Spécialité : Hématologie

Laboratoire : Institut IMAGINE – U1163, Laboratory of molecular mechanisms of

hematologic disorders and therapeutic implications

Thèse de doctorat
En vue de l’obtention du diplôme de : Docteur d’Université de Paris

Mécanismes de contrôle de l’inflammation dans l’arthropathie

hémophilique par les fibroblastes-like
synoviocytes (FLS) et le FVIII

Présentée et soutenue publiquement par :

Sandra MIGNOT
Le 26 Février 2020 à Paris

Thèse dirigée par le Pr. Olivier HERMINE

Jury :
Pr Martine Cohen-Solal Présidente
Pr Philippe Georgel Rapporteur
Pr Delphine Borgel Rapporteur
Dr Sébastien Lacroix Desmazes Examinateur
Pr Jean Sibilia Examinateur
Dr Gaëtane Nocturne Examinateur
Dr Laurent Frenzel Examinateur/Co-encadrant
REMERCIEMENTS

Ces années de thèse ne se résument pas simplement à trois années de travail mais à cinq années
passées au sein du laboratoire. Les derniers moments n’auront pas été les plus simples mais je
suis ravie d’avoir pu mener à terme ce travail. Cela aurait été impossible sans l’aide des
personnes m’ayant soutenu, directement ou indirectement.

Je commencerai ces remerciements par le Professeur Martine Cohen-Solal. Merci de me faire

l’honneur de présider cette thèse. Cela fait maintenant trois ans que vous suivez mon travail par
le biais de mes comités de suivi de thèse et je suis ravie de pouvoir vous présenter
l’accomplissement de celui-ci.

Je remercie le Professeur Philippe Georgel d’avoir accepté de juger cette thèse en tant que
rapporteur. Je n’ai pas eu la chance de pouvoir travailler directement avec vous mais votre
grande connaissance sur les FLS en particulier est enrichissante pour mon travail.

Je remercie le Professeur Delphine Borgel d’être également mon rapporteur. Merci d’avoir
pris du temps pour moi et merci pour ces réunions du jeudi après-midi (même si je ne
comprenais pas toujours tout !) qui étaient très enrichissantes et intéressantes. Merci de
m’apporter la connaissance des facteurs de la coagulation du point de vue du biologiste. Je
remercie au passage le Docteur Peter Lenting qui, pour des raisons administratives, n’a
malheureusement pas pu juger ma thèse mais je le remercie pour tous ses conseils durant mes
trois ans de travail.

Je remercie le Professeur Jean Sibilia d’avoir accepté d’être examinateur sur cette thèse. Je
suis ravie de vous compter dans mon jury de thèse en sachant votre contribution sur la thèse du
Docteur Laurent Frenzel. Je suis honorée d’être « sur ses pas ».

Je remercie le Docteur Gaétane Nocturne. Je n’ai pas eu la chance de travailler directement

avec vous mais je vous remercie d’apporter votre connaissance clinique sur la rhumatologie sur
ce travail.

Je remercie le Docteur Sébastien Lacroix Desmazes d’avoir accepté d’être examinateur mais
également d’avoir été présent tout au long de ma thèse. Dernier membre de mon comité de suivi
de thèse initial, merci de tous vos conseils très avisés et constructifs, dès la première année qui
ont su donner à ma thèse une autre direction. Merci d’avoir partagé vos connaissances et
compétences sur le FVIII. J’en profite pour remercier également Sandrine Delignat pour tous
les instants que j’ai pu lui prendre pour me partager les réactifs ou m’expliquer les protocoles.
Je suis ravie d’avoir pu collaborer avec vous sur mon deuxième papier.

Je voudrai bien entendu remercier mon directeur de thèse, le Professeur Olivier Hermine.
Merci de m’avoir accepté dans votre laboratoire et maintenant dans votre service. Merci pour
vos ouvertures sur cette thèse. Et merci pour les discussions le soir au labo !

Il me paraît inconcevable de terminer les remerciements de jury autrement que par le Docteur
Laurent Frenzel. Finalement, de médecin à chef, il n’y a qu’un pas et merci de m’avoir donné
cette opportunité. Vous avez été présent et vous m’avez guidé depuis mon arrivée au
laboratoire. Surtout, vous m’avez permis d’avancer dans une période compliquée, vous m’avez
fait confiance depuis mon M1 et jusqu’à aujourd’hui encore. Vous avez toujours pris le temps
de regarder mes résultats et de me conseiller pour la suite. Vous m’avez appris à rédiger des
rapports de suivi, des demandes de financement, des articles correctement et vous m’avez
permis de comprendre comment organiser mes présentations orales et me permettre d’être un
peu plus à l’aise devant un auditoire. Merci de m’avoir comprise quand je vous ais dit que je
voulais faire de la recherche clinique et de m’avoir alors donné la chance de pouvoir intégrer le
centre de référence de l’hémophilie. Pour tout ceci, je ne vous remercierai jamais assez, j’ai
toutes les cartes en main grâce à vous pour avancer dans ma future carrière.

Je remercie les membres du laboratoire, actuels ou anciens, pour ces moments passés avec
vous et pour le partage des connaissances. Je remercie en particulier Marie, Elisa, Manon,
Marion, Guillemette, Geneviève, Hervé, Flavia, Florence, Sophia, Lucile, Leïla, Laura, Elia,
Héloïse, Pascal, Mike, Kan, Madeleine, Martin, Thiago, Caroline, Rachel, Matthias, Mirjana,
Asma, Bahia, Anne Florence, Barbara, … J’oublie certainement des personnes, je m’en
excuse… Merci aux différentes étudiantes que j’ai pu encadrer. J’ai une pensée toute
particulière pour Ivan, j’aurai aimé que tu sois là et tu me le répétais assez souvent mais
malheureusement la vie en a décidé autrement…

Je remercie les membres du CRTH, ma nouvelle équipe. Je remercie en particulier Thamila

pour m’avoir intégrée dans son équipe et m’apprendre les rouages de la recherche clinique.
Merci de me challenger au-delà de la fonction d’ARC et merci pour nos discussions animées
pendant nos pauses !

Je remercie Michelle, cette dernière année de thèse sans toi n’aurait pas été la même sinon.
Merci d’avoir été là quand je me suis retrouvée un peu perdue et déboussolée. Je suis heureuse
d’avoir pu lier cette amitié et de pouvoir partager ces moments avec toi. N’oublie pas que les
licornes existent et surtout que certaines pluies peuvent mouiller ;) J’espère que tu vas trouver
ce que tu as envie de faire au plus profond de toi et que tu pourras t’épanouir.

Te remercier Justine ne va pas être chose simple ! Je me souviens très bien de notre première
rencontre au labo, mon premier jour de stage, devant la machine à café, ça aura été un coup de
cœur amical je pense nous deux ! Merci pour toutes ces années de labo et bien au-delà
maintenant. On en aura traversé des périodes ensemble, des plus joyeuses aux plus tristes,
surtout ces derniers mois mais on aura toujours su compter l’une sur l’autre (et ça sera toujours
le cas j’en suis sûre). Merci de m’avoir fait rentrer dans ta famille que j’adore (très accueillants
ces grecs !!). Je suis contente de te voir renouer avec ton amour de la médecine et je te souhaite
tout le bonheur du monde. En tout cas, Tic et Tac ne sont pas prêtes de s’éloigner !!

Je remercie mes amis. Mes cop’s #1 (Laure, Audrey et Carine), depuis Limoges, on en a
partagé des choses et on a grandi et évolué ensemble. Je suis heureuse de voir les femmes que
nous sommes devenues et l’amitié qui nous lient, merci. Mes trois compatriotes de licence de
biologie (Claire, Delphine et Alexandre) qui m’ont accueilli à ce moment-là, je suis ravie de
vous compter dans ma vie. Même si on se voit beaucoup moins, vous êtes toujours présents,
merci.

Je remercie Julien, qui a intégré ma vie en cours de thèse et qui a été très patient surtout en
cette dernière période. Merci de supporter mes dimanches après-midi devant Les Frères Scott ;)
Je voulais te redire à quel point je suis fière de toi et de ce que tu accomplis en ce moment et
fais toi confiance… Je n’ai pas besoin de m’étendre ici, tu sais déjà tout. Je veux juste te dire
« J’te kiffe ».

Je remercie ma famille pour leur soutien sans faille, sans eux tout ceci n’aurait pas été possible.
Merci à Estelle, ma petite sœur, pour ces années de colocation, je n’en garde que de bons
souvenirs et je suis heureuse d’avoir pu partager cela avec toi, cela n’aura fait qu’accroitre notre
complicité. Bientôt ton tour de franchir la plus grande étape de ta vie actuelle, je te souhaite que
de la réussite ! Merci à ma grand-mère Yvonne d’être mon soutien au quotidien, merci de ton
petit appel tous les soirs. Je remercie mes parents, Nicole et Pascal. Vous savez très bien que
je ne sais pas me livrer sur mes sentiments envers vous mais cela n’enlève en rien de l’amour
que je vous porte, j’espère que vous serez fiers de votre grande fille…

Enfin, je finis ces remerciements avec une certaine émotion et les yeux emplis de larmes… Je
dédie cette thèse à mon grand-père, j’espère que tu me voies de là-haut et que tu es fier de ce
que j’accomplis… Tu me manques…
 Table des matières

Table des illustrations ......................................................................................................................... 5

Abréviations ....................................................................................................................................... 7
INTRODUCTION .......................................................................................................................... 13
Chapitre 1 : Coagulation et hémophilie ......................................................................................... 15
1. Coagulation ........................................................................................................................... 15
a. Hémostase : généralités..................................................................................................... 15

b. La coagulation et ses voies ................................................................................................. 16

2. L’hémophilie......................................................................................................................... 19
a. Généralités ........................................................................................................................ 19

b. Un peu d’histoire ..................................................................................................... 19

c. Manifestations cliniques .................................................................................................... 20

d. Traitements ....................................................................................................................... 21

i. Les dérivés plasmatiques................................................................................................ 23

ii. Les facteurs recombinants .............................................................................................. 23
iii. Le traitement pour les patients avec inhibiteurs .......................................................... 24
iv. Les nouveaux traitements ........................................................................................... 24
v. L’émergence de la thérapie génique ............................................................................... 26
Chapitre 2 : L’arthropathie hémophilique, de sa définition à sa physiopathologie ...................... 28
1. Généralités ............................................................................................................................ 28
2. D’un point de vue clinique ........................................................................................................ 28
3. Contexte génétique et rôle de l’environnement........................................................................... 31
4. Focus sur les traitements............................................................................................................ 31
a. Traitement substitutif ............................................................................................................ 31

b. Réeducation .......................................................................................................................... 32

c. Traitement chirurgical............................................................................................................ 32

5. Physiopathologie ....................................................................................................................... 32
a. Cellules de l’immunité adaptative ............................................................................ 33

b. Cellules de l’immunité innée.................................................................................... 34

c. Cellules résidentes............................................................................................................. 34

1
 d. Cellules osseuses et du cartilage ........................................................................................ 36

6. Rôle du fer ................................................................................................................................ 38

a. Origine du fer .................................................................................................................... 38

b. D’un point de vue moléculaire ................................................................................. 39

c. Comparaison avec d’autres types d’arthrites ........................................................... 40

i. Arthropathie rencontrée dans l’hémochromatose ............................................................ 40

ii. Polyarthrite rhumatoïde.................................................................................................. 41
iii. L’arthrose .................................................................................................................. 41
iv. En résumé .................................................................................................................. 42
7. Rôle des autres éléments du sang ............................................................................................... 44
a. Plaquettes ......................................................................................................................... 44

i. Eléments physiologiques................................................................................................ 45
ii. Eléments pathologiques ................................................................................................. 46
b. Globules rouges ................................................................................................................. 46

Chapitre 3 : Rôles des facteurs de la coagulation .......................................................................... 48

1. Les facteurs de la coagulation ................................................................................................ 48
a. Définition générale ............................................................................................................ 48

b. Biogénèse.......................................................................................................................... 49

c. Fonctions des facteurs de la coagulation ............................................................................ 50

i. Rôle dans la coagulation ................................................................................................ 50

ii. Autres rôles ................................................................................................................... 51
2. Le FVIII ................................................................................................................................ 52
a. Historique.......................................................................................................................... 52

b. Caractérisation biochimique .............................................................................................. 52

i. Domaines A................................................................................................................... 53
ii. Domaine B .................................................................................................................... 53
iii. Domaines C ............................................................................................................... 54
c. Biosynthèse et sécrétion du FVIII ....................................................................................... 54

i. Biosynthèse ................................................................................................................... 54
ii. Sécrétion et liaison au vWF .................................................................................................... 54
d. Activation et inactivation du facteur de la coagulation ....................................................... 55

e. Catabolisme du FVIII .......................................................................................................... 56

2
 f. Rôles du FVIII ..................................................................................................................... 57

i. Rôle dans la coagulation ................................................................................................ 57

ii. Rôles du FVIII en dehors de la coagulation .................................................................... 58
1. Rôles associés à l’hémophilie ..................................................................................... 58
2. Rôles associés au FVIII .............................................................................................. 59
Chapitre 4 : Inflammation, TLR et lien avec la coagulation ......................................................... 61
1. L’inflammation ..................................................................................................................... 61
a. Définition .......................................................................................................................... 61

b. Rôles de l’inflammation ........................................................................................... 62

2. Toll-like récepteur (TLR) ...................................................................................................... 63

a. Découverte des Toll-like receptors (TLR) ............................................................................ 63

b. Les TLR et leurs ligands ...................................................................................................... 64

c. Signalisation induite par les TLR ......................................................................................... 68

i. Voies de signalisation dépendantes de myd88 ................................................................ 69

ii. Voies de signalisation dépendantes de TRIF ................................................................... 70
d. Autres familles de PRR ....................................................................................................... 71

i. Les CLR ........................................................................................................................ 71

ii. Les RLR ........................................................................................................................ 71
iii. Les NLR .................................................................................................................... 71
iv. Résumé de signalisations induites par les autres familles de PRR................................ 72
3. Relation entre inflammation et coagulation ............................................................................ 73
a. Principes généraux ............................................................................................................ 73

b. Liens et acteurs.................................................................................................................. 74

i. Le facteur tissulaire (FT) ................................................................................................ 74

ii. La thrombine et PAR ..................................................................................................... 75
iii. La protéine C, la thrombomoduline et le récepteur à la protéine C .............................. 76
iv. Acteurs dans l’immunité innée ................................................................................... 76
1. Les TLR .................................................................................................................... 76
2. Le complément .......................................................................................................... 77
v. Les Neutrophils Extracellulars Traps.............................................................................. 77
Chapitre 5 : Régulation post-transcriptionnelle par dégradation de l’ARNm.............................. 78
1. ARNm : de sa structure à sa dégradation, en passant par sa stabilité ....................................... 78
a. Structure ........................................................................................................................... 78

3
 b. Dégradation ...................................................................................................................... 78

c. Stabilité ................................................................................................................................. 79

2. Les microARNs (miARN) ..................................................................................................... 79

a. Découverte ........................................................................................................................ 79

b. Définition, fonction et localisation ..................................................................................... 80

c. Nomenclature ................................................................................................................... 80

d. Biogénèse.......................................................................................................................... 82

e. Interaction entre le miARN et l’ARNm cible................................................................. 84

f. Action ................................................................................................................................ 85

i. Dégradation des ARNm par les miARN ......................................................................... 85

ii. Répression de la traduction des ARNm .......................................................................... 86
iii. Activation de la traduction ......................................................................................... 86
iv. Résumé ...................................................................................................................... 87
g. Rôle des miARNs.................................................................................................................... 88

3. Autres systèmes de contrôle épigénétique : l’acétylation des histones et la méthylation de

l’ADN........................................................................................................................................... 90
a. Acétylation des histones .................................................................................................... 90

i. Généralités .................................................................................................................... 90
ii. Implication dans l’AH et la PR....................................................................................... 91
b. Méthylation de l’ADN ............................................................................................... 91

i. Généralités .................................................................................................................... 91
ii. Implication dans l’AH et la PR....................................................................................... 92
OBJECTIFS .................................................................................................................................... 93
RESULTATS .................................................................................................................................. 97
TRAVAUX 1................................................................................................................................ 99
TRAVAUX 2.............................................................................................................................. 135
ANNEXES ..................................................................................................................................... 167
BIBLIOGRAPHIE........................................................................................................................ 177

4
 Table des illustrations

Figures

Figure 1 : Hémostase ............................................................................................................ 15

Figure 2 : Hémostase secondaire ou coagulation ................................................................... 17
Figure 3 : Phases de la coagulation ....................................................................................... 18
Figure 4 : Evolution de la prise en charge du traitement de l’hémophilie ............................... 22
Figure 5 : Illustration d’une hémarthrose............................................................................... 29
Figure 6 : Etapes du développement d’une arthropathie hémophilique .................................. 30
Figure 7 : Schéma général de la pathogénèse de l’arthropathie hémophilique ........................ 33
Figure 8 : Principaux mécanismes d’activation des FLS ............................................................ 36
Figure 9 : Concept actuel proposé de la physiopathologie de l’arthropathie hémophilique : rôle
prédominant du fer ........................................................................................................................ 38
Figure 10 : Concept proposé d’évolution de la physiopathologie de l’arthropathie
hémophilique : place centrale des cellules sanguines anucléées et des facteurs de la coagulation.
.............................................................................................................................................44
Figure 11 : Représentation schématique en domaines du FVIII complet ................................ 52
Figure 12 : Représentation de l’activation du FVIII afin d’obtenir le FVIIIa.......................... 56
Figure 13 : Structure d’une chaine polypeptidique de TLR.................................................... 66
Figure 14 : Localisation cellulaire des TLR ........................................................................... 67
Figure 15 : Voies de signalisation TLR ................................................................................. 68
Figure 16 : Voies de signalisation CLR, RLR et NLR ........................................................... 73
Figure 17 : Biogénèse des miARN. ....................................................................................... 83
Figure 18 : Modes d’action des miARN. ............................................................................... 87

5
 Tableaux

Tableau 1 : Comparaison des nouveaux produits pour le traitement de l’hémophilie, hors

facteurs de la coagulation...................................................................................................... 26
Tableau 2 : Etat d’avancement de la thérapie génique dans l’hémophilie à l’heure actuelle 27
Tableau 3 : Différences dans les caractéristiques cliniques et physiopathologiques entre
l’arthropathie hémophilique, la polyarthrite rhumatoïde, l’arthropathie rencontrée dans
l’hémochromatose et l’arthrose ............................................................................................. 43
Tableau 4 : Caractéristiques des facteurs de la coagulation.................................................... 49
Tableau 5 : Modes de synthèse et de régulation des facteurs de la coagulation ...................... 50
Tableau 6 : Systèmes et processus affectés par le FVIII et/ou par l’hémophilie ..................... 60
Tableau 7 : Les TLR et leurs ligands..................................................................................... 65
Tableau 8 : Nomenclature pour les miARN d’origine mammifères........................................ 81
Tableau 9 : Exemples de miARN avec leurs cibles potentielles et leurs implications dans les
pathologies ........................................................................................................................... 89

6
 Abréviations

AAV : adénovirus associé

ADAMTS : a desintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs / désintégrine et

métalloprotéase avec des motifs de thrombospondine

ADN : acide désoxyribonucléique

ADP : adénosine diphosphate

AGO : famille argonaute

AH : arthropathie hémophilique

AP-1 : protéine activatrice-1

APC : protéine C activée

ARN : acide ribonucléique

ARNm : acide ribonucléique messager

BiP : Ig-binding protein / protéine de liaison aux immunoglobulines

C5a : complément 5 activé

CARD : caspase activation and recruitment domains / domaines d’activation et de

recrutement de caspases

CD- : cluster de différentiation-

CLR : C-Type Lectin Receptor / récepteur lectine de type C

DAMP : motifs moléculaires associés aux dégâts

DMNT : ADN méthyltransférase

7
DMO : densité minérale osseuse

DRBP : dsRNA binding protein / protéine de liaison à l’ARN double brin

EPCR : récepteur endothélial à la protéine C

Exp5 : exportine-5

Fe : fer

FLS : fibroblaste-like synoviocyte

FT : facteur tissulaire

F-X : facteur de la coagulation-(nombre en chiffre romain)

HAT : histone acétylase

HDAC : histone désacétylase

HFE : protéine de l’hémochromatose humaine

HCV : virus de l’hépatite C

HIV : virus de l’immunodéficience humaine

HLA : human leukocyte antigen / antigène leucocytaire humain

IFN : interféron

IKB : protéine kinase

IL-X : interleukine-X

ITI : induction de la tolérance immunitaire

IRAK : interleukin-1 receptor-associated kinase/ kinase associée au récepteur d’interleukine-1

IRF : interferon regulatory factor / facteur de régulation de l’interféron

8
 J

JAK : famille des Janus Kinase

LDL/LDLR : lipoprotéine de basse densité/récepteur aux lipoprotéines de basse densité

LGP2 : probable ATP-dependant RNA helicase / hélicase ARN dépendante de l’ATP

LPS : lipopolysaccharide

LRP1 : low density lipoprotein receptor-related protein 1 / protéine-1 liée aux récepteurs des
lipoprotéines de basse densité

LRR : répétition riche en leucine

MDA5 : melanoma differentiation-associated protein 5 / protéine-5 associée à la

différenciation des mélanomes

MAK : male germ cell associated kinase / kinase associée aux cellules germinales mâles

MCP-1 : monocyte chemoattractant protein 1 / protéine-1 chimioattractante des monocytes

miARN : micro ARN

MIP-1α : macrophage inflammatory protein 1α / protéine inflammatoire 1α des macrophages

MMP : métalloprotéinase

MRE : élément de réponse aux miARN

NEMO : NF-κB essential modulator / modulateur essentiel NF-κB

NET : neutrophil extracellular trap / piège extracellulaire de neutrophiles

NF-κB : nuclear factor-κB / facteur nucléaire-κB

NLR : nucleotide oligomerization domain receptor / récepteur de domaine d’oligomérisation

nucléotidique

NOD : nucleotide oligomerization domain / domaine d’oligomérisation de nucléotides

9
 O

OA : ostéoarthrite/arthrose

PAMP : motifs moléculaires associés aux pathogènes

PAR : récepteur activé par la protéinase

PCa : protéine C activée

PDGF : platelet derived growth factor / facteur de croissance dérivé des plaquettes

piARN : piwi ARN

PI3K : phosphoionositide 3-kinase

PR : polyarthrite rhumatoïde

PRR : pattern recognition receptor / récepteur de reconnaissance

PS : protéine S

RANK/RANKL : receptor activator of nuclear factor kappa-B/ receptor activator of nuclear

factor kappa-B ligand – activateur du récepteur du facteur nucléaire-κB / ligand de
l’activateur du récepteur du facteur nucléaire-κB

RasiRNA : repeat-associated siRNA / répétition siARN

RBP : RNA-binding proteins / protéine de liaison à l’ARN

RE : réticulum endoplasmique

RIPK1 : receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 / récepteur interagissant avec la

protéine kinase 1 sérine/thréonine

RLR : récepteur induit par l’acide rétinoïque

mRNP : messenger ribonucleoprotein / ribonucléoprotéine messagère

ROS : espèces réactives de l’oxygène

10
 S

SDF : stromal cell-derived factor / factor dérivé des cellules stromales

siARN : small interfering ARN / petit ARN interférent

SLE : lupus érythémateux disséminé

TAFI : inhibiteur de la fibrinolyse activable par la thrombine

TANK : TRAF family member-associated NF-κB activator / activateur NF-κB associé aux
membres de la famille TRAF

TBK : TANK-binding kinase / kinase de liaison à TANK

TFPI : tissue factor pathway inhibitor / inhibiteur de la voie du facteur tissulaire

TGF : transforming growth factor / transformateur de facteur de croissance

TIR : Toll/interleukin-1 receptor / récepteur de toll/interleukine-1

TIRAP : toll/interleukin-1 receptor domain-containing adaptor protein / protéine adaptatrice

contenant le domaine du récepteur toll/interleukin-1

TLR : Toll like receptor / récepteur à « péage »

TM : thrombomoduline

TNF-α : tumor necrosis factor α / facteur de nécrose tumoral α

TRAF : TNF receptor associated factors / facteurs associés aux récepteurs du TNF

TRAM : translocating chain-associated membrane protein / translocation de la membrane

membranaire associée à une chaine

TRIF : TIR domain containing adapter inducing interferon-β / domaine TIR contenant un
adaptateur induisant l’interféron-β

VCAM : vascular cell adhesion molecule / molécule d’adhésion aux cellules vasculaires

VEGF : vascular endothelial growth factor / facteur de croissance endothélial vasculaire

vWF : facteur von Willebrand

11
12
INTRODUCTION

13
14
 Chapitre 1 : Coagulation et hémophilie

1. Coagulation

a. Hémostase : généralités

L’hémostase est l’ensemble des phénomènes physiologiques qui concourent à la

prévention et à l’arrêt des saignements. Elle participe à la réparation de la brèche vasculaire et
d’une façon générale, elle assure le maintien de l’intégrité des vaisseaux. Le processus
d’hémostase est continu et en équilibre permanent.

L’hémostase générale est constituée de trois étapes qui sont l’hémostase primaire
(comprenant une étape vasculaire et une étape plaquettaire), l’hémostase secondaire
(comprenant la cascade de la coagulation) et la fibrinolyse.

Figure 1 : Hémostase. L’hémostase regroupe trois processus : l’hémostase primaire, l’hémostase secondaire
et la fibrinolyse. La finalité de l’hémostase est d’arrêter le saignement en cas de brèche vasculaire.

L’hémostase primaire est déclenchée immédiatement quand il y a une brèche vasculaire.

Elle met en jeu des éléments cellulaires (cellules endothéliales et plaquettes) et des éléments
plasmatiques (facteur Willebrand et fibrinogène). Cette étape se déroule en trois temps : une
étape vasculaire (avec une vasoconstriction localisée), l’adhésion plaquettaire et l’agrégation
plaquettaire. On a alors formation du clou plaquettaire.

15
 L’hémostase secondaire, ou coagulation, a pour but de consolider le clou plaquettaire.
La coagulation fait intervenir des éléments cellulaires (cellules endothéliales, monocytes,
plaquettes et fibroblastes) et des éléments non cellulaires (facteurs de la coagulation).

Enfin, la fibrinolyse permet d’empêcher l’installation et l’extension du caillot. Elle met

en jeu des facteurs plasmatiques (le plasminogène qui se transforme en plasmine) et des
éléments cellulaires (monocytes et cellules endothéliales).

b. La coagulation et ses voies

Le rôle de l’hémostase secondaire, ou encore appelée coagulation plasmatique, est de

consolider le thrombus plaquettaire formé. La coagulation ne peut être déclenchée sans la
présence de cellules endothéliales, de monocytes et de plaquettes, puisqu’ils expriment le
facteur tissulaire qui est l’élément déclenchant majeur de la coagulation. On note aussi la
présence de fibroblastes qui sont capables d’exprimer le facteur tissulaire et de synthétiser de
nombreux facteurs impliqués dans la coagulation.

La coagulation a également besoin d’éléments non cellulaires : ce sont les facteurs de la

coagulation qui sont des pro enzymes. Ils existent toujours sous deux formes, une forme active
et une forme non active. Chaque facteur sous sa forme activée peut activer un autre facteur ou
modifier certaines protéines impliquées ou non dans la coagulation.

Lors de cette phase, les plaquettes sont alors activées et permettent l’externalisation des
phospholipides membranaires. Certains facteurs portent des résidus γ-carboxylés qui leur
permettent de fixer le calcium et de se lier aux membranes phospholipides. Ce sont les facteurs
vitamine K dépendants : II, VII, IX et X. La coagulation est une cascade de réactions
enzymatiques donnant lieu à la formation de fibrine et la thrombine permet la transformation
du fibrinogène en fibrine.

Classiquement, deux voies d’activation de la coagulation sont identifiées : la voie

intrinsèque et la voie extrinsèque, amenant toutes deux à la voie commune, avec comme finalité
la production de fibrine.

La voie extrinsèque est activée lorsqu’il y a apparition d’une brèche vasculaire, le sous
endothélium est alors mis à nu. Il laisse apparaitre ses composants dont les fibroblastes qui
expriment de façon constitutive le facteur tissulaire (FT) à leur surface. Le facteur VII (FVII)

16
se lie au FT et forment ensemble le complexe FT-FVII. Ce dernier active dans la voie commune
le FVII (FVIIa), qui active le facteur X (FXa) et le facteur IX (FIXa).

La voie intrinsèque est activée en présence d’une surface chargée négativement comme
la membrane des plaquettes et des cellules endothéliales. On parle de « phase contact ». Elle
met en jeu plusieurs protéines (Facteurs XII, XI, kininogène, prékallicréine). Le facteur XII
activé (FXIIa) active le facteur XI (FXIa), qui active à son tour le FIX (FIXa) et qui lui-même
active le FX (FXa) avec le FVIII activé (FVIIIa) par la thrombine et stabilisé par le facteur
Willebrand, au niveau de la voie commune.

Figure 2 : Hémostase secondaire ou coagulation. Il y a classiquement deux voies : la voie intrinsèque et

la voie extrinsèque. Ces deux voies se rejoignent en voie commune et la finalité de ce processus est la production
de fibrine, afin de combler la brèche vasculaire et arrêter le saignement.

Cependant, cette description classique de la voie de la coagulation ne permet pas de

comprendre les symptômes rencontrés dans les déficits en FVIII ou FIX appelés respectivement
l’hémophilie A ou B (Chapitre 1. Partie 2.).

En 1995, Hoffmann (Hoffman, Monroe, et Oliver 1995) propose un modèle combinant

de manière physiologique les voies intrinsèque et extrinsèque. On parle alors de phases
d’initiation, d’amplification, de propagation et de stabilisation de la coagulation. Lors de la

17
phase d’initiation, le FVIIa se lie au FT et forme un complexe FT-FVIIa. Ce complexe active
le FX (FXa). Le FXa initie l’activation plaquettaire par la génération de thrombine. Le
complexe FT-FVIIa active également le FIX (FIXa), ce qui augmente d’autant plus la
génération de thrombine. Les premières molécules de thrombine activent les plaquettes qui
expriment alors le récepteur au facteur V (FV). Le FV est activé (FVa) par la thrombine, ce qui
permet au FXa de se lier au Va. Lors de la phase d’amplification, la thrombine permet
également l’activation du FVIII (FVIIIa), qui une fois activé se lie au FXa et permet
d’augmenter le taux de FXa.

Figure 3 : Phases de la coagulation. Ce modèle est celui proposé par Hoffmann en 1995, il ne fait plus la
distinction entre voies intrinsèque et extrinsèque de la coagulation. On parle alors d’initiation, d’amplification et
de propagation de la coagulation. FT : Facteur tissulaire, vWF : von Willebrand Factor. (D’après Samuelson
Bannow et al. 2019)

Ce modèle met en évidence un rôle central des FVIII et FIX, au carrefour de la

coagulation.

18
 2. L’hémophilie

a. Généralités

L’hémophilie est une maladie héréditaire liée au chromosome X. Elle est caractérisée
par une déficience partielle ou totale des facteurs VIII (hémophilie A) ou IX (hémophilie B) de
la coagulation (les gènes des facteurs VIII et IX sont portés par le chromosome X) (Franchini
et Mannucci 2012). La transmission de ces gènes se fait de façon récessive : les femmes sont
dites conductrices de la maladie alors que ce sont les hommes qui l’exprimeront d’un point de
vue clinique. Cependant chez la femme conductrice, le phénomène de compensation par l’autre
X ne portant pas la mutation, appelé également lyonnisation, est variable d’une femme à l’autre.
Certaines femmes peuvent présenter un taux plus ou moins bas de FVIII ou FIX avec des
symptômes hémorragiques modérés voire même être sévères de manière exceptionnelle. La
prévalence de la pathologie est de 1 naissance sur 5 000 pour l’hémophilie A et 1 naissance sur
30 000 pour l’hémophilie B (Bolton-Maggs et Pasi 2003). L’hémophilie représente la maladie
hémorragique héréditaire la plus commune dans le monde.

Il y a différents grades de sévérité de la maladie en fonction du taux de facteur (en % de

la normale) : hémophilie sévère (1% - <1%), hémophilie modérée (2% - 5%) et hémophilie
mineure (6% - 40%). Ce taux est corrélé à l’activité pro-coagulante résiduelle de facteurs
détectés dans le plasma. Plus de la moitié des patients hémophiles A ou B présentent un taux
de facteurs inférieur à 1% (Nathwani et Tuddenham 1992).

b. Un peu d’histoire

L’hémophilie est connue depuis les temps anciens.

Au IIème siècle de notre ère, il était mentionné dans un recueil d’écrits rabbiniques juifs
(Le Talmud) que les bébés de sexe masculin ne devaient pas être circoncis si leurs deux frères
étaient déjà décédés des suites d’un saignement excessif.

Au 12ième siècle, un médecin arabe a décrit une famille avec des hommes décédés des
suites d’un saignement causé par une blessure (Hoyer 1994).

John Conrad Otto, un médecin originaire de Philadelphia, évoque alors une tendance
héréditaire de certains hommes à présenter des saignements (Otto, 1803).

19
 Le mot hémophilie est apparu pour la première fois en 1828 et l’hémophilie B a été
distinguée de l’hémophilie A en 1952 (Hoyer 1994). D’un point de vue étymologique, le terme
hémophilie est issu de deux mots grecs : haïma (sang) et philia (affection).

L’hémophilie est parfois qualifiée de maladie royale. La reine Victoria, reine

d’Angleterre de 1837 à 1901, était porteuse d’hémophilie B. Certains de ses fils moururent de
cette pathologie. Certaines de ses filles, conductrices, se sont mariées à des princes dans
plusieurs pays européens et cela a contribué à une expansion de la pathologie (Stevens 2005).

Un médecin russe Raspoutine a dit « Je connais cette maladie. Elle est transmise par les
femmes mais seuls les hommes sont atteints. Les hémorragies sont redoutables mais il y a un
moyen de les stopper ». Ce médecin a eu pour mission de soigner le tsarévitch Alexis, un
hémophile très atteint. Il était le fil d’Alix (arrière petite fille de la Reine Victoira d’Angleterre)
et du tsar Nicolas. Raspoutine a traité le petit garçon en arrêtant tous ses traitements en cours ;
un de ses traitements était l’aspirine, qui possède des propriétés pro-hémorragiques. (Stevens
2005)

c. Manifestations cliniques

Le tableau clinique est identique dans les deux types d’hémophilie.

Les manifestations cliniques concourantes à ces pathologies s’apparentent à des

épisodes hémorragiques non contrôlés. La gravité et la fréquence des manifestations vont
dépendre du taux de facteurs plasmatiques circulant (Loomans et Fijnvandraat 2017).

Les manifestations hémorragiques peuvent apparaître à la naissance, notamment des

hémorragies intracrâniennes. De manière générale, les hémorragies vont se montrer plus
fréquentes lors de l’apprentissage de la marche. On peut retrouver plusieurs types
d’hémorragies, caractéristiques ou non de l’hémophilie :

- Les hémarthroses : ces hémorragies vont atteindre les articulations portantes ou peu
protégées. Les signes cliniques de ces hémarthroses seront décrits dans le Chapitre 2
Partie 2.
- Les hématomes : ils peuvent être superficiels et s’accompagner d’ecchymoses. Certains
hématomes vont apparaitre de manière spontanée. Ces hématomes se résorbent de

20
 manière spontanée, plus ou moins rapidement. Certains hématomes sont plus profonds
et plus dangereux comme :
▪ Les hématomes qui vont comprimer le tronc nerveux
▪ Les hématomes entrainant une réaction tendineuse
▪ Les hématomes du plancher de la bouche
▪ Les hématomes rétro-orbitaires
- Les hématuries : elles sont souvent spontanées et récidivantes mais ce ne sont pas les
hémorragies les plus fréquentes.
- Les hémorragies provoquées : elles peuvent être cutanées suite à une coupure, buccales
suite à une morsure de langue, postopératoires.
- Les hémorragies viscérales : elles sont moins fréquentes.
- Les hémorragies intra-crânienne, cérébrale, interne : ces hémorragies sont redoutables
car elles peuvent entraîner un risque vital si elles ne sont pas rapidement prises en
charge. Il est donc nécessaire de reconnaitre les symptômes des saignements pouvant
être graves :
▪ Signes d’hémorragie cérébrale : maux de tête persistants ou s’intensifiant,
vomissements répétés, somnolence, perte d’équilibre, convulsion ou
contractions spasmodiques des membres, …
▪ Saignements pouvant obstruer les voies respiratoires : des difficultés
respiratoires sans cause apparente

d. Traitements

Le but du traitement de l’hémophilie va être d’augmenter le taux de facteur d’une valeur

et d’une durée dépendantes de la dose et de la répétition des administrations. Le traitement de
l’hémophilie peut être à la demande (à la suite d’un épisode hémorragique) ou à titre préventif
(ce que l’on appelle en prophylaxie). Le bénéfice de la prophylaxie est nettement admis depuis
plusieurs années. En effet, Manco-Jonhson et son équipe (Manco-Johnson et al. 2007) ont
démontré que la prophylaxie par facteurs recombinants permet de prévenir les atteintes osseuses
et articulaires ainsi que diminuer les hémarthroses. Le schéma d’une prophylaxie se compose
en général de deux à trois injections par semaine de concentrés en FVIII ou FIX permettant
d’avoir un taux résiduel, c’est à dire minimum, supérieur à 1% ; cela permet aux hémophiles
sévères d’avoir un phénotype clinique proche d’un hémophile modéré. Cette prophylaxie est en

21
général débutée dans l’enfance, dès les premiers ou deuxièmes symptômes hémorragiques
significatifs.

Depuis les 50 dernières années, plusieurs principes doivent être pris en compte pour le
traitement d’un hémophile. Les hémophiles doivent avoir accès à un traitement sûr, disponible
à la maison, orienté vers la prévention des saignements, personnalisé au patient et axé sur des
résultats cliniquement pertinents.

Figure 4 : Evolution de la prise en charge du traitement de l’hémophilie (D’après le Global

Summit Haemophilia Pfizer, Berlin, 2019)

Il y a plusieurs types de thérapies proposées : les dérivés plasmatiques, les facteurs

recombinants, les traitements pour les patients avec inhibiteurs, les nouveaux traitements, les
inhibiteurs d’anticoagulants, l’émergence de la thérapie génique.

22
 i. Les dérivés plasmatiques

Les dérivés plasmatiques sont obtenus à partir de mélanges de plasmas de donneurs

sains et purifiés. De nombreux problèmes de santé publique planent sur l’avis porté à ces
produits : affaires des sangs contaminés dans les années 1980, transmission du prion et de la
maladie de Creutzfeld Jacob dans les années 2010 (Liberski et al. 2010). Ces produits
contiennent également des protéines humaines contaminantes, comme l’albumine ou le vWF
pour exemples. Tous ces problèmes ont eu pour vocation le développement de facteurs
recombinants industriels.

ii. Les facteurs recombinants

A partir des années 1980, le management du traitement de l’hémophilie s’est focalisé

sur le remplacement du facteur manquant/réduit par le biais d’injection intraveineuse et surtout
en prenant en compte la sécurité du patient.

Comme les facteurs plasmatiques, ces facteurs de la coagulation recombinants ont des
inconvénients. Ces facteurs sont disponibles seulement pour des injections intraveineuses et ont
des durées de demi-vies courtes (8 à 12 heures pour le FVIII, 16 à 24 heures pour le FIX), ce
qui nécessite des injections intraveineuses répétées (2 à 3 fois par semaine pour un hémophile
A et 1 à 2 fois par semaine pour un hémophile B). On voit apparaitre maintenant de nouvelles
générations de facteurs recombinant à longue durée de vie, afin de diminuer la fréquence
d’injections de facteurs. Pour augmenter les demi vies de ces facteurs, les industries ont eu
recours à des technologies qui impliquent la fixation de molécules durables (comme les
fragments Fc, l’albumine, etc). Ces procédés sont déjà commercialisés avec de bons résultats
pour le FIX permettant une administration tous les 10 à 15 jours. Pour le FVIII, l’augmentation
significative de la demi-vie est plus diffcile à obtenir du fait du rôle important du vWF.
(Lambert et al. 2018). Des études sont en cours avec notamment un procédé permettant de
rendre le FVIII indépendant de sa stabilisation du vWF avec des résultats préliminaires
intéressants en termes de demi vie.

23
 iii. Le traitement pour les patients avec inhibiteurs

Le développement d’alloanticorps neutralisants anti-FVIII ou inhibiteurs touche 20 à

30% des patients hémophiles A sévères et 3 à 5% des patients hémophiles B sévère (Ehrenforth
et al. 1992).

Le traitement pour les patients hémophiles avec inhibiteurs repose sur une thérapie à la
demande ou bien en prophylaxie en utilisant des agents bypassants, c’est-à-dire du FVIIa
recombinant, des concentrés de complexe de prothrombine activé et des complexes FVIIa/FX
dérivés du plasma. Cependant, ces protocoles thérapeutiques ont un contrôle sur l’hémorragie
limité (Berntorp 2009).

Une autre alternative est l’induction de la tolérance immunitaire (ITI). Le but est
d’irradiquer l’inhibiteur. Pour cela, on administre de grandes doses de concentré de facteur, sur
une longue période, afin que le système immunitaire s’habitue au facteur de la coagulation et
ne le rejette plus. Les études montrent que ce traitement rencontre un succès chez 60 à 70% des
patients hémophiles A et 20 à 30% chez les patients hémophiles B (K Nogami et al. 2018).

iv. Les nouveaux traitements

Depuis quelques années, de nouveaux traitements anti-hémophiliques, qui ne sont pas

des concentrés en facteurs de la coagulation, commencent à apparaitre avec comme chef de file
l’emicizumab (commercialisé sous le nom d’Hemlibra®, Roche). L’emicizumab est un
anticorps monoclonal humanisé qui mime l’activité de cofacteur du FVIII. Comme pour le
FVIII, l’emicizumab se lie conjointement aux FIX activé et FX. Cela entraine une augmentation
significative de l’activation du FX médié par le FIXa et entraine l’augmentation de la génération
de thrombine (Shima et al. 2016). Une série d’études cliniques a été menée (HAVEN) et montre
une réduction du nombre de saignements et une amélioration de la qualité de vie des patients.

L’emicizumab présente de nombreux avantages. Premièrement, il est administré en sous

cutané toutes les semaines, tous les 15 jours voire tous les mois. De plus, il peut être utilisé pour
les patients présentant un inhibiteur.

Un des inconvénients de ce médicament est qu’il reste actif dans le plasma tout le temps
et peut être associé à des épisodes de thromboses et de microangiopathies, en particulier
lorsqu’il est utilisé en combinaison avec des concentrés de complexes de prothrombines activés.

24
(Johannes Oldenburg et Levy 2017). Ce principe doit être pris en compte en cas de chirurgie
ou d’épisode hémorragique nécessitant d’administrer de manière concommittante des
concentrés en facteur qui devra se faire à dose réduite.

Parmi les autres nouvelles thérapies, les inhibiteurs de la coagulation sont également en
cours de développement. La coagulation repose sur une balance entre pro coagulant et anti
coagulant. Les traitements vus précédemment ont pour but de remplacer le facteur pro coagulant
manquant ou déficient. Des recherches ont été menées pour cibler les anticoagulants, afin de
compenser le déficit en pro coagulant et ré-équilibrer la coagulation.

L’antithrombine est un anti coagulant endogène qui inhibe la thrombine, le FX et

certains facteurs pro coagulants à moindre degré. Le fitusiran est une molécule qui a été
développée dans ce sens. C’est un petit ARN interférent (siRNA) qui inhibe l’expression post
transcriptionnelle hépatique du gène SERPINC1, réduisant alors les taux d’anti thrombine de
manière dose dépendante (Sehgal et al. 2015). Le fitusiran est administré en sous cutané, une
une fois par mois. Les études préliminaires sur cette molécule montrent une diminution des taux
d’anti thrombine de 70 à 80% et certains patients hémophiles retrouvent une génération de
thrombine similaire à celle de personnes sans hémophilie (Pasi et al. 2017).

Le TFPI inhibe l’initiation de la voie de la coagulation. De nombreuses industries ont

développé des molécules inhibant le TFPI. Par exemple, le concizumab est un anticorps
monoclonal humanisé qui cible le site de liaison du TFPI pour le FXa. Cette molécule peut
également être administrée en sous cutané (Eichler et al. 2019). Cependant, le développement
de cette molécule a été arrêtée car les premiers essais cliniques effectués reportaient des cas de
thrombose mais de nouvelles études cliniques doivent être débutées très prochainement.

25
 Tableau 1 : Comparaison des nouveaux produits pour le traitement de l’hémophilie, hors
facteurs de la coagulation (D’après K Nogami et Shima 2019)

Toutes ces nouvelles thérapies commencent à changer les habitudes de prescription

clinique des médecins dans les pays développés, du fait de la diminution du nombre
d’injections, une meilleure observance de la prophylaxie, des alternatives variées pour les
patients présentant des inhibiteurs et des voies d’administration plus simples. Cependant, il
reste 80% de patients hémophiles dans le monde qui n’ont pas accès à cela, à cause du manque
de moyens ou de développement. Ces patients ont peu ou pas accès aux facteurs de la
coagulation et leur espérance de vie en est réduite (Ljung 1999).

v. L’émergence de la thérapie génique

20 ans après les premiers rapports sur la thérapie génique, des résultats très prometteurs
de phases 1/2 d’essais cliniques ont récemment été publiées.

Les premiers essais de thérapie génique en hémophilie utilisaient des vecteurs viraux
(vecteurs oncoretroviral et adénoviral) et des vecteurs non viraux. Les vecteurs se sont avérés
sécurisés mais n’ont pas montré de résultats probants sur l’expression du transgène (Roth et al.

26
2001; Roth, Tawa, et Proper 2002). Plus récemment, l’accent a été mis sur les adénovirus
(AAV) à tropisme hépatique comme vecteur viral pour « aller délivrer » le gène
manquant/défectueux dans les hépatocytes. Ces vecteurs présentent un meilleur profil de
sécurité car ils ne sont pas ou très peu integratifs dans le génome ; les AAV sont épisomales.
Cependant, la présence d’une immunité aux adénovirus, les réactions immunitaires hépatiques
après administration et la perte progressive d’expression sont des facteurs limitants à leur
utilisation actuelle.

Tableau 2 : Etat d’avancement de la thérapie génique dans l’hémophilie à l’heure actuelle.

Sont représentés les essais cliniques en cours en fonction du sponsor, des vecteurs utilisés, du transgène et du
statut de l’essai clinique. BDD-FVIII : FVIII avec domaine B délété (d’après American Society of Hematology
Education Program, Hematology, 2019)

27
 Chapitre 2 : L’arthropathie hémophilique, de sa définition à sa
physiopathologie

1. Généralités

La répétition de saignements, nommés hémarthroses, mène à une arthropathie

irréversible appelée arthropathie hémophilique (AH). Les hémarthroses ont tendance à récidiver
au niveau d’une même localisation, on parle d’articulation cible. Une articulation cible est
définie par trois saignements spontanés ou plus dans une seule articulation sur une période de
6 mois consécutifs.

L’AH se caractérise par une destruction complète et progressive du cartilage, associée

à des douleurs, une instabilité musculaire et ayant un impact sur la qualité de vie des patients.
Les saignements sont le plus fréquemment rencontrés au niveau des articulations portantes,
comme le genou ou la cheville, et le coude.

Il y a deux entités majeures qui interviennent dans l’AH et elles sont complémentaires :
la synovite et la destruction osseuse/cartilagineuse. Ces deux entités progressent tout au long
de la maladie (Pulles et al. 2017).

2. D’un point de vue clinique

La synovite rencontrée dans l’AH est le résultat d’épisodes de saignements, menant à

une hypertrophie et une hyperplasie. Selon la gravité de l’hémophilie, basée sur le taux de
facteur de coagulation restant, l’hémarthrose peut survenir après un traumatisme, mais aussi
spontanément. Les patients hémophiles sévères, avec moins de 1% de FVIII ou FIX, peuvent
faire jusqu’à 3 hémarthroses spontanées par mois. Les premières hémarthroses sont provoquées
lors de l’apprentissage de la marche au moment de l’enfance. (Pollmann et al. 1999)

L’hémarthrose aiguë est cliniquement très proche de la poussée d’arthrite

inflammatoire. On retrouve une articulation enflée, chaude, douloureuse et raide. La répétition
d’hémarthroses conduit à développer une AH mais il n’y a pas de corrélation directe entre le
nombre d’hémarthroses et le développement de l’AH. En effet, certains patients développent
des lésions articulaires irréversibles après quelques épisodes hémorragiques, tandis que d’autres

28
présentant de multiples épisodes d’hémarthroses sans dégradation articulaire patente.
(Valentino et al. 2012). Quand l’AH commence à apparaître, à s’installer et à cheminer vers la
destruction osseuse, la douleur devient plus mécanique que l’arthrose et on note une déficience
fonctionnelle importante.

Figure 5 : Illustration d’une hémarthrose. Sur la photo de gauche, on retrouve une imagerie d’un genou
souffrant d’une hémarthrose (on retrouve une poche de sang au niveau de l’articulation). Sur la photo de droite,
on a un genou atteint d’une hémarthrose (genou se trouvant sur la gauche) et un genou sain (genou se trouvant
sur la droite). (Photographies diffusées avec l’accord des patients). En bas, nous avons la représentation
schématique d’une articulation saine (à gauche) et d’une articulation atteinte d’arthropathie hémophilique (à
droite) (D’après Pulles et al. 2017)

29
 Comme décrit dans la polyarthrite rhumatoïde, 3 étapes peuvent être différenciées dans
l’évolution de l’AH :

- Etape saignement : A ce stade précoce d’arthropathie, le patient présente une

répétition de saignements intra-articulaires à une fréquence variable selon le
contexte. Outre la douleur aiguë associée à l’hémarthrose, le patient ne présente
aucune douleur et aucune incapacité fonctionnelle entre les rechutes.
- Etape synovite : Une hyperplasie synoviale apparait alors en raison de la répétition
des saignements intra-articulaires. A ce stade, le patient présente plus souvent une
rechute. En outre, une arthrite inflammatoire peut apparaître sans saignement et une
douleur mécanique commence à affecter la vie du patient. Certaines incapacités
fonctionnelles ne permettent plus au patient d’effectuer certaines activités
quotidiennes ou pratiques sportives.
- Etape os : L’hyperplasie synoviale diminue et la destruction osseuse augmente
progressivement. A ce stade tardif de l’arthropathie, les hémarthroses de
l’articulation cible deviennent de plus en plus rares, voire disparaissent
complètement. La douleur mécanique est quasi permanente avec un handicap
fonctionnel majeur et une altération significative de la qualité de vie du patient.

Figure 6 : Etapes du développement d’une arthropathie hémophilique. Le patient va tout d’abord

saigner dans l’articulation, la répétition de saignements entraine une augmentation des cytokines pro
inflammatoires. Cette répétition de saignements va engendrer des dommages synoviaux et créer une
inflammation. On a alors des hémarthroses récurrentes qui vont entrainer une hypertrophie synoviale.
L’enchainement de tout cela a pour finalité l’arthropathie hémophilique.

30
3. Contexte génétique et rôle de l’environnement

Comme démontré dans la polyarthrite rhumatoïde, il existe très certainement des

facteurs de susceptibilité génétique au développement de l’AH chez les patients hémophiles,
du fait de leur phénotype hétérogène.

Une susceptibilité génétique à la prolifération synoviale a été démontrée dans les

processus hémostatiques, comme la génération de thrombine (Furuhashi et al. 2008), mais aussi
dans diverses voies cellulaires telles que l’expression de cytokines inflammatoires (Sen et al.
2013), l’apoptose (Hakobyan 2004) et le contrôle des minéraux osseux (Gravallese
2002). Certains polymorphismes du contrôle de l’immunité, comme HLA, IL-10, TNF-α, ont
des effets sur le développement d’inhibiteurs dans l’hémophilie sévère (J. Oldenburg 2015). De
plus, les patients présentant un inhibiteur développent plus rapidement une AH.

Ajoutés à ces résultats, les influences de l’environnement pourraient participer au

développement. Cela regroupe le risque d’inhibiteurs, le contexte socio-économique et la co-
morbidité par les infections HIC/HIV (Mauser‐Bunschoten, Putte, et Schutgens 2009).

4. Focus sur les traitements

Pour traiter l’arthropathie hémophilique, il y a plusieurs possibilités : un traitement

substitutif, la rééeducation ou la chirurgie.

a. Traitement substitutif

Ce traitement consiste en des administrations de facteurs de la coagulation concentrés

soit à la demande soit en prophylaxie.

Le traitement à la demande est utilisé pour traiter les hémarthroses aigues en

administrant des facteurs de la coagulation concentrés plusieurs fois par jour pendant 2 à 3
jours, en association avec des analgésiques, du repos et des applications de froid sur
l’articulation. Cela permet de diminuer la durée de l’hémarthrose. Cependant, on ne retarde que
l’évolution de l’AH.

31
 Le traitement en prophylaxie permet de diminuer le nombre d’hémarthroses et prévient
l’évolution de l’AH, surtout lorsque le traitement est débuté dans le plus jeune âge (Fischer et
al. 2002). Il consiste en des administrations de facteurs de la coagulation concentrés 2 à 3 fois
par semaine en continu. Cependant, des études effectuées sur un suivi au long terme de patients
hémophiles sous prophylaxie montrent que ce traitement ne prévient pas complètement l’AH
et qu’elle peut se développer quelques années plus tard (J. Oldenburg 2015).

b. Réeducation

L’administration de facteurs de la coagulation va permettre d’éviter les saignements

para articulaire ou osseux sur l’articulation cible. Le traitement de l’AH va se baser sur de la
réadaptation fonctionnelle de l’articulation visée. Cela comprend le renforcement des muscles
et des tendons, afin de limiter l’évolution.

c. Traitement chirurgical

Au stade final de l’AH, un traitement chirurgical peut être proposé, l’articulation est
alors fusionnée, on limite la douleur mais on n’améliore pas la mobilité articulaire. Il a été
démontré que les prothèses peuvent être une solution intéressante à long terme pour les jeunes
patients, en particulier pour le genou (Westberg et al. 2014) et la cheville (Rodriguez-Merchan
2014) mais cela nécessitera une ré-opération dans les années suivantes pour la changer. Dans
certains cas, des infiltrations intra articulaires cortisoniques ou de viscosupplémentation
peuvent être proposées avec une efficacité plus ou moins intéressante.

5. Physiopathologie

Il y a de nombreux acteurs qui participent à la physiopathogénicité de l’AH. On retrouve

les cellules de l’immunité innée et adaptative, les fibroblastes de la membrane synoviale, les
cellules osseuses et les vaisseaux.

32
 Figure 7 : Schéma général de la pathogénèse de l’arthropathie hémophilique. L’arthropathie
hémophilique montre des caractéristiques de l’inflammation et d’une maladie dégénérative osseuse. (D’après
(Lafeber, Miossec, et Valentino 2008)

a. Cellules de l’immunité adaptative

Lorsque l’on analyse la membrane synoviale d’un patient hémophile à la suite d’une
intervention chirurgicale, on trouve une infiltration lymphocytaire diffuse mais sans formation
d’un follicule (G. Roosendaal et al. 1998).

IL-17 a été retrouvé dans le liquide synovial de patients HA et cela suggère donc que
les cellules TH17 peuvent être un acteur majeur (Øvlisen et al. 2009).

De plus, l’ajout d’IL-4 et d’IL-10 dans un modèle in vitro d’arthropathie hémophilique

pourrait protéger l’articulation des lésions sanguines (van Meegeren et al. 2013). L’hyper-
expression d’IL-4 et IL-10 peut favoriser la prolifération des cellules TH2, au dépens des TH1,
augmenter la population des cellules T régulateurs, favoriser l’activation des macrophages par
les cellules M2 et inhiber l’activation classique des macrophages par M1 (Laurens
Nieuwenhuizen et al. 2014). L’inhibition des cellules M1 mène à une diminution de la
régulation des cytokines inflammatoires IL-1, IL-6 ou bien encore TNF-α.

33
 b. Cellules de l’immunité innée

Dans le liquide synovial après une hémarthrose ou bien encore dans la synovite
hémophilique chronique, l’augmentation d’IL-1, IL-6 et TNF-α démontre une présence et une
activation de monocytes et de macrophages (Forsyth et al. 2012). Ces cellules arrivent avec le
sang qui rentre dans l’articulation pendant les hémarthroses. On les retrouve également dans les
AH chroniques du fait de la présence dans la synovite de nombreuses chemokines recrutant des
cellules immunitaires comme les monocytes chemotactic protein-1 (MCP-1) (G. Roosendaal et
al. 1998). Il a été démontré que la membrane synoviale en présence de sang contient plus de
cytokines inflammatoires par rapport à un tissu normal (G. Roosendaal et al. 1998).

La sécrétion de cytokines inflammatoires dans la membrane synoviale dans l’AH est

directement contrôlée par la voie NF-κB (Sen et al. 2013). En effet, un saignement articulaire
entraine la régulation de plusieurs gènes de la voie du NF-κB et donc des cytokines pro
inflammatoires comme IL-1, IL-6, le TNF-α ou l’IFN. Un polymorphisme de l’activité de NF-
κB dans la synovite pourrait potentiellement expliquer le phénotype hétérogène des patients
hémophiles et le risque de développer une AH. Le rôle des cytokines inflammatoires dans l’AH
a été démontrée en ayant recours à des inhibiteurs spécifiques. L’utilisation d’anti-TNFα réduit
la synovite et les hémarthroses (Daniela Melchiorre et al. 2014) et l’utilisation d’un antagoniste
au récepteur d’IL-6 protège des saignements induits par l’arthropathie dans un modèle murin
hémophile (Narkbunnam et al. 2013). De plus, l’utilisation d’un antagoniste de l’IL-1 a un effet
protecteur sur le dommage articulaire causé par la présence de sang (van Vulpen, Schutgens, et
al. 2015). L’importance du TNF-α dans l’inflammation synoviale est également soulignée par
la présence dans le sang au niveau de l’articulation du couple TACE/iRhom2, qui clive le TNF-
α fixé à la membrane sous une forme circulaire (Haxaire et al. 2018).

c. Cellules résidentes

D’un point de vue anatomique, l’articulation est l’élément prenant en charge la mobilité
d’un individu, elle permet le mouvement et la flexibilité. Autour de cette articulation, on
retrouve la membrane synoviale qui fournit un support structurel, permet un glissement entre
les surfaces et fournit des nutriments au cartilage. Elle se divise en deux compartiments : la
couche bordante (intima) et la couche plus profonde (sub-intima). Ces couches sont constituées

34
de deux types de cellules, retrouvées dans des proportions relativement égales : les cellules
synoviales de type A (appelées macrophage like synoviocyte) et les cellules synoviales de type
B (appelées fibroblaste like synoviocyte).

Les synoviocytes de type B, ou FLS, sont des cellules mésenchymateuses présentant des
caractéristiques similaires à celles des fibroblastes, notamment l’expression des collagènes de
types IV et V, de la vimentine et du CD90 (Thy-1). Cependant, ces cellules ont des propriétés
uniques. Les FLS expriment la cadhérine-11, molécule d’adhésion jouant un rôle clé dans
l’agrégation. De plus, VCAM-1 est exprimée par les synoviocytes, son rôle premier étant
d’intervenir dans l’adhérence des leucocytes. On retrouve également l’expression du CD55, qui
est un facteur d’accélération de la désintégration (Bartok et Firestein 2010).

Leur rôle a été précédemment démontré dans la polyarthrite rhumatoïde. Ils sont au
carrefour entre immunité innée et immunité adaptative. Ils synthétisent des cytokines
inflammatoires et coopèrent avec les lymphocytes et les macrophages (Bartok et Firestein
2010). Ils peuvent être activés de différentes manières et les réponses sont diverses, intervenant
à différents stades de la maladie (Bustamante et al. 2017).

35
Figure 8 : Principaux mécanismes d’activation des FLS. L’environnement pro-inflammatoire dans les
articulations de la PR, y compris les niveaux élevés de cytokines, de facteurs de croissance et l’infiltration des
cellules inflammatoires, activent fortement les FLS. D’autres stimuli, comme les modèles moléculaires associés
au danger (DAMP), les microparticules, les canaux calciques ou la stimulation par les nerfs synoviaux, le
complément et les anticorps, sont également des déclencheurs importants des voies de signalisation
inflammatoires, de changements métaboliques et de changements épigénétiques. (D’après Bustamante et al.
2017)

d. Cellules osseuses et du cartilage

La destruction osseuse et la destruction cartilagineuse dans l’AH dépendent de l’activité

de la synovite mais également de mécanismes indépendants.

Premièrement, une dégradation de la matrice cartilagineuse peut être provoquées par les
cytokines pro inflammatoires, la plasmine et les métalloprotéinases (MMP). Les cytokines pro
inflammatoires provoquent une dégradation du cartilage via les MMP (Cawston et Young

36
2009). La plasmine contribue directement aux dommages du cartilage en induisant une
libération de protéoglycanes dans le cartilage ou indirectement par l’activation des MMP. De
plus, la plasmine est capable d’influencer la signalisation cellulaire via les récepteurs activés
par la protéinase (PAR), entrainant une dégradation du cartilage. Quand il y a un saignement
articulaire, on retrouve une augmentation de PAR dans les chondrocytes et le synovium (L.
Nieuwenhuizen et al. 2016).

Deuxièmement, le facteur de coagulation interagit directement avec l’activité

ostéoclastique : le complexe FVIII-von Willebrand inhibe l’ostéoclastogénèse et la déficience
en FVIII chez la souris est associée à une résorption osseuse accrue (Baud’huin et al. 2009).

Troisièmement, une surexpression de RANK/RANKL a été trouvée dans la membrane

synoviale de patients hémophiles alors qu’une diminution de l’ostéoprogestérine a été observée
(Daniela Melchiorre et al. 2014; Christoforidis et al. 2010). Ce profil cytokinique du
métabolisme osseux montre une tendance à l’activité ostéoclastique et à la destruction osseuse.

Quatrièmement, les métabolites de l’oxygène peuvent être impliqués dans les

dommages articulaires (Goris Roosendaal et al. 1999). Ces espèces réactives de l’oxygène
(ROS) proviennent des cellules activées de la membrane synoviale mais également directement
du sang présent dans l’articulation. La prolifération endothéliale, la néoangiogénèse et
l’augmentation de la vascularisation renforcent ce processus, maintenu par la production de
VEGF (Acharya et al. 2011).

Les modifications osseuses résultent d’un équilibre perturbé entre résorption osseuse et
formation osseuse, entrainant une diminution de la densité minérale osseuse (DMO) et de
l’ostéoporose. Il a été observé une diminution de la DMO chez les enfants et patients
hémophiles plus âgés (Gerstner et al. 2009).

Des études montrent que l’IL-1β provenant des macrophages lors des saignements intra
articulaires est la cytokine impliquée la plus importante dans les dommages articulaires et
l’apoptose des chrondrocytes (van Vulpen, Roosendaal, et al. 2015). Le blocage de l’IL-1β
permet de limiter le dommage articulaire induit par le sang et diminue la sécrétion d’IL-6 alors
que le blocage du TNF-α n’a aucun effet.

37
6. Rôle du fer

Actuellement, le dépôt de fer est considéré comme le principal élément jouant un rôle
dans la physiopathologie de l’AH.

Figure 9 : Concept actuel proposé de la physiopathologie de l’arthropathie hémophilique :

rôle prédominant du fer. Les dépôts de fer provenant du lysat de globules rouges entraînent une synthèse
pro inflammatoire via des cellules immunitaires telles que les macrophages, l’apoptose des chondrocytes, avec
production de ROS et une hyperplasie synoviale. L’expression de VEGF à partir d’une inflammation synoviale
provoque une néoangiogénèse, qui maintient directement les lésions sanguines et l’hémosidérine dans
l’articulation. Les rejets de cytokines entraînent la destruction des os et du cartilage, ainsi que des incapacités,
caractérisant alors l’arthropathie hémophilique. IL : Interleukine, TNF-α : Tumor necrosis factor α, RANKL :
Receptor Activator Nuclear Factor κ-B ligand, ROS : espèces réactives de l’oxygène, VEGF : Vascular
Endothelial Growth Factor, Fe2+ : fer

a. Origine du fer

Le fer provient essentiellement des globules rouges. En effet, lors de

l’hémophagocytose, les globules rouges sont lysés et il y a une libération importante
d’hémosidérine, qui est le réservoir principal en fer.

38
 Le dépôt de fer dans l’articulation est détectable chez les patients hémophiles à l’aide
d’image à résonance magnétique (IRM). Ce dépôt est corrélé avec la sévérité de l’AH. (Lafeber,
Miossec, et Valentino 2008).

Lorsque l’on analyse la synoviale d’un patient atteint d’AH après une chirurgie, le fer
est retrouvé dans la couche synoviale profonde, très proche de l’infiltration lymphocytaire et de
l’hypervascularisation décrites précédemment. (G. Roosendaal et al. 1998)

b. D’un point de vue moléculaire

Le fer induit une prolifération synoviale, une hyperplasie et une inhibition de l’apoptose
dans l’AH (Nishiya 1994). Cela est contrôlé par c-Myc et par mdm2 (Wen 2002)(Hakobyan
2004).

L’accumulation d’hémosidérine dans le tissu synovial est corrélée à une sur-expression

des cytokines inflammatoires (Nishiya 1994)

De plus, le fer catalyse la conversion du H2 O2 et contribue à l’apoptose des

chrondrocytes. Cela cause des dommages oxydants irréversibles et à long terme, des dommages
articulaires et osseux (Goris Roosendaal et al. 1999).

L’hème (qui est un cofacteur constitué essentiellement de fer et retrouvé dans

l’hémoglobine) est directement impliqué dans l’activation du TLR4 et contribue à l’expression
de TNF-α par les macrophages (R. T. Figueiredo et al. 2007).

Egalement, l’expression de bon nombre de protéines régulatrices du fer comme la

ferroportine, CD163, FLVCR ou HCP-1 est renforcée dans l’AH et suggère un mécanisme
d’adaptation synoviale afin de maintenir une hémostase synoviale du fer dans l’AH (L.
Nieuwenhuizen et al. 2013).

Des études cliniques relatent que la sévérité de l’AH (corrélée au nombre

d’hémarthroses par an et au nombre d’articulations touchées) est associée à la présence de
mutation d’HFE, en particulier C28Y et H63D. (Cruz 2005)

Enfin, pour compléter le rôle du fer dans l’AH, l’utilisation du deferasirox, qui est un
chélateur de fer, peut limiter les dommages articulaires après une hémarthrose, cela a été montré
dans un modèle murin d’hémophilie (Laurens Nieuwenhuizen et al. 2014)

39
 Le fer a un rôle important dans la pathogénicité de l’AH mais il est probablement non
exclusif. En effet, quand on compare l’AH avec d’autres types d’arthrites comme la polyarthrite
rhumatoïde (PR), l’ostéoarthrite (OA) ou l’arthrose rencontrée dans l’hémochromatose, on
retrouve des similarités mais également un nombre important de différences.

c. Comparaison avec d’autres types d’arthrites

Si actuellement le dépôt de fer est le lien principal entre inflammation et AH, d’autres
arthrites, avec présence de fer, présentent le même tableau clinique et physiopathologique.
Cependant, si on compare avec l’arthrose rencontrée dans l’hémochromatose, il y a de
nombreuses différences.

i. Arthropathie rencontrée dans l’hémochromatose

L’arthrite est la plus fréquent, précoce et sévère symptôme de l’hémochromatose. Avec

une chrondrocalcinose, une arthrite cliniquement bien distincte peut être développée, avec une
atteinte du second et troisième métacarpophalagien et menant souvent à des dommages
articulaires sévères (Sahinbegovic et al. 2010).

La relation entre surcharge ferrique et arthropathie peut être expliquée par la

précipitation de cristaux de pyrophosphate associée à une chrondrocalcinose, mais aussi par le
fait que le fer peut être trouvé dans la synoviale de patients avec une arthropathie chronique au
moment d’une chirurgie pour remplacement articulaire.

Toutefois, d’un point de vue histologique au niveau de la synoviale, l’arthropathie

rencontrée dans l’hémochromatose est beaucoup plus proche de l’OA que de la PR. On retrouve
une infiltration des neutrophiles importante. Mais on ne retrouve pas d’hyperplasie synoviale
malgré la présence d’un important dépôt de fer dans la synoviale. (Heiland et al. 2010)

Une étude a comparé l’AH avec l’arthropathie rencontrée dans l’hémochromatose et

suggère que les changements synoviaux sont aggravés avec la présence de signaux pro-

40
inflammatoires dans l’AH. Ces signaux peuvent expliquer les différences entre les deux
arthrites, alors qu’un important dépôt de fer est retrouvé dans les deux cas (van Vulpen,
Roosendaal, et al. 2015).

ii. Polyarthrite rhumatoïde

L’analyse de la physiopathologie de la PR permet de retrouver des similarités avec celle

de l’AH. En effet, une hyperplasie synoviale est retrouvée dans les deux cas, avec présence de
différents types de cellules T, de cellules B, présence de cellules mononucléaires et de FLS.
(Firestein 2003). Les cytokines inflammatoires sont présentes en de fortes proportions, avec
une augmentation de métalloprotéases, de ROS et de RANKL, qui peuvent être impliqués dans
les dommages articulaires et osseux. Des éléments épigénétiques ont été retrouvés de manière
similaire dans les deux pathologies (Leah 2011)(Sen et al. 2013).

Malgré toutes ces similarités retrouvées entre AH et PR, il y a également des différences.
Premièrement, l’origine de l’arthropathie n’est pas la même ; pour la PR, c’est une origine auto
immune, pour l’AH, l’arthropathie est due à la présence de sang. Deuxièmement, la PR se
présente de manière plus systémique avec une atteinte plutôt polyarticulaire, alors que l’AH est
mono ou oligo articulaire. Troisièmement, le dépôt de fer est présent dans la synoviale de
patients PR mais de manière beaucoup moins importante que dans l’AH (Muirden et Senator
1968)(Giordano et al. 1991).

iii. L’arthrose

Dans l’ostéoarthrite (OA) ou arthrose, on retrouve quelques similarités avec l’AH et en

particulier, au niveau des dommages articulaires et osseux. En effet, les données cliniques sont
très proches entre AH et OA car les types de dommages articulaires sont semblables. Une large
quantité de cytokines impliquées dans le processus osseux, comme RANKL et
l’ostéoprogestérine, sont synthétisées par le synovium de patients OA et les chrondrocytes, les
métalloprotéases et les ROS sont impliquées dans la destruction osseuse. (Martínez-Calatrava
et al. 2012)

41
 Par contre, il n’y a pas d’hyperplasie synoviale dans l’OA et le rôle de la synovite n’est
pas très clair. L’utilisation d’anti TNF-α comme thérapie dans l’OA n’a pas montré de résultats
probants dans le traitement de l’arthrose de la main (Cicuttini et Wluka 2014)(Chevalier et al.
2015). L’épigénétique semblerait intervenir également, par le biais du miR-140 mais il n’est
pas retrouvé dans l’AH ou dans la PR. (Swingler et al. 2012). De plus, on ne rencontre pas de
dépôt de fer dans l’OA et les régulateurs du fer ne sont pas retrouvés, contrairement à l’AH ou
la PR (Laurens Nieuwenhuizen et al. 2014).

iv. En résumé

La comparaison de ces trois autres types d’arthrites avec l’AH est très intéressante pour
démontrer la place du dépôt de fer dans la physiopathologie de l’AH.

Dans l’arthropathie rencontrée dans l’hémochromatose, il y a d’importants dépôts de

fer. Cependant, on ne retrouve pas d’hyperplasie synoviale et pas de destruction articulaire
similaire à celle de l’AH.

Dans la polyarthrite rhumatoïde, il y a peu de dépôt de fer. Cependant, on retrouve une

hyperplasie synoviale et une inflammation similaires à celles de l’AH mais les dommages
articulaires sont différents.

Dans l’arthrose, il n’y a pas de dépôt de fer. Cependant, les dommages articulaires sont
similaires à ceux rencontrés dans l’AH mais il n’y a pas d’hyperplasie.

42
 Tableau 3 : Différences dans les caractéristiques cliniques et physiopathologiques entre
l’arthropathie hémophilique, la polyarthrite rhumatoïde, l’arthropathie rencontrée dans
l’hémochromatose et l’arthrose. - = aucune différence, + = peu de différences, ++ = différences moyennes,
+++ = différences importantes et prédominantes

Si on se base sur la principale différence entre ces types d’arthrites, l’élément retrouvé
seulement dans l’AH est la présence de sang en contact direct avec la membrane synoviale. Les
éléments du sang en particulier, plaquettes, globules rouges et plasma (et donc facteurs de la
coagulation) sont directement en contact avec la membrane synoviale et avec les cellules
résidentes de la membrane synoviale qui sont les FLS

43
 Figure 10 : Concept proposé d’évolution de la physiopathologie de l’arthropathie
hémophilique : place centrale des cellules sanguines anucléées et des facteurs de la
coagulation. L’arthropathie hémophilique est le seul modèle d’arthropathie avec présence de globules rouges
et de plaquettes directement dans l’articulation. Compte tenu de l’impact des plaquettes, des globules rouges et
des facteurs de la coagulation sur le contrôle de l’inflammation, ces cellules pourraient interagir directement
avec les cellules immunitaires, les chondrocytes et les synoviocytes. Le fer provenant de la synthèse des globules
rouges pourrait contribuer au mécanisme pathologique mais de manière non exclusive.

7. Rôle des autres éléments du sang

a. Plaquettes

Les plaquettes sont considérées comme un effecteur immun (Herter, Rossaint, et

Zarbock 2014).

44
 i. Eléments physiologiques

Les plaquettes sont constituées de granules. Il y a trois types de granules plaquettaires :

les granules-α, les granules denses et les granules lysosomales.

Les deux premiers types de granules contiennent des médiateurs inflammatoires

(Morrell et al. 2014). En effet, les granules-α contiennent nombre de chemokines contrôlant la
prolifération lymphocytaire et la différenciation, telles que PF-4, TGF-β ou CD40L (Srivastava
et al. 2008). On retrouve également dans les granules-α la présence de PDGF, P-sélectine, MIP-
1α et SDF-1 qui contribuent à l’immunité innée en intervenant sur la prolifération, l’activation
et la maturation de monocytes, macrophages et neutrophiles (Blair et Flaumenhaft 2009).

Dans les granules denses, il y a cinq molécules différentes : la sérotonine, l’ADP, des
polyphosphates, du glutamate et l’histamine. Le glutamate et la sérotonine sont impliqués dans
les fonctions des cellules dendritiques et des cellules T (Leon-Ponte, Ahern, et O’Connell
2007). Les autres composants sont principalement impliqués dans l’activation et le recrutement
leucocytaire, dans l’expression de cytokines inflammatoire et dans la perméabilité vasculaire
(Swaim et al. 2010).

La présence du récepteur FCγRIIA et de récepteurs de type Toll-like (TLRs) sur la

membrane des plaquettes montrent une activation non canonique des plaquettes, dépendante de
l’inflammation contrôlée dans des substrats microbiologiques ou autologues tels que PAMPs
ou DAMPs (Aslam 2006). Dans un modèle d’infection, les plaquettes activées par TLR2 ou
TLR4 contribuent à l’activation des neutrophiles, à l’adhésion vasculaire et à la formation de
pièges extracellulaire neutrophiles (NET : neutrophil extracellular traps) (Clark et al. 2007).
Les NETs sont largement connus comme étant impliqués dans la clairance microbiologique et
dans l’activité auto immune en synthétisant certains éléments auto réactifs, comme démontré
dans certaines maladies auto immunes telles que le lupus ou la PR (Dwivedi et Radic 2014).

Les plaquettes peuvent aussi participer directement à l’inflammation par la production

d’IL-1, de thromboxane ou d’oxyde nitrique. Le pré ARNm d’IL-1 est présent directement dans
le cytoplasme des plaquettes et son activation provoque la translation et l’expression d’IL-1β
dans le compartiment extracellulaire (Lindemann et al. 2001).

De nombreuses microvésicules sont présentes dans le cytoplasme des plaquettes et

beaucoup d’entre elles contiennent des miARN qui peuvent être exportés en dehors de la
plaquette. Des études montrent qu’au moins 30 miARNs sont significativement surexprimés

45
dans les micro vésicules des plaquettes et certains sont impliqués dans le contrôle inflammatoire
comme miR-223, miR-142 ou let-7 (Simon et al. 2014).

ii. Eléments pathologiques

Il a été démontré que les plaquettes ont de nombreux éléments qui peuvent contrôler les
voies de l’inflammation, des études démontrent alors une relation entre maladies
inflammatoires chroniques et plaquettes. La PR et le lupus systémique (SLE) sont les
pathologies les mieux décrites.

Dans le SLE, les plaquettes sont activées et expriment de nombreux substrats comme
décrits avant (Eric Boilard, Blanco, et Nigrovic 2012). En particulier, le CD40L contenu dans
le sérum et transmembranaire provenant des plaquettes est particulièrement élevé dans la SLE
et contribue à la maturation des cellules dendritiques et permet la production d’IFN
(Vazgiourakis et al. 2011).

Dans la PR, l’hyperactivation des plaquettes est démontrée par l’augmentation de la P-

sélectine et du CD40L dans le sang des patients atteints de PR aigue (Goules et al. 2006). Les
plaquettes favorisent la perméabilité vasculaire par la sécrétion de sérotonine et contribuent à
la formation de trou endothélial. Ces trous permettent de libérer le contenu des plaquettes dans
l’articulation et contribuent à un renforcement de l’inflammation. En particulier, les
microvésicules avec IL-1β amplifient l’inflammation articulaire avec l’activation des FLS et le
recrutement des neutrophiles et macropahges (E. Boilard et al. 2010).

b. Globules rouges

Le rôle des globules rouges dans le contrôle de l’inflammation est moins bien connu.
Les globules rouges sont le principal réservoir en hémosidérine et leur lyse pendant les
saignements intra articulaires donne lieu à une libération massive d’hémosidérine avec la
formation d’un dépôt de fer dans le synovium et l’activation des macrophages, notamment par
la voie du TLR-4 (R. T. Figueiredo et al. 2007). De plus, l’hémophagocytose des globules
rouges par les macrophages pendant les saignements intra articulaires contribue à une activation

46
des macrophages et une libération de cytokines inflammatoires comme IL-1β, IL-6 et TNF-α
(van Vulpen, Roosendaal, et al. 2015).

Toutefois, les globules rouges peuvent avoir un rôle sur la voie de l’inflammation par
d’autres moyens. Les globules rouges lysés peuvent activer la voie NF-κB et contribuer à
l’expression des ROS. Des données suggèrent que les globules rouges peuvent recruter les
macrophages, contribuer à l’up-régulation d’IL-1β en activant le compartiment de
l’inflammasome, notamment NLRP1 et la caspase-1 et ainsi agir comme un signal de danger
endogène (Yin et al. 2015).

47
 Chapitre 3 : Rôles des facteurs de la coagulation

Outre un potentiel effet des plaquettes et des globules rouges, le plasma des patients
hémophiles pourrait intervenir dans la physiopathologie de l’AH. Dans le plasma, on retrouve
en particulier les facteurs de la coagulation et donc le FVIII et le FIX. Il est intéressant de se
pencher sur le FVIII plus spécifiquement car il a été montré que l’on observe plus de
dégradation articulaire dans l’hémophilie A en comparaison à l’hémophilie B (Blobel et al.
2015).

1. Les facteurs de la coagulation

a. Définition générale

Les facteurs de la coagulation sont un groupe de protéines essentielles à la formation

des caillots sanguins. Il y a dix facteurs plasmatiques de la coagulation. Leur nom (ou
dénomination), leur poids moléculaire et leur concentration respective sont repris dans le
tableau ci-dessous.

48
 Poids Concentration Concentration
Nom/Numéro Dénomination moléculaire plasmatique plasmatique
(kDa) (mg/L) (µmol/L)
I Fibrinogène 340 2500 7.35
II Prothrombine 63 150 2.38
V Proaccélérine 350 10 2.86x10-2
VII Proconvertine 45 0.5 1.11x10-2
Facteur
VIII antihémophilique 290 0.2 6.90x10-4
A
Facteur
IX antihémophilique 60 3 5.00x10-2
B
X Facteur Stuart 55 15 2.73x10-1
Facteur
XI 165 5 3.03x10-2
Rosenthal
Facteur
XII 80 30 3.75x10-1
Hageman
Facteur de
XIII stabilisation de la 320 20 6.25x10-2
fibrine

Tableau 4 : Caractéristiques des facteurs de la coagulation.

b. Biogénèse

Tous les facteurs de la coagulation ont une synthèse hépatique. Le facteur VIII est
également synthétisé au niveau des cellules endothéliales hépatiques.

Certains facteurs sont dépendants de la vitamine K, c’est le cas des facteurs II, VII, IX
et X. Ces facteurs sont régulés par la vitamine K et par certains médicaments (en particulier, les
antagonistes de la vitamine K).

49
 Nom/Numéro Synthèse Vitamine K dépendant
I Foie Non
II Foie Oui
V Foie – SRE Non
VII Foie Oui
Foie / cellules endothéliales
VIII Non
hépatiques
IX Foie Oui
X Foie Oui
XI Foie Non
XII Foie + ? Non
XIII Foie Non

Tableau 5 : Modes de synthèse et de régulation des facteurs de la coagulation

c. Fonctions des facteurs de la coagulation

i. Rôle dans la coagulation

Sur le plan fonctionnel, les facteurs de la coagulation appartiennent à différents groupes

et leur fonction est spécifique de ces groupes. On retrouve les zymogènes, les co facteurs ou
bien encore les substrats. Tous ces groupes ont un rôle particulier dans la coagulation.

- Les zymogènes : Il y a six zymogènes : le FII, le FVII, le FIX, le FX, le FXI et le FXII.
Les zymogènes vont acquérir une fonction enzymatique. Ils ont tous une structure
similaire avec des homologies dans les régions aminoterminales et au niveau des sites
catalytiques. Les régions aminoterminales vont permettre aux zymogènes de créer des
interactions protéine/protéine ou protéine/surface. Les régions carboxyterminales
portent les éléments du site actif. La scission d’une ou plusieurs liaisons peptidiques va
démasquer le site catalytique et permettre la transformation des zymogènes en enzymes
actives.
- Les cofacteurs : Il y a deux cofacteurs : le FV et le FVIII. Ils vont augmenter la vitesse
d’activation du substrat par l’enzyme par le biais d’interactions protéine/protéine ou
protéine/surface.
- Les substrats : il y a un substrat dans le processus de coagulation : le fibrinogène. Il a
un rôle bien spécifique, il se transforme en fibrine sous l’action de la thrombine pour
permettre la coagulation.

50
 Tous ces facteurs de la coagulation sont impliqués dans la voie de la coagulation, avec
pour finalité l’arrêt du saignement.

ii. Autres rôles

Le plasma, et en particulier le déficit en facteur de la coagulation (facteur contenu dans

le plasma) peut avoir un impact sur l’inflammation.

De plus en plus d’études émergent en démontrant un rôle aux facteurs de la coagulation,

un rôle autre que celui de coagulation qui leur ait assigné de base.

C’est le cas dans un modèle murin de PR avec souris déficientes en facteur XIII (FXIII).
Le FXIII pourrait exercer un rôle local sur l’arthrose. En effet, le FXIII dirige la pathogénèse
de l’arthrose en promouvant l’inflammation locale et la dégradation tissulaire et en participant
aux évènements de remodelage. Dans un modèle murin d’arthrose induite au collagène, le
déficit en FXIII limite l’arthrose inflammatoire et protège la destruction osseuse et du cartilage
en réduisant l’ostéoclastogénèse médiée par RANKL (Raghu et al. 2015).

Dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer, la déplétion en FXII améliore la

pathologie. En effet, les souris déficientes en FXII montrent une meilleure fonction cognitive
en comparaison aux souris sauvages. La déplétion en FXII chez les souris inhibe le clivage de
HK dans le plasma et réduit la neuroinflammation et la neurodégénérescence dans le cerveau
(Z.-L. Chen et al. 2017).

Il a été démontré récemment que le FVII exercerait un rôle anti inflammatoire par son
interaction avec EPCR et PAR1. Le FVII bloquerait le TNF-α dans les étapes précoces de la
signalisation médiée par TNFR1. L’utilisation du FVIIa en prophylaxie chez les patients
hémophiles pourrait être étudiée afin de prévenir les hémarthroses chez les patients y compris
ceux avec inhibiteur (Kondreddy et al. 2018).

Ces exemples sont non exhaustifs et permettent de montrer que les facteurs de la
coagulation peuvent donc avoir un impact direct sur l’inflammation intra articulaire et ainsi
conduire à une activation ou inhibition des voies pro ou anti inflammatoires.

51
2. Le FVIII

a. Historique

Le gène du FVIII a été cloné pour la première fois dans les années 1980 par l’équipe de
Gitschier (Gitschier et al. 1984).

La suite des recherches sur ce facteur a permis de mettre en évidence de nombreuses

mutations de ce gène. Il y a plus de 940 mutations situées dans le gène du F8 ou dans des régions
adjacentes à celui-ci.

b. Caractérisation biochimique

Le FVIII humain est une glycoprotéine, encodée par un gène faisant 186 000 paires de
bases et contenant 26 exons. Il est un des plus gros facteurs de la coagulation, pesant alors 293
kDa. Il est localisé sur l’extrémité du bras long du chromosome X, en position Xq28. La
protéine mature est constituée de 2332 acides aminés (contre 2351 acides aminés avant
épissage). L’enchainement de ces acides aminés forme 6 domaines décrits ainsi : A1-A2-B-A3-
C1-C2 (Vehar et al. 1984). Cette protéine peut être clivée par protéolyse en deux chaines : une
chaine lourde de 200 kDa qui reprend les domaines A1-A2-B et une chaine légère de 80 kDa
qui reprend les domaines A3-C1-C2. Ces chaines sont connectées par une liaison covalente.
Chacun des domaines de la protéine présente une fonction particulière.

Figure 11 : Représentation schématique en domaines du FVIII complet (D’après Ngo et al. 2008)

52
 i. Domaines A

Les domaines A du FVIII sont homologues à 40% à ceux du facteur V (FV) et à ceux
de la céruloplasmine qui est une protéine de transport du cuivre dans le sang.

Il y a trois domaines A : A1, A2 et A3. Ces domaines sont de taille similaire avec
respectivement 336 acides aminés, 337 acides aminés et 329 acides aminés. Chaque domaine
contient des structures hautement conservées qui sont appelées β-tonneaux. Ces domaines sont
reliés les uns aux autres de telle sorte que le second sous domaine interagit avec le premier sous
domaine du domaine suivant (McMullen et al. 1995). Les domaines A sont entourés de petites
régions acides de 30 à 40 acides aminés, riches en Asp et en Glu. Le domaine A2 est le domaine
qui va se dissocier le plus facilement pour former la forme active du FVIII. De plus, la séquence
peptidique du domaine A2 forme le site de liaison spécifique au FIXa (Lenting et al. 1996). Un
site spécifique au FX est localisé sur le domaine A1 (Lapan et Fay 1997). De plus, on retrouve
sur le domaine A1 et sur le domaine A2, un site de liaison pour la protéine C activée (Keiji
Nogami et al. 2007). Nombre de patients hémophiles A avec inhibiteurs développent des
anticorps anti-A2 (Astermark 2006). On retrouve des sites de liaison pour le vWF sur le
domaine A3 (Foster et al. 1988) ainsi que pour le FIXa et le FX/FXa (Takeyama et al. 2018).

ii. Domaine B

Le domaine B représente 40% de la masse totale du FVIII. Il est composé de 980 acides
aminés mais sa fonction n’est pas très bien comprise (Alderman et Giles 1993). Le domaine B
est le plus grand de tous les domaines composant le FVIII. Ce domaine ne semble pas impliqué
dans le processus de coagulation du FVIII. En effet, un FVIII avec un domaine B délété présente
une activité comparable au FVIII non délété (Fijnvandraat et al. 1997). Le domaine B est unique
car il ne présente pas d’homologie de séquence avec d’autres protéines. Bien qu’il soit non
indispensable pour l’activité pro coagulante, il apparaît comme ayant des rôles fonctionnels
pour le cycle de vie du FVIII (Pipe 2009). Il serait impliqué dans des interactions intracellulaires
régulant la qualité et la sécrétion du FVIII (Pipe et al. 2005) et contrôlerait la régulation de ce
facteur dans le plasma pendant son activation et sa clairance (Khrenov, Ananyeva, et Saenko
2006).

53
 iii. Domaines C

Il y a trois domaines C : C1 et C2. Ces domaines sont de taille similaire avec

respectivement 153 acides aminés et 160 acides aminés. La présence de deux acides aminés
hydrophobes dans le milieu de la structure du domaine C2 montre que cette surface semble être
responsable de la liaison au facteur de la coagulation. A l’opposé du domaine C2, on retrouve
un domaine C1 et un domaine A1. De plus, le domaine C2 contient des sites pour la thrombine
et pour la forme active du FX. Le domaine C1 ne semble pas jouer de rôle dans la coagulation
mais les recherches menées à ce jour lui suggèrent un impact sur le renforcement du couplage
au facteur de Von Willebrand et au domaine C2 (Lü et al. 2011). Nombre de patients
hémophiles A avec inhibiteurs développent des anticorps anti-C2 (Astermark 2006). On
retrouve des sites de liaison pour le vWF sur le domaine C2 (Saenko et al. 1994). Récemment,
il a été démontré en cristallographie que le domaine C2 se présente sous la forme de deux
conformations (Smith et al. 2019).

c. Biosynthèse et sécrétion du FVIII

i. Biosynthèse

Le foie constitue le site majeur de production du FVIII circulant. En effet, on note la

présence d’ARNm et de protéine du FVIII au niveau du foie (M. S. Figueiredo et Brownlee
1995; Wion et al. 1985).

Le type cellulaire à l’origine du FVIII reste encore sujet à controverse. Des travaux ont
montré la présence d’ARNm codant pour le FVIII dans la rate, certains ganglions, les reins ou
bien encore les poumons (Wion et al. 1985; Jacquemin 2006). Ces études démontrent que le
foie n’est pas le seul site de biosynthèse du FVIII.

ii. Sécrétion et liaison au vWF

Le polypeptide du FVIII mature sera transloqué dans la lumière du réticulum

endoplasmique (RE), où se produisent les N-glycosylations. Il va alors interagir avec de

54
nombreuses protéines chaperonnes et en particulier avec la protéine BiP (Ig-binding protein).
Cette protéine se lie au domaine A1 du FVIII et permet de retenir le FVIII dans le RE.

Avant sa sécrétion, le FVIII subit un clivage protéolytique au niveau du domaine B qui

va alors rompre les liaisons covalentes entre la chaine lourde et la chaine légère. On retrouvera
dans le sang des molécules de FVIII circulantes sous forme d’hétérodimères dont les chaines
lourdes et légères sont associées de manière non covalente (O’Brien, Pattinson, et Tuddenham
1990). Dès qu’il est libéré dans la circulation, le FVIII sous forme hétérodimérique va se lier
au vWF par des liaisons hydrophobes et hydrostatiques. La formation de ce complexe est
indispensable pour le maintien du FVIII dans la circulation : il protège le FVIII d’une liaison
prématurée aux plaquettes activées (NesheimSi et al. 1991) et au FIXa (Lenting et al. 1994) et
empêche également le FVIII d’être dégradé par des protéases comme la protéine C activée ou
le FXa (Koedam et al. 1988). En conditions physiologiques, 2 à 5% du FVIII circule sous forme
libre, c’est-à-dire non complexée au vWF (Schambeck et al. 2004).

d. Activation et inactivation du facteur de la coagulation

Le FVIII est transporté par le vWF vers le site de saignement et il est activé de manière
protéolytique par la thrombine. L’activation est le résultat du clivage d’une Arginine en position
372 (coupant la liaison entre les domaines A1 et A2), d’une arginine en position 740 (coupant
la liaison entre les domaines A2 et B) sur la chaine lourde et du clivage d’une arginine en
position 1689 (coupant la liaison entre les domaines B et A3). Le FVIII activé se retrouve alors
sous forme de trimère constitué du domaine A1, du domaine A2 et des domaines A3-C1-C2
liés. Le domaine B n’est pas retrouvé dans la structure du FVIII activé. (Eaton et al. 1986)

55
 Figure 12 : Représentation de l’activation du FVIII afin d’obtenir le FVIIIa. Ce schéma montre
les sites de clivage spécifiques de la thrombine pendant le processus d’activation (d’après Mazurkiewicz-Pisarek
et al. 2016).

Le FVIII activé est inactivé selon deux processus : soit par dissociation de la liaison
ionique entre le domaine A2 et le dimère A1/A3-C1-C2 (Wakabayashi et Fay 2008) soit par
dégradation protéolytique par l’intermédiaire de la PCa, du FXa et de la plasmine (Keiji Nogami
et al. 2007).

e. Catabolisme du FVIII

Le catabolisme du FVIII est conduit par deux phénomènes : la liaison qu’il possède avec
sa molécule chaperonne qui est le vWF et son interaction à des récepteurs d’endocytose
exprimés à la surface de certaines cellules.

On peut citer plusieurs types de récepteurs d’endocytose : le récepteur LRP1 (LDL

receptor-related protein-1), les récepteurs de la famille aux LDL, les récepteurs de la famille
aux asialoglycoprotéines ou bien encore le Siglec-5.

56
 - Le récepteur LRP1 : le FVIII possède 3 sites de liaison au LRP1 qui sont situés au
niveau des domaines A2, A3 et C2. Le FVIII non activé se lie au LRP1 par sa chaine
lourde et le FVIIIa s’y lie par sa chaine lourde et sa chaine légère. Le LRP1 serait
impliqué dans la clairance du FVIII (Lenting et al. 1999).
- Les récepteurs de la famille aux LDL : il a été montré que les LDLR interagissent avec
le FVIII et permettent de réguler son taux circulant (Bovenschen 2005).
- Les récepteurs de la famille aux asialoglycoprotéines : le plus largement décrit pour le
FVIII est le récepteur ADGPR (Bovenschen et al. 2005). Ce récepteur se lierait au
niveau du domaine B du FVIII. Cependant, le rôle précis de ce récepteur concernant la
clairance du FVIII n’a pas été élucidé à ce jour.
- Le Siglec-5 : Ce récepteur appartient à la famille des lectines et peut se lier au vWF et
au FVIII.

f. Rôles du FVIII

i. Rôle dans la coagulation

Le rôle premier et le plus connu du FVIII est celui qu’il occupe dans la coagulation.
Dans la coagulation, on peut diviser le rôle de ce facteur en deux sous-rôles.

Tout d’abord, le FVIII va promouvoir et maintenir l’hémostase après une blessure. Le

FVIII joue le rôle de co enzyme en accélérant la génération de FXa et de thrombine. Il est
essentiel pour permettre une réponse hémostatique adéquate. Le FVIII circulant est pour sa part
lié au vWF et ce complexe stabilisé se lie à la matrice sous-endothéliale permettant l’adhésion
des plaquettes aux sites de la lésion. Après activation, le FVIIIa forme le complexe tenase avec
le FIXa à la surface des plaquettes et potentialise la génération de FXa.

Secondairement, le FVIII régule le vWF. Le FVIII stabilise les multimères de vWF et

les rend plus susceptibles à la dégradation par ADAMTS-13. Le FVIIIa (qui n’est donc pas lié
au vWF) n’a pas cet effet (Cao et al. 2008).

Comme vu précédemment, lorsque le FVIII n’exerce plus ou exerce moins bien son rôle
dans la coagulation, la pathologie associée est l’hémophilie A.

57
 ii. Rôles du FVIII en dehors de la coagulation

1. Rôles associés à l’hémophilie

L’hémophilie, par son déficit en FVIII, peut influencer de nombreux systèmes.

L’hémophilie peut influencer le risque de maladies cardiovasculaires. On peut s’attendre

à avoir un risque d’évènements thrombotiques réduits chez les patients hémophiles. Cependant,
dans une revue reprenant plusieurs études menées chez des patients atteints de différents
désordres hémorragiques, aucune réduction significative n’a été montrée concernant la
mortalité liée à la thrombose artérielle chez les hémophiles par comparaison à la population
générale (Biere-Rafi, Zwiers, et Peters 2010). Une autre étude avec un nombre plus réduits de
participants montre que l’hémophilie sévère semble offrir une meilleure protection contre les
maladies artérielles que l’hémophilie modérée ou légère (Kulkarni, Soucie, et Evatt 2005). Cela
laisse supposer que plus le taux de FVIII est diminué, plus une protection contre les maladies
artérielles se met en place.

Des études suggèrent une possible association entre des problèmes cognitifs et
comportementaux chez des hémophiles mais n’établissent pas de rôle direct du FVIII (ou FIX)
dans la fonction cérébrale. On ne peut pas conclure si ces observations sont l’impact d’une
maladie chronique ou une manifestation clinique du déficit en FVIII.

Une prévalence pour l’hypertension a été relevée chez les patients hémophiles en
comparaison à la population générale. Comme dans la population générale, l’âge et l’indice de
masse corporelle sont les principaux facteurs de risque (von Drygalski et al. 2013). L’hématurie
est plus fréquente chez les patients hémophiles que dans la population générale et les
hémophiles auraient 50 fois plus de risque de développer une maladie rénale chronique (Quon
et Konkle 2010). Cependant, le rôle précis du FVIII et le mécanisme expliquant cette influence
ne sont pas définis.

Une équipe en Suède a mis en évidence une incidence accrue de cancers, en particulier
des hémopathies malignes et des cancers des organes urinaires, chez les patients hémophiles A
et B (Lövdahl et al. 2016). L’incidence étant commune aux hémophilies A et B, nous pouvons
penser que la cause se situe au niveau de la diminution de génération de thrombine, plutôt que
des FVIII et FIX à proprement parlé.

58
 Des données préliminaires montrent que les macrophages de patients hémophiles
présentent des fonctions de régénération plus altérées que les macrophages dérivés de patients
sains. De plus, l’hémophilie, du fait de la coagulation altérée, entraine une augmentation de
l’inflammation et une dérégulation de la différenciation des macrophages (Knowles et al. 2019).

L’arthropathie hémophilique semble être plus sévère chez les hémophiles A en

comparaison avec les hémophiles B. Des études montrent que les patients hémophiles B sévères
font moins d’hémarthroses et présentent des meilleurs scores clinique et radiologique. De plus,
on retrouve dans le sérum de ces patients et dans la synoviale plus de RANKL et plus
d’ostéoprogesterine, en comparaison avec les patients hémophiles A sévères (Blobel et al.
2015).

2. Rôles associés au FVIII

Des marqueurs d’angiogenèse ont été observés dans les articulations de patients atteints
d’arthropathie hémophilique et le degré d’arthropathie est plus sévère dans l’hémophilie A que
dans l’hémophilie B ; ce qui peut impliquer que le FVIII ait un rôle (D. Melchiorre et al. 2016).
De plus, le vWF est connu pour être un régulateur de l’angiogénèse et ADAMTS13 est
proangiogénique. Cependant, une relation entre ces deux dernières protéines, le FVIII et
l’angiogenèse n’a pas été établie.

Outre le fait que l’hémophilie peut influencer sur la densité minérale osseuse (comme
vu précédemment), des études montrent un potentiel rôle du FVIII. Le remodelage osseux est
contrôlé par la formation et la résorption osseuses, qui sont des processus induits par les
ostéoblastes pour la formation osseuse et les ostéoclastes pour la résorption osseuse. La
formation osseuse peut être affectée de manière indirecte par le FVIII et par la génération de
thrombine, la thrombine étant associée à l’activation des ostéoblastes. Cela a été démontré dans
un modèle animal de lapin (Li et al. 2005). Il a également été démontré un rôle pour le complexe
FVIII-vWF dans le remodelage osseux. (Larson et Taylor 2017). Ces données suggèrent que le
taux de FVIII peut être considéré comme un facteur de risque à prendre en compte dans
l’ostéoporose.

Une étude montre un potentiel rôle du FVIII dans la régulation de l’hématopoïèse. Les
souris « knock-out » FVIII présentent des proportions de progéniteurs de cellules souches
hématopoïétiques modifiées. Les auteurs soulèvent la probabilité que ce mécanisme de

59
dérégulation pourrait plutôt se situer en aval du FVIII, en particulier au niveau de la thrombine
(Aronovich et al. 2013).

Il semble difficile d’isoler des rôles dépendants ou indépendants de la coagulation pour

le FVIII.

Système Rôle spécifique du FVIII Influence de l’hémophilie

Forme le complexe Xase avec le
FIXa à la surface des plaquettes Saignements et atteinte
Coagulation
pour potentialiser la génération de articulaire
thrombine
Un taux de FVIII supérieur à la
norme peut impliquer un risque
Cardiovasculaire cardiovasculaire accru. A l’inverse, Peu d’incidence
un taux de FVIII bas diminue le
risque cardiovasculaire.
Problèmes cognitifs et
Cerveau Non établi
comportementaux
Hypertension Non établi Incidence élevée
Augmentation du risque de
Foie Non établi
maladies du foie
Incidence augmentée dans les
Cancer Non établi hémopathies malignes et les
cancers des organes urinaires
Angiogenèse Liaison au vWF Néoangiogénèse
Augmentation du risque de
Diminution de l’expression de
Os fracture et diminution de la
RANKL
densité osseuse minérale
Fonction altérée et
Macrophages Non établi
différentiation altérée
Altération des proportions de Altération des proportions de
Hématopoïèse
progéniteurs hématopoïétiques progéniteurs hématopoïétiques

Tableau 6 : Systèmes et processus affectés par le FVIII et/ou par l’hémophilie. (D’après
Samuelson Bannow et al. 2019)

60
 Chapitre 4 : Inflammation, TLR et lien avec la coagulation

Comme vu précédemment, la voie du NF-κB est particulièrement impliquée dans l’AH.

En effet, la sécrétion de cytokines inflammatoires dans la membrane synoviale de patients
atteints d’AH est directement contrôlée par cette voie. L’AH semble donc se caractériser par
un processus inflammatoire. Cette inflammation peut alors notamment être médiée par les TLR
car ce sont des activateurs importants de la voie du NF-κB.

1. L’inflammation

a. Définition

L’inflammation est définie comme une réponse immunitaire protectrice résultant de

processus physiopathologiques déclenchés, par exemple, par une infection ou une lésion. Une
réponse inflammatoire est généralement déclenchée dans les heures suivant l’infection ou la
blessure. La défense initiale contre l’infection est souvent initiée par l’immunité innée. Les
agents pathogènes sont reconnus par les récepteurs de reconnaissance ou patter recognition
receptors (PRR) exprimés sur les cellules hématopoïétiques et non hématopoïétiques. A leur
tour, les cellules immunitaires innées sécrètent un panel de cytokines et de chemokines
inflammatoires, du TNF-α et des médiateurs chimiques (comme le leucotriène B4, la
prostaglandine E2 ou l’histamine). Ces cellules créent l’état inflammatoire et attirent les
monocytes et neutrophiles au site de l’infection et permettent aux protéines plasmatiques de
pénétrer dans les tissus à partir du sang.

D’un point de vue clinique, une réaction inflammatoire est caractérisée par une douleur,
une rougeur, une chaleur et un gonflement au niveau du site de l’infection. Ces caractéristiques
reflètent quatre types de modifications au niveau des vaisseaux sanguins locaux.

Il y a une augmentation du diamètre vasculaire, entrainant une augmentation du flux

sanguin local, expliquant la chaleur et la rougeur. On note la réduction de la vitesse du flux
sanguin.

Les cellules endothéliales tapissant le vaisseau sanguin sont activées pour exprimer des
molécules d’adhésion cellulaire et favorisent alors la liaison des leucocytes en circulation. La
combinaison du ralentissement du flux sanguin et la présence de molécules d’adhésion permet

61
aux leucocytes de se fixer à l’endothélium et de migrer dans les tissus. Tous ces changements
sont initiés par les cytokines et chemokines pro-inflammatoires, alors produites par les
macrophages activés.

Le troisième changement majeur dans les vaisseaux sanguins est une augmentation de
la perméabilité vasculaire. Au lieu d’être étroitement jointes, les cellules endothéliales qui
tapissent les parois des vaisseaux sanguins se séparent. Cela entraine la sortie du sang et des
protéines du sang et engendre une accumulation locale dans les tissus. Cela explique le
gonflement, l’œdème et la douleur.

Le quatrième changement est la coagulation dans les micro-vaisseaux au niveau du site

de l’infection. Cela empêche la propagation de l’agent pathogène par le sang.

Ces changements sont induits par divers médiateurs inflammatoires libérés à la suite de
la reconnaissance d’agents pathogènes par les macrophages puis par les neutrophiles et d’autres
globules rouges. Les macrophages et les neutrophiles sécrètent tous deux des médiateurs
lipidiques de l’inflammation : prostaglandines, leucotriènes et facteurs activant les plaquettes.
Ces médiateurs sont produits rapidement par des voies enzymatiques dégradant les
phospholipides membranaires. Leurs actions sont suivies par celles des chemokines et
cytokines sécrétées et synthétisées par les macrophages en réponse à des agents pathogènes.

b. Rôles de l’inflammation

L’inflammation joue trois rôles essentiels dans la lutte contre l’infection.

Le premier consiste à libérer des molécules effectrices et des cellules du sang

supplémentaires au niveau des sites d’infection, augmentant ainsi la destruction des micro-
organismes envahisseurs.

Le second consiste à induire une coagulation sanguine locale, qui constitue une barrière
physique à la propagation de l’infection dans le sang.

Le troisième est de promouvoir la réparation des tissus blessés.

62
2. Toll-like récepteur (TLR)

La production de cytokines et de chemokines par les macrophages résulte de la

stimulation des récepteurs de signalisation de ces cellules par une grande variété de composants
pathogènes. Parmi ces récepteurs, ceux de type Toll (TLR) représentent un système de défense
de l’hôte.

Les TLR ont été la première famille de PRR à être découverte et ils sont toujours les
mieux caractérisés, que ce soit au point de vue de leur structure, de leur liaison aux PAMPS ou
bien encore concernant la vaste gamme de réponses immunitaires innées qu’ils induisent.

a. Découverte des Toll-like receptors (TLR)

Dans les années 1980, des chercheurs allemands ont découvert que les embryons de
mouches Drosophiles ne pouvaient pas établir un axe dorsal-ventral approprié (leur dos était à
l’avant) si le gène codant pour la protéine de membrane Toll était muté. Le mot « Toll »
provient de l’argot allemand qui signifie « bizarre », en référence à l’anatomie étrange de ces
mouches. En 1995, Christiane Nusslein-Volhard, Eric Wieschaus et Edward B. Lewis ont reçu
le prix Nobel de physiologie et de médecine pour leur caractérisation des Toll ainsi que des
gènes liés, portant alors un rôle dans la régulation du développement embryonnaire.

De nombreuses mutations du gène toll ont ensuite été générées. En 1996, Jules Hoffman
et Bruno Lemaitre ont découvert que des mutations de toll rendaient les mouches plus sensibles
à une infection mortelle par Aspergillus fumigatus, un champignon responsable d’infections
sévères chez les humains (Lemaitre et al. 1996). Ils ont également obtenu le prix Nobel. Cette
découverte a conduit à d’autres études montrant que Toll et les protéines associées sont
impliqués dans l’activation des réponses immunitaires innées chez les invertébrés.

La caractérisation de la protéine Toll a révélé que son domaine de signalisation

cytoplasmique est homologue à celui du récepteur pour la cytokine IL-1 chez les vertébrés (IL-
1R). En recherchant des protéines humaines à domaines cytoplasmiques homologues à ceux de
Toll et d’IL1R, Charles Janeway et Ruslan Medzhitov ont découvert en 1997 un gène humain,
similaire à la protéine Toll, qui active l’expression des gènes d’immunité innée dans les cellules
humaines (Medzhitov et Janeway 1997). Cette famille et les autres parents Toll découverts peu
de temps après furent alors nommés récepteurs de type Toll (TLR).

63
 Grâce à des études sur des souris mutantes, Alexander Polotorak et Bruce Beutler ont
obtenu en 1998 la preuve que les TLR contribuent au fonctionnement normal du système
immunitaire chez les mammifères. Les souris homozygotes pour une forme mutante du gène
lps sont résistantes aux réponses néfastes induites par le lipopolysaccharide (LPS). Ils ont
découvert que le gène lps de souris défectueux codait pour une forme mutante d’un TLR, le
TLR4, qui diffère de la forme normale par un seul acide aminé, de sorte qu’il n’est plus activé
par le LPS. Ce travail a apporté la démonstration que TLR4 est le PRR (récepteur de
reconnaissance) d’immunité innée cellulaire qui reconnait le LPS (Poltorak 1998).

Cette série d’expériences a permis de montrer que les invertébrés réagissant aux agents
pathogènes, utilisent des récepteurs également présents chez les vertébrés et un de ces
récepteurs est responsable des réponses immunitaires innées induites par le LPS.

b. Les TLR et leurs ligands

Des travaux au cours des 20 dernières années ont permis d’identifier plusieurs membres
de la famille des TLR chez la souris et l’homme. 13 TLR fonctionnant comme des PRR ont été
identifiés chez ces espèces. Les TLR 1 à 10 sont conservés entre la souris et l’homme alors que
les TLR 11 à 13 sont exprimés seulement chez la souris (Lim et Staudt 2013). L’ensemble des
TLR présents chez l’homme ou la souris peut détecter une grande variété de PAMP provenant
de bactéries, de virus, de champignons et de parasites, ainsi que des DAMP provenant de
cellules et tissus endommagés. Chaque TLR a un répertoire distinct de spécificités pour les
PAMP conservés. Les TLR et certains de leurs ligands sont repris en table 7.

64
 TLR Ligand Microbe
TLR1 Triacyl lipopeptides Mycobactéries et bactéries Gram -
Peptidoglycans Bactéries Gram +
Protéines liées au GPI Trypanosomes
TLR2 Lipoprotéines Mycobactéries et autres bactéries
Zymosan Levures et autres champignons
Phosphatidlyserine Schistosomes
TLR3 Double brin d’ARN Virus
LPS Bactéries Gram -
TLR4 Protéine F Virus respiratoire syncytial
Mannanes Champignons
TLR5 Flagelline Bactéries
Lipopolypeptides diacyl Mycobactéries et bactéries Gram +
TLR6
Zymosan Levures et autres champignons
TLR7 Simple brin d’ARN Virus
TLR8 Simple brin d’ARN Virus
Dinucléotides non méthylés en CpG ADN bactérien
Dinucléotides ADN bactérien
TLR9 Composants du virus de l’herpès Nombreux virus de l’herpès
Sous-produit de l’hème parasite du
Hemozoïne
paludisme
TLR10 Non connu Non connu
Non connu Bactérie uropathogène
TLR11
Profiline Toxoplasme
TLR12 Non connu Non connu
TLR13 Non connu Virus de la stomatite vésiculeuse

Tableau 7 : Les TLR et leurs ligands. Sont encadrés en vert les TLR retrouvés chez l’homme et la souris.
Sont encadrés en noir les TLR présents seulement chez la souris. (D’après Kuby, 2013)

Les TLR sont des protéines membranaires qui partagent un élément structural commun
dans leur région extracellulaire appelée répétition riche en leucine (LRR). De multiples LRR
constituent le domaine de liaison à un ligand extracellulaire de la chaine polypeptidique de
TLR. Lorsque les TLR se lient à leurs ligands PAMP ou DAMP via leurs domaines LRR
extracellulaires, ils se dimérisent. Dans la plupart des cas, chaque TLR se dimérise avec lui-

65
même, formant alors un homodimère. TLR2 forme des hétérodimères par appariement avec
TLR1 et TLR6.

Figure 13 : Structure d’une chaine polypeptidique de TLR. Chaque chaine polypeptidique de TLR
est composée d’un domaine extérieur de liaison au ligand qui contient de nombreuses répétitions riches en
leucine (LRR), un domaine traversant la membrane (en bleu) et un domaine intérieur Toll/IL-1R (TIR), qui
interagit avec les domaines TIR d’autres membres de la voie de transduction du signal TLR. Deux de ces chaines
polypeptidiques se couplent pour former des dimères et se lier aux ligands. (D’après Kuby, 2013)

Les TLR existent à la fois sur la membrane plasmique (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5,
TLR6, TLR10) et dans les membranes d’endosomes et de lysosomes (TLR3, TLR7, TLR8 et
TLR9). Leur localisation cellulaire est adaptée pour leur permettre de répondre de manière
optimale aux ligands microbiens particuliers qu’ils reconnaissent. Les TLR qui reconnaissent
les PAMP sur la surface externe des microbes extracellulaires se trouvent sur la membrane
plasmique, où ils peuvent se lier à ces PAMP et induire des réponses. En revanche, les TLR qui
reconnaissent les composants microbiens internes qui doivent être exposés, par dégradation
d’agents pathogènes endocytés par exemple, se retrouvent dans les endosomes et les lysosomes
(Blasius et Beutler 2010). Le TLR4 est un membre particulier de la famille des TLR. Il a été
démontré que le TLR4 se déplace de la membrane plasmique vers les endosomes / lysosomes
après liaison du LPS ou autres PAMP. Il active alors différentes voies de signalisation à partir
de ces deux emplacements (Beutler 2000).

66
Figure 14 : Localisation cellulaire des TLR. Les TLR qui interagissent avec les ligands extracellulaires
résident dans la membrane plasmique. Les TLR qui lient des ligands générés à partir de microbes endocytés sont
localisés dans des endosomes et/ou des lysosomes. Lors de la liaison du ligand au TLR, le dimère de TLR4 passe
de la membrane plasmatique au compartiment endosomal/lysosomal où il peut activer différents composants de
signalisation. (D’après Kuby, 2013)

Outre les ligands microbiens, les TLR reconnaissent également les DAMP. Ce sont des
composants auto-endogènes libérés par les cellules mortes ou mourantes ou par les tissus
endommagés. Parmi les DAMPS reconnus par les TLR sur les membranes plasmiques, on
trouve les protéines de choc thermique et de chromatine, des fragments de composants de la
matrice extracellulaire (tels que la fibronectine et l’hyaluronique), ainsi que les lipoprotéines
de basse densité et l’amyloïde.

67
 c. Signalisation induite par les TLR

La signalisation par les TLR utilise de nombreux principes et de nombreuses molécules

de signalisation. Ils peuvent également activer des voies propres à eux-mêmes. Les voies de
signalisation mises en jeu par les TLR sont résumées dans la figure ci-dessous.

Figure 15 : Voies de signalisation TLR. Les voies de signalisation en aval des TLR sont représentées
pour trois TLR de surface cellulaire (TLR2/1, TLR4 et TLR5 - elles peuvent être également activées par TRL2/6
et TLR11 [non représentés]) et pour les TLR endosomaux/lysosomaux TLR7 et TLR9 (à droite – également
activée par TLR8 [non représenté]) et par TLR3 et TLR4 (à gauche). Les voies de signalisation dépendantes de
Myd88 sont activées par les adaptateurs de liaison au récepteur TRAM et TRIF. [Tous les composants de
signalisation ne sont pas représentés] (D’après Kuby, 2013)

68
 Un exemple de voie de signalisation mise en jeu par les TLR est la voie NF-κB. Le
facteur de transcription NF-κB (Nuclear Factor-κB) est essentiel pour induire de nombreux
gènes innés et inflammatoires, y compris ceux codant pour les défensives, des enzymes comme
iNOS, des chemokines et des cytokines pro inflammatoires comme TNF-α, IL-1 et IL-6,
produites par les macrophages et les cellules dendritiques (Ghosh et Dass 2016).

La ou les voies de transduction du signal qui seront activées vont dépendre du TLR et
de l’adaptateur protéique initial qui se lie au domaine cytoplasmique du TLR. Cette région est
appelée domaine TIR. Les domaines TIR de tous les dimères TLR servent de sites de liaison
pour les domaines TIR des adaptateurs qui activent les voies de signalisation en aval. Les deux
adaptateurs clés sont Myd88 (facteur de différenciation myéloïde 88) et TRIF (facteur IFN
induisant l’adaptateur contenant un domaine TIR). La plupart des TLR, qu’ils se trouvent aussi
bien à la surface de la cellule ou dans des endosomes/lysosomes, se lient à la protéine
adaptatrice Myd88 (activant les voies de signalisation dépendant de Myd88). En revanche, le
TLR3 se lie à la protéine adaptatrice TRIF (activant les voies de signalisation dépendantes du
TRIF). Le TLR4 est unique car il se lie à Myd88 (lorsqu’il est dans la membrane plasmique,
signalant son endocytose) et le TRIF (lorsqu’il est dans des endosomes, après internalisation).
On peut noter la présence de deux adaptateurs supplémentaires associés à la plupart des TLR :
TIRAP (protéine adaptatrice contenant le domaine TIR) et TRAM (molécule adaptatrice liée
au TRIF). Ce sont des adaptateurs contenant un domaine TIR servant de récepteurs de tri :
TIRAP aide à recruter Myd88 pour les TLR2/1, 2/6 et 4 et TRAM aide à recruter TRIF dans
les TLR3 et les TLR4 endosomal/lysosomal (Horng et al. 2002; Yamamoto et al. 2003).

i. Voies de signalisation dépendantes de myd88

Après association avec un dimère de TLR et liaison du ligand, Myd88 initie une voie de
signalisation qui active principalement les voies NF-κB et MAPK par la même voie que celle
initiée par l’IL-1. Pour les TLR2/1, 4 et 5 de la membrane plasmatique, Myd88 recrute et active
plusieurs protéines kinases IRAK, qui se lient et activent ensuite TRAF6. TRAF6 ubiquitine
les protéines NEMO et TAB, conduisant à l’activation de TAK1, qui phosphoryle ensuite le
complexe IκB kinase (IκK). L’Iκ-K activé phosphoryle ensuite la sous unité inhibitrice Iκ-K de
NF-κB, libérant NF-κB pour pénétrer dans le noyau et activer l’expression génique. TAK1 a un
double rôle dans cette cascade de signalisation TLR. Une fois séparé du complexe IκK, il active

69
les voies de signalisation MAPK, entraînant l’activation de facteurs de transcription,
notamment Fos et Jun, qui constituent le dimère AP-1. (Akira et Takeda 2004)

En plus d’activer les voies NF-κB et MAPK via la voie dépendante de Myd88, les TLR
endosomiques 7, 8 et 9, qui lient les acides nucléiques microbiens, déclenchent également des
voies qui activent les IRF. Lorsqu’ils sont déclenchés par ces TLR, le complexe
Myd88/IRAK/TRAF6 active un complexe contenant TRAF3, IRAK1 et IKK, conduisant à la
phosphorylation, à la dimérisation, à l’activation et à la localisation nucléaire de IRF7. IRF7
induit la transcription de gènes pour les deux interférons de type 1, qui ont une activité antivirale
puissante (Honda et al. 2005).

Ainsi, différents TLR peuvent activer de manière différentielle différents facteurs de

transcription (NF-κB, certains IRF et/ou ceux activés par les voies MAPK), entrainant une
variation dans laquelle les gènes sont activés pour nous protéger contre les agents pathogènes
envahisseurs.

ii. Voies de signalisation dépendantes de TRIF

Pour les deux TLR endosomiques qui recrutent l’adaptateur TRIF au lieu de Myd88
(TLR3 et TLR4 endosomal), les voies de signalisation en aval diffèrent quelque peu de celles
activées par Myd88. TRIF recrute la protéine kinase RIP1 qui, à son tour, recrute et active
TRAF6, initiant ensuite les mêmes étapes que dans la voie dépendante de Myd88 (Meylan et
al. 2004).

TLR3 active également PI3K, ce qui améliore l’activation de la voie MAPK. De plus,
TRIF active TRAF3 et un complexe de TBK-1 et IKK, qui phosphoryle et active IRF7 et un
autre IRF3. IRF3 et IRF7 se dimérisent et pénètrent dans le noyau et induisent (conjointement
avec NF-κB et AP-1) la transcription des gènes IFN (Häcker et al. 2006).

Ainsi, tous les TLR intracellulaires qui lient les PAMP viraux dans une cellule infectée
induisent la synthèse et la sécrétion d’interférons de type I, qui réagissent pour inhiber de
manière puissante la réplication du virus dans cette cellule infectée.

70
 d. Autres familles de PRR

i. Les CLR

La deuxième famille de PRR de surface cellulaire qui active les réponses innées et
inflammatoires est la famille des récepteurs de lectine de type C (CLR). Ce sont des récepteurs
membranaires plasmatiques exprimés de manière variable sur les monocytes, macrophages,
cellules dendritiques, neutrophiles, cellules B et les sous-ensembles de cellules T. Ils
reconnaissent généralement les composants glucidiques des champignons, des mycobactéries,
des virus, des parasites et certains allergènes.

Ils ont différentes fonctions. Contrairement aux TLR qui ne favorisent pas la
phagocytose, certains CLR fonctionnent comme des récepteurs phagocytaires et tous
déclenchent des voies de signalisation qui activent des facteurs de transcription, induisant
l’expression du gène effecteur. Certains CLR déclenchent des évènements de signalisation qui
diffèrent initialement de la signalisation TLR mais conduisent généralement à des étapes en
aval similaires aux voies de TLR dépendantes de Myd88 (Hai Hou* et al. 2017).

ii. Les RLR

La troisième famille de PRR est la famille des récepteurs de type I induits par l’acide
rétinoïque (RLR). Ce sont des PRR solubles qui résident dans le cytosol de nombreux types de
cellules. Ils y jouent un rôle essentiel en tant que capteurs d’infection virale. Les trois RLR
connus sont RIG-I, MDA5 et LGP2. Ce sont des hélicases à ARN contenant CARD qui
reconnaissent les ARN viraux.

Ces récepteurs semblent distinguer l’ARN viral de l’ARN cellulaire sur la base de
caractéristiques structurelles particulières non partagées par l’ARN cellulaire normal (Kato, Oh,
et Fujita 2017).

iii. Les NLR

La dernière famille de PRR est constituée par la famille des récepteurs de type NOS et
les récepteurs contenant le domaine d’oligomérisation des nucléotides/contenant une répétition

71
riche en leucine (NLR). Ces récepteurs constituent une grande famille de protéines cytosoliques
activées par des PAMP intracellulaires et des substances qui alertent les cellules contre les
dommages ou le danger.

Ils jouent un rôle majeur dans l’activation des réponses immunitaires et inflammatoires
innées bénéfiques mais certains déclenchent une inflammation qui provoque des lésions
tissulaires et des maladies graves (Y. K. Kim, Shin, et Nahm 2016).

Les membres de la famille des NLR les mieux caractérisés sont NOD1 et NOD2. Les
PAMPS reconnus par ces derniers sont des produits de dégradation produits lors de la synthèse
ou de la dégradation de peptidoglycanes de paroi cellulaire de bactéries intracellulaires ou
extracellulaires. Ces derniers doivent pénétrer dans la cellule pour activer les NOD. NOD1 et
NOD2 activent la transcription de gènes codant pour des cytokines inflammatoires et des
protéines antimicrobiennes (Motta et al. 2015).

Certains NLR ne déclenchent pas de voies de signalisation induisant l’expression de

gènes impliqués dans les réponses immunitaires innées. Ces NLR s’assemblent alors avec
d’autres protéines en un complexe qui active les protéases nécessaires à la conversion des
formes inactives de précurseurs (procytokines) d’IL-1 et IL-18 en formes matures sécrétées par
des cellules activées. Du fait des effets inflammatoires très puissants de l’IL-1 sécrété, ces
complexes sont maintenant appelés inflammasomes (Davis, Wen, et Ting 2011).

iv. Résumé de signalisations induites par les autres familles de PRR

La figure ci-dessous reprend les principales signalisations induites par les autres familles
de PRR vu précédemment.

72
 Figure 16 : Voies de signalisation CLR, RLR et NLR. Les voies de signalisation en aval des PRR
non-TLR sont indiqués pour (1) la Dectine-1 du CLR au niveau de la membrane plasmatique, (2) le RLR
cytosolique RIG-I et (3) le NLR NOD1 cytosolique. [Tous les composants de signalisation ne sont pas
représentés.] (D’après Kuby, 2013)

3. Relation entre inflammation et coagulation

a. Principes généraux

Le système de coagulation est une autre cascade de protéases qui se déclenche dans le
sang après avoir endommagé les vaisseaux sanguins. Son activation conduit à la formation d’un
caillot de fibrine, dont le rôle normal est d’empêcher la perte de sang (voir Chapitre 1 Partie
1).

73
 Il est connu depuis de très nombreuses années qu’une activation excessive de la
coagulation se produit dans le cadre d’une inflammation. La cascade de coagulation sanguine
est également déclenchée par les cellules endothéliales activées. Elles peuvent donc jouer un
rôle dans la réponse inflammatoire aux agents pathogènes, même si aucune blessure ni lésion
tissulaire importante n’est survenue. Ainsi, dans les minutes qui suivent la pénétration d’un
agent pathogène dans les tissus, la réponse inflammatoire provoque un afflux de protéines et de
cellules pouvant contrôler l’infection. Il se forme également une barrière physique sous forme
de caillots sanguins pour limiter la propagation de l’infection et permettre à l’hôte de prendre
conscience de l’infection locale qui se déroule.

Il existe un dialogue entre les deux systèmes, l’activation de l’un peut amplifier
l’activation de l’autre. Ces systèmes biologiques sont hautement intégrés et délicatement
équilibrés. La dérégulation d’un composant dans un système peut affecter l’équilibre dans
l’ensemble et entraine un large champ de maladies, autant inflammatoires que maladies de la
coagulation.

Les liens moléculaires et cellulaires entre coagulation et inflammation sont de plus en

plus décrits et nous connaissons de mieux en plus les voies et acteurs communs aux deux. Le
principal lien connu entre les deux systèmes est le lien multiple et complexe entre thrombose et
inflammation.

b. Liens et acteurs

i. Le facteur tissulaire (FT)

Le facteur tissulaire (FT) a un rôle central, il est un déclencheur commun entre les deux
systèmes, il sert de pont entre les voies.

Le FT est facilement recrutable car il possède un emplacement stratégique dans les

cellules et on retrouve un taux élevé de FT dans de nombreuses cellules.

En réponse à un dommage, l’expression du FT va être augmentée ou diminuée. Le FT

va alors se complexer avec le FVIIa en circulation et cela déclenche la coagulation. Le
complexe FT-FVIIa induit une signalisation par PAR (récepteur activé par la protéase) et on

74
assiste à une libération de cytokines et chemokines inflammatoires in vivo et in vitro (Demetz
et al. 2010).

De nombreux modèles murins ont montré l’importance du FT, il aurait différents rôles
dans l’inflammation et la coagulation. Des souris avec un taux de FT bas et exposées à des
doses létales d’endotoxines présentent une protection contre la thrombose, l’inflammation et la
mort (Pawlinski 2003). Chez la souris, l’inhibition de la formation du complexe FT-FVIIa
atténue les lésions d’ischémie. On note également une réduction de la signalisation de NF-κB,
de l’activation de TLR-4 et de l’expression de médiateurs pro-inflammatoires (Loubele et al.
2009).

Cependant, l’extrapolation à l’humain n’est pas toujours possible. Même si

l’administration d’inhibiteurs exogènes du FT a été utilisée dans des essais cliniques et pré
cliniques pour atténuer la coagulation induite par l’inflammation, l’efficacité de ces derniers
n’a été démontrée que dans les modèles animaux (van den Boogaard et al. 2015).

ii. La thrombine et PAR

La thrombine est un produit de la coagulation initiée par le FT. Elle possède un rôle
dans le contrôle des hémorragies et présente des propriétés inflammatoires. Elle exerce ses
effets via l’axe coagulation-inflammation : elle clive le fibrinogène pour générer un caillot de
fibrine, amplifie sa propre production par l’activation de co-facteurs et active différents types
de cellules par le clivage protéolytique de PAR (Danckwardt, Hentze, et Kulozik 2013).

Les PAR présentent une grande variété, ils possèdent un profil d’expression large ; ce
qui leur confère une implication dans une gamme variée de processus physiologiques et
pathologiques (hémostase, thrombose, inflammation, cancers, etc). Les PAR sont exprimés
dans tout le corps mais les PAR les plus intéressants pour notre problématique sont ceux
exprimés par les plaquettes, les leucocytes et les cellules endothéliales. Ils ont alors un rôle dans
l’hémostase, la thrombose et l’inflammation. PAR-1 et PAR-4 sont contenus dans les
plaquettes, ils vont contribuer à l’hémostase et la thrombose (Kahn et al. 1999). Côté
inflammatoire, la thrombine peut activer PAR-1 sur les cellules endothéliales et les fibroblastes,
entrainant la production de cytokines pro-inflammatoires (Drake et al. 1992; Sower et al., s. d.).

75
 iii. La protéine C, la thrombomoduline et le récepteur à la protéine C

La protéine C est le précurseur de zymogène circulant dépendant de la vitamine K pour

la protéine C activée (APC). Sa génération est obtenue par clivage par la thrombine et elle est
modulée par la thrombomoduline (TM) et par le récepteur à la protéine C sur les cellules
endothéliales (EPCR).

Ce système intervient dans différents mécanismes de régulation de l’inflammation, de

l’immunité innée et dans la réparation des tissus. La TM amplifie l’activation de la protéine C
par la thrombine et l’inhibiteur de la fibrinolyse activable par la thrombine (TAFI), donnant
alors la protéine C activée et le TAFI activé. L’APC lié à l’EPCR induit une signalisation anti
inflammatoire et cytoprotective par l’action de PAR. APC inhibe la coagulation par les facteurs
de clivage V/Va et VII/VIIa. Le TAFI activé atténue la fibrinolyse et l’inflammation. La TM et
l’EPCR coopèrent comme partenaires pour déterminer la balance entre coagulation et
inflammation.

Dans de nombreux modèles animaux, l’APC, la PC ou l’EPCR diminuent la sécrétion

de cytokines inflammatoires et régulent négativement l’activation de la coagulation (White et
al. 2000).

De plus, la TM et l’EPCR ont un rôle dans la limitation du recrutement et de

l’amplification des voies pro coagulantes et pro inflammatoires (Conway 2012).

iv. Acteurs dans l’immunité innée

1. Les TLR

La fonction et rôle des TLR ont été vus précédemment (Chapitre 4 Partie 2).

Les TLR peuvent contribuer à la thrombose mais le lien est mal connu et mal compris.

TLR2 et TLR4 peuvent induire l’expression du FT et jouent également sur l’activation

plaquettaires et l’augmentation de la coagulation (Semeraro et al. 2011).

76
 2. Le complément

Le système du complément est un élément essentiel de la réponse immunitaire innée. Il

est activé par les voies classiques de réponse aux stimuli.

C’est un facteur majeur d’inflammation et de thrombose dans son ensemble. Les toxines
C3a et C5a (composants de ce système en autre) se lient à leurs récepteurs alors couplés à la
protéine G et interviennent dans les processus inflammatoires et pro-thrombotiques
(Schraufstatter et al. 2002).

Les complexes TP (composés des toxines C5b-7, C5b-8 et C5b-9) activent des cellules
et provoquent la production de médiateurs inflammatoires (Morgan 2016).

v. Les Neutrophils Extracellulars Traps

Les Neutrophils Extracellulars Traps (NET) sont sécrétés par les neutrophiles activés,
par les éosinophiles, les basophiles et les monocytes. Ils sont impliqués dans la pathogénèse des
maladies inflammatoires et thrombotiques.

Au cours de la formation du caillot, les NET se localisent avec la fibrine et le facteur de

Willebrand. Ils sont constitués d’histones et favorisent l’activation des plaquettes et des cellules
endothéliales (Fuchs et al. 2010). Ils induisent la libération de protéines coagulantes contenues
dans les plaquettes via les voies dépendantes TLR2 et TLR4 (Semeraro et al. 2011).

Les NETS constituent la première ligne de défense contre les infections et répondent
rapidement aux stimuli, en induisant divers processus comme l’inflammation, la thrombose,
etc.

77
 Chapitre 5 : Régulation post-transcriptionnelle par dégradation
de l’ARNm

Comme vu précédemment, l’AH semble se caractériser entre autre par un processus

inflammatoire, résultant d’une interaction entre FLS et certains éléments du sang, dont les
facteurs de la coagulation. L’activation, notamment de la voie NF-κB via les TLR, va entrainer
une activité transcriptionnelle accrue et imposer un contrôle post transcriptionnel.

La transcription, au même titre que la régulation post-transcriptionnelle, sont des

mécanismes contribuant à la régulation de l’expression de gènes au cours de divers évènements.
Une cellule exerce un contrôle au niveau post transcriptionnel par un mécanisme qui est celui
de la dégradation d’un ARNm (Mata, Marguerat, et Bähler 2005). La régulation de cette
dégradation fait intervenir certains complexes, contenant soit des protéines soit des ARN non
codants. Cette régulation est également médiée par la présence de nucléases. Les micro ARN
ont un rôle important dans ce phénomène (Glisovic et al. 2008).

1. ARNm : de sa structure à sa dégradation, en passant par sa stabilité

a. Structure

Un ARNm possède des structures régulant sa stabilité. On peut en citer deux

principaux : la queue poly (A) en 3’ de l’ARNm et la coiffe en 5’ de l’ARNm. Ces deux
éléments protègent les transcripts de l’action des exonucléases et permettent l’initiation de la
traduction, en interagissant en particulier avec les protéines eIF4E et poly (A)-binding protein
(PABP).

b. Dégradation

La dégradation d’un ARNm n’est possible que lorsque l’un de ces deux éléments est
éliminé. Quand il est éliminé, une attaque exonucléolytique est possible. La dégradation peut
être réalisée de plusieurs manières :

- Par élimination de la queue poly (A) en 3’

- Par élimination de la coiffe, indépendante de la désadénylation

78
 - Par des endonucléases : PMR1, IRE1

c. Stabilité

Il existe différents facteurs qui vont soit stabiliser soit déstabiliser l’ARNm :

- Les petits ARN dits régulateurs comprenant les siRNA (small interfering RNA), les
miARN (micro ARN), les piRNA (Piwi-interacting RNA), les rasiRNA (repeat-
associated siRNA) (Collins et Cheng 2006)
- Les mRNP (messenger ribonucleoprotein) : ce sont des complexes constitués
d’ARNm et de protéines RBP (RNA-binding proteins) étroitement liés (Jong et al,
2005)

2. Les microARNs (miARN)

a. Découverte

Les miARNs ont été identifiés au début des années 1990, précisément en 1993 par la
mise en évidence que l’ARN non codant lin-4 chez Caenorhabditis elegans avait une
complémentarité anti sens avec lin-14, ce qui entraine une inhibition de lin-14 (R. C. Lee,
Feinbaum, et Ambros 1993). Il a fallu plus d’une dizaine d’années supplémentaires pour
comprendre leur rôle dans la régulation des gènes. (Treiber, Treiber, et Meister 2019) En 2001,
il a été mis en évidence qu’une nouvelle classe de régulateurs de l’expression génique existe :
les micro-ARN (miARN) (Lagos-Quintana 2001; Lau 2001).

Ces miARN appartiennent à la famille des ARN non codants. Cette famille est
composée de plusieurs autres membres comme les siARN, les snARN, les piARN, les snoARN
ou encore les lncARN.

79
 b. Définition, fonction et localisation

Les miARN sont présents chez les eucaryotes de type animal et végétal. Ils sont codés
par un grand nombre de gènes.

Un miARN est un petit ARN de 20 à 24 nucléotides régulant l’expression de gènes de

façon post-transcriptionnelle.

Un ARNm peut être régulé par plusieurs miARN et un miARN peut théoriquement
cibler une centaine de messagers. De ce fait, 30 à 90% du génome pourraient être régulés par
des miARN de manière directe ou indirecte (Engels et Hutvagner 2006) ce qui fait des miARN
une classe de régulateurs géniques.

Leur fonction principale est d’inhiber l’expression d’un gène par un appariement
majoritairement imparfait avec l’ARNm cible. Les miARN se retrouvent alors impliqués dans
l’ensemble des processus biologiques, physiologiques et pathologiques (Bartel 2009).

Les miARN peuvent se localiser dans différentes régions et de différentes manières. Ils
peuvent appartenir à des unités transcriptionnelles déjà connues et annotées ; on les retrouve
alors dans les introns des gènes (Griffiths-Jones et al. 2008; Rodriguez et al. 2004; Saini,
Griffiths-Jones, et Enright 2007). Dans ce cas, ils sont dans le même sens d’orientation et sont
transcrits en même temps que leur gène hôte. Le miARN peut également se localiser dans l’exon
des gènes hôtes. Ils peuvent être transcrits de manière monocistronique, bicistronique ou
polycistronique (ils sont dans ce cas organisés en cluster). Certains miARN sont localisés dans
des régions intergéniques et sont transcrits de manière indépendante en ayant leur propre
promoteur.

c. Nomenclature

Il existe un système de nomenclature permettant d’identifier et de nommer les miARN.

(Luense, Carletti, et Christenson 2009). Les miARN sont également répertoriés dans la base de
données miRBase (Bartel 2009).

La nomenclature des miARN se base sur un système de numérotation qui est fonction
de l’ordre de découverte du miARN. Le numéro du miARN est précédé du suffixe « mir »
quand il s’agit du miARN précurseur ou « miR » quand il s’agit du miARN mature, le tout suivi

80
d’un tiret. La nature de l’espèce est ensuite indiquée par les trois premières lettres (par exemple,
hsa pour Homo Sapiens). Si deux miARN ont des séquences qui diffèrent d’un ou deux
nucléotides seulement, ils auront une lettre différente en suffixe. Si deux miARN proviennent
de précurseurs et de locus génomiques différents mais possèdent la même séquence mature, un
suffixe avec des chiffres différents sera attribué. Si le miARN précurseur produit deux miARN
matures à partir de chacun de ses deux brins opposés, les miARN seront alors différenciés par
le suffixe -5p ou -3p en fonction du brin d’origine.

Tableau 8 : Nomenclature pour les miARN d’origine mammifère. Pour nommer et caractériser les
miARN identifiés, le registre miARN de l’Institut Sanger a été établi. La nomenclature actuelle pour les miARN
est reprise ci-dessus et se compose de 4 composants : espèce, forme (précurseur ou mature), numéro
d’identification et origine du miARN. Chaque composant est séparé par des tirets et est représenté par le modèle
suivant : xxx-miR-#-suffixe. Le xxx signifie l’espèce (hsa = humain, mmu = souris). Pour distinguer les formes
précurseurs et matures, le « r » représente la forme précurseur et le « R » la forme mature. Généralement, une
identification numéro est attribuée dans un ordre séquentiel de découverte. Les définitions des suffixes sont
reprises dans le tableau ci-dessus. (D’après Luense, Carletti, et Christenson 2009)

81
 d. Biogénèse

Les miARNs sont transcrits par l’ARN polymérase II (Pol II) sous forme de miARN
primaires (pri-miARNs), formant un transcrit primaire de 1 à 3 kb et contenant des épingles à
cheveux et des séquences flanquantes 5’ et 3’. L’ARN polymérase II assène aux miARNs les
mêmes mécanismes de coiffe et de polyadénylation que ceux d’un ARNm classique.

La biogénèse des miARNs se déroulent en plusieurs étapes :

- Tout d’abord, les pri-miARN sont transformés en épingles à cheveux appelées miARN
précurseurs (pré-miARN), donnant lieu à des précurseurs de 70 à 100 nucléotides. Cette
étape est réalisée par l’enzyme Drosha (RNase de type III nucléaire). Elle interagit avec
une protéine à domaine de liaison à l’ARN, DGCR8 (DiGeorge syndrome critical
region gene 8) (Y. Lee et al. 2003). Ce complexe peut également avoir besoin d’autres
facteurs auxiliaires moins bien compris tels que la box ARN DEAD et les hélicases p68
(aussi connue sous le nom de DDX5) et p72 (aussi connue sous le nom de DDX17).
- Les pré-miARN ainsi formés sont ensuite exportés vers le cytoplasme par interaction
directe avec le récepteur d’exportation : l’exportine 5 (Exp 5). Cela nécessite
l’intervention de son cofacteur protéique : RAN-GTP (V. N. Kim 2004).
- Une fois dans le cytoplasme, le pré-miARN est clivé par un complexe associant Dicer
et TRBP (Tar Binding Protein). Dicer agit de concert avec cette protéine de liaison à
l’ARN et ces deux protéines appartiennent à la famille des DRBP (dsRNA Binding
Protein). Ce complexe enzymatique élimine la structure en boucle et sépare les deux
brins complémentaires de la partie tige (Ketting et al. 2001). Le miARN double brin
produit par Dicer est alors remis à un membre de la famille de protéines Argonaute
(AGO). Il va sélectionner le brin qui deviendra le miARN mature (brin de guidage) et
rejettera l’autre brin (brin passager). Les protéines AGO ayant alors sélectionnées le
miARN se dissocient de Dicer et forment le complexe RISC (V. N. Kim 2005). C’est
ce brin qui va réguler négativement ses ARNm cibles.

82
 Figure 17 : Biogénèse des miARN. Dans la voie de biogénèse canonique du miARN, le pri-miARN est
traité par le microprocesseur DGCR8-Drosha pour générer le pré-miARN. Dans la voie de biogénèse de miARN
non canonique, le pré-miARN est généré à partir de petits miARN introniques, appelés mirtron, par épissage des
spliceosomes. L’exportine 5 transporte le pré-miARN du noyau vers le cytoplasme. Dans le cytoplasme, le pré-
miARN est ensuite traité par Dicer pour générer un duplex miARN/miARN. La protéine Ago forme avec Dicer
et TRBP le complexe RISC. Bien que les deux brins de miARN duplex aient le même potentiel pour être un
miARN fonctionnel, seul le brin guidé reste dans RISC en tant que miARN. (D’après Dai et Ahmed 2011)

Des études récentes ont ré-évalué le rôle de Drosha, Dicer et Exp5 dans la biogénèse
des miARN. L’inactivation de Drosha abolit l’expression des miARN mais le knockout de
Dicer rend détectables de nombreux miARN, ce qui suggère que les miARN peuvent subir une

83
biogénèse par d’autres voies. De même, le knockout de Exp5 n’a qu’une incidence modeste sur
la biogénèse des miARN (Y.-K. Kim, Kim, et Kim 2016). Le processus de biogénèse des
miARN est bien compris mais il semble plus complexe que ce qui était supposé auparavant.

e. Interaction entre le miARN et l’ARNm cible

La reconnaissance de l’ARNm se fait par complémentarité de séquence entre le miARN

et une séquence partiellement complémentaire située généralement dans le 3’-UTR de l’ARNm
cible, appelée MRE (miRNA Response Element ou élément de réponse au miARN).

Il existe 4 types de fixations décrits pour l’interaction entre le miARN et sa cible

(Friedman et al. 2009; Bartel 2009) :

- Les sites canoniques : ils correspondent à une séquence seed classique de 7 à 8 bases.
Ils sont les mieux prédits, les plus conservés et les plus efficaces.
- Les sites marginaux : ils décrivent une séquence seed de 6 bases. Ils sont moins
conservés mais cela reste correct.
- Les sites supplémentaires : ils correspondent en plus de la séquence seed, à une
séquence supplémentaire d’appariement en 3’, qui augmente l’interaction entre le
miARN et sa cible.
- Les sites complémentaires : quand il existe un mésappariement de fixation au niveau de
la séquence seed, il y a un site complémentaire en 3’ qui permet une compensation de
fixation. Ces sites sont les sites les plus minoritaires.

Une richesse en dinucléotides AU (résidu A en position 1 et A ou U en position 9)

améliorerait l’efficacité de l’interaction. De plus, la proximité du site d’interaction avec un
codon STOP, ainsi que la proximité avec les autres sites de liaison du même miARN ou miARN
différents serait importante car une coopération entre les différents sites est observée et permet
une répression efficace de la traduction (Doench et Sharp 2004; Grimson et al. 2007).

84
 f. Action

Les miARN vont réguler l’expression des ARNm en fonction de leur degré de
complémentarité avec ces derniers. Plus le degré de complémentarité entre le miARN et
l’ARNm cible est élevé, plus l’énergie de liaison est importante et permettra alors le
recrutement de ribonucléases pour cliver l’ARNm par l’intermédiaire du complexe RISC. Ce
complexe est composé du miARN et de protéines de la famille Argonaute et GW182 (Glycin-
Tryptophan repeat-containing proteon of 182 kDa). Dans ce complexe, le miARN sert de guide,
il va reconnaitre l’ARNm cible. Les protéines de la famille Ago et GW182 sont les effectrices
de l’inhibition de la répression des ARNm cibles (Fabian et Sonenberg 2012; Valencia-Sanchez
2006). Quand le degré de complémentarité entre le miARN et l’ARNm cible correspondant est
élevé, le complexe miARN-RISC va recruter des ribonucléases, ces dernières vont cliver
l’ARNm. Si le degré de complémentarité est faible, le complexe va agir par répression
traductionnelle.

Les études publiées démontrent que les miARNs peuvent réprimer l’expression
protéique par différentes voies.

i. Dégradation des ARNm par les miARN

La fixation du miARN sur l’ARNm cible peut entrainer une dégradation de l’ARNm
quand la protéine Ago2 interagit avec les protéines GW182 et DCP1/2 (mRNA-decapping
enzyme). Ce mécanisme nécessite l’élimination de la coiffe poly(A) située en 3’ de l’ARNm,
ce qui permettra l’action d’exonucléases et l’élimination complète de l’ARNm. L’ARNm peut
être dégradé soit dans le sens 3’-5’ soit dans le sens 5’-3’ (Behm-Ansmant, Rehwinkel, et
Izaurralde 2006; Fabian, Sonenberg, et Filipowicz 2010; Coller et Parker 2004). On peut alors
observer une diminution de la quantité des transcrits ciblés après surexpression d’un miARN
particulier (Selbach et al. 2008).

85
 ii. Répression de la traduction des ARNm

Les mécanismes de blocage de la traduction par les miARN sont sujets à controverse. Il
n’existe pas d’argument permettant d’affirmer si la répression de la traduction se fait au moment
de l’initiation de la traduction de la protéine ou après l’initiation.

L’inhibition de la traduction pourrait se faire au moment de l’initiation de celle-ci selon

plusieurs modèles mécanistiques. Les mécanismes alors proposés sont :

- l’inhibition de la reconnaissance de la coiffe : il y aurait une compétition entre miRISC

et eIF4E pour l’interaction avec la coiffe 5’ car il y a une analogie entre le domaine Mid
de la protéine Ago2 et eIF4E (Mathonnet et al. 2007).
- une stimulation de la déadénylation de la queue des ARNm : avec cette déadénylation,
PABP-1 ne peuvent plus rendre circulaire l’ARNm (Wakiyama et al. 2007).
- l’inhibition de l’assemblage du complexe ribosomique : miRISC interviendrait en
bloquant l’interaction entre la sous-unité ribosomale 60S et le complexe de pré-initiation
40S (Chendrimada et al. 2007; B. Wang, Yanez, et Novina 2008).

L’inhibition de la traduction pourrait se faire également après l’étape d’initiation. Cette

idée a été confortée par l’observation d’une association des miARN aux polysomes (Huntzinger
et Izaurralde 2011). En effet, en 2006, l’équipe de Petersen (Petersen et al. 2006) a proposé un
modèle de répression par le complexe miRISC. Ils suggèrent que les miARNs induisent une
dissociation prématurée des ARNm des ribosomes. Dans cette étude, le blocage de l’initiation
de la traduction par l’hippuristanol a conduit à une dissociation rapide des ribosomes de façon
miARN-dépendante. Dans ce modèle, on a une inhibition de l’élongation de la traduction.

iii. Activation de la traduction

Certains miARNs peuvent présenter un rôle activateur ou répresseur de la traduction.

Cela va dépendre de l’état de prolifération des cellules. Les miARN auront un rôle répresseur
dans les cellules en prolifération et un rôle activateur pour les cellules en quiescence. Cela est
dépendant de leur positionnement sur l’ARNm cible. Par exemple, le miR10-a qui interagit
avec les séquences 5’UTR des ARNm de certaines sous unités ribosomiques conduit à

86
l’activation de leur expression. Inversement, leur fixation en 3’UTR conduit à la répression
(Vasudevan, Tong, et Steitz 2007).

iv. Résumé

Ce schéma résume les différents modes d’action des miARN.

Figure 18 : Modes d’action des miARN. Dégradation de l’ARNm : le complexe miRISC interagit avec
le complexe déadénylase et favorise la déadénylation de la queue polyA. Cela nécessite l’interaction de la
protéine GW182 avec la protéine PABP. La coiffe 5’ est retirée par le complexe de décoiffage. Blocage de
l’initiation : le complexe miRISC empêche soit la reconnaissance et le recrutement de la sous-unité ribosomale
40S, soit la formation du complexe ribosomal 80S. Blocage post initiation : le complexe miRISC inhibe l’étape
d’élongation de la traduction en induisant le désassemblage du ribosome ou en favorisant la protéolyse du
polypeptide naissant. (D’après Fabian, Sonenberg, et Filipowicz 2010)

87
 g. Rôle des miARNs

La première mise en évidence de l’importance des miARNs a été démontrée dans un

modèle de développement mammifère. Dans un modèle de souris déficientes pour Dicer et
DGCR8, la perte de ces enzymes nécessaires à la biogénèse des miARNs montre une mortalité
embryonnaire (Bernstein et al. 2003; Yangming Wang et al. 2007).

Les miARNs jouent un rôle dans plusieurs processus fondamentaux comme l’apoptose,
le développement neuronal et notamment le remodelage du développement (Somel et al. 2011),
la différenciation cardiaque et musculaire (van Rooij et al. 2009). Des études ont également mis
en évidence le rôle des miARNs dans l’hématopoïèse, notamment dans les neutrophiles,
lymphocytes, érythrocytes et mégakaryocytes (Lu et al. 2008; Z. Chen et al. 2017).

De plus, une dérégulation des miARNs serait impliquée dans le mécanisme d’action de
nombreuses maladies.

Dans de nombreux cas, il y a un lien de causalité entre la progression de la maladie et

la dérégulation des miARNs correspondants.

88
 Tableau 9 : Exemples de miARN avec leurs cibles potentielles et leurs implications dans les
pathologies (D’après Rupaimoole et Slack 2017)

Le tableau précédent reprend quelques exemples de l’implication des miARN dans des
pathologies diverses comme :

- le cancer : De nombreuses études démontrent une altération de miARNs dans de

nombreux types de cancers.
- les maladies du métabolisme : diabète, athérosclérose,…
- les maladies virales : hépatite C,…
- les maladies inflammatoires : Le rôle des miARN dans la PR notamment est plutôt bien
connu maintenant. En outre, les synoviocytes rhumatoïdes expriment constitutivement
miR-155 et 146a, en comparaison avec des FLS d’arthrose et l’expression du miR-155
est augmentée par le TNF-α, l’IL-1β, le LPS, la poly-C (Stanczyk et al. 2011).

89
 Inversement, l’inhibition du miR-155 dans un modèle murin d’arthrose induit par le
collagène aurait un effet anti-inflammatoire par l’inhibition d’expression d’IL-17. Dans
la même idée, l’expression de miR-146a aurait une fonction anti inflammatoire. Sa
surexpression permettrait d’inhiber la destruction osseuse dans ces mêmes modèles
murins (Nakasa et al. 2008). Par contre, à l’heure actuelle, aucune étude n’a montré de
lien entre miARN et inflammation rencontrée dans l’AH.

3. Autres systèmes de contrôle épigénétique : l’acétylation des histones et la

méthylation de l’ADN

Les miARNs, l’acétylation des histones et la méthylation de l’ADN sont des

phénomènes regroupés sous le nom d’épigénétisme. Cela représente l’ensemble des
modifications transmissibles d’une génération à une autre et réversibles de l’expression
génique, sans altération des séquences nucléotidiques.

a. Acétylation des histones

i. Généralités

L’acétylation consiste en l’ajout d’un groupement CH3-C=O sur les résidus lysine en
position N-terminale ou au sein de la chaine polypeptidique. Cette réaction est catalysée par
des acétyltransférases. Cette modification post-traductionnelle va neutraliser la charge positive
et va modifier la taille de la chaine latérale des résidus lysine, entrainant un changement de
conformation des protéines modifiées et du mode d’interaction avec leurs molécules cibles (en
particulier l’ADN qui est chargé négativement).

L’acétylation des histones stimule la transcription de plusieurs manières :

- Elle augmente la compacité de la chromatine.

- Elle diminue la force d’interaction entre les histones et l’ADN.
- Elle crée des sites de fixation pour les complexes d’activation de la transcription.

90
 L’acétylation est contrôlée par deux familles d’enzymes :

- Les histones acétyl transférases ou HATs. Elles sont regroupées en trois familles :
GNAT/PCAF, MYST et P300/CBP
- Les histones désacétylases ou HDACs. Il y en a 4 familles (qui se différencient par leur
structure, leur fonction, leur localisation subcellulaire et leur profil d’expression)
(Haberland et al, 2009) :
▪ La classe 1 : HDACs 1, 2, 3 et 8. Leur localisation est nucléaire.
▪ La classe 2 : HDACs 4, 5, 6, 7, 9 et 10. Leur localisation est nucléaire et
cytoplasmique.
▪ La classe 3 : les Sirtuines 1 à 7
▪ La classe 4 : HDAC11

ii. Implication dans l’AH et la PR

Aucune donnée publiée à ce jour ne montre un rôle de l’acétylation des histones dans la
physiopathologie de l’AH.

Partant du postulat que la physiopathologie de l’AH se rapproche de celle de la PR, il a

été montré que l’acétylation des histones jouerait un rôle dans les mécanismes
physiopathologiques de la PR.

Les FLS rhumatoïdes ne montrent pas d’augmentation significative de l’acétylation,

comparativement aux FLS d’arthrose (Huber et al. 2007). L’utilisation d’un inhibiteur d’HDAC
permet de diminuer l’inflammation synoviale (Nishida et al. 2004). De plus, une équipe a mis
en évidence que l’utilisation d’inhibiteurs d’HDAC permet une diminution de l’expression de
cytokines inflammatoires en réponse au LPS dans des macrophages de tissu synovial de patients
atteints de PR (Grabiec et al. 2010; Sato et Mitchell 2006).

b. Méthylation de l’ADN

i. Généralités

La méthylation de l’ADN se caractérise par l’ajout d’un groupement méthyl CH3 en

position 5 d’une base cytosine et au niveau de motifs appelés « îlots CpG ». Les îlots CpG sont

91
localisés au niveau des régions promotrices de gènes ou à proximité de site d’initiation de la
transcription.

Le degré de méthylation de l’ADN est corrélé à l’inhibition de l’expression génique et

à la répression de chromatine et cela par deux mécanismes :

- Les groupements méthyls ajoutés vont empêcher la fixation sur les promoteurs de
certains facteurs de transcription.
- Le recrutement de protéines inhibitrices de la transcription par une famille de protéines
appelée MBD, interagissant avec les îlots CpG méthylés. Les protéines MBD présentent
un autre rôle, elles vont recruter des histones désacétylases et participer au mécanisme
d’acétylation des histones.

Le mécanisme de méthylation est possible grâce à des enzymes nommées ADN

méthyltransférase (DMNT). Elles sont regroupées en 2 classes : les méthylases de maintenance
et les méthylases de novo permettant la méthylation de sites exempts de toute méthylation.

ii. Implication dans l’AH et la PR

Aucune donnée publiée à ce jour ne montre un rôle de la méthylation de l’ADN dans la

physiopathologie de l’AH.

Partant du postulat que la physiopathologie de l’AH se rapproche de celle de la PR, il a

été montré que la méthylation des histones jouerait un rôle dans les mécanismes
physiopathologiques de la PR. Les FLS de patients atteints de PR présentent un taux de
méthylation plus bas que les FLS de patients atteints d’arthrose (Karouzakis et al. 2009). Une
équipe (Nakano et al. 2013) a confirmé ces résultats en montrant l’existence de plusieurs gènes
hypométhylés. Ces gènes sont impliqués dans la prolifération, l’adhésion et l’inflammation.
L’hypométhylation serait alors liée à l’augmentation de l’expression de ces gènes.

92
OBJECTIFS

93
94
 La physiopathologie de l’arthropathie hémophilique reste à ce jour non complètement
élucidée. Actuellement, le rôle du fer est montré comme étant l’acteur principal dans la
physiopathologie de l’AH ; ce rôle n’est sûrement pas exhaustif. Comme expliqué
précédemment, l’inflammation rencontrée dans l’AH se rapproche de celle rencontrée dans la
PR ; à la différence que dans l’AH, le sang est en contact direct avec les FLS. Cette répétition
de sang dans l’articulation pourrait engendrer des modifications vis-à-vis de ces cellules.

L’hypothèse de travail est de démontrer que le sang pourrait induire des

modifications dans les cellules résidentes qui sont les FLS et que certains éléments du sang,
comme les facteurs de la coagulation, pourraient avoir un effet modulateur sur
l’inflammation dans un modèle d’AH.

Deux axes d’étude ont ainsi été menés.

Premièrement, j’ai étudié la réponse des FLS vis-à-vis de cette présence de sang.

Le rôle exact des FLS dans la physiopathologie de l’AH est à ce jour inconnu mais il
apparait comme étant central. Il a été démontré que les FLS dans la PR sont au carrefour entre
immunité innée et adaptative. Ils synthétisent des cytokines inflammatoires et coopèrent avec
les lymphocytes et les macrophages. Du fait de leur grand potentiel de prolifération, ces cellules
sont impliquées dans la prolifération synoviale et perpétuent l’inflammation, ce qui contribue
aux dommages articulaires. Il a été démontré que certains FLS dans la PR sont contrôlés par
des mécanismes d’épigénétisme et en particulier par des micro ARN. Notamment, il a été
montré que les FLS, en réponse au LPS, ne sécrétaient pas d’IL-18 ni de TNF-α, qui sont
pourtant des cytokines majeures dans le processus pathologique de la PR (Zeisel et al. 2004). Il
ne s’agit pas d’un défaut de transcription mais d’un mécanisme d’instabilité de l’ARNm.

En se basant sur les données déjà publiées dans la PR, je me suis particulièrement
intéressée à la signature épigénétique des FLS d’AH, en comparaison avec des FLS sains ou
des FLS de PR.

Deuxièmement, j’ai étudié l’effet des facteurs de la coagulation et en particulier du

FVIII sur l’inflammation. Le plasma des patients hémophiles pourrait avoir un impact sur
l’inflammation intra articulaire, du fait de l’absence en facteur de la coagulation. Il a été
démontré dans d’autres modèles de pathologies, que le déficit en facteurs de la coagulation
pourrait avoir des effets sur l’inflammation. De plus, comme vu précédemment, il a été établi

95
que le FVIII pouvait avoir un ou plusieurs fonctions en dehors de son rôle premier qui lui est
attribué, celui de la coagulation. Cependant, aucune étude publiée ce jour n’a démontré de lien
entre FVIII et inflammation. En se basant sur ce contexte, je me suis intéressée à cette
interaction potentielle. Pour cela, j’ai utilisé des modèles de cultures cellulaires différents en
les mettant en contact avec du FVIII et je me suis plus particulièrement intéressée à son effet
sur certaines voies de signalisation, comme la voie du NF-κB.

96
RESULTATS

97
98
TRAVAUX 1

99
 TRAVAUX 1

Signature inflammatoire unique dans l’arthropathie hémophilique : changements

épigénétiques dus à l’interaction entre le sang et les fibroblastes-like synoviocytes

Sandra Mignot1, PhD; Nicolas Cagnard2, PhD; Justine Siavellis1, MD, PhD; Benoit Albaud3,
PhD; Chantal Rothschild4,MD; Cécile Bally4, MD; Julien Even5,MD; Olivier
Hermine1,4,6,PU-PH, PhD ; Laurent Frenzel1,4,6,MD, PhD

1
Laboratory of Cellular and Molecular Mechanisms of Hematological Disorders and Therapeutical
Implications, Paris Descartes – Sorbonne Paris Cité University, Labex GR-Ex, Imagine Institute, Inserm
U1163

2
Bioinformatics Platform – Institut IMAGINE, Paris, France

3
Genomic Platform – Institut CURIE, Paris, France

4
Hematology unit care – hemophilia Center – Necker Hospital, 149, rue de Sèvres, 75015 Paris France

5
Orthopedic surgery – Cochin Hospital, Paris, France

6
Faculté de médecine Paris-Descartes, Paris, France

Une des complications majeures de l’hémophilie est l’apparition d’hémarthrose. Une

hémarthrose est un épanchement de sang au niveau d’une articulation et une succession sur la
même articulation (que l’on appelle articulation cible) engendre un phénomène nommée
arthropathie hémophilique (AH) qui va détruire progressivement le cartilage. De nombreuses
données suggèrent que l’AH partage une pathogénicité similaire avec la polyarthrite rhumatoïde
(PR). Cependant, dans l’AH, les FLS sont en contact direct avec le sang. De ce fait, nous avons
émis l’hypothèse que les FLS de patients AH (HA-FLS) pouvaient présenter une signature
inflammatoire unique à cause de leur contact avec le sang.

Au cours de ce premier travail, j’ai tout d’abord mis au point la technique d’extraction
et de culture des FLS à partir d’une membrane synoviale. Cette technique était nouvelle au
laboratoire. Après avoir vérifié que les FLS de patients AH présentaient un phénotype similaire
aux FLS de patients non-AH ou aux FLS de PR, nous avons pu montrer après stimulation par
du LPS, que les FLS de patients AH ont une sécrétion cytokinique différente des FLS de patients
non AH (non-HA-FLS) et ont un profil cytokinique qui se rapproche de celui des FLS de PR
(RA-FLS).

100
 Des études précédentes ont montré dans la PR que l’expression de certaines cytokines
était régulée par un mécanisme d’épigénétisme qui est le microARN. Le profil cytokinique des
FLS de patients AH se rapprochant de celui des FLS de PR, nous avons montré qu’il y avait
une instabilité de l’ARNm de ces cytokines et plus précisément par l’intervention des
microARN. Nous avons démontré cela diminuant l’expression de DICER. De ce fait, nous
avons réalisé un miRNOME en comparant des FLS de patients AH avec des FLS de patients
non AH et nous avons pu mettre en évidence des différences dans 30 miRNAs, ces derniers
étant impliqués dans des voies de signalisation de l’inflammation ou bien encore dans certaines
maladies inflammatoires (entre autre, nous avons retrouvé 2 miRNAs impliqués dans la
physiopathologie de la PR). En réalisant le réseau transcriptiome, nous avons pu montrer que
dans la condition « activation par le LPS », ce sont les processus protéiques et inflammatoires
qui sont impactés ; alors que dans la condition « sans activation », ce sont les processus de
vascularisation et de modulation ostéoarticulaires.

Ce travail démontre que la présence de sang en contact direct avec les FLS induit des
changements épigénétiques durables et participant vraisembablement à la pathophysiologie de
l’AH. Ce travail pourrait supporter l’hypothèse du « zéro saignement ». Des thérapies ciblant
ces cytokines inflammatoires semblent être intéressantes à développer.

Les résultats obtenus ont fait l’objet d’une soumission dans Haematologica (décembre
2019) et ont été présentés en poster à l’ASH (2017 – Orlando) et lors de communications orales
à la SFH (2018 – Paris) et à l’EAHAD (2019 – Prague).

101
 Unique inflammatory signature in hemophilic arthropathy: epigenetic changes due to
interaction between blood and fibroblast-like synoviocytes

Sandra Mignot1,PhD; Nicolas Cagnard2,PhD; Justine Siavellis1, MD; Benoit Albaud3,PhD;Chantal

Rothschild4,MD; Cécile Bally4, MD; Julien Even5,MD; Olivier Hermine1,4,6,MD, PhD, Laurent
Frenzel1,4,6,MD, PhD

1
Laboratory of Cellular and Molecular Mechanisms of Hematological Disorders and Therapeutical
Implications, Paris Descartes – Sorbonne Paris Cité University, Labex GR-Ex, Imagine Institute,
Inserm U1163

2
Bioinformatics Platform – Institut IMAGINE, Paris, France

3
Genomic Platform – Institut CURIE, Paris, France

4
Hematology unit care – hemophilia Center – Necker Hospital, 149, rue de Sèvres, 75015 Paris
France
5
Orthopedic surgery – Cochin Hospital, Paris, France

6
Faculté de médecine Paris-Descartes, Paris, France

Corresponding author: Laurent Frenzel, Physiopathology of hemophilic arthropathy.

Institut IMAGINE - INSERM U 1163 / CNRS ERL 8254 24 Paris, France , Hematology
Department of Adult hematology – hemophilia Center – Necker Hospital, 149 rue de
Sèvres 75015 Paris, France. Phone: +33(0)144425292 / Fax: +33 (1)1 44495290; Email:
laurent.frenzel@aphp.fr

102
Abstract

Objectives: In hemophilia, the recurrence of hemarthrosis leads to irreversible arthropathy

termed hemophilic arthropathy (HA), with a progressive destruction of the joint. Some data
suggest that HA and rheumatoid arthritis (RA) share a similar pathogenicity. However, HA is
a unique form of arthropathy in which resident cells, such as fibroblast-like synoviocytes (FLS),
come into direct contact with blood. Therefore, we hypothesized that FLS in HA could have a
unique inflammatory signature as a consequence of their contact with blood.

Materials and Methods: Human FLS were isolated from the synovial tissues of HA and non-
HA patients.

Results: We demonstrated with ELISA and ELISPOT analyses that HA-FLS expressed a unique
profile of cytokine secretion, which differed from that of non-HA-FLS, mainly consisting of
cytokines involved in innate immunity. We showed that unstable cytokine mRNAs were
involved in this process, especially through miRNA complexes as confirmed by DICER
silencing. A miRNOME analysis revealed that 30 miRNAs were expressed differently between
HA and non-HA-FLS, with most miRNAs involved in inflammatory control pathways or
described in certain inflammatory diseases, such as RA or lupus. After chronic exposure of
plasma with normal FLS, we observed the same miRNA signature. Analysis of transcriptomic
networks, impacted by these miRNAs, revealed that protein processes and inflammatory
pathways were particularly targeted in LPS-induced FLS, and in particular vascularization and
osteoarticular modulation pathways in steady-state FLS.

Conclusion: Our study demonstrates that the presence of blood in contact with FLS may induce
durable epigenetic changes that likely participate in HA pathophysiology

103
 INTRODUCTION

Hemophilia is an X-linked bleeding disease caused by a partial or complete deficiency

of coagulation factor VIII or IX1. Bleeding mainly occurs in large joints, such as the knee,
elbow, or ankle, as a result of inadequate thrombin generation due to the lack of a clotting
factor2.

Recurring hemarthrosis leads to an irreversible arthropathy, termed hemophilic

arthropathy (HA), characterized by a progressively complete destruction of the joint with
permanent pain, musculoskeletal disability, and poor quality of life. Although prophylactic
treatment with a clotting factor versus episodic infusion has demonstrated superiority in
preventing joint disease3, HA remains a significant comorbidity of the hemophilic patient.

Indeed, the pathophysiology of blood-induced joint disease remains unclear. Some data
suggest that the pathobiology of HA may be similar to the pathogenicity of rheumatoid arthritis
(RA), given that chronic proliferative synovitis and cartilage destruction are present in both4.
Moreover, metalloprotease enzymes, inflammatory cells, and inflammatory cytokines, such as
interleukin-1 (IL-1) or tumor necrosis factor alpha (TNF-α), have been found in the synovium
of HA as would be expected in RA5. One of the main difference between the two diseases is
the origin of inflammation: autoimmunity in RA and blood injury in HA. Synovial iron
deposition as a result of blood in the joint is considered the main component in triggering and
sustaining the inflammatory response and cell proliferation within the synovial membrane 6.
Thus, synovial macrophages from blood injury promote the inflammatory pathway of
hemarthrosis and HA. However, these elements alone cannot explain the entire
pathophysiology of HA. Indeed, in hemochromatosis, another arthropathy characterized by
synovial iron deposition, there is no evidence of significant synovial hyperplasia, though
inflammatory cells and articular destruction have been observed7. If we focus on the main
difference between these two forms of arthritis, the only element found purely in HA is the
presence of blood in the joint in direct contact with the synovial membrane, and, particularly,
with the unique resident cells in joints, the fibroblast-like synoviocytes (FLS).

The exact role of FLS in HA pathophysiology is still unknown, but assumed to be

central. As widely demonstrated in RA, FLS straddles the boundary between innate and
adaptive immunity, given that they synthesize inflammatory cytokines whilst cooperating with
lymphocytes and macrophages8-9. Owing to their high proliferation rate in HA, these cells are
directly involved in synovial proliferation and perpetuate inflammation, thereby contributing

104
to cartilage damage. Due to this proliferative activity, the apoptotic pathway is disrupted to the
advantage of anti-apoptotic activity. C-MYC and Mdm2, two of the main pro-mitotic factors,
are overexpressed in the FLS of HA10-11. The use of an agonistic anti-human Fas monoclonal
antibody can induce FLS apoptosis in HA and reduce inflammatory cytokine production,
thereby abolishing synovial hypertrophy12.

We hypothesized that, in hemophilia, chronic interaction between blood and FLS in the
joint leads to a unique cytokine signature due to acquired and lasted changes, explaining its
inflammatory and proliferative characters. First, from the synovium of patients who underwent
orthopedic surgery, we isolated pure HA-FLS versus non-HA-FLS. Following stimulation, the
expression pattern of cytokines from HA-FLS completely differed from that from non-HA-
FLS, mainly reflected by messenger RNA (mRNA) instability and micro RNA (miRNA)
interaction. A miRNA microarray assay showed HA as possessing a unique signature closer to
the miRNA of patients with chronic inflammatory diseases, such as RA, than other forms of
arthritis.

Our data demonstrated that blood could induce durable epigenetic changes in resident
cells due to pathological interactions.

MATERIALS AND METHODS

Cell culture

Human Fibroblast-like synoviocytes (FLS) were isolated from the synovial tissues of
five different HA patients (3 patients with severe hemophilia A, 1 patient with severe
hemophilia B and 1 patient with type 3 of von Willebrand disease) and three non-HA patients
(1 patient with articular disruption of neurological origin, 1 patient with nodular villous
synovitis and 1 patient with osteoarthritis) during knee, ankle or hip joint arthroscopic
synovectomy, as previously described13, after informed consent had been obtained from
patients.

For miRNOMe analysis, in the group HA-FLS with 3 selected patients, one had a
diagnosis of severe hemophilia A (34 years old man, synovial hypertrophy of right ankle), one
severe hemophilia B (25 years old man, large synovial hypertrophy of left knee), and one Type
3 of von Willebrand disease (22 years old man, synovial hypertrophy of right ankle) presenting

105
a very close clinical phenotype to that of severe hemophilia A with a hemophilic arthropathy.
In the non-HA-FLS group with 2 selected patients, one required synovectomy due to articular
disruption of neurological origin (18 years old man, left hip) and the other due to nodular villous
synovitis (29 years old man, right knee).

Experiments were performed between passages 3 and 9. During that time, cultures
comprised a homogeneous population of fibroblastic cells.

Regular Human Fibroblast-Like Synoviocytes (HR-FLS) and Rheumatoid Arthritis Fibroblast-

like synovoviocytes (RA-FLS) (408-05a, 408RA-05a, Cell Applications, San Diego, US) were
cultured like human FLS. THP-1 cells (88081201, European Collection of Authenticated Cell
Cultures, Salisbury, UK) were cultured, as described previously14-15.

RNA extraction, labeling and miRNA expression profiling analysis

Total RNA was extracted using the supplementary protocol by purifying total RNA
containing miRNA from animal cells using the RNeasy Plus Mini Kit. The GeneChip miRNA
4.0 Array (Affymetrix) was applied for miRNA expression profile analysis. This chip contains
30,424 probe sets, including 2,578 mature human miRNA sets. After total RNA quality had
been inspected, the total RNA of each sample was tailed with poly A and labeled with biotin
using the FlashTag Biotin HSR RNA Labeling Kit (Affymetrix), according to the
manufacturer’s instructions. The hybridization of the bio-labeled RNA samples was performed
according to the manufacturer’s instructions for the Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 Array
with the GeneChip Hybridization Wash and Stain Kit and GeneChip Hybridization Oven 645
(both from Affymetrix). After washing and staining using the GeneChip Fluidics Station 450,
the arrays were scanned by means of the GeneChip Scanner 3000 (both from Affymetrix).

Fluorescence data were imported into the Affymetrix Expression Console and R
Bioconductor. Gene expression levels were calculated using the Expression Console’s RMA
DABG algorithm. Comparisons between groups were performed using Student’s t-test. To
estimate the false discovery rate, we filtered the resulting p-values at 5%. Cluster analysis was
performed by hierarchical clustering using the Spearman correlation similarity measure and
average linkage algorithm.

Data were available on web Array Express, with the number : E-MATB-7442.

106
 Model of onset hemophilic arthropathy after repeated contact between plasma and
normal HR-FLS.

Regular Human Fibroblast-Like Synoviocytes (HR-FLS) were contacted with plasma

repetedly for 3 weeks. Briefly, HR-FLS were inoculated in flask and the next day, a ratio of
50% plasma/50% medium is used for cell culture. Every 3 days, the exposure with fresh
plasma with the same ratio is renewed. After 3 weeks, HR-FLS (5.105 cells) were stimulated
with 1 mL of either medium alone or medium containing LPS for 6 hours. Total RNA was
extracted following the instructions below. miRNA specific primers were obtained from
Qiagen.

RESULTS

HA-FLS and non-HA-FLS are solely composed of a pure homogenous fibroblastic

population.

As only little data described the use of human FLS from hemophilic patients is available,
we first verified that cell cultures of HA and non-HA-FLS were composed of pure fibroblastic
cell populations. A study of cell surface expression, using flow cytometry, revealed that HA-
FLS (Figure S1A), non-HA-FLS (Figure S1B), RA-FLS (Figure S1C), and HR-FLS (Figure
S1D) exhibited similar cell surface markers (CD45, CD55, CD68, CD90, CD106), completely
differing from the THP-1 cell line (Figure 1E)15.

An unique release of inflammatory cytokines in HA-FLS.

To examine the FLS expression profile, we first performed an ELISPOT of 105

cytokines, comparing activated and non-activated cell supernatants from HA and non-HA-FLS
(Figure 1). Concerning all of the cytokines analyzed, we demonstrated significant variations
between non-HA-FLS and HA-FLS under steady-state condition (without LPS activation
[Medium]), particularly in the expression of MIF, DDPIV, and Emmprin, heavily involved in
the control of inflammation (Table 1). As TLR4 lead to a strong activation of NF-B pathways,

107
we proposed to use a ligand of TLR4 as lipopolysaccharide (LPS). Between non-HA-FLS and
HA-FLS after LPS activation from Salmonella abortus equi (1µg/mL), we found significant
variations in 13 expressed cytokines, mostly involved in the control of innate immunity and
macrophage maturation (IL-1α, MCP-1, M-CSF, MIF, and MIP-3α), but also in adaptive
immunity process (IFN-γ, IL-5, and IL-22), angiogenesis (Thrombospondin 1, Pentraxin 3),
bone remodeling (osteopontin and vitamine D BP) and iron metabolism (TfR) (Table1).

Given that innate immunity cytokines appeared particularly dysregulated, in an effort to

confirm the inflammatory signature of HA-FLS, we focused on the cytokine expression of three
pro-inflammatory proteins (IL-1, IL-6, and TNF-α) after 6 hours of activation with LPS.
Activated cell supernatants were analyzed by means of ELISA. Although LPS stimulation
induced IL-6 secretion in all cell cultures (Figure 2), activated HA-FLS (Figure 2A) did not
release any detectable amount of IL-1 in cell culture supernatants in a similar manner than
RA-FLS (Figure 2C), whereas non-HA-FLS (Figure 2B), HR-FLS (Figure 2D), and THP-1 cell
lines (Figure 2E) did release significant detectable amounts of IL-1. As previously described,
no TNF-α expression was found after LPS stimulation in any of the fibroblast subtypes, as
compared to the THP-1 cell line (Figure 2E)16.

Inflammatory cytokine synthesis is repressed post-transcriptionally by a miRNA-

dependent pathway in LPS-activated HA-FLS.

To determine the mechanism underlying the regulation of inflammatory cytokine

expression in activated HA-FLS, we investigated the effect of LPS treatment on IL-1 and IL-
6 mRNA accumulation in HA, non-HA, RA, as well as HR-FLS. RT-qPCR was performed with
RNA isolated from FLS that either had or had not been activated with 1µg/mL LPS for 6 hours.
No constitutive expression of either IL-1 or IL-6 was detected in all FLS subtypes, whereas
LPS treatment of HA-FLS (Figure 3A), non-HA-FLS (Figure 3B), RA-FLS (Figure 3C), as
well as HR-FLS (Figure 3D) resulted in a detectable accumulation of each mRNA within 6
hours. A similar expression of each mRNA was found between HA and non-HA-FLS.

To investigate the mechanism responsible for the lack of IL-1 protein synthesis in LPS-
activated HA-FLS and RA-FLS, as compared to non-HA-FLS and HR-FLS, cells were
incubated with LPS for 6 hours, and then for another 2 hours, with 5µg/mL actinomycin D.

108
After 2 hours of actinomycin D treatment, IL-1 mRNA decreased drastically in both LPS-
activated HA-FLS (Figure 3A) and LPS-activated RA-FLS (Figure 3C), yet neither in LPS-
activated non-HA-FLS (Figure 3B) nor HR-FLS (Figure 3D). The expression of IL-6 mRNA
was not significantly impacted after actinomycin D treatment in any activated FLS. These
results indicate that de novo synthesized IL-1 mRNA is particularly unstable in both LPS-
activated HA-FLS and RA-FLS.

Therefore, to demonstrate the role of miRNAs in the mRNA instability of HA-FLS, we

proceeded to transfect FLS with siRNA targeting human DICER (siRNA-DICER). After 24
hours of siRNA-DICER or negative control transfection at 50nM, FLS were first activated with
LPS for 6 hours and then for another 2 hours with actinomycin D. The efficacy of DICER
silencing was confirmed using RT-qPCR of DICER mRNA. After siRNA-DICER transfection
into HA-FLS (Figure 3A), non-HA-FLS (Figure 3B), RA-FLS (Figure 3C), and HR-FLS
(Figure 3D), DICER mRNA expression was drastically downregulated compared to control
transfection. Moreover, following actinomycin D treatment, siRNA-DICER transfection
restored IL-1 mRNA expression in LPS-induced FLS in both HA-FLS (Figure 3A) and RA-
FLS (Figure 3C).

Microarray analysis of miRNA profile of HA-FLS shows a single miRNA signature

close to that of inflammatory arthritis and diseases.

As miRNAs was likely involved in the post-transcriptional control of inflammatory

cytokines in HA-FLS, we analyzed the global expression profile of miRNAs using a
microarray-based approach after exposing HA and non-HA-FLS to LPS or medium in an effort
to identify miRNAs. FLS were stimulated with LPS (1µg/mL) or medium for 6 hours, with the
extracted RNAs compared using a DNA microarray containing 2,578 probes complementary to
miRNAs of human origin. HA-FLS were collected from patients with hemophilia A,
hemophilia B, and Type 3 von Willebrand disease to be independent of the potential impact of
the constitutive genetic mutation. We also extracted RNA from FLS at three different passages
so that any variation in miRNA expression levels would not be influenced by culture conditions.

According to the miRNA microarray results from the FLS, we found that more than a
thousand miRNAs were differentially expressed in all HA-FLS and non-HA-FLS (P50, p0.05,
f1.2) (Figure S2). We then focused on differences in miRNA expression levels between HA-

109
FLS and non-HA-FLS. As a result, 14 miRNAs in the steady-state condition with medium
control (Table 2) were revealed to display significantly different expression levels, as did 16
different miRNAs after LPS stimulation (Table 3). Most of these 30 miRNAs could potentially
target mRNAs involved in inflammatory processes directly or indirectly, such as
proinflammatory cytokines (IL-1α, IL-6, TNF-α, etc.) or specific signaling pathways (IRAK1,
MAP kinases, etc.).

Interestingly, some of these miRNAs, such as miR-146-5p17-18, miR-204-3p19, miR-

130b-3p20, miR-25-3p21, miR-10b-5p22, miR-221-5p23, miR-428424, and miR-3942-5p53, have
previously been described as being involved in regulating inflammation in RA, Sjögren’s
syndrome, lupus, familial Mediterranean fever, ankylosing spondylitis, as well as Crohn’s
disease. Others have been described as playing a major role in inflammatory control, such as
miR-124626-27 in macrophage polarization, miR-585-5p28 in oxidative stress through PARP1,
miR-34-3p29-30 in fibroblast proliferation and TNF- expression, miR-196b-5p31 in
SOCS3/STAT3 activation, miR-146b-5p in IL-1α/IL-6/IL-8 control through the TLR4
pathway32-33, and miR-22434 through the PTEN pathway. Many of these have been reported to
play a role the pathogenesis of solid and hematologic tumors. However, some of these miRNAs
have not yet been described in any disease or process, such as miR-6511b-5p and miR-4801.

Correlation between acquired miRNA profile in HA-FLS and repeated plasma

exposure.

To demonstrate that epigenetic changes are due to a chronic contact of blood with FLS,
we propose to use an in vitro model of onset hemophilic arthropathy after repeated contact
between plasma and normal HR-FLS.

We first selected 11miRNAs mostly impacted on the miRNome; respectively 6 miRNAs

in LPS condition and 5 miRNAs in steady-state condition. MiR RT-qPCR was initially carried
out in HA and non-HA-FLS, confirming the same variations as observed in the MiRNome
analyse, in the expression ratio of these 11 miRNAs in FLS activated by either medium (Figure
4A) or LPS (Figure 4B).

We also compared expression of these 11 miRNA after 3 weeks of repeated exposure of normal
HR-FLS by plasma or medium. We observed the same variations between plasma exposed

110
versus non-exposed HR-FLS that HA versus non-HA-FLS, after medium activation (Figure
4A) or LPS (Figure 4B).

Transcriptomic network potentially impacted by miRNA expression in HA-FLS:

From inflammatory to ubiquitous changes.

To further investigate the potential impact of epigenetic changes in FLS following chronic
interaction with blood, we performed a computer analysis pertaining to the targets of previous
11 miRNAs selected. As each miRNA is likely to possess several hundred mRNA targets, we
focused on mRNAs potentially interacting with at least three of the 11 selected miRNAs.

Under steady-state condition without LPS activation, we found that 29 mRNAs could be
targeted (Figure 5A). Some of these mRNAs are known to be highly involved in controlling
gene transcription and post-transcriptional regulation, and other to transmembrane protein
control or metabolism changes. However, some miRNAs are known to play a specific role in
osteocartilaginous changes and bone remodeling (FZD3, HOXC8 and SLC10A7) and others
are involved in inflammatory process (ADGRB3, KLRF1, GDNF, IL2 and TNF-α).

Upon LPS activation, we detected that 55 mRNAs could be targeted by three or more
selected miRNAs (Figure 5B). As in steady-state condition, these mRNAs are known to be
particularly involved in protein trafficking, processing, and destruction, as well as inflammatory
pathways. These mRNAs are highly involved in controlling gene transcription and post-
transcriptional regulation, while playing a specific role in angiogenesis and osteocartilaginous
changes.

DISCUSSION

In this study, we demonstrate that episodic blood interaction is likely to induce durable
epigenetic changes in specific resident cells that do not normally interact directly with blood.
In hemophilia, hemarthrosis is the most common complication affecting hemophilic patients,
and repeated intraarticular bleeds lead to progressive joint destruction35. The resident joint cells,
namely the FLS, are repeatedly exposed to blood during flare-ups of hemarthrosis. HA is a
unique form of arthritis characterized by a repeated interaction between blood and FLS.

111
Currently, there are two theories that are not exclusive, as for the nature and type of this arthritis.
On the one hand, HA may result from a mechanical process much like osteoarthritis with little
involvement of inflammation. On the other hand, HA may be envisioned as an inflammatory
process underlying HA similar to that of RA36-38. Our results provide evidence for the second
hypothesis.

Given that so far little data on the use of primary FLS from hemophilic patients are
available, we have first characterized FLS and shown that they were entirely composed of
synoviocytes. The results of flow cytometry confirmed that the primary FLS exhibited exactly
the same profile than the FLS cell line, with no marker of cells of other origin found, in
particular no macrophages (Figure S1). Therefore, the cytokines, mRNAs, and epigenetic
changes observed solely involved FLS.

Cytokine expression profile using ELISPOT analysis between HA-FLS and non-HA-
FLS, either activated or not by LPS, seems to be in line with the inflammatory theory (Figure
1 and Table 1). Cytokines involved in innate immunity were particularly impacted by the
expression difference between non-HA and HA-FLS. We also noticed that HA-FLS were likely
to participate in the bone remodeling process and iron recycling, which confirms the central
role of FLS in the control of hemophilic arthropathy physiopathology. We then observed that
HA-FLS and RA-FLS did not secrete IL-1α after LPS treatment, whereas, in non-HA-FLS,
THP-1 cell lines and HR-FLS IL-1α were detected in supernatants (Figure 2). The reasons for
this paradoxical downregulation of IL-1α in LPS-induced HA-FLS and RA-FLS are unknown,
whereas IL-1’s role in the pathogenesis of HA has been clearly demonstrated39. Indeed, when
activated by erythrocyte phagocytosis, monocytes and macrophages were reported to produce
IL-1 and TNF-α in the joint after hemarthrosis, which could explain the control of FLS
expression by a negative feedback pathway of IL-1 but this hypothesis needs to be confirmed.
Following LPS activation of FLS in RA, non-expression of TNF-α has been reported due to
epigenetic regulation18. Of note is that TNF-α is likewise key to inflammation in HA, as recently
published with regard to the role of the iRhom2/ADAM17/TNF-α pathway40 and also as a
crucial mediator of proliferative synovitis in hemophilia A41.

In contrast to TNF-α and IL-1, we did observe high IL-6 expression levels after LPS
treatment in HA-FLS, in line with previous data that demonstrated the utility of targeting IL-6
in HA42. Interestingly, the cytokine profile of LPS-induced HA-FLS mostly correlated with the
potential post-transcriptomic control of the 30 miRNAs selected (Figure 1 and Table 3). After

112
LPS activation, we observed that HA-FLS upregulated the expression of cytokines involved in
macrophage polarization (also control by miR-1246) and modulated the TH17 pathway (miR-
10b-5p) involved in ankylosing spondylitis. Moreover, most of the other miRNAs may
influence inflammatory cytokine expression directly or indirectly, for instance through the
NFkB, PI3K, or JAK/STAT pathways (miR-146 and miR-196b-5p, the miRNAs with the
highest expression ratios).

We confirm that the FLS cytokine profile was influenced by mRNA instability,
especially in HA-FLS after actinomycin D treatment (Figure 3). However, there is more than
one process involved in mRNA stability, particularly the 5’ and 3’ UTR mRNA regulation
region with RNA-binding proteins or miRNA complexes. To demonstrate that miRNAs were
primarily involved in mRNA instability in HA-FLS, we decided to silence DICER, an essential
enzymatic step for miRNA maturation. Following siRNA DICER transfection, LPS-induced
HA-FLS did not exhibit proinflammatory mRNA instability after actinomycin D treatment
(Figure 3A). The transcriptomic network of the selected miRNAs in LPS-induced HA-FLS
revealed the inflammatory process and protein synthesis to be severely impacted (Figure 5B
and Table 3). Moreover, on analyzing the transcriptomic network of the selected miRNAs in
steady-state HA-FLS without LPS activation, we observed that pathways involved in
angiogenesis, osteocartilaginous changes and inflammatory control process were impacted
without any stimulation (Table 2 and Figure 5A).

To confirm that repeated hemarthrosis could induced those epigenetic changes into
articular resident cells, we proposed to create an in vitro model of hemophilic arthropathy with
normal HR-FLS repeatedly exposed to plasma every 3 days for 3 weeks. We observed that
selected miRNAs acquired the same expression patterns as the HA-FLS, in medium and LPS
conditions (Figures 4A et 4B). It would also be interesting to determine the “plasma free time”
needed for the plasma exposed HR-FLS to restore the same miRNA profile than non exposed.
However, FLS culture conditions and passages induce major limiting factors to perform this
experiment. Indeed, in this model, we used normal plasma samples with the same volume and
duration of exposure. In a clinical point of view, when a hemophilic patient present intra-
articular bleeding, blood in contact with the synovial membrane could have a variable volume
and duration of exposure, with the presence of blood cells and different concentration of
proteins especially coagulation factors. These elements could also modulate FLS signature after
blood exposure and this could be an explanation of variability of joint damage and degree of
hemophilic arthropathy between each patient.

113
 These findings confirm the clinical theory that just a few repeated episodes of
hemarthrosis are sufficient to cause irreversible changes in the joint, while triggering the
process of progressive articular degradation. Targeting the goal of “very few or no bleeds” in
hemophilic patients is therefore justified, primarily designed to avoid these irreversible
epigenetic changes in synoviocytes. Recently, some data demonstrated that other triggers than
classical FVIII or FIX concentrates could protect hemophilic patients from joint bleeding, such
as thrombin-activatable fibrinolysis inhibitors or TAFI, which underscores the relevance of clot
protection in addition to clot formation43. Different prohemostatic strategies must thus be
considered in an effort to avoid definite hemophilia joint bleeding.

It could be interesting to extend this concept of interaction between blood and cells to other cell
types, which, under normal conditions, do not interact with blood, such as neuronal and
microglial cells following repeated intracranial bleeds in certain sports (boxing, American
football etc.).

In conclusion, these findings demonstrate that resident cells in the joints of hemophilic
patients develop a unique proinflammatory pattern, close to rheumatoid arthritis, due to durable
epigenetic changes owing to repeated episodes of hemarthrosis.

114
Authorship Contributions

S.M., J.S., and L.F. contributed to the performance of the experiments.

S.M., L.F., C.R., O.H., C.B., and N.C. contributed to the analysis of data.

S.M., L.F., C.R., C.B., and O.H. contributed to the design of the study and the writing of the
manuscript.

B.A. contributed to the microarray assay and J.E. to the human synovial extraction.

Acknowledgments

This study was supported by the Investigator-Initiated Research Grant from Baxalta US Inc.,
now part of Shire, Bannockburn, IL, USA.

Conflict of interest statement

None of the authors have any conflicts of interest to disclose, relating to this study.

115
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118
FIGURES :

Figure 1 : Differences in cytokine expression between HA-FLS and non-HA-FLS. Cells

(HA-FLS and non-HA-FLS) are activated with LPS (1µg/mL) for 6h. Cytokines releases were
determined by Cytokine Array (The release of 105 cytokines was studied) in culture
supernatants. We compared non-HA-FLS (3 patients) versus HA-FLS (5 patients) in two
conditions : medium or LPS. The cytokine differences were classified according to their
expression : 1 represents the highest expression and < 0.1 means that the cytokine is not released
by the cells. HA-FLS : FLS of hemophilic patients ; non-HA-FLS : FLS of non hemophilic
patients ; LPS : lipopolysaccharide ; BAFF : B-cell activating factor ; BDNF : brain-derived
neurotrophic factor ; CD- : cluster of differentiation ; DPPIV : dipeptidyl peptidase ; EGF :
epidermal growth factor ; ENA- : epithelial neutrophil-activating protein ; FGF : fibroblast
growth factor ; G-CSF : granulocyte-colony stimulating factor ; GDF : growth differentiation
factor ; GM-CSF : granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ; GRO : growth-

119
regulated oncogene ; HGF : hepatocyte growth factor ; ICAM- : intercellular adhesion molecule
; IFN- : interferon ; IGFBP- : insulin-like growth factor-binding protein ; IL- : interleukin ; IP-
: interferon-inducible protein ; I-TAC : interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant ; LIF
: leukemia inhibitory factor ; MCP- : monocyte chemoattractant protein ; M-CSF : monocyte
colony-stimulating factor ; MIF : macrophage migration inhibitory factor ; MIG : monokine
induced by gamma interferon ; MIP- : macrophage inflammatory protein ; MMP- : matrix
metallopeptidase ; PDGF- : platelet-derived growth factor ; PF- : platelet factor ; RAGE :
receptor for advanced glycation end products ; RANTES : regulated on activation, normal T
cell expressed and secreted ; RBP- : retinol-binding protein ; SDF- : stromal cell-derived factor
; SHBG : sex hormone-binding globulin ; TARC : thymus and activation regulated chemokine
; TFF- : trefoil factor ; TGF- : transforming growth factor ; TNF-α : tumor necrosis factor ;
uPAR : urokinase receptor ; VEGF : vascular endothelial growth factor ; TIM- ; T-cell
immunoglobulin and mucin-domain containing- ; VCAM- : vascular cell adhesion molecule

120
Figure 2 : LPS induced a unique release of inflammatory cytokines in HA-FLS, with in
particular a lack of secretion of IL-1 and TNF-α.

121
Effect of LPS of IL-1α, IL-6 and TNF-α release by HA-FLS (A), non-HA-FLS (B), RA-FLS
(C), HR-FLS (D) and THP-1 cells (E). Cells are activated with LPS (1µg/mL) for 6h, cytokines
releases (IL-1α, IL-6 and TNF-α) were determined by ELISA in culture supernatants. Data are
expressed as the mean of triplicate samples +/- SD and are representative of three independant
experiments (*** = p < 0.0001, ** = p < 0.001, ns = not significant). LPS : lipopolysaccharide
; HA-FLS : FLS of hemophilics patients ; non-HA-FLS : FLS of non hemophilics patients ;
RA-FLS : FLS of rheumatoid arthritis (commercial cells) ; HR-FLS : normal FLS (commercial
cells) ; THP-1 : human monocytes ; IL-1 : interleukin-1 ; IL-6 : interleukin-6 ; TNF-α : tumor
necrosis factor

122
Figure 3 : Inflammatory cytokine synthesis is repressed post-transcriptionally by a
miRNA-dependant pathway in LPS-activated HA-FLS.

123
Effect of LPS on IL-1α, IL-6 and DICER mRNA expression by HA-FLS (A), non-HA-FLS
(B), RA-FLS (C) and HR-FLS (D); transfected or not transfected with siRNA DICER. Cells
were transfected with siRNA DICER or with the HiPerFect Transfection negative control
(CTL). LPS (1 µg/mL) activation of transfected cells was performed 24 h posttransfection for
6 h and incubated for another 2h with actinomycin D (5 µg/mL). Non transfected HA-FLS,
non-HA-FLS, RA-FLS and HR-FLS were activated with LPS (1µg/mL) for 6h and incubated
for another 2h with actinomycine D (5µg/mL). mRNA levels were determined using
quantitative RT-PCR. Results were normalized to ACTIN and GAPDH and expressed as the 2-
ΔΔ Ct expression compared with samples from cells incubated in LPS. Data are expressed as
the mean of triplicate samples +/- SD and are representative of three independant experiments
(*** = p < 0.0001, ns = not significant). LPS : lipopolysaccharide ; HA-FLS : FLS of
hemophilics patients ; non-HA-FLS : FLS of non hemophilics patients ; RA-FLS : FLS of
rheumatoid arthritis (commercial cells) ; HR-FLS : normal FLS (commercial cells) ; THP-1 :
human monocytes ; IL-1 : interleukin-1 ; IL-6 : interleukin-6 ; mRNA : RNA messenger

124
Figure 4 : Chronic plasma exposure in normal HR-FLS lead to the same miRNA profile
than HA-FLS.

qRT-PCR was performed of 11 selected miRNAs from microarray discovery in HA and non-
HA-FLS and also in plasma exposed normal HR-FLS (+ plasma) and non exposed HR-FLS (-
/-), on the condition medium (A) (has-miR-181b-5p, hsa-miR-25-3p, has-miR-1271-5p, hsa-
miR-146b-5p, hsa-miR-196b-5p) and on the condition LPS (B) (hsa-miR146a-5p, hsa-miR-
6511b-5p, hsa-miR1246 , hsa-miR-1271-5p, hsa-miR-585-5p, hsa-miR34a-3p ). miRNAs
expression were verified using miScript SYBER Green Kit and miScript Primer Assays. The
2-ΔΔCt method was used to calculate relative changes in miRNA expression. Results were
normalized to SNORD and RNU. Data are expressed as the mean of triplicate samples +/- SD
and are representative of three independants experiments (*** = p < 0.0001,** = p < 0.001, *
= p < 0.01).

125
126
Figure 5 : Transcriptomic network potentially impacted by miRNA expression in HA-
FLS: from inflammatory to ubiquitous changes.

HA and non-HA-FLS were stimulated with LPS (1 µg/mL) for 6 hours. The extracted RNAs
were compared using a DNA microarray containing 2578 probes complementary to miRNAs
of human origin. Chord diagram of the regulated genes (A : Medium ; B : LPS) shared between
the miRs. Each chord represent a number genes regulated by two miRs. The total number of
regulated genes by each miR is mentioned between brackets. Table of genes (A : Medium ; B :
LPS) targeted by at least 3 miRs (according to Ingenuity IPA), 1/green if a gene is a target of a
miR and 0/black if not.

127
TABLES :

Table 1 : Differences of cytokines in Cytokine Array expression – Non-HA-FLS versus

HA-FLS. Some significant variations have been demonstrated between non-HA-FLS (3
patients) and HA-FLS (5 patients) with LPS (1µg/mL) or without LPS. These variations could
be classified into differents groups : innate immunity and macrophage maturation, adaptative
immunity process, angiogenesis, bone remodeling, iron metabolism and others. = : 0 (no
difference) ; ↓↓ : 0 – 0.5 (decrease in cytokine expression between 0 and 50%) ; ↓ : 0.5 – 0.75
(decrease in cytokine expression between 50% and 75%) ; ↑ : 1 – 1.5 (increase in cytokine
expression between 100% et 150 %) ; ↑↑ : 1.5 – 2 (increase in cytokine expression between
150% et 200%). HA-FLS : FLS of hemophilics patients ; non-HA-FLS : FLS of non
hemophilics patients ; LPS : lipopolysaccharide ; DPPIV : dipeptidyl peptidase ; ENA- :
epithelial neutrophil-activating protein ; FGF : fibroblast growth factor ; GRO : growth-
regulated oncogene ; IFN- : interferon ; IL- : interleukin ; MCP- : monocyte chemoattractant
protein ; M-CSF : monocyte colony-stimulating factor ; MIF : macrophage migration inhibitory
factor ; MIP- : macrophage inflammatory protein

128
Table 2 and Table 3: Microarray analysis of miRNA profile of HA-FLS shows a single
miRNA signature close to that of inflammatory arthritis and diseases. The global
expression profile of miRNAs is analyzed using a microarray-based approach after exposing
HA and non-HA-FLS to LPS. FLS were stimulated with medium (Table 2) and LPS (Table 3)
for 6 hours and the extracted RNAs were compared using a DNA microarray containing 2578
probes complementary to miRNAs of human origin. A HA-FLS/non-HA-FLS miRNA ratio
was used to determinate expression levels of each miRNA.

After used of a significant cut-off ratio respectively at <0,75 and >1,5, 14 miRNAs had
significantly different expression levels after medium stimulation (Table 2) and 16 miRNAs
had significantly different expression levels after LPS stimulation (Table 3).

129
MATERIALS AND METHODS (Supplementary data)

Reagents

Cell culture media (RPMI 1640, M199), fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin,
streptomycin, amphotericin B, and trypsin reagent were purchased from Thermo Fisher
Scientific. Lipopolysaccharides (LPS) were obtained from Salmonella abortus equi, Type XI
collagenase and actinomycin D from Streptomyces sp. from Sigma-Aldrich. The Human
Cytokine Array Kit and enzyme immunoassay kit for detecting human IL-1α, IL-6, and TNF-α
were obtained from R&D Systems. The iScript Reverse Transcription Supermix for the real-
time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), and SsoFast EvaGreen Supermix,
were obtained from Bio-Rad. The RNeasy Plus Mini Kit and miScript System were obtained
from Qiagen (Courtaboeuf, France). Flow cytometry antibodies and corresponding isotypes
were obtained from Becton Dickinson (LePontdeClaix, France).

Cell activation

FLS (5.105cells) and THP-1 (107cells) were stimulated with 1 mL of either medium
alone or medium containing LPS (1 µg/mL) for 6 hours. After stimulation, supernatants were
harvested and assayed for cytokine content using commercially available ELISA tests.

Flow cytometry

For the expression of the cluster of differentiation CD45, CD55, CD68, CD90, and
CD106 in human FLS, HFLS cell lines (RA-HFLS, HR-FLS) and THP-1 cells were measured
using a flow cytometry assay15. After culture, the cells were washed twice with phosphate
buffered saline (PBS), then incubated for 20 minutes at room temperature in the dark with a
mixture of Krome Orange-conjugated anti-CD45, PE-conjugated anti-CD55, FITC-conjugated
anti-CD68, BV421-conjugated anti-CD90, and APC-conjugated anti-CD106. Then, after two
washes with PBS, the fluorescent cells were analyzed on a FACScan flow cytometer (Gallios,
Beckman Coulter) using Kaluza Analysis (Beckman Coulter).

130
 Protein profiling from supernatant

Protein profiling was performed based on the supernatant of cell activation. Some 300
µL of supernatant were loaded on proteome profiler antibody array membranes (Human XL
Cytokine Array Kit, R&D Systems), as suggested by the supplier. These membranes were
washed and incubated with biotinylated detection antibody cocktail, streptavidin/horseradish
peroxidase, and chemiluminescent detection reagents, as suggested by the supplier. Membranes
were exposed to a ChemiDoc and analyzed using ImageJ Software.

Image analysis was performed with background subtraction and normalization to

membrane reference points. Differences in the expression levels of various proteins were
calculated pairwise as fold changes, with comparisons made between HA and non-HA-FLS.

Stimulation of cells for total extraction

Total RNA was extracted from human FLS or THP-1 cells incubated for 6 hours with
either medium alone or medium containing LPS used the RNeasy Plus Mini Kit according to
the manufacturer’s instructions. Total RNA isolated from the FLS and THP-1 cells was reverse
transcribed using the iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR, according to the
manufacturer’s instructions (Bio-Rad), and amplified.

mRNA decay measurement

The stability of mRNA was assessed by adding 5 µg/mL of actinomycin D to the cell
medium following activation with fetal bovine serum to inhibit mRNA transcription. At the
indicated time points, it was possible to correlate the relative amount of specific mRNA
remaining in each sample with mRNA degradation. Total RNA was extracted 2 hours after
treatment with actinomycin D and endogenous mRNA levels were analyzed by RT-qPCR.
Because the mRNA levels for GAPDH and β actin were unchanged after actinomycin D
treatment, the GAPDH and β actin gene were employed as a reference, and the ratio of IL-
1α/IL-6 and GAPDH/β actin in each sample was calculated.

131
 Real-time quantitative polymerase chain reaction

RT-qPCR was performed on a total of 20µL using the SsoFast EvaGreen Supermix
(Bio-Rad) and gene specific primers for (i)TNF-α (5’-TCC-TTC-AGA-CAC-CCT-CAA-CC-
3’ and 5’-AGG-CCC-CAG-TTT-GAA-TTC-TT-3’), (ii)IL-1α(5’-CCC-ACA-GAC-CTT-
CCA-GGA-GAA-T-3’ and 5’-CGA-CAC-CCT-CGT-TAT-CCC-ATG-TGT-CG-3’), (iii)IL-6
(5’-TAC-CCC-CAG-GAG-AAG-ATT-CC-3’ and 5’-TTT-TCT-GCC-AGT-GCC-TCT-TT-
3’), (iv)GAPDH (5’-TTG-ATT-TTG-GAG-GGA-TCT-CG-3’ and 5’-GAG-TCA-ACG-GAT-
TTG-GTC-GT-3’) and (v) β -actin (5’-CGT-ACC-CAT-CAC-GAT-GCC-AGT-GGT-ACG-3’
and 5’-ACG-TTG-CTA-TCC-AGG-CTG-TGC-3’).

After initial denaturing at 95°C for 3 minutes, the temperatures used were 95°C for 5
seconds, 58°C for 15 seconds, and 72°C for 15 seconds. Some 40 cycles were performed using
the C1000 Touch Instrument (Bio-Rad).

RT-qPCR analyses for miRNAs were conducted using the miScript System, and the
primers (Qiagen) and RNA concentrations were determined with a NanoDrop instrument
(Thermo Fisher). A 1000ng RNA sample was employed for the assays. Reverse transcriptase
reactions and RT-qPCR were carried out according to the manufacturer’s protocols. An
endogenous control was employed for normalization. All reactions were run in triplicate on a
C1000 Touch Instrument (Bio-Rad).

Single interfering RNA transfection

The DICER siRNA used in our study was designed to effectively inhibit DICER
activity, being supplied by Qiagen.

Cells were transfected with siRNA using the HiPerFect Transfection Reagent kit
(Qiagen). Cells were plated in 24-well plates (1 x 103 cells/well). All assays were performed 24
hours after transfection

Statistical analysis

Statistical analysis was performed using Student’s t-test. Values were compared
between different groups. A p-value of <0.05 was considered statistically significant.

132
FIGURES (Supplementary data)

Figure S1 : Phenotype of different cells : HA-FLS (A), non HA-FLS (B), RA-FLS (C), HR-
FLS (D) and THP1 (E). Expression of CD45, CD55, CD68, CD90 and CD106 markers. HA-
FLS (5 patients), non-HA-FLS (3 patients), RA-FLS and HR-FLS are composed of a pure
homogenous fibroblastic population and completely differed from the THP-1 cell line. In the
joint, we have two specific cells: macrophage-like synoviocytes cells (type A) and fibroblast-
like synoviocytes cells. CD68 (lysosomal glycoprotein) is expressed by macrophage-like
synoviocytes cells. CD90 (Thy-1) is specific for fibroblast-like synoviocytes and this cells
could expressed CD55 (Decay accelerating-factor) and CD106 (Vascular cell adhesion
molecule-1) too. CD45 (leukocyte common antigen) is specific for leucocytes cells like THP-
1. SI (Stain Index) = (Median of Positive – Median of Negative) / (SD of Negative * 2); HA-
FLS : FLS of hemophilics patients ; non-HA-FLS : FLS of non hemophilics patients ; RA-FLS :
FLS of rheumatoid arthritis (commercial cells) ; HR-FLS : normal FLS (commercial cells) ;
THP-1 : human monocytes.

133
Figure S2 : Microarray analysis of miRNA profile of HA-FLS versus non HA-FLS.

HA and non-HA-FLS were stimulated with LPS (1 µg/mL) for 6 hours. The extracted RNAs
were compared using a DNA microarray containing 2578 probes complementary to miRNAs
of human origin. Volcano plot (A : Medium ; B : LPS) of the differentially expressed genes.
Significance (-log10 pvalue) versus log2 fold-change. Genes with statistical significant
modulations are over the horizontal bar (pval<=0.05) and genes modulated >= fold 1.2 are
outside the vertical bars.

134
TRAVAUX 2

135
 TRAVAUX 2

FVIII, NF-κB et Myd88/TIRAP : rôle non-canonique anti inflammatoire du FVIII

Sandra Mignot1, PhD ; Sandrine Delignat2, PhD ; Sébastien Lacroix-Desmazes2, PhD ;

Mickaël Dussiot1, PhD ; Anaïs Martinez1 ; Christine Bole-Feysot3, PhD ; Nicolas Cagnard4,
PhD ; Justine Siavellis1, MD, PhD ; Michelle Marchal1, PhD ; Shérine Tei1 ; Ananthy
Kiddinan1 ; Olivier Hermine1,5,6, PU-PH, PhD ; Laurent Frenzel1,5,6, MD, PhD

1
Laboratory of Cellular and Molecular Mechanisms of Hematological Disorders and Therapeutical
Implications, Paris Descartes – Sorbonne Paris Cité University, Labex GR-Ex, Imagine Institute,
Inserm U1163
2
Laboratory of therapeutic immunopathology and immunointervention, Paris Descartes – Sorbonne
Paris Cité University, CRC, INSERM UMRS 1138 team 16
3
Genomic Platform, Paris Descartes – Sorbonne Paris Cité University, Imagine Institute, INSERM
U1163
4
Bioinformatics Platform, Paris Descartes – Sorbonne Paris Cité University, Imagine Institute,
INSERM U1163
5
Hematology unit care – Hemophilia Center – Necker Hospital, 149 rue de Sèvres 75015 Paris,
France
6
Faculty of medicine, Paris Descartes, Paris

Une des complications majeures de l’hémophilie est l’apparition d’hémarthrose. Une

hémarthrose est un épanchement de sang au niveau d’une articulation et une succession sur la
même articulation (que l’on appelle articulation cible) engendre un phénomène nommé
arthropathie hémophilique (AH), qui va détruire progressivement le cartilage. Dans
l’arthropathie hémophilique, on a un modèle unique où les cellules résidentes synoviocytaires
(FLS) sont en contact direct avec le sang. Nous pouvons donc émettre l’hypothèse que les
éléments du sang, et en particulier les facteurs de la coagulation, pourraient avoir un rôle dans
la physiopathologie de l’arthropathie hémophilique. De nombreuses études s’intéressent à de
potentielles implications des facteurs de la coagulation, en dehors de leur rôle dans la
coagulation. Pour le FVIII, il a été démontré qu’il peut jouer au niveau cardiovasculaire, au
niveau des os, dans l’angiogénèse ou bien encore dans l’hématopoïèse. Cependant, aucune
étude ne montre de potentiel rôle du FVIII dans l’inflammation.

Au cours de ce deuxième travail, j’ai tout d’abord apporté la technique de dialyse du

FVIII au laboratoire. Cette technique était nouvelle. Après incubation avec du FVIII dialysé et
après activation par du LPS, nous avons pu montrer que les cellules sécrétaient moins de

136
cytokines pro inflammatoires en présence de FVIII. Ce profil est retrouvé sur tous les types
cellulaires testés : THP1 (cellules monocytaires), FLS de patients AH (AH-FLS), FLS de
patients non AH (non-HA-FLS), FLS normaux commerciaux (HR-FLS), FLS de patients
atteints de PR commerciaux (RA-FLS). De plus, nous avons testé différents FVIII
commerciaux et l’effet est similaire quel que soit le facteur utilisé. Cet effet anti-inflammatoire
n’est pas trouvé quand on teste d’autres facteurs de la coagulation, comme le FIX ou le vWF.
Nous avons voulu regarder quels domaines du FVIII pouvaient être impliqués dans l’effet
trouvé, nous avons pour cela testé différents anticorps anti-domaines (A2, C1 et C2) et il
semblerait que ce soient les domaines C qui sont impliqués dans le mécanisme anti
inflammatoire. De plus, le FVIII semblerait être endocytosé. En effet, lorsque l’on bloque
l’endocytose, on bloque également l’effet anti inflammatoire du FVIII.

Un transcriptome a été réalisé sur les échantillons de FLS de 3 patients différents, sur
des FLS normaux et sur des THP1, en présence ou l’absence de FVIII et cellules activées ou
non par le LPS. Les résultats transcriptomiques sont corrélés avec l’expression protéique anti
inflammatoire et les résultats sont similaires entre les différents types cellulaires.

Nous nous sommes par la suite intéressés aux différentes voies qui pourraient être
impactées par l’ajout de FVIII, en particulier nous avons regardé la voie du NF-κB. Pour cela,
nous avons utilisé un modèle cellulaire particulier, les THP1 Blue NF-κB, où les cellules sont
élaborées pour étudier la transduction du signal dans la voie du NF-κB. Pour cela, nous avons
testé différents agonistes de TLR. Après incubation avec le FVIII et activation par différents
PRR, une diminution du signal de la voie du NF-κB est retrouvée pour les agonistes du TLR-2
et du TLR-4 mais aucun changement pour l’agoniste du TLR-5. De plus, la translocation du
NF-κB dans le noyau est diminuée quand les cellules sont incubées en présence de FVIII (ceci
a été montré par AMNIS). Quand on se base sur les différences entre TLR-2/TLR-4 et TLR-5,
on remarque que TIRAP est essentiel pour interagir avec Myd88 pour TLR-2/TLR-4, alors que
TLR-5 n’a seulement besoin que de Myd88. Le FVIII bloquerait l’interaction entre TIRAP et
Myd88 et aurait une régulation négative sur la voie du NF-κB.

En conclusion, notre travail démontre un potentiel nouveau rôle du FVIII comme étant
un contrôle inflammatoire dans la voie du NF-KB.

137
 L’article est actuellement en cours d’écriture et ces résultats feront l’objet d’une
publication ultérieure dans un journal international. Les résultats ont été présentés en poster à
l’ASH (2019 – Atlanta) et à l’EAHAD (2020 – La Haye).

138
MATERIEL ET METHODES

1. Réactifs

Les milieux de culture cellulaire (RPMI 1640 et M199), le sérum de veau fœtal (SVF),
la pénicilline, la streptomycine, la L-glutamine, l’amphotéricine B et la trypsine-EDTA
proviennent de Thermo Fischer Scientifics. Le LPS (Salmonella abortus equi), la collagénase
XI et le dynasore ont été fournis par SIGMA-Aldrich (Streiheim, Allemagne). Les kits ELISA
(IL-1, IL-6 et TNF-α) et le kit Human Cytokine Array (Human XL Cytokine Array Kit)
proviennent de R&D Systems. Le iScript Reverse Transcirption Supermix for RT-qPCR et le
Sso Fast EvaGreen Supermix ont été fournis par Biorad. Le kit d’extraction d’ARN (RNeasy
Plus Mini Kit) provient de Qiagen (Courtaboeuf, France). Le kit de translocation en AMNIS
(Amnis NF-κB Translocation Kit) a été fourni par Merck Millipore. La lignée cellulaire THP1-
Blue NF-κB et le réactif Quanti Blue proviennent de Invivogen. Les lignées cellulaires FLS
normaux (HR-FLS) et FLS de polyarthrite rhumatoïde (RA-FLS) ont été obtenus par Cell
Applications, San Diego, US. La lignée cellulaire THP1 provient de European Collection of
Authenticated Cell Cultures (Salisbury, UK).

2. Culture cellulaire

Les FLS humains ont été isolés à partir des membranes synoviales de patients prélevées
au cours de synovectomies arthroscopiques d’articulations. La membrane synoviale est
découpée dans des conditions stériles, puis incubée 3h à 37°C dans du RPMI contenant 1
mg/mL de collagénase de type XI (Sigma). Après centrifugation (1300 rpm, 10 minutes, 4°C),
le culot cellulaire est repris dans 8 mL de milieu de culture à 20% de SVF décomplémenté,
ensemencé dans une boite de culture de 25 cm², puis placé dans un incubateur à 37°C dans une
atmosphère à 5% de CO2. Le milieu de culture est changé au bout de 24h pour éliminer les
cellules non adhérentes, puis deux fois par semaine. A confluence, le tapis cellulaire est décollé
par additition de 2 à 3 mL de trypsine-EDTA 0,05% pendant 5 minutes à 37°C. Après
centrifugation (1300 rpm, 10 minutes, 4°C), le culot cellulaire est repris dans 10 mL de RPMI
1640/M199 à 10% de SVFd et les cellules sont ré-ensemencées dans une boite 75 cm² : les
cellules sont alors à passage 1. Par la suite, les FLS sont cultivés dans du RPMI et du M199
(ratio 1 :1) additionnés de pénicilline (100 UI/L), de streptomycine (100 µg/mL),

139
d’amphotéricine B (0,25 µg/mL) et du SVF décomplémenté 20% (puis 10% après le premier
passage). Les expériences ont été réalisées entre le 3ième et le 9ième passage. Pendant ce temps,
les cultures sont constituées d’une population homogène de cellules fibroblastiques, phénotype
confirmé par analyse FACS. Le nombre de cellules et la viabilité cellulaire ont été contrôlés par
comptage au bleu trypan. Les lignées cellulaires HR-FLS et RA-FLS ont été cultivées de la
même manière (dans un milieu contenant du RPMI et du M199 à 10% de SVF).

Les THP1 et THP1 Blue ont été cultivés dans un milieu comprenant du RPMI et SVF à
10%.

3. Activation cellulaire

Les FLS et les THP1 Blue ont été ensemencés dans une plaque 6 puits à raison de 5x105
cellules par puits et 1x107 cellules par puits pour les THP1.

Les FLS et THP1 seront stimulés par 1 mL par puit de milieu (RPMI et M199 à 5%
SVFd) ou de milieu (RPMI 1640 à 5% de SVFd), contenant ou non du LPS (1 µg/mL) et incubés
ou non en présence de facteurs de la coagulation pendant 6 heures. Après stimulation et
incubation avec les facteurs de la coagulation, les surnageants sont récupérés et préparés pour
analyse de cytokines par kit ELISA.

Les THP1 Blue seront stimulés par 1 mL par puits de milieu (RPMI à 5% SVFd),
contenant ou non des ligands de TLR et incubés ou non en présence de facteurs de la coagulation
pendant 24 heures. Le réactif QuantiBlue (un réactif permettant la détection des SEAP) est
ajouté sur les surnageants, les plaques sont incubées 2 heures supplémentaires et la densité
optique à 595 nm est lue.

4. Préparation du FVIII à partir de concentrés thérapeutiques

Différents produits thérapeutiques du FVIII disponibles dans le commerce ont été

analysés : deux FVIII recombinants complets : Helixate® (deuxième génération, CSL-Behring,
Marburg, Allemagne) et Advate® (troisième génération, Baxter Bioscience, Maurepas, France)
et un FVIII recombinant B-délété : Refacto® (troisième génération, Pfizer, Paris, France).

Les différents FVIII ont été solubilisés dans leurs excipients respectifs puis dialysés en
présence de 2,5 mM de CaCl2 pendant 2 heures à 4°C.

140
 Le FVIII a été quantifié par test chromogénique, en utilisant du plasma humain comme
standard.

La concentration de FVIII dialysé utilisée est celle correspondant à un taux de FVIII

égal à 100% dans le plasma.

5. Analyse du profil des protéines dans le surnageant

L’analyse du profil des protéines a été effectuée à partir de surnageant après stimulation
et incubation. 300 µL de surnageant ont été ajoutés sur les membranes, selon les consignes du
fournisseur. Les membranes ont été lavées et incubées avec un cocktail d’anticorps de détection
biotinylé, de streptavidine et de réactifs de détection chimioluminescents. Les membranes ont
été exposées à un ChemiDoc et analysées à l’aide du logiciel ImageJ.

L’analyse d’image a été réalisée avec soustraction du bruit de fond et normalisation aux
points de référence de la membrane. Les différences dans les niveaux d’expression ont été
comparées entre les conditions avec et sans FVIII.

6. Stimulation des cellules pour extraction

L’ARN total a été extrait à partir des FLS et THP1, stimulés ou non par du LPS et
incubés ou non par des facteurs de la coagulation, en utilisant le kit RNeasy Plus Mini Kit
suivant les instructions du fournisseur. L’ARN extrait a été transcrit de manière inverse en
utilisant le iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR et amplifié.

7. Réaction de polymérase en chaine : RT-qPCR

Les concentrations en ARN ont été préalablement déterminées avec l’appareil

NanoDrop (NanoDrop Technologies). 1 µg d’ARN par échantillon a été utilisé pour les
expériences. La RT-PCR quantitative a été exécutée en utilisant le Sso Fast EvaGreen Supermix
dans un volume total de 20 µL. Les primers spécifiques suivants ont été utilisés : TNF-α (5’-
TCC-TTC-AGA-CAC-CCT-CAA-CC-3’ et 5’-AGG-CCC-CAG-TTT-GAA-TTC-TT-3’), (ii)
IL-1 beta (5’-CCC-ACA-GAC-CTT-CCA-GGA-GAA-T-3’ et 5’-CGA-CAC-CCT-CGT-
TAT-CCC-ATG-TGT-CG-3’), (iii) IL-6 (5’-TAC-CCC-CAG-GAG-AAG-ATT-CC-3’ et 5’-

141
TTT-TCT-GCC-AGT-GCC-TCT-TT-3’), (iv) GAPDH (5’-TTG-ATT-TTG-GAG-GGA-
TCT-CG-3’ and 5’-GAG-TCA-ACG-GAT-TTG-GTC-GT-3’) et (v) beta-actin (5’-CGT-ACC-
CAT-CAC-GAT-GCC-AGT-GGT-ACG-3’ et 5’-ACG-TTG-CTA-TCC-AGG-CTG-TGC-
3’). Le protocole suivant a été utilisé : après une dénaturation initiale à 94°C pendant 3 minutes,
les échantillons ont été exposés à 40 cycles d’amplification (température de 94°C pendant 5
secondes, 58°C pendant 15 secondes et 72°C pendant 15 secondes), en utilisant le
thermocycleur C1000 Touch Instrument (BioRad).

Toutes les réactions ont été répliquées trois fois dans l’appareil et l’expression relative
a été calculée en utilisant la méthode comparative du cycle seuil (ΔΔCt).

8. Test d’endocytose

Les THP1 (1x107 cellules) ont été stimulés avec 1 mL de milieu seul ou contenant du
lipopolysaccharide (1 µg/mL) pendant 6 heures. Les cellules (groupes Medium + Dynasore,
Medium + FVIII + Dynasore, LPS + Dynasore et LPS + FVIII + Dynasore) ont été traitées avec
du dynasore pendant 30 minutes (100 µM) à 37°C. Après stimulation et incubation avec le
facteur de la coagulation, les surnageants ont été récoltés et testés en ELISA pour mesurer la
synthèse protéique en cytokines inflammatoires.

9. Translocation du NF-κB par la technique d’AMNIS

La mesure de la translocation NF-κB a été réalisée avec le kit de translocation Amnis

NF-κB. Les THP1 (1x106 cellules par condition) ont été incubés avec du FVIII et activés avec
du LPS pendant 1 heure. Après incubation et stimulation, les cellules ont été lavées et fixées
pendant 10 minutes. 100 µL d’anticorps anti-NF-Alexa Fluor 488 anti-humain ont été ajoutés
pendant 30 minutes. Juste avant de passer les échantillons à l’AMNIS, du 7AAD a été ajouté à
tous les échantillons pour visualizer le noyau. 5 000 évènements ont été collectés par
échantilons en utilisant un laser d’excitation à 488 nm.

L’assistant de localisation nucléaire du logiciel AMNIS crée un modèle d’analyse pour

mesurer la localisation nucléaire du NF-κB. Cet assistant utilise la fonction de similarité qui
calcule une corrélation pixel par pixel de l’image nucléaire 7AAD avec l’image Alexa Fluor
488 anti-humain NF-κB. Un score de similitude élevé indique que les deux images sont

142
fortement corrélées et similaires, tandis que des scores faibles indiquent que les images sont
différentes.

10. Analyse statistique

Les résultats sont représentatifs de trois expériences différentes. Chaque experience

représente la moyenne de deux essais +/- SEM, effectués en triple. L’analyse statistique a été
réalisée à l’aide du test t de Strudent. Les valeurs ont été comparées entre différents groupes.
Une valeur de p < 0,01 a été considérée comme statisitiquement significative.

143
RESULTATS

1. La présence de FVIII entraine une modification de la sécrétion de cytokines et en

particulier engendre une diminution de la production de cytokines pro-
inflammatoires.

Dans cette étude, nous avons regardé dans un premier temps l’expression d’un panel de
cytokines (105 cytokines) par les FLS de patients hémophiles en réponse au LPS et en présence
de FVIII.

Les FLS de patients hémophiles (HA-FLS ; 5x105 cellules par puit d’activation) ont été
incubés pendant 6 heures en présence de FVIII et activés par le LPS (1 µg/mL). Le contrôle
“Medium” correspond à une incubation de 6 heures en l’absence de FVIII et sans activation par
le LPS. La détection de la sécrétion des cytokines a été réalisée par un kit Cytokine Array sur
les surnageants des différentes conditions.

L’analyse de ces résultats montre que l’ajout de FVIII entraine une modification de la
sécrétion des cytokines (Figure 1). Les cytokines modifiées appartiennent à des systèmes
biologiques différents : immunité innée, immunité adaptative et maturation macrophagique.

144
 Medium + FVIII

Medium + FVIII

Medium + FVIII
LPS + FVIII

LPS + FVIII

LPS + FVIII
Medium

Medium

Medium
LPS

LPS

LPS
Adinopectin IGFBP-2 MCP-3
Apolipoprotein A-I IGFBP-3 M-CSF
Angiogenin IL-1α MIF
Angiopoietin-1 IL-1β MIG
Angiopoietin-2 IL-1ra MIP-1α/MIP-1β
BAFF IL-2 MIP-3α
BDNF IL-3 MIP-3β
Complement component C5/C5a IL-4 MMP-9
CD14 IL-5 Myeloperoxidase
CD30 IL-6 Osteopontin
CD40 ligand IL-8 PDGF-AA
Chitinase 3-like 1 IL-10 PDGF-AB/BB 1-0,9
Complement Factor D IL-11 Pentraxin 3 0,9-0,8
C-Reactive Protein IL-12p70 PF4 0,8-0,7
Cripto-1 IL-13 RAGE 0,7-0,6
Cystatin C IL-15 RANTES 0,6-0,5
Dkk-1 IL-16 RBP-4 0,5-0,4
DPPIV IL-17A Relaxin-2 0,4-0,3
EGF IL-18 Bpa Resistin 0,3-0,2
Emmprin IL-19 SDF-1α 0,2-0,1
ENA-78 IL-22 Serpin E1 0,1
Endoglin IL-23 SHBG
Fas Ligand IL-24 ST2
FGF basic IL-27 TARC
FGF-7 IL-31 TFF3
FGF-19 IL-32 TfR
Flt-3 Ligand IL-33 TGF-α
G-CSF IL-34 Thrombospondin 1
GDF-15 IP-10 TNF-α
GM-CSF I-TAC uPAR
GRO α Kallikrein 3 VEGF
Growth Hormone Leptin Vitamin D BP
HGF LIF CD31
ICAM-1 Lipocalin-2 TIM-3
IFN-γ MCP-1 VCAM-1

Figure 1 : Différences dans l’expression cytokinique entre les cellules en présence de FVIII et
les cellules en l’absence de FVIII. Les cellules (HA-FLS) ont été activées avec du LPS (1
µg/mL) et incubées avec du FVIII pendant 6 heures. La sécrétion des cytokines a été déterminée
par Cytokine Array (la sécrétion de 105 cytokines a été étudiée) dans les surnageants de
culture. Les cellules en présence de FVIII et en l’absence de FVIII ont été comparées et selon
deux conditions : medium (sans activation) et LPS (avec activation). Les différences
cytokiniques ont été classées selon leur expression : 1 représente la plus forte expression et <
0,1 signifie que la cytokine n’est pas sécrétée par la cellule. HA-FLS : FLS de patients
hémophiles ; LPS : Lipopolysaccharide ; FVIII : facteur de la coagulation VIII.

Dans la suite de cette étude, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à des
cytokines pro inflammatoires et sur un plus grand nombre de types cellulaires.

Les FLS (5x105 cellules par puit d’activation) de patients (hémophiles : HA-FLS, non
hémophiles : non-HA-FLS) et de lignées (RA-FLS : FLS de polyarthrite rhumatoïde, HR-FLS
: FLS normaux) ont été incubés pendant 6 heures en présence de FVIII et activés par le LPS (1

145
µg/mL). La même incubation/activation a été réalisée sur des THP1 (1x107 cellules par puit
d’activation). Le contrôle “Medium” correspond à une incubation de 6 heures en l’absence de
FVIII et sans activation par le LPS. La détection de la sécrétion des cytokines a été réalisée par
un kit Cytokine Array sur les surnageants des différentes conditions.

L’analyse de ces résultats montre que l’ajout de FVIII entraine une diminution de la
sécrétion des cytokines pro inflammatoires (Figure 2). On note la diminution de l’IL-6 en
présence de FVIII dans les HA-FLS (Figure 2A), dans les non-HA-FLS (Figure 2B), dans les
RA-FLS (Figure 2C) et dans les HR-FLS (Figure 2D). De la même manière, on note une
diminution de la cytokine TNF-α dans les THP1 (Figure 2E).

146
Figure 2 : Le FVIII induit une diminution de la sécrétion de cytokines pro inflammatoires. Effet
du FVIII sur la sécrétion de l’IL-6 (A, B, C et D) et du TNF-α (E) par les HA-FLS (A), non-
HA-FLS (B), RA-FLS (C), HR-FLS (D) et THP-1 (E). Les cellules ont été activées par le LPS
(1 µg/mL) et incubées avec du FVIII pendant 6 heures. Le TNF-α et l’IL-6 ont été dosés dans
les surnageants de culture par test ELISA sandwich. Les valeurs représentent les moyennes de
trois essais effectués en double avec des FLS et des THP-1. Les écarts-type indiquent la
déviation standard. *** = p < 0,0001, ** = p < 0,001, * = p < 0,01, ns = non significatif. HA-
FLS : FLS de patient hémophile ; non-HA-FLS : FLS de patient non hémophile ; RA-FLS : FLS
de polyarthrite rhumatoïde ; HR-FLS : FLS normaux ; THP1 : monocytes humains ; LPS :
lipopolysaccharide ; FVIII : facteur de la coagulation VIII ; IL-6 : Interleukine-6 ; TNF-α :
tumor necrosis factor α

2. La présence de FVIII entraine une diminution de l’ARNm de cytokines pro-

inflammatoires

Dans cette étude, nous avons regardé l’expression de l’ARNm des cytokines IL-6 et
TNF-α en réponse à l’activation par le LPS et à l’incubation en présence de FVIII.

147
 Les FLS (5x105 cellules par puit d’activation) de patients (hémophiles : HA-FLS, non
hémophiles : non-HA-FLS) et de lignées (RA-FLS : FLS de polyarthrite rhumatoïde, HR-FLS
: FLS normaux) ont été incubés pendant 6 heures en présence de FVIII et activés par le LPS (1
µg/mL). La même incubation/activation a été réalisée sur des THP1 (1x107 cellules par puit
d’activation). Le contrôle “Medium” correspond à une incubation de 6 heures en l’absence de
FVIII et sans activation par le LPS. Les ARN messagers de l’IL-6 et du TNF-α ont été analysés,
après extraction de l’ARN total, par RT-qPCR, en utilisant les primers décrits antérieurement.

L’utilisation de FVIII modifie l’expression de l’ARNm de l’IL-6 et du TNF-α. En effet,

on observe une diminution de l’expression de l’ARNm l’IL-6 (Figure 3A, B, C et D) et du
TNF-α (Figure 3E) après ajout du FVIII et activation par le LPS. Les expressions en ARNm
et protéiques des cytokines IL-6 et TNF-α sont corrélées.

148
Figure 3 : La synthèse des cytokines inflammatoires est diminuée en présence de FVIII dans
les cellules activées. Effet du FVIII sur l’expression de l’ARNm de l’IL-6 (A, B, C et D) et du
TNF-α (E) par les HA-FLS (A), non-HA-FLS (B), RA-FLS (C), HR-FLS (D) et THP-1 (E). Les
cellules ont été activées par le LPS (1 µg/mL) et incubées avec du FVIII pendant 6 heures. Les
ARN messagers de l’IL-6 et du TNF-α ont été analysés par RT-qPCR. Les résultats ont été
normalisés par rapport à l’actine et à la GAPDH et exprimés sous forme 2-ΔΔCt en
comparaison aux cellules incubées avec du LPS sans FVIII. Les valeurs représentent les
moyennes de trois essais effectués en double avec des FLS et des THP-1. Les écarts-type
indiquent la déviation standard. *** = p < 0,0001, ns = non significatif. HA-FLS : FLS de
patient hémophile ; non-HA-FLS : FLS de patient non hémophile ; RA-FLS : FLS de
polyarthrite rhumatoïde ; HR-FLS : FLS normaux ; THP1 : monocytes humains ; LPS :
lipopolysaccharide ; FVIII : facteur de la coagulation VIII ; IL-6 : Interleukine-6 ; TNF-α :
tumor necrosis factor α ; mRNA : ARN messager

149
 3. La présence de FVIII entraine des modifications dans la voie du NF-κB, par
diminution de son activation et inhibition de la translocation du NF-κB dans le
noyau

Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à la transduction du signal de la voie de
signalisation du NF-κB, en réponse à l’activation par différents PRR et à l’incubation en
présence de FVIII.

Nous avons utilisé comme modèle d’étude les cellules THP1 Blue NF-κB. Ces cellules
ont été construites afin de pouvoir suivre la transduction du signal NF-κB. En effet, en réponse
à l’activation de ces cellules par PRR, ces cellules vont exprimer une certaine quantité de SEAP
et cette quantité sécrétée est quantifiée par ajout de Quanti-Blue (réactif de détection de SEAP
colorimétrique). Les THP1 Blue NF-κB (5x105 cellules par puit d’activation) ont été incubés
pendant 24 heures en présence de FVIII et activés par différents PRR. Le contrôle “Medium”
correspond à une incubation de 24 heures en l’absence de FVIII et sans activation par PRR. La
détection de la sécrétion de SEAP a été réalisée par ajout de Quantiblue pendant 2 heures sur
les surnageants des différentes conditions et l’absorbance a été mesurée à 595 nm.

Différentes conditions ont été réalisées. Nous avons tout d’abord testé différents FVIII
commerciaux (Figure 4A). Nous avons testé : l’Advate (FVIII complet recombinant de
troisième génération), l’Helixate (FVIII complet recombinant de troisième génération) et le
Refacto (FVIII recombinant domaine B-délété). Les cellules ont été activées avec du LPS (1
µg/mL) et incubées avec les différents FVIII pendant 24 heures. Nous avons ensuite testé l’effet
d’autres facteurs de la coagulation, particulièrement le vWF et le FIX (Figure 4B). Les cellules
ont été activées avec du LPS (1 µg/mL) et incubées avec les différents facteurs de la coagulation
pendant 24 heures. Nous avons voulu regarder par la suite l’effet de différents PRR (Figure
4C). Nous avons alors incubé les cellules avec du FVIII (Advate) et activé les cellules soit par
le ligand du TLR-2 (cellules HKLM), le ligand du TLR-4 (LPS) ou le ligand du TLR-5
(flagelline) et cela pendant 24 heures. Enfin, pour compléter notre étude, nous avons regardé
l’impact de chacun des domaines du FVIII (Figure 4D). Pour cela, les cellules ont été activées
par du LPS et incubées en présence des anticorps anti-domaines : anti-A2, anti-C1 ou anti-C2,
et cela pendant 24 heures.

Le FVIII diminue l’activation de la voie du NF-κB et cet effet est retrouvé avec
l’ensemble des FVIII testés (Figure 4A). Cet effet sur la voie du NF-κB n’est retrouvé qu’avec

150
le FVIII ; en effet, nous pouvons voir que l’ajout de vWF ou de FIX n’a aucun impact sur
l’activation de cette voie (Figure 4B). De plus, le FVIII semble exercer cet effet que lorsque
les cellules sont activées par les cellules HKLM (TLR-2) et par le LPS (TLR-4) mais pas par
la flagelline (TLR-5) (Figure 4C). Enfin, le domaine du FVIII impliqué dans cet effet anti
inflammatoire parait être au niveau des domaines C. Nous ne retrouvons pas d’impact quand
les cellules sont incubées avec les anticorps anti-A2, contrairement aux cellules incubées avec
les anticorps anti-C1 et anti-C2 (Figure 4D).

151
 A B
*** ns
1.5 *** ***
*** Medium 1.5 ns
Medium
LPS *** LPS
DO 595 nm

1.0

DO 595 nm
1.0

0.5
0.5

0.0
0.0

C D
1.5 ns 2.0
*** -/- *** Medium
ns
+ FVIII LPS
* 1.5 **
ns
*** LPS + FVIII
DO 595 nm

1.0

DO 595 nm
1.0
0.5
ns 0.5

0.0 0.0

Figure 4 : Effet du FVIII sur la voie de signalisation du NF-κB. Pour ces expériences, les
THP1-Blue NF-κB ont été utilisés. Ces cellules sont désignées spécifiquement pour suivre la
transduction du signal de la voie du NF-κB. Après stimulation et incubation pendant 24 heures
avec différentes conditions, les surnageants sont récoltés et du QuantiBlue (un réactif de
détection de SEAP) est ajouté sur ces surnageants, incubé pendant 2 heures et la densité
optique est ensuite mesurée à 595 nm. (A) : différents types de FVIII ont été testés : Advate
(FVIII recombinant complet de troisième génération), Helixate (FVIII recombinant complet de
seconde génération) et Refacto (FVIII recombinant B-délété de troisième génération). Les
cellules ont été activées par du LPS (1 µg/mL) et incubées avec les différents FVIII pendant 24
heures. (B) : les cellules ont été activées par le LPS (1 µg/mL) et incubées avec différentes
conditions pendant 24 heures : FVIII, vWF, vWF + FVIII, FIX. (C) : Les cellules ont été
incubées avec du FVIII et activées avec différents PRR pendant 24 heures : TLR-2 (cellules
HKLM), TLR-4 (LPS) et TLR-5 (Flagelline). (D) : les cellules ont été activées par du LPS (1
µg/mL) et incubées avec du FVIII et différents anticorps anti-domaines : GMA-8015 (anti-A2),

152
BO2B11 (anti-A2), BO2C11 (anti-C1) et LE2E9 (anti-C2). Les valeurs représentent les
moyennes de trois essais effectués en double avec des THP-1 Blue NF-κB. Les écarts-type
indiquent la déviation standard. *** = p < 0,0001, ** = p < 0,001, * = p < 0,01, ns = non
significatif. LPS : lipopolysaccharide ; FVIII : facteur de la coagulation VIII ; vWF : facteur
de von Willebrand ; FIX : facteur de la coagulation IX ; DO : densité optique

Dans la suite de cette étude, nous nous sommes intéressés plus particulièrement à une
étape de la voie de signalisation du NF-κB, qui est sa translocation dans le noyau, en présence
de FVIII.

Les THP1 (1x106 cellules par puit d’activation) ont été activés par le LPS (1 µg/mL)
et incubés en présence de différents facteurs de la coagulation : FVIII, vWF ou FIX. Après
incubation et activation, les cellules ont été récupérées et traitées selon les instructions du
fournisseur du kit de translocation Amnis NF-κB. 5 000 évènements ont été acquis sur un
appareil d’ImageStream et la localisation nucléaire a été analysée. Le contrôle “Medium”
correspond à une incubation de 24 heures en l’absence de facteur de la coagulation et sans
activation par LPS.

La présence de FVIII induit une diminution de près de 50% de la translocation du NF-

κB dans le noyau (Figure 5). On ne retrouve pas d’effet des autres facteurs de la coagulation
sur cette translocation. Sans activation par le LPS, il n’y a pas ou peu de translocation dans le
noyau.

153
Figure 5 : Effet du FVIII sur la translocation du NF-κB dans le noyau. Les cellules THP1 ont
été activées avec du LPS (1 µg/mL) et incubées avec différents facteurs de la coagulation
(FVIII, vWF et FIX) pendant 3 heures. Après activation et incubation, les cellules ont été
traitées selon les instructions du fournisseur du kit NF-κB translocation kit pour AMNIS
(Merck). 5 000 évènements ont été acquis sur un appareil Image Stream en utilisant le laser
d’excitation 488 nm. Un masque de translocation a été créé pour l’appliquer à chacune des
conditions. LPS : lipopolysaccharide ; THP-1 : monocytes humains ; FVIII : facteur de la
coagulation VIII ; vWF : facteur von Willebrand ; FIX : facteur de la coagulation IX

4. L’inhibition de l’endocytose bloque l’effet anti inflammatoire du FVIII.

Sur un test préliminaire en AMNIS, nous avons voulu regarder en AMNIS la

localisation potentielle du FVIII sur la cellule. Quand les cellules ne sont pas activées par le
LPS, on retrouve un marquage ponctiforme du FVIII dans le cytoplasme en présence de FVIII.
Cependant, quand les cellules sont activées par le LPS, ce marquage n’est pas retrouvé. Cela
peut laisser penser que le FVIII pourrait être internalisé avec l’activation par le LPS (données
non présentées).

Pour exploiter cette hypothèse, nous avons alors incubé les cellules THP-1 (1x107
cellules par puit d’activation) avec du FVIII et activé par du LPS (1 µg/mL) pendant 6 heures.
Du dynasore (1 µg/mL) a été ajouté pendant 30 minutes à 37°C. Le dynasore permet un blocage
de l’endocytose. Le contrôle “LPS” correspond à une incubation de 6 heures en l’absence de
facteur de la coagulation et activation par le LPS. Les surnageants ont été prélevés et la
sécrétion de cytokine (TNF-α) a été analysée par test ELISA.

154
 Quand il y a ajout de dynasore, nous retrouvons une restauration de l’expression
cytokinique du TNF-α, similaire à celle avec le LPS seul (Figure 6). Il y a moins de diminution
du TNF-α, contrairement à la condition LPS + FVIII.

1500 *
*** Medium
**
LPS
[TNF] (pg/mL)

1000

500

Figure 6 : Effet du dynasore et du FVIII sur l’endocytose. Les cellules THP1 ont été activées
par du LPS (1 µg/mL) et incubées avec du FVIII pendant 6 heures. Du dynasore (1 µg/mL) a
été ajouté pendant 30 minutes à 37°C. La sécrétion de la cytokine TNF-α a été analysée par
ELISA dans les surnageants de culture. Les valeurs représentent les moyennes de trois essais
effectués en double avec des THP-1. Les écarts-type indiquent la déviation standard. *** = p
< 0,0001, ** = p < 0,001, * = p < 0,01. LPS : lipopolysaccharide ; FVIII : facteur de la
coagulation VIII ; THP-1 : monocytes humains ; TNF-α : tumor necrosis factor α

155
156
DISCUSSION ET
CONCLUSION

157
158
 La physiopathologie de l’arthropathie hémophilique est à ce jour incomplète. Dans
l’hémophilie, l’hémarthrose est la complication la plus fréquente. Les patients vont présenter
des saignements à répétition et les saignements intra-articulaires répétés entrainent la
destruction progressive de l’articulation. Les cellules résidentes, les FLS, sont donc exposées
de manière répétée au sang lors des hémarthroses. L’AH est une forme d’arthrite unique
caractérisée par une interaction répétée entre le sang et les FLS.

Actuellement, il y a deux théories tentant d’expliquer la nature et le type de l’arthrite

rencontrée dans l’AH. D’une part, l’AH résulte d’un processus mécanique similaire à l’arthrose,
avec dans ce cas une implication faible de l’inflammation. D’autre part, l’AH peut être
envisagée comme un processus inflammatoire, similaire dans ce cas à celui de la PR. Nos
différents résultats fournissent des preuves pour la deuxième hypothèse.

Notre hypothèse de travail était de montrer un potentiel effet du sang sur les cellules
résidentes et que certains éléments du sang, comme les facteurs de la coagulation, pourraient
avoir un effet modulateur sur l’inflammation dans le modèle d’AH.

Premièrement, nous avons étudié la réponse des FLS vis-à-vis de la présence de sang.
Deuxièmement, nous avons étudié l’effet des facteurs de la coagulation, en particulier le FVIII,
sur l’inflammation.

1. Réponse des FLS vis-à-vis de la présence de sang dans l’articulation

Notre modèle d’étude est un modèle de cellules résidentes, les FLS. Ces cellules
proviennent de membranes synoviales de patients (obtenues lors d’une intervention
chirurgicale). Cette membrane synoviale est digérée par de la collagénase puis après digestion,
mise en culture dans un milieu spécifique permettant de sélectionner les FLS. En effet, de
manière générale, la membrane synoviale est composée de macrophages like synoviocytes et
de fibroblastes like synoviocytes. Afin de s’assurer d’avoir une population homogène de FLS
pour notre étude, nous avons vérifié le phénotype de ces cellules. Nous avons en particulier
regardé les marqueurs CD55 et CD90, étant des marqueurs spécifiques des FLS (Bartok et
Firestein 2010). Les FLS de patients montrent un profil similaire à ceux de lignées cellulaires
commerciales et aucun autre marqueur de surface n’est exprimé par ces cellules (en particulier
les marqueurs des macrophages CD14 et CD68).

159
 Le profil d’expression cytokinique des FLS de patients hémophiles (HA-FLS) en
comparaison aux FLS de patients non hémophiles (non-HA-FLS) semble être en adéquation
avec la théorie de l’inflammation. En effet, il y a une forte différence d’expression dans les
cytokines impliquées dans l’immunité innée entre HA-FLS et non-HA-FLS. Les HA-FLS
semblent également participer au processus de remodelage osseux. Ils auraient aussi un rôle
dans le recyclage du fer. Cela confirme le rôle central des FLS dans le contrôle de la
physiopathologie de l’AH, le fer étant considéré comme l’acteur principal à ce jour dans la
physiopathologie de l’AH. Il est intéressant de souligner que les HA-FLS ne sécrètent pas d’IL-
1 après activation par le LPS, contrairement aux non-HA-FLS ou aux FLS normaux de lignées
cellulaires ou aux THP1. De la même manière, les HA-FLS ne sécrètent pas de TNF-α. Une
non sécrétion de l’IL-1α par les HA-FLS est paradoxale et les raisons en sont inconnues, alors
que le rôle de l’IL-1β dans la pathogénicité de l’AH est clairement démontré (van Vulpen,
Schutgens, et al. 2015). Lors de la phagocytose des érythrocytes, les monocytes et les
macrophages produisent de l’IL-1β et du TNF-α dans l’articulation après une hémarthrose. Les
FLS pourraient dans ce cas exercer un rétrocontrôle négatif. Concernant le TNF-α, il a été
démontré dans un modèle de PR, que les FLS activés par le LPS ne sécrétaient pas de TNF-α
en raison d’une régulation épigénétique. Récemment, il a été démontré que le TNF-α est un
élément clé de l’inflammation dans l’AH (Haxaire et al. 2018; Manetti et al. 2019). De manière
contradictoire aux deux cytokines précédentes, nous pouvons noter une sécrétion accrue de
l’IL-6 après activation par le LPS chez les HA-FLS. Cela est en adéquation avec des études
précédentes démontrant l’utilité de cibler l’IL-6 dans l’AH (Narkbunnam et al. 2013).

Il n’y a pas sécrétion de certaines cytokines mais on retrouve tout de même une
expression de leurs ARNm respectifs. Le profil de sécrétions cytokiniques des FLS semble être
influencé par l’instabilité de l’ARNm. Nous avons démontré cela après traitement des HA-FLS
par de l’actinomycine D. L’actinomycine D est un intercalant de l’ADN bloquant la
transcription. De ce fait, il y a mise en évidence d’une implication de l’instabilité de l’ARNm
quand après ajout de l’actinomycine D, on retrouve une diminution de l’ARNm de la cytokine
que l’on souhaite analyser. Cependant, plusieurs processus peuvent être impliqués dans la
dégradation de l’ARNm. Nous nous sommes particulièrement intéressés aux miARN dans notre
étude. Pour démontrer l’intervention des miARN dans l’instabilité de l’ARNm chez les HA-
FLS, nous avons éteint DICER, DICER étant une étape enzymatique essentielle pour la
maturation des miARN. Quand DICER est éteint, les HA-FLS activés par le LPS ne présentent
plus d’instabilité pro-inflammatoire de l’ARNm après traitement par l’actinomycine D. Nous

160
avons alors regardé les réseaux transcriptomiques des HA-FLS, en comparaison aux non-HA-
FLS, et activés ou non par le LPS.

En analysant le réseau transcriptomique des miARN dans la condition HA-FLS sans

activation par le LPS, nous pouvons remarquer que certains processus, comme l’angiogénèse,
les modifications ostéocartilagineuses ou bien encore le processus de contrôle inflammatoire,
sont modifiés. Ces résultats confirment que les épisodes répétés d’hémarthroses suffisent à
provoquer des modifications irréversibles de l’articulation et déclenchent le processus de
dégradation articulaire progressive. L’objectif « zéro saignement » est plus que jamais justifié
pour les patients hémophiles pour éviter ces modifications épigénétiques irréversibles dans les
synoviocytes.

Le réseau transcriptomique des miARN des HA-FLS activés par le LPS révèle de
grandes modifications dans le processus inflammatoire et dans la synthèse protéique. Le profil
cytokinique des HA-FLS activés par les LPS semble être sous le contrôle transcriptomique de
certains miARN. La plupart des miARN peuvent contrôler de manière directe ou indirecte
l’expression de cytokines inflammatoires, par les voies NK-κB, PI3K ou JAK/STAT. C’est
principalement le cas pour les miR-146 et miR-196b-5p. De plus, les HA-FLS activés par le
LPS semblent réguler positivement l’expression de cytokines impliquées dans la polarisation
des macrophages, polarisation des macrophages également sous le contrôle du miR-1246. Il
semble y avoir également une modulation de la voie TH-17, mettant en jeu le miR-10b-5p, qui
est impliqué dans la spondylarthrite ankylosante. D’un point de vue clinique, cela pourrait
impliquer que plus les patients hémophiles présentent d’épisodes d’hémarthroses, plus la
réponse inflammatoire synoviale sera élevée.

Des études ont démontré que certains éléments (autres que les concentrés en FVIII ou
FIX) pourraient protéger les patients hémophiles des saignements articulaires. C’est le cas par
exemple du TAFI (Wyseure et al. 2018). Des stratégies pro hémostatiques doivent être
envisagées pour éviter les saignements articulaires chez les hémophiles.

Pour confirmer l’impact du sang sur les changements épigénétiques, nous avons proposé
un modèle d’arthropathie hémophilique in vitro. Pour cela, nous exposons des FLS n’ayant
jamais vu de sang à des expositions répétées de sang sur une période de trois semaines, avec
une exposition chronique au sang répétée tous les 3 jours. Nous regardons par la suite
l’expression des miARN précédemment sélectionnées, en présence ou en l’absence de sang et
avec activation ou non par le LPS. Dans un premier temps, nous avons testé du sang « sain »

161
mais nous souhaiterions également tester du sang provenant de patients hémophiles (avec
différents stades de sévérité de la pathologie). Dans ce modèle, nous observons que les miARN
sélectionnés acquièrent les mêmes profils d’expression que les HA-FLS, dans les conditions
medium ou LPS. Ce modèle pourrait potentiellement prédire en fonction du taux résiduel de
facteur manquant si le patient aura tendance à développer une arthropathie hémophilique et le
cas échéant, qu’elle pourra en être la gravité inflammatoire afin de lui proposer un traitement
préventif en amont. Il serait également intéressant de déterminer avec ce modèle quel serait le
temps nécessaire sans présence de plasma pour restaurer un profil de miARN similaire à celui
des FLS non exposés au sang. Cependant, ce modèle a des limites. En effet, nous sommes avec
un modèle de culture in vitro et les limites de la culture cellulaire sont présentes. Les passages
restreints des FLS sont des facteurs limitants. De plus, nous avons testé le même volume de
plasma, à des temps similaires. En clinique, le patient peut présenter des hémarthroses plus ou
moins importantes en terme de volume et sur des périodes plus ou moins longues. Les cellules
sanguines sont donc en concentration différente et cela peut moduler la signature des FLS et
expliquer des variabilités inter individuelles.

Dans notre étude, nous nous intéressons à des cellules, les FLS, qui dans les conditions
non pathologiques ne sont jamais en contact avec le sang, et nous regardons l’effet du sang de
manière répétée sur ces cellules. Il pourrait être intéressant d’étendre ce concept d’interaction
entre le sang et des cellules qui dans des conditions normales n’interagissent pas avec le sang.
Par exemple, le concept pourrait être étendu aux cellules neuronales et microgliales en contact
avec le sang lors de saignements intra-crâniens. Cela pourrait apporter un plus dans la
prévention de certains sports de contact tels que la boxe, le football américain ou encore le
rugby.

Cette étude nous montre que les cellules résidentes des articulations de patients
hémophiles développent un aspect pro-inflammatoire unique, proche de celui de la PR, en
raison de modifications épigénétiques dues aux épisodes répétés d’hémarthroses. Ce travail
ouvre la perspective de stratégies thérapeutiques ciblant les cytokines pro inflammatoires pour
préserver l’articulation.

162
2. Effet des facteurs de la coagulation, en particulier le FVIII, sur l’inflammation

De la même manière que dans la partie précédente, le profil d’expression cytokinique

des FLS de patients hémophiles (HA-FLS) en présence de FVIII en comparaison aux FLS de
patients hémophiles en l’absence de FVIII semble être en adéquation avec la théorie de
l’inflammation. En effet, il y a une forte différence d’expression dans les cytokines impliquées
dans l’immunité innée entre ajout ou non de FVIII. Le FVIII semble avoir un rôle de modulateur
négatif de l’inflammation, mais également du point de vue du remodelage osseux et dans le
recyclage du fer. Le rôle potentiellement anti inflammatoire du FVIII est ubiquitaire puisque le
même profil d’expression cytokinique est retrouvé dans tous les types cellulaires. En effet, la
sécrétion des cytokines pro inflammatoires qui ont été dosées en particulier (IL-6 et TNF-α) est
diminuée en présence de FVIII. De plus, l’expression en ARNm de ces cytokines pro
inflammatoires est également réduite en présence de FVIII. Les expressions en ARNm et
protéiques sont alors corrélées suite à l’ajout de FVIII.

Il est intéressant de noter que ce rôle nouvellement mis en évidence pour le FVIII n’est
pas retrouvé pour d’autres facteurs de la coagulation, en particulier pour le FIX. Il est admis
que les patients hémophiles B présentent moins de complications inflammatoires que les
patients hémophiles A (Blobel et al. 2015). On peut alors penser que le FVIII non déficient chez
les hémophiles B aurait potentiellement un rôle protecteur ; alors que les hémophiles A
n’auraient pas de composante intrinsèque par l’intermédiaire du FVIII pour se protéger de
l’inflammation. Quand les cellules ont été incubées en présence de vWF, il n’y a pas de
modification de l’expression de la voie du NF-κB, le vWF n’exerce pas le même effet que le
FVIII. Il est intéressant de noter qu’en cas d’incubation conjointe entre vWF et FVIII, une
diminution du signal de la voie de signalisation est retrouvée. Cela pourrait signifier que le
domaine impliqué dans l’effet anti inflammatoire du FVIII n’est pas le même domaine qui est
impliqué dans la liaison du FVIII au vWF et que l’effet serait potentiellement relié à une forme
circulante hétérodimérique du FVIII non stabilisé par le vWF (Schambeck et al. 2004).

Concernant l’analyse de la structure du FVIII, le domaine B n’est pas impliqué dans

l’effet anti inflammatoire du FVIII. En effet, l’utilisation d’un FVIII complet ou B délété donne
exactement les mêmes résultats, ce qui suggère que cette nouvelle fonction mise en évidence
du FVIII n’est pas portée par le domaine B. Il reste alors les domaines A et les domaines C. Les
domaines C semblent être ceux impliqués dans le rôle anti-inflammatoire du FVIII. On sait que

163
les domaines C portent des sites de liaison pour le vWF (Saenko et al. 1994) mais également
que le domaine C2 se présente sous la forme de deux conformations (Smith et al. 2019). Il
pourrait donc tout à fait être admis que l’une de ces conformations pourrait être impliquée dans
ce que nous démontrons dans notre étude. Pour conforter cette étude, il serait intéressant de
tester différents mutants de FVIII pour ces domaines. Les premiers résultats obtenus sont en
adéquation avec ce que nous avons démontré, la partie du FVIII porteuse du rôle dans
l’inflammation réside dans les domaines C.

Afin d’avancer dans le mécanisme d’action, nous avons testé différents PRR. Il est
intéressant de noter que l’effet du FVIII est retrouvé pour le TLR-2 et le TLR-4 et qu’aucun
effet n’est retrouvé pour le TLR-5. Si on se base sur les différences entre ces TLR, il apparait
que TLR-2 et TLR-4 ont besoin conjointement de Myd88 et de TIRAP pour ensuite induire
l’activation de la voie de signalisation alors que seul Myd88 est indispensable pour TLR-5.
Nous pouvons donc penser que nous avons un mécanisme d’action dépendant de TIRAP. Il
serait intéressant d’inhiber chacune de ces protéines seules et ensuite conjointement afin de
conforter l’hypothèse. Nous avons tenté de réaliser des siARN de Myd88, de TIRAP et de
Myd88 + TIRAP mais les premiers résultats obtenus sont difficilement interprétables et nous
ne pouvons pas en tirer de conclusion. Il serait également envisageable de réaliser des
expériences de confocal afin de déterminer la co-localisation du FVIII avec Myd88 ou TIRAP.
Les FLS sont un bon modèle cellulaire pour réaliser ces expériences.

L’activation de la voie du NF-κB induite par le LPS mène à diverses sécrétions de

cytokines et de chemokines. Il a été démontré que le dynasore n’a pas d’influence précoce sur
NF-κB (à 6 heures d’incubation par le LPS) (Yanyan Wang et al. 2012). Le dynasore est une
molécule qui inhibe la dynamine et régule l’endocytose (en inhibant l’endocytose)
(Kirchhausen, Macia, et Pelish 2008). Lorsque l’on inhibe l’endocytose et que l’on incube les
cellules en présence de FVIII, il y a moins de diminution de l’inflammation. Le FVIII semble
donc endocytosé car il perd sa fonction quand l’endocytose est bloquée. Il serait intéressant de
réaliser une expérience en suivant le FVIII en temps réel et en particulier en regardant dans les
endosomes.

Parallèlement à la recherche du mécanisme d’action, nous avons réalisé un

transcriptome sur plusieurs types cellulaires différents (FLS de 3 patients hémophiles, FLS
normaux et cellules THP1), cellules activées ou non par du LPS et en présence ou non de FVIII.
L’objectif est de se rendre compte de l’effet du FVIII de manière plus générale et d’avoir une

164
vision globale. L’analyse est actuellement en cours et semble conforter l’idée que le FVIII
interagit fortement dans les mécanismes inflammatoires.

Le FVIII pourrait avoir un rôle inflammatoire et avoir un impact sur la voie NF-κB,
indépendamment de son rôle dans la voie de la coagulation. Les mêmes études ont été menées
avec le FIX et le vWF mais ils ne présentent pas le même profil que le FVIII.

Cette étude montre que le traitement de l’arthropathie hémophilique doit s’articuler

autour de deux axes : acquérir l’objectif « zéro saignement » et avoir un effet anti-
inflammatoire dans l’articulation. La thérapie génique AAV FVIII/FIX en hémophilie semble
être un candidat prometteur permettant de vérifier ces deux objectifs. En effet, des études
récentes montrent l’efficacité de la thérapie génique chez les patients hémophiles sur des études
cliniques. En hémophilie A, le vecteur de transfection AAV5-hFVIII-SQ permet d’obtenir un
taux de FVIII moyen autour des 50% après 3 ans d’administration de la thérapie génique chez
13 patients (Rangarajan et al. 2017). Dans l’hémophilie B, la perfusion du SPK9001-FIX Padua
a prolongé l’expression thérapeutique de l’activité coagulante du FIX en moyenne de 33,7% et
a permis de mettre fin à la prophylaxie initiale et à la quasi-élimination du saignement et de
l’utilisation de facteurs chez 10 patients hémophiles B sévères (George et al. 2017). De plus,
les adénovirus ont un tropisme pour les cellules articulaires et en particulier les synoviocytes,
les cartilages et les cellules osseuses. De nombreuses publications ont également démontré la
faisabilité de la thérapie génique dans différents modèles d’arthrite et ont montré l’efficacité du
transfert de gènes d’AAV dans les synoviocytes (Apparailly et al. 2005; Adriaansen et et al
2015; Mingozzi et al. 2013). Dans la suite de mon projet, nous aimerions démontrer que, dans
l’hémophilie, la thérapie génique avec les vecteurs AAV FVIII/FIX permet d’obtenir une
production intra-articulaire anti-inflammatoire de FVIII/FIX par des FLS transfectés, pouvant
conduire à une amélioration des articulations des patients. L’efficacité potentielle de la thérapie
génique dans l’arthropathie hémophilique en tant qu’anti inflammatoire n’a pas été encore
publiée ni même soumise. Ce projet a pour but de venir confirmer les données déjà publiées en
thérapie génique dans l’hémophilie, mais surtout viendra s’inscrire dans la continuité de mon
projet mené lors de cette thèse. Ce projet fournirait des données préliminaires sur la possibilité
d’améliorer le statut articulaire des patients admissibles à différents programmes de thérapie
génique de l’hémophilie. En effet, seuls les patients hémophiles adultes sont éligibles pour la
thérapie génique et la majorité d’eux ont déjà une ou plusieurs articulations atteintes
d’arthropathie.

165
 Notre étude montre que le FVIII isolé présente un rôle anti-inflammatoire
indépendamment de la coagulation. Nous souhaiterions démontrer également que le plasma de
patients présente le même potentiel anti-inflammatoire corrélé aux taux de FVIII plasmatique.
Pour cela, nous proposons de mettre au point un modèle de culture cellulaire en mettant les
cellules en présence de plasma (hémophiles sévères, modérés, mineurs, non hémophiles,
présentant d’autres types de déficits hémorragiques, sains, etc) à différentes concentrations et
durant différents temps d’incubation. A la suite de ces différentes conditions, les cytokines pro
inflammatoires seront alors dosées afin d’établir une potentielle corrélation entre le taux de
FVIII plasmatique et le taux d’inflammation. A l’heure actuelle, 27 plasmas sont disponibles
au laboratoire et les résultats préliminaires montrent que l’ajout de plasma sain (avec un taux
de FVIII normal) entraine une diminution de l’expression de cytokines pro inflammatoires. On
retrouve donc le même effet pour le FVIII plasmatique que celui que nous avons démontré pour
le FVIII isolé.

Par la suite, l’utilisation de modèles murins déficients en FVIII (déficience partielle ou

totale) pourra être proposée. Ces souris seront croisées avec différents modèles inflammatoires.
L’objectif est de confirmer l’impact du FVIII sur l’inflammation in vivo.

166
ANNEXES

167
168
Poster ASH 2017 (American Society of Hematology - Atlanta)

169
Abstract communication orale SFH 2018 (Société Française d’Hématologie
- Paris)

Signature inflammatoire unique dans l’arthropathie hémophilique : changements

épigénétiques dus à l’interaction entre le sang et les fibroblastes-like synoviocytes

Contexte : Les patients hémophiles peuvent présenter des saignements au niveau des
articulations ; ces saignements se produisent principalement dans les grosses articulations telles
que le genou, le coude ou la cheville. La succession d’hémarthroses entraîne une arthropathie
irréversible nommée arthropathie hémophilique (AH) alors caractérisée par une destruction
complète et progressive de l’articulation avec douleur permanente, troubles musculo-
squelettiques et une mauvaise qualité de vie. La physiopathologie de cette maladie reste non
élucidée à ce jour. Certaines données suggèrent que l’AH et la polyarthrite rhumatoïde (PR)
peuvent partager une pathogénicité similaire, comprenant l’élévation des cytokines
inflammatoires, une prolifération de la synovite et une destruction du cartilage. Cependant, dans
ces deux maladies, l’origine de l’inflammation diffère et est liée à l’auto-immunité dans la PR
et au saignement dans l’AH. L’AH est le seul modèle d’arthropathie dans lequel les cellules
résidentes, comme les fibroblastes-like synoviocytes (FLS), sont directement en contact avec
le sang. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que les FLS dans l’AH pourraient avoir
une signature inflammatoire unique à la suite d’un contact avec le sang.

Matériel et Méthodes : Des FLS humains ont été isolés à partir de tissus synoviaux de cinq
patients AH différents et de deux patients non AH au moment de la synovectomie
arthroscopique de l’articulation du genou ou de la cheville après obtention du consentement
éclairé de ces patients. Les expériences avec des cultures de FLS ont été effectuées entre le
troisième et le neuvième passage. Les cultures sont constituées d’une population homogène de
FLS durant ces passages. La lignée de cellules THP-1 a été utilisée comme témoin.

Résultats : Les FLS de patients hémophiles présentent un profil cytokinique inflammatoire

unique.

170
 - Des FLS (5x105 cellules) ont été activés ou non (milieu seul) par du LPS (Salmonella
Abortus Equi, 1 µg/mL) pendant 6 heures et les surnageants récupérés ont été analysés
par ELISA. Un ELISPOT sur un panel de 105 cytokines différentes a également été
mené. Après stimulation par le LPS, les FLS de patients hémophiles montrent un profil
de sécrétion cytokinique unique, qui diffère de celui des FLS de patients non hémophiles
et de la lignée cellulaire THP-1. Cela inclut les cytokines IL-1α, IL-6 et IL-8 impliquées
dans l’immunité innée, les cytokines IFN-γ, IL-5, IL-17A et IL-22 impliquées dans
l’immunité adaptative et les cytokines MCP-1, M-CSF, MIF et MIP-3α impliquées dans
la polarisation des macrophages.
- L’expression constitutive d’ARN messager d’IL-1 et d’IL-6 est décelable dans toutes
les cellules, mais en revanche, comme cela avait été déjà montré, on ne retrouve pas
d’ARN messager du TNF-α. Pour comprendre les mécanismes responsables de la
disparition de la synthèse de la protéine IL-1 dans les FLS de patients hémophiles
activés par le LPS, les cellules ont été incubées avec du LPS pendant 6 heures et ensuite
avec 5 µg/mL d’actinomycine D. Après 2 heures de traitement par l’actinomycine D,
l’ARN messager de l’IL-1 est diminué chez les FLS hémophiles activés par le LPS
contrairement aux FLS non hémophiles et aux cellules THP1 activées par le LPS. Ces
résultats indiquent que l’ARN messager de l’IL-1 synthétisé de novo a une demi-vie
courte dans les FLS hémophiles activés par le LPS.
- Puisque l’ARN messager des cytokines semble être instable, nous avons ensuite étudié
l’implication des micro-ARN dans la régulation des cytokines. Une analyse de
miRNOME (Transcriptome Profiling miRNA, AFFYMETRIX) a montré que
l’expression des miARN est différentes entre FLS hémophiles et non hémophiles. Cinq
miARN présentent une différence d’expression (hsa-miR664b-5p, hsa-miR4516, hsa-
miR4289, hsa-miR6719-3p, hsa-miR675-5p), ces miRNA ciblent potentiellement
l’ARN messager impliqué dans les voies inflammatoires (NFKB, MPK, Wnt/bêta-
caténin).

Conclusion : Notre étude démontre pour la première fois que la présence de sang au contact
des FLS peut induire des changements épigénétiques durables pouvant participer à la
physiopathologie de l’AH.

171
 Abstract communication orale EAHAD 2018 (European Association for
Haemophilia and Allied Disorders - Prague)

Unique Inflammatory Signature in Hemophilic Arthropathy: Epigenetic Changes Due to

Interaction between Blood and Fibroblast-like Synoviocytes

Sandra Mignot1*, Chantal Rothschild, MD2*, Annie Harroche, MD2*, Julien Even, MD3*,
Nicolas Cagnard, PhD4*, Audrey Rapinat, PhD5*, Olivier Hermine, MD, PhD1,2* and Laurent
Frenzel, MD, PhD1,6*

1
Institut Imagine, INSERM U1163, CNRS ERL 8254, Paris, France; 2Hematology Department
/ Hemophilia Center, Necker University Hospital, AP-HP, Paris, France; 3Orthopedic surgery,
Cochin Hospital AP-HP, Paris, France; 4Bioinformatic platform, SFR Necker, Paris, France;
5
Genomic Platform, Institut Curie, Paris, France; 6Hematology Department / Hemophilia
Center, INSERM U1163, CNRS ERL 8254, Paris, France

Context: Severe recurrence of hemarthrosis leads to irreversible arthropathy called hemophilic

arthropathy (HA). Physiopathology of blood joint disease remains unclear. Some data suggest
that HA and rheumatoid arthritis (RA) may share similar pathogenicity including elevation of
inflammatory cytokines, chronic proliferative synovitis and cartilage destruction. However, in
these two diseases the origin of inflammation differs. HA is the unique model of arthropathy in
which resident cells like fibroblasts-like synoviocytes (FLS) are directly in contact with blood.
Therefore, we hypothesized that FLS in HA could have a unique inflammatory signature as a
consequence of contact with blood.

Materials and methods : Human FLS were isolated from synovial tissues from different HA
patients and non-HA patients at the time of knee or ankle joint arthroscopic synovectomy. THP-
1 cells line has been used as a control.

Results : FLS from hemophilic patients have a singular inflammatory cytokines profile

FLS were activated or not with LPS and activated-cells supernatants were analyzed by ELISA
and ELISPOT. After LPS stimulation, HA FLS expressed a unique profile of cytokines
secretion, which differs from no-HA FLS and THP-1 cell line, including cytokines involved in

172
innate immunity, in adaptive immunity and in macrophages polarization. Constitutive
expression of IL-1 and IL-6 mRNA was detectable in all cells, but in contrast, no TNF-α mRNA
was detectable. To investigate mechanisms responsible for the lack of IL-1 protein synthesis in
LPS-activated HA FLS, cells were incubated with LPS and then with actinomycin D. After
actinomycin D treatment, IL-1 mRNA became lower in LPS-activated HA FLS versus LPS-
activated no-HA FLS and THP-1 cells. These results indicate that de novo synthesized IL-1
mRNA has a short half-life in LPS-activated HA FLS. Since cytokines mRNA seems to be
unstable, we then investigated microRNA involvement in the regulation of cytokines. A
miRNOME analysis showed that miRNAs expression was different between HA and no-HA
FLS. Some have a very high difference in expression, which potentially target mRNA involved
in inflammatory pathways. Two of these miRs (hsa-miR146a-5p and hsa-miR34a-3p) are
known to have a role in the pathophysiology of RA.

In conclusion our study demonstrates that the presence of blood in contact with FLS may
induce durable epigenetic changes that may participate to the pathophysiology of hemophilic
arthropathy.

173
Poster ASH 2019 (American Society of Hematology - Orlando)

174
Poster EAHAD 2019 (European Association for Haemophilia and Allied
Disorders – La Haye)

175
176
BIBLIOGRAPHIE

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200
 Mécanismes de contrôle de l’inflammation dans l’arthropathie hémophilique par les
fibroblastes-like synoviocytes (FLS) et le FVIII

par Sandra MIGNOT

Résumé : L’arthropathie hémophilique (AH) est une des complications de l’hémophilie et la
physiopathologie de cette maladie reste incomplète à ce jour. La présence de sang dans la
cavité articulaire est l’élément principal permettant de différencier l’AH des autres types
d’arthrites. Nous avons pu démontrer que la présence de sang en contact direct avec les FLS
induit des changements épigénétiques durables et participant vraisemblablement à la
pathophysiologie de l’AH. Ce travail démontre l’importance de limiter voire empêcher les
saignements articulaires chez les patients hémophiles, pour préserver leur capital articulaire.
Cela pourrait donc supporter l’hypothèse du « zéro saignement ». Le plasma des patients
hémophiliques aurait un impact sur l’inflammation intra articulaire du fait de l’absence en
facteur de la coagulation. Le FVIII présenterait un effet anti-inflammatoire et cet effet serait
dépendant des protéines myd88 et TIRAP. L’ensemble de ces travaux ont permis de mettre en
évidence un rôle important de l’inflammation de la synoviale chez les patients hémophiles,
notamment par l’intermédiaire des cellules résidentes qui acquièrent ce phénotype en raison
de la répétition des saignements. Le contact du sang avec les FLS engendre des modifications
épigénétiques durables pouvant être majorées par l’absence de FVIII qui aurait lui un rôle anti
inflammatoire.
Mots clés : arthropathie hémophilique ; FLS ; microARN ; FVIII ; myd88 ; TIRAP

Mechanisms of control of the inflammation in haemophilic arthropathy by fibroblast-like

synoviocytes (FLS) and FVIII

by Sandra MIGNOT
Abstract : Hemophilic arthropathy (HA) is one of the complications of hemophilia and the
pathophysiology of this disease remains unclear. The main difference in HA from other types
of arthritis is the presence of blood in the joint. We have demonstrate that the presence of
blood in direct contact with FLS induces epigenetic changes and participates in the
pathophysiology of HA. This work demonstrates the importance to prevent joint bleeding to
preserve the joint capital. This could therefore support the « zero bleeding » hypothesis. The
plasma of hemophilia patients could have an impact on intra articular inflammation due to the
lack of a coagulation factor. FVIII had an anti-inflammatory effect and this effect would be
dependent on the proteins myd88 and TIRAP. All of this work has made it possible to
highlight an important role of inflammation of the synovium in hemophiliac patients, in
particular through the intermediary of the resident cells, which acquire this phenotype due to
the repetition of bleeding. Contact of the blood with the FLS causes epigenetic modifications
which can be increased by the absence of FVIII which would have an anti-inflammatory role.
Key words : hemophilic arthropathy ; FLS ; microRNA ; FVIII ; myd88 ; TIRAP

201