Cours Physiologie de L'hémostase Et Méthodes D'exploration

Etudes Post-Universitaires en «
Hématologie »
HÉMOSTASE: Physiologie
et exploration
MCA Saoussen Chouchène
MCA Fatma Megdiche
MCA Amira CHERIF
MCA Linda KHEFACHA
23 février 2023
EPU Hématologie: 2022-2023
Pré-requis
Physiologie de l’hémostase (4ème année Ph)
Objectifs pédagogiques
1. Décrire clairement la physiologie de l’hémostase

(acteurs, étapes, régulation)
2. Maitriser les conditions pré-analytiques en hémostase
3. Décrire et interpréter les tests d’exploration de
l’hémostase primaire, de la coagulation et de la
fibrinolyse
4. Connaitre les limites des tests classiques de la
coagulation 3
PLAN
Physiologie de l’hémostase
L’étape pré-analytique en hémostase
Exploration de l’hémostase
Démarche diagnostique et interprétation des

tests
4
PLAN

tests
5
HÉMOSTASE
L’hémostase est l’ensemble des mécanismes qui
concourent à :
Prévention des saignements spontanés

Arrêt des hémorragies
Prévention des thromboses
Elle participe à la réparation de la brèche vasculaire et

elle assure le maintien de l’intégrité des vaisseaux.
6
HÉMOSTASE
Série de systèmes en équilibre qui sont intimement

intriqués:
-Système vasculaire
-Système plaquettaire
-Système de la coagulation
-Système de la fibrinolyse
7
THROMBOSE HEMORRAGIES
Hémostase Iaire
Coagulation Fibrinolyse
Situation normale: Etat d’équilibre
8
EFFRACTION
VASCULAIRE
HEMOSTASE PRIMAIRE COAGULATION
Vaisseau facteurs
Plaquettes coagulation et
vWF inhibiteurs
Fibrinogène physiologiques
CAILLOT FIBRINO-PLAQUETTAIRE
Plasmine :
FIBRINOLYSE Activateurs
et
OBLITERATION DE LA
inhibiteurs
BRECHE VASCULAIRE
DISSOLUTION DU CAILLOT ET
REPARATION DU VAISSEAU 9
Rappel…physiologie de L’HÉMOSTASE
Hémostase primaire
11
PARAMETRES DE L’HEMOSTASE PRIMAIRE
- Système vasculaire: Endothélium et sous endothélium

- Système plaquettaire
- Fibrinogène
- Facteur Von Willebrand (VWF)
- Forces hémodynamiques
STRUCTURE D’UN VAISSEAU SANGUIN
Terminaison nerveuse
Vaisseau
Adventice
Fibre musculaire
Média
Fibroblaste
Sous-endo
Intima
Membrane basale
Cellule
endothéliale
Limitante
elastique
interne
Limitante
élastique
externe
PROPRIETES DE L’ENDOTHELIUM VASCULAIRE
• L’endothélium vasculaire est une surface

thromborésistante par sa capacité d’empêcher:
 l’activation des systèmes de l’hémostase
 l’adhésion des cellules circulantes au sous
endothélium.
Mécanismes de la thromborésistance
de l’endothélium
* Richesse en GAG ( héparane sulfate++)
constituent une forte densité de charge négative qui s’oppose à la charge
négative des plaquettes.
* Synthèse de l’EDRF ( NO )
Puissant vasodilatateur et antiagrégant plaquettaire par augmentation de l’AMPc
intra plaquettaire.
* Synthèse de la prostacycline (PGI2)
Puissant agent vasodilatateur et antiagrégant plaquettaire
* Richesse en activités enzymatiques qui catabolisent les

agonistes plaquettaires
- ADPase dégrade l’ADP
- Monoamine-oxydase dégrade les catécholamines et la sérotonine
Endothélium vasculaire
Acide arachidonique
cyclooxygénase
Endoperoxydes
Aspirine
Prostacycline synthase
Prostaglandine I2 (PGI2)
PROPRIETE DU SOUS ENDOTHELIUM
Le sous endothélium est une surface

thrombogène:
Il permet l’adhésion, l’activation et l’agrégation

plaquettaire.
LE SYSTEME PLAQUETTAIRE
Plaquettes: Fragments cytoplasmiques issus des

Mégacaryocytes.
- Cellules anucléées: Forme discoïde
diamètre: 2-3 μm
VMP: 7 – 8 μm3
- 150 – 400.000/mm3
- Durée de vie: 8 –10 j
- A l’état normal: 1/3 séquestré dans la rate
• Plaquettes = Support de la coagulation in vivo
Ultra structure complexe:
- Une membrane - Mitochondrie
- Un cytoplasme - Lysosyme
- Un système canaliculaire ouvert - Glucogène
- Un système tubulaire dense
- Granules intra plaquettaires
Ultra structure d’une plaquette
Granules denses
Granules Alpha
Granules lysosomiaux
Syst. tubulaire denses
Glycoprotéines
Le facteur Von Willebrand
20000
o VWF :glycoprotéine de structure multimérique kDa
complexe de 500 à 20 000 kDa, formée par

l’association de sous-unités identiques de 270 kDa
(monomère de VWF)
500
kDa
VWF: Biosynthèse
Le VWF :
-est sécrété immédiatement de façon constitutive
- est stocké en vue d’une sécrétion régulée
 corps de Weibel-Palade dans les
Cellules endothéliales (80%)
Granules α dans les Plaquettes (20%)
Sécrétion dans le sang ou le sous-endothélium en

réponse à des stimulus physiologiques (thrombine, force
de cisaillement) ou pharmacologiques (desmopressine
VWF: Relation structure-activité
domaines
propeptide
D1 D2
ligands
Ristocétine
VWF et ADAMTS13
o ADAMTS13:
(A Desintegrin Metalloprotease with ThromboboSpondin 13)
-Une métalloprotéase de 200 kDa

-module la distrubution multimérique du VWF
en circulation dans le plasma en dégradant les
multimères de très haut PM issus des
compartiments cellulaires
-protéolyse physiologique au niveau du
domaine A2 (Tyr 1605/Met 1606)
-permet de prévenir la formation spontanée
pathogène d’agrégats plaquettaires
VWF: Rôle physiologique
GPIIb/IIIa
GPIb/IX
VWF: Rôle physiologique
Formation d’un complexe VWF et FVIII:

 Stabilise et protège le FVIII contre la
dégradation par les protéases plasmatiques
 Concentre le FVIII au niveau de la lésion
Prolonge sa durée de vie (12-20h)
VWF: influence du groupe sanguin ABO
Sousa NC et al, Haematologica 2007

L’hémostase primaire
Le temps vasculaire
La lésion du vaisseau sanguin induit des spasmes vasculaires c’est à

dire une VASOCONSTRICTION
Le débit sanguin diminue. L’hémorragie est

temporairement jugulée
Le temps plaquettaire
Étape 1 : Les plaquettes adhèrent au vWF du sous-endothélial et collagène

Étape2 : Activation et sécrétion des plaquettes

Étape3 : Agrégation plaquettaire

Adhésion plaquettaire
- adhésion au FVW:
Les plaquettes n’adhèrent pas au FVW circulant
mais au FVW ancré dans le sous endothélium mis
à nu . Le substratum moléculaire de cette
adhésion: GPIb/IX. Ceci se passe dans des fortes forces de
cisaillement.
- adhésion au collagène:
Les plaquettes adhèrent au collagène ancré dans le sous

endothélium mis à nu par l’intermédiaire du complexe
glycoproteique Ia/IIa de la membrane plaquettaire
Activation plaquettaire
Changement de forme
(émet des pseudopodes, réorganisation des GP membranaires,
exposition de la GPIIb/IIIa)
 Réaction de libération: Release
Libération du contenu des granules intraplaquettaires
 Synthèse de prostaglandine
TXA2 = Puissant agrégant plaquettaire
 Expression d’une activité procoagulante
Flip-flop, externalisation des PL anioniques
Métabolisme de l’acide arachidonique
Plaquette activée
Acide arachidonique
cyclooxygénase
Endoperoxydes
Aspirine
Thromboxane A2 synthase
Thromboxane A2 (TXA2)
Agrégation plaquettaire
 Agrégation réversible:
GP IIb/IIIa fixent le Fg en présence de calcium
Agrégation irréversible
consolidation par fibronectine, thrombospendine…
Coagulation
37
Les facteurs de coagulation
Lieu de synthèse Dénomination Facteurs
Foie Fibrinogène I
Foie + Vit K dépendant Prothrombine II
Foie Proaccélérine V
Foie + Vit K dépendant Proconvertine VII

Foie, cellule endothéliale F.antihémophilique A VIII
Foie + Vit K dépendant F.antihémophilique B IX
Foie + Vit K dépendant F. Stuart X
Foie F. Rosenthal XI
Foie F. Hageman XII
Foie F. stabilisant de la Fb XIII
Foie Prékallikréine PK
Foie Kininogène de haut poids KHPM
moléculaire 38
Ces facteurs sont classés en:
II,VII,IX,X,XI,XII,PK,XIII Proenzymes
Vitamine K
V, VIII, KHPM Cofacteurs
Fibrinogène Substrat
39
MECANISME D’ACTION DE LA VITAMINE K
Précurseur inactif Forme mature

Acide glutamique carboxylase
(glu) Vitamine K Acide γ-carboxyglutamique
(gla)
Vitamine KH2 Vitamine KO

(Naphtohydroquinone) (2,3 époxide)
X Xa Liaison aux PL membranaires

Va Ca++ par l’intermédiaire des ions Ca+
PL
+
et formation des complexes
II enzymatiques
40
LA COAGULATION :
UN PHENOMENE DE SURFACE
Phénomène localisé :
surface des plaquettes activées
PL anioniques : phosphatidylsérine
41
Le schéma classique de la coagulation (schéma en Y)
Voie extrinsèque Voie intrinsèque
• Facteur Tissulaire • Facteur XII
• Facteur VII • Facteur XI
• Facteur V • Facteur IX
• Facteur X • Facteur VIII
PROTHROMBINASE
céphaline activateur
Xa - Va – Phospholipides
Ca++
prothrombine
Temps de
Temps de
Voie commune PROTHROMBINE THROMBINE
Facteur II Facteur IIa
FIBRINOGÈNE FIBRINE
Facteur I Facteur Ia
42
ANOMALIES DU SCHEMA CLASSIQUE DE LA
COAGULATION
1. Pas de problème de saignement chez les patients

déficients en FXII, PK ou KHPM (facteurs du système
contact), alors que le TCA est très allongé.
2. Les patients déficients en FVII ont généralement un

problème de saignement malgré une voie intrinsèque
normale.
3. Le FVII peut activer le FIX alors qu’ils appartiennent à

deux voies différentes
43
LA THEORIE MODERNE DE LA COAGULATION
-La séparation en trois voies distinctes n’est plus

appliquée: il s’agit d’une seule voie d’activation: « boucle
de la coagulation ».
- Ce schéma moderne de la coagulation est plus

dynamique que le précédent et il est aussi plus
représentatif des phénomènes in vivo initiés par la mise à
nu du FT.
44
Les étapes de la coagulation moderne
1-Initiation
2-Amplification
3-Propagation
4-fibrinoformation
45
1 - la phase d’initiation:
46
1- la phase d’initiation
- La lésion de la paroi vasculaire entraîne un contact direct entre le

sang et le FT du sous endothélium.
- Le FT active le FVII, il se forme ainsi un complexe FT-FVIIa appelé:
Tenase extrinsèque.
- La Tenase extrinsèque fournit de faibles quantités de FIXa et de FXa.
- Le complexe FXa-FVa converti de petite quantité de prothrombine
( FII ) pour donner la thrombine (FIIa) en faible quantité. Cette
quantité faible de FIIa active le FV, le FVIII, le FXI et les plaquettes.
47
b - La phase d’amplification
48
2 - La phase d’amplification
-Les plaquettes activées fixent les FVa, FVIIIa et le FIXa
-Le FXI active le FIX en FIXa.
-L’activation de 2 cofacteurs ( FVa-FVIIIa ) permet la formation

d’un complexe FVIIIa – FIXa appelé: Ténase intrinsèque
(FVIIIa–FIXa ) qui permet une activation rapide du FX.
49
Action de la thrombine
- Auto activation
- Activation des plaquettes
- Activation des FV, FVIII,

FXI et du FXIII
- Transformation du
Fibrinogène en fibrine
3 - La phase de propagation
51
-Le complexe Ténase intrinsèque (FVIIIa,FIXa, PL,

Ca2+) active le FX au niveau de la surface des
plaquettes activées.
-Le FXa en association avec le FVa constitue le

complexe prothrombinase ( FVa, FXa, PL, Ca2+).
-Ce complexe prothrombinase est responsable

d’une génération abondante de thrombine qui est
105 fois plus importante que si le FXa était seul.
52
-Le complexe FVIIIa-FIXa est environ 50 fois plus efficace
que le complexe FVIIa- FT pour activer le FX. Ainsi, la plus

grande partie du FXa est produite par le complexe FVIIIa-
FIXa.
En absence du FVIII ou du FIX, la tenase intrinsèque ne peut

pas être rassemblée et la phase de propagation n’aura pas
lieu. C’est le principal défaut observé en cas d’hémophilie A
et B. 53
4 - La phase de fibrinoformation
-Lorsque la cc de thrombine atteint un certain seuil, la

thrombine va convertir le fibrinogène en fibrine:
 Protéolyse du fibrinogène par la thrombine:
séparation des fibrinopeptides A et B des monomères
de fibrine.
 Polymérisation de la fibrine
 Stabilisation de la fibrine: le polymère de fibrine
instable doit être stabilisé par le FXIIIa, l’activation du
FXIII étant réalisée par la thrombine.
54
REGULATION DE LA COAGULATION IN VIVO
Pour éviter une activation diffuse et continue du processus de la

coagulation, chaque facteur possède son inhibiteur Spécifique.
On connaît trois systèmes d’inhibiteurs principaux:
- Le système de l’antithrombine (AT).

- Le système Protéine C - Protéine S et
Proteine Z.
- Le TFPI: Tissue Factor Pathway Inhibitor
55
Fibrinolyse
56
LA FIBRINOLYSE
Sa finalité est l’inverse de celle de l’HI et de la

coagulation qui visaient à former le caillot de fibrine,
la fibrinolyse tend à détruire la formation de tel
caillot.
Il s’agit donc d’un phénomène physiologique qui

aboutit à la destruction enzymatique du thrombus
fibrinoplaquettaire pour éviter le dépôt excessif de
fibrine et sans doute pour assurer la
reperméabilisation d’un vaisseau après formation d’un
thrombus.
La fibrinolyse est un phénomène localisé au niveau du
caillot. 57
Mécanisme de LA FIBRINOLYSE
Plasminogène
Activateurs Antiactivateurs
Fibrinogène Fibrine
Plasmine
PDFg D-Dimères
Fibrinogénolyse Fibrinolyse
58
Régulation de LA FIBRINOLYSE
Plasminogène TAFI
Activateurs: Antiactivateurs
-Voie du tPA (inhibiteurs):
-Voie de la PUK-UK - PAI-1 (tPA)
-Voie du FXII - PAI-2 (UK)
Plasmine
- α2 antiplasmine
-α2 macroglobuline
59
PLAN

tests
60
Spécificités de la phase pré-analytique en hémostase
La qualité des examens d’hémostase dépend de

certains paramètres de la phase pré-analytique
1- Paramètres liés au patient
2- Paramètres liés au prélèvement
3- Paramètres liés au spécimen

A/Interférences médicamenteuses:
De nombreux médicaments peuvent influencer les

résultats d’un bilan d’hémostase.
Aspirine: action irréversible sur la fonction agrégante des
plaquettes
Allongement TS durant toute la durée de vie des
plaquettes (7 à 10 jours).
doit être réalisé au moins 10 jours après arrêt du
traitement
B/ Interférences alimentaires:
Les aliments riches en vitamines K influencent le suivi

biologique des traitements AVK en neutralisant l’effet des
AVK
Cause de résistance thérapeutique de loin la plus

fréquente
 Les aliments riches en

vitamines K neutralisent
l’effet des AVK:
La Guimauve:‫ا;;لخبيزة‬
•Nature de l’ anticoagulant:
Citrate trisodique: Agent complexant le calcium
CTAD (citrate, théophylline, adénosine,dipyridamole):
inhibition de l’activation plaquettaire
•Concentration de l’ anticoagulant :
Recommandée par l’OMS: 0.109M ou 3.2%
Acceptable: 0.129M ou 3.8%
Respect des dates de péremption tant pour la qualité de

l’anticoagulant que pour le maintien du vide initial
Prélèvement proprement dit:
Ponction franche de la veine du pli du coude au

niveau du bras opposé à une perfusion ou une fistule
artério-veineuse chez les hémodialysés
Prélèvement proprement dit:
Garrot peu serré pour éviter la stase prolongé

(micro caillots)
Prélèvement sur cathéter à éviter, ou après rejet de
5 ml.
Prélèvement à la seringue À PROSCRIRE
Eliminer les premiers ml de sang

Si prélèvement multiple, l’ordre des
tubes doit être respecté:
1. Sans additif
Citrate 2.
3. EDTA
4. Autres
Ne jamais prélever après un tube hépariné
Mélanger immédiatement le sang et l’anticoagulant par
retournements successifs sans faire de mousse
Rapport volume d’anticoagulant /volume de sang.

1 volume d’anticoagulant pour 9 volumes de sang.
Il convient de s’assurer du remplissage du tube
jusqu’au trait de jauge (Optimum calcique)
Un mauvais remplissage induit une erreur de dilution:
 L’excès de citrate dans le plasma, lorsque le tube est

insuffisamment rempli, allonge artificiellement les
temps de coagulation
 Le défaut de citrate, dans un tube trop rempli,
favorise l’activation des plaquettes et raccourci les
temps de coagulation
Possibilité de réduire le volume d’anticoagulant et de sang

en respectant toujours le rapport 1v / 9 v.
Effet de l’hématocrite
Il faut ajuster le volume de l’anticoagulant utilisé pour les
hématocrites supérieures à 55% ou inférieures à
33%,selon des formules qui tiennent compte de la valeur
de l’hématocrite
Volume de sang à prélever =

Le stockage et le transport des tubes:
 Position verticale
 T° ambiante
 < à 4°C: activation des plaquettes
 2°C à 8°C: Activation du FVII
 > à 30°C: dégradation des facteurs thermolabiles: FV
et FVIII entraînant de faux allongements du TQ et du
TCA.
Délai avant le test doit être le plus court possible:
Recommandé < 2 h
Acceptable < 4 h
Non conforme > 4 h
Préparation du plasma:
Les tests de coagulation sont réalisés sur Plasma
Pauvre en Plaquettes (PPP).
Se débarrasser des plaquettes par centrifugation.
Préparation du plasma:
Centrifugation thermostatée 15°C à 20°C,15 min, 2000g à 2500g
Pour certains tests ou surtout si le plasma doit être

congelé, il est important d’éliminer au maximum les
plaquettes résiduelles. Ceci peut être obtenu par
double centrifugation 15 min à 2000g.
Conservation par congélation rapide :
 - 20ºC (< à 30 jours),

 - 80ºC (idéale: activité biologique préservée)
 4ºC à éviter
La décongélation doit être rapide au bain marie à 37°C.
La recongélation n’est pas permise.
PLAN

tests
78
Les explorations plaquettaires
1- Numération plaquettaire+ Volume plq+Morphologie
- VN : 150 - 400 G/L
- VPM: 7 – 8 μm3
- Thrombocytopénie si PLT < 150 G/L

1- Numération plaquettaire+ Volume plq+Morphologie

- VN : 150 - 400 G/L
- Thrombopénie si PLT<150 G/L
- l’histogramme plaquettaire est

lissé et doit commencer et
finir à la ligne base VMP
!!!Vraie thrombopénie
Le frottis sanguin: confirme la rareté des plaquettes
une fausse thrombopénie…FS!!!!
Amas plaquettaire Macroplaquette Satellitisme

plaquettaire
une fausse thrombopénie…FS!!!!
Absence de
retour à la ligne
de base
une fausse thrombopénie
Absence de courbe lissée


Alarmes +++
Macroplaquettes, plaquettes géantes
Agrégats plaquettaires
Interférence cellulaire (GB)
Frottis sanguin !!!!

plaquettaire
CAT???????

plaquettaire
CAT???????

plaquettaire
NFS sur tube PLq au bout NFS sur tube

citraté du doigt citraté
Frottis sanguin !!!!

Le Temps de saignement (TS)
•Test global explorant l’hémostase primaire in vivo
•Principe:
Il consiste à mesurer le temps nécessaire à l’arrêt du
saignement après incision superficielle (épreuve de Duke
ou test d’Ivy incision) ou piqûre de la peau du patient (test
d’Ivy 3 points); Pression cste à 40 mmHg
Limites +++
Test relativement invasif
Peu reproductible (opérateur dépendant)
Peu sensible
non prédictif du risque hémorragique
Faux positifs : si incision trop profonde: Atteinte des gros
vaisseaux
Le Temps d’Occlusion (TO)
Simulation in vitro des conditions physiologiques

d’adhésion, activation, agrégation plaquettaire
Valeurs Usuelles
Collagène/Epinephrine <150 sec
Collagène/ADP <120 sec
Chaque laboratoire doit établir ses propres valeurs de
références: les temps varient en fonction de
l’anticoagulant utilisé (3,8% donnent des temps
significativement plus élevés que 3,2%)
Avantages +++ :
Sensible aux thrombopathies
Très sensible pour la détection de la maladie de Willebrand (sauf
2N) surtout avec cartouche ADP
fortement sensible au ttt par l’aspirine (TO allongé avec
épinéphrine et normal avec ADP)
Non opérateur dépendant
Limites :
N’explore pas les facteurs vasculaires
ininterprétable si PLQ <100 000/mm3, HTE<30%, PVT>4h
Etude de l’agrégation
plaquettaire par photométrie
Mesure de la capacité des plaquettes à agréger en présence
d’agonistes
d’agonistes
Enregistrement graphique de la transmission d’un faisceau lumineux à
travers une suspension de plasma riche en plaquettes (PRP) sous
agitation continue régulière à 37°C.
Les plaquettes en suspension empêchent la transmission du signal

lumineux. Après ajout d’un inducteur, les plaquettes s’agrègent, le
milieu s’éclaircit et la quantité de lumière transmise augmente
proportionnellement à cet éclaircissement.
d’agonistes
Conditions à respecter+++:
- Arrêt TTT AAP!!! Eviter les repas riches en lipides.
- Etude réalisée sans dépasser 3h après le prélèvement
- Préparer PRP , PPP
- Ajuster le PRP à 300 000/mm3 par le PPP autologue (résultats obtenus avec du
PRP de moins de 150 000/mm3 à interpréter avec précautions)
d’agonistes
Conditions à respecter+++:
-Calibration avec le PPP (100%) et le PRP (0%)
-Etude à 37°C, PRP sous agitation continue
-Pré-incuber l’échantillon à 37°C pendant au moins 3 min
- Un enregistrement d’au moins 6 min est nécessaire

+++ centres expérimentés
Agrégation plaquettaire par impédance
MULTIPLATE
(sur sang total)
-Méthode plus rapide, simple

Autres explorations
plaquettaires
Cytométrie en flux
- Principe
exploration semi-quantitative des GP membranaires
des PLT à l’aide d’Ac spécifiques marqués par des
fluorochromes
- Anticorps utilisés : anti CD42b (GPIbα), CD41

(GPIIb), CD 61(GPIIIa), CD49b (GPIa), PAC-1
(GPIIbIIIa activée), CD62P (P-selectin, granules α),
CD63 (GP53-LAMP3, granules denses)
Autres explorations
plaquettaires
Techniques spécialisées
- Etude de l’ultrastructure
plaquettaire(ME)
-Sécrétion des granules denses
(ADP, sérotonine) et granules
alpha
- Production de TX
- Dosage des seconds messagers
(Ca++, IP3, DAG)
- biologie moléculaire...
Tests d’exploration du VWF
VWF: Rco
-Il mesure la capacité de liaison du VWF à la GPIb
plaquettaire en présence de ristocétine (antibiotique qui
induit la liaison du VWF à la GPIb plaquettaire).
Valeur Normale: 50% - 200%
Test de première intention (Test fonctionnel)

VWF:RCo diminué dans tous les cas (sauf 2N)
+++ le critère de choix pour le Diagnostic de MW
Tests d’exploration du VWF
La mesure du vWF: Rco +++ Indétectable dans les formes graves,
parallèle au déficit du vWF:Ag dans les déficits quantitatifs et plus abaissé que le
vWF:Ag dans les anomalies qualitatives.
• La mesure du vWF: Ag (Dosage immunologique) ne détecte pas les

anomalies qualitatives du VWF (Il quantifie la protéine en circulation qu’elle soit
fonctionnelle ou non)
• Mesure de la capacité du vWF à se lier au collagène

(vWF:CB) sensible aux variants fonctionnels associés à la perte des multimères de HPM
• Etude de la distribution des multimères de vWF Séparation
des multimères par électrophorèse en gel d’agarose
Dosage du FVIII …
Coagulation
Temps de Quick (TQ)
 Le TQ mesure le temps de formation du caillot
 après la recalcification d’un PPP
 en présence de Thromboplastine
 Facteur Tissulaire (FT) en excès

 Phospholipides procoagulants d’origine et de composition
variables
Réactif de TQ:
-Thromboplastine tissulaire calcique
-inhibiteur de l’héparine
107
Coagulation
Temps de Quick (TQ)
Les résultats sont exprimés

• En secondes (TQ) et sont comparés versus ceux d’un
pool d’au moins 30 plasmas normaux appelés
« témoin »
• Valeurs normales 11 – 13 s selon le réactif utilisé
• En % : Taux de Prothrombine ou TP
70-100%
• En International Normalized Ratio : INR
108
Coagulation
La thromboplastine
 Hétérogénéité de préparation:
-recombinante /Dade Innovin®
-extraction
 Hétérogénéité d’origine:
- d’origine humaine (placenta ou cerveau) /Thromborel®
- d’origine animale (bovine, lapin …)/ Néoplastine® CI Plus
Un même plasma aura des TQ différents selon la

thromboplastine utilisée.
Standardisation en Taux de Prothrombine (TP)
109
Conversion du TQ en TP
- Calibration ou étalonnage grâce à un ou des plasmas citratés
lyophilisés de référence
 Etaloquick:
Néoplatine CI Néoplastine CI Plus
Réactif 1 exemple
87 % 79 %
Réactif 2 34 % 29 %
Réactif 3 24 % 20 %
 Unicalibrator: Effectuer au moins 4 points: pur, 1/2; 1/3 ; 1/4

en tampon OK
Néoplatine CI Néoplastine CI Plus
pur 99 % 93 % 110
Conversion du TQ en TP
Droite de Thivolle
construction de la droite
55
d’étalonnage en coordonnés semi- 50
logarithmiques 45
40
-abscisse: activité en % (inverse 35
psensec
de la dilution ) 30
tem
25
-ordonnée: temps en s 20
15
10
100 50 25 12,5
inverse des dilutions
111
SURVEILLANCE DU TRAITEMENT PAR AVK
Chaque laboratoire utilise une thromboplastine différente. Ainsi un TP mesuré à Gafsa
sera différent à Monastir. L’INR permet de faire concorder et uniformiser les résultats de
deux laboratoires en réduisant la variabilité des résultats exprimés en %:
- Due à l’utilisation de réactifs différents
- et des protocoles et des automates différents
112
Chaque fabricant étalonne son lot de thromboplastine par rapport à
une thromboplastine de référence d’origine humaine fournie par
l’OMS.
Chaque fabricant doit indiquer l’ISI

sur la notice de sa thromboplastine.
L’ISI dépend aussi de l’automate

sur le quel le test est réalisé.
3 types de thromboplastines commercialisées:
-ISI proche de 2: origine animale, peu sensible, à proscrire

-ISI faible entre 1,2 et 1,4
-ISI égal (origine recombinante) ou très proche de1(origine
humaine)
INR et phase pré-analytique
Hémolyse Diminue l’INR
Tube mal rempli Augmente l’INR

(remplissage < 80%)
Température excessive Augmente l’INR
Réfrigération à +4°C Diminue l’INR
Analyse différée Augmente l’INR
114
Temps de Quick: exploration
• Explore la voie extrinsèque et la voie commune.
• Sensible aux déficits en facteur: VII, V et X
• Moins sensible aux déficits en FII et FI
• Insensible au déficit en FXIII
115
TQ allongé:
 Penser à faire un TQ (TP) sur un mélange 50 :

50 (malade + Témoin)
 Différencier entre un déficit en facteur ou un

anti-facteur 116
TQ allongé (TP < 70%) + TCA normal:
 Déficit en FVII
 Carence débutante en vitamine K
 Début de traitement par AVK
 Insuffisance hépatique modérée
117
Coagulation
Temps de Céphaline Activateur (TCA)
 Le TCA mesure le temps de formation du caillot
 après la recalcification d’un PPP en présence de
 de Céphaline
 phospholipides procoagulants d’origine et de composition

variable (substitut des phospholipides plaquettaires)
Contrairement au TQ (thromboplastine en excès), la céphaline

est apportée à une concentration optimale et non en excès.
 d’un activateur de la phase contact (kaolin, célite,

silice, acide ellagique)
118
Coagulation
 Les résultats sont exprimés
 en seconds et sont comparés versus ceux d’un pool
des plasmas normaux appelés « témoin »
Valeurs normales variables selon le réactif utilisé
 en ratio Malade/Témoin
 Valeurs normales
Adulte <1,22
Femme enceinte < 1,20
Nouveau-Né < 1,70
119
Coagulation
Réactifs
Le TCA est un test réactif-dépendant (et automate- dépendant aussi)
La sensibilité du réactif dépend de sa composition en activateur et
en phospholipides
Le choix du réactif dépend du contexte
120
CHOIX du réactif: contexte clinique
Bilan préopératoire ou Surveillance du

Bilan thromboembolique traitement par HNF
syndrome hémorragique
risque hémorragique
Recherche de déficits en Recherche d’un ACC de Sensibilité variable

facteurs type lupus des différents réactifs
(antiphospholipidique)
Choix d’un réactif Établir la zone

sensible aux déficits en Choix d’un réactif sensible thérapeutique en
facteurs de la aux ACC LA (i.e. silice ) fonction d’une
coagulation courbe d’étalonnage
(i.e. kaolin) de l’héparinémie
121
Réactifs du Temps de Céphaline Activateur
Attention
• Le TCA est prolongé en présence de déficiences en PK
ou en KHPM ,pour autant que le réactif utilisé ne
contienne pas de l’acide ellagique comme activateur.
• La concentration en phospholipides varie

considérablement d’un réactif à l’autre. Il s’agit de
l’une des raisons pour lesquelles la sensibilité des
réactifs à la présence d’anticoagulants lupiques varie
de façon marquée.
122
TCA: Exploration
Explore la voie intrinsèque et la voie commune.

Sensible aux déficits en facteurs: KHPM, PK, XII, XI, IX
et VIII
Moins sensible aux facteurs: X, V, II et I.
Insensible au facteur XIII
Sensible à la présence d’héparine standard

(surveillance biologique du ttt par HNF).
123
CAT devant un TCA isolément allongé
 Faire temps de thrombine (TT): (VN : 18-22s).
Si TT allongé :
**mise en évidence d’une antithrombine = HNF:
- Traitement
- Contamination
**PDF
**fibrinogène (déficit, dysfibrinogénémie)
Si TT Normal
-Vérifier l’allongement du TCA sur un 2 ème prélèvement
Faire l’épreuve de Correction

124
Epreuve de CORRECTION
 Choix du plasma témoin :
- Pool de plasmas normaux congelés à -80°C (double

centrifugation), ou plasma lyophilisé de commerce.
- Éviter le choix « d’un plasma témoin du jour »
 Réaliser 3 TCA en parallèle : Temps malade, Temps

témoin et Temps du mélange (Malade + Témoin)
Sans incubation du mélange
Rq: mélanger au moins 250µl du plasma Malade + 250 µl

du plasma Témoin
125
Epreuve de CORRECTION
 Calcul de l’indice de Rosner :
IR= (M+T) - T x100

M
<12% Déficit en Facteur

12 – 15% douteux
>15% présence d’un ACC
126
Indice de Rosner <12%
• Déficit en facteur de la voie intrinsèque
• Dosage des facteurs VIII, IX, XI, XII et VWF
• Dosage de PK et KHPM (rare)
Déficit en FXII, KHPM, PK: absence de

manifestations hémorragiques
127
Indice de Rosner > 15%
 Présence d’un ACC
ACC de type lupique (antiphospholipidique)
Inhibiteur immunologique d’un ou plusieurs des
facteurs de la voie intrinsèque*
* Une incubation prolongée du mélange M+T à 37°C est parfois

nécessaire pour la démonstration de la présence d’un inhibiteur
spécifique immunologique : 2h pour l’anti-VIII, 30 min pour l’anti-IX.
128
Test du mélange avec incubation
Coagulation
Temps de trombine (TT)
Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un PPP

décalcifié, en présence d’une quantité standardisée de
thrombine diluée et de Ca2+
• Réalisé si TCA allongé
•TT allongé si TT malade – TT témoin > 5s
• Si TT allongé:
déficit en fibrinogène
Dysfibrinogénémie
inhibiteur de la thrombine (héparine+++, Ig monoclonale,
PDF…) 130
Coagulation
Temps de Reptilase (TR)
La reptilase est une enzyme extraite à partir

d’un venin de serpent, elle transforme le
fibrinogène en fibrine et elle est insensible à
l’héparine à la différence de la thrombine
TT allongé
Présence d’héparine
TR normal
131
Coagulation
Fibrinogène
-Dosage fonctionnel du fibrinogène par

méthode chronométrique (méthode de Clauss)
-Il mesure le temps de coagulation du plasma dilué du malade
après addition de thrombine à une concentration élevé
impliquant la transformation du fibrinogène en fibrine.
-Il mesure donc l’activité fonctionnelle coagulante du
fibrinogène.
-Le taux normal de fibrinogène est compris entre 2-4g/l
-Le dosage est sensible aux hypofibrinogénémies et aux
dysfibrinogénémies.
132
Coagulation
Fibrinogène
Astuce technique
 Une dilution 1/10 est utilisée en routine.
 Pour les concentrations faibles ( temps mesuré très allongé ),
le plasma doit être dilué à 1/5 (la valeur en fibrinogène lue doit
être divisée par 2).
 Pour les concentrations très élevées , le plasma à tester doit
être dilué à 1/20 (la valeur en fibrinogène lue doit être
multipliée par 2).
133
Coagulation
Fibrinogène
-Dosage antigénique ( méthode immunologique /
immunodiffusion radiale)
Il s’agit d’un dosage quantitatif du fibrinogène
Hypofibrinogénémie Dysfibrinogénémie
Méthode de
clauss  
Méthode
 N
antigénique
Risque hémorragique Risque hémorragique ou

thrombotique
134
Coagulation
TQ/TCA/FIB
TQ et fibrinogène:
-Utiliser la même courbe d’étalonnage pendant la durée

d’utilisation du lot sous réserve d’un contrôle de qualité quotidien
-Refaire la calibration :
 changement du lot
 contrôles en dehors de la fourchette de validation après
vérification des conditions opératoires et des réactifs
TQ , TCA et fibrinogène:
Contrôle N + contrôle P:
-au moins une fois/24h
-à chaque nouveau flacon reconstitué
-après une maintenance de l’analyseur 135
Coagulation
Dosage de l’activité des facteurs de la
coagulation (à l’exception du FXIII)
-Plasmas réactifs déficients en un seul facteur
-Temps de coagulation d’un plasma déficitaire est fonction de la
quantité du facteur apporté par le plasma à tester.
-Résultats exprimés en % de facteur par rapport à des plasmas
normaux étalons.
-Selon le facteur à doser, il sera réalisé un TQ (pour les facteurs II,
VII, V, X) ou un TCA ( pour les facteurs VIII, IX, XI, XII).
-Le TQ ou le TCA ne sont pas réalisés sur des plasmas purs mais sur
plasmas dilués au1/10 dans le tampon d’Owren.
136
Coagulation
Attention
Des niveaux élevés d’un facteur de coagulation peuvent compenser
des niveaux plus bas d’autres facteurs. Par exemple, un facteur VIII
très élevé lors d’une réaction de phase aiguë peut entrainer un TCA
normal en présence d’une réduction en facteurs IX ou XI. Si un
patient présente des antécédents personnels ou familiaux
caractéristiques, suggérant l’existence d’une diathèse hémorragique,
une recherche plus approfondie, comprenant des dosages de facteurs
de coagulation particuliers, peut être justifiée en présence d’un TCA
normal, surtout si son résultat se situe dans la partie supérieure de
l’intervalle de référence.
137
Attention
-Courbe de calibration/Etalonnage
 stabilité variable en fonction du facteur
 meilleure pour FII et FV
 mauvaise pour les facteurs de la voie intrinsèque
138
Dosage de l’activité du facteur XIII
-Le diagnostic du déficit en FXIII est évoqué devant la normalité

du TQ , du TCA contrastant avec un syndrome hémorragique
sévère dès la naissance et souvent caractéristique (chute du cordon
ombilical).
-Le diagnostic est porté par la mee de la solubilité du caillot
(différentes dilutions du plasma) dans une solution d’urée 5M ou
d’acide monochloracétique à 1%.
139
Fibrinolyse
tests globaux
 Test de Fearnley : temps de lyse d’un

caillot de sang total V.N : 5-12h
 Test de Von Kaulla : temps de lyse d’un

caillot d’euglobulines VN : 3-5h.
140
Fibrinolyse
Test de Von Kaulla
-Ce test évalue l’activité fibrinolytique globale t-PA
dépendante.
-Il consiste à faire précipiter en milieu acide les
euglobulines (les facteurs de la coagulation, le
fibrinogène, activateurs du plasminogène), ce qui
laisse dans le surnageant la majorité des inhibiteurs
de la lyse ; on mesure la vitesse de lyse du caillot
obtenu après addition de thrombine
 valeur normale > 3h
 CIVD: temps raccourci de façon modérée.
 Fibrinogénolyse primitive: temps très raccourci
< 15 mn
Autres tests d’exploration de la fibrinolyse
-Dosage du plasminogène, dosage du t-PA, dosage du

PAI-1 et PAI-2…
-Tests indirects:
*Dosage du fibrinogène
*Temps de thrombine
*PDF
*DDi
142
Monomères de fibrine ≠ D-Dimères
Fibrinoformation
Fibrinolyse
143
Limites du TQ/TCA
1. Modèle de la cascade: base théorique

du TQ/TCA
Distinction artificielle entre voie extrinsèque et voie
intrinsèque: loin de la réalité physiologique
2. Phase étudiée par le TQ/TCA

Mesure exclusive du temps de latence entre l’activation
de la coagulation et la formation du caillot.
Vue partielle sur la coagulation (5% de thrombine totale

générée).
Limites du TQ/TCA
3. Réactifs
-Réactifs déclencheurs à des concentrations en excès,
très éloignées des conditions in vivo.
-Hétérogénéité des résultats en fonction des réactifs,
des coagulomètres.
4. Conditions expérimentales
Caractère statique du plasma dans les conditions de
mesure ≠ caractère dynamique in vivo.
Limites du TQ/TCA
5. Sensibilité et spécificité et déficits en
facteurs
-peu sensible au fibrinogène et aux troubles de
polymérisation, insensible au déficit au FXIII.
-Compromis entre sensibilité et spécificité
-Bonne corrélation entre taux en facteurs et
allongement du TQ/TCA entre 5-25%.
6. Phénotype biologique/phénotype clinique
-Pas de garantie de l’absence du risque hémorragique
en cas de temps presque normaux.
-La sévérité du saignement n’est pas corrélée au degré de
l’allongement des TQ/TCA ni au taux du facteur déficitaire.
NOUVEAUX TESTS d’exploration de la coagulation et
de la fibrinoformation
 La thrombinographie ou test de génération

de thrombine (TGT)
La thromboélastographie /
thromboélastométrie rotative
147
TEST DE GENERATION DE THROMBINE
• TGT: une mesure globale et directe du

potentiel hémostatique.
• TGT: étude de la cinétique complète de
l’activité thrombinique au cours de la
coagulation in vitro dans des conditions
définies et appropriées.
CAT/ Calibrated Automated
Thrombin
 Principe:
Mesure automatisée, assistée par ordinateur, de

l’activité de la thrombine en temps réel in vitro
dans un PPP ou PRP après le déclenchement de la
coagulation en présence d’un substrat
fluorogénique lent.
Substrat libérant un signal fluorescent après sa

coupure par la thrombine,
149
ajouté au plasma étudié
150
Etude de la génération de thrombine en
temps réel
15s
151
PARAMÈTRES DU THROMBOGRAMME
200
ttPeak Peak
150
thrombin (nM)
MRI
100
ETP
*Endogenous Thrombin Potential:
50
« Man hours» of thrombin activity
Lag-time (Hemker 1993)
Clotting time
0 10 20
152
time(min) Gerotziafas et al Thrombosis Journal 2005, 3:16
153
Profils de TGT
Etat d’hypercoagulabilité
250
thrombine (nM)
200 normale
150
100
50
0 hypocoagulabilité
0 10 20 154
Temps (min)
THROMBOELASTOGRAPHIE/
THROMBOELASTOMETRIE
 Tracé produit par le changement de la viscosité sanguine liée à
la polymérisation de la fibrine au cours de la coagulation.
• Test global sur sang total natif
• Diagramme en diapason: initiation, stabilisation et lyse du

caillot
155
PARAMÈTRES DU THROMBOELASTOGRAMME
α-angle (°)
Maximum Lysis (%)
MCF = Maximum Clot Firmness (mm)
è Clot Quality
CT = Clotting Time (sec)
CFT = Clot Formation Time (Sec)
156
Différents profils du TEMogramme
Profil normal
Profil d’hypercoagulabilité
Profil d’hyperfibrinolyse
Profil d’hypocoagulabilité
157
PLAN

tests
158
Interrogatoire
Phase Pré-analytique
Tests de première intention
Tests de deuxième intention
Tests spécialisés
Interrogatoire
Est ce que le saignement présente un caractère pathologique?

fréquence, abondance, durée, localisation, circonstances…
Congénital ou acquis?
âge, membre de la famille, consanguinité…
Est il lié à un défaut de l’hémostase primaire, à la coagulation ou
à la fibrinolyse?
cutané, muqueux, muscle, articulation, point de piqure, plaie…
Y’a-t-il une pathologie sous-jacente pouvant être responsable
d’une exacerbation du saignement?
insuffisance hépatique, insuffisance rénale…
Y’a-t-il une notion de prise de médicament pouvant être
responsable du saignement?
AVK, Anti-plaquettaire…
1 ère
éventualité
Plaquettes diminuées
TCA Normal
TQ Normal
Thrombocytopénie
161
2 ème
éventualité
Plaquettes Normale
TCA Allongé
TQ Normal
TO Normal
 Anomalie au niveau de la voie endogène Hémostase primaire et
coagulation exogène normales
162
TCA allongé
Temps de Thrombine
Allongé Non
Allongé
Héparine Test de mélange
HNF*+++ Plasma malade+ PPN
Pas de correction correction
Recherche Dosage des

d’ACC* facteurs
Déficit en
ACC ACC facteurs
spécifiques non spécifiques
163
*ACC: anticoagulant Circulant; HNF: héparine non fractionnée
3 ème
éventualité
Plaquettes Normale
TCA Normal
TQ Allongé
TO Normal
Coagulation exogène anormale (FVII+++)

Hémostase primaire et coagulation endogène normales
164
3 ème
éventualité
TQ Allongé isolément
• Déficit congénital en FVII (rare)
• Début d’un traitement par AVK
• Insuffisance hépatique modérée
• Inhibiteur anti-VII
165
4 ème
éventualité
Plaquettes Normale
TCA Allongé
TQ Allongé
TO Normal
Anomalie de la voie commune

Anomalie de la fibrinoformation
166
4 ème
éventualité
TCA et TQ allongés
Temps de Thrombine
Normal Allongé
Test du mélange Dosage du Fibrinogène
Correction Pas de correction

Dosage des facteurs
II, V, VII, X
Déficit Déficit
Monofactoriel Plurifactoriel 167
5 ème
éventualité
Plaquettes Normale
TCA Normal/Allongé
TQ Normal
TO Allongé
Anomalie de l’Hémostase primaire
168
5 ème
éventualité
Test d’agrégation
plaquettaire
TCA
non Allongé
TO allongé
Exploration du
TCA
facteur
Allongé Willebrand
169
6 ème
éventualité
Plaquettes diminuées
TCA Allongé
TQ Allongé
TO Allongé
L’ensemble de l’hémostase est perturbé
 penser à une CIVD ou à une insuffisance hépatique sévère
170
7 ème
éventualité
Plaquettes Normale
TCA Normal
TQ Normal
TO Normal
Ce bilan ne permet pas d’exclure formellement une pathologie de

l’hémostase
171
7 ème
éventualité
• Le facteur XIII n’est pas exploré par ces tests
• Un déficit modéré en FVIII coagulant ou une

maladie de Willebrand peuvent ne pas être
détectés
• Ne pas oublier les anomalies de la fibrinolyse
172

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Etudes Post-Universitaires en «

Physiologie de l’hémostase (4ème année Ph)

1. Décrire clairement la physiologie de l’hémostase

L’étape pré-analytique en hémostase

Démarche diagnostique et interprétation des

L’étape pré-analytique en hémostase

Démarche diagnostique et interprétation des

Prévention des saignements spontanés

Elle participe à la réparation de la brèche vasculaire et

Série de systèmes en équilibre qui sont intimement

Situation normale: Etat d’équilibre

HEMOSTASE PRIMAIRE COAGULATION

- Système vasculaire: Endothélium et sous endothélium

• L’endothélium vasculaire est une surface

* Richesse en activités enzymatiques qui catabolisent les

Le sous endothélium est une surface

Il permet l’adhésion, l’activation et l’agrégation

Plaquettes: Fragments cytoplasmiques issus des

complexe de 500 à 20 000 kDa, formée par

Sécrétion dans le sang ou le sous-endothélium en

-Une métalloprotéase de 200 kDa

Formation d’un complexe VWF et FVIII:

Sousa NC et al, Haematologica 2007

La lésion du vaisseau sanguin induit des spasmes vasculaires c’est à

Le débit sanguin diminue. L’hémorragie est

Étape 1 : Les plaquettes adhèrent au vWF du sous-endothélial et collagène

Étape2 : Activation et sécrétion des plaquettes

Étape3 : Agrégation plaquettaire

Les plaquettes adhèrent au collagène ancré dans le sous

Foie + Vit K dépendant Proconvertine VII

Précurseur inactif Forme mature

Vitamine KH2 Vitamine KO

X Xa Liaison aux PL membranaires

1. Pas de problème de saignement chez les patients

2. Les patients déficients en FVII ont généralement un

3. Le FVII peut activer le FIX alors qu’ils appartiennent à

-La séparation en trois voies distinctes n’est plus

- Ce schéma moderne de la coagulation est plus

- La lésion de la paroi vasculaire entraîne un contact direct entre le

-Les plaquettes activées fixent les FVa, FVIIIa et le FIXa

-Le FXI active le FIX en FIXa.

-L’activation de 2 cofacteurs ( FVa-FVIIIa ) permet la formation

- Activation des plaquettes

- Activation des FV, FVIII,

-Le complexe Ténase intrinsèque (FVIIIa,FIXa, PL,

-Le FXa en association avec le FVa constitue le

-Ce complexe prothrombinase est responsable

-Le complexe FVIIIa-FIXa est environ 50 fois plus efficace

que le complexe FVIIa- FT pour activer le FX. Ainsi, la plus

En absence du FVIII ou du FIX, la tenase intrinsèque ne peut

-Lorsque la cc de thrombine atteint un certain seuil, la

Pour éviter une activation diffuse et continue du processus de la

On connaît trois systèmes d’inhibiteurs principaux:

- Le système de l’antithrombine (AT).

Sa finalité est l’inverse de celle de l’HI et de la

Il s’agit donc d’un phénomène physiologique qui

L’étape pré-analytique en hémostase

Démarche diagnostique et interprétation des

La qualité des examens d’hémostase dépend de

1- Paramètres liés au patient

2- Paramètres liés au prélèvement

3- Paramètres liés au spécimen

De nombreux médicaments peuvent influencer les