Carvalho 2017

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Manuscrit Accepté
Urtica spp. : composition phénolique, sécurité, activités antioxydantes et anti
inflammatoires
Ana Rita Carvalho, Gustavo Costa, Artur Figueirinha, Joana Liberal, João AV Prior,
Maria Celeste Lopes, Maria Teresa Cruz, Maria Teresa Batista
IIP : S09639969(17)302612 doi :
EST CE QUE JE:
10.1016/j.foodres.2017.06.008 FRIN 6736
Référence:
Apparaitre dans: Recherche alimentaire internationale
Date de réception: 19 avril 2017
Date de révision : 31 mai 2017
Date d'acceptation : 2 juin 2017
Veuillez citer cet article comme suit : Ana Rita Carvalho, Gustavo Costa, Artur Figueirinha, Joana Liberal, João AV Prior,
Maria Celeste Lopes, Maria Teresa Cruz, Maria Teresa Batista Urtica spp. : composition phénolique, sécurité, activités
, antioxydantes et antiinflammatoires,
Food Research International (2017), doi : 10.1016/j.foodres.2017.06.008
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MANUSCRIT ACCEPTÉ
Urtica SPP. : composition phénolique, sécurité, antioxydant et anti
activités inflammatoires
Auteurs:
Ana Rita Carvalhoa , Gustavo Costab,c, Artur Figueirinhab,d,*, Joana Liberalb,c, João AV
Priord , Maria Celeste Lopesb,c, Maria Teresa Cruzb,c, Maria Teresa Batistaa,c
Affiliations :
MANUSCRIT
aCentre d'études pharmaceutiques, Faculté de pharmacie, Université de Coimbra, Pólo
das Ciências da Saúde, Azinhaga de Santa Comba, 3000548 Coimbra, Portugal
b
Faculté de pharmacie, Université de Coimbra, Pólo das Ciências da Saúde, Azinhaga de
Santa Comba, 3000548 Coimbra, Portugal
cCentre de neurosciences et de biologie cellulaire, Université de Coimbra, Azinhaga de Santa
Comba, 3004517 Coimbra, Portugal
d
LAQV, REQUIMTE, Département des Sciences Chimiques, Laboratoire de Sciences Appliquées
ACCEPTÉ
Chimie, Faculté de Pharmacie, Université de Porto, Rua de Jorge Viterbo Ferreira, 228
4050313 Porto, Portugal
*Téléphone : +351 239488498 ; Télécopie : +351 239827126 ; Courriel : amfigueirinha@ff.uc.pt
Abstrait:
Urtica dioica et d'autres espèces d'Urtica moins étudiées (Urticaceae) sont souvent utilisées comme aliment
ingrédient. Quinze dérivés de l'acide hydroxycinnamique et seize flavonoïdes, flavone
et des glycosides de type flavonol ont été identifiés dans des extraits hydroalcooliques de parties aériennes
d' Urtica dioica L., Urtica urens L. et Urtica membranacea par HPLCPDA
ESI/MSn . Parmi eux, deux isomères de l'acide pcoumaroylcaféoylquinique et trois statines
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MANUSCRIT ACCEPTÉ
comme les dérivés de 3hydroxy3méthylglutaroyl flavone ont été identifiés pour la première fois
chez Urtica urens et U. membranacea respectivement. Urtica membranacea a montré la
teneur plus élevée en flavonoïdes, principalement la lutéoline et l'apigénine Cglycosides, qui sont
presque absent chez les autres espèces étudiées.
In vitro, Urtica dioica a montré une plus grande activité antioxydante mais Urtica urens a montré
potentiel antiinflammatoire plus fort. Fait intéressant, les composés de type statine détectés dans
L'urtica membranacea a été associée à une activité hypocholestérolémiante
cette plante intéressante pour de futures investigations. Aucun des extraits n'était cytotoxique pour
macrophages et hépatocytes à des concentrations bioactives (200 et 350 µg/mL),
MANUSCRIT
suggérant leur utilisation sécuritaire dans les applications alimentaires.
Mots clés : Urtica spp ; antioxydant; antiinflammatoire; polyphénols; cytotoxicité; semblable aux statines
composés
1. Introduction
ACCEPTÉ
Urtica spp. (orties) se caractérise par des espèces à feuilles dentelées, des plantes piquantes et
taille moyenne, ayant une large gamme d'utilisations, étant économiquement viable dans de nombreux
secteurs industriels, à savoir dans les industries du textile, du papier, de l'alimentation, des cosmétiques, et sont encore
considérés comme pertinents en tant que promoteurs de la santé humaine (Di Virgilio et al., 2015 ; Upton, 2013).
Les espèces abordées dans cette étude Urtica dioica L., Urtica membranacea Poir. et
Urtica urens L. ont des caractéristiques morphologiques distinctes et diffèrent par leur
diffusion (Upton, 2013). « L'ortie commune » (Urtica dioica) est une plante vivace, à
large distribution mondiale; l'ortie des queues (Urtica membranacea) est une plante vivace
avec une distribution restreinte à la région méditerranéenne et encore peu étudiée ;
« sans ortie » (Urtica urens) se répand principalement dans l'hémisphère nord (Rodríguez,
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MANUSCRIT ACCEPTÉ
Palacios, Molina et Corchero, 2006). Après avoir été cuites, séchées ou transformées, les orties perdent
leur propriété d'aiguillon permettant leur emploi comme ressource alimentaire. Les orties sont
particulièrement riche en fibres et en protéines et l'étude de sa composition chimique
révèle un bon apport en carotène (50 μg/g), riboflavine (4 μg/g) vitamine E (10 μg/g) et
vitamine C (Bisht, Bhandari et Bisht, 2012). Les composés phénoliques ont également été
divulgué dans Urtica dioica; cependant d'autres espèces du genre Urtica L., y compris
Urtica urens et Urtica membranacea, ont été peu étudiées (Farag, Weigend,
Luebert, Brokamp et Wessjohann, 2013).
Des études épidémiologiques ont mis en évidence une corrélation directe entre l'apport alimentaire
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de composés phénoliques, à savoir les acides phénoliques, les flavonoïdes, les tanins et les anthocyanes,
et leurs effets bénéfiques sur la santé (Pandey & Rizvi, 2009). En effet, antiinflammatoire
propriétés ont été attribuées à plusieurs composés phénoliques (Figueirinha, Cruz,
Francisco, Lopes et Batista, 2010 ; Francisco et al., 2011, 2013), leur conférant une
énorme potentiel, en particulier dans l'inflammation chronique; parallèlement, leur potentiel de
piéger les espèces réactives, soit de l'azote (RNS) ou de l'oxygène (ROS), pourrait avoir
ACCEPTÉ
des effets bénéfiques dans les pathologies associées au stress oxydatif et à l'inflammation,
à savoir le diabète, les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, l'athérosclérose et
cancer (Pandey & Rizvi, 2009). Il est donc primordial de valider l'utilisation
d'orties dans les aliments en tant qu'agents de promotion de la santé.
Le travail ici présenté vise à dévoiler la composition phénolique des extraits obtenus
de trois espèces d'ortie (Urtica dioica, U. urens et U. membranacea). En outre,
leurs propriétés antioxydantes et antiinflammatoires et leur cytotoxicité putative ont également été
rapporté, envisageant une future application des orties qui ont gagné économiquement et
valeur thérapeutique ces dernières années.
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MANUSCRIT ACCEPTÉ
2. Matériel et méthodes
2.1. Matériel végétal
Urtica dioica L., Urtica membranacea Poir. et les parties aériennes d'Urtica urens L. ont été
fourni par « Confraria da Urtiga, Portugal ». Le matériel végétal a été collecté à Serra
da Estrela pendant la saison de floraison (mars 2012), séché, identifié et un bon
spécimen a été déposé à l'Herbier des Plantes Médicinales, Faculté de Pharmacie,
Université de Coimbra, avec références : M. Paraíso 02012 U. dioica, M. Paraíso
01012 U. urens et M. Paraíso 03012 U. membranacea.
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2.2. Produits chimiques
Réactif de FolinCiocalteu, solution saline tamponnée au phosphate (PBS), (N(1naphtyl)
dichlorhydrate d'éthylènediamine) et sulfanilamide pour la préparation de Griess
réactif ont été achetés chez Merck (Darmstadt, Allemagne).
2,2diphényl1picrylhydrazyl (DPPH), 2,2′azinobis(3éthylbenzothiazoline6
acide sulfonique (ABTS), acide 6hydroxy2,5,7,8tétraméthylchromane2carboxylique
ACCEPTÉ
(TROLOX), 2,4,6Tris(2pyridyl)striazine – TPTZ, acide caféique, acide gallique,
pyrogallol, rutine, colorant bleu trypan, alcool isopropylique, 3(4,5diméthylthiazol2yl)2,5
bromure de diphényltétrazolium (MTT), LPS (de Escherichia coli sérotype 026:B6), D
le glucose, la pénicilline et la streptomycine ont été achetés chez Sigma Chemical Co. (St
Louis, ÉtatsUnis). Le sérum fœtal bovin (FBS) a été acquis auprès de Gibco (Paisley, RoyaumeUni),
Le milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) à faible teneur en glucose a été acheté auprès de
Invitrogen (Paisley, UK) et l'acrylamide provenaient de Promega (Madison, WI, USA).
Tous les autres réactifs, c'estàdire acétone, acide acétique, carbonate de sodium anhydre, anhydre
acétate de sodium, éthanol, acétate d'éthyle, acide formique, glycine, acide chlorhydrique, hydrogène
peroxyde, chlorure de fer hexahydraté, nhexane, persulfate de potassium, peroxydase,
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MANUSCRIT ACCEPTÉ
carbonate de sodium décahydraté nitrite de sodium, molybdate de sodium, bicarbonate de sodium,
chlorure de sodium, provenaient de Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO) ou de Merck
(Darmstadt, Allemagne). Les solvants de qualité HPLC ont été achetés chez Merck (Darmstadt,
Allemagne). L'eau ultrapure MilliQ de Millipore (Molsheim, France) a été utilisée dans tous
les expériences.
2.3. La préparation des échantillons
Les parties aériennes de chaque matière végétale en poudre (10 g) ont été macérées dans une solution aqueuse à 50 %.
éthanol (v/v) (200 mL) pendant 24 h, sous agitation magnétique. Trois extraits ont été obtenus :
MANUSCRIT
Ud (Urtica dioica parties aériennes), Uu (Urtica urens parties aériennes) et Um (Urtica
parties aériennes membranacées ). Les extraits ont été filtrés sous vide, concentrés dans un
rotavapor, congelé, lyophilisé et conservé à 20°C dans l'obscurité jusqu'à utilisation.
2.4. Analyse des composés phénoliques par HPLCPDAESI/MSn
Des échantillons de Ud, Uu et Um ont été analysés par un système de chromatographie liquide équipé
ACCEPTÉ
avec une colonne en phase inverse Spherisorb® ODS2 C18 (150 mm x 2,1 mm id ; particules
taille 3 µm; Waters Corporation, Milford, Massachusetts, ÉtatsUnis) et un Spherisorb® ODS
2 Cartouche de garde C18 (10 mm x 4,6 mm, granulométrie 5 µm Waters Corporation,
Milford, Massachusetts, ÉtatsUnis) à 25 ºC. Une phase mobile d'acide formique aqueux à 1 % v/v
(A) et le méthanol (B) ont été utilisés avec un profil de gradient : 515 % B (010 min), 1525 % B
(1015min), 2550% B (1550min), 5080% B (5060min), à un débit de 0,2 mL/min.
La détection a été faite avec le détecteur PDA (Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA, USA) dans une gamme de longueurs d'onde de 200 à 600 nm, et interfacé avec un Finnigan LCQ
(San Jose, CA, USA) spectromètre de masse équipé d'une chambre d'ionisation APIES.
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Le spectromètre de masse a été programmé pour effectuer trois balayages consécutifs dans le
mode ions négatifs : pleine masse MS1 (m/z 502000), MS2 de l'ion le plus abondant dans MS1
et MS3 de l'ion le plus abondant dans MS2 . Les tensions de la source et du capillaire étaient de 4,5 kV
et 10V respectivement et la température capillaire était de 250 ºC. Le gaz gaine utilisé était
Azote à un débit de 20 unités arbitraires. L'hélium a été utilisé comme gaz de collision à un
énergie de collision normalisée de 45 %.
2.5. Teneurs totales en phénols, flavonoïdes et hydroxycinnamiques
2.5.1. Contenu phénolique total (TPC) MANUSCRIT
Une version modifiée de la méthode FolinCiocalteu (Wang, Lee, & Peng, 1997) a été
utilisé. Le réactif de FolinCiocalteau (1 mL) a été ajouté aux extraits d'Urtica dans une solution aqueuse à 70 %.
acétone (v/v). Après mélange vigoureux, carbonate de sodium aqueux à 20 % (p/v) (5 mL)
était ajouté. L'absorbance a été mesurée à 700 et 735 nm et les résultats exprimés en
équivalent d'acide gallique par 100 g d'échantillons lyophilisés. Tous les extraits ont été analysés en
triplicata.
ACCEPTÉ
2.5.2. Teneur totale en flavonoïdes (TFC)
La teneur totale en flavonoïdes a été déterminée selon une méthode de Lamaison et Carnat
(1991). Dans un tube à essai, des extraits d'Urtica solubilisés dans du méthanol (5 mL) et un méthanol
solution d' AlCl3.6H2O à 2% (5 mL) ont été mélangés 1 min dans le vortex. Après 10 min le
l'absorbance a été mesurée contre le blanc, à 430 nm. La courbe standard pour le total
flavonoïdes a été fabriqué à l'aide d'une solution standard de rutine selon la même procédure que précédemment
décrit. Les flavonoïdes totaux ont été exprimés en grammes d'équivalents rutine par g de
extraits lyophilisés. Tous les échantillons ont été analysés en triple.
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2.5.3. Teneur totale en acides hydroxycinnamiques (THC)
Les acides hydroxycinnamiques ont été évalués selon Lamaison, PetitjeanFreytet et
Carnat (1990). Les extraits d'Urtica ont été solubilisés avec du méthanol aqueux à 50 % (v/v).
Des aliquotes de ces échantillons (1 ml) ont été ajoutées à du HCl 0,5 N (1 ml) et du réactif d'Arnow
(nitrate de sodium à 10 % p/v et molybdate de sodium à 10 % p/v dans de l'eau distillée) (1 mL).
Ensuite, NaOH 1N (1 mL) et de l'eau MilliQ pour compléter un volume final de 10 mL.
Le mélange a été soigneusement secoué pendant 1 min et l'absorbance a été lue à 505
nm. Chaque solution a été comparée à un blanc. L'acide caféique a été utilisé pour préparer un
courbe d'étalonnage et les résultats ont été exprimés en équivalents d'acide caféique (g CAE/100 g
MANUSCRIT
extrait sec). Tous les échantillons ont été analysés en triple.
2.6. Activité antioxydante
2.6.1. Activité de récupération du DPPH
L'activité de piégeage du DPPH a été déterminée selon la méthode décrite par Blois
(1958). Des aliquotes d'échantillon (100 µL) ont été ajoutées à une solution méthanolique de 500 µM de 2,2
ACCEPTÉ
diphényl1picrylhydrazyl (DPPH) (500 µL) en présence de tampon acétate 100 mM,
pH 6,0 (1 ml). Les mélanges ont été conservés pendant 30 minutes dans l'obscurité à température ambiante. Le
l'absorbance a été mesurée à 517 nm, avec un spectrophotomètre Cintra 101 (GBC
SCIENTIFIC EQUIPMENT, Melbourne, Australie) (Costa et al., 2015). Différent
dilutions de chaque extrait d'Urtica ont été dosées et les résultats ont été obtenus par
en interpolant l'absorbance sur une courbe d'étalonnage obtenue avec Trolox (62,51000
µM). Deux expériences indépendantes en triple ont été réalisées pour chaque extrait.
Les résultats ont été exprimés en capacité antioxydante équivalente Trolox (TEAC), définie comme
la concentration de l'extrait dont la capacité antioxydante est équivalente à 1 mM
Solution de Trolox (Antolovich, Prenzler, Patsalides, McDonald et Robards, 2002).
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2.6.2. Activité de piégeage des radicaux ABTS (pH = 4,5)
Le test a été effectué selon Cano, HernándezRuíz, GarcíaCánovas, Acosta
et Arnao (1998) légèrement modifié par Villaño, FernándezPachón, Troncoso et
GarcíaParrilla (2004) utilisant un système enzymatique contenant de la peroxydase de raifort
enzyme, le peroxyde d'hydrogène et le 2,2'azinobis3éthylbenzothiazoline6sulfonique
chromophore acide (ABTS). Le cation radical ABTS•+ à une concentration de 30 µM est
généré par la réaction entre 1,5 mM d'ABTS, 15 µM de peroxyde d'hydrogène et 0,25
Peroxydase µM en présence de tampon glycineHCl 50 mM (pH 4,5) dans un volume final
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de 60 mL. L'échantillon a été ajouté après la formation du radical et l'absorbance a été
surveillé à température ambiante. Le blanc a été préparé à l'aide d'un tampon glycineHCl
(Costa et al., 2015). La réaction a commencé en ajoutant 100 µL d' échantillons d'extrait d'Urtica à
2 mL de solution ABTS•+ et vortexer pendant 10 s. L'absorbance a été mesurée à 414
nm après 2 min de réaction. Deux expériences indépendantes ont été réalisées en triple
pour chaque extrait. Six dilutions différentes de chaque échantillon dans du méthanol aqueux à 50 % (v/v)
ACCEPTÉ
ont été analysés. Les valeurs TEAC ont été obtenues par interpolation dans l'étalonnage
courbe obtenue à partir des mesures d'absorbance des solutions de Trolox de 62,5 à
500 µM.
2.6.3. Activité de piégeage des radicaux ABTS (pH = 7,4)
Le radical ABTS•+ a été produit par l'oxydation de 7 mM d'ABTS à l'aide d'une solution aqueuse
persulfate de potassium (2,45 mM). Après 1216 h dans l'obscurité à température ambiante, le
La solution ABTS•+ a été diluée avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à pH 7,4 à 30 ºC pour
atteindre une valeur d'absorbance de 0,7 ± 0,02 à 734 nm. Aliquotes (50 µL) de solution aqueuse à 50 %
méthanol (v/v) des extraits ont été mélangés avec l'ABTS•+ préalablement préparé (2 ml)
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MANUSCRIT ACCEPTÉ
et vortexé pendant 10s. L'absorbance a été mesurée à 734 nm après 4 min de réaction à
30 ºC (Costa et al., 2015). Différentes dilutions de chaque extrait d'Urtica ont été dosées et
les résultats ont été obtenus en interpolant l'absorbance sur une courbe d'étalonnage obtenue
avec Trolox (62,5500 µM). Les résultats ont été exprimés en valeurs TEAC. Deux
des expériences indépendantes en triple ont été réalisées pour chacun des extraits dosés.
2.6.4. Dosage du pouvoir réducteur ferrique (FRAP)
Le pouvoir réducteur ferrique a été évalué par la méthode de Benzie et Strain (1996) avec
MANUSCRIT
modifications mineures (Costa et al., 2015). Le réactif FRAP a été préparé en utilisant 10 mM
de solution TPTZ dans 40 mM HCl, 20 mM FeCl3·6H2O et tampon acétate (300 mM, pH
3.6) (1:1:10, v/v/v). Aliquotes (100 µL) des extraits d'Urtica dans du méthanol aqueux à 50 %
(v/v) ont été ajoutés au réactif FRAP (3 mL) et incubés pendant 6 min à température ambiante
température. L'absorbance a été mesurée à 593 nm, avec le FRAP comme réactif blanc.
Plusieurs dilutions des extraits ont été dosées et les résultats ont été calculés par
en interpolant dans une courbe d'étalonnage obtenue avec les valeurs d'absorbance obtenues pour le
ACCEPTÉ
Solutions de Trolox (31,251000 µM). Les résultats ont été exprimés en valeurs TEAC. Deux
des expériences indépendantes pour chaque extrait ont été réalisées en triple exemplaire.
2.7. Activité antiinflammatoire et cytotoxicité
2.7.1. Lignées cellulaires
Une lignée cellulaire de macrophages monocytes leucémiques de souris Raw 264.7 (ATCC TIB71) a été
gracieusement fourni par le Dr Otília Vieira (Centre de neurosciences et de biologie cellulaire,
Université de Coimbra, Portugal) et cultivées dans un Dulbecco sans endotoxine
Milieu d'Eagle modifié (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose et additionné de 10 %
(v/v) de sérum bovin fœtal non inactivé par la chaleur (FBS). Cellule de carcinome hépatique humain
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MANUSCRIT ACCEPTÉ
(HepG2, ATCC HB8065) ont été gracieusement fournis par le Dr Henrique Faneca (Centre
pour les neurosciences et la biologie cellulaire, Université de Coimbra, Portugal) et cultivé en
DMEM avec 1 g/L de glucose et additionné de 10 % (v/v) de FBS inactivé par la chaleur.
Tous les milieux contenaient 100 μg/mL de streptomycine et 100 U/mL de pénicilline. Cellules
ont été maintenus à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 95 % d'air et 5 % de CO2 et
observé par microscopie optique pour détecter tout changement morphologique au cours de la
expériences.
2.7.2. Détermination de la viabilité cellulaire par le test MTT
MANUSCRIT
L'évaluation des cellules métaboliquement actives a été réalisée à l'aide de 3(4,5diméthylthiazol2
Dosage colorimétrique de réduction du bromure de yl)2,5diphényltétrazolium (MTT) comme précédemment
rapporté (Mosmann, 1983). Cellules brutes 264,7 (0,3 × 106 cellules/puits) ou cellules HepG2 (0,3 ×
106 cellules/puits) ont été étalées et laissées se stabiliser pendant 12 h. Après cette période, les cellules
ont été soit maintenus en milieu de culture (témoin), soit préincubés avec Urtica
extraits pendant 1 h, puis activés avec 1 µg/mL de lipopolysaccharide (LPS) pendant 24 h.
Après les traitements, une solution MTT (5 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate) (1:10)
ACCEPTÉ
a été ajouté et les cellules ont été incubées à 37 ºC pendant 15 min (cellules brutes 264.7) ou 1 heure
(HepG2), dans une atmosphère humidifiée à 95% d'air et 5% de CO2. Les surnageants ont ensuite été
mis au rebut et cristaux bleu foncé de formazan solubilisés dans de l'isopropanol acide (0,04 N
HCl dans l'isopropanol). La quantification du formazan a été réalisée à l'aide de BioTek Synergy
Lecteur de plaque HT (BioTek Instruments, Winooski, VT) à 570 nm, avec une référence
longueur d'onde de 620 nm.
2.7.3. Mesure de la production de nitrites par le réactif de Griess
dix
MANUSCRIT ACCEPTÉ
L'effet antiinflammatoire des extraits d'Urtica a été évalué par le
accumulation de nitrite, en utilisant des dosages in chemico et in vitro .
Pour le dosage in chemico , plusieurs concentrations des extraits d'Urtica ont été incubées avec
Solution SNAP de SnitrosoNacétylDLpénicillamine (300 µM) en milieu DMEM pendant 3
h. L'activité de piégeage du NO a été mesurée en quantifiant les niveaux de nitrite dans le
milieu en utilisant la réaction de Griess, comme décrit cidessous.
Pour le test in vitro , les macrophages ont été cultivés dans des microplaques à 48 puits (0,3 x 106
cellules/puits) avec un volume final de 600 µL. Après une période de stabilisation de 12 h, les cellules
MANUSCRIT
ont été maintenus en milieu de culture (témoin) ou préincubés avec différents
concentrations des extraits pendant 1 h et activés avec du LPS (1 µg/mL) pendant 24 h.
Les surnageants de culture acellulaires ont été dilués avec des volumes égaux du réactif de Griess
[0,1 % (p/v) de dichlorhydrate de N(1naphtyl)éthylènediamine et 1 % (p/v)
sulfanilamide contenant 5 % (p/v) de H3PO4] et maintenu dans l'obscurité pendant 30 min. Le
l'absorbance a été mesurée à 550 nm à l'aide d'un lecteur de plaque BioTek Synergy HT (BioTek
Instruments, Winooski, VT). La concentration de nitrite a été déterminée par régression
ACCEPTÉ
analyse à partir des mesures de dilutions en série de l'étalon de nitrite de sodium, en utilisant
milieu de culture comme blanc (Green et al., 1982).
2.8. analyses statistiques
Les données obtenues à partir des dosages TPC, TFC, THC et antioxydant ont été analysées à l'aide de
GraphPad Prism, version 5.02 (logiciel GraphPad, San Diego, Californie, ÉtatsUnis). Les données étaient
rapporté comme moyenne ± SEM. Les résultats ont été évalués à l'aide de la corrélation de Spearman
coefficients afin de caractériser la relation entre les capacités antioxydantes
détectés par différents dosages et les phénols totaux, acides hydroxycinnamiques et
11
MANUSCRIT ACCEPTÉ
teneur en flavonoïdes. Le niveau de signification statistique a été fixé à p < 0,05, pour deux
test de côté.
Les résultats in vitro ont été exprimés en moyenne ± SEM du nombre d'expériences. Un multiple
une comparaison de groupe a été effectuée et une ANOVA à une voie suivie du test de Dunnett a été
utilisé pour comparer l'effet de différents traitements sur des cellules stimulées par le LPS. Calculs
pour les tests statistiques ont été effectués dans GraphPad Prism, version 5.02 (GraphPad
Software, San Diego, Californie, ÉtatsUnis). Le niveau de signification était #p < 0,05, ##p < 0,01 et ###p
< 0,001, par rapport au contrôle et *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 et ****p
< 0, 0001, par rapport au LPS. MANUSCRIT
3. Résultats et discussion
3.1. Caractérisation des polyphénols par HPLC–PDA–ESI/MSn
Les polyphénols présents dans les extraits de parties aériennes des trois espèces d'Urtica ont été
identifié à l'aide des spectres PDA et des données MSn. Profils chromatographiques UV typiques de
les échantillons analysés sont présentés à la Fig. 1.
ACCEPTÉ
Le tableau 1 rapporte tous les composés identifiés, avec leur absorption UV maximale et
Modèle de fragmentation MSn dans des conditions d'ionisation électrospray négative (ESI), par
comparaison avec les données disponibles dans la littérature. Les composés étaient numérotés selon leur
ordre d'élution puisque la plupart d'entre eux n'ont pas été trouvés dans tous les échantillons.
3.1.1. Esters d'acide caféique et pcoumarique
Les pics 1, 2, 4, 5, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17 ont été identifiés. Pics 1, 4, 5 et 9 présentés
le même ion moléculaire à m/z 353 et spectres UV, avec le maximum à 250 et 324
nm et un épaulement à 298 nm. Ces données sont caractéristiques de l'acide caféoylquinique
isomères. Selon les schémas de fragmentation décrits dans la littérature (Jaiswal,
12
MANUSCRIT ACCEPTÉ
Kiprotich, & Kuhnert, 2011), le pic 4 a été identifié comme étant l'acide 4Ocaféoylquinique (4
CQA) en raison de la présence d'un pic de base à m/z 173 dans MS2 , tandis que le pic 1 était lié à
l' acide 3Ocaféoylquinique (3CQA) en raison de son signal intense à m/z 179 dans MS2 . SP
profil du pic 5 est caractérisé par un pic de base à m/z 191 et l'absence d'un
fragment de cinnamate à m/z 179, caractéristique de l' acide 5Ocaféoylquinique
(5CQA) qui s'élue plus tard que les autres isomères en chromatographie en phase inverse. Le
l'ion à double charge [2MH] à m/z 707 présenté par le pic 9 est à l'origine d'un pic de base à
m/z 353 et le même schéma de fragmentation du pic 5 après clivage, probablement
correspondant à un isomère cis de l'acide 5Ocaféoylquinique (5CQA) précédemment identifié
comme pic 5.
MANUSCRIT
Le spectre UV du pic 2 suggère un composé avec une structure liée au caféique
acide. Ce composé a généré un spectre de masse avec un ion moléculaire à m/z 311 et
+
le pic de base MS2 à m/z 149 ([acide tartriqueH ] ), par la perte d'un résidu caféoyle, et
+ +
pics secondaires à m/z 179 ([acide caféiqueH ] ) et 135 ([acide caféiqueCO2H ] ). Basé
sur les données cidessus, conformément à la revue de la littérature (Jaiswal et al., 2011), le composé
2 a été identifié comme étant l'acide caféoyltartrique (acide caftarique).
ACCEPTÉ
Le pic 10 montrait un fragment MS2 à m/z 179 ([acide caféiqueH
+
] ) qui est cohérent
avec la présence d'un groupe caféoyle. L'ion à double charge (2[MH] ) à m/z 591,
suggère un poids molaire de 296, et la présence de fragment à m/z 133 pourrait entraîner
d'un groupe d'acide malique tel que décrit précédemment par Spínola, Pinto et Castilho (2015).
Par conséquent, le composé 10 a été provisoirement identifié comme étant l'acide caféoylmalique.
Les pics 14, 15, 16, 17 présentaient un maximum UV proche de 314 nm et un épaulement ca. 290 nm
suggérant une structure d'acide pcoumarique. Les pics 14 et 16 présentaient un ion parent à m/z
337 avec des ions MS2 à m/z 173 et 191 qui est caractéristique de l'acide pcoumaroylquinique
13
MANUSCRIT ACCEPTÉ
isomères. À notre connaissance, il s'agissait de la première identification de ces isomères chez U.
urènes.
Les pics 15 et 17 présentaient des profils de spectres UV caractéristiques de l'acide pcoumarique
structure et un spectre de masse contenant un ion parent à m/z 279 résultant probablement de
la présence d'un acide pcoumaroylmalique. Cette hypothèse est corroborée par le MS2
+
ions à m/z 163 ([acide coumariqueH ] ) et m/z 133 en raison d'un groupe acide malique comme
décrit précédemment par Farag et al. (2013).
Le composé correspondant au pic 8 a produit un spectre de masse avec un ion moléculaire
à m/z 499, ce qui est cohérent avec la présence d'un acide caféoylpcoumaroylquinique.
MANUSCRIT
Le modèle de fragmentation présenté par le composé, consistant en un pic de base MS2 à
m/z 353 et la présence d' un pic MS3 à m/z 173 a été interprétée par Jaiswal et al.
(2011) du fait de la présence d'un résidu pcoumaroyl en C5 et d'un caffeoyl en
Position C4 du fragment acide quinique. Ainsi nous proposons un 4caféoyl5p
l'acide coumaroylquinique pour la structure du composé 8.
3.1.2. Dérivés des acides férulique et sinapique
ACCEPTÉ
Les pics 3, 6, 7 et 18 ont été identifiés dans ce groupe de composés. Spectre UV du pic 3
a des maxima à 234 et 325 avec un épaulement à 292 nm. Un ion moléculaire de m/z 355 et
le profil de fragmentation caractérisé par un ion à m/z 209 [MHdeoxyhexosyl
fraction] qui a généré un ion à m/z 191 [hydroxyférulateH2O] indiquent que l'on
l'unité désoxyhexosyle pourrait être attachée à l'acide hydroxyférulique. Ces données sont cohérentes
avec une identification faite par Bamawa, Ndjele et Foma (2013) et a permis de proposer une
structure désoxyhexoside de l'acide hydroxyférulique pour le composé 3.
Le pic 6 présentait un ion moléculaire à m/z 399 et un schéma de fragmentation dans MS2
contenant un fragment majeur de m/z 205 [sinapoyl18 amu] et un pic moins abondant à
14
MANUSCRIT ACCEPTÉ
m/z 223, qui pourrait résulter d'une perte d'unité glucuronyle (176 amu) comme décrit par
Zhao, Long, Dai, Bi et Chen (2012). Par conséquent, le composé 6 a été provisoirement
identifié comme acide sinapoylglucuronide.
Le pic 7 présentait un ion moléculaire à m/z 309 avec un schéma de fragmentation dans MS2
contenant un fragment majeur de m/z 193, qui peut correspondre à une fraction féruloyle.
Le fragment à m/z 149 est probablement le résultat de la perte d'un résidu de malate attaché à
groupe carbonyle de l'acide férulique. D'autres fragments trouvés dans ce spectre sont cohérents
avec revue de la littérature pour l'acide féruloylmalique (Farag et al., 2013).
MANUSCRIT
Le pic 18 a été provisoirement identifié comme étant l'acide 4Oféruloylquinique parce qu'il présentait une masse
spectre avec un ion moléculaire à m/z 367 et un pic de base MS2 à m/z 173 qui est
similaire au schéma décrit par d'autres auteurs pour la même structure (Jaiswal et al.,
2011).
3.1.3. Cglycosylflavonoïdes
Les pics 11, 12, 13, 19, 20, 21 et 23 ont été identifiés comme étant des Cglycosylflavonoïdes. Culminer
ACCEPTÉ
11 a montré un ion moléculaire à m/z 609 et un modèle de fragmentation suggérant la
présence d'un Cglycoside. Le MS2 présentait des signaux à m/z 489 [(MH)120] et
519 [(MH)90] correspondant à une rupture d'un motif hexosyle. Fragmentation de la base
le pic à m/z 489 a créé un schéma similaire dans le spectre MS3 avec des signaux à m/z
369 [(MH)120120] et 399 [(MH)12090] à la suite du clivage d'un autre
unité hexosyle. La présence des fragments 369 (aglycone + 83) et 399 (aglycone + 113)
suggère, selon Ferreres, GilIzquierdo, Andrade, Valentão et TomásBarberán
(2007), la présence d'une structure de lutéoline. Ces données sont compatibles avec une présence de
un lutéolinediChexoside comme le suggère son spectre UV (Figueirinha, Paranhos,
PérezAlonso, SantosBuelga et Batista, 2008).
15
MANUSCRIT ACCEPTÉ
Les pics 12 et 13 ont montré un ion moléculaire à m/z 593 et un schéma de fragmentation commun
d'un Cglycoside. Le MS2 présentait des signaux à m/z 473 [(MH)120] et 503 [(MH)
90] correspondant à une rupture d'un motif hexosyle. Fragmentation du pic de base à m/z
473 est à l'origine d'un schéma similaire dans le spectre MS3 avec des signaux à m/z 353 [(MH)120
120] et 383 [(MH)12090] à la suite du clivage d'une autre unité hexosyle. Le
présence à m/z 353 (aglycone + 83) et 383 (aglycone + 113) suggèrent, selon
Ferrères et al. (2007), la présence d'une structure d'apigénine. Ces données sont cohérentes
avec une présence d'un apigéninediChexoside corroborée par des données spectrales UV
(Figueirinha et al., 2008). MANUSCRIT
Le pic 19 a montré un ion moléculaire à m/z 563 et un schéma de fragmentation similaire à
diCglycosides asymétriques . Les données MS2 ont montré des fragments à m/z 473 [(MH)90] et 443
[(MH)120] , indiquant la présence d'un motif Chexosyle. Dans le même spectre, il pourrait
observer les fragments à m/z 503 [(MH)60] , 383 [(MH)12060] et 353 [(MH)120
90] , correspondant à la fragmentation d'un motif pentosyle. Un pic de base à m/z 443 [(M
H)120] et la grande abondance des pics de fragmentation pour l'unité hexosyle relative
ACCEPTÉ
au pentosyle, a suggéré qu'un hexose en position 6 se produit dans ce composé. Le bas
abondance du pic à m/z 503 [(MH)60] , qui se traduit par une caractéristique
fragmentation des pentoses, a corroboré ce modèle de substitution. Les ions à m/z 353
(aglycone + 83) et 383 (aglycone + 113), caractéristiques du diC
fragmentation des glycosylflavones (Figueirinha et al., 2008), a suggéré le trihydroxylé
nature de l'aglycone (apigénine, MW 270). Par conséquent, le composé 19 peut être
apparenté à un apigénine6Chexosyl8Cpentosyle.
Le pic 20 présentait un ion moléculaire à m/z 447 et un motif de fragmentation caractéristique
de Cglycoside. Le MS2 présentait des signaux à m/z 327 [(MH)120] et 357 [(MH)
90] correspondant à une rupture d'un motif hexosyle. Fragmentation du pic de base à m/z
16
MANUSCRIT ACCEPTÉ
357 dans le spectre MS3 ont généré des signaux à m/z 297 [(MH)150] également à la suite de
clivage du motif hexosyle. La présence des fragments 327 (aglycone + 41) et 357
(aglycone + 71) suggère, selon Ferreres et al. (2007), la présence d'un
aglycone tétrahydroxylé comme la lutéoline. La position de la glycosylation peut être déduite
par la présence du fragment 429 qui résulte de la perte d'une molécule d'eau.
Selon Ferreres et al. (2007), les hexosides 6C présentent un fragment comme celuici, avec une
abondance de 2030%. Ces données sont cohérentes avec la présence d'une lutéoline6C
hexoside.
Le pic 21 présentait un ion moléculaire à m/z 593. Le MS2 présentait des signaux à m/z
MANUSCRIT
473 [(MH)120] et 503 [(MH)90] indiquant probablement la présence d'un Chexosyl
unité. Le signal à m/z 447 [(MH)146] peut être interprété par la perte d'un
unité désoxyhexosyle. Selon Ferreres et al. (2007), la faible intensité de ce signal
et la relative haute intensité du signal à m/z 429 [(MH)146H2O] est une
comportement caractéristique des O,Cdiglycosides. Selon les mêmes auteurs, ce signal
suggère également que le lien interglycosidique est situé en C2´´ de l'unité hexosyl. Le
ACCEPTÉ
les fragments m/z 357 (aglycone+71) et 327 (aglycone+41) sont généralement présents dans les spectres
de flavones tétrahydroxylées comme la lutéoline (Ferreres et al., 2007). Le fragment à m/z
357 a plus d'intensité que le fragment m/z 327 indiquant que le diglycoside est lié en C6
de l'aglycone (Ferreres et al., 2007). Ce profil de fragmentation suggère que la lutéoline
6Crutinoside.
Le pic 23 présentait un ion moléculaire à m/z 577 et un schéma de fragmentation similaire à celui
du composé 21. Cependant, le fragment m/z 353 (aglycone+83) est habituellement présent dans
spectres de flavones trihydroxylées comme l'apigénine (Ferreres et al., 2007). De plus,
intensités similaires du fragment m/z 341 (aglycone+71) et du fragment m/z 311
17
MANUSCRIT ACCEPTÉ
(aglycone + 41) indique que le diglycoside est probablement lié au C8 de l'aglycone
(Ferreres et al., 2007). Ainsi, ce composé a été identifié comme étant l'apigénine8Crutinoside.
3.1.4. Oglycosylflavonoïdes
Les pics 22, 24, 27, 29, 30, 31 ont été identifiés comme Oglycosylflavonoïdes. Le pic 22 a montré une
ion précurseur à m/z 725 [MH] qui a produit un spectre de second ordre avec un parent
ion à m/z 477 après élimination d'un motif malonylhexosyle. MS3 produit un ion à m/z
315 correspondant à une unité isorhamnétine après la perte d'un groupement hexosyle (Liu,
MANUSCRIT
Kallio, & Yang, 2014). Par conséquent, la structure proposée pour le composé 22 était
isorhamnétine hexosylmalonylhexoside.
Les pics 24, 27, 29 et 30 avec des ions moléculaires à m/z 609, 593, 607 et 623 ont montré une
perte possible d'un fragment rutinoside [(MH)162146] , origine de fragments à m/z 301,
285, 299 et 315, respectivement, dans les spectres du second ordre. Le spectre UV du pic 24 est
concordant avec celui de la quercétine et du fragment MS2 à m/z 301 et des ions
résultant de sa fragmentation, à m/z 179 et 151, corroborent cette identification,
ACCEPTÉ
basé sur le profil de fragmentation précédemment décrit (AbadGarcía, GarmónLobato,
Berrueta, Gallo et Vicente, 2012 ; Justesen, 2000). Ces résultats suggèrent que la quercétine
Orutinoside.
Le pic 27 montrait un spectre UV de type flavonol et un aglycone avec m/z 285, 16 Da
en dessous du pic 24, suggérant le kaempférolOrutinoside.
Le pic 29 qui a montré le pic de base à m/z 299 dans MS2 a perdu 14 amu, résultant en un
fragment à m/z 285 dans MS3 , correspondant probablement à la déméthylation de l'aglycone
diosmétine (Lin & Harnly, 2010). Ainsi, ce composé a été identifié comme étant la diosmétineO
rutinoside.
18
MANUSCRIT ACCEPTÉ
Pic 30, qui provient du fragment à m/z 315 dans le spectre de second ordre, présenté dans
Spectre MS3 un pic de base à m/z 300 d'une perte de groupe méthyle, suggérant la
présence d'une isorhamnétine (Farag et al., 2013). Par conséquent, ce composé peut être
isorhamnétineOrutinoside.
Le pic 31 a montré un spectre UV caractéristique du kaempférol. Dans les spectres MS, une molécule
ion à m/z 533 est présent, qui a produit un fragment à m/z 285 correspondant à
kaempférol après élimination d'une unité malonylhexose (Liu et al., 2014). Ces données
indiquent la présence de kaempférolOmalonylhexoside.
MANUSCRIT
3.1.5. Glycosides de flavonoïdes hydroxyméthylglutaroyl
Les pics 25, 26, 28 ont perdu 144, 102 et 62 uma dans les spectres du second ordre ce qui était
attribué pour les glycosides flavonoïdes 3hydroxy3méthylglutaroyl dans Citrus bergamia
(DiDonna et al., 2014); chez Oxytropis racemosa (Song et al., 2010) et chez Cytisus
multiflorus (Pereira, Silva, Domingues et Cardoso, 2012).
Le pic 25 présentait un spectre UV caractéristique des dérivés de lutéoline et une masse
ACCEPTÉ
spectre avec ion moléculaire à m/z 737. Dans MS3, un fragment à m/z 473 se produit, qui
pourrait résulter de la perte de 120 amu du pic de base MS2 [(MH)144120] , suggérant une
unité Chexosyle attachée au squelette flavonoïde, tandis que le signal à m/z 429 peut être
liée à la perte d'une unité désoxyhexosyle. La faible intensité de ce signal dans le MS2
suggère la présence d'un fragment ChexosylX´Ódésoxyhexosyle et les fragments à
m/z 327 (aglycone+41) et 357 (aglycone+71) dans MS3 suggèrent la présence d'un
aglycone tétrahydroxylé comme la lutéoline (Ferreres et al., 2007). La structure proposée
pour le composé 25 était la lutéoline C(3hidroxy3méthylglutaroyl)X”désoxyhexosyle
hexoside.
19
MANUSCRIT ACCEPTÉ
Le pic 26 présentait un spectre UV caractéristique des dérivés de flavones trihydroxylées
et un spectre de masse avec un ion parent à m/z 721. MS3 a présenté un pic de base à m/z 413
[(MH)144164] , correspondant à la perte de 164 amu du pic de base MS2,
suggérant une unité désoxyhexosyle attachée à une autre unité sucre. Un autre représentant
fragment à m/z 293 [(MH)144164120] peut indiquer la présence d'un Chexosyl
fraction dans la structure. Comme Ferreres et al. (2007) pointu, fragments à m/z 341
(aglycone+71) et m/z 311 (aglycone+41) sont caractéristiques des flavones trihydroxylées
comme l'apigénine. Sur la base de ces preuves, nous proposons l'apigénine C(3hydroxy3
méthylglutaroyl)X´Ódésoxyhexosylhexoside. MANUSCRIT
Le pic 28 présentait un spectre UV caractéristique des flavones et un spectre de masse avec une
ion moléculaire à m/z 751. Le modèle de fragmentation pour MS3 est le même que le pic 26, mais le
présence de fragments à m/z 371 (aglycone+71) et m/z 341 (aglycone+41) est
compatible avec la diosmétine aglycone. En conséquence, nous proposons la structure diosmétine C
(3hydroxy3méthylglutaroyl)X´Ódésoxyhexosylhexoside pour le composé 28.
ACCEPTÉ
3.2. Evaluation des phénols totaux, flavonoïdes et hydroxycinnamiques et antioxydants
capacité
Les résultats obtenus pour les phénols totaux (TPC), les flavonoïdes (TFC) et les hydroxycinnamiques
teneur en acides (THC) et évaluation de l'activité antioxydante (DPPH, ABTS et FRAP
tests) des trois espèces d'Urtica sont présentés dans le tableau 2.
Urtica dioica présentait la plus grande quantité de composés phénoliques (7,9 g/100 g
extrait), dont principalement les acides hydroxycinnamiques (2,54 g/100 g), suivis par Urtica
membranacea (2,8 g/100 g), constituée majoritairement de flavonoïdes (2,14 g/100 g).
Urtica urens présentait la plus faible teneur en composés phénoliques (0,8 g/100 g) et seulement
les acides hydroxycinnamiques ont été quantifiés dans cet extrait (0,66 g/100 g). Ces résultats sont
20
MANUSCRIT ACCEPTÉ
conformes à celles obtenues par HPLCPDAESI/MS (Tableau 1), confirmant
la prédominance des acides hydroxycinnamiques chez U. urens.
En ce qui concerne la capacité antioxydante, l' extrait d'Urtica dioica a présenté le plus haut
activité antioxydante dans tous les dosages suggérant une forte corrélation avec la teneur élevée en composés phénoliques
contenu de cet extrait. L' Urtica membranaceae a également montré une action antioxydante importante
activité, malgré sa teneur phénolique relativement plus faible (environ 65% de moins si l'on compare
avec Urtica dioica). Comme prévu, les extraits d'Urtica urens ont montré la plus faible
activités antioxydantes, compte tenu de la faible teneur trouvée dans le dosage TPC.
Ensuite, les résultats obtenus précédemment ont été utilisés pour estimer
MANUSCRIT
corrélations sur la base des coefficients de classement de Spearman pour évaluer la
relations entre les phénols totaux, les flavonoïdes, les teneurs en hydroxycinnamique et la
activités antioxydantes et antiradicalaires des extraits. Les résultats du Spearman
test statistique de corrélation sont compilés dans le tableau 3.
Dans ce tableau, on peut observer une forte corrélation entre le TPC et le THC
(r = 0,976, P < 0,001), indiquant avec une forte probabilité que le THC est principalement
ACCEPTÉ
responsables des activités antioxydantes/antiradicalaires des échantillons. Ces résultats ont été
cohérent avec les résultats obtenus par l'analyse HPLCPDAESI/MS qui a révélé
que les acides hydroxycinnamiques étaient les principaux composés phénoliques dans les extraits de tous les
espèces d'Urtica testées (tableau 1).
DPPH et ABTS sont des radicaux synthétiques qui ont permis d'évaluer le piégeage
capacité des extraits en milieu aqueux à différentes valeurs de pH, à savoir, pH = 6 pour
DPPH, tandis que pH = 4,5 et pH = 7,4 pour ABTS. Le test FRAP a permis de
mesure du potentiel antioxydant des extraits en déterminant leur capacité à
réduire les métaux lourds.
21
MANUSCRIT ACCEPTÉ
L'analyse du classement de Spearman a montré une forte corrélation entre TPC et DPPH,
Les dosages ABTS et FRAP qui semblent confirmer que les composés phénoliques présents
dans les extraits sont responsables à la fois des activités antiradicalaires et antioxydantes. Un autre

conclusion importante est la forte corrélation négative entre TPC et FRAP (r =
0,976, P < 0,001). Cette corrélation indique avec une forte probabilité que les composés
présents dans ces extraits ont montré une grande capacité à réduire les métaux lourds suggérant que
ils pourraient également éviter certaines des voies oxydatives catalysées par les métaux (par exemple Fenton
réaction).
MANUSCRIT
Enfin, les résultats du tableau 3 ont montré de bonnes corrélations entre l'action antiradicalaire et
des dosages d'antioxydants, ce qui renforce les résultats obtenus. Plus précisément, les résultats
des dosages DPPH et ABTS (pH 7,4) ont démontré une très bonne corrélation
(r = 0,950, P < 0,001). En revanche, le dosage ABTS à pH 4,5 semble être le
moins corrélé des dosages. Ainsi, on peut conclure qu'en général, tous les extraits
possèdent plus d'activité antiradicalaire à un pH physiologique de 7,4.
ACCEPTÉ
3.3. Inhibition in vitro de la production d'oxyde nitrique par les macrophages
Afin d'explorer en profondeur si les extraits modulent la production d'oxyde nitrique, nous
ont utilisé un modèle in vitro d'inflammation constitué de macrophages stimulés par le
Agoniste du récepteur Tolllike 4, le LPS. La figure 2 résume la libération d'oxyde nitrique par le LPS
macrophages stimulés traités avec différentes concentrations des extraits préparés
de Urtica dioica (Ud), Urtica urens (Uu) et Urtica membranacea (Um). Comme représenté sur la
Fig. 2, l'incubation des macrophages avec du LPS, pendant 24 h, a entraîné une augmentation significative
dans la production de nitrites. Fait intéressant, tous les échantillons ont inhibé la production de nitrites
induite par le LPS. La réduction la plus importante a été obtenue avec l' extrait d'Uu pour la
22
MANUSCRIT ACCEPTÉ
concentration de 350 µg/mL, ce qui diminue la production de nitrite à 41 %, par rapport à
LPS (p<0,001). L' extrait d'Um a légèrement diminué la production de NO stimulée par le LPS.
Il est généralement admis et bien documenté que les acides phénoliques (Artur Figueirinha et
al., 2010) et les flavonoïdes (Nijvdelt et al., 2001) possèdent une activité antiinflammatoire en
réduire la production de médiateurs inflammatoires ou par piégeage des radicaux libres
capacité, entre autres mécanisme d'action (Pietta, 2000; Seyoum, Asres, & ElFiky,
2006). La présence de composés phénoliques, à savoir les acides chlorogéniques dans Urtica dioica
et Urtica urens pourraient être partiellement liés à leur activité antiinflammatoire
MANUSCRIT
(Marrassini, Acevedo, Miño, Ferraro et Gorzalczany, 2010). Parmi les flavonoïdes, le
le composé majeur identifié dans l'extrait d'Urtica dioica était la quercétine, sous la forme de son
glycosides. En conséquence, il a déjà été démontré que la quercétineOrutinoside (rutine)
possèdent des propriétés antiinflammatoires dans des modèles animaux in vivo (Chen et al., 2005). Alors, il
est raisonnable de suggérer que les glycosides de quercétine identifiés pourraient également contribuer à la
activité détectée d' Urtica dioica. Urtica membranacea est particulièrement riche en
les glycosides de lutéoline et d'apigénine qui peuvent être responsables de l'effet antiinflammatoire
ACCEPTÉ
l'activité de l'extrait, comme démontré précédemment par leur capacité à inhiber iNOS
expression (LópezPosadas et al., 2008) et la production de NO (Matsuda, Morikawa,
Ando, Toguchida et Yoshikawa, 2003). Les composés identifiés dans U. urens peuvent ne pas
être le seul responsable de la plus forte activité antiinflammatoire manifestée par ce
extrait.
3.4. Cytotoxicité sur les hépatocytes et les macrophages
Compte tenu de l'administration orale des extraits, leur cytotoxicité a été
évalué sur macrophages RAW 264.7 et hépatocytes humains HepG2. Comme représenté sur la
Tableau 4, tous les extraits sont clairement dépourvus de toxicité, présentant ainsi un profil de sécurité pour
23
MANUSCRIT ACCEPTÉ
toutes les cellules étudiées. Fait intéressant, l'extrait d'Urtica membranacea déclenche une augmentation de
Diminution du MTT, qui peut suggérer une augmentation de l'activité métabolique des cellules ou une
croissance dans la prolifération cellulaire. L'activité proliférative des polyphénols a été liée à
leurs effets immunostimulants partiellement responsables de la réduction de la tumorigenèse
(Cichello, Yao et He, 2016). D'autres études devraient être faites pour explorer davantage ces
résultats.
4. Conclusions
Dans ce travail, nous avons évalué la composition en polyphénols, antioxydant et anti
MANUSCRIT
l'activité inflammatoire ainsi que l'innocuité des extraits hydroalcooliques de parties aériennes de
trois espèces d'Urtica : Urtica dioica, Urtica urens et Urtica membranacea.
La composition phénolique des extraits comprenait des dérivés d'acide hydroxycinnamique
qui contenait deux isomères de l'acide pcoumaroylcaféoylquinique qui ont été identifiés pour
la première fois dans Urtica urens. Les flavones et les flavonols, C, et O,Cglycosides, ont été
également identifié, y compris les trois moins courants 3hydroxy3méthylglutaroyl
dérivés jamais décrits dans Urtica membranacea. Ces composés de type statine ont
ACCEPTÉ
été associée à une activité hypocholestérolémiante chez d'autres plantes (Di Donna et al.,
2014). D'autres études doivent être faites pour confirmer cette hypothèse pour Urtica
membranacées.
Le profil phénolique d' Urtica membranacea, caractérisé pour la première fois, dans cette
travail, a montré des différences significatives avec les autres espèces d'Urtica étudiées, présentant une
teneur élevée en flavonoïdes, principalement des flavones (lutéoline et apigénine Cglycosides).
L'activité biologique et la sécurité des extraits ont été évaluées pour pallier le manque de
informations soutenant la valeur bénéfique d' Urtica spp en tant qu'ingrédient alimentaire. Parmi
l'espèce testée, Urtica dioica a montré un plus grand potentiel antioxydant que les autres
deux espèces, Urtica urens présentant cependant une action antiinflammatoire in vitro plus forte
24
MANUSCRIT ACCEPTÉ
activité. Ces résultats suggèrent que le contenu phénolique des extraits est fortement
corrélé à l'activité antioxydante et que l'activité antiinflammatoire manifestée
pourrait résulter d'autres mécanismes que celui basé sur les espèces réactives de l'oxygène
capacité de récupération. De plus, les concentrations bioactives des extraits (200 et
350 µg/mL) a présenté un très faible effet néfaste sur les types de cellules de mammifères testés.
D'autres études sont nécessaires pour clarifier les mécanismes moléculaires sousjacents à l'anti
activité inflammatoire, ainsi que pour confirmer l'absence de toxicité dans les modèles in vivo .
Ces résultats ajoutent des informations importantes à la composition et à l'activité biologique de
espèces Urtica , justifiant et renforçant ainsi l'utilisation de ces plantes comme bénéfiques
MANUSCRIT
ingrédient alimentaire et ouvrant de nouvelles voies pour leur exploitation ultérieure dans l'alimentation et
industries pharmaceutiques.
5. Remerciements
Nous remercions Confraria da Urtiga, Portugal, pour la fourniture des plantes et pour
Laboratoire de Spectrométrie de Masse du nœud UC, intégré au National Mass
ACCEPTÉ
Réseau de Spectrométrie (RNEM) du Portugal, pour l'acquisition des spectres de masse.
Ce travail a été soutenu par l'Union Européenne (fonds FEDER
POCI/01/0145/FEDER/007265) et Fonds nationaux (FCT/MEC, Fundação para a
Ciência e Tecnologia et Ministério da Educação e Ciência) dans le cadre du Partenariat
Accord PT2020 UID/QUI/50006/2013.
Les conflits d'intérêts
Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.
Les références
25
MANUSCRIT ACCEPTÉ
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30
MANUSCRIT ACCEPTÉ
5 dix
Urtica dioïque
24
17
1
3
15
2 30
22 27
Urtica urens
MANUSCRIT
4
8 13
7 29
ACCEPTÉ Urtique membraneuse
5
16
6 18
11
13 26 28,29
19 21
14 23 25
2 20
1 12
31
Figure 1. Profils HPLCPDA des Urtica spp. extraits enregistrés à 280 nm.
31
MANUSCRIT ACCEPTÉ
150
100
* *** ***
50 ****
0
SPL 350 200 350 200 350 200
Production
contrôle)
nitrites
(%
du
de
Oud UuMANUSCRIT euh
Figure 2. Effet inhibiteur des extraits d' Urtica dioica (Ud), d'Urtica urens (Uu) et d'Urtica membranacea (Um) sur la
production de NO déclenchée par le LPS dans les macrophages. Les cellules ont été activées avec du LPS (1 µg/mL)
ou préincubées avec les concentrations indiquées des extraits (µg/mL), pendant 1 h, avant stimulation avec du LPS
pendant 24 h. Les niveaux de nitrite dans les surnageants de culture ont été évalués par la réaction de Griess et les
résultats ont été exprimés en pourcentage par rapport aux cellules traitées au LPS. Chaque valeur représente la
moyenne ± SEM d'au moins 3 expériences indépendantes (****p < 0,0001 ; ***p < 0,001, *p < 0,05, par rapport au LPS).
ACCEPTÉ
32
MANUSCRIT ACCEPTÉ
Tableau 1. Caractérisation des polyphénols d' Urtica spp. par HPLC–PDA–ESI/MSn .
Nº Rt λ maximum [MH] HPLCPDA–ESI/MSn m/z Identification provisoire Composés détectés
(minute)
(nm) (% pic de base)
Ud Uu Um
1 13,97 250 ; 353 MS2 [353] : 191(100) ; 179(79); 3 Acide Ocaféoylquinique + + +

298sh ; 135(3)
324
2 15,36 251 ; 311 MS2 [311] : 179(70) ; 178(4); Acide caféoyltartrique + +

298sh ; 149(100); 135(3)
328
18.05 234, 355 +
3 MS2 [355] : 337(16) ; 209(77); Désoxyhexoside de
292sh; 191(100); 173(1); 129(1) l'acide hydroxyférulique
325
MS3 [355 → 191] : 85(100)
MANUSCRIT
4 20.33 251 ; 353 +
MS2 [353] : 173(100) 4 Acide Ocaféoylquinique +
298sh ;
325
5 21,35 257 ; 295 sh; 353 MS2 [353] : 191(100) 5 Acide Ocaféoylquinique + + +

315
6 21,56 281 ; 288sh ; 399 +
MS2 [399] : 369(4) ; 223(40); Acide sinapoylglucuronide
205(100)
326
7 23,97 254 shillings ; 309 +
MS2 [309] : 291(4) ; 263(11); Acide féruloylmalique
295 sh;
ACCEPTÉ 246(21); 219(2); 201(4); 193(100);
317 177(5); 149(15); 131(8); 115(7)
8 24,27 308 499 +
MS2 [499] : 353(100) ; 163(2) Acide 4caféoyl5
p coumaroylquinique
MS3 [499 → 353] : 173(100)
*
9 24,77 252; 298sh ; 707 MS2 [707] : 353 acide cis5O +
326 caféoylquinique
MS3 [707 → 353] : 191(100) ;
173(37); 155(7); 111(20)
10 25,68 260 ; 294sh ; 591* +
MS2 [591] : 295(100); 179(34) Acide caféoyl malique
326 MS3 [591 → 295] : 179(20) ;
133(100)
11 25.81 609 LutéolinediChexoside +

254 ; MS2 [609] : 591(3) ; 519(24);
286 ; 501(3); 489(100); 471(8); 441(3);
330 429(10); 411(3); 399(30); 369(26)
MS3 [609 → 489] : 471(4) ; 441(2);
33
MANUSCRIT ACCEPTÉ
399(38); 381(1); 369(100); 333(1)
12 27,94 271 ; 332 593 +
MS2 [593] : 575(7); 503(34); Apigénine diChexoside
473(100); 455(8); 425(4); 413(5);
383(37); 353(62);
MS3 [593 → 473] : 383(16) ;
353(100); 325(2); 297(1)
13 28.11 295 sh; 593 + +

MS2 [593] : 575(5); 515(2); Apigénine diChexoside
326 503(34); 473(100); 455(5); 425(3);
413(6); 395(3); 383(41); 353(64); 325(1)
MANUSCRIT
MS3 [593 → 473] : 455(1) ; 395(1);
383(20); 353(100); 325(2); 297(1)
14 28,93 290 sh; 337 +

MS2 [337] : 191(9) ; 173(100) acide pcoumaroylquinique
312 (isomère)
15 29,42 270 shillings ; 279 +
MS2 [279] : 163(100) ; 133(94) acide pcoumaroylmalique
311 (isomère)
16 29.63 280 sh; 337 +

ACCEPTÉ MS2 [337] : 191(1) ; 173(100) acide pcoumaroylquinique
314 (isomère)
17 30.92 289sh; 313 279 +
MS2 [279] : 163(100) ; 133(1); acide pcoumaroylmalique
119(3) (isomère)
MS3 [279 → 163] : 119(100)
18 32.02 298sh; 329 367 +
MS2 [367] : 173 (100) ; 155(8); 111 (19) Acide 4Oféruloylquinique
19 33,61 257 ; 563 +

MS2 [563] : 545(7) ; 517(3); 503(4); Apigénine6Chexosyl8
273 ; 485(5); 474(16); 473(65); 455(7); Cpentosyle
320 444(20); 443(100); 425(4); 413(8);
384(6); 383(38); 354(8); 353(47)
MS3 [563 → 443] : 383(30) ;
354(11); 353(100); 311(1)
34
MANUSCRIT ACCEPTÉ
20 34,87 259 sh; 269 ; 447 MS2 [447] : 429(21) ; 399(3); Lutéoline6Chexoside +
345 369(3); 357(100); 339(2); 327(76); 285(2)
MS3 [447 → 357] : 339(100) ;
327(13); 311(10); 299(10); 297(64); 285(26)
21 35,59 259 shillings ; 593 Lutéoline6Crutinoside +

MS2 [593] : 575(3); 503(1);
269 ; 473(100); 447(2); 429(53); 411(3); 371(3);
347 369(5); 357(24); 351(3); 339(11);
327(12); 309(10); 298(1)
MS3 [593 → 473] : 399(1) ;
327(100); 325(11); 298(30)
22 39,54 258 ; 269sh ; 725 +
MS2 [725] : 678(19) ; 621(23); Isorhamnétine hexosyl
332 561(19); 519(67); 477(100); malonylhexoside
MANUSCRIT
447(20); 357(31)
MS3 [725 → 477] : 315(100)
23 39,85 270 ; 336 577 +
MS2 [577] : 457(8) ; 431(1); Apigénine8Crutinoside
414(15); 413(100); 377(1); 353(3);
341(10); 323(7); 311(6); 294(4); 293(37)
MS3 [577 → 413] : 396(1) ; 353(1);
335(6); 294(6); 293(100); 281(1)
24 41,83 257 ; 609 +

MS2 [609] : 591(1) ; 463(1); 343(7); Quercétine Orutinoside
270sh ; 301(100); 271(11); 179(2)
293sh ;
353
ACCEPTÉ MS3 [609 → 301] : 299(4) ; 283(5);
271(93); 255(85); 211(3); 179(100); 151(33)
25 42,23 260sh ; 737 +

MS2 [737] : 675(9) ; 635(31); Lutéoline C(3hidroxy3
269 ; 593(100); 575(25); 473(20); 429(6); 357(3); méthylglutaroyl)X`Ò –
349 309(1) désoxyhexosylhexoside
MS3 [737 → 593] : 575(1) ;
473(100); 429(48); 369(3); 357(29); 351(3);
339(11); 327(11); 309(14); 298(2)
26 46,20 270 ; 338 721 MS2 [721] : 659(6) ; 619(36); Apigénine C(3hydroxy 3

+
577(100); 559(21); 495(1); 457(4); 455(9); méthylglutaroyl)X´´
413(14); 395(1); 293(4) Odésoxyhexosylhexoside
MS3 [721 → 577] : 457(8) ; 431(1);
413(100); 383(1); 355(2); 341(11); 335(4);
323(8); 311(8); 293(48); 269(1)
35
MANUSCRIT ACCEPTÉ
27 47,44 265 ; 336 593
MS2 [593] : 505(1); 357(1); 327(3); Kaempférol Orutinoside +
285(100); 255(4); 195(1)
MS3 [593 → 285] : 267(80) ;
257(100); 241(27); 227(33);
213(27); 199(38)
28 47,49 258 shillings ; 751 +
MS2 [751] : 689(5) ; 649(28); Diosmétine C(3hydroxy 3
270 ; 608(5); 607(100); 589(17); 487(4); méthylglutaroyl)X´´
349 485(7); 443(13); 425(1); 323(6) Odésoxyhexosylhexoside
MS3 [751 → 607] : 487(10) ; 461(2);
443(100); 383(2); 371(14); 365(5);
353(9); 341(6); 323(84); 308(8);
299(1)
29 48,53 259sh ; 607 Diosmétine Orutinoside + +

MS2 [607] : 299 (100) ; 285(19)
268 ;
325 MANUSCRIT
MS3 [607 → 299] : 285(100)
30 49.05 256 ; 270sh ; 623 Isorhamnétine Orutinoside +

MS2 [623] : 591(1) ; 387(1); 357(1);
298sh ; 315(100); 301(20); 271(8); 243(1);
215(1)
354
MS3 [623 → 315] : 300(100) ;
287(5); 271(7); 257(1)
31 49,47 265 ; 344 533 +
MS2 [533] : 475(100) ; 383(1) Kaempférol3Omalonyl
hexoside
MS3 [533 → 475] : 285(100)
Urtica dioïque (Ud); Urtica urens (Uu); Urtica membraneuse (Um)
ACCEPTÉ
36
MANUSCRIT ACCEPTÉ
Tableau 2. Résultats des dosages TPC, TFC et THC et capacités antioxydantes.
Urtica spp. TPC* TFC* THC* DPPH** ABTS** ABTS** FRAP**
(pH 4,5) (pH 7,4)
U. dioica 7,9±1,1 0,22±0,08 2,54±0,14 2,89±0,33 11,95±0,90 2,60±0,14 3,81±0,32
U. urens 0,8 ± 1,3 ND 0,66±0,04 10,60±1,53 21,69±0,72 11,42±1,11 10,11±1,59
U. membranacea 2,8±1,2 2,14±0,4 0,82±0,09 7,73±1,02 20,74±0,86 4,41±0,38 7,71±0,85
Contenu phénolique total (TPC); Teneur totale en flavonoïdes (TFC); Teneur totale en acide hydroxycinnamique (THC).
*Exprimé en g/100 g lyophilisé ; ** TEAC, équivalents Trolox (N=5) ; ND, non détecté.
MANUSCRIT
ACCEPTÉ
37
MANUSCRIT ACCEPTÉ
Tableau 3. Corrélations de classement de Spearman entre les paramètres d'activité
antioxydante et les teneurs totales en phénols, flavonoïdes et hydroxycinnamiques.
ABTS ABTS
PTC TFC THC DPPH FRAP
(pH 4,5) (pH 7,4)
corrélation r 0.600 0,976 0,857 0,857 0,881 0,976

PTC
P valeur ns < 0,001 0,011 0,011 0,007 < 0,001
corrélation r 0,600 0.600 0,900 0,600 1.000 0,600

TFC
P valeur ns ns ns ns 0,017 ns
corrélation r 0,976 0.600 0.800 0,867 0,850 0,917

THC
P valeur < 0,001 ns 0,014 0,005 0,006 0,001
corrélation r 0,857 0,900 0.800 0,783 0,950 0,867

DPPH
P valeur 0,011 ns 0,014 0,017 < 0,001 0,004
corrélation r 0,857 0,600
MANUSCRIT
0,867 0,783 0,783 0,883
ABTS
(pH 4,5) P valeur 0,011 ns 0,004 0,017 0,017 0,003
corrélation r 0,881 1,000 0,850 0,950 0,783 0,883

ABTS
(pH 7,4) P valeur 0,007 0,017 0,006 < 0,001 0,017 0,003
corrélation r 0,976 0,600 0,917 0,867 0,883 0,883

FRAP
P valeur < 0,001 ns 0,001 0,005 0,003 0,003
Contenu phénolique total (TPC); Teneur totale en flavonoïdes (TFC); Teneur totale en acide hydroxycinnamique (THC).
Les coefficients en gras sont significatifs (P < 0,05) ; ns – non significatif.
ACCEPTÉ
38
MANUSCRIT ACCEPTÉ
Tableau 4. Effet d' Urtica spp. extraits sur la viabilité des hépatocytes et des macrophages.
Viabilité cellulaire (% du contrôle)
Goûter HepG2 RAW 264.7
Contrôle 100,0 100,0
Ud (350 µg/mL) 74,60 ± 18,94 99,47 ± 1,81
Ud (200 µg/mL) 99,38 ± 18,21 88,08 ± 2,65
Uu (350 µg/mL) 95,78 ± 10,93 116,00 ± 36,63
Uu (200 µg/mL) 85,82 ± 13,52 83,64 ± 4,83
Um (350 µg/mL) 87,67 ± 16,16 127,13 ± 13,30
Um (200 µg/mL) 121,82 ± 13,00 110,13 ± 7,88
MANUSCRIT
Résultats pour Urtica dioica (Ud); Les extraits d'Urtica urens (Uu) et d'Urtica membranacea (Um) sont exprimés en
pourcentage de réduction du MTT par rapport aux cellules témoins maintenues en milieu de culture. Chaque valeur
représente la moyenne ± SEM d'au moins trois expériences indépendantes réalisées en double. Les résultats sont
exprimés en pourcentage de réduction du MTT par rapport aux cellules témoins maintenues en milieu de culture.
Chaque valeur représente la moyenne ± SEM d'au moins trois expériences indépendantes réalisées en double.
L'analyse statistique a été effectuée à l'aide d'une ANOVA à une voie suivie du test de Dunnett.
ACCEPTÉ
39
MANUSCRIT ACCEPTÉ
Résumé graphique
MANUSCRIT
ACCEPTÉ
40
MANUSCRIT ACCEPTÉ
Points forts:
Cinq polyphénols ont été identifiés pour la première fois chez U. urens et U. membranacea
Des flavones de type statine ont été identifiées dans U. membranacea
L'activité antioxydante est fortement corrélée aux composés phénoliques
Urtica dioica était le plus puissant antioxydant et U. urens plus antiinflammatoire
Aucun des extraits n'a montré de cytotoxicité pour les doses bioactives
MANUSCRIT
ACCEPTÉ
41

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Oud UuMANUSCRIT euh

1 13,97 250 ; 353 MS2 [353] : 191(100) ; 179(79); 3­ Acide O­caféoylquinique + + +

2 15,36 251 ; 311 MS2 [311] : 179(70) ; 178(4); Acide caféoyltartrique + ­ +

5 21,35 257 ; 295 sh; 353 MS2 [353] : 191(100) 5­ Acide O­caféoylquinique + + +

11 25.81 609 Lutéoline­di­C­hexoside ­ ­ +

13 28.11 295 sh; 593 ­ + +

14 28,93 290 sh; 337 ­ ­ +

16 29.63 280 sh; 337 ­ ­ +

19 33,61 257 ; 563 ­ ­ +

20 34,87 259 sh; 269 ; 447 MS2 [447] : 429(21) ; 399(3); Lutéoline­6­C­hexoside ­ ­ +

21 35,59 259 shillings ; 593 Lutéoline­6­C­rutinoside ­ ­ +

24 41,83 257 ; 609 + ­ ­

25 42,23 260sh ; 737 ­ ­ +

26 46,20 270 ; 338 721 MS2 [721] : 659(6) ; 619(36); Apigénine C­(3­hydroxy 3­

29 48,53 259sh ; 607 Diosmétine O­rutinoside ­ + +

30 49.05 256 ; 270sh ; 623 Isorhamnétine O­rutinoside + ­ ­

Urtica spp. TPC* TFC* THC* DPPH** ABTS** ABTS** FRAP**

U. dioica 7,9±1,1 0,22±0,08 2,54±0,14 2,89±0,33 11,95±0,90 2,60±0,14 3,81±0,32

U. urens 0,8 ± 1,3 ND 0,66±0,04 10,60±1,53 21,69±0,72 11,42±1,11 10,11±1,59

corrélation r ­ ­0.600 0,976 ­0,857 ­0,857 ­0,881 ­0,976

corrélation r ­0,600 ­ ­0.600 0,900 0,600 1.000 0,600

corrélation r 0,976 ­0.600 ­ ­0.800 ­0,867 ­0,850 ­0,917

corrélation r ­0,857 0,900 ­0.800 ­ 0,783 0,950 0,867

corrélation r ­0,881 1,000 ­0,850 0,950 0,783 ­ 0,883

corrélation r ­0,976 0,600 ­0,917 0,867 0,883 0,883 ­

Goûter HepG2 RAW 264.7

Contrôle 100,0 100,0

Ud (200 µg/mL) 99,38 ± 18,21 88,08 ± 2,65

Uu (350 µg/mL) 95,78 ± 10,93 116,00 ± 36,63

Uu (200 µg/mL) 85,82 ± 13,52 83,64 ± 4,83

Um (350 µg/mL) 87,67 ± 16,16 127,13 ± 13,30

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29 48,53 259sh ; 607 Diosmétine Orutinoside + +

30 49.05 256 ; 270sh ; 623 Isorhamnétine Orutinoside +

Urtica spp. TPC* TFC* THC* DPPH ABTS ABTS FRAP

corrélation r 0.600 0,976 0,857 0,857 0,881 0,976

corrélation r 0,600 0.600 0,900 0,600 1.000 0,600

corrélation r 0,976 0.600 0.800 0,867 0,850 0,917

corrélation r 0,857 0,900 0.800 0,783 0,950 0,867

corrélation r 0,881 1,000 0,850 0,950 0,783 0,883

corrélation r 0,976 0,600 0,917 0,867 0,883 0,883