4.3 Élaboration de surfaces
à revêtements antimicrobiens
Les revêtements antibactériens ont été largement étudiés ces
dernières années. L’objectif n’est plus simplement de repousser
les micro-organismes mais de les tuer. Les molécules biocides
peuvent être soit immobilisées sur les surfaces, soit incorporées
dans le polymère. Deux grandes classes de molécules sont le plus
souvent utilisées : des espèces inorganiques chargées ou des
agents antimicrobiens.
4.3.1 Incorporation d’espèces inorganiques
et/ou chargées
Le développement de revêtements contenant des particules
d’argent ou des sels d’argent est une méthode efficace pour préve-
nir la colonisation bactérienne. L’argent possède un large spectre
antibactérien. Son action est due à la diffusion d’ions Ag2+ capables
de se fixer sur l’ADN microbien et sur les groupes sulhydril des
enzymes. Cioffi et coll. [43] ont proposé en 2005 des films de
poly(vinylméthylcétone) piégeant des nanoparticules de cuivre et
d’argent. Ces films présentent une activité antibactérienne signifi-
cative et sont incorporables dans des peintures antifouling. Cepen-
dant, l’incorporation de ces sels métalliques dans les peintures sera
totalement interdite en 2008 (directive européenne no 99/54/EC).
La fonctionnalisation des surfaces par des ammoniums quater-
naires ou des polymères cationiques (poly(éthylèneimine)) réduit
aussi considérablement l’adhésion microbienne [44]. Il a été montré
que des films multicouches de polyélectrolytes contenant de la
cétrimide inhibent fortement la colonisation bactérienne [45].
Récemment ont été proposé des matériaux en polyuréthanes et
copolyuréthanes porteurs de groupes ammonium et hydroxyl, qui
sont efficaces contre P. aeruginosa [46]. De bons résultats ont éga-
lement été obtenus par greffage d’ions N+ et Si+ sur la silicone ou
le polyuréthane [47].
4.3.2 Incorporation d’agents antimicrobiens
L’incorporation d’antimicrobiens (antibiotiques, antiseptiques ou
enzymes) dans des polymères est une des stratégies utilisées pour
lutter contre les biofilms. Deux méthodes sont utilisées :
– (i) l’adsorption de la molécule sur la surface après fabrication
du matériau ;
– (ii) l’incorporation de la molécule dans le polymère durant le
processus de fabrication.
Cette seconde approche concerne entre autres des peptides anti-
bactériens piégés au sein de films multicouches de polyélectroly-
tes [48]. L’avantage de cette approche est que les molécules diffusent
lentement, maintenant dans le milieu environnant des concentra-
tions inhibitrices sur de longues périodes. L’inconvénient majeur est
le risque d’émergence de multirésistance. Pour éviter ce risque, de
nouvelles stratégies ont été proposées comme le greffage chimique
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H H
Br Br O H
Br H
O
N
O O H
H H O
O O
Furanone C30 Furanone C56 C4-HSL
O O
H
O
N
3-oxo-C12-HSL H O
Figure 7 – Structures chimiques de furanones synthétiques
(C30 et C56) et des molécules signal (C4-HSL et 3-oxo-C12-HSL)
produites par la bactérie P. aeruginosa
de ces agents antibactériens, le challenge consistant à maintenir leur
activité biologique. Cela implique également que ces agents doivent
agir au niveau de la paroi bactérienne. Dans ce contexte, Haynie et
coll. [49] ont lié de façon covalente le résidu C-terminal de la magai-
nine sur une résine de polyamine-éthylènediamine modifiée.
Compte tenu de l’émergence des résistances aux antibiotiques
et de la toxicité des molécules utilisées (métaux lourds ...), un mar-
ché important est ouvert concernant la recherche de nouvelles
molécules moins toxiques. Au début des années 1990, P. Steinberg
s’est étonné de voir la capacité de l’algue marine Delisea pulchra à
rester libre de toute colonisation dans des eaux pourtant fortement
contaminées. Manefield et coll. [50] ont démontré que la molécule,
appelée furanone, qui prévient la contamination de l’algue, a une
structure très proche des HSL (figure 7) et se comporte donc
comme un antagoniste des HSL. Ces furanones sont aujourd’hui
incorporées dans divers produits comme les pâtes dentifrices, des
vernis ou des chewing-gums. Très récemment, une équipe de l’Ins-
titut Pasteur associée au CNRS vient de caractériser une molécule
capable d’inhiber la formation de biofilm. Dans un travail publié
dans PNAS (USA) [51], ces chercheurs ont montré que cette molé-
cule, sucre complexe sécrété dans le milieu de culture par des
Escherichia coli uropathogènes, appliquée sur différents types de
matériaux comme le plastique et le verre, empêche la formation
de biofilm par des bactéries pathogènes.
5. Conclusion
L’intérêt grandissant porté aux biofilms cette dernière décennie
procède de la prise de conscience :
– (i) qu’ils sont ubiquitaires et concernent plus de 90 % des
micro-organismes présents sur notre planète ;
– (ii) que les méthodes conventionnelles pour tuer les bactéries
sont inefficaces sur ces structures.
Les doses massives d’agents antimicrobiens requises pour éra-
diquer ces biofilms sont incompatibles avec l’exigence environne-
mentale, la réalité médicale (éradiquer le biofilm engendrerait la
mort du patient) et, souvent, avec la législation en vigueur ou à venir.
En conséquence, il est urgent de proposer de nouvelles stratégies
de lutte antibactérienne, celles-ci devant reposer sur une meilleure
connaissance des mécanismes d’adhésion. Pour cela, il est impératif
de croiser les compétences de très nombreux domaines complé-
mentaires comme la microbiologie, la chimie des solutions, la
physico-chimie des surfaces, l’hydrodynamique, la science des
matériaux, l’ingénierie..., condition sine qua non pour relever ce qui
est probablement le plus grand défi de la microbiologie du 21e siècle.
Cet impératif a conduit le CNRS à créer en 2005 le Pôle de Recherche
National à Implantation Régionale (PNIR) « Biofilms » qui rassemble
21 laboratoires sous la tutelle de quatre départements scientifiques
(science pour l’ingénieur, chimie, vivant, sciences de l’univers).