VERSION 1 – DATE EFFECTIVE : 01/01/2016

PRÉPARATION DE SOLUTION
TAMPONNÉE À pH 7,2

DIAGNOSTIC MICROSCOPIQUE DU PALUDISME

MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS ­– DMP-MON-03A

1. OBJECTIF ET CHAMP D’ACTION

Fournir une description de la procédure à suivre pour la préparation de solution (eau) tamponnée à
pH 7,2, à utiliser pour préparer une solution de travail Giemsa pour la coloration de routine d’étalements
de sang à la recherche du paludisme.
Cette procédure ne peut être modifiée qu’avec l’approbation du coordonnateur national pour l’assurance
de la qualité du diagnostic microscopique du paludisme. Toutes les procédures exposées ici sont
obligatoires pour tous les techniciens de la microscopie travaillant dans les laboratoires nationaux de
référence, dans les laboratoires des hôpitaux ou dans les laboratoires médicaux de base au sein des
établissements sanitaires où sont effectués des examens microscopiques pour le diagnostic du paludisme.

2. HISTORIQUE
On observe très clairement les parasites du paludisme au microscope dans des étalements de sang
correctement colorés. Avant la coloration, il faut préparer la solution tamponnée qui servira à diluer le
colorant. L’emploi d’une solution tamponnée à un pH correct aide à garantir une bonne coloration.
Ce MON comprend trois volets :
• préparation d’une solution tamponnée à pH 7,2 ;
• préparation des solutions d’ajustement à 2% et
• vérification et ajustement du pH de l’eau tamponnée.

Le pH est une valeur exprimant l’acidité ou l’alcalinité d’un liquide. Il varie sur une échelle allant de près de
0 (très forte acidité) à 14 (très grande alcalinité). On qualifie de neutres les liquides qui ne sont ni acides,
ni alcalins ; leur pH est de 7,0. On mesure le pH d’un liquide avec un pH mètre ou avec un indicateur
coloré, comparateur de marque Lovibond, par exemple. On peut aussi utiliser du papier-pH, mais il se
dégrade rapidement en présence d’une forte humidité et perd sa fiabilité. Les programmes nationaux
de lutte contre le paludisme peuvent recommander l’utilisation de différents types de pH-mètre ou de
comparateurs. Les membres du personnel de laboratoire devraient apprendre à se servir du type en
usage dans leur laboratoire.
Ce MON décrit comment utiliser le comparateur de marque Lovibond pour mesurer le pH de
l’eau tamponneuse.
L’addition de certains sels, dit sels tampons, permet d’acidifier ou d’alcaliniser l’eau. On les conserve
séparément jusqu’au moment de les mélanger, en respectant les proportions correctes dans un volume
d’eau précis pour obtenir le pH voulu. Ces sels sont pesés sur une balance. Il est important de les conserver
correctement, à l’abri de l’humidité ambiante, faute de quoi ils ne rempliront pas leur fonction.
On trouve dans le commerce des comprimés prêts à l’emploi (comprimés tampons), donnant un pH bien
précis lorsqu’on les ajoute à un volume d’eau déterminé (en général un litre). Ces comprimés n’ont pas
besoin d’être pesés et sont utiles dans les structures ayant un équipement limité. Un MON distinct (DMP-
MON-03b) a été rédigé à l’intention des laboratoires utilisant les comprimés tampons. Il faut en revanche
conserver les comprimés dans des tubes fermés hermétiquement et au sec. Dans le cas contraire,
ils absorbent rapidement l’humidité et doivent être jetés. Certains pensent que lorsqu’on utilise ces
comprimés, les résultats obtenus à la coloration sont moins bons, mais aucune preuve concrète n’indique
que cela soit effectivement le cas.
DMP–MON–03A : PRÉPARATION DE SOLUTION TAMPONNÉE À PH 7,2

3. FOURNITURES, MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT

3.1. Préparation d’eau tamponnée à pH 7,2
• Une balance analytique d’une sensibilité de 0,01 g (une balance à deux plateaux convient
parfaitement). Divers types de balances électriques à plateau unique sont disponibles, faciles à
utiliser et conviennent également.
• Du papier filtre de 11 cm de diamètre.
• Une flasque d’Erlenmeyer (flacon conique) en verre de 1 litre.
• Un bécher en verre de 250 ml.
• Des spatules en bois (les abaisse-langues sont facilement disponibles).
• De l’eau distillée ou déionisée, 1 litre.
• Du dihydrogénophosphate de potassium (anhydre) (KH2PO4).
• Du monohydrogénophosphate disodique (anhydre) (Na2HPO4).
• Des étiquettes.
• Un flacon en verre de 1 litre ou de 500 ml, propre, sec et se fermant hermétiquement.

3.2. Préparation des solutions d’ajustement à 2%

• Une balance analytique d’une sensibilité égale ou supérieure à 0,01 g (une balance à deux plateaux
convient parfaitement ou utilisez une balance électrique à un plateau).
• Du papier filtre de 11 cm de diamètre.
• Deux flacons en verre à bouchon rodé de 100 ou 150 ml chacun.
• Du dihydrogénophosphate de potassium (anhydre) (KH2PO4).
• Du monohydrogénophosphate disodique (anhydre) (Na2HPO4).
• De l’eau distillée ou déionisée, environ 200 ml.
• Des spatules en bois.
• Deux béchers de 250 ml.
• Une éprouvette graduée de 100 ml.
• Des étiquettes.

3.3. Vérification et ajustement du pH de la solution tamponnée

• Une flasque d’Erlenmeyer contenant de l’eau tamponnée.
• Les deux flacons contenant les solutions d’ajustement.
• Un pH-mètre (portatif ou tenu à la main) ou le papier indicateur de pH et ses éléments connexes.

Si vous utilisez un comparateur de marque Lovibond, vous aurez besoin de :

• deux cuves en verre pour le comparateur de pH ;
• un flacon de bleu de bromothymol et
• une pipette de 1 ml.

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DMP–MON–03A : PRÉPARATION DE SOLUTION TAMPONNÉE À PH 7,2
4. PROCÉDURE
schéma
4.1. Préparez de la solution (eau) tamponnée
à pH 7,2
1. Pesez 0,7 g de
dihydrogénophosphate de
potassium (KH2PO4).
2. Mettez le KH2PO4 que vous venez de
peser dans un bécher en verre. Ajoutez
150 ml d’eau. Remuez avec une spatule
en bois jusqu’à dissolution du sel.
3. Pesez 1 g de Na2HPO4.
4. Ajoutez le Na2HPO4 à la solution dans
le bécher et remuez.
5. Versez la solution dans la flasque
d’Erlenmeyer et rajoutez de l’eau jusqu’à
la graduation de 1 litre.
6. Transvasez l’eau tamponnée dans
un flacon en verre. Étiquetez le flacon et
consignez votre activité dans le registre
de contrôle de la qualité.
7. Conservez l’eau
tamponnée dans un endroit frais à
l’abri de la lumière.
DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ
1. Pesez 0,7 g de dihydrogénophosphate
de potassium (KH2PO4) sur une balance à
deux plateaux:
Assurez-vous que l’indicateur de la balance
est à zéro en ajustant la vis de réglage sur le
bras droit. Mettez un disque de papier filtre
dans chaque plateau ; mettez la balance à
zéro, cette fois-ci en déplaçant le curseur le
long de la tige graduée. Déplacez le curseur
de 0,7 g le long de la tige graduée pour
peser le KH2PO4. Avec une spatule en bois,
mettez du KH2PO4 sur le papier filtre sur le
plateau de gauche jusqu’à arriver à 0,7 g.
2. Mettez le KH2PO4 que vous venez de peser
dans le bécher en verre, ajoutez environ
150 ml d’eau et remuez avec une spatule
propre jusqu’à dissolution du sel.
3. Pesez 1 g de Na2HPO4.
Mettez un nouveau disque de papier filtre
dans le plateau de gauche. Réglez la
balance comme la fois précédente, cette
fois-ci en amenant le curseur à 1 g. Avec une
spatule sèche et propre, mettez le Na2HPO4
sur le plateau de droite, en équilibrant la
balance comme décrit ci‑dessus.
4. Ajoutez le Na2HPO4 à la solution dans le
bécher et remuez comme à l’étape 2.
5. Après dissolution des sels, versez la solution
dans la flasque d’Erlenmeyer et rajoutez de
l’eau jusqu’à la graduation de 1 litre.
6. Transvasez l’eau tamponnée dans un
flacon en verre. Étiquetez-le clairement et
consignez votre activité dans le registre de
contrôle de la qualité, en indiquant la date
de la préparation, la date de péremption
et le nom de la personne ayant préparé
le tampon.
Eau tamponnée, pH 7,2
Date de la préparation : 3 juin 2015
Date de péremption : 10 juin 2015
Préparé par : nom, prénom
7. L’eau tamponnée peut être conservée
pendant sept jours maximum dans un flacon
fermé hermétiquement et dans un endroit
frais, à l’abri des rayons directs du soleil.
Il est recommandé d’utiliser un flacon en
verre brun ou de couleur sombre.
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DMP–MON–03A : PRÉPARATION DE SOLUTION TAMPONNÉE À PH 7,2
schéma
4.2.1. Préparation de Na2HPO4 à 2%
1. Pesez 2 g de Na2HPO4.
2. Mettez le produit dans 100 ml
d’eau dans le bécher. Remuez jusqu’à
dissolution des sels.
3. Versez la solution dans un flacon en
verre et étiquetez-le.
4. Conservez le flacon
dans un endroit frais et à l’abri de la
lumière du soleil.
4.2.1. Préparation de KH2PO4 à 2%
1. Pesez 2 g de KH2PO4 .
2. Mettez le produit dans 100 ml
d’eau dans le bécher. Remuez jusqu’à
dissolution des sels.
3. Versez la solution dans un flacon en
verre et étiquetez-le.
4. Conservez le
flacon dans un endroit frais et à l’abri
de la lumière du soleil.
DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ
4.2.1. Préparation de Na2HPO4 à 2%
1. Pesez 2 g de Na2HPO4.
2. Mettez le produit dans 100 ml d’eau dans
un bécher propre et remuez avec la spatule
jusqu’à dissolution des sels.
3. Versez la solution dans l’un des flacons
en verre et étiquetez-le avec la mention :
« Na2HPO4 à 2% ». Inscrivez la date de
la préparation et le nom de la personne
ayant préparé la solution d’ajustement
sur l’étiquette.
4. Conservez le flacon de Na2HPO4 à 2 % au
frais et à l’abri de la lumière du soleil.
4.2.2.Préparation de KH2PO4 à 2%
1. Pesez 2 g de KH2PO4 .
2. Mettez le produit dans 100 ml d’eau dans
un bécher propre et remuez avec la spatule
jusqu’à dissolution des sels.
3. Versez la solution dans l’un des flacons
en verre et étiquetez-le avec la mention :
« KH2PO4 à 2 % ». Inscrivez la date de la
préparation et le nom de la personne
ayant préparé la solution d’ajustement
sur l’étiquette.
4. Conservez le flacon de KH2PO4 à 2 % au frais
et à l’abri de la lumière du soleil.
4
DMP–MON–03A : PRÉPARATION DE SOLUTION TAMPONNÉE À PH 7,2
schéma
4.3. Vérification et ajustement du pH de l’eau
tamponnée
La méthode d’utilisation du comparateur Lovibond
pour mesurer le pH est la suivante.
1. Versez de
l’eau tamponnée à tester
dans chacune des cuves en verre
du comparateur jusqu’au trait
indiquant 10 ml.
2. Mettez une cuve dans le
compartiment de gauche du
comparateur ; elle servira de témoin.
3. Avec la pipette, mettez 0,5 ml de
bleu de bromothymol dans l’autre cuve,
mélangez et placez cette deuxième cuve
dans le compartiment de droite.
4. Tournez le disque coloré jusqu’à ce
que la couleur soit identique à celle de la
solution dans la cuve du compartiment
de droite.
5. Ajuster le pH de l’eau restant dans
la flasque d’Erlenmeyer en ajoutant
deux ou trois gouttes de la solution qui
convient.
6. Répétez les
étapes 1 à 5 jusqu’à l’obtention du
pH à 7,2.
DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ
Vérifiez systématiquement le pH de l’eau
tamponnée avant de vous en servir. Pour corriger le
pH, ajoutez de petites quantités de l’une ou l’autre
des solutions d’ajustement : la solution de Na2HPO4
à 2 % si le pH est inférieur à 7,2 (trop acide) ou la
solution de KH2PO4 à 2 % si le pH est supérieur à 7,2
(trop alcaline). Les ajustements peuvent se faire en
employant la méthode décrite ci-après.
La méthode d’utilisation du comparateur Lovibond
pour mesurer le pH est la suivante.
1. Versez de l’eau tamponnée à tester dans
chacune des cuves en verre du comparateur
jusqu’au trait indiquant 10 ml.
2. Mettez une cuve dans le compartiment
de gauche du comparateur ; elle servira
de témoin.
3. Avec la pipette, mettez 0,5 ml de bleu de
bromothymol dans l’autre cuve, mélangez
et placez cette deuxième cuve dans le
compartiment de droite.
4. En tenant le comparateur sur un fond blanc
bien éclairé, tournez le disque coloré jusqu’à
ce que la couleur soit identique à celle de
la solution dans la cuve du compartiment
de droite.
5. Ajoutez le pH de l’eau restant dans la
flasque d’Erlenmeyer en ajoutant deux ou
trois gouttes de la solution qui convient :
Na2HPO4 pour l’alcaliniser, KH2PO4 pour
l’acidifier. Remuez avec une spatule propre.
6. Contrôlez le pH de l’eau tamponnée en
répétant les étapes 1 à 5. Continuez jusqu’à
l’obtention du pH correct à 7,2.
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DMP–MON–03A : PRÉPARATION DE SOLUTION TAMPONNÉE À PH 7,2

5. REMARQUES
• Différents types de pH-mètres sont disponibles. Il est recommandé aux membres du personnel
d’apprendre à se servir du type en usage dans leur laboratoire.
• Il est préférable de conserver l’eau tamponnée dans un endroit frais et à l’abri de la lumière
directe du soleil. Il est recommandé d’utiliser un flacon de couleur sombre ou un flacon en
verre transparent enveloppé dans du papier brun afin d’éviter la prolifération de bactéries,
de champignons et d’algues.
• Vérifiez systématiquement que l’eau n’a pas été contaminée.
• Ne conservez pas la solution tampon au-delà de sept jours afin d’éviter les changements dans la
valeur du pH et la contamination.
• Vérifiez le pH de l’eau tamponnée avant chaque utilisation et consignez le résultat dans le registre
de contrôle de la qualité.

6. CONTRÔLE DE LA QUALITÉ ET DOCUMENTATION

Effectuez un test de contrôle de la qualité pour chaque nouveau lot d’eau tamponnée et avant de vous en
servir. Consignez vos informations dans le registre de contrôle de la qualité. Voir DMP-MON 3c : Contrôle
de la qualité de la solution mère de Giemsa et de l’eau tamponnée.

7. MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS CONNEXES

DMP-MON 3c : Contrôle de la qualité de la solution mère de Giemsa et de l’eau tamponnée

8. RÉFÉRENCE
OMS. Techniques de bases pour le diagnostic microscopique du paludisme – Partie I : Guide du stagiaire.
Genève, 2010.

9. HISTORIQUE DU DOCUMENT
Date Personne responsable
Version Commentaires
(mmm/aaaa) (nom, prénom)
Examiné et finalisé par Gonzales, Glenda
Janv. 2016 1 des experts, édité et mis Fonctionnaire
en page technique, WPRO

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