UFR de Medecine Paris 7 - Denis Diderot

P2 - Hmatologie

Physiologie et exploration de lHmostase

Annie BEZEAUD

- 2011

Janvier 2011 Annie BEZEAUD

Plan

HEMOSTASE : PHYSIOLOGIE Hmostase primaire I - Les intervenants II -. Les diffrentes tapes Coagulation plasmatique I - Les protines plasmatiques II - Le rle de la vitamine K dans la synthse des protines de la coagulation III - Initiation par le facteur tissulaire IV - Le rle des cofacteurs protiques de la coagulation V - Phase contact VI - Formation du caillot de fibrine VII - Rsum des tapes La fibrinolyse Inhibiteurs physiologiques I - Contrle de lactivation des plaquettes II - Contrle de la coagulation plasmatique HEMOSTASE : EXPLORATION I - Hmostase primaire II - Coagulation plasmatique III - La fibrinolyse INTERROGATOIRE ET EXAMEN DU PATIENT PRESENTANT UN SYNDROME HEMORRAGIQUE

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Rfrences : Hmatologie et transfusion, Connaissances et pratique, J.P. Lvy, B. Varet, J.P. Clauvel, F. Lefrre, A. Bezeaud, M.C. Guillin, Masson, Paris, 2008, Chapitre 23 et 24. Plan de cours 2011 Site web: http://www.hemostasep2.geht.org

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HEMOSTASE : PHYSIOLOGIE

DEFINITION

L'hmostase est un processus physiologique qui regroupe l'ensemble des phnomnes dclenchs par une lsion vasculaire et destins limiter les pertes sanguines au niveau de la brche vasculaire.

aCE

Plaquette b-

Flux

Vaisseau intact: Pas de contact plaquettes ou facteurs de coagulation avec Le sous-endothlium

Blessure vasculaire: Saignement = Exposition du sous-endothlium au contact du sang (plaquettes, facteurs de coagulation)

cFibrine

Plaquettes agrges
Thrombus hmostatique: Plaquettes agrges + rseau de fibrine = Arrt du saignement

a) Dans un vaisseau intact, le sang reste fluide. Les plaquettes ne sont pas actives par l'endothlium et il ny a pas de contact des facteurs de coagulation avec le sous-endothlium. b) Un traumatisme cre une brche vasculaire qui rompt la continuit de la mono-couche de cellules endothliales et expose les structures sous endothliales au contact du sang. c) Ce contact avec le sous-endothlium entrane l'adhsion et l'activation des plaquettes au site de la lsion ainsi que l'activation de la coagulation conduisant la formation de fibrine : le thrombus fait de plaquettes agrges et de fibrine comble la brche vasculaire et arrte le saignement, et permet la cicatrisation. Le processus de fibrinolyse permettra la redissolution du caillot et la repermabilisation du vaisseau.

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Les principales caractristiques de la coagulation du sang Un vnement provoqu (lsion vasculaire) Localis la brche vasculaire Le thrombus hmostatique (plaquettes + fibrine) rsulte dune succession de ractions enzymatiques se droulant sur une surface phospholipidique (plaquettes actives) Ces ractions enzymatiques sont des protolyses limites qui convertissent des pro-enzymes en enzymes Important processus dauto-amplification (rapidit = efficacit) Contrle ngatif limitant la diffusion distance de la brche Le thrombus hmostatique permet la cicatrisation La fibrine est ensuite dissoute (fibrinolyse) Schmatiquement on distingue : - hmostase primaire (adhsion/activation/agrgation des plaquettes) et - activation de la coagulation plasmatique, mais les 2 phnomnes sont simultans et interdpendants.

Hmostase primaire
I - LES INTERVENANTS Une surface catalytique = les plaquettes actives. Succession dvnements aboutissant la formation dun agrgat de plaquettes sur la brche vasculaire Fait intervenir : - Le vaisseau - Les plaquettes et des rcepteurs - Le facteur Willebrand (circule li au F.VIII) - Le Fibrinogne 1) Le vaisseau

Structure schmatique dun vaisseau

La paroi du vaisseau comporte 3 tuniques concentriques. A partir de la lumire vasculaire se trouvent l'intima, la mdia puis l'adventice. L'intima (la tunique la plus interne) est forme de l'endothlium et du sousendothlium. L'endothlium est constitu d'une monocouche de cellules endothliales qui empche le sang dentrer en contact avec le sous-endothlium thrombogne.

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La cellule endothliale est non thrombogne : elle protge de l'activation des plaquettes, elle rgule ngativement la coagulation et synthtise des protines du systme fibrinolytique.

Le sous-endothlium est thrombogne : il va permet l'adhsion des plaquettes et l'activation de la coagulation. Il est compos de macromolcules synthtises par la cellule endothliale sus-jacente : collagnes, microfibrilles, fibronectine, thrombospondine, facteur Willebrand, glycosaminoglycanes.

2) Les plaquettes Formes dans la molle osseuse partir du mgacaryocyte, ce sont des structures discodes, anucles (150 400 G/l). Leur dure de vie est de 8 10 jours. Aprs leur mort, elles sont phagocytes par les macrophages essentiellement de la rate, du foie, de la molle osseuse. Des granules sont prsents dans le cytoplasme des plaquettes : - les granules contiennent des protines. Certaines sont spcifiques de la plaquette (facteur 4 plaquettaire, thromboglobuline) ou non (fibronectine, thrombospondine, fibrinogne, facteur Willebrand et autres facteurs de la coagulation, des facteurs de croissance, des inhibiteurs de la fibrinolyse, des immunoglobulines). - les granules denses contiennent de l'ADP, du calcium et de la srotonine. Le contenu des granules sera scrt via le systme canaliculaire ouvert lors de lactivation. La membrane des plaquettes est forme d'une bicouche de phospholipides dans laquelle sont insrs des rcepteurs pour un certain nombre de molcules (ADP, collagne, thrombine ...). Certains de ces rcepteurs deviennent fonctionnels uniquement aprs activation des plaquettes (ex : GPIIb-IIIa).

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3) Le facteur Willebrand (FW) Scrt par la cellule endothliale, Il est libr a la fois dans le sous endothlium et le plasma. Le FW du sang circulant n'a pas la conformation requise pour se fixer la plaquette, il circule li au facteur VIII qu'il stabilise. Le FW est galement prsent dans les granules alpha des plaquettes. Le degr de polymrisation du FW est fonction de sa localisation: les multimres de grande taille sont prsents dans le sous endothlium o ils ont la conformation ncessaire leur fixation sur la plaquette, le FW des plaquettes qui est aussi sous forme de multimres n'intervient qu'aprs l'activation plaquettaire

4) Le fibrinogne Synthtis par le foie, il est prsent dans le plasma et les granules des plaquettes. Il est la fois indispensable pour l'hmostase primaire o il conditionne l'agrgation des plaquettes, et pour la coagulation o la thrombine, enzyme produite lors de lactivation de la coagulation, le transforme de protine soluble en un rseau insoluble.

II - LES DIFFERENTES ETAPES Ds l'exposition du sous-endothlium par la lsion vasculaire et la mise en contact du sang avec des protines du sous-endothlium, les plaquettes vont s'arrter pour boucher le trou. 1) Adhsion Elle se fait grce au facteur Willebrand (FW) ancr dans le sous-endothlium. La fixation du FW la matrice sous-endothliale induit un changement de conformation permettant sa fixation la plaquette. Le FW sert de COLLE entre le sous-endothlium et la plaquette laquelle il se fixe par l'intermdiaire d'une glycoprotine membranaire : la Glycoprotine Ib (GPIb). (Un dficit en GPIb ou en FW entranera un dfaut d'adhsion des plaquettes donc un saignement.)
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Les plaquettes peuvent galement se fixer directement au collagne du sous-endothlium par lintermdiaire de rcepteurs spcifiques : lintgrine 21, GPVI Le plasma contient une protine de la famille des mtalloprotase : ADAMTS 13 (A disintegrin and metalloprotease with thromboSpondin type 1 repeats), a pour fonction de limiter la taille (et donc le pouvoir adhsif vis--vis des plaquettes) des multimres du FW. 2) Activation Ladhsion des plaquettes au sous-endothlium dclenche des signaux intra-cellulaires qui aboutissent une srie de rponses : 2.1. Les plaquettes changent de forme. Elles deviennent sphriques et forment des pseudopodes. Les granules se regroupent et leurs membranes fusionnent avec celle du systme canaliculaire ouvert. 2.2. Cette fusion permet la scrtion rapide du contenu des granules : . Les granules denses librent leur ADP, puissant agent pro-agrgant, et la srotonine, agent proagrgant et vasoconstricteur. . Les granules librent des protines qui vont participer lagrgation des plaquettes (ex : fibrinogne), ou lactivation de la coagulation (ex : Facteur V). 2.3. Les phospholipides membranaires librent lacide arachidonique qui est transform en thromboxane A2 (TxA2). Deux voies permettent la libration dacide arachidonique et lactivation de la voie des prostaglandines : elles mettent en jeu, selon linducteur (collagne, ADP, thrombine ), la phospholipase C ou la phospholipase A2. La cyclooxygnase (Cox) et la thromboxane synthase transforment lacide arachidonique en thromboxane A2 (TxA2), puissant agent pro-agrgant et vasoconstricteur.

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PO UR E N S A V O I R PL US

L'aspirine est un inhibiteur de la cyclooxygnase (Cox) qui inhibe l'activation des plaquettes en bloquant la production de TxA2 : c'est un antiagrgant plaquettaire. Dans la cellule endothliale, la thromboxane synthase n'existe pas et est remplace par une PGI2 synthase : l'activation conduit la formation, non pas de TxA2, mais de prostacycline (PGI2), un puissant anti-agrgant. L'aspirine peut bloquer la Cox de la cellule endothliale et diminuer la production de PGI2, ce qui limite son effet antithrombotique, mais seulement dose leve : c'est pourquoi l'aspirine est utilise faible dose pour la prvention des accidents thrombotiques.

2.4. Les phospholipides de la membrane plaquettaire subissent des remaniements, avec exposition en surface de phospholipides acides (phosphatidylserine par exemple), essentiels au processus de coagulation.

Pourquoi lactivation des plaquettes cre une surface procoagulante ?

PLT 50 40

Plaquette

Feuillet exoplasmique

30 SM 20 PC 10 PE
PS+PI

SM : Sphingomyline PC : Phosphatidylcholine PS : Phosphatidylsrine PE : Phosphatidylthanolamine PI : Phophatidylinositol PLT : Phospholipides totaux

10 20 30 40 50

Feuillet cytoplasmique

Dans toutes les cellules au repos (y compris les plaquettes), les phospholipides membranaires sont rpartis de faon asymtrique dans les 2 feuillets de la membrane. La phosphatidylsrine (PS) et la phosphatidylthanolamine (PE), deux aminophospholipides, sont squestrs dans le feuillet interne, alors que le feuillet externe est constitu presque exclusivement de phosphatidylcholine (PC) et de sphingomyline.

La membrane joue un rle essentiel dans la communication entre la cellule et son environnement et certains vnements cellulaires sont associs une modification de l'asymtrie membranaire avec exposition en surface des aminophospholipides : c'est ce qui s'observe lors de l'activation des plaquettes ou lors du dclenchement du signal de reconnaissance des cellules apoptotiques par les macrophages.

Pourcentage du total

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Activation cellulaire et vsiculisation

1- Formation de bulles 2- Emission de microvsicules

Phosphatidylsrine

Glycoprotine membranaire

Lors de lactivation des plaquettes, les aminophospholipides sont rapidement transports vers le feuillet externe de la membrane et exposs la surface des plaquettes o ils vont servir de surface d'amarrage des protines vitamine K-dpendantes pour la constitution des complexes enzymatiques de la coagulation.

3) Recrutement des plaquettes - LADP et le TxA2 ont leurs propres rcepteurs spcifiques la surface des plaquettes. La scrtion dADP et la production de TxA2 ont donc pour consquences le recrutement de nouvelles plaquettes et lamplification du processus dactivation plaquettaire. - La thrombine, produite au terme des ractions de la coagulation qui se droulent la surface des plaquettes, est elle-mme un puissant agent pro-agrgant. En se fixant sur son rcepteur et en le clivant, elle permet le recrutement et lactivation de nouvelles plaquettes, et laccroissement du thrombus plaquettaire.

Les consquences de l'activation sont : changement de forme, scrtion, activation de la voie des prostaglandines, exposition des phospholipides acides, recrutement et activation de nouvelles plaquettes.

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4) Agrgation des plaquettes

Lagrgation des plaquettes
IIb3 au repos Poche de liaison du fibrinogne IIb 3 IIb3 active

Fibrinogne

Elle se fait par l'intermdiaire du fibrinogne qui se fixe sur une glycoprotine de la membrane plaquettaire, l'intgrine IIb3 (ou GPIIb-IIIa). Lorsque les plaquettes sont actives, cette glycoprotine adopte une conformation qui lui permet de reconnatre et de fixer le fibrinogne. Le fibrinogne est une protine dimrique, qui possde plusieurs sites de reconnaissance pour GPIIbIIIa active.

plaquette plaquette

Fibrinogne

Ces interactions vont permettre d'accrocher les plaquettes les unes aux autres pour former un agrgat de plaquettes. (Un dficit en GPIIb-IIIa se traduira par un dfaut d'agrgation des plaquettes).

Thrombine

Recrutement de nouvelles plaquettes

Phospholipides procoagulants

Tx A2 ADP

2-Activation /Secrtion

IIb 3 active
3-Agrgation

1-Adhsion

21 GPVI

GPIb
F. Willebrand

Fibrinogne

Collagne

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POUR EN SAVOIR PLUS : Plaquettes et rcepteurs 1 - L'adhsion des plaquettes au vaisseau ls fait intervenir des protines adhsives, qui sont essentiellement le FW et le collagne. Ces protines ont leurs rcepteurs spcifiques. Le FW du sous-endothelium se fixe sur la glycoprotine Ib (GPIb) au sein du complexe GPIbV-IX form de glycoprotines riches en leucines. La liaison du FW la GPIb permet de ralentir le mouvement des plaquettes la surface de la lsion vasculaire et dclenche l'activation des plaquettes, et entre autres, de l'intgrine IIb3 (ou GPIIbIIIa). L'intgrine IIb3 active permet son tour la liaison irrversible du FW aux plaquettes. L'interaction des plaquettes avec le collagne fait intervenir plusieurs rcepteurs membranaires, parmi lesquels l'intgrine 2 1 (ou GPIaIIa) et une protine de la superfamille des immunoglobulines, GPVI.

2 - L'activation des plaquettes par des agonistes solubles fait intervenir essentiellement des rcepteurs coupls aux protines G, composs de 7 domaines transmembranaires. - La thrombine active PAR1, le prototype des membres de la famille des rcepteurs activs par protolyse (PARs pour Protease Activated Receptors). Elle se lie PAR1 et clive l'extrmit N terminale du rcepteur. La nouvelle extrmit N terminale qui est dmasque se lie au rcepteur et induit la signalisation. Elle active aussi PAR3 et PAR4. - Le TxA2 form lors de l'activation des plaquettes va recruter de nouvelles plaquettes et les activer. Il exerce son action en se fixant sur des rcepteurs plaquettaires (TP) qui sont coupls aux protines. - L'ADP qui est libr des granules denses va aussi activer d'autres plaquettes et induire leur agrgation en se fixant sur plusieurs rcepteurs : on en connait au moins 2 actuellement : P2Y1 et P2Y12 qui sont des rcepteurs coupls aux protines G.

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3 - L'intgrine IIb3 a la particularit de devoir tre active avant de lier le fibrinogne. Les signaux intracellulaires (inside/out) permettent un changement de conformation de l'intgrine, qui reconnait alors des squences complmentaires (en particulier une squence Arg-Gly-Asp ou RGD) sur le fibrinogne. La liaison du fibrinogne IIb3 active dclenche son tour des signaux intracellulaires (outside/in). 4 - Dans tous les cas, la liaison des ligands leurs rcepteurs dclenche un processus de signalisation intraplaquettaire. 5 - L'identification des rcepteurs et de leurs mcanismes d'action, a permis de proposer des mdicaments antiagrgants qui ont diffrentes cibles : - Aspirine (inhibiteur de la cyclooxygnase) - Clopidogre, Prasugrel (inhibiteurs de l'activation par l'ADP) - Anticorps anti IIb3 : Abciximab ou ReoPro (inhibiteur de la liaison du fibrinogne IIb3)

POUR EN SAVOIR PLUS : ADAMTS13 Physiologiquement, la mtalloprotase, ADAMTS 13, (A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin type 1 repeats), a pour fonction de limiter la taille (et donc le pouvoir adhsif vis--vis des plaquettes) des multimres du facteur von Willebrand (VWF), une protine de l'hmostase indispensable l'agrgation plaquettaire dans la microcirculation.

Le facteur Willebrand libr par la cellule endotheliale (CE), diffuse dans la circulation ou adhre la CE, ADAMTS13 clive le FVW, transformant ainsi les multimres de trs grandes tailles en produits de taille infrieure, moins actifs. Le purpura thrombotique thrombocytopnique (PTT) est une microangiopathie thrombotique dfinie par la formation spontane dans la microcirculation sanguine de thrombi plaquettaires responsables d'une anmie hmolytique mcanique, d'une thrombopnie de consommation et de signes d'ischmie multiviscrale touchant principalement le rein et le cerveau. Dans le PTT de lenfant (syndrome d'Upshaw-Schulman), il existe un dficit fonctionnel svre en ADAMTS13 (taux plasmatique infrieur 5 %) qui prdispose l'accumulation de grands multimres du VWF dans le plasma et donc la formation spontane de thrombi plaquettaires dans les microvaisseaux.

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la fin de lhmostase primaire:

Plaquettes agrges

Fibrine

= caillot

A RETENIR : Les intervenants : hmostase primaire 3 tapes : adhsion, activation, agrgation Liaison de GpIb-IX-V au facteur Von Willebrand Changement de forme des plaquettes Scrtion du contenu des granules (ADP, fibrinogne) Production de mtabolites: Thromboxane A2 (TxA2) Activation de GPIIbIIIa: liaison du fibrinogne Flip-flop des phospholipides membranaires cad externalisation de phosphatidylsrine ; PS charg (-) qui a la capacit de fixer des protines de la coagulation la surface DONC Prrequis indispensable.

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Coagulation plasmatique
Succession de ractions enzymatiques Aboutit la formation dun rseau de Fibrine Ce rseau enserre lamas de plaquettes fix sur la brche vasculaire Fait intervenir des facteurs de coagulation, des inhibiteurs et une protine membranaire: le facteur tissulaire Coagulation plasmatique et hmostase primaire: phnomnes simultans et complmentaires

I - LES PROTEINES PLASMATIQUES 1) Les facteurs de la coagulation Ce sont des protines plasmatiques, qui sont plus souvent dsignes par des chiffres romains. Ex : prothrombine = Facteur II. Une fois activs, ils portent leur nom suivi du suffixe "a" : ex : Facteur Xa (F.Xa) dsigne le facteur X activ. 1.1. Fibrinogne - Dimre symtrique de 3 paires de chanes A2 / B2 / 2 de 340 kDa - Protine soluble, synthtise dans le foie, prsente dans le plasma et dans les granules des plaquettes 1.2. Zymognes de srine protases (enzymes protolytiques) Facteurs II, VII, IX, X : - Synthtiss dans le foie - Prsents dans le plasma - liaison calcium-dpendante aux phospholipides (-) dtermine par les rsidus Gla (modification post-traductionnelle, vitK-dpendante) - Sites de liaison aux protines (enzymes, co-facteurs) 1.3. Facteur XI (FXII, prkallikrine) - Synthtiss dans le foie, non vitamine K-dpendants, prsents dans le plasma - Domaines de liaison aux phospholipides (ex: domaine Apple A3 du FXI) et aux protines (ex: domaines A2, A3 du FXI et FIX) 1.4. Zymogne dune transglutaminase : FXIII - Ttramre : 2 sous-units A (83 kDa), 2 sous-units B (79.7 kDa) assembles de faon non covalente dans le plasma. . Sous-unit A : synthtise dans le foie, les monocytes, les mgacaryocytes, porte le site actif trans-glutaminase, seule prsente dans les plaquettes (dimre A2), secrte dans le plasma o elle sassocie la sous-unit B. . Sous-unit B : synthtise dans le foie, transporte la sous-unit A dans le plasma. - Le FXIII a une affinit trs importante pour le fibrinogne et la fibrine. 1.5. Les co-facteurs - FV : . Synthtis par les hpatocytes . Prsent dans le plasma (80%) et les granules des plaquettes (20%)

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- FVIII : . Synthse: foie (hpatocyte, CE sinusodale), poumon, rein, rate, cerveau . Prsent dans le plasma sous forme dune srie dhtrodimres (protolyse du domaine B) . Li au facteur Willebrand 1.6. Les facteurs du contact (Facteur XI, XII, Prkallikrine et Kininogne de haut poids molculaire) sont synthtiss dans le foie. 2) Les inhibiteurs plasmatiques 2.1. Antithrombine (AT) Cest une serpine (inhibiteurs des srine protases) synthtise par le foie, active par la liaison aux glycosaminoglycanes de la paroi vasculaire ou lhparine. Les autres serpines : cofacteur II de lhparine, 1 anti-trypsine. 2.2. Systme de la Protine C . Protine C zymogne produit par lhpatocyte. . Protine S cofacteur produit par lhpatocyte et la cellule endothliale. . 2 rcepteurs: Thrombomoduline et EPCR (endothelial protein C receptor). . TFPI (tissue factor pathway inhibitor) est produit par diffrents types cellulaires (cellule endothliale, mgacaryocyte ...). Il appartient la famille des inhibiteurs de type Kunitz (se comporte comme un faux substrat vis--vis de lenzyme). - 2 macroglobuline, 1 antitrypsine. A RETENIR : I - Les protines plasmatiques Facteurs de coagulation Fibrinogne = protine soluble, dimrique, capable de se transformer en un rseau de fibres (caillot). Cest le substrat final de la coagulation Pro-enzymes de la coagulation = - 5 zymognes de srine protases (FII, VII, IX , X, XI), dont 4 (FII, VII, IX , X ) dpendent de la vitamine K pour leur synthse et ont une affinit leve pour les phospholipides (-). - 1 zymogne de transglutaminase, affinit leve pour le fibrin(ogn)e. Co-facteurs V et VIII = affinit leve pour les PL, affinit slective pour une enzyme et son substrat. Les pro-enzymes et co-facteurs doivent subir une protolyse pour acqurir leur activit biologique. Inhibiteurs de la coagulation 3 familles : antithrombine, systme de la PC et TFPI.

II LE RLE DE LA VITAMINE K DANS LA SYNTHESE DES PROTEINES DE LA COAGULATION 1) Vitamine K et fonction des zymognes 1.1. Rle de la vitamine K et du Ca2+ Les protines vitamine K dpendantes subissent dans lhpatocyte les modifications post-traductionnelles qui sont indispensables leur activit fonctionnelle. Elles contiennent leur

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extrmit N terminale 9 12 rsidus carboxyglutamique (Gla). Ces Gla permettent la fixation de ces protines aux phospholipides acides en prsence de Ca2+. Protines vitamine K-dpendantes : - Facteurs de coagulation : FII, VII, IX, X - Inhibiteurs de la coagulation : protines C, S, Z - Protines des tissus minraliss : Matrix Gla-protine (prvention de la calcification des artres et des cartilages), ostocalcine (formation de los) La carboxylation des acides glutamiques (Glu) se fait dans l'hpatocyte. La carboxylase hpatocytaire utilise la vitamine K rduite comme cofacteur, la rduction se fait grce des rductases sensibles au traitement par les antagonistes de la vitamine K (AVK). En l'absence de vitamine K, la carboxylation ne se fait pas et les protines vitamine K-dpendantes ne se lient pas aux phospholipides membranaires. Les traitements par les AVK qui inhibent la carboxylation des Glu, ralentissent la coagulation : les facteurs vitamine K-dpendants ne se fixent plus aux phospholipides membranaires et donc ne sont plus fonctionnels.

Acide glutamique (Glu) COOH CH2 CH2 NH2-CH-COOH

CO2 + O2

Acide -carboxyglutamique (Gla) HOOC COOH

CH2 NH2-CH-COOH

-glutamyl-carboxylase

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A RETENIR : II Le rle de la vitamine K dans la synthse des protines de la coagulation Modification post-traductionnelle : Glu Gla. Rgule par des enzymes membranaires (RE de lhpatocyte). Les Gla permettent la liaison au Ca++ et par cet intermdiaire (pontage + changement de conformation) la liaison des protines (enzyme et substrat) aux phospholipides anioniques (phosphatidylsrine). Concentration de lenzyme et de son substrat sur une surface solide. Augmentent lefficacit catalytique (affinit). 1.2. Principes de l'activation des zymognes Fix la surface des plaquettes actives, un zymogne dpourvu d'activit catalytique sera cliv par une enzyme avec libration d'un peptide inactif et dmasquage du site catalytique. C'est ainsi que dans l'tape finale de la coagulation plasmatique le F. Xa (enzyme) scinde la prothrombine (zymogne) en thrombine (enzyme) et fragment 1+2 (peptide d'activation inactif). L'activation des zymognes se fait en cascade. Ces ractions enzyme-substrat sont lentes en solution ; elles deviennent trs rapides si l'enzyme et le substrat sont fixs sur une surface phospholipidique et en prsence d'un cofacteur. III - INITIATION PAR LE FACTEUR TISSULAIRE L'vnement initial majeur est l'exposition du facteur tissulaire qui permet l'activation du F. VII et le dclenchement de ce qui est appel voie exogne de la coagulation. Le facteur tissulaire (FT) est une protine membranaire synthtise par les fibroblastes prsents dans la tunique externe (adventice) des vaisseaux. Il est distribu de faon trs particulire formant une enveloppe autour du vaisseau, spar du sang par l'endothlium mais prt intervenir en cas de lsion vasculaire. Il est insr dans la bicouche lipidique des membranes des cellules qui l'expriment. Lors d'une lsion vasculaire, le F. VII prsent dans le plasma se fixe sur le FT qui se comporte comme un rcepteur. 1) Activation du F. VII (complexe : FT.VIIa)
Facteur tissulaire (FT): 1- co-facteur de lauto-activation du FVII par le FVIIa

VIIa
SP

VII
SP
EGF2 EGF1

FT

EGF2 EGF1

FT

Gla

Gla

Dans le sang: FVII (pro-enzyme) + traces de FVIIa (inactif en absence de FT.

Phosphatidylsrine (PS)

Fibroblaste

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Facteur tissulaire (FT): 2- co-facteur de lactivation du FIX et du FX par le FVIIa

FIXa, FXa FVIIa

SP
EGF2 EGF2 EGF1 EGF1

FIX, FX

SP
La liaison Ca++ et Gla dpendante entre VIIa, IX, X et PS est indispensable lactivation du IX et du X.

Gla
Ca++

Gla
Ca++

Le complexe FT.VIIa active ensuite le facteur IX et le X, fixs sur les surfaces membranaires, initiant ainsi la voie exogne. Le facteur Xa active la prothrombine (F.II) et produit la thrombine.

FT
Fibroblaste

Phosphatidylsrine (PS)

A RETENIR : III Initiation de la coagulation La coagulation est initie lorsquune protine membranaire, le facteur tissulaire (adventice, epithelium) vient au contact du sang (blessure vasculaire). Insr dans la bicouche de phospholipides membranaires, il interagit avec le VII/VIIa = - auto-activation du VII, - activation du IX et du X par le VIIa. Pathologie : lexpression du FT peut tre induite par les mdiateurs de linflammation dans des cellules circulantes (monocytes) ou vasculaires (cellules endothliales, cellules musculaires lisses).
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2) La propagation et lamplification de la coagulation Les premires traces de thrombine : activent les co-facteurs (FV et FVIII), recrutent et activent de nouvelles plaquettes, activent le FXI.

Fibroblaste

Adventice Sous-endothelium
IX
XIIa XII KHPM KHPM XI XIa PK K

FT VII VIIa IX

F.Willebrand

IXa VIIIa X VIII Xa V Va II

IXa VIIIa X Xa Va II XI
XIa

Thrombine

PAR

Plaquette

Fibrinogne XIII

Fibrine XIIIa

Fibrine stabilise

La thrombine amplifie sa formation

La thrombine a plusieurs actions : - Elle transforme le fibrinogne en fibrine qui stabilise lagrgat de plaquettes. - Elle joue un rle fondamental dans sa propre formation ; d'abord produite lentement, elle va stimuler les plaquettes qui passent proximit pour une exposition plus grande de phospholipides acides membranaires, c'est--dire de surfaces catalytiques. Elle active les cofacteurs V et VIII leur permettant de jouer leur rle d'acclrateur. Elle active le F. XI renforant les ractions qui mnent sa propre production. - La thrombine est aussi capable dactiver tous les types cellulaires, incluant non seulement les plaquettes, mais aussi les leucocytes et les cellules vasculaires. Les rponses cellulaires la thrombine sont dues principalement lactivation des PARs, rcepteurs 7 domaines transmembranaires coupls aux protines G, parmi les 4 PARs identifis, 3 sont activables par la thrombine : PAR-1, PAR-3 et PAR-4. Elle participe ainsi aux vnements qui suivent une lsion vasculaire : raction inflammatoire, remodelage vasculaire et cicatrisation.

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- Elle a aussi un rle inhibiteur de la coagulation en activant la protine C (voir chapitre inhibiteurs ).

IV - LE ROLE DES COFACTEURS PROTEIQUES DE LA COAGULATION Pour que l'activation des zymognes se fasse de faon efficace, il faut que la cohsion des complexes (enzyme-substrat) soit assure par les cofacteurs Va et VIIIa. Les facteurs V et VIII, dont la structure est trs proche, sont prsents dans le sang sous forme inactive. Pour jouer leur rle, ils devront tre activs par la thrombine (ou plus accessoirement par le F. Xa).

Le F. Va et le F. VIIIa se lient troitement aux phospholipides, mais aussi l'enzyme et au substrat de la raction enzymatique dans laquelle ils interviennent. Le F. VIIIa est le cofacteur de l'activation du F. X par le F. IXa et le F. Va est le cofacteur de l'activation de la prothrombine (II) par le F. Xa. (Le F. VIII est complex au FW qui le stabilise en le protgeant de la dgradation in vivo. L'hmophilie A est caractrise par un dficit en F. VIII : les sujets saignent La maladie de Willebrand est caractrise par un dficit en FW, qui a pour consquence un dficit en FVIII : les sujets saignent.)

Lassemblage des complexes enzymatiques de la coagulation

Enzyme Gla
Ca 2+

Substrat Gla Cofacteur

Ca 2+

(-) (-)

(-) (-)

Phospholipides chargs ngativement (phosphatidylsrine)

- une surface membranaire (plaquettes actives) - une srine protase et son substrat, concentrs sur cette surface - un co-facteur protique qui interagit avec la surface phospholipidique et directement avec lenzyme et son substrat

Dans le sang circulant, une molcule d'enzyme a peu de chance de rencontrer son substrat, alors que lorsque les intervenants sont amarrs une surface ils vont se rencontrer ; les cofacteurs se fixent la fois aux phospholipides, l'enzyme et au substrat, ce qui va encore faciliter la raction.

Dans le complexe d'activation form par l'enzyme, le substrat, le cofacteur et les phospholipides acides, les phospholipides augmentent l'affinit de l'enzyme pour le substrat (diminution du Km), tandis que les cofacteurs acclrent considrablement (> 1 000 fois) la raction. La prsence des deux lments (phospholipides et cofacteurs) augmente considrablement l'efficacit catalytique de la raction.

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A RETENIR : IV - Le rle des co-facteurs protiques de la coagulation Liaison aux phospholipides et aux protines (enzyme et substrat). Positionnent le site catalytique de lenzyme en position favorable vis vis de la liaison peptidique cible du substrat. Augmentation +++ de la vitesse de clivage. La phosphatidylsrine et les co-facteurs protiques augmentent ~ 20 000 300 000 fois lefficacit catalytique des ractions enzymatiques de la coagulation.
POUR EN SAVOIR PLUS La vitesse d'une raction enzymatique (V) augmente quand la concentration de substrat (S) s'lve jusqu' une valeur maximale (Vmax). A ce stade tous les sites de fixation du substrat sur l'enzyme sont occups et la vitesse de la raction est limite. Pour la plupart des substrats, la concentration du substrat form 1/2 de Vmax reprsente l'affinit de l'enzyme pour le substrat, c'est le Km ; plus il est bas, plus la liaison est de forte affinit. Exemples de reprsentations graphiques : - Equation de Michaelis Menten : v = (Vmax. S) / (Km + S) - Lineweaver-Burk (double inverse) 1/v = (Km / Vmax). 1/S + 1/Vmax

V - PHASE CONTACT Il existe une autre voie d'initiation de la coagulation dont l'importance est mineure compare l'initiation par le facteur tissulaire. Elle est la consquence du contact de protines plasmatiques avec le sous-endothlium, faisant intervenir 4 protines : les facteurs XII et XI, la prkallikrine (PK) qui sont des zymognes et le kininogne de haut poids molculaire (KHPM) qui joue le rle de cofacteur. Le KHPM et le F. XI circulent dans le sang, lis la PK. En cas de lsion de l'endothlium, ces complexes se fixent au sous-endothlium. La PK est transforme en kallikrine (K) par une protase de la paroi vasculaire. La K active son tour le F. XII qui lui-mme active le F. XI. Le F. XIIa amplifie le processus en activant de faon rtroactive la PK. Le rle de cette voie
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d'activation dans la coagulation est mineur, l'activation rtroactive du F. XI par la thrombine tant beaucoup plus importante.

En revanche, la K active efficacement 3 autres systmes : - Elle clive le KHPM librant un peptide vasoactif puissant : la bradykinine qui entrane hypotension, bronchoconstriction et augmentation de la permabilit vasculaire. - Elle active la pro-urokinase (scuPA) fixe sur son rcepteur (uPAR), produisant l'urokinase (tcuPA) qui transforme le plasminogne (Pg) en plasmine (Pe), une enzyme fibrinolytique. - Elle active le systme du complment, activ galement par le F. XIIa.

VI - FORMATION DU CAILLOT DE FIBRINE La thrombine va convertir le fibrinogne soluble en fibrine insoluble. La fibrine forme une solide enveloppe autour de l'agrgat de plaquettes pour raliser le caillot. 1) Protolyse du fibrinogne par la thrombine Le fibrinogne est constitu de 3 paires de chanes A, B et . La thrombine clive l'extrmit NH2 terminale des chanes A et B et spare ainsi les fibrinopeptides A et B des monomres de fibrine. 2) Polymrisation de la fibrine La libration des fibrinopeptides donne naissance de nouvelles squences N terminales : Gly-Pro-Arg sur les chanes et Gly His Arg sur les chanes des monomres de fibrine. Ces squences s'apparient avec des squences complmentaires sur les chanes et d'un monomre voisin ce qui entrane la formation d'un polymre de fibrine.

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3) Stabilisation Le polymre de fibrine instable doit tre stabilis par le facteur XIIIa. La formation du caillot de fibrine acclre l'activation du F. XIII par la thrombine. Cette activation est rgule par la prsence de Ca2+ et de fibrine qui sert de cofacteur. Le F. XIIIa est une transglutaminase. Il stabilise le caillot en crant des liaisons covalentes glutamine-lysine entre les monomres adjacents. Cette liaison conduit la formation d'un caillot de fibrine trs solide. Le F. XIIIa pourrait intervenir aussi en amarrant le caillot de fibrine des protines du sous-endothlium comme la fibronectine et pourrait aussi en liant l'2 antiplasmine la fibrine retarder la destruction du caillot jusqu' rparation des tissus.

GPR GHR

RPG RHG

Thrombine

Ca++
XIIIa

Ca++

XIII

Liaison covalente

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A RETENIR : Conversion du fibrinogne en fibrine La thrombine scinde 2 FpA et 2 FpB des chanes Aa et Bb respectivement, convertissant le fibrinogne en monomre de fibrine soluble. Le clivage des Fp dmasque des sites de polymrisation qui permettent dtablir des liaisons hydrogne entre monomres : polymre de fibrine solide mais instable. Association de monomres bout bout (longitudinale) puis latrale : paissisement des fibres. Paralllement, la thrombine active le FXIII par protolyse des sous-units a. Le dmasquage du site actif du XIIIa ncessite le Ca2+ et la fibrine. fix lextrmit C-ter des chanes a, le XIIIa tablit des liaisons covalentes entre une Gln (donneur) et une Lys (accepteur) des chanes a et des chanes g: polymre de fibrine solide et stable. Fp: fibrinopeptide (A:18 aa, B:16aa) VII - RESUME DES ETAPES L'vnement initial est l'exposition du facteur tissulaire qui se lie au facteur VII, lui faisant acqurir une activit catalytique. - Le facteur VIIa active le F. IX et le F. X. - Le F. Xa active la prothrombine (F.II) produisant d'abord des traces de thrombine. - La thrombine forme amplifie considrablement la raction en recrutant de nouvelles plaquettes, et surtout en activant les cofacteurs VIII et V. - Le F. IXa se lie au F.VIIIa et active le F. X. Le F. Xa se lie au F.Va et active la prothrombine gnrant ainsi des quantits importantes de thrombine. - Lactivation du F. XI par la thrombine vient encore renforcer la production de thrombine, qui coagule le fibrinogne pour former le caillot de fibrine.

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La fibrinolyse
La fibrinolyse est le processus qui entrane la dissolution progressive de la fibrine forme au niveau de la brche vasculaire. Ce processus fait intervenir le plasminogne, synthtis dans le foie. Le plasminogne est un zymogne, synthtis dans le foie, qui contient un domaine de forte affinit pour la lysine (LBS), ces LBS permettent sa fixation fibrine. Sous linfluence dactivateurs (t-PA, u-PA), le plasminogne se transforme en une srine protase : la plasmine. La plasmine protolyse la fibrine produisant des produits de dgradation solubles.

1) Les cellules endothliales synthtisent lactivateur tissulaire du plasminogne (t-PA) et son inhibiteur le PAI-1 (plasminogen activator inhibitor de type 1). Le t-PA nest pas efficace en circulation car il est immdiatement complex au PAI-1. En revanche, il a une affinit trs importante pour la fibrine et donc, quand le caillot est form, il peut se fixer sur la fibrine et chapper linhibition par le PAI-1 ; le plasminogne, dont laffinit pour la fibrine est aussi trs leve, se fixe galement sur la fibrine. Le t-PA au sein de ce complexe peut transformer le plasminogne en plasmine de faon efficace. Ceci permet donc de localiser la fibrinolyse l o elle est ncessaire : sur le caillot de fibrine.

Schma de la fibrinolyse

Le systme plasminogne-plasmine Digestion de la fibrine

PAI-1

tPA Plasmine
PAI-1 PAI-1

tPA tPA Pg Fibrine

PDF solubles
2) Il existe un deuxime systme dactivation du plasminogne : lurokinase (u-PA), prsente essentiellement dans la paroi vasculaire, son rle est important dans la matrice extracellulaire. le rle principal de lu-PA est la dgradation des protines associes aux mouvements cellulaires (migration cellulaire, remodelage tissulaire, invasion cellulaire) Lurokinase se lie a un rcepteur spcifique : lu-PAR qui est prsent sur plusieurs cellules : endothliales, monocytes, fibroblastes et qui a pour fonction la fixation de lurokinase sur la membrane cellulaire. L'activation du plasminogne par l'urokinase lie son rcepteur permet le dveloppement d'une activit protolytique importante focalise la membrane cellulaire. La
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plasmine intervient dans les processus de dgradation de la matrice extracellulaire en activant des mtalloprotases (rle par exemple dans linvasion tumorale). Le F. XII activ (XIIa), en prsence de kininogne de haut poids molculaire, agit sur la prkallikrine pour la transformer en kallikrine ; cette dernire est capable son tour d'activer la pro urokinase (scu-PA) en urokinase (tcu-PA). L'activation du plasminogne par le t-PA dans le sang permet la fibrinolyse. L'activation du plasminogne par l'u-PA dans la paroi vasculaire permet le remodelage vasculaire.

3) Ce systme est rgul :

Le systme plasminogne-plasmine Digestion de la fibrine

tPA

Pg Pn

Fibrine

PDF solubles
Contrle: PAI-1 2-antiplasmine (Foie) TAFI ( Foie) (pro-carboxypeptidase B)

3.1. Dune part, par le PAI-1 qui est une serpine produite par les cellules endothliales, mais aussi par les hpatocytes, les mgacaryocytes et les monocytes. Son expression est stimule par les cytokines pro inflammatoires et les hormones. Son rle est de prvenir toute activation du systme de la fibrinolyse. 3.2. Dautre part, par des inhibiteurs de la plasmine : le principal inhibiteur est l2 antiplasmine, une serpine synthtise par le foie, qui inhibe trs rapidement la plasmine en circulation. 3.3. Le TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor) ou procarboxypeptidase B a un rle ralentisseur de la fibrinolyse. Son rle est de ralentir la fibrinolyse en liminant les sites lysines et arginine en position carboxy terminale de la fibrine en cours de dgradation, ce qui entrane une diminution de la fixation du plasminogne la fibrine.

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A RETENIR : Systme plasminogne-plasmine Le plasminogne (Pg) et son activateur plasmatique (tPA) se fixent sur la fibrine. Cette fixation protge le tPA de son inhibiteur (PAI-1) = le tPA active le Pg et la plasmine produite solubilise la fibrine (fibrinolyse). Dans la paroi du vaisseau, le Pg et ses activateurs (uPA et tPA) se fixent sur des rcepteurs cellulaires (cellule endothliale, cellule musculaire lisse). Cette fixation protge luPA et le tPA de leurs inhibiteurs (PAI-1, PN-1) = le Pg est transform en plasmine qui active des mtalloprotases et des facteurs de croissance (remodelage vasculaire). Le systme est rgul ngativement par le PAI-1 et la2- antiplasmine qui forment des complexes irrversibles inactifs avec le tPA ou uPA, et la plasmine, respectivement, lorsque les enzymes diffusent distance de la fibrine. Le TAFI, activ par la thrombine empche le plasminogne de se fixer la fibrine.

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Inhibiteurs physiologiques
La coagulation est sous le contrle de lendothlium. L'extension des ractions de l'hmostase (activation des plaquettes et de la coagulation) distance de la brche vasculaire est limite par diffrents systmes physiologiques, qui sont tous sous le contrle de la cellule endothliale.

I - CONTROLE DE L'ACTIVATION DES PLAQUETTES La prostacycline (PGI2) est produite par la cellule endothliale. Sa production augmente lorsque la cellule est stimule.

Le monoxyde d'azote (NO) est synthtis partir de la L-Arginine sous l'action de la NO synthase (NOS) prsente dans la cellule endothliale. La PGI2 et le NO diffusent dans la lumire vasculaire
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o ils inhibent l'adhsion, l'activation et l'agrgation des plaquettes, ainsi que l'adhsion des leucocytes aux cellules endothliales. Une ecto-ADPase prsente la surface des cellules endothliales dgrade l'ADP en AMP, limitant le recrutement de plaquettes.

II - CONTROLE DE LA COAGULATION PLASMATIQUE 1) L'antithrombine (AT) C'est une serpine qui comporte d'une part un site ractif dans sa partie C-terminale qui va se lier aux srine protases et, d'autre part, dans sa rgion N-terminale un site de liaison aux hparane sulfates du vaisseau. La liaison aux hparane sulfates entrane un changement de conformation de l'AT lui permettant ainsi dinhiber rapidement : thrombine, Xa, IXa, XIa, XIIa. L'AT n'inhibe pas le VIIa de faon efficace.

L'AT qui est en circulation se lie, la fois l'hparane sulfate la surface de la cellule endothliale et aux enzymes cibles : il se forme un complexe ternaire (enzyme-AT-hparane sulfate).

La coagulation est sous le contrle de lendothlium

Fibroblaste
FT VIIa FW IX IXa VIIIa X

Adventice Media ce

brche

Flux

Va Xa

II
Fibrine

IIa
TFPI
GAGs

AT AT
GAGs
T M

Fibrinogne

PC
EPCR

Les mcanismes dinhibition de la thrombine et du facteur Xa sont un peu diffrents selon l'enzyme cible : dans le cas de la thrombine (T), lhparane sulfate (HS) se lie la fois l'AT et la T, alors que dans le cas du F. Xa, il n'y a pas d'interaction directe F. Xa-HS et, seule l'interaction AT-HS conditionne l'inhibition du F. Xa. Le complexe enzyme-AT est covalent, donc trs stable : l'inhibition est irrversible.
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Le complexe se dtache de l'hparane sulfate et va se fixer sur un rcepteur de l'hpatocyte pour tre internalis. (Cette internalisation induit probablement la synthse d'AT). Lhparane sulfate est alors nouveau disponible. Cette proprit de l'AT de se lier aux hparane sulfates pour inhiber de faon immdiate les srine protases est la base du traitement anticoagulant par un analogue : l'hparine.

POUR EN SAVOIR PLUS : AT, hparine et HBPM L'hparine est un glycosaminoglycane acide, compos polysaccharidiques de tailles et de structures diffrentes. d'une famille de chanes

Les hparane sulfates (HS) qui sont des composants de la paroi vasculaire, et les hparines acclrent l'inhibition des srines protases (F. Xa, thrombine) en induisant un changement de conformation de l'antithrombine (AT). Lorsque l'AT entre en contact avec l'hparine ou l'HS, elle change de conformation, et forme rapidement un complexe AT-protase. L'AT adopte ensuite un tat de "faible affinit" pour l'hparine, ce qui lui permet de se librer de l'hparine ou des HS. Le changement de conformation de l'AT est d la liaison d'un motif particulier (5 rsidus = pentasaccharide) de l'hparine ou de l'HS qui se lie des domaines spcifiques de l'AT en hlice, prsents dans la rgion N terminale. Cette liaison entrane l'exposition de la boucle ractive de l'AT. Cette boucle qui contient une Arginine sera reconnue par les enzymes cibles (F. Xa, thrombine ...) qui vont cliver le pont Arg 393-Ser394 (P1-P'1).

Aprs clivage, la boucle s'insre l'intrieur de l'AT o elle vient former le 6e brin d'une structure en feuillet (feuillet A). De cette faon l'enzyme qui reste lie son pseudo substrat : lAT est inhibe de faon irrversible. L'inactivation de la thrombine et du F. Xa se fait par des mcanismes un peu diffrents. L'hparine se lie la thrombine en se fixant sur un domaine comportant des rsidus basiques : l'exosite 2, et se lie aussi l'AT (bridging mechanism). En revanche, l'hparine ne se lie pas au F. Xa et l'acclration de l'inhibition est due au changement de conformation de l'AT. De cette faon l'inhibition de la thrombine et du F. Xa par l'AT est acclre au moins 1 000 fois.
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Pour rduire certains effets secondaires dus l'utilisation des hparines longue chane (hparine standard), on utilise des hparines courtes chanes (hparine de bas poids molculaire ou HBPM), comportant le pentasaccharide, catalysant l'interaction AT-F.Xa, mais qui ne se lie pas la thrombine ou mme le pentasaccharide lui-mme.

Hparine et interaction Antithrombine (AT) / protases

-A-

-B-

AT IIa

AT Xa

AT Xa HBPM

HNF

HNF

pentasaccharide

pentasaccharide Les enzymes de la coagulation chappent au contrle de lAT tant quelles sont lies aux phospholipides de la membrane plaquettaire mais sont accessibles quand elles diffusent vers la phase liquide. 2) Le second cofacteur de lhparine (HCII) Le second cofacteur de lhparine qui est aussi une serpine, est capable dinhiber la thrombine. Son action est potentialise par un autre glycosaminoglycane : le dermatane sulfate, prsent dans les matrices extracellulaires. 3) Le systme de la protine C La protine C (PC) est une protine plasmatique dont l'activation est rgule par un rcepteur membranaire de la cellule endothliale : la thrombomoduline (TM). La TM est prsente en grande quantit dans la microcirculation. Elle fixe la thrombine (T) et modifie sa spcificit enzymatique en la transformant en activateur de la protine C et en la rendant incapable de coaguler le fibrinogne et d'activer les cofacteurs V et VIII ou les plaquettes. La thrombine en se fixant la thrombomoduline perd ses proprits procoagulantes et acquiert des proprits anticoagulantes. Il existe un deuxime rcepteur (EPCR, pour endothelial protein C receptor) dont la densit est trs leve dans les gros vaisseaux (aorte). Ce rcepteur est capable de fixer la PC et dacclrer son activation par le complexe T-TM. Son rle pourrait tre de concentrer la PC sur des sites o la TM est peu prsente (gros vaisseaux). La protine C active (PCa) est une srine protase vitamine K-dpendante, elle a besoin pour agir d'un cofacteur, la protine S (PS). La PS n'a pas d'activit enzymatique. Elle circule dans le sang lie en partie une protine du systme du complment, la C4bBinding protein (C4bBp). Seule la protine S libre, (soit environ 40 % de la protine S totale) a une activit cofacteur.

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La PCa l'aide de son cofacteur la PS, fixe sur les phospholipides membranaires exerce son effet anticoagulant en inactivant par protolyse le F.Va et le F.VIIIa.

Les complexes d'activation de la prothrombine et du facteur X ne peuvent plus se former efficacement puisque les cofacteurs Va et VIIIa ne sont plus actifs, et la cintique de production de la thrombine devient trs lente. (Le dficit constitutionnel en AT, protine C et protine S est une cause de thrombose du sujet jeune.) Une anomalie gntique du facteur V : facteur V Leiden est caractrise par une mutation Arg 506-Gln qui empche le clivage, donc linactivation du facteur Va par la PCa, elle se traduit par un risque accru de thrombose. Le systme de la PC est lui-mme rgul ; on connat deux inhibiteurs de la PCa : la PCI pour Protein C Inhibitor qui est une serpine trs efficace, de concentration faible et l'1 antitrypsine moins efficace mais prsente une concentration leve. 4) Inhibition de la voie exogne : le TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor) La voie exogne est rgule par un inhibiteur plasmatique produit par la cellule endothliale, le TFPI. Cet inhibiteur comporte 3 domaines de type Kunitz. Le domaine 2 se lie au F. Xa, le domaine 1 se lie au complexe FT.VIIa et le domaine 3 se lie aux lipoprotines et aux glycosaminoglycanes (GAGs). Le TFPI est prsent la fois dans le sang et fix sur les GAGs de la paroi vasculaire. Cette fraction est probablement la plus importante. Le rle du TFPI devient important aprs la gnration de faibles quantits de F.Xa sur lequel se fixe le TFPI. Il se forme ensuite un complexe quaternaire F. Xa-TFPI-VIIa-FT. Le complexe VIIa-FT est inhib bloquant ainsi la production de F.Xa et de F.IXa.

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Rgulation de la coagulation par le TFPI

(Tissue Factor Pathway Inhibitor) Fibroblaste, monocyte/macrophage
Xa FT VIIa

VIIa IX
Xa TFPI IXa VIIIa X Xa Va II
Ca ++

TFPI

TFPI

Thrombine

Glycosaminoglycanes

TFPI

TFPI-2

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A RETENIR : Rgulation ngative de la coagulation Lantithrombine est une serpine (inhibiteur de srine protases) dont lactivit est potentialise par lhparane sulfate des parois vasculaires. Elle forme des complexes irrversibles inactifs avec la thrombine, le FXa, les FIXa et XIa, lorsque ceux-ci ne sont pas fixs sur les surfaces membranaires. Systme de la protine C : 2 protines membranaires endothliales (thrombomoduline et EPCR) potentialisent lactivation de la protine C par la thrombine. La protine C active (avec son co-facteur la protine S) dgrade les co-facteurs Va et VIIIa, et ralentit la production de thrombine. Le TFPI, fix sur les glycosaminoglycanes de la paroi vasculaire, forme un complexe avec le FXa. Le complexe FXa-TFPI se fixe sur le complexe FT-FVIIa et bloque linitiation de la coagulation par le facteur tissulaire (FT).

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HEMOSTASE : EXPLORATION

I - HEMOSTASE PRIMAIRE 1) Numration des plaquettes Elle se fait l'aide de compteurs globulaires automatiques. Le nombre normal est de 150 400 Giga/litre (G/l) 2) Temps de saignement : mthodes et valeurs normales Le temps de saignement (TS) permet une exploration globale de lhmostase primaire in vivo. Il correspond au temps qui scoule entre la ralisation dune petite plaie cutane superficielle et le moment o le saignement provoqu sarrte. Il explore les diffrentes phases de lhmostase primaire, cest--dire ladhsion des plaquettes au sous-endothlium en prsence de facteur Willebrand, lactivation des plaquettes par leurs agonistes physiologiques et la scrtion du contenu de leurs granules et, enfin, leur agrgation en prsence de fibrinogne.

Temps de saignement
- Mthode d'Ivy-incision N < 10 min F.Willebrand / collagne - Explore : . nombre et qualit des ADP plaquettes . F.Willebrand, fibrinogne TxA2 . qualit du vaisseau Fibrinogne

- Fonction de l'hmatocrite - Limites : . valeur prdictive du saignement mdiocre . reproductibilit imparfaite, oprateur dpendant . sensibilit limite . fiabilit faible en cas d'anomalie cutane - Alternative : analyseur des fonctions plaquettaires (PFA) sur un prlvement sanguin beaucoup plus utilis

Il est donc fonction la fois de la qualit de la paroi vasculaire, du nombre et de la qualit des plaquettes, et de la concentration plasmatique de facteur Willebrand et de fibrinogne. Mthode dIvy-incision (normale < 10 minutes) Une incision horizontale est faite la face antrieure du tiers suprieur de lavant-bras, sous une pression de 4 cm Hg maintenue laide dun brassard manomtrique. Un dispositif standardis usage unique, ralisant une incision de 5 mm de longueur et 1 mm de profondeur, est utilis pour amliorer la reproductibilit. Cette technique trs sensible, raisonnablement reproductible, constitue la mthode de rfrence. Elle nest plus beaucoup utilise.
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3) Etude des fonctions plaquettaires Ltude des fontions plaquettaires peut aussi tre ralise in vitro sur un tube de sang laide dun appareil, le PFA-100 (platelet function analyzer). Le test consiste mesurer le temps dadhsion et dagrgation des plaquettes sur une membrane recouverte de collagne (en prsence dadrnaline ou dADP) dans des conditions de flux standardises. Ce test est inutilisable en cas de thrombopnie. Chacune des fonctions des plaquettes peut tre tudie in vitro si le TS ou le temps docclusion du PFA sont anormaux, en labsence de thrombopnie ou de prise de mdicaments anti-agrgants. 4) Les anomalies - Un allongement du TS avec nombre de plaquettes normal et allongement du TCA sobserve en cas de dficit en FW (maladie de Willebrand). - Un allongement du TS avec nombre de plaquettes normal et TCA normal se voit au cours des thrombopathies, cest--dire danomalie fonctionnelle des plaquettes. Il faut dabord avoir limin une prise mdicamenteuse : antiagrgant plaquettaire de type Aspirine, Clopidogrel. - Un allongement isol du TS avec fonctions plaquettaires normales peut se voir dans des anomalies de la paroi vasculaire.

II - COAGULATION PLASMATIQUE Les tests se pratiquent sur un tube de sang, prlev sur un anticoagulant (chlateur du Ca2+, par exemple), le sang est centrifug pour sparer le plasma des cellules (GR, GB et plaquettes) et les tudes sont ralises sur le plasma. Le plasma ne contient ni plaquettes (source de phospholipides), ni calcium, donc tous les tests de coagulation devront ncessiter lapport de phospholipides et de calcium en plus des ractifs spcifiques.

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Il existe des tests globaux (TCA et temps de Quick). Lorsquils sont anormaux, chacun des facteurs de coagulation peut tre dos de faon spcifique, en fonction de ces premiers rsultats et du contexte clinique. 1) Le temps de cphaline + activateur (TCA)

Temps de cphaline + activateur

(TCA)
Cphaline: phospholipides Activateur + Ca++ F. XII, KHPM, PK
XI XIa IX VIIIa IXa Xa Va II Thrombine X

Exprim en secondes: N< T+6 8 sec ou en ratio P/T <= 1.2

Voie endogne

Tous les facteurs se mesurent sparment Leur taux est exprim en % de la normale

Fibrinogne

Fibrine

Tronc commun

1.1. Mthodes et valeurs normales Le TCA mesure le temps de coagulation 37 C dun plasma en prsence de phospholipides (cphaline), dun activateur de la phase contact (kaolin, acide ellagique, clite ou autre) et de calcium. Il explore la voie de la coagulation dclenche par le contact (voie dite endogne ), et il est donc fonction de la concentration plasmatique de chacun des facteurs de coagulation impliqus : facteurs de la phase contact (facteurs XII, kininogne de haut poids molculaire, prkallikrine), facteurs XI, IX, VIII, X, V, II et fibrinogne. Il nexplore pas le facteur VII ni les plaquettes. Le temps obtenu est exprim par rapport au temps du plasma tmoin, dont la valeur moyenne varie entre 30 et 40 secondes selon les ractifs utiliss. Le rsultat est rendu sous forme de ratio M/T, ratio normal = 1,2. Le TCA est allong lorsquil dpasse de 6 8 secondes le temps du tmoin, mais la frontire nest pas stricte. Un ratio > 1,2 est anormal. 1.2. Les anomalies Un allongement isol du TCA sobserve dans les cas suivants : - Dficit isol en facteur VIII (hmophilie A), facteur IX (hmophilie B) ou facteur XI. Ces dficits saccompagnent de manifestations hmorragiques.
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- Dficit en facteurs de la phase contact. Ces dficits exceptionnels nentranent jamais dincidents hmorragiques, mme lorsquils sont svres. - Anticoagulant circulant (ACC) : La mise en vidence repose sur un test de correction : lexamen est rpt sur un mlange parties gales de plasma du malade et du plasma normal. Si lanomalie est due un dficit, lapport de 50 % de plasma normal suffit corriger le TCA. Sil sagit dun ACC, celui-ci inhibe la coagulation et dans ce cas le TCA du mlange reste anormalement long. Les anticorps anti-facteur VIII ou anti-facteur IX exposent un risque hmorragique majeur contrairement aux anticoagulants de type anti-phospholipides. 2) Le temps de quick (TQ)

2.1. Mthodes et valeurs normales Le temps de Quick est le temps de coagulation 37 C dun plasma en prsence dun mlange de facteur tissulaire et de phospholipides (thromboplastine) et de calcium. Le temps de coagulation du plasma du patient est compar celui dun tmoin, voisin de 12 secondes pour la plupart des ractifs. Le rsultat est exprim en France en pourcentage dactivit, en dsignant ce pourcentage sous le nom de taux de prothrombine (TP), terme incorrect. Le pourcentage est calcul en utilisant un plasma tmoin qui, par dfinition correspond 100 % de la normale (normale = > 70 %). Les valeurs infrieures 70 % sont considres comme pathologiques. Un autre mode dexpression est exclusivement rserv la surveillance des traitements anticoagulants par les antagonistes de la vitamine K : lINR (International Normalized Ratio) correspond au rapport du temps de Quick du patient sur celui du tmoin, lev la puissance ISI, cet index (International Sensitivity Index) dfinissant la sensibilit du ractif utilis. Le temps de Quick explore de faon globale les facteurs de coagulation de la voie exogne de la coagulation (facteurs VII, X, V, II et fibrinogne). Dans les conditions de concentration de facteur tissulaire utilises, le complexe FT-VIIa active exclusivement le F. X : les F. IX et VIII ne sont donc pas explors par le TQ. 2.2. Les anomalies - Un temps de Quick allong avec TCA normal indique un dficit isol en facteur VII.
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- Un allongement associ du TCA et du temps de Quick sobserve dans : . Hypovitaminose K : facteur II, VII et X diminus, facteur V normal. . Insuffisance hpatocellulaire : facteur II, VII, X et V diminus. . CIVD (coagulation intravasculaire dissmine) : elle associe une thrombopnie, une diminution du taux de fibrinogne et des autres facteurs de coagulation (en particulier F.II et F.V) consomms au cours du processus de coagulation ; ces anomalies sont associes la prsence de produits de dgradation de la fibrine (D-dimres). . Anticoagulants circulants, le plus souvent de type antiphospholipides. . Dficits isols en fibrinogne, facteur II, V ou X. . Tous les facteurs de coagulation peuvent tre mesurs individuellement : dosage de F.VII par exemple III - LA FIBRINOLYSE 1) Tests globaux - Temps de lyse d'un caillot de sang total : test peu utilis car peu sensible. - Temps de lyse des euglobulines : Ce test plus sensible que le prcdent, consiste valuer l'activit fibrinolytique d'un plasma dplt en inhibiteurs par prcipitation en milieu acide (pH 5,9). Le prcipit d'euglobulines (facteurs de coagulation, plasminogne, plasmine, t-PA, u-PA) est recalcifi et le temps de lyse du caillot form est ensuite mesur. Valeurs normales > 3 h. Le temps de lyse est acclr lorsque la quantit de tPA circulant augmente. 2) Tests analytiques - Les dosages du plasminogne, du t-PA, de l2 antiplasmine, du PAI-1 et des autres inhibiteurs sont possibles. - Dosage des produits de dgradation de la fibrine : les D-dimres proviennent de la dgradation de la fibrine par la fibrinolyse physiologique et, sont donc le tmoin de la formation de fibrine. Le dosage des D-dimres a une excellente valeur prdictive ngative (VPN) : lorsque leur concentration plasmatique est basse, la probabilit d'une thrombose veineuse profonde est trs faible. En revanche, la valeur prdictive positive est mauvaise (taux augment dans de nombreuses situations pathologiques : inflammation, traumatisme, et aussi l'ge).

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COMMENT EXAMINER ET INTERROGER UN PATIENT QUI PRESENTE UN SYNDROME HEMORRAGIQUE

1) EXAMEN CLINIQUE - Prciser le contexte : . Infectieux, septicmie, fivre, . Hmopathie associe, . Maladie hpatique, rnale ou auto-immune associe, . Prise de mdicaments anti-coagulants, . Ou hmorragie isole. - Prciser le type de lhmorragie : . Cutane : purpura (ponctuations pourpre en tte dpingle), ecchymoses (placards bleus voluant vers le jaune). . Muqueuse (pistaxis, gingivorragie, hmatmse, mno-mtrorragie). . Hmatomes (intra-musculaires). . Hmarthroses (intra-articulaires). - Apprcier la gravit : purpura limit ou gnralis ? Anmie ? En cas de thrombopnie svre, il faut raliser un fond dil (FO) la recherche dune hmorragie rtinienne, tmoin du risque dhmorragie intra-crnienne.

2) INTERROGATOIRE - Eliminer les principales pathologies responsables de manifestations hmorragiques cites ci-dessus. - Prciser le caractre spontan ou provoqu, la date des premires manifestations. - Rechercher la prise de mdicaments, et faire une liste ; en particulier les antiagrgants plaquettaires (Aspirine). - Demander au patient sil a subi des interventions chirurgicales ou des extractions dentaires, si elles ont t accompagnes de saignement. Recherche si le patient a du tre transfus cette occasion. - Rechercher des manifestations familiales, faire un arbre gnalogique.

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