Master : Biotechnologies Végétales pour l’amélioration des plantes

SYMBIOSE ACTINORHIZIENNE

Pr. Kaoutar TAHA

Équipe de Microbiologie et Biologie Moléculaire
 Introduction
La symbiose (du grec sun "avec" et bioō "vivre") est une association intime et durable entre deux
organismes vivants, hétérospécifiques (appartenant à des espèces différentes), et parfois plus de
deux. Les organismes sont qualifiés de symbiotes, ou, plus rarement symbiontes; le plus gros est
nommé hôte.

Une association biologique durable et réciproque entre deux ou plusieurs organismes vivants.
 Introduction
Une relation permanente entre deux organismes d'espèces différentes et qui se traduit par des effets
bénéfiques aussi bien pour l'un que pour l'autre.

l'ectosymbiose
le symbiote vit à la surface de l'hôte

Anémone de mer et le bernard-l’hermite

 Introduction

l'endosymbiose
Le symbiote est situé dans l'espace intercellulaire ou
intracellulaire (Intravacuolaire ou libre dans le
cytoplasme) de l’hôte.

Bactéries endophytes du riz (P.Hardoim 2011)

 La symbiose fixatrice d’azote (Rappel)

Plusieurs plantes ont développé des symbioses bénéfiques, elles ont la capacité unique de mettre en place une
symbiose avec les bactéries diazotrophes présentes naturellement dans le sol, qui convertissent l’azote de l’air (N2)
présent dans leur environnement en une forme intermédiaire, l’azote ammoniacal (NH3), grâce à une enzyme
bactérienne spécifique, la nitrogénase.
L’azote ainsi réduit sous forme de NH3 est ensuite assimilé par la plante, pour constituer ses molécules organiques,
notamment les protéines.

Cette symbiose naturelle permet à la plante d’utiliser

directement l’azote de l’air environnant pour sa croissance.
On parle de plantes fixatrices d’azote et de fixation
symbiotique de l’azote atmosphérique.

Modèle résumé de la fixation symbiotique de l'azote chez les légumineuses par les rhizobiums
(Lindström & Mousavi, 2019)
 La symbiose fixatrice d’azote (Rappel)

La phylogénie moléculaire des groupes de plantes qui

effectuent des symbioses fixatrices d’azote montre qu'ils
appartiennent tous à une seule lignée, le clade Fabid, et
suggèrent un ancêtre commun avec une prédisposition à la
nodulation.

Arbre phylogénétique des huit familles actinorhiziennes et de la famille des légumineuses qui forment
des symbioses de nodules racinaires, toutes appartenant au clade Fabid (Perrine-Walker et al., 2011)
Familles de plantes participantes à l'endosymbiose intracellulaire (A) et l'évolution des associations symbiotiques mutualistes : un scénario
possible (B)(modifié de Martin et al., 2017); a, associations de type mycorhize arbusculaire et/ou mucoromycotine ; b, mycorhizes arbusculaires;
c, ectomycorhize; d, mycorhizes arbusculaires; e, Frankia N-fixation; f, fixation de N rhizobien (Wei Dong and Yuguang Song, 2020).
Plantes actinorhiziennes
Les plantes susceptibles d'établir une symbiose fixatrice d'azote avec l'actinomycète Frankia.

Cette aptitude à fixer symbiotiquement l'azote

Frankia-plantes actinorhiziennes
atmosphérique a permis à ces végétaux de se développer
sur des sols pauvres et de servir souvent de plantes ≈ Fixation de l’azote (N2)
pionnières permettant l'installation d'autres communautés Rhizobium-légumineuses
de végétaux.
 Quantité d’azote fixée par les PA

PFN (potentiel fixateur d’azote) FNR (fixation d’azote réelle)

La quantité d’azote maximale qu'un système La quantité d’azote fixée dans un système qui
donné est capable de fixer. n’a pas été optimisé.

• La FNR est toujours inférieure au PFN.

• L'expression du PFN est limitée par des contraintes climatiques ou édaphiques, une mauvaise gestion, l'absence
ou l'insuffisance d'irrigation ou de fertilisation, des attaques de pathogènes et ennemis divers, l'âge des plantes
(la fixation augmente pendant les premières années, puis tend à diminuer après un laps de temps variable de 10
à 20 ans à la suite de divers processus, dont l'accumulation d’azote disponible dans le sol),….
 Symbiose actinorhizienne
C’est une symbiose fixatrice d’azote moléculaire. Les bactéries
responsables de cette symbiose sont du genre Frankia (famille des
Frankiaceae).
Ces bactéries ont une morphologie typique des actinobactéries avec
des hyphes ramifiées et segmentées, des sporanges multiloculaires et,
en plus et d’une façon exclusive, des vésicules où la nitrogénase est
synthétisée (diazovésicules).
Ce sont des bactéries qui fixent l’azote en symbiose avec un large
spectre de plantes dicotylédones, appelées plantes actinorhiziennes.
Règne Bacteria
Embranchement Actinobacteria
Ordre Frankiales
Symbioses actinorhiziennes, a: Discaria chacaye (arbustes poussant le long d'une rivière
Sous-ordre Frankineae dans nord-ouest de la Patagonie), b: pousse de Discaria trinervis avec fruits mures, c: nodule
multilobé, Discaria trinervis maturenodule en coupe longitudinal emontrant centrale
Famille Frankiaceae caractéristique tissu vasculaire (vt), méristème apical (m) et cellules infectées pleines des
grappes de vésicules colorées en bleu, e: culture liquide de Frankia souche DcI45 isolée à
Genre Frankia partir de nodules racinaires de Discaria chacaye ; f: Souche de Frankia DaI1 isolée de Dicsaria
articulata montrant des hyphes caractéristiques (E.E. Chaia et al., 2010).
 Plantes actinorhiziennes
Sur le plan fondamental, l’intérêt des plantes actinorhiziennes s’est développé considérablement
lorsque Callaham et col. (1978) ont parvenu pour la première fois à isoler Frankia à partir d’un
nodule de Comptonia peregrina et le cultiver in vitro (souche CpI1).

1-9 Photographies et photomicrographies de jeunes nodules racinaires en

Comptonia peregrin (L.), Czechia, Arboretum Kostelec nad Černými Lesy (6 October 2013) Comptonia peregrina.Kitty Kohout.Robert W. Freckmann
Herbarium University of Wisconsin at Stevens développement sur des semis de Comptonia peregrina cultivés en culture
Point.wisplants.uwisp.edu (Accessed 5/2014). aéroponique. I. Nodule sur la racine latérale du semis 22 jours après
l'inoculation (B. Bowes et al.,1977)
Classification et distribution géographique des PA
Les plantes actinorhiziennes sont des Angiospermes Dicotylédones réparties en 7 ordres, 8 familles, 25
genres et plus de 250 espèces . De ce nombre, toutes sont des arbres et arbustes, exception faite de
Datisca, qui possède des racines ligneuses, mais des parties aériennes herbacées.
Ces plantes poussent dans différentes régions du monde, sous différents climats, dans différents types de
sols et à des altitudes variables. Cette capacité d’adaptation a entraîné l'exportation de certains genres hors
de leurs zones de répartition naturelles.

Datisca glomerataa
 Classification et distribution géographique des PA
Dans les régions tropicales arides et semi-arides, les arbres actinorhiziens de la famille des Casuarinaceae sont
très utilisés pour réhabiliter les sols dégradés, protéger les zones côtières, les cultures de l’ensablement, et
pour fournir du bois de chauffe.
Genus : Casuarina
Species : Casuarina sp. L.

Casuarina africana Lour.

Casuarina brunoniana Miq.
Casuarina equisetifolia subsp. equisetifolia
Casuarina equisetifolia var. souderi Fosberg
Casuarina excelsa Dehnh. ex Miq.
Casuarina indica Pers.
Casuarina lateriflora Poir.
Casuarina littorea Oken
Casuarina littorea var. souderi (Fosberg)
Casuarina mertensiana Rupr. ex Miq.
Casuarina repens Hoffmanns.
Casuarina sparsa Tausch
Casuarina truncata Willd.
Sous-classe Famille Genre Nombre Distribution native
d'espèces
Hamamélidées Casuarinacées Allocasuarina 54 Australie
Casuarina 16 Australie, Asie tropicale, Pacifique Sud-O.
Gymnostoma 20 Australie, N.-Calédonie, Sumatra
Ceuthostoma 2 Océanie

Hamamélidées Betulacées Alnus 47 Europe, Asie, Amérique du Nord, Andes, Maroc

Hamamélidées Myricacées Comptonia 1 Amérique du Nord

Myrica 28 Partout, sauf 1'Australie

Magnoliidées Coriariacées Coriaria 16 Méditerranée, Asie, N. Zélande, Amérique du Nord

Dilléniidées Datiscacées Datisca 2 Asie, Amérique du Nord, Europe

Rosidées Elaeagnacées Elaeagnus 35 Europe, Asie, A. du Nord

Hippophaë 2 Europe, Asie
Shepherdia 2 Amérique du Nord

Rosidées Rhamnacées Ceanothus 31 Amérique du Nord

Colletia 4 Amérique du Sud
Discaria 5 Amérique du Sud, Australie, N. Zélande
Kentrothamnus 2 Amérique du Sud
Retanilla 2 Amérique du Sud (Chili)
Talguenea 1 Amérique du Sud
Trevoa 2 Amérique du Sud

Rosidées Rosacées Cercocarpus 4 Mexique, Etats-Unis du Sud-ouest

Chamaebatia 1 Sierra Nevada (montagnes)
Cowania 1 Mexique, Etats-Unis du Sud-ouest
Dryas 1 Arctique
Purshia 2 Amérique du Nord-ouest
Rubus 2 Hémisphère nord
Les Casuarinacées
Classification
Les Casuarinacées se distinguent par leurs feuilles caractéristiques qui sont réduites à de petites dents
disposées sur des rameaux photosynthétiques caduques ayant l’aspect d’aiguilles relativement semblables
à celles des Gymnospermes. Ces rameaux ressemblent au plumage d’un genre d’oiseau appelé Casuarius,
d’où le nom de Casuarina.
 Les Casuarinacées
Classification

La famille des Casuarinacées est une famille de

plantes dicotylédones comprenant 90-100 espèces
d'arbres ou d'arbustes réparties en 4 genres:
Casuarina, Allocasuarina, Ceuthostoma, et Gymnostoma

Genre Casuarina: comprend 16 espèces qui poussent

naturellement en Australie, dans le sud-est asiatique
ainsi que dans les îles du Pacifique. Ce sont des
espèces arborées pouvant atteindre jusqu'à 30 m de C. equisitifolia
hauteur. Compte tenu de leurs excellentes
performances dans différentes régions du monde, C.
equisitifolia, C. Junghumiana, C. cunninghamiana et
C. glauca sont les quatre espèces les plus utilisées
hors de leur aire géographique d'origine. C. Junghumiana
 Les Casuarinacées
Classification

Genre Allocasuarina: ce genre comprend 54 espèces d'arbres et d'arbustes qui

sont originaires pour la plupart d'Australie et poussent dans des écosystèmes
variés allant de la forêt tropicale humide aux déserts de l'Australie centrale.

Allocasuarina verticillata

Un nodule racinaire fixateur d'azote sur Allocasuarina

verticillat, devoloppé en symbiose actinorhizienne avec
Allocasuarina humilis la bactérie actinomycete du sol du genre Frankia
 Les Casuarinacées
Classification

Genre Gymnostoma: C'est le genre le plus

archaïque de la famille des Casuarinacées, il
comprend 20 espèces généralement arborescentes
et poussant dans des régions tropicales humides,
en particulier dans les îles du sud-ouest de l'océan
pacifique.
Un seul représentant existe en Australie (G.
australianum).

Gymnostoma australianum Gymnostoma deplancheanum

 Les Casuarinacées
Classification
Genre Ceuthostoma: ce genre ne comprend que 2 espèces
originaires de Palawan (Philippines) et de Nouvelle Guinée. C'est
le seul genre qui ne soit pas représenté en Australie

• Ceuthostoma palawanense
• Ceuthostoma terminale

Ceuthostoma terminale
 Symbiose actinorhizienne

Les plantes actinorhiziennes constituent, après les légumineuses, le deuxième groupe de plantes capables
de fixer biologiquement l'azote atmosphérique

 Une large répartition taxonomique

 La structure du nodule actinorhizien (ou actinorhize) qui s'apparente à celle d'une racine adventive
induite en réponse aux signaux émis par le microorganisme Frankia
 La bacterie Frankia
Si le rôle écologique des plantes actinorhiziennes est connu depuis longtemps, ce n’est qu’en 1978 qu’une culture
pure de Frankia a été isolée à partir de nodules d’une plante actinorhizienne, Comptonia peregrina (Callaham et al.,
1978).
Le premier isolement du symbiote de Casuarina date de 1982.

La cause de la difficulté d’isoler Frankia pourrait s’expliquer par l’existence

probable de certains obstacles non encore élucidés ou sujette à des hypothèses :
 Présence dans les extraits de nodules, de composés inhibiteurs de la
croissance du Frankia,
 Absence de milieux efficaces d’isolement et de culture,
 Lenteur de la croissance de Frankia et l’intervention des contaminants
pendant les tentatives de son isolement,
 Difficulté pour le microorganisme de passer d’un état symbiotique à un état Aspect morphologique de la bactérie Frankia en culture pure
saprophytique.
 La bacterie Frankia
Pour remédier au problème de contamination, il est recommandé de ne pas isoler à partir de nodules
prélevés au champ car ils sont très contaminés mais d’utiliser des nodules jeunes obtenus in vitro en inoculant
la plante hôte cultivée stérilement en culture hydroponique avec un broyat de jeunes nodules récoltés au
champ et préalablement stérilisés en surface.

La stérilisation de surface est délicate, car les cellules renfermant l’endophyte fixateur d’azote ne sont pas
situées à l’intérieur du nodule, comme chez les légumineuses, mais sont proches de la surface.
Pour éviter de tuer les Frankia, il faut donc que l’agent stérilisant ne pénètre pas trop profondément dans
les tissus de nodule (Le tétroxyde d’osmium répond à cette exigence tout en étant très efficace).
 A B C
I : zone méristématique
II : zone d'infection
II-III : interzone II-III
IV : zone de sénescence

Structure des nodules de légumineuses et des plantes actinorhiziennes. A : Nodule de Légumineuse de type indéterminé. B : Nodule de
Légumineuse de type déterminé. C : Lobe nodulaire actinorhizien.(Pawlowski et Bisseling, 1996)
 La bacterie Frankia
Isolement de Frankia à partir du sol

Frankia est une bactérie de sol présente dans différents habitats. En 1984, Baker & O’Keefe (1984)
sont les premiers à isoler cette bactérie du sol, ils ont utilisé un sol associé à Cercocarpus, Ceanothus, Casuarina
et à Myrica.
• Des suspensions de chaque sol ont été préparées et réparties dans un milieu minimum, avec un gradient de
sucrose.
• Frankia fixatrice de N2 a été isolé seulement à partir de la rhizosphèrique de Cercocarpus montanus, mais
malheureusement son pouvoir infective n’a pas été démontré par Baker & O’Keefe (1984).
 La bacterie Frankia
Isolement de Frankia

Il existe plusieurs méthodes d’isolement, mais la moins coûteuse et la plus efficace consiste, après stérilisation, à
couper les lobes des nodules en petits fragments et de les déposer sur un milieu de culture gélosé. Les premières
microcolonies apparaissent au bout d’un temps variable entre une semaine à trois mois.

Dans certains cas, la souche isolée peut être incapable de noduler la plante hôte d’origine mais nodule un autre
hôte; ces souches sont appelées souches atypiques.
On décrit ces souches sous les termes de «souches Nod- sur l’hôte d’origine» et «souches Nod+ sur un autre
hôte».
 La bacterie Frankia
Isolement de Frankia (Exigences nutritionnelles)

Les souches de Frankia présentent une grande diversité en ce qui concerne les substrats carbonés.
 Les souches nodulant Alnus poussent bien sur les acides gras à chaînes carbonées courtes (acétate, propionate),
de façon variable sur succinate, malate, Tween 80, pyruvate et pratiquement pas sur les sucres.
 Les espèces génomiques qui infectent les Elaeagnacees et les Casuarinacees poussent aussi bien sur les sucres que
sur les acides gras.
Le propionate est la source de carbone la plus utilisée pour la culture de Frankia.

 Les Frankia peuvent utiliser les sources d’azote variées; acides aminés, urée, nitrate, ammoniaque et N2.
 Toutes les souches de Frankia connues actuellement n’exigent pas de facteurs de croissance particuliers (=
prototrophes ≠ auxotrophes) et peuvent donc être cultivées sur un milieu minimal.
 Les souches de Frankia sont, en général, aérobies; mais certaines d’entre elles ont une tendance à la microaérophilie
 La bacterie Frankia
Isolement de Frankia (Milieux de cultures)

Les milieux habituellement utilisés pour cultiver Frankia sont de deux types:
- Milieu complexe contenant des substances organiques par ex. peptone, extrait de levure, très favorables à la
préservation de ce microorganisme (milieu Qmod);
- Milieu minéral contenant le chlorure d’ammonium comme source d’azote et le propionate de sodium comme source de
carbone (milieu BAP).
 Parmi les vitamines, seule la biotine paraît avoir un effet stimulant significatif.
 L’addition des substances telles que Tween 80, la lécithine ou le charbon actif au milieu de base peut améliorer la
croissance de Frankia.
 Le plus souvent Frankia est cultivé en milieu liquide avec du propionate comme source de carbone.
 Certaines souches peuvent aussi être cultivées sur milieu gélosé. Des colonies à partir d'une seule spore ont pu être
obtenues.
 Frankia préfère un pH neutre ou alcalin (Certaines souches poussent à des pH élevés qui peuvent atteindre 9,5).
Isolement de Frankia (Milieux de cultures)
Composition du milieu BAP (Murry et al., 1984) pour un litre de solution

Produit chimique Quantité Produit chimique Quantité

(en mg) (en µg)
Macroéléments Vitamines BAP

MgSO4, 7 H2O 50 Thiamine HCl 10

CaCl2, 2 H2O 10 Pyridoxine Monohydrochloride 50
Propionate de Na 480 Acide folique 10
NH4Cl 267 Acide nicotinique 50
Biotine 225
Oligo-éléments Pantothénate de Ca 10
Riboflavine 10
H3BO3 2,680
MnCl2, 4 H2O 1,810 Solution tampon 10 ml
ZnSO4, 7 H2O 0,220
CuSO4, 5 H2O 0,080 On la prépare en mélangeant :
Na2MoO4, 2 H2O 0,025 560 ml de KH2PO4 à 136,09 g/l
CoSO4, 7 H2O 0,001 avec 320 ml de K2HPO4 à 174,18 g/l et on ajuste
FeNaEDTA 10 le pH à 6,7 à l’aide des deux solutions
Isolement de Frankia (Milieux de cultures)
Composition du milieu Qmod (Lalonde et Calvert, 1979)

Composants Concentration (g/l d’eau distillée)

K2HPO4 0,3
NaH2PO4 0,2
MgSO4, 7 H2O 0,2
KCl 0,2
Extrait de levure 0,5
Peptone 5
Glucose 10
Solution de L-α -lécithine de Soja 1 ml
Solution d’oligoéléments 1ml
Le milieu est ajusté à pH 6,8 - 7
_____________________________________ _____________________________
Solution d’Oligo-éléments : (g par litre)
H3BO3 1,5
Mn SO4, 7 H2O 0,8
ZnSO4, 7 H2O 0,6
CuSO4, 7 H2O 0,1
(NH4)Mo7O24, 4 H2O 0,2
CoSO4, 7 H2O 0,01
 Cinétique de la croissance
Le temps de génération est de 15-24 h, parfois plus (20 mn pour E. coli et 4h pour Rhizobium).
Il varie considérablement en fonction des conditions de culture. Ainsi, la croissance de la souche Casuarina-
compatible Br est très nettement améliorée après une agitation modérée et l’adjonction au milieu de
phosphatidylcholines.
La cinétique de croissance de Frankia comporte une phase de latence plus ou moins longue, suivie d’une phase
exponentielle de courte durée (2-4 jours), puis d’une phase stationnaire et d’une longue phase de déclin au cours de
laquelle les phénomènes de lyse prédominent.

Courbe de la croissance de la
souche de Frankia Br obtenue
sans agitation ou avec agitation
(200 tpm). La biomasse est
exprimée en µg de protéines
/ml.
 La bacterie Frankia
Morphologie de Frankia

En culture pure et dans un milieu liquide les Frankia

apparaissent sous forme de colonies hyphales ovoïdes ou
circulaires, organisés en amas floconneux, formant des
microcolonies ovoides de 100 à 2000 µm de diamètre qui
sédimentent sous forme d’un amas cotonneux.

Certaines souches sont non pigmentées et d’autres

produisent des pigments solubles jaunes, orangés, rouges
ou noirs.

Sur milieu solide, les Frankia croissent sous forme de

colonies en étoile de mer ou diffuses avec un réseau lâche
d’hyphes plus ou moins lâche à croissance radiale; la partie
centrale est constituée par un conglomérat d’hyphes,
sporanges et vésicules enrobés de mucilage.
Morphologie de Frankia : a,b) Morphologie type de Frankia, c) Sporange Mutiloculaire au microscope
électronique, d) Vésicule de Frankia observé au microscope électronique, e) Les structures de Frankia
(H : Hyphe, V : vésicule et S :sporange) (Groupe de Frankineae, MBA) (Nouioui 2014)
 La bacterie Frankia
Morphologie de Frankia

Les colonies de Frankia ont été séparées en trois types de cellules distinctes: hyphes, vésicules et des
sporanges multiloculaires renfermant des spores non mobiles).

Frankia isolée à partir des nodositées de Casuarina cunninghamiana

 La bacterie Frankia
Morphologie de Frankia

- Les hyphes, sont des structures filamenteuses septées, ramifiées,

de 0,5 à 1 µm de diamètre et souvent entremêlées en pelotes. Ce
sont des cellules végétatives qui constituent la structure principale
dans les conditions nutritionnelles non limitantes. Elles représentent
aussi les formes de croissance les plus actives qui aboutissent à la
constitution d'un mycelium typique des Actinomycètes.

Frankia isolée à partir des nodositées de

Casuarina cunninghamiana
 La bacterie Frankia
Morphologie de Frankia
Les vésicules (ou diazovésicules), produites en l'absence d'une source
assimilable d'azote minéral ou organique, sont des structures sphériques
d'un diamètre de 2 à 6 µm se forment à l'extrémité ou sur de courtes
branches latérales des hyphes.
- Ces structures sont spécialisées dans la fixation de l'azote
atmosphérique puisqu'elles renferment la nitrogénase, l'enzyme
responsable de la réduction de l'azote moléculaire en ammonium.
- Les vésicules sont entourées d'une paroi épaissie ayant une
concentration très importante en lipides. Cette structure lipidique
constitue un frein à la diffusion de l'oxygène qui inhibe la synthèse de la
Frankia isolée à partir des nodositées
nitrogénase ou l'inactive de façon irrémédiable. de Casuarina cunninghamiana
 La bacterie Frankia
Morphologie de Frankia

Les sporanges, situés en général à l'extrémité des hyphes mais aussi en

position intercalaire, sont produits dans des conditions de carence azotée ou
dans des milieux minéraux contenant certains acides aminés tels que l'alanine,
la phénylalanine, l'arginine et la valine. Ces structures de résistance ont une
taille et une forme variables; elles peuvent être allongées et filiformes,
allongées et élargies à leur extrémité ou trapues et en forme de massue (10 à
50 µm de diamètre). Les sporanges mûrs sont subdivisés en compartiments qui
contiennent des spores de 1,5 à 2,5 µm de diamètre.
Frankia isolée à partir des nodositées de
Casuarina cunninghamiana
 La bacterie Frankia
Morphologie de Frankia

- Les hyphes toruleux reproducteurs, produits dans des

milieux défavorables par certaines souches de Frankia isolées
de Casuarina et d'Alnus, constituent une autre forme de
résistance.
Ces hyphes appelés "reproductive torulose hypha" (RTH) résultent
de la transformation des hyphes normaux par élargissement puis
segmentation en cellules individuelles (par la formation de septa)
et apparaissent ensuite comme des longues chaînes de cellules
courtes rectangulaires connectées les unes aux autres.
 Ces cellules peuvent se séparer et produire chacune des
excroissances hyphales et par la suite des microcolonies plus
l’hyphe toruleux de Frankia alni ACN14a, Bernèche
rapidement que ne le font les spores. D’Amours (2012)
Effet de la prolifération de vésicules
sur la différenciation en hyphes
toruleux chez Frankia alni ACN14a.
(A) BAPS sans NH4Cl pH 6,7 incubé
2 semaines, (B) BAPS sans NH4Cl 50
mM KH2PO4 pH 5,8-5,9 incubé 2
semaines, (C) BAPS sans NH4Cl pH
6,7 incubé 2 semaines et transférés
dans du BAPS sans NH4Cl 50 mM
KH2PO4 pH 5,8-5,9 incubé 2
semaines, (D) BAPS 50 mM KH2PO4
pH 5,8-5,9 incubé 2 semaines et
transférés dans du BAPS sans azote
50 mM KH2PO4 incubé 2 semaines.
Les flèches pointent les vésicules et
les losanges pointent les cellules
différenciées en RTH. Observé avec
un grossissement de 1000X (Lafond-
Lambert, 2014).
 La bacterie Frankia
Morphologie de Frankia

Ce sont des Procaryotes caractérisés par:

- La présence au niveau de la paroi d'un peptidoglycane,

- L'absence de chitine ou de cellulose,
- La sensibilité à certains antibiotiques antibactériens,
- La résistance aux antibiotiques antifongiques
- Le diamètre de leurs hyphes est de l’ordre de 0,5 à 1 µm,
soit approximativement un dixième de celui de la plupart
des hyphes fongiques.
Micrographie électronique à balayage de la souche Frankia coriariae BMG5.1T
cultivée pendant 4 semaines à 28°C sur milieu BAP liquide. Structures
cellulaires : h, hyphes ; v, vésicule. Aucun sporange n'a été détecté. Barre, 1 µm
( Nouioui et al. 2017).
 La bacterie Frankia
Caractères généraux

Les Frankia forment un groupe homogène qui se différencie très nettement des autres actinomycètes par les
caractères suivants :

 Son pouvoir infectif vis-à-vis des plantes actinorhiziennes.

 Sa morphologie (hyphes, vésicules, sporanges multiloculaires renfermant des spores non mobiles).
 La nature chimique de sa paroi cellulaire (paroi de type III, c'est-à-dire renfermant l’acide meso-
diaminopimélique, alanine, acide glutamique, acide muramique et glucosamine).

Cependant, ce regroupement n’est pas strict du fait que les souches présentent différents degrés de spécificité
vis à vis des plantes hôtes allant d'une spécificité stricte (souches d'Alnus rubra), à une spécificité relative
(souches des Elaeagnaceae) ou à une absence totale de spécificité (souches des Myrica).
 La bacterie Frankia
Classification

Morphologiquement, la formation de sporanges multiloculaires et des vésicules, lieu de synthèse de la

nitrogénase, distingue le genre Frankia des autres actinomycètes.

Ce sont les critères génétiques et plus particulièrement l’analyse de l'ARNr 16S qui ont permis de mieux définir
les relations existant entre le genre Frankia et les autres genres des actinomycètes.

Les gènes nifK, nifD et nifH responsables de l'enzyme nitrogénase ont été clonées et séquencé à partir de Frankia

La spécificité d’hôte est l’un des critères les plus étudiés et qui a permis de grandes avancées dans la taxonomie des
microorganismes pathogènes et symbiotiques. Les tests d'inoculation croisée de Baker (1987) portant sur 50 cultures
pures de Frankia, disponibles dans les différentes collections internationales, ont permis de définir quatre groupes
d’infectivité;

(i) souches infectives des Alnus, Comptonia et des Myrica,

(ii) souches infectives des Casuarina et des Myrica,
(iii) souches infectives des Elaeagnus et des Myrica,
(iv) souches infectives seulement sur l’Elaeagnus.
La bacterie Frankia
Chimiotaxonomie: Quelques caractéristiques phénotypiques et chimiotaxonomiques distinguant les espèces du genre Frankia
Espèces de Frankia
F. coriariae F. alni F. casuarinae F. elaeagni F. inefficax
Caractéristiques
BMG5.1T DSM 45986T DSM 45818T DSM 46783T DSM 45817T
Couleur de colonie Marron Blanche Blanche Rouge Blanche
Métabolisme de la source de carbone
d-glucose 6-phosphate − + − + +
d-fructose 6-phosphate + + − + +
Acide α-hydroxybutyrique + − + − −
Acide β-hydroxybutyrique − − − + −
Acide α-cétobutyrique − − + + −
Acide acétoacétique + − + − −
Pyruvate de méthyle + + + − −
Acide l-lactique + − − + −
Acide malique − + − − −
Acide citrique + − − − +
Acide bromosuccinique − − − − +
Acide p-hydroxyphénylacétique + − + − −
Acide α-cétoglutarique + − − − +
Croissance en présence de:
Acide acétique + − + + −
Lactate de sodium (1%) + + + − +
Alnus viridis,
Origine de la plante hôte Coriaria japonica Casuarina cunninghamiana Elaeagnus angustifolia Elaeagnus umbelata
Crispa
Coriariaceae, Casuarinaceae (excepté Elaeagnaceae, Elaeagnaceae,
Spectre de plantes hôtes Alnus, Myricaceae
Datiscaceae Gymnostoma), Myricaceae Myricaceae Myricaceae
Teneur génomique en G + C (% molaire) 71.2  72.8 70.1 71.7 72.3
Numéro d'accession GenBank de la séquence du génome JWIO00000000 CT573213 CP000249 ARFH00000000 CP002299
 La bacterie Frankia
Génome et génétique

L’ADN des souches de Frankia est caractérisé par un pourcentage élevé de G+C similaire aux actinobactéries, compris
entre 66 et 72 % et la taille du génome varie de 8,7 à 12. 106 pb, et des plasmides, dont la taille est comprise entre 7 à
190 kb.

L’analyse de génome par séquençage total de trois souches de Frankia a montré la présence d’un seul gène de
nodulation similaire à ceux de Rhizobium (Normand et al, 2007), mais avec une similarité très faible.

Un nombre très restreint de gènes a pu être détecté par hybridation hétérologue sur le génome de Frankia.
Parmi des gènes impliqués dans la symbiose, on peut citer les gènes codant la nitrogénase (nif), l’hydrogénase
d'absorption (hup) et le squalène hopane cyclase (SHC) (biosynthèse de bactériohopane).
Phylogénie moléculaire de Frankia, chronogramme et phylogénie moléculaire des plantes actinorhiziennes, montrant leurs relations symbiotique,
Benson and Dawson (2007), van Velzen et al. (2019), Ardley and Sprent (2020).
 Espèces actinorhiziennes au sein des Fagales sont
infectés a travers la courbure des poils absorbants.

 La léghémoglobine ne se trouve que dans les nodules

de Casuarina et Allocasuarina.

Benson and Dawson (2007), van Velzen et al. (2019), Ardley and Sprent (2020).
Seulement quelques souches de Frankia appartenant au groupe 2
contiennent homologues des gènes nod rhizobiens, nécessaires
au dialogue moléculaire qui initie des relations symbiotiques
entre légumineuses et rhizobiums.

Benson and Dawson (2007), van Velzen

et al. (2019), Ardley and Sprent (2020).
Symbiose actinorhizienne
Séance II
Symbiose actinorhizienne
L’infection
La pénétration du symbiote se fait par deux mécanismes, soit par l'intermédiaire de poils racinaires
déformés (cas des Bétulacées (Alnus)), des Casuarinacées et des Myricacées (Comptonia et Myrica), soit par
les espaces intercellulaires (cas des Elaeagnacées, des Rhamnacées et des Rosacées).

Les Bétulacées (Alnus), les Les Elaeagnacées, les

Casuarinacées et les Myricacées Rhamnacées et les Rosacées
(Comptonia et Myrica)
 Symbiose actinorhizienne
L’infection
Infection intracellulaire (par les poils absorbants)
L’hyphe infectieux pénètre dans le poil absorbant où il est entouré
par le plasmalemme de l’hôte et par une capsule constituée de
cellulose, d’hémicellulose et de pectine.
En même temps, à proximité du poil absorbant qui vient d’être
infecté, les cellules du cortex se divisent activement pour former
une région appelée prénodule (p).
Le prénodule provoque un léger gonflement de la racine qui
précède l’initiation du primordium du lobe nodulaire (LN) ou
méristème nodulaire. Après avoir traversé le poil absorbant, les
hyphes encapsulés de Frankia pénètrent dans les tissus du
prénodule dont les cellules sont hypertrophiées et passent de
cellule en cellule, puis envahissent les cellules du lobe nodulaire.
 Symbiose actinorhizienne
L’infection
Infection intracellulaire (par les poils absorbants)

Chez les Bétulacées (Alnus), les Casuarinacées et les Myricacées (Comptonia et Myrica), l’infection et
l’ontogenèse nodulaire se déroulent en six étapes :
 pénétration du Frankia au niveau d’un poil absorbant ;
 progression des hyphes de Frankia dans le cortex racinaire par voie intracellulaire ;
 prolifération en amont des hyphes de cellules du cortex donnant naissance à un renflement appelé
prénodule ;
 infection des cellules du prénodule ;
 initiation à partir des cellules du péricycle d’un primordium nodulaire ;
 croissance du primordium et infection du cortex nodulaire à partir de Frankia présent dans le prénodule.
 Symbiose actinorhizienne
L’infection
Infection intercellulaire

Ce mode d’infection n’est pas liée à l’absence de poils absorbants.

Frankia pénètre par la lamelle moyenne des cellules du rhizoderme et
progresse à travers le cortex racinaire en empruntant les espaces
intercellulaires.
Simultanément un primordium de lobe nodulaire est initié dans le
péricycle, mais il y’a pas de formation de prénodule. L’infection de la racine
se poursuit par la progression intercellulaire des hyphes vers le lobe
nodulaire qui s’est différencié également à partir des cellules du péricycle
opposées au pôle du protoxylème.
L’invasion de Frankia dans le lobe nodulaire est intercellulaire et reste
localisée, comme dans l’infection intracellulaire, au parenchyme cortical
du lobe nodulaire.
 Symbiose actinorhizienne
L’infection
Infection intercellulaire

Chez les Elaeagnacées, les Rhamnacées et les Rosacées, l’infection et l’ontogenèse nodulaire se
déroulent en 4 étapes :

 pénétration du Frankia par des espaces intercellulaires du rhizoderme ;

 progression des hyphes de Frankia dans le cortex racinaire par voie intercellulaire ;
 initiation à partir des cellules du péricycle d’un primordium nodulaire ;
 croissance du primordium et invasion du cortex du lobe nodulaire par Frankia.
Symbiose actinorhizienne
L’infection

Quel que soit la nature d’infection, le nodule lui-même se développe de la même manière
qu’une racine latérale.

• Un primordium du lobe nodulaire est initié dans le péricycle en réponse à des signaux émis
par les hyphes de Frankia.
• Les primordia ont une structure de racine et se développent à une certaine distance du
prénodule; ils croissent en traversant les régions du cortex de la racine qui ne sont pas
encore infectées.
• La croissance du lobe est assuré par un méristème qui se trouve en position apicale.
 Symbiose actinorhizienne

L’établissement de la symbiose implique le développement d’un

nouvel organe, l’actinorhize ou nodule actinorhizien, qui est le
site de la fixation d’azote atmosphérique par le microsymbiote.

A) Échange de signaux entre la plante actinorhizienne et la

bactérie Frankia qui mène à l’infection du poil racinaire;

B) Frankia pénètre un poil déformé et induit des divisions dans

les cellules corticales;

Différentes étapes du développement du nodule symbiotique chez Casuarina

glauca (d’après Péret et al., 2007)
 Symbiose actinorhizienne
C) Les cellules corticales en division sont infectées par les
hyphes de Frankia et s’hypertrophient entraînant la formation
du prénodule. En même temps, des divisions cellulaires s’initient
au niveau du péricycle en face d’un pôle de xylème formant ainsi
le primordium nodulaire.

D) Les hyphes de Frankia progressent à partir du prénodule,

prolifèrent dans les cellules corticales de la racine et envahissent
le jeune lobe nodulaire.

E) Le nodule mature montre une structure de racine latérale

modifiée.

Différentes étapes du développement du nodule symbiotique chez

Casuarina glauca (d’après Péret et al., 2007)
Symbiose actinorhizienne
Comparaison avec le nodule rhizobien

 Le nodule actinorhizien, appelé également actinorhize est formé sur le système racinaire de
la plante après un processus complexe d’interactions cellulaires et moléculaires entre la
plante-hôte et Frankia.

 Contrairement au nodule des légumineuses qui est un organe nouveau, l’actinorhize

s’apparente, par son origine et sa structure, à une racine adventive modifiée
Symbiose actinorhizienne
Comparaison avec le nodule rhizobien
La structure du nodule actinorhizien diffère considérablement de celle des nodules des légumineuses.
Chez ces dernières, la zone infectée est située au centre du nodule (ic); elle est enfermée dans un
endoderme et une couche corticale interne tandis que les tissus vasculaires (vt) sont disposés à la périphérie
du nodule.
Par contre, dans les nodules actinorhiziens, les tissus vasculaires sont normalement au centre du nodule et
les tissus infectés sont localisés à la périphérie. En général, le nodule actiorhizien comporte un méristème
nodulaire (nm).

Nodule actinorhizien Nodule rhizobien

 Symbiose actinorhizienne
Gènes impliqués dans la mise en place de la symbiose actinorhizienne chez Casuarina
Dans la symbiose rhizobienne, la chaîne
moléculaire d’événements intervenant dans son
établissement est bien connue:
• une émission de signaux flavonoïdes,
• expression du gène nod de la bactérie,
• sécrétion du facteur Nod,
• déclenchement chez la plante de la
déformation des poils absorbants et de la
division des cellules corticales racinaires.
Dans le cas de la symbiose actinorhizienne, les mécanismes
moléculaires de la formation de l’actinorhize ne sont pas
encore bien connus.
Les gènes de plantes exprimés de manière spécifique en
réponse à l’infection par Frankia sont appelés gènes de
nodulines actinorhiziennes par homologie aux nodulines
des Légumineuses. On distingue des nodulines précoces
exprimées pendant les premières phases de l’infection, et
des nodulines tardives impliquées dans le fonctionnement
du nodule.
Le développement du nodule actinorizien ne se produit qu’en situation de carence azotée.

Les racines émettent des signaux qui sont perçus par Frankia. Par analogie avec les légumineuses, les flavonoïdes sont
suspectés jouer ce rôle de signalisation.

En effet, les flavonoïdes pourraient effectivement intervenir pour affecter la nodulation, puisqu’on a montré que des
composés ressemblants à des flavonoïdes extraits des graines d’Alnus pouvaient soit stimuler soit réduire la nodulation.

En présence des cultures de Frankia, les poils absorbants de plusieurs plantes actinorhiziennes se déforment. Un test
biologique a été mis au point pour déceler si les flavonoïdes sont impliquées dans le cas de la symbiose Casuarina-Frankia.
Le test proposé consiste à :
1) préparer un extrait de flavonoïdes à partir de graines de Casuarina
2) ajouter cet extrait à une culture de Frankia,
3) appliquer à des racines de plantules axéniques de Casuarina le surnageant de la culture de Frankia additionné de
flavonoïdes.

Résultat:
La déformation des poils racinaires intervient en moins de 24 h. Ceci
indique que les flavonoïdes ajoutées dans le milieu de culture de
Frankia ont provoqué l’expression du gène nod de la bactérie ce qui a
entrainé la sécrétion d’un facteur qui a déclenché chez les plantules de
Casuarina la déformation des poils absorbants.
Les témoins constitués par les cultures de Frankia n’ayant pas reçu
l’extrait de flavonoïdes ne déforment pas les poils absorbants, c'est-à-
dire que les plantules n’ont pas reconnu le Frankia.
B
(B): Déformation des poils absorbants de
Casuarina glauca après 15 h d’incubation à 28°C
avec une dilution de 1/1000 de surnageant de
culture de Frankia additionnée d’extraits de
flavonoïdes provenant des graines de cette
même plante.
(A): Racines traités avec le même surnageant de
culture de Frankia sans addition préalable de
flavonoïdes.
Analyse comparative des principales caractéristiques des symbioses actinorhiziennes et des symbioses Rhizobium-
légumineuses (d’après Duhoux et al., 1996).
 Le processus de fixation de N2 et d’assimilation de N2 fixé

L’azote représente 78 % de l’air et constitue la principale source de cet élément. On le trouve sous forme
gazeuse ou minérale. Pour son incorporation dans les molécules biologiques on distingue deux processus : la fixation
biologique, caractéristique uniquement des microorganismes fixateurs, et la fixation non biologique portant sur
l’azote minéral.

Quelle que soit sa forme (fixation biologique, réduction des nitrates ou des nitrites, absorption directe de l’ion
ammonium), l’azote est converti en ammoniac (NH3). Ce dernier est toxique pour l’organisme. Il sera transformé en
fonction amine ou amide non toxique. On parle alors de l’assimilation de l’ammoniac. Trois enzymes interviennent :
la glutamate déshydrogénase (ou GOGAT : glutamine 2-oxoglutarate aminotransférase), la glutamine synthétase et
la glutamate synthase.
Métabolisme de l’azote fixé par Frankia ex planta
Fixation d’azote
En aérobiose
• Les Frankia cultivés ex planta
peuvent fixer l’azote et croître
en utilisant l’azote de l’air
comme seule source d’azote. La
fixation d’azote est liée à la
formation de vésicules,
structures qui renferment la
nitrogénase.
En microaérobiose
• En conditions de
microaérophilie (pO2 < 0,3 kPa
dans l’atmosphère), les
vésicules ne se forment pas, on
trouve alors la nitrogénase dans
les hyphes, ce qui explique que
dans ces conditions, les
vésicules ne sont plus
nécessaires pour protéger la
nitrogénase contre l’oxygène.
Métabolisme de l’azote de Frankia in planta

Protection de la nitrogénase contre l’oxygène

Chez les plantes actinorhiziennes, l’activité nitrogénase est optimale pour une pO2 de
20 kPa. Elle est inhibée significativement au-dessus de 25 kPa. La protection de la
nitrogénase contre l’oxygène est assurée par 4 mécanismes dont l’importance relative
varie considérablement suivant l’espèce considérée:
vésicules, barrière de diffusion, hémoglobine et switch-off transitoire de la
nitrogénase.
Métabolisme de l’azote de Frankia in planta

1. Protection par les vésicules

Ce type de protection concerne la plupart des plantes actinorhiziennes.

C’est le cas, par exemple, des Alnus, dont les nodules comportent des vésicules typiques
entourées de couches lipidiques. Le nombre de ces couches varie en fonction de la pO2 (il
y en a 15 lorsque la pO2 est de 4 kPa, et jusqu’à 50 pour 40 kPa).
• La vésicule est donc protégé par une enveloppe plurilamellaire, alors que dans la
symbiose rhizobienne la bactérie fixatrice d’azote est entouré d’une seule membrane
péribactéroide.
2. Protection par une barrière de diffusion dans le nodule

Cette barrière résulterait du dépôt, dans certaines cellules des nodules,

de composés hydrophobes ressemblant à la lignine ou à la subérine. De tels
dépôts ont été observés chez Casuarina. Mais l’efficacité d’une telle barrière est
contestée, puisque différentes expériences ont montré que l’air peut pénétrer
facilement jusqu’aux cellules infectées.
Il y aurait donc une différence dans la structure entre les nodules rhizobiens et les
nodules actinorhiziens. Dans le premier cas, la zone infectée est toujours située à
l’intérieur d’une barrière de diffusion alors que dans le deuxième cas, une telle
barrière de diffusion serait pratiquement inexistante.
 Diffusion de l’oxygène dans différents types de
nodules.

Le nodule rhizobien (Légumineuses et Parasponia) possède

une barrière externe de diffusion contre l’oxygène, alors que
cette barrière est absente (ou tout au moins peu effective)
dans les nodules actinorhiziens. Les flèches indiquent les
voies probables de diffusion de l’oxygène. (NR) = racine
nodulaire
3. Protection par l’hémoglobine
Chez les légumineuses, l’hémoglobine (Hb) intervient non seulement en
fournissant l’oxygène à la chaîne respiratoire du symbiote, mais aussi en protégeant la
nitrogénase contre l’oxygène. Chez les PA, seuls Casuarina et Myrica présentent une
concentration en hémoglobine comparable à celle observée chez les Légumineuses.
Dans les nodules comportant de l’hémoglobine, les vésicules sont mal
développées: elles ne sont pas sphériques (Myrica) et pourraient même simplement
avoir l’aspect d’hyphes (Casuarina). Pourtant, ces structures sont le siège de la fixation
puisqu’elles renferment la nitrogénase, ce qui confirme l’hypothèse que, chez Casuarina
et Myrica, la protection de la nitrogénase contre l’oxygène est essentiellement le fait de
l’hémoglobine.
4. Switch-off transitoire de la nitrogénase
En réponse à une augmentation de la pression de l’oxygène (pO2), il y a une chute
brutale de l’activité nitrogénasique, puis on observe une récupération rapide de cette
activité.
Une hypothèse explicative serait que la première phase correspondrait à un Switch-off
très rapide de la nitrogénase (protection conformationnelle), suivi d’une accélération de
la respiration, qui absorberait l’oxygène en excès, d’où retour à une pO2 normale et à une
reprise de l’activité nitrogénasique.

Une autre explication de ce phénomène résiderait dans un détournement

temporaire de flux d’électrons de la nitrogénase vers l’oxygène.
Inhibition de la fixation d’azote
Pour expliquer l’inhibition de la fixation d’azote, deux hypothèses ont été invoquées :

(i) celle d’une modification de la translocation des photosyntéthats impliquant une

réduction de l’approvisionnement des nodules en énergie et par conséquent la
désactivation de la nitrogenèse et

(ii) celle d’une réduction de la quantité de nitrogénase active dans les nodules, en d’autres
termes, une diminution des protéines constitutives de la nitrogénase. Cette deuxième
hypothèse serait confortée par le fait que l’apport d’ammonium entraîne au bout de 4 jours
la dégénérescence des vésicules dans les nodules d’Alnus incana.
Autres fonctions de la symbiose actinorhizienne

Le rôle de l’endophyte Frankia ne se limite pas seulement à la fixation d’azote. Ainsi, Frankia
pourrait:

 améliorer la tolérance de plantes hôtes réputées comme non halophiles (ex. Casuarina
cunninghamiana) à une légère salure du sol en accroissant son potentiel osmotique par
l’intermédiaire de produits de fixation d’N2 comme la citruline, d’où réduction du risque de
plasmolyse.
 améliorer la croissance de la plante hôte en synthétisant des facteurs de croissance
(phytohormones). On a pu mettre en évidence que les jeunes tissus de nodules renferment
des quantités importantes de composés conjugués avec des auxines et de dérivés de
cytokinines.
 faciliter la nutrition minérale de son partenaire végétal et notamment l’absorption d’oligo-
éléments, et plus particulièrement le fer, en produisant les sidérophores de type
hydroxamate ou de type catécholate.