‫الجوهىريت الجسائريت الديوقراطيت الشعبيت‬

République Algérienne Démocratique et Populaire

‫وزارة التعلين العالي و البحث العلوي‬

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

‫جاهعـت حسيبت بن بى علي الشلف‬

Université Hassiba Benbouali de Chlef
‫كليت علىم الطبيعت و الحياة‬
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

‫قسن البيىلىجيا‬
Département de biologie

Résumé du Mémoire de Master

Domaine : Sciences de la nature et de la vie
Filière : Sciences biologiques
Spécialité : Microbiologie appliquée

Thème

Les effets des nanoparticules sur la croissance de bactéries sporulées

Réalisé par :

 Brahim-Azzouz Chahrazed

Soutenue publiquement le 14 /07 / 2021 devant le jury composé de :

Mr Djouad M.E MAA Université Hassiba Ben Bouali de Chlef Président

Mr El hammer H MCA Université Hassiba Ben Bouali de Chlef Encadreur
Mr.Benabbou T.A MCB Université Hassiba Ben Bouali de Chlef Examinateur

Année universitaire : 2020 / 2021

 Résumé

Les bactéries sporulantes sont une source de nuisances majeures dans le domaine de
l’hygiène, de la sante et dans les divers secteurs industriels. Leurs spores multirésistantes et
leur capacité à former des biofilms sont les principaux obstacles à leur élimination. Le
développement de bionanoparticules sporicides et antibiofilm est une alternative efficace
pour lutter contre ces bactéries. Dans ce contexte nous avons élaboré des nanoparticules de
zinc, de et hybrides zinc- fer par route microbiologique en utilisant des extraits acellulaires
de la levure XD (produisant des molécules a fort potentiel réducteur) a l’encontre d’isolats
multiresistants hospitalier de Bacillus subtilis et Bacillus cereus. Les résultats trouvés ont
montré que les nanoparticules de Zn-Fe ont un effet sporicide et antibiofilm remarquable
notamment sur Bacillus subtilis.

Mots clés : Extraits acellulaires, nanoparticule, spores, multirésistantes, biofilms, Bacillus.

Abstract

Sporulating bacteria are a major source of nuisance in the field of hygiene, health and in various
industrial sectors. Their multidrug-resistant spores and their ability to form biofilms are the main
obstacles to their elimination. The development of sporicidal and antibiofilm bionanoparticles is an
effective alternative to fight against these bacteria.
In this context we have developed zinc nanoparticles, and zinc-iron hybrids by microbiological route
using cell-free extracts of XD yeast (producing molecules with high reducing potential) against hospital
multiresistant isolates of Bacillus subtilis and Bacillus cereus. The results found have shown that the
Zn-Fe nanoparticles have a remarkable sporicidal and antibiofilm effect, in particular on Bacillus
subtilis.

Keywords: Cell-free extracts, nanoparticle, spores, multidrug resistant, biofilms, Bacillus.

 Tables des matières
Introduction ............................................................................................................................ 01

Matériel et Méthodes

1. Réactivation et caractérisation de la levure .................................................................. 02

2. Etude de la cinétique de croissance et d’évolution du pH chez levure XD .................. 02
3. Production et scan spectrophotométrie de l’extrait acellulaire de la levure XD ...... ....02
4. Dosage du glucose résiduel .......................................................................................... 02
5. Dosage des polyphénols totaux par colorimétrie ......................................................... 03
6. Dosage des flavonoïdes ................................................................................................ 03
7. Réduction du fer ........................................................................................................... 03
8. Etude de l’activité antioxydant de la levure XD........................................................... 04

8.1. Test de piégeage du radical libre DPPH ........................................................... 04

8.2. Test du β-Carotène-acide linoléique..................................................................04

9. Biosynthèse des nanoparticules .................................................................................. .04

10. Identification des bactéries sporulées ........................................................................... 05
11. Evaluation de l’effet antimicrobien des nanoparticules sur la croissance des souches
bactériennes .................................................................................................................. 05
11.1. Test effet des nanoparticules sur les bactéries sporulées dans un bouillon
BHI................................................................................................................................05
11.2. Test de diffusion des nanoparticules sur milieu solide.........................................05

Résultats et discussion

1. Caractérisation de la levure XD ................................................................................ ...07

2. Etude cinétique de la croissance et d’évolution du pH.............................................. ...07
3. Evolution du glucose résiduel ................................................................................... ...07
4. Scan spectrophotométrie de l’extrait acellulaire ....................................................... ...07
5. Evolution de la production des polyphénols ................................................................ 08
6. Evolution de la production des flavonoïdes ................................................................. 08
 7. Activité anti radicalaire de la levure XD ...................................................................... 08
8. Test de blanchissement de  -carotène .......................................................................... 08
9. Potentiel réducteur du fer ............................................................................................. 08
10. Identification des souches bactériennes........................................................................ 09
11. Effet antibactérien des nanoparticules sur les bactéries ............................................... 09
Effet des nanoparticules sur les bactéries sporulées en bouillon
BHI ............................................................................................................................... 09
Test de diffusion des nanoparticules sur milieu solide................................................. 09

Conclusion ............................................................................................................................... 10

Références bibliographiques ................................................................................................. .11

Introduction

Certaines bactéries soumises à un stress peuvent modifier temporairement et de

manière réversible l'expression de leurs gènes, ce qui entraîne un nouveau phénotype appelé
spores. On les appelle bactéries sporulées. Les spores ou endospores sont des cellules qui se
différencient des cellules végétatives par leur structure, notamment une résistance élevée aux
agents physico-chimiques et antimicrobiens. Cette résistance leur permet de survivre dans des
conditions défavorables (Mckenneyet et al., 2013). Il existe environ 200 espèces de bactéries
sporulées, incluses dans environ 25 genres, appartenant généralement à la famille des Bacillus
(Henrique et Moran, 2007). Bacillus et Clostridium sont les plus étudiés (Marklandet et al.,
2013). De par leur forte représentation, leur potentiel pathogène et leur haute résistance, les
bactéries sporulées jouent un rôle reconnu dans le mécanisme de résistance et de formation
des biofilms. En effet, les biofilms contiennent des niveaux élevés de bactéries de sporulation
et favorisent l'activation des gènes de sporulation de la p-SpoA (Abeet et al., 2011). Pour cette
raison, ils contiennent un nombre élevé de spores, ce qui limite leur destruction. Cela peut
entraîner des problèmes de santé majeurs car majeurs, puisque les biofilms peuvent également
abriter des espèces pathogènes telles que Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus et
Bacillus cereus (Faille et al., 2014). Environ 40 % des maladies d'origine alimentaire causées
par des bactéries dues à la formation de biofilms dans les industries alimentaires (Haeghebaert
et al., 2001). Utilisation intensive d'antibiotiques, de détergents, de biocides et biofertilisants.
En raison de la résistance accrue des microorganismes sous forme de biofilms, ils sont
généralement inefficaces et même nocifs pour l'environnement et la santé humaine (Saulou,
2009).

La recherche de nouveaux agents antibactériens a ouvert un nouveau domaine de la

nanotechnologie. Différentes approches sont à l'étude aujourd'hui. Les agents antibactériens
qui ont suscité un grand intérêt sont les nanoparticules, qui ont démontré leurs propriétés
antibactériennes à large spectre contre Gram-positif et Gram négatives, les nanoparticules
d'oxydes métalliques ont reçu le plus d'attention en raison de leur bonne conductivité
électrique,de leur stabilité chimique et de leur fort effet antibactérien sur les bactéries.

Dans ce contexte, le but de cette étude est d'améliorer des procédés de lutter contre les
bactéries sporulées par élaboration des nanoparticules d’oxyde métallique en utilisant des
extraits acellulaires de la levure XD.

~1~
 Matériel et Méthodes

Ce travail a été effectué au niveau du laboratoire de biotechnologie de l’université Hassiba

Ben Bouali de Chlef, il a pour objectif de synthétiser les nanoparticules et étudier leurs effets
sur certaines souches appartenant à des espèces de bactéries sporulées.

1. Réactivation et caractérisation de la levure

La souche utilisée dans cette étude est une levure codée XD, Afin de caractériser cette
souche, les étapes suivantes ont été appliquées :

 Le repiquage : a pour but la revitalisation de la souche.

 Examen macroscopique : Permet de décrire l'aspect des colonies de la levure XD.
 Examen microscopique : Permet de voir le mode de division des cellules.

2. Etude de la cinétique de croissance et d’évolution du pH chez levure XD

La culture a été réalisée dans un flacon contenant 100 ml de bouillon YPG.

L’ensemencement a été réalisé par un pré culture de 24 heures
L'étude de croissance de la levure XD a été réalisée en mesurant la densité à 600 nm avec
un spectrophotomètre, et en mesurant en même temps la valeur du pH par des méthodes
électrochimiques.

3. Production et scan spectrophotométrie de l’extrait acellulaire de la levure XD

Inoculer la levure XD dans 4 flacons contenant 100 ml d’YPG, Incuber à 30°C à des
intervalles de 24h, 48h, 72h et 96h.

Sortez un flacon par jour et centrifugez à 6000 rpm pendant 15 minutes.

Récupérer le surnageant pour obtenir un extrait acellulaire Les extraits acellulaires à

chaque intervalle de temps (24h, 48h, 72h, 96h) seront scannés à 200-800nm.

4. Dosage du glucose résiduel:

 On prend 200 mg du glucose dans une fiole de 100 ml, ajustés au trait de jauge avec
de l'eau ultra pure et agiter jusqu'à dissolution complète pour obtenir solution glucose.

~2~
 Matériel et Méthodes

 Dans un tube à essai on ajoute 10 µl de solution de glucose et 1000 µl de kit

enzymatique et 5 ml d'extrait acellulaire, incubation pendant 10 min après on passe à
la lecture spectroscopique.

5. Dosage des polyphénols totaux par colorimétrie :

-Ajouter dans un tube à essai :

 0.2 ml de l'extrait acellulaire (24h, 48h, 72h, 96h) ;
 1 ml du réactif de Folin-Ciocalteu ;
 0.8 ml de la solution de carbonate de sodium à 7.5%.
-Agiter bien le tube ;
-Incuber la solution pendant une heure à température ambiante à l'abri de la
lumière ;
-Lire l'absorbance à 765 nm.

6. Dosage des flavonoïdes :

-Ajouter dans un tube à essai :

 1 ml d'extrait acellulaire ;
 1 ml AlCl3 à 2% dans le méthanol.
-Incuber à l'ombre avec une température ambiante pendant 30 min;
-Lire l'absorbance à 430 nm.

7. Réduction du fer

-Préparer les solutions métalliques (Fe, Zn et Fe+Zn) avec des différentes concentrations ;
-Préparer une série des tubes à essai contenant les différentes concentrations des solutions
métalliques.
-Ajouter dans chaque tube :
 10 ml de bouillon YPG ;
 100 µl de suspension de la levure XD.
-Incuber les tubes à 30°C pendant (24 h, 48h, 72h, 96h).

~3~
 Matériel et Méthodes

8. Etude de l'activité antioxydant de la levure XD

8.1.Test de piégeage du radical libre DPPH

-Ajouter dans un tube à essai :

 500 µl de l'extrait acellulaire ;
 3 ml de solution méthanoïque de DPPH ;
 500 ml d'éthanol.
-Incuber pendant 10 min à l'obscurité puis passer à la lecture spectroscopique.

8.2. Test du β-Carotène-acide linoléique:

-Préparation d’emulsion, sa composition est :

 0,5 mg de B-Carotène ;
 1 ml de chloroforme ;
 20 ml d'acide linoléique ;
 200 mg de tween 40.
-Élimination du chloroforme par évaporateur rotatif sous vide ;

-Ajouter 100 ml d'eau oxygène saturé ;

-Préparer une série de tubes à essai contenant 350 µl d'extrait acellulaire ;
- Ajouter 2,5 ml d'émulsion dans chaque tube ;
- Incuber les tubes pendant 48heures
-Lire l’absorbances à 490 nm.

9. Biosynthèse de nanoparticules

Les nanoparticules de Zn, Fe, ZnFe ont été élaborée par voie biologique en utilisant
lesdifférents extraits acellulaire, nous avons besoin :
 Extraits acellulaire ;
 Solution ZnSo4 avec une concentration de 0,05M ;
 Solution FeCl2 avec concentration de 0,02M.

~4~
 Matériel et Méthodes

10. Identification des bactéries sporulées

Les souches bactériennes utilisées dans cette étude sont de genre bacillus, Afin d'identifier
cessouches, les étapes suivantes ont été appliquées :

 Repiquage des souches : L’objectif est d'obtenir des cultures jeunes.

 Examen macroscopique : Permet la description des colonies pour savoir la forme, la
taille, la couleur, aspect.....
 Examen microscopique : Permet de déterminer la morphologie des bactéries, leur
mode de regroupement, le type de gram, la présence ou l'absence de spores.
 Réalisation des tests enzymatique d'orientation rapide (oxydase et catalase) .
 Réalisation test biochimique par galerie API50 CHB pour identification rapide des
espèces du genre bacillus.
 Étude de la formation de biofilm dans la microplaque.

11. Évaluation de l'effet antimicrobien des nanoparticules sur la croissance des

souches bactériennes

11.1. Test l'effet des nanoparticules sur les bactéries sporulées dans un bouillon BHI
-Préparer une culture de 72 h des souches (B.sub, B.cer) dans un milieu BHI, Incuber à
37°C.
-Pasteurisation à 80°C pendant 30 min.
-Préparer une série des tubes de bouillonBHI
-Dans la première série, nous ajoutons :
 1 ml de suspension bactérienne ;
 2 g la poudre de nanoparticules (Zn, Fe, ZnFe).
-Dans la deuxième série, nous ajoutons :
 1 ml de suspension bactérienne.
-Ces tubes seront Incubés pendant 24 h à 37 °C.

11.2. Test de diffusion des nanoparticules sur milieu solide

-Préparer la dilution de 10-4 des souches (B.sub et B.cer).

~5~
 Matériel et Méthodes

-Inoculer la suspension liquide 10-4 de la souche en film sur le milieu gélose Muller
Hinton pendant 15 min.
-Retirer l'excédent et laisser la boite sécher.
-Les spots sont réalisés en déposant de la poudre de nanoparticules (Zn, Fe, ZnFe) sur une
boîte de Pétri.
-Incuber à 37 °C pendant 24 heures.

~6~
 Résultats et discussions

1. Caractérisation de la levure XD:

Après incubation de 18-24 h à 30°c sur milieu YPG, les colonies sont de couleur
blanche crémeuse d'aspect brillant de contour arrondi et régulier.

2. Etude de la cinétique de croissance et d'évaluation du ph

Les résultats de croissance obtenu montre qu’il existe deux phases, la première phase
ascendante correspond à la phase exponentielle, la seconde phase correspond à la phase
stationnaire et l'absence de la phase de latence.

Nos résultat réclame deux phases d'où l'absence de la phase de latence, contrairement à
l'étude de Halàsz et laztity (1999), cela déduire que notre souche est déjà adapté à ce
milieu.

La mesure du pH révèle deux phases, la première phase descendante passant de 6 à 5

unités pour une durée de 20 heures, la seconde phase caractérisée par un niveau de pH
invariable jusqu'à l'arrêt de la croissance.

Le pH optimal pour la croissance de la levure est compris entre 5 à 5,25 mais il peut
atteindre un pH compris entre 3,5 et 6 lors de la fermentation, d’après Russel (2003).

3. Évolution du glucose résiduel

D'après les résultats, obtenu on remarque la consommation du glucose a la même

allure que celle de l'évaluation du pH.

Cela indique que la consommation de glucose est la cause de la baisse du pH.

4. Scan spectrophotométrie de l'extrait acellulaire

D'après les résultats, un pic d'excitation correspondant aux molécules aromatiques est
observé dans la bande ultraviolette de 200～250nm

Autre pics dans le visible, avec un maximum de 400 nm, correspondant à des
molécules triploïdes.

~7~
 Résultats et discussions

5. Evolution de la production de polyphénols

Sur la base des valeurs obtenues, il a été observé que la levure XD produit des
composés polyphénoliques. Nous avons montré que selon Huynh et al (2014), la
production de polyphénols lors de la fermentation va augmenter.

6. Evolution de la production de flavonoïdes

Les résultats trouvés montrent que les teneurs en flavonoïdes totaux produits par la
souche XD sont associés à la croissance

Selon l'étude de Kahkineh et al (1999), la levure à une capacité de produire des

molécules bioactive.

7. Activités antiradicalaire de la levure XD

Les résultats obtenus à partir du potentiel DPPH de l'extrait acellulaire ont montré que
la souche XD a une phase qui dure 1 heure, l'IC50 diminue, puis la stabilité de l'IC50
démarre à partir de 7 heures. Plus la valeur IC50 est basse, l'extrait est considéré comme
un puissant antioxydant (Benammar et al., 2008)

8. Test de blanchissement de β-Carotène

Le résultat obtenu montre que le maximum de test β-Carotène chez la souche XD est
de 56,07% à 30 heures

Les résultats obtenus montrent que le test maximum de β-carotène de la souche XD à

30 heures est de 56,07 % Par rapport au BHT, la capacité élevée d'inhibition de
l'oxydation combine l'acide linoléique et le β-carotène Teepe et al., (2006).

9. Potentiel réducteur du fer

Les résultats ont montré que la souche XD présente une évaluation de la

capacité deréduction de Fe3+ dans Fe2+.

~8~
 Résultats et discussions

10. Identification des souches bactériennes

Les deux souches sont des bacilles en forme de bâtonnet, lisses, de taille moyenne,
decouleur crème, à Gram positif, à oxydase négative et à catalase positive.

Les résultats des caractéristiques biochimiques nous permettent d'identifier la souche

cible :La souche 1 est Bacillus cereus ;

La souche 2 est Bacillus subtilis.

Les deux souches peuvent former des biofilms.

11. Effet antibactérien des nanoparticules sur les bactéries sporulées

11.1. L'effet des nanoparticules sur les bactéries sporulées dans le bouillon BHI

Par rapport au témoin, une turbidité plus faible a été observée dans le tube contenant
Zn- Np, il n'y a pas de différence entre Fe-Np et ZnFe-Np.

11.2 Test de diffusion de nanoparticules sur milieu solide

Des zones d'inhibition sont observées autour des points Zn-Np et ZnFe-Np Absence de
zone d'inhibition autour du point Fe-Np.

Le ZnFe-Np est plus efficace contre les bactéries de sporulation que le Zn-Np. Nos
résultats sont cohérents avec les résultats rapportés par Thati et al (2010), qui ont
démontré que la taille de la zone d'inhibition augmente en présence de Zn.

Fe-Np n'a pas d'effet antibactérien, et on ne sait pas qu'ils ont une activité
antibactérienne (Gordon et al., 2011)

~9~
Conclusion

Le but de ce travail est de développer des nanoparticules antibactériennes en utilisant

des extraits acellulaires de la levure XD sur le bouillon YBJ .Il a été constaté que les extraits
acellulaires ont des activités antioxydantes et réductrices très intéressantes, notamment :
DDPH de 76,69%, IC50 de 3,4μg/ml et le pouvoir réducteur du fer est de 1,77μg/ml.

Nous avons utilisé la méthode de la galerie API 50CHB pour identifier les bactéries,
Les résultats d'analyse du profil biochimique des souches montrent que ce sont Bacillus
subtilis et Bacillus cereus, et d’étudié leur capacité à former des biofilms. Ces souches sont
multi-résistantes et posent de nombreuses nuisances.

La synthèse des nanoparticules par l’utilisation d'extraits acellulaires de la levure XD

est très efficace contre les deux souches Bacillus subtilis et Bacillus cereus, surtout en
combinant des nanoparticules de fer et de zinc.

Les NPs Zn-Fe ont une capacité antibactérienne très efficace. Il sera très important
d'évaluer l'influence de ces NPs (Zn-Fe) sur la cinétique de croissance et le développement du
biofilm.

~ 10 ~
 Références bibliographique

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