Master MABIOVA

Biotechnologie végétale pour l’amélioration des

plantes

Travaux pratiques
Valorisation agro-biotechnologique des bactéries du sol

-L’antagonisme bactérien-

Polycopié préparé par : Pr. AURAG Jamal et Pr.TAHA Kaoutar

2022/2023
Mise en évidence des mécanismes d’action des bactéries antagonistes vis-à-
vis des champignons filamenteux

L’objectif de cette séance est d’étudier l’antagonisme d’une collection de souches appartenant
à différents genres bactériens vis-à-vis d’une souche de Botrytis cinerea, un champignon
filamenteux phytopathogène. Différentes méthodes de confrontation vont être utilisées pour
révéler le mode d’action éventuel des bactéries testées sur la croissance du champignon étudié.

1- Confrontation actinomycète – Botrytis cinerea

1.1 -Confrontation directe

La méthode de confrontation par contact directe consiste à cultiver le champignon mycélien et

la bactérie côte à côte dans le milieu PDA: un fragment de 0.5 cm de champignon est déposé
en face de 5µl de suspension bactérienne. La distance qui sépare les deux microorganismes est
de 1cm.

Après une semaine d’incubation à 28C° on pourra déterminer l’inhibition de la croissance du

champignon étudié par l’utilisation de la formule suivante :

I= T-C/T * 100

T= Diamètre du mycélium en absence de la bactérie

C= Diamètre du mycélium en présence de la bactérie

Suspension bactérienne

Fragment de mycélium

Méthode de confrontation directe, le fragment de champignon au centre de la boite entouré

par 3 gouttes (5µl) de suspension bactérienne équidistances (1 cm)
1. 2- Action par des substances diffusibles dans le milieu

Cette technique permet de tester la présence et l’efficacité des substances diffusibles inhibitrices
de l’agent pathogène et qui sont produites par les bactéries en question.

Les souches sont mises en préculture pendant 24h dans des tubes contenant du bouillon nutritif.

Des boites de Petri contenant le milieu PDA sont préparées. Après solidification de la gélose,
des membranes de nitrocellulose type millipore stériles (0.45µm de porosité) sont délicatement
déposées à la surface du milieu gélosé à l’aide de pinces stériles. Ensuite 5µl de suspension
bactérienne à tester est déposé sur la membrane et laissé sur place jusqu’à l’absorption des
gouttes. Les boites ainsi préparées sont incubées à 28C°.

Après 48h d’incubation, la membrane (contenant la culture bactérienne) est retirée de la surface
du milieu de culture gélosé et un fragment du champignon de 0.5cm est déposé à la surface de
la gélose et ré-incubées pour une période supplémentaire d’une semaine.

La boite témoin est préparée de la même façon mais en déposant de l’eau distillée stérile au lieu
de la suspension bactérienne.

1.3- Action par des substances volatiles

Aussi dite confrontation indirecte, cette expérience permet d’étudier l’effet des souches sur le
champignon via des substances volatiles.

A cet effet des précultures des bactéries sont réalisées dans le bouillon nutritif liquide pendant
24h. Une suspension bactérienne diluée est striée dans une boite de Petri contenant le milieu
YEM.

Dans une deuxième boite de Petri contenant le milieu PDA, on dépose au centre un fragment
de champignon de 0.5 cm. Les deux boites mises l’une sur l’autre sont scellées par le parafilm
et incubées à 28 C° pendant une semaine.

La boite servant de témoin est réalisée de la même façon sauf que la bactérie est absente.
Milieux de culture (composition par Litre)
 Composition du Bouillon nutritif

Tryptone 20g
Extrait de viande 5g
Chlorure de sodium 5g
20g/litre de Milieu prêt à l’emploi
Stériliser par autoclavage à 121°C pendant 20mn
 Composition du milieu PDA (Potatose Dextrose Agar)

Infusion de pomme de terre 200g

Dextrose 20g
Agar agar 15g
39g/litre de Milieu prêt à l’emploi
Stériliser par autoclavage à 121°C pendant 15mn

 Composition du milieu YEM (Yeast Extract Mannitol)

Mannitol 5g
Extrait de levure 1g
K2HPO4, 3H2O 0,46g
MgSO4, 7H2O 0,2g
KH2PO4 012g
NaCl 0,1g

Pour le YEM solide, ajouter 15g d’Agar par litre + Rouge Congo (si nécessaire) à une concentration finale de
0,0025%.
Stériliser par autoclavage à 121°C pendant 20mn