TP4 : Spectrophotométrie : vérification de la loi de Beer Lambert

Que l’on a le droit d’ouvrir une pissette d’eau distillée pour remplir
Spectrophotométrie - Dilution plus rapidement la fiole jaugée.
1 Dilution et facteur de dilution.
Qu’il faut s’arrêter 1 cm avant le trait de jauge, et finir de

1.1 Mode opératoire :

compléter avec la pipette pasteur (en prélevant l’eau distillée
dans un bécher , et non directement dans la pissette comme un
1. Prélever V mL de la solution mère à la pipette jaugée. souillon).
Est-ce que je sais : 4. Agiter pour homogénéiser.

Mettre une propipette sur une pipette sans être un danger public Est ce que je sais :
(tenir la pipette au boût, au niveau où on positionne doucement la
Qu’il faut ici utiliser un bouchon propre pour la fiole jaugée.
propipette).
Qu’il ne faut pas agiter sauvagement, pour éviter en particulier des

Ne pas souiller une solution (pipeter dans un deuxième bécher et émulsions dans certains cas.
non comme un souillon dans la solution mère ?)

Me tenir debout. 1.2 Calcul théorique
-1

Tenir la pipette verticale. Exemple : solution mère à Cmère = 0,50 mol.L . Vprélevé à mère = 20,0 mL

Assurer avec mes deux mains la pipette, la propipette et le bécher (volume de la pipette jaugée)
à chaque instant. Vfille = 50,0 mL (volume de

Qu’il ne faut jamais mettre de liquide dans la propipette (qu’il ne la fiole jaugée)
faut pas laisser un système « pipette-propipette » incliné avec un Alors la quantité de matière prélevée à la solution mère se
angle supérieur ou égal à 90° ; au passage, la propipette ne doit retrouve dans la solution fille :
pas être laissée sur la pipette lorsque la pipette est posée sur la Cmère × Vprélevé à mère = Cfille × Vfille.
paillasse). Vmère

Avoir mes yeux au niveau du liquide ? D’où Cfille = Cmère ×

Qu’il faut lire au bas du ménisque.
V fille

Qu’il faut ajuster le volume en faisant couler le liquide « par
capillarité » (incliner le bécher de 45°, laisser la pipette verticale, le V fille
niveau du liquide à hauteur des yeux) le facteur est appelé « facteur de dilution », et vaut ici 2,5
Vmère

Que certaines pipettes jaugées sont des pipettes 2 traits.
2. Verser ce prélèvement dans la fiole jaugée. (on dilue ici 2,5 fois…)
Est-ce que je sais : Cmère -1
Ce rapport vaut donc aussi , il vient Cfille = 0,20 mol.L .

Que la dernière goutte doit couler par capillarité. C fille
3. Compléter au trait de jauge avec le solvant. Utilisation du « facteur de dilution ».
Est-ce que je sais : -1
Si on a une solution mère à Cmère = 0,50 mol.L et que l’on veut une solution fille à
-1
0,010 mol.L , le facteur de dilution vaut 50 : il faut donc diluer 50 fois :

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 Soit on prélève 1,0 mL de mère que l’on place dans une fiole jaugée de 50,0 mL Volume Volume de la
Facteur
compléter au trait de jauge avec le solvant, Concentration Concentration de la fiole solution mère
de
 Soit on prélève 2,0 mL de mère que l’on place dans une fiole jaugée de 100,0 mL (solution mère) (solution fille) jaugée prélevé à la
dilution
compléter au trait de jauge avec le solvant, utilisée pipette.
 Soit on prélève 5,0 mL de mère que l’on place dans une fiole jaugée de 250,0 mL -2 -1 -4 -1
1,0.10 mol.L 5,0.10 mol.L 50 mL 2,5 mL 20
compléter au trait de jauge avec le solvant,…
Et on s’arrange pour pouvoir garder expérimentalement une précision suffisante 100 mL
e
(ici, la 3 méthode est satisfaisante, mais consomme beaucoup d’eau distillée. On -2 -1 -4 -1
1,0.10 mol.L 4,0.10 mol.L 50 mL
préfèrera pour diluer 50 fois : diluer 5× puis diluer 10 ×
 Diluer 5× : prélever 10,0 mL de mère que l’on place dans une fiole 100 mL
jaugée de 50,0 mL compléter au trait de jauge. -2 -1 -4 -1
5,0.10 mol.L 1,0.10 mol.L 50 mL
 Puis diluer 10 × : prélever 10,0 mL de la solution précédente que l’on
place dans une fiole jaugée de 100,0 mL. 100 mL

1.3 Visualisation d’une dilution et du facteur de dilution -2

2,0.10 mol.L
-1 -3
4,0.10 mol.L
-1
50 mL

100 mL
Diluer 2 fois
2) Solvant rajouté
jusqu’au trait de jauge de la -1 -1 -3 -1 (on le fait
fiole 1,0.10 mol.L 2,5.10 mol.L 100 mL
donc en 2
OU temps)
1) Solution mère (C1) Dilution facteur 5
(prélevée à la pipette) -1 -2 -1
1/2 du volume de la fiole jaugée
à partir de 1,0.10 2,0.10 mol.L 50 mL
-1
mol.L
Dilution facteur 8 à
Solution mère partir de la solution 200 mL
Diluer 5 fois
(concentration C1) 2) Solvant rajouté précédente
jusqu’au trait de jauge de la Dilution facteur 4
fiole -1 -2 -1
à partir de 1,0.10 2,5.10 mol.L 100 mL
-1
mol.L
Dilution facteur 10 à
partir de la solution 100 mL
1) Solution mère (C1) précédente
(prélevée à la pipette)
1/5 du volume de la fiole
jaugée

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2 Spectrophotométrie d’absorption 3 Montage expérimental

La spectrophotométrie est l’étude quantitative des interactions Schématiquement, une source de lumière émet une gamme de
lumière – matière. radiation électromagnétique. On sélectionne l’une des longueurs d’onde à
En arrivant sur une substance, une partie de la lumière est transmise, l’aide d’un prisme ou d’un réseau. Cette radiation traverse une cuve de
une partie est absorbée. Si l’absorption de lumière a lieu dans le longueur l contenant la solution à étudier. On connaît en entrée l’intensité
domaine des longueurs d’onde du visible (longueur d’onde λ entre 400 lumineuse I0 (λ) de la radiation lumineuse incidente à la longueur d’onde λ.
nm (violet) et 750 nm (rouge)), la substance est colorée. On mesure en sortie l’intensité lumineuse I (λ) après traversée de la
c 14 14 solution. I (λ) < I0 (λ).
f (Hz) = 7,5.10 4.10 Hz
λ Hz I0(λ) I (λ)
Infrarouge vers les ondes Intensité lumineuse incidente Intensité lumineuse transmise
vers les ondes ultraviolet visible (I.R.) E.M.
E.M. (U.V.)
de forte énergie de faible énergie

400 nm 750 nm c
λ (nm) =
f l
Les radiations transmises (qui composent la couleur de l’objet telle longueur de la cuve
que notre œil la perçoit) sont complémentaires des radiations absorbées. I0
Le spectrophotomètre donne directement la valeur A = log , nommée
On admet en général « l’étoile des couleurs complémentaires » : deux I
couleurs complémentaires sont diamétralement opposées dans le absorbance ou ‘densité optique’ D.O.
diagramme ci-dessous :
750 nm I0
A = D.O. = log
rouge I
400 nm 630 nm Il existe des spectrophotomètres monofaisceau ou bifaisceaux
violet orangé (l’un des faisceau traverse une cuve contenant la solution de référence, ou
blanc (voir réalisation de mesures)).

450 nm jaune 580 nm Réalisation pratique de mesures : Pour réaliser une mesure à une
bleu
vert longueur d’onde donnée :
490 nm 545 nm  Régler la longueur d’onde du spectrophotomètre à la valeur souhaitée.
510 nm 530 nm  Remplir la cuve avec le solvant, la placer dans le spectro et « faire le
blanc » ou « le zéro » : régler l’absorbance à 0,000.
Remarques : Remarque : 2 types de cuves sont disponibles :
• Les transitions dans l’IR correspondent à des transitions entre - en verre de silice (quartz) : très coûteuses.
deux niveaux vibrationnels. - en polystyrène : ne pas nettoyer à l’acétone !
• Les transitions dans l’UV et visible correspondent à des - Remplir suffisamment la cuve, mais pas trop (jusqu’à 1/2 cm du haut
transitions entre deux niveaux électroniques. environ)

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- Essuyer soigneusement au papier Joseph les faces d’entrée et de
sortie des cuves.
- Ne pas poser les doigts sur ces faces !
- Vérifier que les faces d’entrée et de sortie ne sont ni rayées, ni
entachées de marques de doigts.
- Positionner correctement la cuve.
Faire un blanc sur le solvant : les absorbances étant additives, il faut
soustraire (faire un « blanc ») les valeurs qui ne nous intéressent pas dans
l’étude (la solution de référence est souvent le solvant, mais elle peut aussi
contenir d’autres espèces que l’on ne souhaite pas étudier, et dont on
soustrait donc l’absorbance) : placer du solvant dans une cuve, placer la
cuve dans le spectro, fermer le clapet du spectro et valider sur « blanc »
ou « zéro ». La mesure d’absorbance doit indiquer 0.000. Ce blanc, qui
doit être obligatoirement effectué à chaque valeur de la longueur d’onde,
est aussi justifié par la qualité spectrale de la lampe du spectro qui n’émet
pas la même intensité I0 à toutes les longueurs d’ondes.
 Vider la cuve, la rincer, puis la remplir avec la solution étudiée. Réaliser
la mesure sur la solution à étudier. Une valeur positive signifie que la
solution étudiée absorbe plus que le « blanc » à cette longueur d’onde.
remarques :
Bien rincer la cuve entre deux mesures. Commencer par l’étude
des solutions les plus diluées (elles fausseront moins les mesures sur les
solutions plus concentrées).
La remise à zéro de l’absorbance avec le solvant doit être
réalisée pour chaque nouvelle longueur d’onde λ, les coefficients
d’absorption molaire du solvant et du matériau de la cuve dépendant
aussi de λ. Si on dispose de deux cuves rigoureusement identiques, on
peut en réserver une pour le solvant, l’autre pour la solution.
4 Loi de Beer Lambert
4.1 Loi de Beer Lambert
Pour une concentration pas trop importante en espèce absorbante,
l’absorbance à une longueur d’onde donnée est proportionnelle à la
concentration du soluté :
A = D.O. = ελ. l .c
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I0
A :absorbance = log , aussi nommée ‘densité optique’ D.O..
I
Sans unité. I0 intensité lumineuse incidente, I intensité lumineuse
transmise.
l longueur de la cuve, exprimée souvent en cm.
-1
c concentration de l’espèce absorbante, souvent en mol.L .
ελ coefficient d’extinction molaire, qui dépend de la
longueur d’onde de travail (d’où un “spectre” de l’espèce colorée (évolution
-1 -1
de A en fonction de la longueur d’onde)); unité usuelle : L mol .cm .
L’absorbance A est une grandeur additive : si deux espèces B1 et
B2 absorbent à la longueur d’onde λ, alors l’absorbance de la solution de A
et B vaut :
A(solution contenant B1 et B2) = ελ(B1) l .cA + ελ(B2) l .cB =
l .[ελ(B1).cA + ελ(B2).cB] = A(B1) + A(B2)
4.2 Limites de la loi
loi de Beer Lambert
En pratique, les spectrophotomètres UV-visibles ne donnent pas de
valeurs précises de A pour A supérieure à 1 ou 2 : les photomultiplicateurs
ne sont pas précis pour des intensités 100 fois plus petites que l’intensité
incidente.
Si la solution est trop concentrée, l’absorbance ne sera plus
proportionnelle à la concentration (d’un point de vue microscopique et
imagé, si une molécule absorbante B’ se situe « derrière » une molécule B
ayant déjà absorbé un photon, B’ ne pourra pas absorber de photon, et ne
participera donc pas à l’absorbance de la solution).
Il faut donc toujours avant toute utilisation de la loi de Beer Lambert (pour
un suivi de cinétique par exemple) vérifier que le domaine d’étude
correspond à un domaine de validité de la loi de Beer Lambert.
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5 Vérification de la loi de Beer Lambert

Q5 : Pourquoi se place-t-on à λmax ?

• A-Première partie : spectre et recherche de λmax : Q6 : tracer sur papier millimétré le graphe A = f(c) pour λ = λmax. Quel est
le domaine de validité de la loi de Beer Lambert pour le permanganate de
-4 -1
But : Prendre le spectre d’une solution à 1,0.10 mol.L de permanganate potassium en solution aqueuse ?
de potassium.
Q7 : calculer le coefficient d’extinction molaire du permanganate de
Q1 : comment avez-vous réalisé la dilution ? Faire les calculs montrant potassium.
que l’on obtient bien la concentration prévue.
Q2 : Avant de faire le spectre d’absorption déterminer un odre de grandeur
de la valeur de λmax (longueur d’onde où l’absorbtion est maximale), à • C-Troisième partie :
l’aide de l’étoile des couleurs. But : Trouver un mode opératoire pour connaître la concentration
-3
Q3 : tracer le spectre d’absorption sur papier millimétré. (titre, échelles, (supposée inconnue) de la solution B de concentration environ 4.10
-1
…) ; quelle est la valeur maximale de l’absorbance de cette solution ? A mol.L .
quelle longueur d’onde (λmax) correspond-elle ?
Q8 : expliquer le mode opératoire et en déduire la concentration de la
Par la suite on ne travaillera plus qu’à λ = λmax solution inconnue. Faites ressortir clairement les valeurs expérimentales
que vous avez mesurées.
• B-Deuxième partie : droite étalon et limites : Réaliser les
dilutions :
-
c mol.L Volume fiole
solution 1 Vmère paillasses
jaugée
-3
S1 5,0.10 - mère
-4
8,0.10 50 mL
-4 Les 4 paillasses de
6,0.10 50 mL
-4 gauche
4,0.10 50 mL
-4
2,0.10 50 mL
-3
S2 1,0.10 mère
-5
8,0.10 100 mL
-5
6,0.10 100 mL Les 4 paillasses de droite
-5
4,0.10 100 mL
-5
2,0.10 100 mL
Pour chaque concentration, noter la valeur de l’absorbance pour λ = λmax.

Q4 : Rappeler la loi de Beer Lambert sans oublier de définir chacun de ses

termes (nom, les unités…).

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-1 -1
Epsilon ~ 2250 L.mol cm

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