Cinétique Enzymatique

C
O L L E C T I O N
R E N O B L E
C I E N C E S
DIRIGE PAR JEAN BORNAREL
CINTIQUE ENZYMATIQUE
Athel CORNISH-BOWDEN Marc JAMIN Valdur SAKS
Grenoble Sciences poursuit un triple objectif : raliser des ouvrages correspondant un projet clairement dfini, sans contrainte de mode ou de programme, garantir les qualits scientifique et pdagogique des ouvrages retenus, proposer des ouvrages un prix accessible au public le plus large possible. Chaque projet est slectionn au niveau de Grenoble Sciences avec le concours de referees anonymes. Puis les auteurs travaillent pendant une anne (en moyenne) avec les membres dun comit de lecture interactif, dont les noms apparaissent au dbut de louvrage. Celui-ci est ensuite publi chez lditeur le plus adapt. Deux collections existent chez EDP Sciences : la Collection Grenoble Sciences, connue pour son originalit de projets et sa qualit Grenoble Sciences - Rencontres Scientifiques, collection prsentant des thmes de recherche dactualit, traits par des scientifiques de premier plan issus de disciplines diffrentes. Jean BORNAREL, Professeur l'Universit Joseph Fourier, Grenoble 1 Serge CHESNE, Matre de Confrences l'Universit de La Runion Jean-Marie FRRE, Professeur l'Universit de Lige Michel VAN DER REST, Professeur l'Ecole Nationale Suprieure de Lyon, Directeur-adjoint de la Recherche Julien BRVIER Grenoble Sciences reoit le soutien du Ministre de l'ducation nationale, du Ministre de la Recherche, et de la Rgion Rhne-Alpes. Ralisation et mise en pages : Centre technique Grenoble Sciences Directeur scientifique de Grenoble Sciences (Contact : Tl. : (33)4 76 51 46 95 - E-mail : Grenoble.Sciences@ujf-grenoble.fr)
Grenoble Sciences
Comit de lecture pour Cintique enzymatique
et
Illustration de couverture : Alice GIRAUD partir dune image originale reprsentant la structure de la cratine kinase fournie par le Professeur Theo WALLIMANN et le Docteur Uwe SCHLATTNER de ETH de Zurich (Suisse) ISBN 2-86883-742-5 EDP Sciences, 2005 Portland Press, Ltd. London, 2004 This translation of portions of FUNDAMENTALS OF ENZYME KINETICS first published in (1995, 2004) is published by arrangement with Portland Press, London
Athel CORNISH-BOWDEN Marc JAMIN Valdur SAKS
Ouvrages Grenoble Sciences dits par EDP Sciences

Chimie. Le minimum savoir (J. Le Coarer) - Electrochimie des solides (C. Dportes et al.) - Thermodynamique chimique (M. Oturan & M. Robert) - Chimie organomtallique (D. Astruc) - De l'atome la raction chimique (sous la direction de R. Barlet)
Collection Grenoble Sciences
Exercices corrigs d'analyse, T. 1 et 2 (D. Alibert) - Introduction aux varits diffrentielles (J. Lafontaine) - Analyse numrique et quations diffrentielles (J.P. Demailly) - Mathmatiques pour les sciences de la vie, de la nature et de la sant (F. & J.P. Bertrandias) - Approximation hilbertienne. Splines, ondelettes, fractales (M. Attia & J. Gaches) - Mathmatiques pour ltudiant scientifique, T. 1 et 2 (Ph.J. Haug)
Introduction la mcanique statistique (E. Belorizky & W. Gorecki) - Mcanique statistique. Exercices et problmes corrigs (E. Belorizky & W. Gorecki) - La cavitation. Mcanismes physiques et aspects industriels (J.P. Franc et al.) - La turbulence (M. Lesieur) - Magntisme : I Fondements, II Matriaux et applications (sous la direction dE. du Trmolet de Lacheisserie) - Du Soleil la Terre. Aronomie et mtorologie de lespace (J. Lilensten & P.L. Blelly) - Sous les feux du Soleil. Vers une mtorologie de lespace (J. Lilensten & J. Bornarel) - Mcanique. De la formulation lagrangienne au chaos hamiltonien (C. Gignoux & B. Silvestre-Brac) - Problmes corrigs de mcanique et rsums de cours. De Lagrange Hamilton (C. Gignoux & B. Silvestre-Brac) - La mcanique quantique. Problmes rsolus, T. 1 et 2 (V.M. Galitsky, B.M. Karnakov & V.I. Kogan) - Analyse statistique des donnes exprimentales (K. Protassov) - Description de la symtrie. Des groupes de symtrie aux structures fractales (J. Sivardire) - Symtrie et proprits physiques. Du principe de Curie aux brisures de symtrie (J. Sivardire)
Bactries et environnement. Adaptations physiologiques (J. Pelmont) - Enzymes. Catalyseurs du monde vivant (J. Pelmont) - La plonge sous-marine l'air. L'adaptation de l'organisme et s e s limites (Ph. Foster) - Endocrinologie e t communications cellulaires (S. Idelman & J. Verdetti) - Elments de biologie l'usage d'autres disciplines (P. Tracqui & J. Demongeot Bionergtique (B. Gurin) L'Asie, source de sciences et de techniques (M. Soutif) - La biologie, des origines nos jours (P. Vignais) - Naissance de la physique. De la Sicile la Chine (M. Soutif) - Le rgime omga 3. Le programme alimentaire pour sauver notre sant (A. Simopoulos, J. Robinson, M. de Lorgeril & P. Salen) - Gestes et mouvements justes. Guide de l'ergomotricit pour tous (M. Gendrier)
Listening Comprehension for Scientific English (J. Upjohn) - Speaking Skills in Scientific English (J. Upjohn, M.H. Fries & D. Amadis) - Minimum Competence in Scientific English (S. Blattes, V. Jans & J. Upjohn) Radiopharmaceutiques. Chimie des radiotraceurs et applications biologiques (sous la direction de M. Comet & M. Vidal) - Turbulence et dterminisme (sous la direction de M. Lesieur) Mthodes et techniques de la chimie organique (sous la direction de D. Astruc) - L'nergie de demain. Techniques, environnement et conomie (sous la direction de H. Nifenecker)
Grenoble Sciences - Rencontres Scientifiques
PRFACE
Dans le contexte post-gnomique actuel, la recherche en biologie doit faire face de nouveaux dfis et tendre ses domaines dinvestigation vers des niveaux de complexit croissante. Il sagit notamment de dterminer la structure et la fonction de toutes les protines encodes dans les gnomes tudis, de comprendre les processus de contrle de lexpression diffrentielle de ces protines dans les diffrents types de cellules dun organisme vivant, de mettre en vidence les interactions protine/protine en relation avec leur implication dans les phnomnes biologiques (protomique) ou encore de dcrire de manire quantitative le fonctionnement molculaire dun organisme dans ses tats normaux et physiopathologiques. Ce dernier domaine dtude constitue, dans la mouvance scientifique actuelle, ltude du physiome ou physiologie gnomique. Cette physiologie gnomique a pour objectif de dcrire le fonctionnement des organismes vivants en allant du gnome vers le protome et le mtabolome jusqu la caractrisation du fonctionnement intgr des cellules, des tissus et des organes. Cette tude de systmes mtaboliques complexes repose sur le dveloppement de modles comprhensibles des systmes biologiques par des mthodes de modlisation mathmatique, un domaine aujourdhui en plein essor, et sur lutilisation de la cintique enzymatique pour obtenir les donnes quantitatives ncessaires pour cette analyse. La cintique enzymatique a pour objectif didentifier et de dcrire les mcanismes de raction en tudiant leur vitesse et les flux mtaboliques. En partant des enzymes isols et en allant vers des systmes mtaboliques organiss et intgrs, les mthodes de cintique enzymatique permettent de dcrire de manire quantitative les proprits catalytiques des enzymes et les mcanismes de leur rgulation. Historiquement, les lois gouvernant la vitesse des processus chimiques ont t dcouvertes empiriquement dans le courant du XIXe sicle et les explications thoriques rendant compte des observations phnomnologiques sont apparues au dbut du XXe sicle, sur la base des dcouvertes de la physique molculaire, de la thermodynamique chimique et statistique et de la mcanique quantique. La cintique enzymatique utilise les thories et les dcouvertes de la cintique chimique pour la description et ltude des mcanismes des ractions catalyses par des enzymes, les catalyseurs biologiques, qui sont essentiellement des protines comportant des sites actifs catalytiques. Dans les tudes biochimiques fondamentales, les mthodes cintiques sont combines avec des tudes structurales et des mthodes de biologie molculaire, telle la mutagense dirige, afin daboutir une description du
mcanisme ractionnel au niveau atomique. Ainsi, la cintique enzymatique est un outil important et ncessaire dans de nombreuses tudes biochimiques mais sa nature quantitative et sa capacit prvoir l'volution dun processus biochimique au cours du temps, en font galement un lment de base de la biotechnologie. La cintique enzymatique constitue donc une part importante de la culture et de la connaissance biochimique que les tudiants en biologie, quelle que soit leur spcialisation, devraient acqurir au cours de leur cursus. Il existe plusieurs ouvrages classiques de cintique enzymatique en anglais (SEGEL, CORNISH-BOWDEN, GUTFREUND) qui constituent une source de formation et dinformation suffisamment dtaille et complte de ce type dapproche. Toutefois, la situation en langue franaise est diffrente. Lexcellent ouvrage de J. PELMONT intitul Enzymes donne une bonne description de lenzymologie, mais principalement de ses aspects qualitatifs. Le but de notre ouvrage est de fournir un manuel de rfrence pour la cintique enzymatique, complmentaire de celui de PELMONT. Dans ce but, nous avons traduit et adapt le livre dAthel CORNISH-BOWDEN intitul Fundamentals of Enzyme Kinetics en utilisant le matriel du cours denzymologie donn lUniversit Joseph Fourier de Grenoble par Valdur SAKS et Marc JAMIN. Ce livre commence par une description des principes simples de la cintique chimique et de la thermodynamique et comprend une description dtaille de la cintique dans des conditions dtat stationnaire pour les enzymes un ou plusieurs substrats, des phnomnes dinhibition et dactivation, de la rgulation allostrique et de la cooprativit dans les ractions enzymatiques. Il aborde les systmes multienzymatiques et lanalyse du contrle mtabolique en prsentant une analyse soigneuse des applications pratiques de ces mthodes. Nous esprons que ce nouvel ouvrage comblera le vide existant dans la littrature en langue franaise et sera utile aussi bien pour les tudiants de licence et de master que pour les chercheurs dans tous les domaines de la biologie. Les auteurs remercient tout particulirement Lonard CHAVAS qui, au cours de sa matrise de biochimie l'Universit Joseph Fourier de Grenoble, a contribu de manire importante la traduction et l'adaptation des premiers chapitres de ce livre, ainsi que Madame Simone JERME et Monsieur Philippe MOTTET de la Bibliothque des Sciences de lUniversit Lige pour leur aide dans la consultation de documents concernant Victor HENRI. Athel CORNISH-BOWDEN Marc JAMIN Valdur SAKS
1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE

1.1. INTRODUCTION
Les enzymes sont des catalyseurs biologiques qui jouent un rle central dans le monde vivant. Les ractions essentielles pour le fonctionnement d'un tre vivant sont trop lentes et sans la prsence de ces catalyseurs, la vie telle que nous la connaissons aujourd'hui ne serait pas possible. Qu'il s'agisse de ractions simples comme la formation de bicarbonate partir d'eau et de dioxyde de carbone ou de ractions complexes comme la rplication de l'ADN, chaque raction chimique se droulant au sein d'un tre vivant est catalyse par un ou plusieurs enzymes spcifiques. Les enzymes sont des macromolcules, des protines ou des ARN (les ARN catalytiques sont plus correctement dnomms ribozymes), qui reconnaissent spcifiquement certaines molcules et acclrent les ractions de transformation de ces molcules suffisamment pour que leur vitesse devienne compatible avec le fonctionnement de l'organisme. Un second rle essentiel jou par les enzymes est d'assurer le couplage physique entre ractions endergoniques et ractions exergoniques et de permettre ainsi de maintenir les systmes biologiques dans des tats hors d'quilibre, galement indispensables pour le maintien de la vie. La comprhension du mcanisme molculaire des processus biologiques reste un des objectifs majeurs de la biologie moderne. En particulier, l'tude des ractions enzymatiques vise comprendre les mcanismes ractionnels mais aussi tablir de manire quantitative comment un enzyme est capable d'acclrer spcifiquement une raction chimique. Puisque les enzymes agissent en modifiant la vitesse des ractions, il est ncessaire d'tudier la cintique des ractions pour comprendre leur mode d'action. Dans ce premier chapitre, nous allons commencer par rappeler les conventions et les concepts de base de la cintique chimique, qui seront utiles pour la comprhension de la cintique enzymatique : la vitesse de raction, les notions de raction lmentaire, d'ordre et de molcularit d'une raction.
Les conventions d'criture des ractions chimiques

Une raction chimique est un processus au cours duquel une ou plusieurs substances chimiques (molcules) se transforment en une ou plusieurs autres substances chimiques, par un rarrangement des lectrons et des liaisons entre les atomes
constitutifs. Ce processus implique gnralement la rupture ou la formation de nouvelles liaisons chimiques. Une raction chimique peut tre reprsente par une quation telle que celle de la figure 1.1 en respectant les conventions tablies. Les substrats (ractifs) sont les substances qui disparaissent au cours de la raction et sont reprsentes dans la partie gauche de l'quation. Les produits sont les substances qui apparaissent au cours de la raction et sont reprsentes dans la partie droite de l'quation.
Sens de la raction directe Ractif Constante d'quilibre Constante de vitesse de la raction directe Coefficient stchiomtrique
K
k1
Coefficient stchiomtrique Sens de la raction inverse
aA
k1
pP
x
Produit Constante de vitesse de la raction inverse
[A]0 x
Avancement de la raction
Concentration initiale de A
1.1 - Reprsentation schmatique d'une raction chimique et conventions d'criture
Dans ce livre nous suivons autant que possible les recommandations du Nomenclature Committee de l'IUBMB (IUB, 1982). Nanmoins, comme ces recommandations permettent une certaine latitude et qu'elles ne couvrent pas toujours tous les cas dont nous aurons traiter, il est utile de commencer par noter quelques points qui s'appliquent de manire gnrale ce manuel. Premirement, il est essentiel de reconnatre qu'une substance chimique et sa concentration sont deux entits diffrentes qui doivent tre reprsentes par des symboles diffrents. Les recommandations permettent sans dfinition pralable, de reprsenter la concentration d'une substance par le symbole de la substance entour de crochets, ainsi [glucose] reprsente la concentration de glucose, [ A ] reprsente la concentration de la substance A Dans ce livre, nous avons choisi d'utiliser cette convention qui peut, dans le cas d'quations complexes, compliquer la notation en raison de la multiplication des crochets et des parenthses mais qui a l'avantage d'tre utilise couramment par les tudiants. Puisque l'un des objectifs de ce manuel est de fournir aux tudiants une premire approche vers l'tude des systmes enzymatiques, nous avons choisi d'utiliser cette notation courante. En cela, ce manuel diverge de la version originale en anglais qui utilise une notation simplifie. Nanmoins, afin d'viter toute confusion entre le texte et les symboles utiliss pour les grandeurs exprimentales, ces dernires seront crites en italique.
Pour reprsenter les ractifs, nous utiliserons les recommandations de l'IUBMB et dsignerons les substrats par les lettres A, B, C et les produits par les lettres P, Q, R Les coefficients stchiomtriques apparaissent comme des nombres qui prcdent les ractifs et les produits respectifs. La raction est symbolise par une ) ou double ( ) selon que la raction est ou non flche qui peut tre simple ( rversible. Dans le cas d'une raction rversible, le sens direct de la raction est dfini comme celui de la conversion des substrats en produits (il est reprsent par la flche dirige vers la droite) alors que le sens inverse est dfini comme celui de la conversion des produits en ractifs (il est reprsent par la flche dirige vers la gauche). Dans le cas d'une raction rversible, la dfinition du sens de la raction est arbitraire, puisque la raction peut galement tre dcrite par l'quilibre inverse. Nanmoins, le sens de la raction est important pour la dfinition des grandeurs thermodynamiques et doit tre dfini prcisment lors de l'analyse du systme. Les constantes de vitesse et d'quilibre apparaissent en vis--vis des flches correspondantes. Pour distinguer ces deux types de constantes, il est recommand de suivre les conventions et de reprsenter les constantes d'quilibre par des lettres majuscules et les constantes de vitesse par des lettres minuscules. De plus, comme nous allons le voir, les ractions enzymatiques consistent presque toujours en deux ou plusieurs tapes, et puisque nous aurons besoin de symboles pour faire rfrence ces diffrentes tapes, il est ncessaire de disposer d'un systme adquat d'indexation afin de prciser quel symbole fait rfrence une tape donne. Les recommandations de l'IUBMB n'imposent aucun systme en particulier, mais au contraire impose de dcrire le systme utilis. Parce que le mme symbole, par exemple k2, peut tre utilis de diverses manires dans la littrature biochimique, il est prudent de toujours dfinir clairement ce qu'il signifie. Le systme utilis dans ce manuel est le suivant : pour une raction comportant n tapes, celles-ci sont numrotes 1, 2 n ; un k minuscule et italique avec un indice positif dsigne la constante de vitesse de la raction directe dont le numro correspond l'indice, c'est--dire que, dans ce cas, k2 est la constante de vitesse pour la raction directe de la seconde tape de la raction ; le mme symbole mais avec un indice ngatif est utilis pour reprsenter la constante de vitesse de la raction inverse, par exemple k2 pour la seconde tape ; un K majuscule et italique avec un indice est utilis pour reprsenter la constante d'quilibre (thermodynamique) de l'tape, dsigne par l'indice et typiquement quivalente au rapport des constantes de vitesse, c'est--dire que K 2 = k 2 k 2 . Lorsqu'elles sont ncessaires, des indications sur les concentrations des ractifs et des produits, ainsi que sur la relation entre celles-ci et l'avancement de la raction, peuvent tre indiques par des symboles ou des valeurs places en dessous des ractifs et des produits correspondants. Les catalyseurs sont rgnrs la fin de la raction ; ils peuvent tre incorpors dans l'quation la fois dans les ractifs et dans les produits ou apparatre sous la forme d'une indication place en vis--vis des flches.
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1.2. LES PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE

1.2.1. Vitesse de raction et quation de vitesse
La vitesse d'une raction chimique est une mesure de la rapidit avec laquelle la concentration des ractifs et des produits change au cours du temps. La vitesse de la raction peut tre dfinie partir de la disparition des ractifs ou partir de l'apparition du produit. Si la concentration d'un ractif, reprsente par [ A ] , varie d'une quantit [ A ] pendant l'intervalle de temps D t, la vitesse est donne par v = [ A ] t . En d'autres termes, la vitesse est la variation par unit de temps de la concentration de l'une des substances initiales ou finales. Si la variation est considre sur un temps infiniment court, nous obtenons la vitesse instantane de la raction : d[ A] d[ P ] v = 1 = 1 [1.1] a dt p dt o a et p reprsentent les coefficients stchiomtriques de la raction limitant la vitesse. Les deux variations de la concentration dfinissent la vitesse de la raction v, qui peut indiffremment tre dfinie en termes d'apparition des produits ou de disparition des ractifs puisque chaque molcule de A consomme est convertie en une molcule P. Si la raction implique plusieurs substrats ou plusieurs produits, la vitesse de la raction peut tre dfinie vis--vis de chacun de ceux-ci. L'objectif d'une tude cintique est de mesurer la vitesse de la raction considre, et, pour cela, il est ncessaire de disposer d'une mthode qui permette de suivre l'volution de la concentration au cours du temps d'au moins un des ractifs ou des produits. Ces problmes pratiques seront discuts dans le chapitre 4. Malheureusement, la mesure de la vitesse dans un seul ensemble de conditions exprimentales n'est pas suffisante pour dterminer le mcanisme d'une raction. Pour mieux comprendre les mcanismes ractionnels, il est ncessaire d'tablir les quations de vitesse de la raction, c'est--dire d'tablir des quations qui rendent compte de la dpendance de la vitesse vis--vis de la concentration des ractifs, [ A ] , et des produits, [ P ] ou vis--vis de certains paramtres extrieurs comme la temprature, T, la pression, p, ou le pH. [1.2] v = f [ A ] , [ P ] , T , p , pH K La condition ncessaire pour qu'une raction chimique se produise entre les ractifs est que ces particules entrent en contact, c'est--dire qu'elles se rapprochent suffisamment les unes des autres pour que la raction puisse se drouler. On conoit aisment que la vitesse d'une raction soit proportionnelle au nombre de collisions entre ces particules. Puisque le nombre de collisions est d'autant plus lev que la concentration des ractifs est leve, la vitesse de la raction est proportionnelle au produit des concentrations des ractifs. Ces considrations sont
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synthtises dans la loi d'action de masses tablie par GULDBERG et WAAGE (1867) : temprature constante, la vitesse d'une raction est proportionnelle au produit des concentrations des ractifs o chacune des concentrations entrant dans ce produit est leve une puissance gale au coefficient stchiomtrique de ce ractif dans l'quation chimique de la raction. Ainsi, pour la raction 2A + B P [1.3] [1.4] l'quation de vitesse est donne par v = k [ A ]2 [ B ]
o k est un coefficient de proportionnalit appel constante de vitesse de la raction. La loi d'action des masses peut se vrifier simplement en mesurant l'effet sur la vitesse de la raction de la variation de la concentration d'un des ractifs.
1.2.2. Mcanisme de raction et ractions lmentaires

Le mcanisme d'une raction dcrit comment la raction se droule. Pour un grand nombre de ractions, plusieurs mcanismes sont possibles. Le mcanisme retenu doit tre en accord avec la loi de vitesse observe exprimentalement, mais plusieurs mcanismes peuvent avoir la mme loi de vitesse. Les tudes cintiques permettent d'carter certains mcanismes mais ne permettent pas d'affirmer qu'un mcanisme est le mcanisme correct. Gnralement, le mcanisme ractionnel retenu sera le mcanisme le plus simple qui soit en accord avec l'ensemble des donnes exprimentales et toutes les donnes exprimentales indpendantes doivent tre utilises pour dfinir le mcanisme le plus plausible. Si la raction se droule en une seule tape, on parle de raction lmentaire. Dans ce cas, l'ordre et la molcularit de la raction s'valuent facilement (voir 1.2.3). Nanmoins, de nombreux mcanismes ractionnels sont constitus d'une combinaison de plusieurs tapes, qui s'additionnent pour donner la raction globale. C'est notamment le cas des ractions faisant intervenir des catalyseurs.
1.2.3. Ordre et molcularit d'une raction

Une raction chimique peut tre classe selon sa molcularit ou selon son ordre. La molcularit fait rfrence au nombre de molcules altres au cours de la P est unimolculaire (parfois appele monoraction. Une raction de type A P est bimolculaire. Les ractions molculaire), et une raction de type A + B de molcularit suprieure deux sont extrmement rares, mais, si elle existait, une raction de type A + B + C P serait dite trimolculaire (ou termolculaire). L'ordre est une description de la cintique de la raction qui dcoule directement de la loi d'action des masses ; il dfinit le nombre de termes de concentration qui doivent tre multiplis pour obtenir l'quation de vitesse de la raction. Ainsi, dans une raction de premier ordre, la vitesse est proportionnelle la concentration d'un
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seul ractif, dans une raction de second ordre, elle est proportionnelle au produit de deux concentrations ou au carr de la concentration d'un seul ractif, et ainsi de suite. Pour une raction simple qui consiste en une seule tape ou pour chaque tape lmentaire d'une raction complexe, l'ordre est gnralement identique la molcularit. Toutefois, beaucoup de ractions impliquent une srie d'tapes unimolculaires ou bimolculaires, et la molcularit globale de la raction ne correspond pas ncessairement l'ordre global de la raction. En fait, l'ordre d'une raction complexe n'est gnralement pas significatif, puisque la vitesse ne peut pas toujours tre exprime comme le produit de termes de concentrations. Comme nous le verrons dans les prochains chapitres, cette situation est quasiment universelle dans la cintique enzymatique, et mme la plus simple des ractions enzymatiques ne possde pas d'ordre simple. Nanmoins, le concept d'ordre de raction est trs important pour comprendre la cintique enzymatique, parce que les tapes individuelles des ractions catalyses par des enzymes ont habituellement des ordres simples ; elles sont de premier ou de second ordre. La fixation d'une molcule de substrat sur une molcule d'enzyme est un exemple typique de raction bimolculaire de second ordre, alors que la conversion du complexe enzymesubstrat en produits ou en un intermdiaire est un exemple typique de raction unimolculaire du premier ordre. P, la vitesse v est exprime par Pour une raction du premier ordre A l'quation suivante : d[ P ] [1.5] v = = k [ A ] = k ([ A ]0 [ P ]) dt dans laquelle [ A ] et [ P ] reprsentent respectivement les concentrations de A et P n'importe quel temps t, et k reprsente la constante de vitesse de premier ordre. Le second terme de l'quation spcifie que la raction est de premier ordre, puisqu'il montre que la vitesse est directement proportionnelle la concentration du ractif A leve la puissance 1. Finalement, si au temps initial de la raction, t = 0, la concentration [ A ] = [ A ]0 , la stchiomtrie permet de relier les valeurs de [ A ] et de [ P ] tout moment de la raction, en accord avec l'quation de conservation [ A ] + [ P ] = [ A ]0 , et permet d'crire le dernier terme de l'quation. L'quation [1.5] peut facilement tre intgre en isolant les deux variables [ P ] et t, c'est--dire en plaant tous les termes en [ P ] dans la partie gauche de l'quation et tous les termes en t dans la partie droite.
d[ P ] = k dt [ A ]0 [ P ]
Aprs intgration, nous obtenons :
[1.6]
ln([ A ]0 [ P ]) = k t + a
o a est une constante d'intgration.
[1.7]
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Celle-ci peut tre value en considrant qu'il n'y a pas de produit P au dbut de la raction, c'est--dire que [ P ] = 0 quand t = 0. Alors, a = ln([ A ]0 ) , et l'quation [1.7] peut tre rcrite :
[ A ]0 [ P ] ln = kt [ A ]0
[1.8]
En prenant l'exponentielle des deux cts de l'quation, nous obtenons l'quation
[ A ]0 [ P ] = e k t [ A ]0
qui peut tre rarrange pour donner :
[1.9]
[ P ] = [ A ]0 ( 1 e k t )
[1.10]
Il est important de noter que la constante d'intgration a est diffrente de zro et qu'elle doit tre value et utilise pour obtenir les quations [1.8] [1.10]. Les constantes d'intgration doivent toujours tre incluses et values lors de l'intgration des quations de cintique ; elles sont rarement nulles. Le type le plus commun de raction bimolculaire est celui de la forme P + Q, dans lequel deux sortes de molcules, A et B, ragissent pour A+B donner des produits. Dans ce cas, il est commun que la vitesse soit donne par une expression du second ordre de la forme :
d[ P ] [1.11] = k [ A ][ B ] = k ([ A ]0 [ P ])([ B ]0 [ P ]) dt o k est la constante de vitesse de second ordre. Il faut noter que le symbolisme conventionnel utilis pour les constantes de vitesse ne prvoit pas de distinguer l'ordre de ces constantes. L'intgration est ralise en sparant les variables [ P ] et t : v =
d[ P ] ([ A ] [ P ])([ B ] [ P ]) = k dt 0 0
[1.12]
Pour le lecteur ayant une exprience limite en mathmatiques, la manire la plus simple et la plus fiable de rsoudre cette intgration est de consulter des tables d'intgrales standards. Dans ce cas prcis, l'intgration peut galement tre ralise en multipliant les deux cts de l'quation par ( [ B ]0 [ A ]0 ) et en sparant la partie gauche de l'quation en deux intgrales simples :
d[ P ] d[ P ] = ([ B ]0 [ A ]0 ) k dt [ A ]0 [ P ] [ B ]0 [ P ]
De l, nous obtenons :
[1.13]
ln ([ A ]0 [ P ]) + ln ([ B ]0 [ P ]) = ([ B ]0 [ A ]0 ) k t + a
[1.14]
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En considrant que [ P ] = 0 au temps t = 0, nous obtenons une valuation de la constante d'intgration a = ln( [ B ]0 [ A ]0 ) et l'quation devient :
[ A ]0 ([ B ]0 [ P ]) ln = ([ B ]0 [ A ]0 ) k t [ B ]0 ([ A ]0 [ P ])
ou
[1.15] [1.16]
[ A ]0 ([ B ]0 [ P ]) = e ([ B ] 0 [ A ] 0 ) k t [ B ]0 ([ A ]0 [ P ])
Un cas particulier de cette quation est intressant : si [ A ]0 est trs petit par rapport [ B ]0 , alors, tout moment de la raction, [ P ] doit galement tre trs petit par rapport [ B ]0 car [ P ] ne peut jamais tre plus grand que [ A ]0 . De cette manire, ( [ B ]0 [ A ]0 ) et ( [ B ]0 [ P ] ) peuvent tous les deux tre assimils [ B ]0 et l'quation [1.16] peut tre simplifie comme suit :
[ P ] = [ A ]0 ( 1 e k [ B ] 0 t )
[1.17]
Cette quation a exactement la mme forme que l'quation [1.10], qui est l'quation d'une raction du premier ordre. Cette situation est connue comme une raction de pseudo-premier ordre, et k [ B ]0 est une constante de pseudo-premier ordre. Cette situation se prsente si l'un des ractifs est le solvant, comme dans la majorit des ractions d'hydrolyse, mais il est parfois utile de se placer dlibrment dans des conditions de pseudo-premier ordre de manire simplifier l'valuation de la constante de vitesse comme nous en discuterons au 3.8. P n'impliquent habituellement Les ractions trimolculaires comme A + B + C pas une seule tape trimolculaire, et ne sont donc pas des ractions d'ordre trois. Inversement, ces ractions se droulent en deux ou plusieurs tapes lmentaires, X, suivi par X + C P. Si une des tapes est plus lente que comme A + B les autres, la constante de vitesse de la raction est trs proche de la constante de vitesse de l'tape la plus lente, qui est alors dnomme l'tape limitante de la raction. Si aucune tape n'est clairement limitante, l'quation de vitesse sera vraisemblablement complexe et l'ordre de la raction ne correspondra pas obligatoirement un nombre entier. Quelques ractions trimolculaires donne lieu une cintique d'ordre trois, avec v = k [ A ][ B ][ C ] , o k est une constante de troisime ordre, sans toutefois impliquer des collisions entre les trois ractifs qui sont des vnements fondamentalement improbables. Dans un mcanisme deux tapes, comme celui prsent ci-dessus, si la premire tape est en quilibre rapide, la concentration de l'intermdiaire X peut tre exprime partir de la constante d'quilibre : [ X ] = K [ A ][ B ] , o K est la constante d'quilibre pour la raction entre A B, c'est--dire la constante d'association de X. La vitesse de la raction correspond la vitesse de la seconde tape qui est donne par l'quation : [1.18] v = k' [ X ][ C ] = k' K [ A ][ B ][ C ] o k' est la constante de vitesse de second ordre pour la seconde tape. Ds lors, la constante apparente de vitesse de troisime ordre correspond en ralit au produit d'une constante de vitesse de second ordre et d'une constante d'quilibre.
15
On observe aussi quelques ractions d'ordre zro, c'est--dire des ractions qui ont une vitesse constante, indpendante de la concentration de substrat. Une raction peut tre d'ordre zro par rapport l'un des substrats, signifiant simplement que ce ractif intervient dans la raction en aval de l'tape limitante. Cependant, quelques ractions sont globalement d'ordre zro, c'est--dire qu'elles ne dpendent de la concentration d'aucun ractif. Ce sont invariablement des ractions catalyses et sont observes uniquement si chaque ractif est prsent en large excs de telle sorte que le catalyseur a atteint son efficacit maximum. Les cintiques d'ordre zro sont communment rencontres dans les ractions enzymatiques, lorsque la vitesse approche sa valeur limite pour des concentrations leves de substrat.
1.2.4. Dtermination de l'ordre d'une raction

La manire la plus simple de dterminer l'ordre d'une raction consiste mesurer la vitesse v pour diffrentes concentrations de substrat [ A ] . Ensuite, en traant le graphique de log v en fonction de log [ A ] , on obtient une droite dont la pente est gale l'ordre de la raction. Si les concentrations de tous les ractifs sont varies dans un rapport constant, la pente du graphique donne l'ordre global de la raction. Toutefois, il est utile de connatre l'ordre respectif pour chacun des ractifs qui peut tre obtenu en modifiant indpendamment la concentration de chaque ractif et en maintenant constante la concentration des autres. Dans ce cas, la pente de la droite est prcisment gale l'ordre partiel de la raction pour le ractif dont la concentration est prise comme variable. Par exemple, si la raction est du second ordre en A et du premier ordre en B, la vitesse est donne par l'quation :
v = k [ A ]2 [ B ]
qui peut galement s'crire : log v = log k + 2 log [ A ] + log [ B ]
[1.19] [1.20]
Le graphique de log v en fonction de log [ A ] (dans des conditions o [ B ] est maintenue constante) a une pente de 2, alors que le graphique log v en fonction de log [ B ] (en maintenant [ A ] constant) a une pente de 1. Ces graphiques sont illustrs la figure 1.2. Les caractristiques et l'allure de diffrents graphiques pour les trois ordres diffrents de raction les plus communment rencontrs, l'ordre 0, 1 et 2, sont prsentes dans le tableau 1.1. Il est important de raliser que si les vitesses sont dtermines partir des courbes d'volution de la raction (correspondant aux courbes de la variation de la concentration d'un ractif en fonction du temps), la concentration de chaque ractif varie. En consquence, pour obtenir des rsultats corrects, il est ncessaire soit de maintenir la concentration des ractifs dans un rapport stchiomtrique constant, permettant la dtermination de l'ordre global de la raction, soit (et c'est le cas le plus courant) d'avoir les ractifs constants prsents en large excs au dbut de la raction de telle sorte que la variation de leur concentration soit ngligeable.
16
0,4
log v
0,4
log v
0,2
0,2
Pente = 2
0 0
Pente = 1
0,2
0,4
log [A]
0,2
0,4
log [B]
1.2 - Dtermination de l'ordre de raction Les droites sont traces pour une raction du second ordre (a) et du premier ordre(b), impliquant que les pentes de ces droites valent respectivement 2 et 1.
Si aucune de ces alternatives n'est possible, la vitesse doit tre dtermine partir de la pente au temps initial, c'est--dire dans des conditions de vitesses initiales. Pratiquement, cette mthode est prfrable pour raliser les mesures cintiques de ractions enzymatiques, car les courbes d'volution des ractions catalyses par des enzymes n'obissent gnralement pas des quations simples de vitesse pour de longues priodes de temps. La modlisation de la courbe complte d'volution d'une raction enzymatique requiert souvent d'utiliser une quation plus complexe que celle de la forme de l'quation intgre de vitesse pour des vitesses initiales, du fait de la perte progressive d'activit de l'enzyme, d'inhibition par des produits ou d'autres phnomnes.
1.2.5. Dimensions des constantes de vitesse

L'analyse des quations aux dimensions est l'une des techniques les plus simples et les plus fiables pour dtecter des erreurs algbriques et pour vrifier les rsultats obtenus. Cette analyse dpend de quelques rgles simples qui rgissent la manire de combiner des quantits de dimensions diffrentes, et son application repose sur le fait que les erreurs algbriques conduisent frquemment des expressions dont les dimensions sont inhomognes. On dfinit ainsi la dimension de concentration, exprime en molarit (symbole M ou mol L1 ) et la dimension des vitesses de raction (symbole M s1) Par consquent, dans une expression telle que v = k [ A ] , la constante de vitesse k doit tre exprime en s1 afin que les termes de gauche et de droite de l'quation aient les mmes dimensions. Toutes les constantes de vitesse du premier ordre ont des dimensions de temps1 , et par des raisonnements similaires, on dmontre aisment que les constantes de vitesse du second ordre ont les dimensions de concentration1 temps1 , que les constantes de vitesse de troisime ordre ont les dimensions de concentration2 temps1 , et que les constantes d'ordre zro ont les dimensions de concentration temps1 (tableau 1.1).
Ordre 0 Equation de vitesse

v (M1. s1)
Ordre 1
Ordre 2
v0 = k
v (M1. s1)
2.10
4
v0 = k.[A]
2,5.103 2.10
3 3
v0 = k.[A]2
v (M1. s1)
3.103 2,5.103 2.103
3.103
Graphique v en fonction de [A]
1,5.104 1.104 5.105 0.10 0

0
Tableau 1.1 - Caractristiques de ractions d'ordre 0, 1 et 2
1,5.10
1,5.103 1.103 5.104 0,00006
1.103 5.10 0,00006

4 0
[A] (M)
0,0012
0.10 0
[A] (M)
0,0012
0.1000
0,00006
[A] (M)
0,0012
Dtermination de l'ordre de la raction

log v
1 2 3 4 5 6 7 8 6,5
log v0 = log k
log v
log v0 = 1.log [A] + log k

2 3 4 5 6 7
log v0 = 2.log [A] + log k

log v
1 2 3 4 5 6 7
Graphique log v en fonction de log [A]
4,5
log [A]
2,5
8 6,5
4,5
log [A]
2,5
8 6,5
4,5
log [A]
2,5
Dtermination de la constante de vitesse

[A] (M)
1.103 1.10 8.10 6.10 4.10 2.10
3 4 4 4 4 0
[A]t = [A]0 k.t

ln [A]
6.10 8.10
ln [A]t = ln [A]0 k.t

0
1/[A]t = 1/[A]0 + k.t

1/[A] (M1)
1.103 1.10 8.10 6.10 4.10 2.10
3 4 4 4 4 0
Linarisation du graphique [A] en fonction du temps
1.100 1.10
0
1.100 2.100 2.10 3

0 0
0.10
Temps (s)
2.10
Temps (s)
0.10
Temps (s)
Unit de la constante de vitesse
M.s1
s1
M1.s1
17
18
La connaissance des dimensions des constantes de vitesse permet de vrifier trs facilement l'exactitude des quations : la partie gauche et la partie droite de toute galit (ou ingalit) doivent avoir les mmes dimensions et tous les termes d'une somme doivent avoir les mmes dimensions. Par exemple, si le terme (1 + t) fait partie d'une quation, o t a la dimension du temps, alors, en toute rigueur, l'quation est incorrecte, mme si la valeur de 1 correspond un temps dont la valeur numrique est 1. Plutt que de mlanger de cette manire des constantes et des variables dimensionnelles dans une quation, il est prfrable d'crire l'unit aprs le nombre, par exemple (1s + t), o d'attribuer un symbole la constante, par exemple (t0 + t). Bien que chacune de ces alternatives paraisse plus lourde que l'expression (1 + t), elles vitent toute possibilit de confusion. L'quation [7.17] ( 7.6.1) reprsente un cas dans lequel cette pratique est parfaitement justifie. Des quantits de dimensions diffrentes peuvent tre multiplies ou divises mais ne peuvent tre ni additionnes ni soustraites. Ainsi, si k1 est une constante de vitesse du premier ordre et si k2 est une constante de vitesse du second ordre, une affirmation telle que k1 >> k2 est aussi dpourvue de sens que l'affirmation 5 g >> 25C. Cependant, une constante de vitesse de pseudo-premier ordre comme k 2 [ A ] a les dimensions de concentration1 temps1 concentration, c'est--dire de temps1, et a ds lors les dimensions d'une constante de vitesse de premier ordre. Dans ce cas, il est correct de comparer cette constante de pseudo-premier ordre avec d'autres constantes de vitesse du premier ordre. Un autre principe important de l'analyse aux dimensions est de ne jamais utiliser une quantit ayant une dimension comme un exposant, ni d'en prendre le logarithme. Par exemple, e k t est autoris, condition que k soit une constante de premier ordre, mais e k t ne l'est pas. Une exception apparente la rgle est celle qui, pour des raisons pratiques, consiste prendre le logarithme de ce qui apparat tre une concentration. Par exemple, le pH est souvent dfini comme log [H +] (bien qu'en toute rigueur, le pH est dfinit partir de l'activit du proton et non partir de sa concentration molaire). Cette dfinition qui n'est pas strictement correcte reprsente une simplification de la dfinition plus rigoureuse qui consiste dfinir le pH comme le rapport log ([H +]/[H +]), o [H +] est la valeur de [H +] dans l'tat standard, c'est--dire pH = 0. Comme [H +] a une valeur numrique de 1, ce terme est habituellement omis de la dfinition. Dans tous les cas o, comme dans l'exemple prcdent, on prend le logarithme d'une quantit ayant une dimension, un tat standard est toujours impliqu dans la dfinition, qu'il soit prcis explicitement ou non (voir galement la dfinition des constantes d'quilibre au chapitre 2). L'analyse des dimensions est particulirement utile comme un moyen de se rappeler les pentes et les ordonnes l'origine de graphiques communment utiliss : toute intersection avec un axe doit avoir les mmes dimensions que la variable qui est porte le long de cet axe, alors que la pente a toujours les dimensions de l'ordonne (y) divises par celles de l'abscisse (x). Ces rgles sont illustres dans la figure 1.3.
19
La pente = Dy/Dx a les dimensions de y/x
L'intersection avec l'axe des x a les dimensions de x
Dx
Dy
L'ordonne l'origine a les dimensions de y
x
1.3 - Application de l'analyse aux dimensions dans un graphique
1.2.6. Les ractions rversibles

De nombreuses ractions sont rversibles et les deux sens de la raction doivent tre introduits dans l'quation de vitesse : A k1 k 1 P [1.21]
Ainsi, dans le cas o [ P ]0 = 0 , nous pouvons crire : d[ P ] v = = k1([ A ]0 [ P ]) k 1 [ P ] = k1 [ A ]0 ( k1 + k 1 )[ P ] [1.22] dt Cette quation diffrentielle est exactement de la mme forme que l'quation [1.5], et peut tre rsolue de la mme manire :
d[ P ] k [ A ] ( k + k )[ P ] = dt 1 0 1 1
Donc
[1.23] [1.24]
ln ( k1 [ A ]0 ( k1 + k 1 )[ P ] ) ( k1 + k 1 )
= t +a
Si nous posons que [ P ] = 0 quand t = 0, nous obtenons que a = et l'quation suivante :
ln( k1 [ A ]0 ) , ( k1 + k 1 )
[1.25]
k [ A ]0 ( k1 + k 1 )[ P ] ln 1 = ( k1 + k 1 )t k1 [ A ]0
En prenant l'exponentielle des deux cts, nous obtenons l'quation :
k1 [ A ]0 ( k1 + k 1 )[ P ] = e ( k 1 +k 1 ) t k1 [ A ]0
[1.26]
20
[P] =
k1 [ A ]0 ( 1 e ( k 1 +k 1 ) t ) = [ P ] ( 1 e ( k 1 +k 1 ) t ) k1 + k 1
[1.27]
o [ P ] = k1 [ A ]0 ( k1 + k 1 ) est la valeur de [ P ] aprs un temps infini, c'est-dire l'quilibre. Cette valeur dcoule du fait que le terme exponentiel tend vers zro quand t devient grand.
1.2.7. Dtermination des constantes de vitesse du premier ordre

De trs nombreuses ractions sont du premier ordre pour chacun des ractifs et, dans ces cas, il est souvent possible de raliser les mesures dans des conditions de pseudo-premier ordre en maintenant en large excs la concentration de tous les ractifs sauf un. Ainsi, dans de nombreuses situations exprimentales, le problme de la dtermination d'une constante de vitesse peut-il tre rduit au problme de la dtermination d'une constante de vitesse de premier ordre. Nous avons vu dans l'quation [1.10] que pour une raction simple de premier ordre :
[ P ] = [ A ]0 ( 1 e k t ) [ P ] = [ P ] ( 1 e ( k 1 +k 1 ) t )
De cette manire et donc
[1.28] [1.29] [1.30] [1.31]
et dans l'quation [1.27], que dans le cas plus gnral d'une raction rversible :
[ P ] [ P ] = [ P ] e ( k 1 +k 1 ) t
ln ([ P ] [ P ]) = ln [ P ] ( k1 + k 1 )t
Un graphique de ln([ P ] [ P ]) en fonction de t donne une droite de pente (k1 + k1). Avant l'avnement des calculatrices de poche, cette quation tait couramment exprime en termes de logarithmes en base 10 :
log ([ P ] [ P ]) = log [ P ]
( k1 + k 1 )t 2 , 303
[1.32]
Le graphique log([ P ] [ P ]) en fonction de t donne une droite dont la pente vaut (k1 + k1)/2,303. GUGGENHEIM (1926) a soulev une objection majeure l'utilisation de ce graphique, savoir que la dtermination de la constante de vitesse dpend trs fortement de la prcision de la mesure de [ P ] . Dans le cas gnral d'une raction rversible, o [ P ] [ A ]0 , une valeur prcise de [ P ] est difficile obtenir, et mme dans le cas particulier d'une raction irrversible o [ P ] = [ A ]0 , la concentration instantane en A au temps zro peut tre difficile mesurer avec prcision. GUGGENHEIM a suggr de mesurer deux ensembles de valeurs [ P ]i et [ P ]i ' aux temps ti et ti', tel que ti' = ti + t o t est une constante. Ainsi, partir de l'quation [1.30], nous pouvons crire les deux quations suivantes :
21
[ P ] [ P ]i = [ P ] e ( k 1 +k 1 ) t i [ P ] [ P ]i ' = [ P ] e
Par soustraction, nous obtenons :
( k 1 +k 1 )( t i +t )
[1.33] [1.34] [1.35] [1.36]
[ P ]i ' [ P ]i = [ P ] ( 1 e ( k 1 +k 1 ) t ) e ( k 1 +k 1 ) t i
et en prenant les logarithmes, nous obtenons :
ln ([ P ]i ' [ P ]i ) = ln [ P ] + ln ( 1 e ( k 1 +k 1 ) t ) ( k1 + k 1 )ti
que nous pouvons galement crire :
log ([ P ]i ' [ P ]i ) = constante
( k1 + k 1 )ti 2 , 303
[1.37]
Ainsi, un graphique de log([ P ]i ' [ P ]i ) en fonction de t donne une droite dont la pente vaut (k1 + k1)/2,303, comme illustr dans la figure 1.4. Ce graphique, connu sous le nom de graphique de GUGGENHEIM, ne ncessite pas l'estimation de [ P ] . Puisque le rapport k1/k1 est gal la constante d'quilibre, qui peut tre estime indpendamment, les valeurs des constantes individuelles de vitesse k1 et k1 peuvent tre calcules partir des deux combinaisons.
log ([P'i ] [Pi ])
1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0 5 10 15 20
Pente = (k1 + k1)/2,303
Temps (min)
1.4 - Le graphique de GUGGENHEIM Ce graphique permet de dterminer la valeur d'une constante de vitesse de premier ordre sans la ncessit de dterminer prcisment l'tat d'avancement de la raction l'quilibre ([ P ] ). Les symboles sont dfinis comme suit : [ P ]i et [ P ]i', concentration du produit respectivement, aux temps t et t + t, o t est une constante.
Le graphique de GUGGENHEIM est insensible aux dviations des cintiques par rapport aux cintiques de premier ordre, c'est--dire qu'il peut avoir une apparence linaire mme si les cintiques n'obissent pas une dpendance de premier ordre. Le mme commentaire s'applique au graphique apparent de KZDY-SWINBOURNE, qui est le sujet du problme [1.3]. A ct des mthodes de linarisation et de traitement graphique des rsultats qui restent trs utiles aux points de vue conceptuel et pdagogique, l'avnement de la
22
micro-informatique a progressivement transform et amlior l'analyse des donnes cintiques. L'utilisation notamment de la mthode des moindres carrs pour l'ajustement paramtrique sur des quations linaires et non-linaires est aujourd'hui trs largement rpandue (voir par exemple CORNISH-BOWDEN, 1995). De nombreux logiciels commerciaux permettent de traiter un grand nombre de cas. La dtermination des paramtres d'une courbe d'apparition exponentielle du produit d'une raction peut tre facilement ralise par ajustement d'une courbe de [ P ] en fonction du temps, t, l'aide de l'quation non-linaire [1.29] figure 1.5. De manire gnrale, il est prfrable d'utiliser ces mthodes d'ajustement afin d'obtenir la meilleure estimation des paramtres recherchs mais galement une indication de la qualit de ces valeurs (dviation standard). Bien que des remarques de ce type s'appliquent au traitement de nombreux cas abords dans la suite de ce manuel et que nous mentionnions l'occasion l'importance d'utiliser les procdures d'ajustement paramtriques non-linaires, nous prsenterons gnralement les mthodes de reprsentation graphiques qui sont plus didactiques. Une discussion dtaille des problmes d'estimation des meilleurs paramtres ne faisant pas partie des objectifs de ce manuel, nous renvoyons les lecteurs intresss vers des ouvrage plus spcialiss (CORNISH-BOWDEN, 1995).
[P] (M) 35
30 25 20 15 10 5 0
Temps (s)
1.5 - Ajustement paramtrique non-linaire d'une courbe de [ P ] en fonction du temps Un programme d'ajustement paramtrique utilisant la mthode des moindres carrs a t utilis pour modliser les points exprimentaux sur l'quation [1.29]. Cette procdure a fourni les paramtres suivants : [ P ] = 25,6 0,7 mM et k = 0,95 0,09 s1 qui ont t utiliss pour tracer la ligne continue qui reprsente donc la meilleure courbe passant par les points exprimentaux.
23
PROBLMES
1.1 - Les donnes du tableau suivant ont t obtenues pour la vitesse d'une
P diffrentes concentrations de A raction de stchiomtrie A + B et de B. Dterminez l'ordre de la raction par rapport A et B et suggrez une explication pour l'ordre observ pour A.
[ A ] (mM) [ B ] (mM)
v (mol1 s1)
10 10 0,6 10 50 3,2
20 10 1,0 20 50 4,4
50 10 1,4 50 50 7,3
100 10 1,9 100 50 9,8
10 20 1,3 10 100 6,3
20 20 2,0 20 100 8,9
50 20 2,9 50 100 14,4
100 20 3,9 100 100 20,3
[ A ] (mM) [ B ] (mM)
v (mol1 s1)
1.2 - Vrifiez les affirmations suivantes concernant les dimensions en supposant que t reprsente le temps (s), v et V reprsentent des vitesses (M s1 ou mol L1 s1), et [ A ] , [ P ] et Km reprsentent des concentrations (M) : a - Dans un graphique de v en fonction de V / [ A ] , la pente vaut 1/Km et l'ordonne l'origine vaut Km /V. b - Dans une raction bimolculaire 2 A P, caractrise par la constante de vitesse k, la concentration de P au temps t est donne 2 par [ P ] = [ A ]0 k t / ( 1 + 2[ A ]0 k t ) . [ A ]0 [ A ] t en fonction de c - Dans un graphique de ln([ A ]0 / [ A ]) ln ([ A ]0 / [ A ])
pour une raction catalyse par un enzyme donne une droite dont la pente vaut 1/V et dont l'ordonne l'origine vaut V/Km.
1.3 - KZDY, JAZ et BRUYLANTS (1958) et S WINBOURNE (1960) suggrrent

indpendamment une alternative au graphique de GUGGENHEIM, drive partir des quations [1.29] et [1.30] en divisant l'une par l'autre. Montrer que l'expression rsultante pour ([ P ] [ Pi ]) ([ P ] [ Pi ' ]) peut tre rarrange de telle sorte que le graphique de [ Pi ' ] en fonction de [ Pi ] donne une droite. Quelle est la pente de cette droite ? Si plusieurs graphiques sont tracs partir des mmes donnes mais pour diffrentes valeurs de t, quelles sont les coordonnes du point d'intersection de ces droites ?
2 LA THERMODYNAMIQUE ET LA
THORIE DES VITESSES ABSOLUES 2.1. LA THERMODYNAMIQUE ET SES LIMITES
Dans le premier chapitre, nous avons discut de ltude de la cintique des ractions, dans le second nous allons nous intresser aux relations qui existent entre la cintique et la thermodynamique ; ces relations constituent la base de la thermocintique. Lanalyse thermodynamique est une mthode extrmement puissante pour obtenir des informations dtailles sur le fonctionnement des systmes biologiques quil est souhaitable dexploiter dans ltude du mcanisme daction des enzymes. Une premire connexion entre les mesures cintiques et les mesures lquilibre repose sur le concept de potentiel chimique dvelopp par Josiah Willard GIBBS (1878). Une seconde connexion rside dans la thorie de la vitesse absolue dune raction. Lapplication de ces relations permet dtablir le profil dnergie de GIBBS dune raction qui est un outil trs utile pour lanalyse du mcanisme des ractions enzymatiques. Avant de dcrire plus en dtail ces concepts, il est ncessaire de rappeler quelques principes fondamentaux de thermodynamique qui nous seront utiles. Une prsentation dtaille de lanalyse thermodynamique ne fait toutefois pas partie des objectifs de ce livre et nous renvoyons plusieurs ouvrages de rfrence dans ce domaine (EISENBERG et CROTHERS, 1979 ; OTURAN et ROBERT, 1997 ; ATKINS et DE PAULA, 2001), les tudiants qui souhaitent sassurer de leurs connaissances ou les approfondir. La thermodynamique est une branche de la chimie physique qui permet de dcrire, un niveau macroscopique, la matire et les changements physiques et chimiques quelle subit. Cette description repose sur une reprsentation simplifie de la ralit (un modle) et sur un nombre restreint de lois. Un tre vivant est le sige de modifications physiques et chimiques continuelles qui impliquent des changes dnergie et de matire. Pour un biologiste, il est essentiel de comprendre les mcanismes de ces changes. Comme nous allons en discuter, lanalyse thermodynamique des systmes biologiques est principalement oriente vers ltude des quilibres et la dfinition de relations entre les proprits dun systme, mais elle permet galement de dterminer le sens des ractions dans des systmes qui ne sont pas lquilibre et de caractriser des processus irrversibles. La thermodynamique
26
a nanmoins des limites ; elle ne nous informe ni sur la rapidit dune raction, ni sur la manire dont une raction se droule (interactions molculaires). Pour obtenir ces informations, il faut avoir recours des tudes cintiques dans lesquelles on observe lvolution du systme au cours du temps. Les tudes cintiques fournissent une mesure de la vitesse laquelle une raction sapproche de son tat dquilibre ou sen carte si la raction est couple une seconde raction. Les deux approches sont donc complmentaires et doivent tre exploites conjointement dans ltude des ractions enzymatiques.
2.2. CONCEPTS GNRAUX DE LA THERMODYNAMIQUE

2.2.1. tats du systme
Dans toute tude, il est toujours ncessaire de dfinir lobjet qui est tudi. En thermodynamique, la partie de lunivers qui est tudie est appele le systme, alors que la partie restante est appele lenvironnement. Le systme est dfini en fonction de ltude raliser et des objectifs recherchs. Un tre vivant ou une cellule peuvent reprsenter un systme. Une cellule vivante renferme une grande quantit denzymes diffrentes et donc, dans le cas de ltude de ractions enzymatiques, la cellule constitue un systme dans lequel les ractions se droulent dans un espace spar du reste du monde par la membrane plasmique de la cellule. Le systme correspond lespace occup par les substrats, les enzymes et les produits. Dans les tudes in vitro, le systme peut ainsi se rduire au tube essai ou la cuve du spectromtre contenant la solution de substrat et denzyme. La dfinition dun systme thermodynamique implique galement de dfinir les proprits de ses frontires. La nature des changes entre le systme et son environnement permet de distinguer diffrents types de systmes : les systmes ouverts permettent des changes de matire et dnergie ; les systmes ferms permettent des changes dnergie mais pas de matire ; les systmes isols ne permettent aucun change.
Univers
Environnement Systme
2.1 - Description thermodynamique de lunivers
2 LA THERMODYNAMIQUE ET LA THORIE DES VITESSES ABSOLUES
27
Ltat dun systme thermodynamique est dcrit par un nombre restreint de proprits ou variables dtat qui sont caractristiques du systme au moment de la mesure et sont indpendantes du chemin qua suivi le systme pour atteindre cet tat. Certaines de ces proprits sont des grandeurs intensives comme la temprature ou la concentration, alors que dautres sont des grandeurs extensives comme le volume, la masse ou lnergie. Un systme est dans un tat dfini lorsque toutes les proprits qui le caractrisent ont des valeurs dfinies. Diffrents types dtat peuvent tre dfinis. Selon que le systme est travers ou non par un flux de matire ou dnergie, on distingue : ltat dquilibre, si les proprits du systme sont indpendantes du temps et si aucun flux de matire ou dnergie ne traverse le systme ; ltat de non-quilibre stationnaire si le systme est travers par un flux de matire ou dnergie mais que les proprits du systme ne changent pas au cours du temps ; ltat de non-quilibre non-stationnaire si les changes dnergie et de matire sont importants et rapides (cest habituellement ltat du systme pr-stationnaire rencontr dans les tudes de cintique rapide).
2.2.2. Un processus est un vnement au cours duquel une proprit du systme change
Ltat dun systme macroscopique lquilibre peut tre dfini par un nombre restreint de proprits. Si le systme change dtat, son nouvel tat est caractris par un nouvel ensemble de proprits et le passage dun tat lautre implique quune ou plusieurs des proprits du systme varient. En thermodynamique, un processus est dfini comme la variation dune des proprits du systme. Quand de la chaleur, du travail ou de la matire sont changs entre le systme et son environnement, le systme volue de son tat dquilibre initial vers un nouvel tat dquilibre. Il faut distinguer les changements rversibles et les changements irrversibles. Un processus rversible se droule en passant par une succession dtats dquilibre, chacun diffrant du prcdent par une modification infinitsimale dune des proprits du systme. Par contre, si le changement est opr de manire brutale et entrane une grande variation dune des proprits, le processus est irrversible. Considrons deux processus, lun rversible et lautre irrversible, caractriss par les mmes tats initiaux et finaux. Dune part, ces deux processus sont similaires puisque les proprits initiales et finales de chacun de ces systmes sont identiques. Par contre, ils sont diffrents parce que les quantits changes de chaleur et de travail au cours des ces deux processus sont diffrentes. La chaleur et le travail dpendent du chemin suivi par le systme au cours de sa transformation. Si le processus est rversible, le systme est constamment lquilibre et toutes les proprits restent uniformes pendant la raction. Si le processus est irrversible, certaines proprits, comme la temprature ou la pression, ne sont pas uniformes
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dans le systme et nont pas de valeur bien dfinie jusqu ce que le systme ait atteint sont nouvel tat dquilibre. De nombreux processus naturels sont irrversibles dans le sens o le systme ne peut tre ramen son tat de dpart quen fournissant de lnergie partir dun autre systme. Il faut noter que lirrversibilit au sens thermodynamique ne signifie pas que le systme ne puisse pas retourner son tat initial, mais simplement que ce retour ncessite un apport dnergie.
2.3. LES LOIS DE LA THERMODYNAMIQUE

2.3.1. Loi de conservation de lnergie
La conservation de lnergie est un principe universel. La premire loi de la thermodynamique stipule que lnergie totale dun systme et de son environnement est une constante ou en dautres termes que lnergie est conserve. Les variations dnergie rsultent de la somme de lnergie ajoute sous forme de travail et sous forme de chaleur. La premire loi peut donc tre exprime par lquation :
dE = E f E0 = dq + dw
[2.1]
o E0 est lnergie du systme dans son tat initial, Ef est lnergie du systme dans son tat final, dq est la quantit dnergie change sous la forme de chaleur et dw, celle change sous la forme de travail. Lnergie est une proprit du systme qui dpend uniquement de ltat initial et de ltat final du systme et qui est indpendante du chemin suivi. Inversement, le travail et la chaleur sont des moyens de transfrer lnergie et dpendent du chemin suivi lors de lvolution du systme. La dfinition la plus simple de la chaleur est la capacit modifier la temprature dun objet. Si nous considrons, par exemple, quun systme absorbe de la chaleur partir de lenvironnement, cela se traduit par une augmentation de la temprature du systme qui peut tre mesure trs prcisment. Si dT est laugmentation de temprature, la chaleur absorbe par le systme est donne par : [2.2] dq = C dT o C est une constante caractristique du systme, appele la capacit de chaleur. Par dfinition, la capacit de chaleur dune substance est la quantit de chaleur ncessaire pour lever la temprature dune mole de substance de un degr. Elle est gnralement dfinie volume constant (CV) ou pression constante (Cp),
CV =
Cp =
E T V
E T p
[2.3a] [2.3b]
29
Pour un gaz parfait, ces deux paramtres sont relis par lquation suivante :
C p CV = n R
o n est le nombre de moles et R est la constante des gaz parfaits.
[2.4]
Par convention, des valeurs positives sont attribues aux variations dq et dT lorsque la chaleur est absorbe par le systme. Pour le travail, qui peut tre effectu par le systme sur lenvironnement ou sur le systme par lenvironnement, dw est positif lorsque le travail est effectu sur le systme par lenvironnement. Un travail positif correspond ainsi un flux dnergie vers le systme. La diffrence majeure entre la chaleur et le travail rside dans les chelles des mouvements travers la frontire du systme. Le travail correspond des mouvements qui sont organiss lchelle macroscopique alors que la chaleur correspond des mouvements lchelle molculaire qui ne prsentent aucune organisation lchelle macroscopique. Lquation [2.1] indique que lorsquil y a un dsquilibre entre travail et chaleur, le systme volue dune faon mesurable. Par exemple, si le systme fournit plus de travail quil ne reoit de chaleur, lnergie du systme est progressivement consomme (E diminue). Inversement, si le systme reoit plus dnergie sous forme de chaleur quil n'en dpense sous forme de travail, la temprature du systme augmente. Une faon simple et courante dobtenir des informations sur les variations dnergie dun systme consiste mesurer la variation de chaleur. Nous avons vu que la variation dnergie dE est une diffrentielle exacte, cest--dire quelle ne dpend que des tats initiaux et finaux du systme, alors que les variations dq et d w sont des diffrentielles inexactes qui sont dpendantes de la manire selon laquelle les modifications seffectuent. Dans des cas simples, il est possible de montrer que la variation de chaleur dpend uniquement des tats initiaux et finaux. Par exemple, si lon considre uniquement un travail mcanique se droulant volume constant, la variation de chaleur est gale la variation dnergie. Par contre, si la raction se droule pression constante, le travail est donn par dw = pdV et lquation de conservation scrit :
dE = dq p dV
[2.5]
Une nouvelle variable dtat, lenthalpie, est dfinie pour reprsenter la quantit de chaleur change pression constante :
H = Q p = E + pV
[2.6]
Le terme pdV na une grandeur significative que pour des ractions impliquant des gaz ou pour des ractions seffectuant des pressions extrmement leves. En biochimie, il est donc courant dassimiler dH dQp et puisquil est plus facile de mesurer une variation de la quantit de chaleur pression constante plutt qu volume constant, la variation denthalpie est une grandeur couramment utilise pour suivre lvolution des systmes biologiques.
30
Dans lanalyse thermodynamique, il est particulirement important de considrer les systmes cycliques puisquils permettent de reprsenter le fonctionnement des machines, y compris des machines molculaires que sont les enzymes. Dans un processus cyclique, une srie de ractions successives ramne le systme dans son tat initial. Dans ce cas, toutes les proprits doivent retourner leur valeur initiale. Par exemple, la somme des variations dnergie du systme pour toutes les tapes dun cycle doit tre gale zro :
cycle
DE = 0
[2.7]
Par contre, la chaleur et le travail ntant pas des variables dtats, la somme de ces grandeurs ne doit pas obligatoirement tre gale zro, ce que nous pouvons exprimer par les deux quations suivantes :
cycle
w 0 q 0
[2.8a] [2.8b]
cycle
2.3.2. La dfinition de lentropie et du critre de spontanit

Le premier principe de la thermodynamique tablit que lnergie est conserve lors dune raction, cependant il ne dfinit pas le sens spontan de la raction. Certaines ractions se droulent spontanment malgr un DE > 0, en absorbant de la chaleur partir de lenvironnement. Un critre de spontanit est fourni par la deuxime loi de la thermodynamique qui utilise une nouvelle proprit introduite par Rudolf CLAUSIUS en 1850 : lentropie. Lentropie est souvent prsente comme une mesure du dsordre dun systme, qui augmente lorsque le dsordre du systme augmente. La deuxime loi de la thermodynamique stipule quun systme isol volue jusqu atteindre un tat dquilibre caractris par un tat de dsordre maximal et donc une valeur maximale dentropie. Dans un systme ouvert, un processus a lieu spontanment, uniquement si lentropie de lunivers, donne par la somme des entropies du systme et de lenvironnement, augmente au cours du processus en accord avec lingalit suivante :
DS systme + DS environnement 0
[2.9]
Selon lquation [2.9], lentropie du systme peut diminuer au cours dun processus spontan condition que lentropie de lenvironnement augmente de sorte que la somme des variations soit positive. Par exemple, la formation dune structure biologique hautement organise, implique une diminution de lentropie, mais ce processus est possible uniquement sil saccompagne dune augmentation de lentropie de lenvironnement. Lentropie a t introduite sur la base de lanalyse du rendement d'un moteur thermique. Dans un moteur thermique, une quantit de chaleur passe dun rservoir
31
chaud vers un rservoir froid. Au cours de ce processus, une partie de la chaleur est convertie en travail. Il peut tre dmontr que le rendement maximum dun moteur est atteint si le transfert de chaleur se fait dans des conditions rversibles dun point de vue thermodynamique et la variation dentropie pour chaque tape est alors dfinie comme : dq rev [2.10] dS = T o dqrev reprsente la variation de chaleur si le processus se droule de manire rversible. Lentropie est une proprit du systme, et donc la variation dentropie au cours dun processus, comme la variation dnergie (quation [2.1]), dpend uniquement de ltat initial et de ltat final du systme :
dS = S f S0
[2.11]
o S0 et Sf reprsentent respectivement lentropie du systme dans son tat initial et dans son tat final.
2.3.3. La dfinition statistique de lentropie

La relation quantitative entre lentropie et le dsordre a t tablie pour la premire fois par BOLTZMANN. Les molcules dun mme chantillon peuvent stocker une mme quantit dnergie de diffrentes manires. Le nombre de faons diffrentes de rpartir une mme quantit dnergie dans un tat donn du systme est appel la dgnrescence, . BOLTZMANN a dmontr que lentropie est relie la dgnrescence par lquation :
S = kB logw
[2.12]
o kB est la constante de BOLTZMANN, qui est relie la constante des gaz (R) et au nombre dAVOGADRO (NA) par kB = R [2.13] NA Un systme volue donc spontanment vers ltat pour lequel la dgnrescence est maximale. En accord avec la dfinition de BOLTZMANN, un systme dont la dgnrescence vaut 1 a une entropie gale zro. Il devient alors possible de mesurer lentropie sur une chelle absolue en posant que lentropie dun systme parfaitement ordonn (par exemple, un cristal parfait) a une valeur se rapprochant de zro lorsque la temprature se rapproche de zro :
T 0K
lim S = 0
[2.14]
Ce principe est souvent appel la troisime loi de la thermodynamique.
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2.3.4. Lentropie dans les systmes vivants et les ractions couples

Conformment la deuxime loi de la thermodynamique, lentropie 1 est relie lorganisation du systme et est donc directement lie lvolution du systme. Par exemple un cristal est caractris par une entropie faible, quasiment nulle, parce que les atomes sont organiss entre eux dans lespace. Lorsquil y a vaporation partir du cristal, chaque atome acquiert la possibilit doccuper diffrentes positions dans lespace et donc lentropie du systme augmente. Pour quun processus puisse se drouler spontanment, il faut que DS > 0. Dans un systme biologique, une augmentation du dsordre, et donc de lentropie, conduit la mort biologique, suggrant que toute cette thorie ne fonctionne pas. En ralit, les systmes biologiques ne sont pas des systmes lquilibre, mais des systmes ouverts o chaque processus est associ une augmentation globale de lentropie de lunivers. Les enzymes nchappent pas ce principe sine qua non de la vie cellulaire: ils utilisent lentropie de lunivers pour diminuer lentropie de la cellule. Ce principe de base est galement central dans le fonctionnement des systmes coupls, o une diminution dentropie associe une organisation molculaire peut tre compense par laugmentation dentropie associe une autre raction.
2.3.5. Lnergie de GIBBS

En pratique, lutilisation de lentropie comme critre de spontanit pose un problme puisque cette proprit nest pas facilement mesurable et que son utilisation ncessite de dterminer la fois la variation dentropie du systme et celle de son environnement. Il est prfrable de dfinir le sens spontan dvolution dun processus partir dune proprit intrinsque du systme. Ces difficults sont vites en utilisant une proprit thermodynamique galement introduite par J.W. GIBBS : lnergie libre ou nergie de GIBBS. Si nous combinons la premire et la deuxime loi : Premire loi : [2.15] dq rel = dE + p dV Deuxime loi :
dq rev = T dS
[2.16]
et si nous tenons compte du fait quun processus spontan se caractrise par dq rev dq rel , nous obtenons lquation suivante en substituant lquation [2.16] dans lquation [2.15] : [2.17] dE + p dV T dS 0
1. Une relation peut galement tre tablie entre linformation contenue dans un systme et son entropie. Linformation rduit lincertitude concernant la ralisation dun vnement et donc constitue une forme dorganisation du systme. Par exemple, linformation contenue dans un texte provient de la disposition prcise des caractres. Linformation peut tre considre comme une forme dnergie que lon appelle lentropie ngative ou ngentropie du systme (SCHRDINGER, 2000).
33
Comme nous lavons vu prcdemment, pression constante, dE + p dV = dH , et donc nous pouvons dfinir une nouvelle proprit du systme, que est appele lnergie de GIBBS : [2.18] G = H TS = E + pV TS La variation dnergie de GIBBS, dfinie comme la diffrence entre lnergie de GIBBS des produits et lnergie de GIBBS des ractifs, est une proprit qui dpend uniquement du systme et qui permet de dterminer le sens spontan dune raction.
dGT , p = dHT , p TdST , p = dE + p dV TdS 0
[2.19]
Le systme volue spontanment vers ltat pour lequel lnergie de GIBBS est la plus basse ; si dans le sens dfini de la raction la variation du DG est ngative, la raction sera spontane dans ce sens. Par exemple, si DG = GP GA < 0, la raction de la figure 1.1 volue spontanment de la gauche vers la droite. La mesure de la variation dnergie de GIBBS fournit donc un critre de spontanit de la raction dans des conditions donnes.
2.3.6. Le potentiel chimique : Lnergie de GIBBS dun solut dpend de sa concentration

Une caractristique essentielle de lnergie de GIBBS est que sa valeur pour un composant donn du systme dpend de la quantit de ce compos qui est prsente dans le systme. Pour rendre compte de cette dpendance J.W. GIBBS a introduit la notion de potentiel chimique, qui, pour la substance i, correspond la drive partielle de lnergie de GIBBS du systme par rapport au nombre de moles de ce compos i (ni) : G [2.20] = mi ni p ,T ,n
j
Cette quation montre que pour des valeurs constantes de pression p, de temprature T et du nombre de moles de tout composant j, nj :
G = ni mi
i
[2.21]
Ces quations [2.20] et [2.21] indiquent clairement que lnergie de GIBBS du systme augmente lorsque la quantit de la substance i, prsente dans le systme, augmente. Aprs avoir ajout la substance au systme, celle-ci va se distribuer dans lensemble du systme de telle sorte quaucune partie du systme ne soit un potentiel plus lev quune autre partie. En consquence, lquilibre, le potentiel chimique dune substance doit tre le mme dans lensemble du systme. Puisquun systme volue vers ltat caractris par une nergie de GIBBS minimum, lhomognisation du potentiel chimique au sein du systme explique que les molcules dun solut se dplacent dune rgion de haute concentration vers une rgion de faible concentration. Lnergie de GIBBS telle que nous lavons
34
utilise jusqu prsent est une grandeur extensive, puisquelle dpend du nombre de moles de la substance prsent dans lchantillon. Le potentiel chimique au contraire est une grandeur intensive: il nous renseigne sur la faon dont lnergie de GIBBS varie par mole de substance ajoute au systme. En enzymologie, nous sommes principalement intresss par le comportement des solutions. La thermodynamique des solutions est dtermine par la manire dont lnergie totale de GIBBS ou les potentiels chimiques de chaque composant dpendent de la composition. Il est habituel de dfinir une solution idale comme une solution pour laquelle lnergie de GIBBS de chacun des soluts dpend de sa fraction molaire : [2.22] Gi = ni Gi + ni RT lnX i o Gi est lnergie de GIBBS molaire de la substance pure et Xi est sa fraction molaire. Comme dans une solution suffisamment dilue, la fraction molaire est proportionnelle la concentration, lnergie de GIBBS de chaque solut est donne par : C [2.23] Gi = ni Gi + ni RT ln i C o Gi est lnergie de GIBBS par mole dans ltat standard, cest--dire dans des conditions dfinies de pression (1 atm), de temprature (298 K) et de concentration (C = 1 mole par litre). Cette dernire quation indique que lnergie de GIBBS dune substance dissoute dpend non seulement du nombre de moles n, mais galement de la concentration C de la substance dissoute. Lquation [2.24], obtenue en combinant les quations [2.20] et [2.23], montre que le potentiel chimique dpend de la concentration : C [2.24] mi = mi + RT ln i C Dans cette quation, Ci est la concentration molaire du compos i et mi est son potentiel chimique dans des conditions standard (Ci = 1 M). Dans le cas de molcules portant des charges lectriques Z, on utilise le potentiel lectrique, y, qui, combin avec le potentiel chimique, donne le potentiel lectrochimique, mi , C [2.25] mi = mi + RT ln i + ZFy C o F est la constante de FARADAY dont la valeur est : 96 480 J mol1 V1.
2.3.7. Relation entre la constante dquilibre et la variation dnergie de GIBBS

Pour une raction chimique limite par un quilibre, comme par exemple la raction disomrisation simple de A en P, A k1 k1 P [2.26]
35
le potentiel chimique de chacun des constituants du systme est donn par lquation [2.24] et la variation dnergie de GIBBS est donne par la diffrence entre les potentiels chimiques des produits et des ractifs : DG = mP m A [P] [ A] = ( mP + RT ln ) ( m A + RT ln ) [2.27] C C [P] = ( mP m A ) + RT ln [ A] o ( mP m A ) = DG reprsente la variation dnergie de GIBBS du systme dans des conditions standards. Le rapport de concentration entre le produit et le substrat, [ P ] / [ A ] est appel le rapport daction de masses et est dsign par la lettre grecque G : [P] G = [2.28a] [A] qui pour une raction impliquant des coefficients stchiomtriques diffrents de un scrit : [P] p G = [2.28b] [A]a et qui, de manire gnrale, scrit de faon suivante :
G =
[Pi ]
i
[Aj ]
j
[2.28c]
Ainsi, la variation dnergie de GIBBS dpend du rapport daction de masses, en accord avec lquation : [2.29] DG = DG + RT ln G qui tout moment de la raction permet dobtenir le DG de la raction partir des concentrations instantanes de A et de P. Puisque tout systme volue spontanment vers ltat dont lnergie de GIBBS est la plus faible, le sens spontan dune raction correspond une variation ngative dnergie de GIBBS, DG < 0. En consquence, une raction chimique temprature et pression constantes est lquilibre lorsque lnergie de GIBBS est minimum. Dans ces conditions, la variation dnergie de GIBBS cause par une petite variation de la quantit de substrat est exactement compense par la variation dnergie de GIBBS cause par lapparition dune petite quantit de produit. Donc, lorsque le systme a atteint lquilibre, la variation dnergie de GIBBS est nulle : [2.30] DG = DG + RT ln G = 0 Puisque DG est une constante, il dcoule que dans des conditions dquilibre, le rapport daction de masses G doit tre une constante quivalente la constante
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dquilibre de la raction. Cette relation importante en biologie, qui relie la constante dquilibre, K, et la variation dnergie de GIBBS dans les conditions standard, fut tablie par Jacobus VAN'T HOFF dans les annes 1860 :
DG = mP m A = RT ln K
[2.31]
Le systme est dcrit par la constante dquilibre, K, qui est donne par lquation suivante :
G eq = K =
[Pi ]eq
i
[Aj ]eq
j
[2.32]
Une relation gnrale entre la variation dnergie de GIBBS et le rapport daction de masses du systme peut galement tre tablie : [2.33] DG = RT ln G K Graphiquement, cette relation entre la variation dnergie de GIBBS et G est illustre dans la figure 2.2 pour la raction disomrisation de A en P.
Contenu en nergie de GIBBS G (J)
20 000
P
19 000
A
18 000
17 000
G <K
16 000
G >K
15 000 0,001
0,01
0,1
10
100
1000
G /K
2.2 - Evolution de lnergie de GIBBS en fonction du rapport daction de masse G
Comme nous lavons dj discut dans le premier chapitre au sujet du pH, il est incorrect dattribuer une signification au logarithme dune quantit ayant une dimension. Un second exemple est fourni par la dfinition des constantes dquilibre. Pour toutes les ractions dans lesquelles le nombre de substrats est diffrent du nombre de produits, il est habituel dcrire la constante dquilibre K de la raction comme une grandeur qui a une dimension.
37
Par exemple, pour la raction
P+Q [2.34] A la constante dquilibre est gnralement dfinie comme une grandeur qui a une dimension apparente de concentration : [ P ][ Q ] K = [2.35] [ A]
Dans de nombreux cas, il est commode dutiliser les constantes dquilibre dfinies de cette manire. Nanmoins, le calcul de la variation dnergie de GIBBS standard partir de la constante dquilibre (quation [2.31]) ncessite de prendre le logarithme de K et donc de raliser une opration illicite. Il est, dans ce cas, utile de se rappeler la dfinition complte de la constante dquilibre dans laquelle les termes de concentration sont, en ralit, des rapports entre la concentration relle et la concentration dans ltat standard :
[P ] [Aj ] DG = DG + RT ln i i C j C
[2.36]
o C est la concentration standard. Ainsi, la constante dquilibre pour la raction [2.34] est donne par : [ B ][ C ] K = [2.37] [ A ]C o la constante dquilibre est bien une grandeur sans dimension. Afin dviter les erreurs de calcul, il est donc recommand de toujours exprimer les concentrations en units molaires lorsque lon calcule des constantes dquilibre.
2.4. RELATIONS ENTRE LA THERMODYNAMIQUE ET LA CINTIQUE : LES NOTIONS DQUILIBRE ET DTAT STATIONNAIRE
Un rsultat important des travaux de J.W. GIBBS est ltablissement de relations entre la thermodynamique et la cintique, cest--dire entre la loi daction de masses et la variation dnergie de GIBBS, DG. Nous allons discuter ces relations dans deux situations particulires, la situation dquilibre et la situation dtat stationnaire qui seront utiles pour ltude des ractions enzymatiques.
2.4.1. Distinction entre vitesse initiale et vitesse nette

Dans une raction limite par un quilibre, il est ncessaire de distinguer les notions de vitesse initiale et de vitesse nette. Considrons le systme disomrisation simple de A en P prsent dans lquation [2.26]. La raction peut tre divise en deux demi-ractions qui peuvent chacune tre dcrite par une quation de vitesse. Ces deux quations de vitesse correspondent aux quations donnant la
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vitesse initiale de chacune des demi-ractions. Si au temps zro, le systme ne contient uniquement que le substrat A et ne contient pas de produit P, la vitesse de la raction exprime selon la loi daction de masses (voir quation [1.4]), donne la vitesse initiale de la raction : [2.38] v1 = k1 [ A ]0 Si par contre, au temps zro, le systme contient uniquement le produit P et ne contient pas de substrat A, la vitesse de la raction est donne par :
v 1 = k 1 [ P ]0
[2.39]
Lorsque le systme contient la fois le substrat et le produit, les deux demiractions se droulent simultanment et la vitesse nette de disparition du substrat est donne, en accord avec la loi daction de masses, par la diffrence entre la vitesse de la raction directe et la vitesse de la raction inverse : d[ A] [2.40] v nette = = k1 [ A ] k 1 [ P ] dt
2.4.2. Ltat dquilibre

Par dfinition, dans un systme isol ou ferm, un quilibre chimique ou physique est atteint lorsque les quantits des diffrentes substances prsentes dans le mlange nvoluent plus au cours du temps. Cette situation dquilibre ne signifie pas que la raction sarrte, mais elle correspond un tat dynamique du systme dans lequel la vitesse de la raction directe est gale la vitesse de la raction inverse. Dans lexemple choisi dune raction simple disomrisation, si la conversion entre A et P (quation [2.26]) est lquilibre, les quantits de A et de P ne varient pas au cours du temps ou, en dautres termes, la conversion de A en P est exactement contrebalance par la conversion de P en A. Cette situation est dfinie par lquation suivante o la vitesse nette de la raction est nulle :
d[ A] [2.41] = 0 = k1 [ A ]eq k 1 [ P ]eq dt et o [ A ]eq et [ P ]eq reprsentent respectivement les concentrations de A et de P lquilibre. Le tableau 2.1 et la figure 2.3 dcrivent les variations de concentration des substances A et P pour une raction qui volue vers une situation dquilibre. v nette =
Tableau 2.1 - Variation des concentrations dune raction simple disomrisation voluant vers une situation dquilibre Temps 0 t lquilibre [A] [A]0 [A]0 [P]t [A]eq [P] 0 [P]t [P]eq
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Ceq C (units arbitraires)t
1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Produit
Ractif
Temps (s)
a - Reprsentation de lvolution au cours du temps des concentrations du ractif et du produit. Aprs un temps infini, les concentrations ont atteint leur valeur dquilibre.
Ceq Ct 1,0 (units 0,8 arbitraires)

0,6 0,4 0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Produit
Ractif
Temps (s)
b - Reprsentation de lvolution au cours du temps de lcart des concentrations de produit et de ractif par rapport aux concentrations lquilibre 2.3 - Evolution dune raction simple disomrisation vers son tat dquilibre
Alors que la constante dquilibre (quation [2.32]) dcrit la situation lquilibre, lquation [2.41] donne une dfinition rigoureuse de ltat dquilibre. Elle peut tre rarrange de manire dmontrer que la constante dquilibre K sexprime indiffremment comme le rapport entre les concentrations de produit et de ractif
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ou comme le rapport des constantes de vitesse de la raction inverse et de la raction directe : ( m P m A ) DG [ P ]eq k G eq = K = = 1 = e RT = e RT [2.42a] [ A ]eq k 1 Mais, comme le montrent les deux termes de droite de lquation [2.42a], la constante dquilibre peut galement tre exprime en fonction du DG ou de la diffrence entre les potentiels chimiques en utilisant lquation [2.31]. Ainsi, lquation [2.42a] dmontre lexistence dune relation entre les constantes de vitesse, k1 et k 1, la variation dnergie de GIBBS dans des conditions standard, DG, et les potentiels chimiques standards, mA et mP. Lquation peut tre gnralise au cas dune raction dans laquelle les coefficients stchiomtriques sont diffrents de un : p [ P ]eq k G eq = K = = 1 [2.42b] a k 1 [ A ]eq Dans une situation dquilibre, si la vitesse nette de la raction est nulle, par contre les vitesses v1 et v 2 pour chaque demi-raction ne sont pas nulles. Si lon considre la raction A P, alors lquation [2.24] peut scrire comme :
m A m A = RT ln [ A ]
Do nous obtenons :
[2.43] [2.44]
ln [ A ] =
mA mA RT
mA mA e RT
En prenant les exponentielles de chaque ct de lgalit, lquation devient
[ A] =
[2.45]
En associant cette quation la loi de vitesse, nous obtenons :
v1 = k1 e
mA mA RT
[2.46]
Cette quation tablit une autre relation directe entre la vitesse initiale et le potentiel chimique du substrat et reprsente une des quations fondamentales reliant la thermodynamique la cintique. Des relations similaires entre thermodynamique et cintique peuvent galement tre obtenues pour des systmes plus complexes. Considrons par exemple, la raction suivante : K1 K2 K3 A X Y P [2.47] o lintermdiaire X est le produit de la premire raction mais est galement le substrat de la deuxime raction dans laquelle X est en quilibre avec Y, qui a son tour est le substrat de la troisime raction o Y est en quilibre avec le produit final P. Lorsque toutes les ractions atteignent lquilibre, chaque tape est
41
caractrise par une variation dnergie de GIBBS nulle, DG = 0. La situation lquilibre est dcrite par des constantes dquilibre (K1, K2 et K3) qui dans ce cas sont donnes respectivement par [ X ]eq [ A ]eq , [ Y ]eq [ X ]eq et [ P ]eq [ Y ]eq . Puisque, lquilibre, la vitesse nette est nulle pour chaque tape de la raction, nous obtenons facilement des relations entre les constantes dquilibre et les constantes de vitesse. Par exemple, pour la premire tape :
v nette = k1 [ A ]eq k 1 [ X ]eq = 0

do :
[2.48] [2.49]
K1 =
[ X ]eq k = 1 k 1 [ A ]eq
Dans un systme de ractions successives comme celui-ci, la concentration de P lquilibre peut tre obtenue partir de la concentration de A, simplement en utilisant les formules des constantes dquilibre :
[ P ]eq = Ki [ A ]eq
i
[2.50]
Le principe de micro-rversibilit stipule que dans un systme lquilibre, la conversion entre deux tats seffectue la mme vitesse dans les deux sens de la raction. La conversion de A en P est donc exactement contrebalance par la conversion de P en A. Une implication de ce principe est que la raction inverse se droule en suivant le mme chemin que la raction directe et passe par le mme tat de transition. Cette affirmation est galement valable pour un systme en tat stationnaire.
2.4.3. Ltat stationnaire

Ltude des systmes hors dquilibre est beaucoup plus difficile que celle des systmes lquilibre, nanmoins la description de tels systmes est grandement facilite si ceux-ci se trouvent dans un tat stationnaire ou au moins sils sen approchent suffisamment pour tre correctement reprsents par lapproximation de ltat stationnaire. Une situation de non-quilibre se caractrise par une vitesse nette non-nulle et par une variation dnergie de GIBBS du systme non-nulle : vnette 0 DG 0 [2.51a] [2.51b]
Dans une telle situation, il est plus difficile de dcrire quantitativement la manire dont lapparition du produit dpend de la concentration de substrat : le systme change au cours du temps. Une premire solution consiste utiliser une forme intgre de lquation de vitesse. Cette dmarche est simple pour les ractions simples comme celle dcrite dans lquation [2.26], mais pour des ractions plus complexes impliquant la formation successive de plusieurs intermdiaires (comme celle de lquation [2.47]), qui sont rgulirement observes dans les
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processus enzymatiques, lquation de vitesse ne donne pas une intgrale dfinie. Il est alors ncessaire dutiliser un systme dquations diffrentielles et de le rsoudre numriquement par une mthode dintgration numrique approprie. Habituellement une telle approche se heurte des difficults pratiques comme la ncessit de dterminer les valeurs exactes des diffrentes constantes de vitesse en utilisant des techniques de cintique rapide. Une seconde solution ce problme a t propose par BODENSTEIN (1913) et repose sur le principe dtat stationnaire. Ltat stationnaire est un tat du systme dans lequel un flux de matire ou dnergie traverse le systme mais dans lequel les proprits du systme ne varient pas au cours du temps. Des exemples dtat stationnaire peuvent tre rencontrs dans la vie courante. Par exemple, lorsque nous chauffons lintrieur dune maison, le mur se trouve dans un tat stationnaire. Il est le sige dun passage de chaleur entre lintrieur et lextrieur mais sa temprature reste stable au cours du temps. Un autre exemple, est celui dune cellule ou dun organisme vivant qui respire. Ceux-ci se trouvent dans un tat stationnaire, puisquils absorbent continuellement de loxygne (O2) et librent continuellement de leau et du dioxyde de carbone (CO2). Il est important de bien saisir la diffrence entre une situation dquilibre et une situation dtat stationnaire 2. La figure 2.4 illustre cette diffrence dans le cas dun coulement de fluide. Dans une srie de ractions successives, ltat stationnaire peut sappliquer une espce intermdiaire dont la concentration est faible par rapport au flux de matire traversant le systme. Par exemple, si nous supposons que la formation de P passe par la formation dun intermdiaire X, nous obtenons le mcanisme suivant : A k1 k1 X k2 P [2.52]
Pour analyser la cintique dun tel mcanisme, BODENSTEIN a postul que dans un intervalle de temps donn, le systme existe dans un tat tel que la vitesse de formation de lintermdiaire est proche de la vitesse de sa dcomposition. En consquence, la concentration de cet intermdiaire ne varie pas au cours du temps et d [ X ] dt = 0 . Cette situation peut tre reprsente par lquation : d[ X ] d[ X ] [2.53] + = = 0 dt dt
2. Attention lutilisation du terme tat stationnaire . Trs souvent la situation dtat stationnaire est considre comme celle dun quilibre dynamique , mais cette dnomination est totalement errone et ne devrait jamais tre utilise pour les raisons suivantes : comme nous lavons expliqu ci-dessus, tous les quilibres correspondent des situations dynamiques (voir quation [2.41]), par dfinition un quilibre implique G = 0, alors quau contraire un tat station naire implique G 0.
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a - quilibre
b - tat stationnaire
2.4 - Illustration de la diffrence entre (a) une situation dquilibre et (b) une situation dtat stationnaire dans le cas de lcoulement dun fluide
Cette dernire quation dcrit mathmatiquement ltat stationnaire du systme. Pour un tat stationnaire donn, la vitesse nette, vnette, et le D G ont des valeurs quasiment constantes mais diffrentes de zro. Pour des ractions conscutives dans une situation de non-quilibre, la loi daction de masses reste nanmoins valable et il est alors facile de montrer que la vitesse de formation du produit (en premire approche, la dernire raction est considre comme irrversible) peut tre obtenue en accord avec la loi daction de masses. Selon cette loi : d[ P ] [2.54] v = = k2 [ X ] dt Il est souvent prfrable dexprimer la vitesse en terme dune variation de la concentration de substrat et puisque, en accord avec le principe de BODENSTEIN, les vitesses nettes dans chacun des sens de la raction (formation et utilisation de X) sont gales et il est possible dcrire :
d[ X ] d[ X ] = k1 [ A ] = = ( k 1 + k 2 )[ X ] dt dt
[2.55]
do il est possible de dduire une expression pour la concentration de X qui dpend de la concentration de substrat, [ A ] : k1 [X] = [ A] [2.56] k 1 + k 2
44
En combinant les quations [2.54] et [2.56], nous obtenons : k1 v tat stationnaire = k 2 [ A] k 1 + k 2
[2.57]
De cette manire, la vitesse globale de la raction dapparition du produit P peut tre facilement exprime en fonction de la concentration du substrat A, sans quil soit ncessaire davoir recours une intgration numrique des quations diffrentielles. Notons simplement que dans lquation de vitesse [2.57], les constantes dquilibre sont remplaces par des rapports de constantes de vitesse. Au cours dune raction, ltat stationnaire nest pas permanent. Trois phases peuvent tre distingues, qui sont reprsentes dans la figure 2.5. Au dbut de la raction, lintermdiaire nest pas prsent et la raction dbute par une phase prstationnaire, au cours de laquelle lintermdiaire saccumule. La deuxime phase est la phase dtat stationnaire proprement dite, au cours de laquelle le substrat est transform en produit sans que la concentration dintermdiaire ne varie au cours du temps. Cest uniquement dans cet intervalle de temps que les quations dcrites ci-dessus sont applicables. La troisime phase, post-stationnaire, dbute lorsque le substrat est presque entirement consomm ou que la raction approche de sa position dquilibre. La concentration de lintermdiaire diminue et la raction ralentit.
Etat Etat stationnaire pr-stationnaire Etat post-stationnaire
Concentration (u. a.)
0,0010 0,0008 0,0006 0,0004 0,0002
A P X
0,0000 0,0002
0 0,03
200
400
600
800
1000
Temps (s) 2.5 - Variations de la concentration des diffrents ractifs et intermdiaires au cours dune raction
En pratique, ltat stationnaire nest quasiment jamais atteint. Nanmoins, dans un grand nombre de situations, le systme se trouve suffisamment proche de ltat stationnaire pour quune approximation de ltat stationnaire soit faite. La
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difficult est alors destimer jusquo cette approximation reste valable. En pratique, cette approximation peut tre accepte aussi longtemps que la variation de la concentration de lespce intermdiaire reste faible par rapport la variation de la concentration des ractifs et des produits finaux. En enzymologie, le principe dtat stationnaire a t utilis pour la premire fois par BRIGGS et HALDANE (1925). Nous discuterons plus en dtails de lutilisation de ltat stationnaire pour lanalyse de la cintique enzymatique dans les chapitres suivants.
2.5. LINFLUENCE DE LA TEMPRATURE

SUR LES CONSTANTES DE VITESSE
Dans le premier chapitre, nous avons exprim la vitesse dune raction lmentaire en terme de constante de vitesse, qui est un paramtre exprimental utilisable pour dcrire quantitativement la vitesse dune raction chimique ou biochimique. Nous allons maintenant essayer de comprendre ce qui dtermine la grandeur de la constante de vitesse. Il est clair que la constante de vitesse dune raction dpend des interactions molculaires qui ont lieu durant les rencontres entre molcules individuelles et que la vitesse dune raction dpend avant tout de la frquence avec laquelle les molcules se rencontrent dans la solution. La loi daction de masses tablit clairement la relation entre la vitesse et la concentration des ractifs. Toutefois, la vitesse des ractions ne dpend pas seulement de la frquence des rencontres et toutes les rencontres ne donnent pas lieu une raction. Comme nous allons le voir, la probabilit quune rencontre entre molcules conduise une raction dpend de la variation dnergie de GIBBS qui se produit lorsque les molcules se rencontrent. La premire tape de notre dmarche consiste donc donner une reprsentation de la variation de lnergie du systme au cours de la rencontre entre molcules ractionnelles.
2.5.1. Le profil ractionnel

La description dune raction en terme molculaire ncessite de prciser lvolution de divers paramtres structuraux dcrivant les molcules au cours de leur rencontre. Lnergie de GIBBS du systme peut tre reprsente comme une surface dans un espace multidimensionnel. Si nous restreignons notre analyse deux variables spatiales, cette surface peut tre visualise comme une carte o les courbes de niveau reprsentent lnergie de GIBBS du systme. Une simplification supplmentaire de ce problme consiste dcrire la raction en termes de coordonnes de la raction, qui mesurent lvolution du systme le long du chemin ractionnel le plus probable. Une analogie simple est la mesure du parcours quun promeneur suit pour traverser une chane de montagne. En principe, plusieurs routes sont possibles mais il en existe une
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qui est plus facilement accessible et qui suit gnralement un chemin tortueux passant par un col. Le chemin suivi peut tre dcrit compltement sur une carte deux dimensions, mais la progression du promeneur peut galement tre dcrite par une seule variable correspondant la distance parcourue le long du chemin. La variable quivalente utilise pour dcrire la progression dune raction chimique est appele coordonnes de la raction. Le profil dnergie de GIBBS de la raction est un graphique reprsentant lnergie de GIBBS du systme en fonction des coordonnes de la raction. Dans un tel profil, les substrats et les ractifs reprsentent des tats stables du systme et correspondent donc des minima dnergie de GIBBS. Puisque le passage des substrats aux produits ncessite de rompre ou de former de nouvelles liaisons, le systme ractionnel passe travers un continuum dtats dnergie lorsquil volue le long des coordonnes de la raction. A un certain stade de ce processus, le systme doit passer par un tat dans lequel lnergie de GIBBS est maximale, correspondant un point de selle de la surface dnergie de GIBBS. A ce stade de la raction, lnergie de GIBBS est maximale le long des coordonnes ractionnelles mais est minimale pour tout mouvement perpendiculaire ce chemin. Les molcules au point de selle sont dites tre dans un tat activ, qui est aussi appel ltat de transition. La variation dnergie entre les substrats et ltat de transition est appele lnergie dactivation de GIBBS, qui peut, de la mme faon, tre dfinie pour la raction inverse.
2.5.2. Lquation dARRHENIUS

Ds les premires tudes de la vitesse des ractions, il est apparu clairement que les constantes de vitesse variaient fortement avec la temprature. De ces observations il dcoule que, dune part il est ncessaire de contrler la temprature lors des mesures cintiques, mais dautre part des informations essentielles sur le mcanisme de raction peuvent tre obtenues en mesurant leffet de la temprature sur la vitesse de la raction. Les tudes de VANT HOFF (1884) et dARRHENIUS (1889) constituent le point de dpart de toutes les thories modernes qui visent expliquer la dpendance des constantes de vitesse vis--vis de la temprature. HARCOURT (1867) avait pralablement not que la vitesse de nombreuses ractions doublait approximativement pour chaque augmentation de 10 C de la temprature, mais VANT HOFF et ARRHENIUS ont tent dtablir une relation plus exacte en comparant les observations cintiques avec les proprits dj connues des constantes dquilibre. Toute constante dquilibre K varie avec la temprature absolue T, en accord avec lquation de VANT HOFF :
d lnK DH [2.58] = dT RT 2 o R est la constante des gaz parfaits et DH est la variation denthalpie libre standard associe la raction.
47
Puisque la constante dquilibre K est galement donne par le rapport k1/k1, nous pouvons crire : d ln ( k1 / k 1 ) d ln k1 d ln k 1 DH [2.59] = = dT dT dT RT 2 Sur base de cette galit, nous pouvons driver des expressions spares pour chacune des constantes de vitesse, k 1 et k 1 :
d ln k1 DH1 [2.60a] = +l dT RT 2 d ln k 1 DH 1 [2.60b] = +l dT RT 2 o l est une grandeur au sujet de laquelle nous ne disposons daucune information, si ce nest quelle a vraisemblablement la mme valeur dans les deux quations [2.60a] et [2.60b]. Dans le cas contraire, elle ne disparatrait pas quand ces quations sont combines pour obtenir lquation [2.59]. Toutefois, il est impossible de dmontrer exprimentalement lexistence du terme l dans ces quations et ARRHENIUS a postul que l est gal zro. Ds lors, la dpendance la temprature de toute constante de vitesse k peut tre exprime par une quation de la forme d ln k EA [2.61] = dT RT 2 o EA est lnergie dactivation qui est relie lenthalpie standard de la raction, DH, dans lquation de VANT HOFF. Lintgration de lquation [2.61] donne : E [2.62] ln k = ln A A RT o A est une constante dintgration. Cette forme de lquation de ARRHENIUS est la plus approprie pour des reprsentations graphiques, puisquelle autorise de tracer soit un graphique reprsentant ln k en fonction de 1/T caractris par une droite dont la pente vaut EA /R, soit un graphique reprsentant log k en fonction de 1/T, caractris par une droite ayant une pente qui vaut EA /2,303R. Ce graphique illustr dans la figure 2.6, est connu sous le nom de graphique dARRHENIUS, et constitue une mthode simple dvaluation de EA.
2.5.3. Thorie de collision lmentaire

En prenant lexponentielle de chaque partie de lquation [2.62], nous obtenons lquation : [2.63] k = A e E a RT Selon la thorie de BOLTZMANN pour la distribution de lnergie entre les molcules, le nombre de molcules possdant lnergie Ea dans une solution est proportionnel e E a RT .
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Temprature (C) log k 3,5

70 60 50 40 30 20 10 0
k/1000
3
Pente = EA / 2,303R
0 0 2,5 20 40 60
Temprature (C)
2,9
3,1
3,2
3,3
3,4
3,5
3,6
1000 /T 2.6 - Graphique dARRHENIUS Lnergie dactivation EA est calcule partir de la pente. Linsert montre les mmes donnes avec une reprsentation linaire des coordonns.
3,7 1) (K
Par consquent, lquation dARRHENIUS montre que les molcules ne peuvent prendre part une raction que si leur nergie atteint une certaine valeur seuil, correspondant lnergie dactivation. Dans cette interprtation, la constante A devrait tre gale la force de collision, Z, au moins pour les ractions bimolculaires, et il dcoule de lquation [2.61] que la limite de la constante de vitesse est atteinte lorsque 1/T = 0, cest--dire pour une temprature infinie. Pour quelques ractions simples en phase gazeuse, comme la dcomposition de liodure dhydrogne par exemple, A est gale Z, mais en gnral, il est ncessaire dintroduire un facteur P supplmentaire qui tienne compte de lorientation des molcules au moment de la collision :
k = P Z e E a
RT
[2.64]
En plus de possder une nergie suffisante, les molcules doivent galement tre correctement orientes pour ragir. Le facteur P est une mesure de la probabilit davoir les molcules dans une orientation favorable au moment de la collision ; ainsi linterprtation ci-dessus se trouve modifie et temprature infinie, une collision nest productive que si lorientation est correcte. Lquation [2.64] fournit un accord raisonnable avec les thories modernes des vitesses de raction, mais dans plusieurs cas, il est prfrable dutiliser une autre approche qui est connue comme la thorie de ltat de transition et est discute dans le paragraphe suivant.
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2.5.4. Thorie de ltat de transition - Thorie de la vitesse absolue

Lorsque le systme ractionnel volue le long des coordonnes de la raction, il doit passer par un tat dans lequel lnergie de GIBBS est maximale, ltat de transition. Cet tat est clairement diffrent dun intermdiaire, qui ne reprsente pas un maximum dnergie de GIBBS mais un minimum mtastable dans le profil ractionnel. La thorie de ltat de transition, qui a t propose par EYRING (1935) et inclut dimportantes contributions par EVANS et POLYANI (1935) et par PELZER et WIGNER (1932), est le concept le plus gnralement utilis aujourdhui pour dcrire les vitesses de raction. Elle est appele ainsi car elle relie la vitesse des ractions chimiques aux proprits thermodynamiques dun tat particulier des molcules ractives, dnomm tat de transition ou complexe activ. Elle est aussi connue sous le nom de thorie de la vitesse absolue car elle prdit la vitesse des ractions partir de principes lmentaires, contrairement la loi dARRHENIUS qui est une loi empirique. Lide centrale de la thorie dEYRING est qu une temprature donne, la vitesse de la raction dpend uniquement de la concentration du complexe activ de haute nergie qui est en quilibre avec les substrats.
G Etat de transition X Etat de transition
DG Energie de GIBBS d'activation
intermdiaire
A+B Ractifs Energie de GIBBS de la raction DG P+Q Produits
Coordonnes de la raction
2.7 - Profil ractionnel en accord avec la thorie de ltat de transition Le diagramme le long de laxe des abscisses reprsente les coordonns de raction pour une simple raction bimolculaire. L'insert montre le cas o la raction passe par un intermdiaire.
50
Pour la raction de A avec B, les substrats sont en quilibre avec le complexe activ K P+Q X [2.65] A+B et lquilibre est dcrit par une constante dquilibre :
[X ] [ A ][ B ]
[2.66]
A partir de cette quation, il est possible de dfinir la concentration du complexe activ partir de la concentration des substrats :
[X ] = K [ A ][ B ]
[2.67]
La vitesse de la raction peut tre obtenue en considrant les vnements qui se droulent dans ltat de transition. Il est possible de schmatiser ce qui se passe dans ltat de transition comme un mouvement de vibration dun ou de plusieurs atomes du complexe activ selon la direction spcifie par les coordonnes de la raction. Cependant, au lieu de suivre un mouvement oscillatoire continu, la vibration se transforme en un mouvement de translation et le ou les atomes continuent leur mouvement, donnant lieu la rupture de la liaison ou la formation dune nouvelle liaison. La vitesse de la raction, d [ A ] dt , est alors donne par le produit de la concentration du complexe activ et de la vitesse de passage qui correspond la vitesse laquelle le complexe activ volue lorsquil a atteint le point de selle dans le profil nergtique. Pour tre complet, il faudrait galement considrer quau point de selle, seulement une fraction k des molcules va voluer vers les produits de la raction, le reste des molcules retournant vers les substrats. Les thories de la physique molculaire peuvent tre utilises pour dterminer la vitesse de passage au point de selle. Dans la thorie de EYRING, la constante de vitesse de passage au point de selle, k , est gale la frquence de vibration productive et est exprime comme une frquence J en cycle par seconde (nous utilisons ici le symbole J pour reprsenter la frquence afin de le distinguer du symbole v, utilis pour la vitesse) : J = k . Ds lors la vitesse de la raction peut tre dcrite par lquation suivante :
v =
d[ A] = k [X ] = J [X ] dt
[2.68]
Lnergie associe un mouvement de vibration est donne par :
Evib = h J
[2.69]
o h est la constante de PLANCK. Ds lors, la frquence de passage peut tre exprime par : E [2.70] J = vib h
51
Lnergie moyenne dun atome se dplaant le long des coordonnes de la raction peut tre remplace par lnergie moyenne dune particule vibrant dans une dimension. La vibration sera productive si l'nergie de vibration est gale ou suprieure l'nergie potentielle de la liaison covalente. La mcanique quantique nous apprend que : [2.71] Epot = kB T o kB est la constante de BOLTZMANN et T est la temprature. Donc pour la formation du complexe X : [2.72] Epot = Evib et
h J = kB T
[2.73]
Nous obtenons une expression pour la constante de vitesse de passage : k T J = B h
[2.74]
Dun autre ct, en accord avec les lois de la thermodynamique classique, la constante dquilibre peut tre relie la variation dnergie de GIBBS pour la formation de ltat de transition partir des ractifs :
DG
= RT lnK
DG RT
[2.75]
Cette quation peut galement scrire sous la forme suivante :
= e
[2.76]
En utilisant les quations [2.67] et [2.76], la concentration de ltat activ pour la raction est donne par :
[X ] = e
DG RT
[ A ][ B ]
[2.77]
La vitesse de la raction peut alors scrire :
v =
DG kB T RT e [ A ][ B ] h
[2.78]
Dans le premier chapitre, nous avons vu que la loi empirique daction de masses fournit lexpression suivante pour la vitesse dune raction de second ordre : [2.79] v = k [ A ][ B ] La comparaison des quations [2.78] et [2.79] montre que la constante de vitesse k est donne par : k T DG [2.80] k = B e RT h Lquation [2.80] est lquation centrale de la thorie dEYRING de ltat de transition et limine le mystre qui entoure la constante de vitesse : elle donne cette grandeur une valeur qui dpend des constantes fondamentales de la mcanique quantique, kB et
52
h, de la temprature absolue, T, et de la variation dnergie de GIBBS entre les substrats et ltat de transition. Cette quation est galement une quation centrale de la thermocintique, reliant un paramtre cintique de la raction, la constante de vitesse k, un paramtre thermodynamique, la variation dnergie de GIBBS pour la formation de ltat de transition, DG . Bien que cette quation ait t dveloppe pour reprsenter une raction simple en phase gazeuse (un systme idal) en utilisant lhypothse de lexistence dun quilibre entre ltat initial et ltat de transition, son application sest largie de nombreux autres domaines, y compris lenzymologie. Dans ce cas, son application est justifie puisque la thorie prdit une dpendance linaire entre ln(k/T) et 1/T qui est vrifie pour les ractions enzymatiques : k [2.81] ln k = ln B DG T h RT Puisque la variation dnergie de GIBBS est relie aux variations denthalpie et dentropie, nous avons : [2.82] DG = DH TDS et lquation [2.81] peut scrire :
k [2.83] ln k = ln B + DS DH T h R RT qui implique une dpendance linaire entre ln(k/T) et 1/T avec une pente gale DH /R 3. Lexprience montre quune telle dpendance linaire est couramment observe dans de nombreuses situations, y compris des ractions enzymatiques.
3. En diffrentiant lquation [2.83], on obtient lquation suivante :
DH + RT = dT RT 2 En comparant cette quation avec lquation dARRHENIUS (quation [2.59]) on peut voir que lnergie dactivation EA nest pas gale H , mais H + RT. Du reste, EA nest pas strictement indpendant de la temprature, impliquant que le graphique dARRHENIUS est non-linaire. Toutefois, la courbure attendue est tellement faible quelle nest pas dtectable et que la variation de k rsultant du facteur T est faible en comparaison de la variation due au terme exponentiel. Comme A et EA dans lquation [2.61] peuvent tre dtermins exprimentalement partir dun graphique d'ARRHENIUS, H et S pourront tre calculs partir des relations suivantes H = EA RT AN A h R DS = R ln ou EA = H + RT et RT Ces quations montrent quun catalyseur peut augmenter la vitesse dune raction en diminuant S ou en diminuant H ou en affectant les deux proprits. Il est probable que ces deux effets soient importants en catalyse enzymatique, bien que dans la plupart des cas, il soit difficile de justifier ceci, du fait que les ractions non catalyses sont trop lentes pour que les valeurs de S et de H puissent tre mesures.
d lnk
53
Lenthalpie et lentropie dactivation dune raction chimique fournissent une information prcise sur la nature de ltat de transition et donc sur le mcanisme de raction. Une enthalpie dactivation leve indique une augmentation de la tension ou la rupture dune liaison chimique, qui est ncessaire pour la formation de ltat de transition. Si DS est fortement ngatif, la formation de ltat de transition ncessite que les molcules ractives adoptent des conformations prcises et sapprochent les unes des autres avec un angle prcis. Comme les molcules varient dans leur stabilit conformationnelle, cest--dire dans leur rigidit, et dans leur complexit, on pourrait sattendre ce que les valeurs de DS varient beaucoup entre diverses ractions, ce qui est le cas. Les molcules qui sont importantes dans les processus mtaboliques sont nombreuses et flexibles, impliquant que des ractions non catalyses entre les mmes molcules sont fortement improbables.
2.5.5. Les enzymes stabilisent ltat de transition de la raction

En plus de fournir une explication la dpendance de la vitesse de la raction sur la temprature, lquation [2.80] fournit galement un moyen de mesurer lefficacit catalytique des enzymes. Leffet de tout catalyseur, y compris celui des enzymes, est dacclrer les ractions en augmentant les constantes de vitesse, sans affecter lquilibre global de la raction. Le paramtre qui varie est K ou la variation dnergie de GIBBS associe, DG . Lexistence dinteractions spcifiques entre les substrats et les groupes du centre catalytique de raction (site actif des enzymes), facilite la formation de ltat de transition ( stabilisation de ltat de transition) et le DG diminue dune quantit DDG . Si DG est la variation dnergie de GIBBS dactivation en absence denzyme, la variation dnergie de GIBBS en prsence denzyme est donne par : DG DDG . Cette diminution de lnergie de GIBBS dactivation se traduit par une variation dans lexpression de la constante de vitesse, dans laquelle il devient possible de dfinir un facteur dacclration :
kcat =
kB T e h
( DG DDG ) RT
DG kB T RT DDG e e RT h
= k non cat f acc
[2.84]
o le facteur dacclration donn par e
DDG RT
peut atteindre une valeur de 1014.
Parce que le DDG est identique dans les deux sens de la raction, le mme facteur dacclration sapplique dans les deux sens de la raction. Le catalyseur augmente donc la vitesse dans les deux sens mais ne modifie pas la position de lquilibre entre les substrats et les produits. Ce principe fondamental de la catalyse enzymatique a t propos par HALDANE en 1930 et dvelopp par PAULING en 1946 : les enzymes catalysent les ractions chimiques en stabilisant spcifiquement ltat de transition de la raction. Pour catalyser une raction, un enzyme doit tre complmentaire de ltat de transition de la raction. Cela signifie que les interactions entre le substrat et lenzyme
54
doivent tre optimales dans ltat de transition. La difficult dans ltude de ltat de transition est que sa structure ne peut pas tre dtermine directement. La complmentarit entre lenzyme et ltat de transition de la raction ne peut tre dmontre que de manire indirecte.
PROBLMES
2.1 - De nombreuses ractions se caractrisent par un doublement de la
vitesse quand la temprature est augmente de 25oC 35o C. Quelle conclusion peut-on tirer au sujet de lenthalpie dactivation ? (R = 8,31 J mol1 K1, 0oC = 273 K, ln 2 = 0,693)
2.2 - Dans le calcul de lquation dARRHENIUS ( 2.5.2), un terme l a t

introduit et subsquemment suppos gal zro. A la lumire de la thorie de ltat de transition ( 2.5.4), quelle serait la valeur de l 300 K (27oC) ?
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT

3.1. HISTORIQUE
3.1.1. La dcouverte des enzymes
Les premires dmonstrations dune activit enzymatique dans des extraits naturels remontent au XVIIe sicle, quand RAUMUR dabord et SPALLANZANI ensuite montrent que le suc gastrique des oiseaux est impliqu dans la digestion de la viande. Dans une exprience simple, SPALLANZANI nourrit des aigles avec des morceaux de viande entours dun treillis mtallique quil peut ensuite extraire de lestomac des oiseaux pour suivre lvolution de la digestion. La mise en vidence de lactivit dautres enzymes se poursuit au XIXe sicle. En 1833, PAYEN et PERSOZ isolent partir du malt une substance qui est responsable de la fermentation et quils nomment diastase. Ce terme sera par la suite utilis pour dsigner de manire gnrale toutes substances responsables de fermentation. Plus tard, le suffixe -ase a t conserv pour dsigner la macromolcule responsable dune activit enzymatique. Par exemple, lamylase est un enzyme responsable de la dgradation de lamidon. En 1836, alors quil tudie les processus digestifs, SCHWANN isole la pepsine, une substance responsable de la digestion dans lestomac et le premier enzyme obtenu partir dun tissu animal. Les dcouvertes se succdent ensuite : lmulsine (WOHLER et LIEBIG, 1837), la lipase du pancras (BERNARD, 1840), linvertase de la levure (BERTHELOT, 1860) et la trypsine du pancras (KUHNE, 1877). A cette poque, la nature de ces agents actifs est inconnue et fait mme lobjet dune controverse. Dun ct, il y a ceux qui, derrire Louis PASTEUR, pensent que les fermentations sont provoques par des microorganismes et que les agents responsables, les ferments, ne peuvent tre dissocis de la prsence de cellules vivantes. De lautre ct, il y a ceux, qui derrire Julius LIEBIG, pensent que les ferments sont des substances dissociables des tres vivants. Les ferments sont donc diviss en deux catgories, les ferments figurs qui sont visibles et impliquent la prsence de cellules vivantes et les ferments solubles . Pour dsigner ces derniers, KUHNE invente le mot enzyme qui signifie littralement dans la levure , mais
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en 1897, Eduard BUCHNER rsout le problme en montrant que les ferments solubles sont les vritables principes actifs et quils sont contenus dans les ferments figurs . A partir de levure de bire, il isole une substance quil nomme zymase et avec laquelle il est capable de reproduire la fermentation in vitro. Toutefois, la nature chimique des enzymes nest pas tablie. Certains comme Eduard BUCHNER et Emil FISCHER considrent les enzymes comme des protines, mais dautres pensent que le principe actif des enzymes est une petite molcule adsorbe sur la protine. Il faudra attendre la purification et la cristallisation de lurase par James B. SUMNER en 1926 pour que soit dfinitivement accepte la nature protique des enzymes. La composition des protines sera tablie au dbut du XXe sicle et la premire structure tridimensionnelle est dtermine par KENDREW en 1957. Finalement, dans les annes 1980, Thomas CECH dcouvre les ARN catalytiques, une autre classe de macromolcule galement dote dune activit catalytique.
R en A nto ine F E RC HAULT
DE
R AU MUR (1683-1757)
La premire mise en vidence exprimentale de lactivit des enzymes est attribue RAUMUR, dont la carrire scientifique est un bel exemple de ces savants des sicles passs qui taient capables de briller dans les disciplines les plus varies. Rn Antoine FERCHAULT DE RAUMUR nat la Rochelle le 28 fvrier 1683 dune famille de petite noblesse. Il commence ses tudes la Rochelle, les poursuit chez les Jsuites Poitiers et ensuite tudie le droit Bourges. Il se passionne alors pour les sciences et lobservation de la nature et entame des tudes de mathmatiques. A 25 ans, il est admis lAcadmie des Sciences comme lve gomtre. Il sera directeur de cette institution douze reprises et sous-directeur neuf reprises. Il sintresse la mtallurgie et au dveloppement de cette industrie. En 1722, il publie le Trait sur lart de convertir le fer en acier et dadoucir le fer fondu dans lequel il rapporte de nombreuses expriences sur la mise au point de procds de fabrication de lacier. Il se proccupe galement de la fabrication de la porcelaine et ce sont ses successeurs qui, travaillant sur ses indications, tabliront lutilisation de largile blanche, notamment dans la rgion de Limoges. RAUMUR est surtout clbre pour la construction, sur la base des travaux de NEWTON, du premier thermomtre alcool fiable et que nous utilisons toujours. Il publie ses travaux dans un mmoire intitul Rgles pour construire des thermomtres. Il choisit comme points extrmes de sa graduation les tempratures de fusion et dbullition de leau, mais les fabricants divisent cette gamme en 80 degrs. Cest CELSIUS qui plus tard introduira la division centsimale utilise jusqu nos jours. Il fait de trs nombreuses dcouvertes dans le domaine des sciences naturelles. Il tudie principalement les invertbrs qui, cette poque, sont gnralement dlaisss par les autres naturalistes. Entre 1734 et 1742, RAUMUR publie six volumes de ses Mmoires pour servir lHistoire des Insectes dans lesquels il prsente des observations rigoureuses
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT
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de lanatomie et du comportement de ces arthropodes. Ces ouvrages sont crits dans un style clair et vivant sans perdre la rigueur et la prcision ncessaires un expos scientifique. Ces deux qualits seront reconnues et loues plus tard par Jean-Henri FABRE, un entomologiste de renom de la fin du XIXe sicle. En 1752, RAUMUR ralise des expriences dans lesquelles il dmontre que la digestion de la viande par des oiseaux de proie rsulte de laction chimique du suc gastrique plutt que dune action mcanique. Il fait avaler des rapaces des tubes contenant de la viande et qui sont ferms leurs extrmits par un bouchon grillag. Lorsque les oiseaux rgurgitent les tubes, il constate que la viande est partiellement digre. Dans son Second mmoire sur la digestion (1752), il crit : La digestion est opre par la seule action dun dissolvant et par la fermentation quil fait natre. RAUMUR ne sest jamais mari et a consacr sa vie sa carrire acadmique et scientifique. Il meurt en 1757 dans sa proprit de La Bermondire, St-Julien-du-Terroux, des suites dune chute de cheval.
3.1.2. Les premires tudes de la cintique enzymatique et le dveloppement du concept du complexe enzyme-substrat
Ltude de la vitesse des ractions catalyses par des enzymes dbute dans la seconde moiti du XIXe sicle, un moment o la cintique chimique est en plein dveloppement. A cette poque la majorit des tudes taient ralises avec des enzymes impliqus dans des processus de fermentation, en particulier linvertase 1, qui catalyse lhydrolyse du saccharose figure 3.1.
Ltude de la cintique dhydrolyse du saccharose en prsence de diffrents acides

avait conduit au dveloppement des quations de vitesse et avait finalement amen GULDBERG et WAAGE proposer en 1864 la loi daction de masses et ensuite VANT HOFF dfinir la constante dquilibre dune raction rversible comme le rapport des vitesses dans les directions directe et inverse. A la fin du XIXe sicle, les fondements thoriques de la cintique chimique sont donc tablis et la question qui intrigue les savants de lpoque est de savoir si la cintique des ractions catalyses par les enzymes peut tre dcrite par les mmes lois. Les enzymes sont associs des ractions du monde vivant et la dmonstration que ces composs obissent aux mmes lois que les ractions chimiques a, lpoque, une porte beaucoup plus profonde que la rsolution dun problme de cintique de raction.
1. Dans la nomenclature internationale, linvertase est aujourdhui connue sous le nom de b-fructo-furanosidase.
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CH2OH O H HOCH2 O H H OH H o H HO CH OH HO 2 [a]D = + 66,5 H OH OH H H -D-fructofuranosyl--D-glucopyranoside
H2O CH2OH O H H OH H OH HO [a]D = + 112,2 H OH H -D-glucopyranose A l'quilibre [a]D = + 52,6 CH2OH O OH H OH H HO H [a]D = + 18,7 H OH H -D-glucopyranoside
+ H2O
Invertase
HOCH2 O H H HO
CH2OH OH
OH H -D-fructofuranose Equilibre global []D = 22 A l'quilibre []D = 92,4
HOCH2 O H H HO
OH CH2OH
OH H -D-fructofuranose
3.1 - Lhydrolyse et la mutarotation du saccharose La majorit des tudes ralises au XIXe sicle et au dbut du XXe sicle portaient sur des enzymes impliqus dans les phnomnes de fermentation, et en particulier sur linvertase qui catalyse lhydrolyse du saccharose. Lhydrolyse du saccharose par les acides ou par linvertase est un modle important qui a servi aux premiers dveloppements de la cintique chimique et de la cintique enzymatique. Lhydrolyse du saccharose, qui saccompagne de la mutarotation du glucose et du fructose, tait suivie par polarimtrie. Le pouvoir rotatoire spcifique []D correspond langle de rotation du plan de polarisation de la lumire mesur 589,6 nm (la longueur donde de la raie D du sodium) rapporte pour une cuvette dont le trajet optique a une longueur de 1dm et pour un chantillon dont la concentration est gale 1 g mL1.
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3.1.3. Les travaux de Victor HENRI

En 1903, Victor HENRI publie sa thse de doctorat s Sciences intitule Lois gnrales de laction des diastases dans laquelle il fait une synthse critique des donnes cintiques disponibles lpoque, y compris des siennes, dans le but de driver une quation de vitesse qui reprsente correctement la cintique enzymatique. Il obtient ainsi la premire quation de vitesse base sur un mcanisme ractionnel dfini et prouve dfinitivement que la cintique enzymatique respecte la loi daction de masses comme les ractions chimiques (voir ci-dessous). En suivant la dmarche quil adopte dans lintroduction de sa thse, nous prsentons ici brivement trois ensembles dides et de donnes exprimentales sur lesquels repose le travail de thse de Victor HENRI : Les enzymes sont des catalyseurs - Les premires tudes de la cintique enzymatique avaient permis de dmontrer que les enzymes taient des catalyseurs. En 1835, BERZELIUS avait introduit le terme daction catalytique pour expliquer divers processus chimiques parmi lesquels il rangeait la dcomposition de lamidon par un extrait de malt. Grce son sjour dans le laboratoire dOSTWALD, HENRI est parfaitement bien inform sur les tudes ralises lpoque pour comprendre les mcanismes catalytiques. Il prsente dans sa thse les proprits des enzymes qui sont caractristiques de laction des catalyseurs : lexistence dune grande disproportion entre la quantit de catalyseur utilise et la masse transforme de substrat, la modification complte par lenzyme de la courbe dvolution dune raction sans modification de la position des quilibres et la dpendance de la constante de vitesse vis--vis de la concentration denzyme. Finalement, il note limportance dtudier la loi de vitesse qui caractrise une raction parce quelle permet de distinguer les diffrents types de mcanismes catalytiques, et ventuellement de mettre en vidence la formation transitoire de complexes entre le catalyseur et le substrat. Les premires tudes de la cintique des ractions enzymatiques - Au moment o HENRI entame son tude, de nombreux travaux ont dj t raliss par dautres pour comprendre le mcanisme daction de divers enzymes. Dans la seconde partie de son introduction, il discute de limportance de certains travaux et notamment de ceux raliss sur laction de linvertase (quil appelle invertine). Divers rsultats dmontrent laction catalytique des enzymes selon les critres dfinis par HENRI. Par exemple, OSULLIVAN et TOMPSON (1890) qui ont tudi par polarimtrie la raction dhydrolyse du saccharose par linvertase, ont montr que cette enzyme nest ni altre, ni dtruite au cours de la raction (except aux tempratures leves) et quun chantillon reste actif aprs avoir catalys lhydrolyse dune masse de saccharose correspondant 100 000 fois la masse de lenzyme. Concernant lquation de vitesse, diverses tudes ont t consacres la variation de la vitesse avec la concentration denzyme. Les rsultats dOSULLIVAN et TOMPSON (1890) et ceux de TAMMANN, montrent que lactivit de lenzyme est
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directement proportionnelle la concentration denzyme utilise dans lessai et donc que la cintique suit les prdictions de la loi daction de masses. Par contre, lorsquil sagit dexpliquer la variation de la vitesse de la raction avec la concentration de saccharose, c'est--dire avec la concentration de substrat, les choses sont moins videntes. A une concentration fixe de substrat, les cintiques observes par OSULLIVAN et TOMPSON suivent approximativement une courbe exponentielle comme le prdisent les lois de la cintique chimique pour une raction unimolculaire. Toutefois, bien que ces auteurs aient constat une lgre dviation par rapport cette loi, ils nont pas tudi la variation de la vitesse avec la concentration initiale de substrat. Cette tude a nanmoins t ralise par BARTH (1878) et par DUCLAUX (1898), mais ceux-ci ont conclu que la vitesse de la raction enzymatique tait indpendante de la concentration de substrat. DUCLAUX propose un modle cintique o la diminution de la vitesse observe au cours de la cintique est explique par une inhibition par le produit de la raction. BARTH a remarqu que cette indpendance de la vitesse vis--vis de la concentration de substrat nest plus vrifie pour des solutions suffisamment dilues de substrat, une observation qui a ensuite t confirme par BROWN (1892). Le concept du complexe enzyme-substrat - La formation dun complexe entre lenzyme et son substrat constitue aujourdhui le concept central de la catalyse enzymatique ; son importance dans les mcanismes de fonctionnement des enzymes sera discute plus en dtails dans dautres chapitres. La notion selon laquelle la formation dun complexe entre lenzyme et son substrat est ncessaire pour lactivit enzymatique est apparue dans divers travaux la fin du XIXe et au dbut du XXe sicle. Cette notion est dj implicite dans les travaux dEmil FISCHER qui sintresse la spcificit de laction des enzymes. Il propose que la complmentarit strique entre lenzyme et son substrat est lorigine de cette spcificit et que les enzymes et les substrats se reconnaissent comme une cl sadapte dans une serrure figure 3.2.
Groupe catalytique 3 Site actif
+
Substrat (A) Enzyme Enzyme (E) Groupe catalytique 1 Groupe catalytique 2 Complexe (EA)
3.2 - Le concept cl-serrure propos par Emil FISCHER pour expliquer la spcificit daction des enzymes suggrait lexistence dun complexe enzyme-substrat
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Dans leurs tudes menes sur linvertase, OSULLIVAN et TOMPSON ont remarqu que la stabilit thermique de lenzyme augmentait en prsence de son substrat et ils ont voqu lide de la formation dun complexe enzyme-substrat pour expliquer cette variation des proprits de la protine. Linvertase, quand elle est mise en prsence de sucre de canne (saccharose) supporte une temprature de 25oC suprieure celle quelle supporte en son absence. Cest un fait trs marquant et, autant que nous pouvons en juger, il y a une seule explication cela, nommment que linvertase se combine avec le sucre. Adolphe WURTZ (1880) est arriv une conclusion similaire pour expliquer lapparition dun prcipit lors de lhydrolyse de la fibrine catalyse par la papane ; il suggre que le prcipit est un compos papane-fibrine qui agit comme un intermdiaire dans lhydrolyse. Nanmoins, cest BROWN qui dmontre dfinitivement que la formation dun complexe entre lenzyme et son substrat explique les dpendances exprimentales de la vitesse de raction vis--vis des concentrations denzyme et de substrat. En parallle avec dautres chercheurs, BROWN observe que les vitesses des ractions catalyses par des enzymes dvient des cintiques de second ordre (1892). Initialement, il a montr que la vitesse dhydrolyse du saccharose dans la raction de fermentation par des levures vivantes semble tre dpendante de la concentration de saccharose. Le conflit entre les rsultats de BROWN et ceux de OSULLIVAN et TOMPSON na pas t apprhend srieusement, parce que la catalyse par des enzymes isols est considre comme un phnomne fondamentalement diffrent de la fermentation par des organismes vivants. Mais la dcouverte par Eduard BUCHNER (1897), quun extrait de levure dpourvu de cellule vivante peut catalyser la fermentation alcoolique, pousse BROWN (1902) rexaminer ses rsultats. Aprs avoir confirm leur vracit, il montre que des rsultats similaires peuvent tre obtenus avec linvertase purifie. BROWN (1892) dfend lide du complexe enzyme-substrat dans un contexte purement cintique. Il propose quun mcanisme impliquant un complexe enzyme-substrat impose une limite sur la vitesse de raction qui peut tre atteinte par le systme. Si un complexe existe pendant un bref laps de temps avant la libration du produit, alors une vitesse maximale devrait tre atteinte lorsque la concentration de substrat est suffisante pour convertir tout lenzyme en complexe enzyme-substrat, en accord avec la loi daction de masses. Inversement, de plus faibles concentrations de substrat, la vitesse laquelle le complexe est form devient significative et, en consquence, la vitesse de raction est dpendante de la concentration de substrat. Selon HENRI (1903), diverses tudes menes au moment o il entame son travail font apparatre des diffrences entre laction des enzymes et celle des acides et suggrent que les enzymes oprent par un mcanisme diffrent de celui des acides. HENRI propose dentreprendre une tude exprimentale systmatique de la cintique enzymatique en faisant varier les conditions dune manire aussi complte que possible et danalyser les rsultats en se plaant de nouveau au point de vue des lois de la chimie gnrale afin de dfinir un mode daction gnral pour
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les enzymes qui sappuie uniquement sur la loi de laction de masses, sans avoir recours des proprits sui generis qui seraient dues seulement aux diastases. Dans son travail de thse, Victor HENRI tudie la cintique daction de trois enzymes quil purifie lui-mme ou quil obtient sous la forme de prparations commerciales : linvertase, lmulsine et lamylase. Pour linvertase, il observe que la vitesse diminue au cours de la raction mais il prouve dfinitivement que cette diminution est beaucoup moins rapide que ne le prdit une loi de premier ordre. Pour expliquer cette diffrence, il mesure la variation de la vitesse avec la concentration de saccharose et observe une variation complexe de la vitesse avec la concentration de substrat. Ainsi, dans la figure 3.3 qui reproduit les donnes de HENRI, la vitesse double pour une augmentation dun facteur quatre de la concentration de substrat entre 0,025 M 0,1 M, mais la vitesse est peine trois fois plus grande pour une augmentation dun facteur dix de la concentration de substrat entre 0,025 M et 0,25 M. Il dmontre que lenzyme nest pas modifi au cours de la raction et que la diminution de la vitesse observe aux fortes concentrations de substrat (montre dans la figure 3.3) est due laction inhibitrice des produits, principalement du fructose (quil appelle lvulose). Finalement, en tudiant la variation de la vitesse de la raction avec la concentration denzyme, il confirme la proportionnalit directe entre la vitesse de la raction et la concentration denzyme.
Vitesse initiale (quantits de saccharose interverties par minute)
6
0,4
0,8
Concentration de saccharose (M) 3.3 - Cintique dhydrolyse du saccharose par linvertase Donnes prsentes par HENRI dans sa thse de doctorat. La ligne en trait continu montre la courbe thorique dessine en utilisant lquation [3.2] et les valeurs suivantes des paramtres : k = 72,25 s1 et m = 12,1 M1.
Sur la base de ces rsultats, il cherche tablir une quation de vitesse qui permette de dfinir une constante de vitesse indpendante des concentrations denzyme et de
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substrat, qui soit drive partir dun mcanisme ractionnel dfini et qui soit en accord avec la loi daction de masses. Ce travail lamne remettre en question le modle daction enzymatique de BROWN qui impliquait un temps de vie fix pour le complexe enzyme-substrat entre sa cration et sa dnaturation, et il propose pour le remplacer un mcanisme qui, quoique conceptuellement similaire celui de BROWN, est exprim en des termes mathmatiques et chimiques plus prcis. HENRI propose que lenzyme interagisse de manire rversible avec le substrat et avec le produit et que ce soit la rupture du complexe enzyme-substrat qui donne le produit. Il conoit parfaitement que son modle repose sur deux hypothses et il en discute les consquences : des quilibres rapides stablissent entre lenzyme et le substrat et entre lenzyme et le produit ; il existe une grande diffrence de concentration entre le substrat et lenzyme. A partir de ces considrations, il drive une quation de vitesse (quation [3.1]) qui rend compte des dpendances de la vitesse aux concentrations de substrat, denzyme et de produit : k ( [ A ]0 [ P ] ) d[ P ] v = = [3.1] dt 1 + m ( [ A ]0 [ P ] ) + n[ P ] Pour la vitesse initiale, cette quation se simplifie puisque [ P ] = 0 :
v = d [ P] dt =
k [ A ]0 1 + m[ A ]0
[3.2]
Dans ces quations, k, m et n sont des constantes caractristiques du systme enzymatique tudi. Comme le note HENRI, cette quation prdit que pour une concentration suffisamment leve de substrat la vitesse de la raction devient indpendante de la concentration de substrat mais que, pour une concentration faible de substrat, la vitesse est directement proportionnelle cette concentration.
3.1.4. Les problmes rencontrs par HENRI

A la fin du XIXe sicle, aucun enzyme ntait disponible sous une forme purifie et les mthodes de mesure de lactivit de ces enzymes taient primitives. En dehors de ces problmes, plusieurs critiques ont t faites au sujet du travail de HENRI. Bien que lui et BROWN aient atteint des conclusions essentiellement correctes sur le mode daction des enzymes, ils lont fait sur la base dexpriences qui ouvrent la porte de srieuses objections. Premirement, la notion de pH qui est particulirement importante pour ltude des ractions en solution na pas encore t introduite, et HENRI nutilise pas de tampon pour contrler le pH de son chantillon. Le concept de pH ne sera introduit par SRENSEN quen 1909. OSULLIVAN et TOMPSON avaient ralis, sans pouvoir y apporter une solution, que la vitesse de la raction dpendait fortement de lacidit du mlange ractionnel. Lorsque lacidit est dans la proportion la plus favorable, ils obtiennent des rsultats reproductibles.
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Pour contrler lacidit du milieu, OSULLIVAN et TOMPSON ajoutent de lacide dans leur prparation denzyme jusqu atteindre un pH optimum aux environs de pH 4. De son ct, BROWN prpare lenzyme dune manire diffrente et observe que laddition dacide nest pas ncessaire (ses solutions sont vraisemblablement suffisamment tamponnes par les composants naturels de la levure), alors que HENRI ne mentionne pas ce problme. Deuximement, dans ses travaux sur linvertase, HENRI utilise la mesure directe de polarimtrie pour calculer la quantit de sucre qui a ragi et ne tient pas compte de la mutarotation du produit. A cette poque, seuls OSULLIVAN et de TOMPSON prenaient en compte la mutarotation du glucose. Selon SEGAL, il semble cependant que cette mauvaise pratique nait par affect significativement les rsultats de HENRI.
Victor H ENR I (1872-1940)

Victor HENRI est lun des fondateurs de la physicochimie biologique en France. Sa carrire est un bel exemple de pluridisciplinarit et de mobilit qui na pas empch HENRI de briller par la nouveaut de ses ides dans les diffrents domaines quil a abords. Comme le mentionne Jean DUCHESNE, Victor HENRI tait un penseur universel pour qui les grands problmes industriels ne pouvaient tre rsolus quen se basant sur la science fondamentale, une conception de la recherche que nous avons peut tre trop tendance oublier aujourdhui. Victor HENRI est n Marseille le 6 juin 1872, de parents issus de laristocratie russe. Il passe sa jeunesse en France, puis entreprend, lcole allemande de Saint-Ptersbourg, des tudes classiques quil termine Paris o il vient sinstaller lage de 14 ans. Il tudie ensuite la Sorbonne o il obtient un certificat de mathmatiques et un de sciences naturelles. Il travaille ensuite dans le laboratoire de philosophie de lUniversit de Leipzig et acquiert en 1897 le grade de docteur en philosophie lUniversit de Gttingen grce une thse intitule ber die Raumwahrnehmungen des Tastsinnes (Localisation des sensations du got). Revenu Paris, il sintresse la psychologie et en particulier au stress psychologique des tudiants. En 1898, il publie avec Alfred BINET un ouvrage intitul La fatigue intellectuelle, dans lequel ils prsentent de nombreuses donnes physiologiques rythmes cardiaques et respiratoires, pression sanguine, temprature corporelle, sensibilit cutane mesures lors dactivits intellectuelles et qui fut longtemps cit en rfrence. Convaincu que la psychologie repose sur la physiologie et finalement sur la physique et la chimie molculaire, il poursuit sa formation comme assistant la Sorbonne dans le laboratoire du professeur Albert DASTRE qui a t un lve de Claude BERNARD et est un fervent dfenseur de lapplication des tudes physico-chimiques des problmes

de physiologie. Il va se former ltude quantitative des ractions enzymatiques et de la catalyse dans le laboratoire de Wilhelm OSWALD Leipzig. Le 20 fvrier 1903, il obtient le titre de docteur s Sciences grce une thse intitule Lois gnrales de laction des diastases dans laquelle il rduit lactivit des agents biologiques aux lois fondamentales de la chimie-physique et introduit une quation fondamentale rgissant la cintique des ractions enzymatiques. En 1907, HENRI devient matre de confrence la Sorbonne o il enseigne la chimie physique.
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Bien quil continue sintresser la matire dans son tat collodal, cest cette poque quil commence sintresser aux interactions entre les radiations lectromagntiques et la matire biologique, et la photochimie, un sujet de recherche quil poursuivra dans la suite de sa carrire et qui lui vaudra une nouvelle reconnaissance internationale. Avec Ren WURMSER, il montre que les molcules passent, sous laction de la lumire, dans un tat activ qui est pralable la raction elle-mme. Cette notion importante dtat activ sous linfluence de la lumire aura dimportantes applications dans ltude de la photosynthse. La premire guerre mondiale va cependant interrompre ses travaux. Durant cette priode, il est envoy en Russie o, au titre dattach franais, il est charg dorganiser lindustrie chimique en vue de la dfense nationale. Aprs la rvolution dOctobre, il obtient une chaire de physiologie lUniversit CHONIAWSKI de Moscou. Il y poursuit ses travaux de photochimie en analysant et publiant les rsultats quil avait obtenus Paris. En 1920, son retour de Russie, il est nomm professeur de chimie physique lUniversit de Zrich o il a pour collgue Hermann WEYL, Erwin SCHRDINGER et Peter DEBYE. Cest pendant son sjour Zrich quil fait une importante dcouverte dans le domaine de la physique molculaire en tudiant la largeur des bandes dabsorption de molcules gazeuses, la pr-dissociation des molcules dans leur tat activ. Il publie ce concept fondamental de la photochimie dans une monographie intitule Structures des molcules (1925). En 1927, il publie avec Rn WURMSER une autre contribution importante pour la photochimie. Ils comparent le nombre de quanta absorbs au nombre de molcules qui ragissent et concluent que le principe dquivalence photochimique tabli par Einstein (selon lequel le nombre de molcules ragissant avec la lumire est gal au nombre de quanta absorbs) nest pas respect car dans la majorit des cas, les phnomnes mesurs comprennent plusieurs ractions lmentaires successives et le rendement quantique est diffrent de un. En 1930, il quitte Zrich et sinstalle proximit de Marseille o il doit prendre la direction dun institut de ptrochimie. Ce projet ne verra jamais le jour et en 1931, Victor HENRI est nomm titulaire de la chaire de chimie physique lUniversit de Lige. A Lige, il poursuit ses tudes de photochimie, dveloppant notamment la spectroscopie des molcules polyatomiques et commence sintresser lactivation thermique. Il utilise galement la spectroscopie pour caractriser la structure dhormones et de vitamines et pour doser ces molcules. Il retrouve Peter DEBYE, invit Lige pour un an en tant que titulaire de la chaire FRANCQUI. En 1933, HENRI publie son cours donn lUniversit de Lige sous le titre Physique molculaire : Matire et nergie. La guerre interrompt une seconde fois ses recherches. En 1940, il rentre en France pour se mettre au service de la dfense nationale et rejoint LANGEVIN au Centre national de recherche scientifique applique franaise. Il meurt cette anne-l La Rochelle des suites dune congestion pulmonaire.
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Rfrences C. DEBRU - 1991 - Victor HENRI, dans Dictionary of Scientific Biography Supplement II, vol. 1 : 410-413 C. DEBRU - La photosynthse : Victor HENRI, Otto WARBURG, Rn WURMSER J. DUCHESNE - 1967 - dans Liber Memorialis de lUniversit de Lige, tome II : 471-478
3.1.5. La notion de site actif et le mcanisme daction des enzymes

Les progrs raliss au dbut du XXe sicle dans la connaissance de la nature et de la structure des protines, ont progressivement conduit au dveloppement de la notion de site actif. La premire reprsentation dun substrat se fixant la surface dun enzyme a t propose par E.F. ARMSTRONG en 1904 pour expliquer la strospcificit des enzymes (figure 3.4). Aujourdhui, on dfinit le site actif comme la rgion particulire de lenzyme au sein de laquelle se droule la raction enzymatique proprement dite. De manire gnrale, le site actif a une taille restreinte par rapport la taille globale de la protine, il est dfini dans les trois dimensions et est souvent localis dans une crevasse caractrise par un micro-environnement spcifique. Cest larrangement des atomes constituant le site actif qui va dterminer la spcificit daction de lenzyme et la slection prcise du substrat, la molcul de substrat devant sadapter la forme et aux proprits de fixation de ce site actif.
OH H RO H O
H HO H
b
OH H OH H H
a - Reproduction de la premire reprsentation schmatique dun substrat dans son site actif due E.F. ARMSTRONG (1904) A cette poque, le glucose tait reprsent sous la forme dun cycle 5 pices et la structure de lenzyme dont la nature ntait pas tablie tait matrialise par un trait gras. Malgr sa simplicit, cette reprsentation mettait dj en vidence le contact intime existant entre lenzyme et le substrat. b - Reprsentation moderne du site actif de la chymotrypsine (code pdb : 1GG6) occup par un inhibiteur laide du logiciel VMD (HUMPHREY, DALKE et SCHULTEN, 1996) Lenzyme est reprsent sous la forme dune surface. Les parties ombres indiquent les rsidus essentiels directement impliqus dans la catalyse chimique ou dans la fixation de linhibiteur. Linhibiteur est reprsent de manire simplifie (Image prpare par H. VALADIE).
3.4 - Reprsentation du site actif des enzymes La reprsentation de la structure du site actif des enzymes a volu avec les progrs raliss la fois dans la dtermination exprimentale de la structure des protines et dans le dveloppement des logiciels de visualisation de ces structures.
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Les progrs dans ltude des mcanismes enzymatiques ont conduit au dveloppement dun second modle dcrivant linteraction entre le substrat et lenzyme. Le premier, illustr dans la figure 3.2, a t introduit par FISCHER et repose sur lexistence dune complmentarit entre le substrat et le site actif de lenzyme qui peut tre compare celle existant entre une cl et une serrure. Le second modle, propos ultrieurement par KOSHLAND, implique un changement de conformation du site actif de lenzyme lors de la fixation du substrat. Ce modle est connu sous le nom dajustement induit (induced-fit) et est illustr dans la figure 3.5. Ce modle implique que lenzyme slectionne spcifiquement son substrat, non sur la base dune complmentarit statique entre lenzyme et le substrat, mais en agissant comme des pinces qui se renferment pour piger le substrat. Lenzyme devient actif uniquement dans sa forme ferme impliquant une rgulation de lactivit par la fixation du substrat.
Site actif Groupe catalytique 3
+
Enzyme Substrat (A) Groupe catalytique 1 Groupe catalytique 2 Complexe (EA)
Enzyme (E)
3.5 - Illustration du mcanisme dajustement induit propos par KOSHLAND
3.2. DESCRIPTION CINTIQUE DES RACTIONS ENZYMATIQUES DANS DES CONDITIONS DQUILIBRE
3.2.1. La premire quation cintique : lquation de HENRI
Comme nous lavons vu ci-dessus, HENRI a driv la premire quation de vitesse reprsentant correctement le mcanisme daction des enzymes. Le principe fondamental du fonctionnement des enzymes, tel quHENRI lenvisage, est la formation dun complexe enzyme-substrat, EA, en quilibre avec le substrat libre. Ce mcanisme implique une premire tape de fixation du substrat sur lenzyme et une seconde tape de conversion du substrat en produit, qui se droule au sein du complexe enzyme-substrat (EA). La seconde tape se termine par la libration du produit. Si nous considrons la cas simple o [ P ]0 = 0 et la vitesse initiale de la raction est mesure ( 4.1.2), ce mcanisme est reprsent par le schma suivant :
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E+A
Ka
EA
k2
E+P
[3.3]
o A et P reprsentent respectivement le substrat et le produit, E lenzyme libre, EA le complexe enzyme-substrat, et o Ka est la constante de dissociation du complexe enzyme-substrat EA : [ E ][ A ] Ka = [3.4] [ EA ] Comme nous lavons dit, HENRI suppose lexistence dun quilibre rapide pour la formation du complexe EA partir de lenzyme libre et du substrat libre et cest partir de ce modle quil a obtenu lquation de vitesse prsente dans lquation [3.1]. Il est utile de se rappeler quen enzymologie, la constante dquilibre est gnralement dfinie dans le sens de la dissociation du complexe, ce qui conduit une constante dquilibre Ka exprime en units apparentes de concentration. Dans le cas de ractions enzymatiques complexes, cette convention simplifie considrablement lquation de vitesse par rapport lutilisation de constantes dassociation. La formulation mathmatique dun mcanisme enzymatique et lcriture de lquation de vitesse correspondante sont gnralement des tapes difficiles raliser par les tudiants. A cette difficult sajoute le fait que le problme peut tre rsolu de diverses manires et que souvent les ouvrages de rfrence se limitent au traitement dtaill des cas simples, ne prsentant que lquation finale de vitesse pour les mcanismes plus complexes. Nous prsentons ici une mthode gnrale et simple pour lcriture des quations de vitesse qui repose sur lapplication successive de trois rgles. Nous lappliquerons dabord au cas simple dune raction un seul substrat dans des conditions irrversibles (quation [3.3]), mais nous appliquerons systmatiquement cette mthode dans la suite de ce livre pour driver les quations de vitesse de ractions plus complexes. Une autre mthode, mieux adapte au traitement de systmes complexes, sera prsente dans le chapitre 6. La premire rgle consiste appliquer la loi daction de masses pour dfinir la vitesse de formation du produit P : d[ P ] [3.5] v = = k 2 [ EA ] dt La mesure de la concentration instantane du complexe [ EA ] est gnralement difficile, souvent peu commode, et voire mme impossible. En utilisant lquation [3.4] qui peut scrire de la manire suivante : [ E ][ A ] [ EA ] = [3.6] Ka nous obtenons :
v = k2
[ E ][ A ] Ka
[3.7]
Puisque la concentration instantane denzyme [ E ] est aussi difficile mesurer que celle du complexe EA, il serait prfrable dexprimer la vitesse en terme de
69
concentration initiale denzyme [ E ]0 qui constitue gnralement un paramtre contrlable dans une exprience de cintique enzymatique. La deuxime rgle consiste utiliser lquation de conservation de lenzyme pour exprimer lquation [3.7] en fonction de la concentration initiale denzyme et non de concentration denzyme libre. Dans le mcanisme de lquation [3.3], lenzyme existe soit sous forme libre, soit sous forme complexe avec le substrat EA et nous pouvons donc crire :
[ E ]0 = [ E ] + [ EA ]
[3.8]
En combinant cette quation avec lquation [3.6], nous obtenons : [ E ][ A ] [ A] [ E ]0 = [ E ] + = [ E ]( 1 + ) [3.9] Ka Ka qui fournit une expression de la concentration denzyme libre partir de la concentration initiale denzyme : [ E ]0 [3.10] [E] = D o D = 1 + [ A ] Ka reprsente le dnominateur de lquation [3.10]. Une fois cette expression obtenue, nous pouvons lintroduire dans lquation [3.7] :
v = k2
([ E ]0 D )[ A ]
Ka
[3.11]
A ce stade, la vitesse de la raction nest dfinie que si la concentration instantane de substrat libre, [ A ] , peut tre mesure, ce qui nous amne introduire la troisime rgle. La troisime rgle consiste imposer une contrainte sur le systme permettant de connatre la concentration instantane de substrat libre partir de la concentration initiale de substrat. En gnral, les enzymes sont tudis dans des conditions o la concentration denzyme [ E ]0 est beaucoup plus faible que la concentration de substrat [ A ]0 . Ainsi, lquation de conservation du substrat scrit comme suit :
[ A ]0 = [ A ] + [ EA ]
[3.12]
o nous pouvons ngliger [ EA ] vis--vis de [ A ] . En se plaant dans des conditions de vitesse initiale, nous pouvons donc assimiler la concentration instantane de substrat la concentration initiale : [ A ]0 = [ A ] . Cette situation est valable pour la majorit des tudes ralises in vitro, mais il est important de noter quin vivo la situation o [ E ]0 [ A ] est trs courante. Dans ce cas, [ EA ] ne peut plus tre nglig dans lquation [3.12], et lquation de vitesse prend une forme plus complexe (voir ci-dessous). En appliquant successivement ces trois rgles, nous obtenons lquation de vitesse suivante : [ A ]0 Ka [ E ]0 [ A ]0 v = k2 = k 2 [ E ]0 [3.13] D Ka 1 + ( [ A ]0 Ka )
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Le terme de droite de lquation [3.13] est identique lquation de HENRI (quation [3.2]) pour une raction enzymatique simple nimpliquant pas dinhibition par le produit o les paramtres de HENRI sont assimils ceux de lquation [3.13] : k = k 2 Ka [ E ]0 et m = 1 Ka . En remplaant ces termes dans lquation [3.2], nous pouvons donc rcrire lquation de HENRI de la manire suivante :
v =
k 2 [ E ]0 ( [ A ]0 Ka ) 1 + ( [ A ]0 Ka )
[3.14]
Dans la majorit des ouvrages traitant de la cintique enzymatique, lquation [3.14] est obtenue plus simplement en extrayant une expression de [ E A] en fonction de la concentration initiale denzyme partir lquation de conservation de lenzyme. Nanmoins le passage par lcriture dune expression de [ E ], comme nous lavons fait dans lquation [3.10], permet une application plus gnrale puisque la forme libre de lenzyme est toujours prsente dans le mcanisme ractionnel quelle que soit la complexit de ce mcanisme. Ainsi, la mthode de drivation de lquation de vitesse prsente ici, peut sembler complexe mais comme nous le verrons dans les chapitres suivants, son utilisation simplifiera la procdure de drivation pour des mcanismes enzymatiques plus complexes.
3.2.2. Le traitement de MICHAELIS et MENTEN

MICHAELIS et MENTEN sintressaient galement la raction dhydrolyse du saccharose catalyse par linvertase. En contrlant le pH de la solution laide dun tampon actate, et en laissant voluer la raction de mutarotation du produit jusqu lquilibre, MICHAELIS et MENTEN (1913) ont valid les rsultats obtenus par HENRI. Ils ont ralis leurs mesures dans des conditions de vitesse initiale vitant ainsi un certain nombre de complications comme le droulement de la raction inverse, linhibition par le produit ou la dnaturation progressive de lenzyme. Sur la base de ces rsultats, MICHAELIS et MENTEN ont propos un mcanisme similaire celui de HENRI et ont driv lquation de vitesse correspondante. k [ E ]0 [ A ] v = 2 [3.15] Ka + [ A ] o Ka est la constante de dissociation du complexe enzyme-substrat et k2 la constante de vitesse pour la conversion du complexe enzyme-substrat en enzyme libre et en produit. La drivation de cette quation de vitesse reposait sur les mmes hypothses que celles faites par HENRI, nommment que le premier quilibre entre lenzyme et le substrat est tabli rapidement et que la concentration de substrat est largement suprieure la concentration denzyme. Bien que, dans sa thse de doctorat, Victor HENRI voque galement lutilit davoir recours la mesure de vitesses initiales, MICHAELIS et MENTEN sont galement lorigine de lutilisation systmatique de ce type de mesure dans la cintique enzymatique.
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Dans leur publication, MICHAELIS et MENTEN reconnaissaient limportance des travaux de HENRI : Les expriences de HENRI sont particulirement importantes, parce quil est parvenu une conception rationnelle de la nature de laction enzymatique qui a permis une formulation mathmatique de lvolution de laction dun enzyme qui rende compte des observations sur de nombreux points. Lquation [3.15] drive par MICHAELIS et MENTEN est une simple variante de lquation de vitesse [3.14] propose par HENRI (1903) et peut tre obtenue directement partir de lquation de HENRI en multipliant le numrateur et le dnominateur par Ka : [ A] k 2 [ E ]0 Ka Ka k [ E ]0 [ A ] [3.16] = 2 v = [ A] Ka + [ A ] Ka 1 + Ka Lquation [3.15] est parfois appele lquation de HENRI, MICHAELIS et MENTEN mais parce que les expriences de MICHAELIS et MENTEN ont t ralises dans des conditions mieux dfinies et mieux contrles, ces chercheurs sont gnralement reconnus comme les fondateurs de lenzymologie moderne, et lquation de vitesse dune raction enzymatique simple est gnralement connue comme lquation de MICHAELIS et MENTEN. En plus du ct historique, lutilisation gnralise de la forme de MICHAELIS et MENTEN, tient dans la simplicit de son criture et de son analyse. Comme nous le verrons dans le 3.5, elle peut facilement tre crite sous diffrentes formes linaires.
Maud M ENT EN (1879-1960) 2

Maud MENTEN est ne Port Lambton dans lOntario et est devenue en 1911 la premire femme canadienne recevoir un doctorat en mdecine. Son travail avec MICHAELIS sur linvertase ntait quun intermde dans sa carrire essentiellement dvolue la pathologie et aux aspects mdicaux de la biochimie et de la physiologie. Elle a pass la majeure partie de sa carrire lUniversit de Pittsburgh, mais elle est retourne au Canada aprs sa retraire.
2. Pour la biographie de Leonor MICHAELIS, voir chapitre 8.
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3.3. DESCRIPTION CINTIQUE DES RACTIONS ENZYMATIQUES DANS DES CONDITIONS DTAT STATIONNAIRE
3.3.1. Les premires utilisations de la notion dtat stationnaire
Au moment o MICHAELIS et MENTEN publiaient leurs rsultats sur linvertase, VAN SLYKE et CULLEN (1914) obtinrent des rsultats similaires avec lurase et proposrent un mcanisme identique, except quils supposrent une premire tape irrversible :
E+A
k1
EA
k2
E+P
[3.17]
Dans ce cas, la concentration du complexe, [ E A], ne peut tre obtenue partir de la constante d'quilibre mais peut tre obtenue uniquement partir de lquation diffrentielle dcrivant la variation de la concentration du complexe EA en fonction du temps :
d [ EA ] = k1 ([ E ]0 [ EA ])[ A ] k 2 [ EA ] dt
[3.18]
En faisant lhypothse que la concentration de lintermdiaire est constante, c'est-dire que d [ EA ] dt = 0 , VAN SLIKE et CULLEN ont obtenu lquation suivante :
k1 ([ E ]0 [ EA ] )[ A ] k 2 [ EA ] = 0
[3.19]
[ EA ] =
k1 [ E ]0 [ A ] k1 [ A ] + k 2
[3.20]
En substituant lquation [3.20] dans lquation de vitesse v = k 2 [ EA ] , ils ont finalement obtenu lquation de vitesse suivante : k k [ E ]0 [ A ] k [ E ]0 [ A ] v = k 2 [ EA ] = 1 2 = 2 [3.21] k 2 + k1 [ A ] (k 2 k1 ) + [ A ] La seule diffrence entre cette quation et lquation [3.15], rside dans le remplacement de Ka par le rapport k2/k1 (la constante Ka est gale au rapport k1/k1), une situation qui est en pratique indiscernable. A la mme poque o ont lieu ces dveloppements dans la comprhension de la cintique enzymatique, LANGMUIR (1916, 1918) dveloppe une formulation identique pour expliquer ladsorption de gaz sur des solides. Son traitement est beaucoup plus gnral, mais le cas simple de ladsorption dune molcule sur une surface correspond exactement au type de fixation propos par HENRI et par MICHAELIS et MENTEN. LANGMUIR reconnat dailleurs la similarit entre les surfaces solides et les enzymes, mais il imagine que la surface entire de lenzyme est active , par opposition la surface limite qui correspond au site actif.
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HITCHCOCK (1936) souligne galement la similarit entre les quations pour la fixation de ligands sur des surfaces solides et sur des protines. Cette comparaison est complte par celle de LINEWEAVER et BURK (1934), qui tendent les ides de HITCHCOCK aux processus catalytiques.
3.3.2. Le traitement de BRIGGS et HALDANE

Comme nous lavons vu, la formulation de HENRI et celle de MICHAELIS et MENTEN conduisent une forme identique de lquation de vitesse. Dans ces deux cas, le fait de traiter la premire tape de la raction enzymatique comme un quilibre impose des hypothses injustifies sur la dtermination des constantes de vitesse. Il en va de mme pour le mcanisme propos par VAN SLYKE et CULLEN qui repose sur lhypothse de deux tapes irrversibles. B RIGGS et HALDANE (1925) ont propos un mcanisme plus gnral qui se rduit au mcanisme de HENRI, MICHAELIS et MENTEN dans des cas particuliers. Le modle utilis par BRIGGS et HALDANE est le suivant : E+P [3.22] k1 o le premier quilibre est dcrit par des constantes individuelles de vitesse pour les ractions directe et inverse. Dans ce cas, la variation de la concentration du complexe EA est donne par la somme des vitesses de sa formation et de sa dissociation : d [ EA ] [3.23] = k1 ([ E ]0 [ EA ])[ A ] k 1 [ EA ] k 2 [ EA ] dt E+A EA BRIGGS et HALDANE ont argument quun tat stationnaire peut tre atteint pour lequel la concentration de lintermdiaire est constante, c'est--dire d [ EA ] dt = 0 . Pour obtenir lquation de vitesse, v = d [ P ] dt , les trois rgles dcrites pour le cas dquilibre peuvent tre adaptes de la manire suivante. La vitesse nette de la raction est obtenue en appliquant la loi daction de masses ltape de conversion de EA en produit : k1 k2
v = k 2 [ EA ]
Lquation de conservation de lenzyme reste la mme que lquation [3.8] :
[3.24] [3.25
[ E ]0 = [ E ] + [ EA ]
mais pour obtenir une expression de la concentration denzyme libre en fonction de la concentration initiale denzyme, B RIGGS et HALDANE appliquent au complexe EA le principe dtat stationnaire dvelopp par BODENSTEIN : d [ EA ] d [ EA ] [3.26] = = 0 dt dt
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A partir de lquation [3.23] qui exprime la variation de la concentration du complexe EA en fonction du temps, lhypothse dun tat stationnaire impose que : d [ EA ] [3.27] = k 2 [ E ][ A ] ( k 1 + k 2 )[ EA ] = 0 dt do nous obtenons : et
k1 [ E ][ A ] = ( k 1 + k 2 )[ EA ]
[ EA ] = k1 [ E ][ A ] ( k 1 + k 2 )
[3.28] [3.29]
En introduisant lquation [3.29] dans lquation de conservation [3.25], on obtient lquation suivante :
[ E ]0 = [ E ] +
k1 k1 [ E ][ A ] = [ E ] 1 + [ A ] k 1 + k 2 k 1 + k 2
[3.30]
Cette quation relie la concentration denzyme libre la concentration initiale denzyme et peut scrire sous une mme forme que lquation [3.10] : [ E ]0 [3.31] [E] = D bien que lexpression de D soit diffrente :
D = 1+
k1 [ A] k 1 + k 2
[3.32]
Si lhypothse [ A ]0 >> [ E ]0 est respecte, lquation de conservation du substrat se simplifie comme prcdemment et nous pouvons crire [ A ] [ A ]0 .
Concentration
Etat stationnaire d[EA] = 0 dt A
EA
E Temps
3.6 - Variations de [ A ], [ EA ], [ E ] et [ P ] pour une raction enzymatique ltat stationnaire
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A partir de ces trois rgles, nous pouvons crire lquation de vitesse : k1 [ E ]0 v = k2 [ A ]0 k 1 + k 2 D
[3.33]
Cette quation peut tre simplifie en multipliant le numrateur et le dnominateur par ( k 1 + k 2 ) k1 , ce qui permet dobtenir lquation suivante : k 2 [ E ]0 [ A ]0 v = [3.34] k 1 + k 2 + [ A ]0 k1
3.3.3. Lquation de MICHAELIS et MENTEN

Aujourdhui, les noms de MICHAELIS et de MENTEN sont couramment associs une forme gnrale de lquation de vitesse qui utilise indiffremment lhypothse de ltat stationnaire ou lhypothse de lquilibre. Cette forme gnrale de lquation de vitesse, dnomme quation de MICHAELIS et MENTEN, est donne par lquation suivante : k [ E ]0 [ A ] v = 0 [3.35] Km + [ A ] dans laquelle la constante k2 est remplace par k0 et le rapport (k1+k2)/k1 de lquation [3.34] est remplac par Km, la constante de MICHAELIS. Lquation [3.35] est plus gnrale que lquation [3.15] et sapplique des mcanismes plus complexes que le mcanisme simple considr par MICHAELIS et MENTEN. Dans de nombreux mcanismes complexes, lquation [3.35] reste valable, mais la constante k0 ne fait pas obligatoirement rfrence la constante de vitesse dune tape individuelle du mcanisme et la constante Km ne reste pas obligatoirement quivalente la constante de dissociation du complexe EA ou au rapport (k1+k2)/k1. La constante k0 conserve nanmoins les proprits dune constante de vitesse de premier ordre et dfinit la capacit du complexe enzyme-substrat former le produit de la raction. Pour cette raison, la constante k2 de lquation [3.34] peut tre remplace par k0. Elle est aussi connue comme la constante catalytique et est souvent symbolise par kcat plutt que par k0. Alternativement, elle reprsente le nombre de cycles catalytiques (turnover), faisant allusion au fait quelle correspond linverse dun temps et quelle dfinit le nombre de cycles que lenzyme ralise par unit de temps. Au dbut de ltude des mcanismes enzymatiques, la vritable molarit de lenzyme, c'est--dire [ E ]0 , tait gnralement inconnue, ce qui compliquait lutilisation de lquation de MICHAELIS et MENTEN dans la forme illustre par lquation [3.35]. Cette difficult tait gnralement contourne en combinant k0 et [ E ]0 en une constante unique V = k0 [ E ]0 , appele la vitesse limite qui, du fait de sa dpendance la concentration de lenzyme, ne reprsente pas une proprit fondamentale de lenzyme.
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Ainsi, lquation de MICHAELIS et MENTEN est couramment crite comme suit :
v =
V [ A] Km + [ A ]
[3.36]
Afin dviter toute confusion avec la vitesse de la raction, v, la vitesse limite V est habituellement dnomme la vitesse maximum, et est parfois crite Vmax ou Vm. Ces termes et symboles sont drivs de la dnomination ancienne (et encore souvent utilise, bien que son utilisation soit dcourage par le Comit de Nomenclature IUBMB (IUB, 1982) parce quelle ne correspond pas un maximum au sens mathmatique du terme, mais une limite). Lutilisation du symbole Vm est particulirement dconseille parce quil peut, de manire errone, suggrer une correspondance avec lindice m de la constante K m . En ralit, lindice m de la constante K m est pour MICHAELIS, un hommage qui tait plus clair avec lancien usage du terme KM. Dans certains cas, il est utile de normaliser la vitesse v par rapport la vitesse limite V. Lquation de HENRI (quation [3.14]) scrit alors de la manire suivante : v = [ A ]0 1 + [ A ]0 [3.37] V Ka Ka et lquation de MICHAELIS et MENTEN ((quations [3.15] et [3.35]) scrit : [ A] v = V Km + [ A ]
[3.38]
3.3.4. Analyse de la courbe dfinie par lquation de MICHAELIS et MENTEN

La courbe dfinie par lquation [3.36] et prsente dans la figure 3.7 a la forme dune hyperbole rectangulaire passant par lorigine et ayant les asymptotes suivantes : [ A ] = K m et v = V. En fonction de la concentration de substrat, trois situations exprimentales peuvent tre distingues qui vont dfinir trois rgions dans le graphique de v en fonction de [ A ] . Situation o [ A ] << Km Pour de faibles valeurs de [ A ] , largement infrieures Km , le dnominateur du terme de droite des quations [3.35] et [3.36] est domin par Km ; en dautres termes, [ A ] est ngligeable par rapport Km et la vitesse v est directement proportionnelle [ A ] : k v = 0 [ E ]0 [ A ] = V [ A ] [3.39] Km Km c'est--dire que la vitesse de la raction est approximativement dordre global deux, mais dordre un par rapport au substrat. Il est instructif de raliser que k0 Km ne reprsente pas uniquement le rsultat de la division de k0 par K m mais que ce rapport correspond la constante de vitesse de second ordre pour la raction E + P mesure pour de faibles concentrations de substrat. Ce E+A
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paramtre est appel la constante de spcificit pour des raisons qui seront dveloppes dans la section [3.5], et peut tre symbolise par kA, o lindice indique quel substrat il fait rfrence.
v = k A [ E ]0 [ A ]
[3.40]
Le paramtre Km V , linverse du paramtre V Km , a les dimensions du temps et peut tre appel le temps spcifique de la raction. Ce temps correspond au temps qui serait ncessaire lenzyme pour consommer tout le substrat sil fonctionnait en permanence dans des conditions de premier ordre et maintenait indfiniment la mme vitesse (CORNISH-BOWDEN, 1987). Bien que cette dfinition soit particulirement abstraite pour les conditions exprimentales habituelles, elle est trs utile pour dfinir lactivit dans la cellule o de nombreux enzymes oprent dans des conditions de premier ordre et maintiennent la mme vitesse pendant une longue priode (parce que leur substrat est continuellement gnr) ; dans ces circonstances, le temps spcifique correspond au temps ncessaire pour consommer tout le substrat.
v V
0,83 V 0,75 V 0,67 V 0,5 V
Pente initiale = V/Km
1 Km
2 Km
3 Km
4 Km
5 Km
[A]
3.7 - Dpendance de la vitesse initiale v vis--vis de la concentration [A] pour une raction obissant lquation de MICHAELIS et MENTEN Puisquaucun graphique de ce type na t utilis ou mme voqu par MICHAELIS et MENTEN, il est inappropri de le nommer le graphique de MICHAELIS et MENTEN . Ils ont en ralit, utilis un graphique de v en fonction de log [ A ] et ont utilis le fait quil a une pente maximale gale 0,577 V (c'est--dire 0,25 V ln 10) comme moyen destimer la valeur de V et, partir de celle-ci, obtenir la valeur de Km.
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Situation o [ A ] = Km Si [ A ] est gal Km , lquation [3.36] se simplifie et donne : V [ A] 1 = V v = 2[ A ] 2
[3.41]
Cette quation fournit une dfinition oprationnelle de Km , qui sapplique quel que soit le mcanisme cintique auquel lquation de MICHAELIS et MENTEN est applique ; nommment, Km reprsente la concentration de substrat pour laquelle la vitesse est gale la moiti de la vitesse limite. Situation o [ A ] >> Km Pour des valeurs leves de [ A ] , largement suprieures celle de Km , le dnominateur du terme de droite des quations [3.35] et [3.36] est domin par [ A ] , c'est-dire que Km est ngligeable par rapport [ A ] , et que lquation se simplifie :
v = k0 [ E ]0 = V
[3.42]
Dans ce cas, la raction est approximativement dordre zro en [ A ] car lenzyme est satur en substrat. Ce rsultat est lorigine de la dnomination de vitesse limite pour V.
3.3.5. Autres formes de lquation de MICHAELIS et MENTEN

Comme nous venons de le voir, trois paramtres peuvent tre utiliss pour caractriser lquation de MICHAELIS et MENTEN si la concentration denzyme est connue : la constante catalytique k0, la constante de spcificit kA et la constante de MICHAELIS Km. Puisquau minimum, deux de ces paramtres sont ncessaires pour dcrire le systme et que ces trois paramtres sont relis entre eux par lidentit k A k0 Km , lquation de MICHAELIS et MENTEN peut galement scrire en fonction des paramtres kA et k0 : k k [ E ]0 [ A ] v = 0 A [3.43] k0 + k A [ A ] ou en fonction des paramtres kA et Km :
v =
k A [ E ]0 [ A ] 1 + ( [ A ] Km )
[3.44]
La forme courante de lquation de MICHAELIS et MENTEN, crite en fonction de k0 et de K m , doit sa popularit plus lhistoire quau caractre fondamental de ces paramtres. Lutilisation de lquation [3.43] simplifierait en effet la discussion de nombreux aspects de ltude des enzymes, tels que la distinction entre les diffrents types dinhibition ou lestimation des paramtres par des mthodes graphiques ou statistiques. Dans ce livre, nous suivrons la pratique courante et continuerons dcrire lquation de MICHAELIS et MENTEN sous la forme de lquation [3.35]. Il
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est toutefois bon de se rappeler, quelle que soit la manire dont lquation est crite, que les paramtres fondamentaux de lquation de MICHAELIS et MENTEN sont k0 et kA, et que de nombreux aspects du comportement des enzymes sont plus aisment apprhends en considrant les effets sur lun ou lautre de ces deux paramtres. En consquence, il est prfrable de considrer kA comme un paramtre fondamental plutt que comme un paramtre driv et inversement de considrer Km comme le rapport k0 k A .
3.3.6. Lquilibre comme un cas particulier de ltat stationnaire

Lquation [3.35] indique que la constante K m est une combinaison de constantes de vitesse. Il est intressant de noter que, si k1 >> k2, c'est--dire si la raction chimique est lente par comparaison avec la dissociation du complexe EA, k2 est ngligeable vis--vis de k1 et nous obtenons : k Km = 1 = Ka [3.45] k1 Cette simplification suggre que la situation dquilibre est simplement un cas extrme de ltat stationnaire et il est facile de se convaincre que le traitement propos par BRIGGS et HALDANE est plus gnral que celui propos par MICHAELIS et MENTEN. Un grand nombre douvrages de rfrence ont suggrs que le traitement de BRIGGS-HALDANE est le seul valable , et quil a remplac celui de MICHAELIS et MENTEN plus naf . En ralit, il existe deux objections srieuses au fait que lquation [3.34] reprsente une amlioration par rapport aux quations [3.14] et [3.15] et puisse tre considre comme une forme gnrale de lquation de vitesse. Premirement, lquation [3.34] implique que la raction soit irrversible, alors que toutes les ractions enzymatiques sont rversibles. Deuximement, lquation [3.34] implique lexistence dun complexe entre lenzyme et le substrat mais pas entre lenzyme et le produit. Le traitement du substrat et du produit est conceptuellement diffrent mais nous reviendrons sur ces points dans le 3.7. En attendant, la meilleure leon tirer de cette analyse est de considrer lquation [3.34] comme la manire la plus approprie dcrire lquation de vitesse pour une raction un substrat. A moins quil ny ait des raisons suffisantes pour suspecter lexistence dun quilibre rapide, un mcanisme enzymatique devrait toujours tre analys sur la base de lhypothse dun tat stationnaire.
3.3.7. Validit et limites de lhypothse de ltat stationnaire

Lobtention de lquation [3.34] repose sur lhypothse de lexistence dun tat stationnaire au cours duquel d [ EA ] dt = 0 . En ralit, lquation [3.23] peut facilement tre intgre si [ A ] est trait comme une constante, et il est instructif de driver lquation de vitesse sans faire lhypothse de ltat stationnaire, parce que cette dmarche permet de tester la validit de cette hypothse.
80
En sparant les deux variables, [ EA ] et t, nous obtenons :
d [ EA ] k [ E ] [ A ] ( k [ A ] + k + k )[ EA ] = dt 1 0 1 2 1
[3.46]
En dpit de son apparence plus complexe, le terme de gauche de cette quation a la mme forme que la plupart des intgrales que nous avons dj rencontres ( 1.1) et peut facilement tre intgr en utilisant la mme mthode. Nous obtenons ainsi lquation suivante :
ln[ k1 [ E ]0 [ A ] ( k1 [ A ] + k 1 + k 2 )[ EA ]] = t +a ( k1 [ A ] + k 1 + k 2 )
[3.47]
Au dbut de la raction, aucun complexe EA nest prsent, c'est--dire que [ EA ] = 0 quand t = 0, et donc nous obtenons une expression pour la constante a :
a =
et donc :
ln( k1 [ E ]0 [ A ]) ( k1 [ A ] + k 1 + k 2 )
[3.48]
k [ E ]0 [ A ] ( k1 [ A ] + k 1 + k 2 )[ EA ] ln 1 = ( k1 [ A ] + k 1 + k 2 )t [3.49] k1 [ E ]0 [ A ]
En prenant lexponentielle de chaque terme de cette quation, nous obtenons :
( k1 [ A ] + k 1 + k 2 )[ EA ] = e ( k 1 [ A ] +k 1 +k 2 ) t k1 [ E ]0 [ A ]
[3.50]
et en rsolvant cette quation pour [ EA ], nous obtenons une expression de la valeur instantane de [ EA ] :
[ EA ] =
k1 [ E ]0 [ A ]( 1 e ( k 1 [ A ] +k 1 +k 2 ) t ) k1 [ A ] + k 1 + k 2
[3.51]
La vitesse est donne par v = k 2 [ EA ] et, en substituant V = k 2 [ E ]0 et Km = ( k 1 + k 2 ) k1 , nous obtenons :
v =
V [ A ]( 1 e ( k 1 [ A ] +k 1 +k 2 ) t ) Km + [ A ]
[3.52]
Pour de grandes valeurs de t, le terme exponentiel approche e , c'est--dire zro, et ainsi lquation [3.52] devient identique lquation [3.36], c'est--dire lquation de MICHAELIS et MENTEN. La valeur de t pour laquelle cette simplification sapplique dpend de la grandeur du terme ( k1 [ A ] + k 1 + k 2 ) : si ce dernier terme est de lordre de 1 000 s1 (une valeur raisonnable dans la pratique), le terme exponentiel prend une valeur infrieure 0,01 pour des valeurs de t suprieures 5 ms. En dautres termes, lquation [3.52] nest plus distinguable de lquation de MICHAELIS et MENTEN aprs seulement quelques millisecondes.
81
Quand nous avons driv lquation [3.52], nous avons trait [ A ] comme une constante, une supposition qui nest pas strictement correcte puisque [ A ] change au cours de la raction. Toutefois, condition que [ A ]0 soit beaucoup plus grand que [ E ]0 , une condition gnralement satisfaite dans les expriences ralises ltat stationnaire, la variation de [ A ] peut tre nglige. LAIDLER (1955) a driv une quation similaire lquation [3.52] comme un cas particulier dun traitement beaucoup plus gnral dans lequel il prend en compte une diminution de [ A ] partir de sa valeur initiale [ A ]0 . Il a obtenu quun tat stationnaire est atteint pour lequel : V ([ A ]0 [ P ]) v = [3.53] Km + [ A ]0 [ P ] qui est similaire lquation [3.36] lexception du remplacement de [ A ] par ([ A ]0 [ P ]) . Il peut sembler contradictoire que nous parlions dun tat stationnaire dans lequel v doit dcrotre lorsque [ P ] augmente, mais cette diminution de v est extrmement lente compare laugmentation rapide de v qui survient lors la phase transitoire, c'est--dire la priode pour laquelle lquation [3.52] doit tre utilise, avant que ltat stationnaire ne soit atteint. Largument de B RIGGS et de HALDANE doit seulement tre lgrement modifi en remplaant lhypothse d [ EA ] dt = 0 par lhypothse que d [ EA ] dt est trs petit : lquation [3.27] ne peut alors plus tre considre comme une exactitude mais plutt comme une bonne approximation. Comme WONG (1975) la fait remarquer, limportant nest pas la grandeur absolue de d [ EA ] dt mais sa grandeur relative vis--vis de k1 [ E ]0 [ A ] .
3.4. UNITS DE LACTIVIT ENZYMATIQUE

Lactivit dun enzyme est obtenue par une mesure de la vitesse de la raction quil catalyse dans des conditions dfinies. Puisque la vitesse de la raction varie avec la concentration denzyme, il est utile de dfinir une grandeur qui soit indpendante de la concentration denzyme utilise. Lactivit spcifique est dfinie comme lactivit de lenzyme rapporte un milligramme denzyme alors que lactivit molculaire est dfinie comme lactivit rapporte une mole denzyme. Cette dernire correspond donc au nombre de molcules de substrat transformes par molcule denzyme et par unit de temps. Le passage de lactivit spcifique lactivit molculaire ncessite de connatre la masse molculaire de lenzyme. Pour des enzymes dont la concentration molaire ne peut tre dtermine, soit parce que lenzyme na pas pu tre purifi, soit parce que sa masse molculaire est inconnue, il est souvent utile de dfinir une unit dactivit catalytique. Diffrents systmes dunits peuvent tre utiliss. Lunit internationale adopte actuellement est le katal mais danciens systmes sont encore utiliss. Dans les premiers temps de ltude des enzymes, il tait courant de dfinir une unit dactivit qui corres-
82
pondait une quantit de substrat transforme par unit de temps et qui pouvait tre diffrente selon lenzyme tudi. En 1961, lUnion Internationale de Biochimie a donn une dfinition standard de lunit dactivit enzymatique. Une unit denzyme reprsente la quantit denzyme qui catalyse la transformation dune micromole de substrat par minute dans des conditions standards. Dans ce cas, la temprature devra tre mentionne et si possible tre de 25oC. Les autres conditions, telles que le pH, la force ionique et la concentration de substrat devraient, si cela est pratiquement possible, tre optimales. Lunit denzyme est aujourdhui abandonne dans les publications scientifiques mais elle est encore parfois utilise par certaines compagnies spcialises dans la production denzyme. Lunit internationale (SI) accepte aujourdhui pour reprsenter lactivit enzymatique est le katal qui est dfini comme la quantit denzyme suffisante pour catalyser la conversion d1 mole de substrat en produit en 1 seconde dans des conditions standards. Un argument gnralement voqu contre lutilisation de cette unit est que 1 katal est une quantit excessivement grande : une activit enzymatique typique dans un extrait cellulaire est de lordre de 1 unit mL1 ou de 20 kat L1. Toutefois, des objections plus svres nont pas empch lutilisation du farad comme unit de capacit bien que ses sous-multiples soient plus couramment utiliss. Similairement, il existe des sous-multiples du katal, tout comme le kat, gal 60 units ou le nkat, gal 0,06 units, qui pourraient tre aisment utiliss au laboratoire.
3.5. MTHODES DANALYSE DES DONNES CINTIQUES

3.5.1. Le graphique de v en fonction de [A]
Quand une srie de vitesses initiales est mesure diffrentes concentrations de substrat, il est souhaitable de reprsenter les rsultats sous une forme graphique, de sorte que les valeurs des paramtres cintiques puissent tre estimes et que la prcision de ces dterminations soit tablie. La manire la plus directe de porter ces donnes en graphique consiste tracer le graphique de v en fonction de [ A ] comme dans la figure 3.7. Comme nous en avons dj discut au 1.2.7, il est vident que la dtermination prcise des paramtres cintiques peut tre obtenue par ajustement paramtrique non-linaire de ce graphe sur lquation de MICHAELIS et MENTEN [3.36]. Nanmoins, dun point de vue didactique, ce graphique nest pas entirement satisfaisant pour diverses raisons : il est difficile de dessiner avec prcision une hyperbole rectangulaire, il est difficile de dterminer la position des asymptotes (en gnral, on est tent de les placer trop prs de la courbe), il est difficile de percevoir les relations qui existent entre diffrentes courbes et il est difficile de dtecter des dviations de la courbe par rapport une courbe thorique.
83
Le graphique de v en fonction de [ A ] est parfois illustr de manire trompeuse dans certains ouvrages de biochimie et mme dans certains ouvrages spcialiss denzymologie. Pour cette raison, les tudiants acquirent une conception errone de la forme de cette courbe et supposent que V peut tre estime partir dun graphique des donnes exprimentales en lassimilant la valeur mesure de v0 la plus leve. Lerreur la plus courante consiste dessiner une courbe qui saplatit trop rapidement et donne une asymptote trop proche de la courbe. En ralit, v0 natteint jamais la valeur limite V pour une concentration finie de substrat A, comme le montre lexamen de lquation [3.36] ; mme quand [ A ] = 10 Km (une concentration suprieure celles habituellement utilises dans la majorit des expriences) la valeur de v0 est toujours infrieure 90% de la valeur de V. Ce point peut tre apprhend plus facilement en examinant une portion plus grande de la courbe dfinie par lquation [3.36] que celle examine dans la figure 3.7 : une telle vue de la courbe est prsente dans la figure 3.8, qui stend dans les deux directions bien au del des valeurs habituelles de [ A ] , allant de zro jusqu plusieurs fois la valeur de K m . Linclusion de valeurs ngatives sans signification physique permet de comprendre la relation qui existe entre cette courbe et les hyperboles tudies en mathmatiques, et montre que la dtermination des valeurs de K m et de V partir de mesures exprimentales revient localiser le point dintersection des deux asymptotes limitant une courbe infinie partir dobservations localises sur un arc court. Lestimation de K m et de V nest donc pas un problme trivial, mais est un problme qui requiert une bonne expertise, et sur lequel nous reviendrons dans le 3.8 et au chapitre 12.
v
v=V
[A] = Km
[A]
3.8 - Dpendance de la vitesse initiale v vis--vis de la concentration de [A] pour une raction qui obit lquation de MICHAELIS et MENTEN La partie de la courbe allant de [ A ] = 0 jusqu 5 Km, c'est--dire la partie ombre de la figure, est la mme que celle prsente dans la figure 3.7, mais la gamme des valeurs prsentes est beaucoup plus tendue et inclut des valeurs physiquement impossibles, afin dillustrer la relation de la courbe avec les deux asymptotes qui se croisent au point ( Km, V).
84
Ces difficults inhrentes lanalyse des donnes exprimentales avaient dj t soulignes par MICHAELIS et MENTEN (1913) qui ont propos comme alternative de porter en graphique v en fonction de log [ A ] (figure 3.9). Cette forme graphique, mis part son ct historique, offre certains intrts. Elle permet galement de mettre en vidence que la vitesse limite nest approche que pour des concentrations de substrat largement suprieures la valeur de Km (figure 3.9a). En particulier, elle est utile pour comparer les proprits de diffrents isoenzymes qui catalysent la mme raction mais avec des valeurs diffrentes des paramtres Km et V, parce quelle permet de visualiser simultanment des rsultats tals sur une large gamme de concentrations de substrat (figure 3.9b). Malgr ces avantages, ce type de graphique nest pas couramment utilis par les enzymologistes et ne sera pas discut plus en dtails ici.
3.5.2. Diffrentes mthodes de transformation linaire

Le graphique en double inverse ou graphique de LINEWEAVER et BURK Depuis LINEWEAVER et BURK (1934), les biochimistes prfrent rcrire lquation de MICHAELIS et MENTEN sous des formes conduisant une reprsentation linaire des rsultats. La manire la plus communment utilise est le graphique en double inverse, obtenu partir de lquation [3.36] en prenant linverse de chacun des cts de lquation : 1 = 1 + Km 1 [3.54] v V V [ A] ou en effectuant la mme opration partir de lquation [3.43] :
[ E ]0 = 1 + 1 1 v k0 k A [ A ]
[3.55]
Cette seconde quation [3.55] accentue la correspondance entre k0 et k A, qui nest pas clairement visible dans lquation de MICHAELIS et MENTEN en raison de lutilisation de V et de K m . Quoi quil en soit, un graphique de 1 v en fonction de 1 [ A ] donne une droite dont la pente vaut 1 k A [ E ]0 ( = Km v ) , lordonne lorigine 1 k0 [ E ]0 ( = 1 v ) et lintersection avec laxe des abscisses vaut k A k0 ( = 1 Km ) . Ce graphique, illustr dans la figure 3.10, est connu sous le nom de graphique de LINEWEAVER et BURK ou sous le nom de graphique en double inverse. Bien quil soit de loin le plus largement utilis en cintique enzymatique, il est peu recommandable, car il donne une mauvaise apprciation des erreurs exprimentales : les erreurs commises sur les petites valeurs de v acquirent une importance dmesure et inversement, les erreurs commises sur les grandes valeurs en v sont fortement minimises. Ce problme peut tre apprci en analysant la taille des barres derreur dans la figure 3.10, qui sont clairement non-symtriques bien quelles soient calcules partir derreurs exprimentales encadrant de manire symtrique les valeurs de v.
85
12 10 8 6 4 2 0
Vitesse limite, V
0,001
0,01
0,1
10
100
1000
[A]/Km
a - Graphique de v en fonction de [ A ]/Km Lutilisation dune chelle logarithmique pour laxe des abscisses montre que la vitesse limite nest approche que pour des concentrations leves de substrat, suprieures 100 Km.
Concentration de glucose (mM)
Activit (% du maximum)
100
0,001
0,01
0,1
10
100
80
Hexokinase : A B C D ("glucokinase")
60
40
20
Gamme normale de concentration de glucose dans les hpatocytes
0 6 5 4 3 2 1
log [Glucose (M)]

b - Dpendance de lactivit de quatre isoenzymes de lhexokinase obtenues partir de foie de rat en fonction de la concentration de glucose Lutilisation dune chelle logarithmique pour laxe des abscisses permet de visualiser sur le mme graphique le comportement disoenzymes dont les proprits sont trs diffrentes. Dessin partir de la figure 6.2 de CRDENAs (1995). 3.9 - Echelles logarithmiques
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DOWD et RIGGS (1965) ont montr que le graphique en double inverse minimisait la mauvaise qualit des donnes, c'est--dire quil minimisait la divergence des points exprimentaux, et ils ont suggr que cette proprit avait contribu le rendre populaire parmi les biochimistes. En principe, les problmes lis lutilisation du graphique en double inverse sont limins en appliquant une pondration adquate sur les donnes, bien que cette solution ne soit pas toujours satisfaisante. En effet, une telle procdure conduit gnralement une droite ajuste qui, visuellement, reprsente mal les donnes. Malgr ces aspects critiquables, aucun reproche ne peut tre formul lencontre de LINEWEAVER et de BURK pour lusage inadquat du graphique en double inverse, puisquils avaient reconnu ses limitations et prconisaient lutilisation dune pondration des donnes. (LINEWEAVER et BURK, 1934 ; LINEWEAVER, BURK et DEMING, 1934.)
1/v
1/v
a - v faibles
0 1/[A]
Pente = Km/V
1/v
1/V 1/Km
0
b - v leves
0 1/[A]
1/[A]
3.10 - Graphique de 1/v en fonction de 1/[A] Il faut noter la variation importante de la taille des barres derreur sur v calcules de manire identique, chacune reprsentant 0,05 V. De nombreux auteurs font rfrence ce graphique comme un graphique en double inverse ou le graphique de LINEWEAVER et BURK . Les deux inserts illustrent comment un choix judicieux des chelles utilises pour les axes peut camoufler un mauvais choix des conditions exprimentales (voir figure 3.12), soit (a) parce que la gamme des valeurs de v est trop basse ou (b) parce quelle est trop leve. Dans chaque insert, les trois points prsents correspondent aux extrmes du graphique principal.
Le graphique de [ A ]/v en fonction de [ A ] ou graphique de HANES Une seconde forme linaire de lquation de MICHAELIS et MENTEN peut tre obtenue en multipliant les quations [3.54] et [3.55] par [ A ] :
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[ A] K = m + 1 [ A] v V V [ E ]0 [ A ] = 1 + 1 [ A] v k A k0
[3.56] [3.57]
Ces deux quations indiquent quun graphique de [ A ] v en fonction de [ A ] est galement une droite dont la pente vaut 1 k0 [ E ]0 ( = 1 V ) , dont lordonne lorigine vaut 1 k A [ E ]0 ( = Km V ) et dont lintersection avec laxe des abscisses vaut k0 k A ( = Km ) (noter que les valeurs de la pente et de lordonne lorigine sont inverses par rapport au graphique en double inverse). Ce graphique, que lon appelle parfois graphique de HANES, est illustr dans la figure 3.11. Sur une large gamme de concentrations de substrat, les erreurs sur [ A ] v refltent fidlement les erreurs sur v, comme il est possible den juger par la taille des barres derreur dans la figure 3.11 ; pour cette raison le graphique de [ A ] v en fonction de [ A ] devrait tre prfr aux autres graphiques linaires.
[A]/v
[A]/v
a - v faibles
0 [A]
Pente = 1/V
[A]/v
Km/V Km
0
b - v leves
0 [A]
[A]
3.11 - Graphique de [A]/v en fonction de [A] Les barres derreur sont gales 0,05 V, comme dans la figure 3.10. Ce graphique est parfois appel le graphique de HANES ou le graphique de WOOLF. Les inserts ont la mme signification que ceux de la figure 3.10.
Le graphique de v en fonction de v/[ A ] ou graphique de EADIE et HOFSTEE Une troisime forme linaire peut tre obtenue en multipliant les deux cts de lquation [3.54] par vV et en rorganisant lquation. v = V Km v [3.58] [ A] Cette quation montre quun graphique de v en fonction de v [ A ] est une droite dont la pente vaut Km , dont lordonne lorigine vaut V et dont lintersection
88
avec laxe des abscisses vaut V Km . Ce graphique est couramment appel graphique de EADIE-HOFSTEE et est illustr dans la figure 3.12. Ce type de reprsentation donne de bons rsultats dans la pratique, bien que la prsence de la grandeur mesure, la vitesse v, dans chacune des coordonnes signifie que les erreurs commises sur la mesure de v provoquent des dviations le long des deux axes.
v V
v
a - v faibles
0 v/[A]
b - v leves
v/[A]
Pente = Km
Les barres d'erreurs se prolongent dans des directions passant par l'origine
V/Km
v/[A]
3.12 - Graphique de v en fonction de v/[A] Les barres derreur sont gales 0,05 V. Ce graphique est quelques fois appel graphique dEADIE-HOFSTEE. Les inserts ont la mme signification que ceux de la figure 3.10, mais dans ce cas, il est impossible de choisir les chelles de manire camoufler un mauvais choix des conditions exprimentales.
Le graphique de v en fonction de v [ A ] a la proprit oppose celle du graphique en double inverse ; plutt que damliorer lapparence de mauvaises donnes, il donne une mauvaise apparence de bonnes donnes. Ainsi, par exemple, ce graphique met en vidence toute dviation par rapport une ligne droite, plus spcialement si les dviations sont spcifiques (DOWD et RIGGS, 1965.) De ce fait, ce type de graphique est utile pour dtecter une dviation par rapport au comportement prvu par lquation de MICHAELIS et MENTEN. De plus, laxe allant de 0 V correspond la gamme entire des vitesses observables (c'est--dire quil couvre toute la gamme de concentrations de substrat, de 0 linfini) et permet de mettre en vidence un mauvais choix de conditions exprimentales qui ne couvrirait quune gamme restreinte de concentrations de substrat. En terme de marketing, lutilisation du graphique dEADIE-HOFSTEE constituerait une erreur, mais pour les chercheurs dsireux de dcouvrir le comportement rel dun enzyme, ce graphique possde des qualits indniables. Dans un premier temps, les trois reprsentations linaires que nous venons de dcrire ont t attribues WOOLF (1932), mais elles navaient pas t publies
89
par lui. Lquation [3.56] a t publie pour la premire fois par HANES (1932), bien quil ne lait accompagne daucune reprsentation graphique des rsultats. Les diffrents graphiques et leur utilisation ont t populariss par les travaux de LINEWEAVER et BURK (1934), EADIE (1942) et HOFSTEE (1952), ce qui explique pourquoi ces noms leurs sont associs. Le graphique linaire direct EISENTHAL et CORNISH-BOWDEN (1974) ont dcrit une mthode assez diffrente de reprsentation graphique de lquation de MICHAELIS et MENTEN, qui est connue sous le nom de graphique linaire direct. Lquation de MICHAELIS et MENTEN peut tre facilement rarrange partir de lquation [3.58], pour exprimer la dpendance de V sur Km. V = v + v Km [3.59] [ A] Si V et K m sont traits comme des variables, et [ A ] et v comme des constantes, cette quation dfinit une droite dont la pente vaut v [ A ] , dont lordonne lorigine vaut v et dont lintersection avec laxe des abscisses vaut [ A ] . Traiter V et Km comme des variables ou traiter v et [ A ] comme des constantes peut a priori sembler pervers, mais une certaine logique ressort de ce traitement. Dune part, une fois que v et [ A ] ont t mesures exprimentalement, elles peuvent tre considres comme des constantes, puisque au cours de lanalyse, leurs valeurs resteront inchanges. Dautre part, avant que les meilleures valeurs de V et de Km naient t dtermines, nimporte quelle valeur peut leur tre attribue et donc, dans ce sens, ces paramtres peuvent tre considrs comme des variables. Pour chaque paire de valeurs de v et de [ A ] , il existe une infinit de paires de valeurs de V et de K m qui satisfont exactement lquation de MICHAELIS et MENTEN. Pour chaque valeur arbitrairement fixe de Km, lquation [3.59] dfinit une valeur correspondante de V. En consquence, la droite trace sur la base de cette quation relie toutes les paires de valeurs de K m et de V qui satisfont exactement une observation. Si une seconde droite est trace pour une seconde observation (c'est--dire pour un couple diffrent de valeurs de [ A ] et de v), elle reliera les paires de valeur de K m et de V qui satisfont exactement cette observation. Cependant, les deux droites ne dfiniront pas les mme paires de valeurs de K m et de V, except au point dintersection. Ce point dintersection dfinit une paire unique de valeurs de Km et de V qui satisfait exactement aux deux observations. Dans un systme idal dans lequel les erreurs exprimentales seraient inexistantes, il serait possible de porter sur un graphique une srie de telles droites, chacune correspondant une seule dtermination exprimentale de v obtenue pour une valeur particulire de [ A ] , et de dterminer un point unique dintersection qui correspondrait aux valeurs de K m et de V. Cette procdure est illustre dans la figure 3.13. Dans la ralit, les observations ne sont jamais exactes, et en
90
consquence, toutes les droites ne se coupent pas prcisment au mme endroit. Un graphique rel ressemble plus probablement celui prsent dans linsert de la figure 3.13. Chaque point dintersection entre deux droites fournit une estimation des valeurs de K m et de V, et pour chaque srie de points exprimentaux, on peut choisir la valeur mdiane comme la meilleure valeur. Dans linsert, la ligne verticale qui indique la meilleure valeur de K m est trace gauche de la moiti des intersections individuelles et droite de lautre moiti ; de faon similaire, la ligne horizontale qui indique la meilleure valeur de V est trace au-dessus de la moiti des intersections individuelles et en dessous de lautre moiti.
V V* V* V
K*m Km
v5 v4 v3 v2 v1
[A]5
[A]4
[A]3
[A]2
[A]1
K*m
Km
3.13 - Graphique linaire direct de V en fonction de Km Chaque droite reprsente une observation et est trace avec une intersection avec laxe des abscisses gale [ A ] et une intersection avec laxe des ordonne gale v. Dans un cas idal (sans erreur exprimentale) prsent dans la partie centrale de la figure, toutes les droites se croisent en un point unique dont les coordonnes correspondent aux valeurs de Km et de V qui reprsentent au mieux les donnes. Dans un cas plus raliste, comme celui prsent dans linsert, les erreurs exprimentales conduisent la dfinition dune famille de points, chacun fournissant une estimation de Km et une estimation de V. La meilleure estimation de ces valeurs peut tre obtenue en prenant les valeurs mdianes des deux sries. Pour plus de dtails se reporter la figure 12.1 dans le 12.3.
Comme il existe trois faons de reprsenter sous forme linaire lquation de MICHAELIS et MENTEN, il existe trois faons de tracer le graphique linaire direct. Celle qui est prsente dans la figure 3.13 est la forme dcrite lorigine, mais une seconde forme est reprsente dans la figure 3.14 dans laquelle les intersections
91
avec les axes valent [ A ] v et 1 v , plutt que [ A ] et v (CORNISH-BOWDEN et EISENTHAL, 1978). Lutilisation de cette forme du graphique peut se justifier dans la pratique, puisque les droites se coupent avec des angles mieux marqus et que les points dintersection sont ainsi mieux dfinis. De plus, comme nous en parlerons dans le 12.3, son utilisation ne ncessite pas lintroduction de rgles particulires tenant compte des points dintersection qui tombent en dehors du premier quadrant, c'est--dire de points qui dfinissent des valeurs ngatives de lun ou de lautre paramtre.
1/V 1/v1 1/V
1/V* 0 0 1/V* K*m /V* Km /V
0 0 K*m /V* [A]1/v1 Km /V

3.14 - Graphique linaire direct modifi prsentant 1 V en fonction de Km V Chaque observation est reprsente sous la forme dune droite qui croisent laxe des abscisses une valeur de [A] /v et laxe des ordonnes une valeur de 1/v. Les erreurs exprimentales gnrent une famille de points dintersection, comme dans la figure 3.13, qui peut tre analyse de la mme manire.
Le graphique linaire direct prsente divers avantages sur les autres mthodes graphiques (fig. 3.13) dcrites dans ce paragraphe, dont la plus apparente est que, dans sa forme originelle, il ne ncessite pas de calcul. Ceci permet de lutiliser trs facilement au laboratoire pendant que lexprience se droule, de sorte que nous pouvons visualiser immdiatement les valeurs probables des paramtres et adapter les conditions de mesure pour permettre une dtermination prcise de ces paramtres. Analyse des expriences de fixation : le graphique de SCATCHARD A ct des ractions enzymatiques, de nombreux processus biologiques reposent sur la fixation dune petite molcule sur une macromolcule ou sur une surface, sans que cette fixation ne soit suivie dune raction chimique. Comme nous allons
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le voir, le phnomne de fixation dun ligand peut tre dcrit par une quation qui a une forme similaire celle de lquation de MICHAELIS et MENTEN, alors que la fixation sur plusieurs sites indpendants peut tre reprsente par une quation qui a la mme forme que lquation cintique pour un mlange denzymes catalysant la mme raction. Bien quun traitement exhaustif de la fixation de ligands ne fasse pas partie des objectifs de cet ouvrage, nous prsentons brivement le traitement de ces systmes parce que les expriences de fixation complmentent souvent les mesures cintiques dans ltude de systmes enzymatiques. La ressemblance entre les quations de fixation et les quations de vitesse des systmes enzymatiques, nous amne galement discuter de lutilisation du graphique de SCATCHARD, notamment en raison de labondance derreurs associes avec lutilisation de ce type de graphique. En pratique, la fixation dun ligand est souvent mesure par dialyse lquilibre, une exprience qui consiste tablir un quilibre travers une membrane semi-permable (permable au ligand mais pas la protine), et mesurer la concentration de ligand de part et dautre de cette membrane. Une fois lquilibre atteint, si nous supposons que la concentration de ligand libre, [ L ]libre , est identique de chaque ct de la membrane et quelle peut tre mesure directement dans le compartiment qui ne contient pas de protine, la concentration de ligand fix la protine peut alors tre dtermine en soustrayant la valeur connue de [ L ]libre de la concentration totale de ligand mesure dans le compartiment contenant la protine. A ce stade, il est essentiel de prendre conscience dune caractristique essentielle des mesures de dialyse lquilibre. Dans une exprience de cintique ltat stationnaire, cest lactivit cintique de lenzyme qui est mesure, et condition que lactivit spcifique de cette enzyme soit suffisamment leve, une concentration faible denzyme peut tre utilise sans affecter la prcision de la mesure. Inversement, dans une exprience de dialyse lquilibre, la quantit mesure, [ L ]fix , ne peut jamais dpasser la concentration totale des sites de fixation et est obtenue par soustraction ; il est important ds lors de sassurer que la concentration de la macromolcule est du mme ordre de grandeur que la concentration du ligand. Puisque les expriences de dialyse lquilibre et celles de cintique dans des conditions dtat stationnaire sont ralises dans des conditions diffrentes, elles peuvent dans certains cas conduire des rsultats apparemment inconsistants, si par exemple lenzyme sassocie de hautes concentrations. Sil existe un seul type de site de fixation de L sur E, le phnomne de fixation peut tre reprsent par le modle suivant : K E + nL ELn [3.60] Dans ce modle, K reprsente la constante individuelle de dissociation du ligand L pour chaque site de fixation et n reprsente le nombre de sites de fixation : [ E ][ L ]libre K = [3.61] [ EL ]
93
La saturation du site de fixation peut tre dfinie par le rapport suivant : [ EL ] Y = [ E ] + [ EL ]
[3.62]
En introduisant lquation [3.61] dans lquation [3.62], nous pouvons exprimer Y en terme de la concentration de ligand libre :
Y =
[ L ]libre K [ L ]libre = K + [ L ]libre 1 + ( [ L ]libre K )
[3.63]
Sil existe un seul site de fixation de L sur E, [ L ]fix correspond la fraction sature de la protine, Y, multiplie par la concentration totale de la protine [ E ]0 :
[ L ]fix = Y [ E ]0
[3.64]
et lquilibre de fixation peut tre exprim en fonction des concentrations de ligand sous forme libre et sous forme fixe :
[ L ]fix [ E ]0 [ L ]fix = K K [ L ]libre
[3.65]
Sil existe n sites de fixation de L sur E qui sont indpendants et quivalents, nous pouvons crire : [ L ]libre Y = n [3.66] K + [ L ]libre Si nous supposons que le nombre de sites de fixation est inconnu, la quantit [ L ]fix doit tre traite comme une quantit observe dont la dpendance vis-vis de [ L ]libre est donne par lquation suivante :
[ L ]fix =
n [ E ]0 [ L ]libre K + [ L ]libre
[3.67]
Les quations [3.66 ] et [3.67] peuvent tre crites sous les formes suivantes :
YK + Y [ L ]libre = n[ L ]libre
[ L ]fix K + [ L ]fix [ L ]libre = n[ E ]0 [ L ]libre
[3.68a] [3.68b]
qui aprs division par K [ L ]libre et rarrangement donne des formes linaires de lquation de fixation connue comme lquation de SCATCHARD :
Y = n Y [ L ]libre K K
[ L ]fix n[ E ]0 [ L ]fix = K K [ L ]libre
[3.69a] [3.69b]
Un graphique de Y [ L ]libre en fonction de Y a la forme dune droite dont la pente vaut 1 K , dont lordonne lorigine vaut n K et dont lintersection avec laxe des abscisses vaut n.
94
Lquation [3.67] est similaire lquation de MICHAELIS et MENTEN [3.35] et peut tre obtenue facilement partir de celle-ci si nous nous souvenons que la vitesse de la raction enzymatique est donne par le produit de la constante k0 et de la concentration de complexe EA, v = k0 [ EA ] . Si cette dernire est assimile la concentration de substrat fix, nous obtenons : [ E ]0 [ A ]libre [ EA ] = [ A ]fix = [3.70] K + [ A ]libre En principe, le cas cintique diffre par le fait qu saturation de lenzyme, la vitesse limite doit toujours tre traite comme une quantit exprimentale mesurable, alors que dans le cas de la fixation, il est clair a priori que la saturation signifie quune molcule de ligand est fixe sur chaque site de fixation. Nanmoins, cette diffrence est, en ralit, plus thorique que relle puisque dans de nombreux cas, la molarit de la protine nest pas connue avec une prcision suffisante pour que la limite exacte soit dtermine, et le nombre de sites de fixation par molcule peut tre inconnu (et est gnralement inconnu, puisquil sagit de linformation recherche dans les expriences de fixation). La relation vidente entre lquation de fixation et lquation de MICHAELIS et MENTEN permet de bien comprendre le phnomne de saturation qui intervient dans la cintique enzymatique. La vitesse limite de la raction est atteinte lorsque lenzyme est satur, c'est--dire lorsque la concentration de [ A ]libre est largement suprieure K et donc, que tout lenzyme est sous forme de complexe enzymesubstrat, [ EA ] = [ A ]fix = [ E ]0 . Lorsque la concentration de [ A ]libre est quivalente K, lenzyme est moiti satur par le substrat (la moiti des molcules denzyme est complexe une molcule de substrat) et donc la concentration de [ EA ] = [ A ]fix = 0 ,5[ E ]0 et la vitesse initiale est gale la moiti de la vitesse limite, v 0 = 0,5 V. La vitesse de la raction enzymatique est donc directement proportionnelle au degr de saturation de lenzyme. Dans les quations [3.69], n reprsente le nombre de sites de fixation et chacun de ces sites est suppos fixer le ligand avec la mme constante de dissociation K. Puisque cette quation a exactement la mme forme que lquation de MICHAELIS et MENTEN, les donnes exprimentales peuvent en principe tre analyses par les mmes mthodes. En pratique, le graphique universellement utilis pour reprsenter les quilibres de fixation est un graphique de [ L ]fix [ L ]libre en fonction de [ L ]fix qui est connu sous le nom de graphique de SCATCHARD (SCATCHARD, 1949). Lexamen de ce graphique indique quil est quivalent au graphique de v en fonction de v [ A ] prsent prcdemment, except que les axes sont inverss. Curieusement, les biochimistes qui utilisent couramment le graphique en double inverse pour reprsenter leurs donnes cintiques utilisent exclusivement le graphique de SCATCHARD pour reprsenter leurs donnes de fixation. Lquivalent du graphique en double inverse pour les quilibres de fixation, parfois appel graphique de KLOTZ (KLOTZ, WALKER et PIVAN, 1946) est trs rarement utilis (voir cependant SU et ROBYT (1994) pour quelques exemples de son utilisation), et
95
nous navons aucune connaissance dexemple dutilisation dun graphique de [ A ] v en fonction de [ A ] pour lanalyse de la cintique enzymatique. Nanmoins, il est essentiel de noter que lutilisation de ces diffrentes reprsentations graphiques nest dicte ni par les mrites de ces graphiques, ni par les ncessits imposes par les mthodes de mesure, mais est plutt une question de mode. Comme le graphique de SCATCHARD est frquemment utilis pour analyser des donnes plus complexes que celles exprimes par lquation [3.69], il est important de comprendre ses proprits dans le cas dun systme comportant des sites de fixation non-quivalents. Le cas le plus simple est celui dune protine comportant deux classes de sites : n1 sites caractriss par une constante de dissociation K1 et n2 sites caractriss par une constante de dissociation K2. Lquation de fixation devient :
[ L ]fix =
n1 [ E ]0 [ L ]libre n2 [ E ]0 [ L ]libre + K1 + [ L ]libre K 2 + [ L ]libre
[3.71]
La question est de savoir si une mthode de reprsentation graphique permet destimer rellement ces paramtres. La rponse correcte cette question est non, mais ce nest pas la rponse que donnerait la majorit des personnes qui ralise des expriences de fixation. Pour un ensemble donn de valeurs des diffrents paramtres, il est facile de tracer la courbe attendue pour un graphique de SCATCHARD. Malheureusement, cette dmarche est rarement suivie et en consquence, les paramtres estims partir de graphiques de SCATCHARD ne saccordent presque jamais, mme approximativement, avec les donnes partir desquelles ils sont drivs. Un exemple est prsent dans la figure 3.15. Pour des sites indpendants et non-quivalents, la courbure est presque toujours oriente dans le sens montr dans cette figure, bien que les dtails quantitatifs puissent varier. Le point essentiel noter est que les deux asymptotes qui reprsentent les graphiques pour chaque type de sites de fixation sont fortement loignes de la courbe exprimentale (voir la courbe de MICHAELIS et MENTEN prsente dans la figure 3.7 et la discussion du 3.5.1). Ceci signifie quil est impossible destimer la position de lune ou de lautre de ces asymptotes (et donc destimer le couple de paramtres la caractrisant) en traant une droite passant au travers de certains points. Lerreur qui rsulterait dune telle procdure peut tre trs importante : par exemple, dans la figure 3.15 une extrapolation nave de la partie de la courbe faibles valeurs de [ A ]fix indiquerait la prsence de deux sites de fixation de haute affinit plutt quun seul. En gnral, un seul paramtre dintrt peut tre estim de manire simple partir dun graphique de SCATCHARD, il sagit du nombre total de sites de fixation, qui correspond lintersection de lextrapolation de la courbe avec laxe des abscisses ( [ A ]fix ). Il est, en ralit, trs simple de juger visuellement si les points sur un graphique de SCATCHARD sont en accord avec les asymptotes supposes, parce que la courbe peut tre obtenue en additionnant les valeurs des asymptotes le long de lignes passant par lorigine. Cette addition est illustre dans la figure 3.15 pour une ligne arbitraire passant par lorigine. Ce calcul sapplique mme sil y a plus de deux
96
classes de sites de fixation, c'est--dire que lon peut tracer des droites pour diffrentes classes de sites et obtenir une courbe finale en calculant la somme le long de droites passant par lorigine des contributions de chacune de ces classes.
v /[A] ou [A]fix /[A]libre
1,5
Les vitesses s'additionnent le long de droites passant par l'origine : OA = BC, c'est--dire : OC = OA + OB v2 C B A v1 + v2 v1
1 2
0,5
0,0
O
0
v ou [A]fix
3.15 - Interprtation dun graphique de SCATCHARD courb par la mthode de ROSENTHAL (1967) La courbe rsultante peut tre drive partir de deux ou plusieurs composantes linaires par addition le long de droites passant par lorigine. Lanalyse sapplique de manire similaire aux donnes cintiques (v /[A] en fonction v) et aux donnes de fixation ([A]fix /[A]libre en fonction de [A]fix).
3.6. LES RACTIONS RVERSIBLES

3.6.1. Lquation de vitesse du mcanisme rversible simple
En principe toutes les ractions catalyses par des enzymes sont rversibles, et dans la ralit de nombreuses ractions importantes en biochimie sont rversibles dans le sens o des quantits significatives de substrat et de produit coexistent lquilibre. Il est vident, ds lors, que le mcanisme de MICHAELIS et MENTEN que nous avons dcrit jusqu prsent est incomplet, et que la raction en sens inverse doit apparatre dans le schma ractionnel. Le modle le plus simple consiste rendre rversible la seconde raction comme indiqu dans le modle suivant : E + A k1 k1 EA k2 k2 E + P [3.72]
[ E ]0 [ EA ]
[ A]
[ EA ]
[P]
97
Pour ce mcanisme, lquation dtat stationnaire pour le complexe EA scrit : d [ EA ] = k1([ E ]0 [ EA ])[ A ] + k 2 ([ E ]0 [ EA ])[ P ] ( k 1 + k 2 )[ EA ] dt [3.73] = 0 En groupant tous les termes en [ EA ] et en rarrangeant lquation, nous obtenons lquation : k [ E ]0 [ A ] + k 2 [ E ]0 [ P ] [ EA ] = 1 [3.74] k 1 + k 2 + k1 [ A ] + k 2 [ P ] Puisque la raction est rversible, la vitesse nette de formation du produit P est obtenue E+P par la diffrence entre la vitesse laquelle il est form dans la raction EA EA. La concentration et la vitesse laquelle il disparat dans la raction E + P denzyme libre disponible pour la raction inverse est donne par [ E ]0 [ EA ] .
v = k 2 [ EA ] k 2 ([ E ]0 [ EA ])[ P ]
k 2 ( k1 [ E ]0 [ A ] + k 2 [ E ]0 [ P ]) k 2 [ E ]0 [ P ] k 1 + k 2 + k1 [ A ] + k 2 [ P ] k ( k [ E ]0 [ A ] + k 2 [ E ]0 [ P ]) [ P ] + 2 1 k 1 + k 2 + k1 [ A ] + k 2 [ P ]
[3.75]
En combinant les quations [3.74] et [3.75], nous obtenons lexpression suivante :
v =
[3.76]
La multiplication croise permettant dobtenir un dnominateur commun fournit un numrateur apparemment complexe comprenant huit termes. Cependant, six de ces termes sliminent mutuellement, laissant lquation suivante :
v =
k1 k 2 [ E ]0 [ A ] k 1k 2 [ E ]0 [ P ] k 1 + k 2 + k1 [ A ] + k 2 [ P ]
[3.77]
Dans le cas particulier o [ P ] = 0 , lquation [3.77] est quivalente lquation [3.34], avec lexception que [ A ] doit tre remplac par [ A ]0 , puisque lhypothse de [ P ] = 0 nest valable quau temps initial de la raction, quand t = 0. Il est important de noter que cest la contrainte [ P ] = 0 qui permet de faire cette simplification et non certaines hypothses sur la grandeur de k2. Si [ P ] = 0 , la vitesse k 2 [ P ] est nulle, quelle que soit la valeur de k2. Dans le cas complmentaire o [ A ] = 0 , lquation [3.77] se simplifie sous la forme dune quation donnant la vitesse initiale de la raction inverse : k 1k 2 [ E ]0 [ P ] v = [3.78] k 1 + k 2 + k 2 [ P ] Un signe ngatif apparat dans cette quation parce que la vitesse de la raction est dfinie comme la vitesse dapparition du produit P, c'est--dire v = d [ P ] dt ; si la vitesse de la raction est dfinie comme d [ A ] dt lquation devient positive. A lexception du signe, lquation [3.78] est identique lquation de MICHAELIS et
98
MENTEN, et en la comparant avec les quations [3.34] [3.44], nous pouvons dfinir les paramtres caractristiques de la raction inverse :
k0 = k 1
kP = Km P = k 1k 2 k 1 + k 2 k 1 + k 2 k 2
[3.79a] [3.79b] [3.79c]
Lquation [3.79b] reprsente la constante de spcificit pour la raction inverse o lindice P indique le substrat de la raction. Ces termes sont analogues ceux qui ont t dfinis prcdemment pour la raction directe.
k0 = k 2
kA = Km A = k1k 2 k 1 + k 2 k 1 + k 2 k1
[3.80a] [3.80b] [3.80c]
En utilisant ces dfinitions, lquation [3.77] peut tre rcrite sous la forme suivante :
v =
k A [ E ]0 [ A ] kP [ E ]0 [ P ] [ A] [ P ] 1+ + Km A Km P
[3.81]
Cette dernire quation peut tre considre comme la forme gnrale de lquation de MICHAELIS et MENTEN. A linverse de lquation [3.77], celle-ci ne fait rfrence aucun mcanisme particulier et elle peut tre considre comme une quation empirique. Il existe de nombreux mcanismes plus complexes que celui de lquation [3.72] qui conduisent une quation de vitesse de la forme de lquation [3.81]. Parmi ceux-ci se trouve le mcanisme plus raliste de conversion de A en P en trois tapes qui est envisag dans le suivant. Dans ce mcanisme, la conversion chimique de A en P au site catalytique de lenzyme est traite comme une tape spare des processus dassociation/dissociation du substrat A et du produit P.
3.6.2. Lquation de vitesse du mcanisme en trois tapes : traitement lquilibre

Considrons maintenant un cas plus raliste o un substrat A est converti en produit P dans le site actif dun enzyme. Cette raction est reprsente par une tape distincte du mcanisme cintique qui prcde la dissociation de lenzyme et du produit. Par simplicit, considrons que la formation de EA et celle de EP sont
99
EP. Dans ce cas, nous pouvons lquilibre, par opposition avec la raction EA reprsenter le mcanisme ractionnel par lquation suivante : E + A k1 k1 EA k2 k2 EP k3 k3 E + P [3.82]
[ E ]0 [ EA ] [ EP ] [ A ]
[ EA ]
[ EP ]
[P]
Si, par souci de simplification, nous supposons que les tapes de fixation du substrat et de libration du produit sont rapides par rapport la raction chimique EA EP, nous pouvons dfinir les paramtres Km A = k 1 k1 et Km P = k3 k 3 comme les constantes de dissociation des complexe EA et EP. Dans ce cas, lobtention de lquation de vitesse ncessite de trouver lquation pour la vitesse nette : [3.83] vnette = v 2 v 2 o
v 2 = vP = v 2
d [ EP ] dt d [ EA ] = vA = dt
[3.84a] [3.84b]
Lquation de vitesse peut aisment tre obtenue en appliquant les trois rgles prcdemment tablies. La loi daction de masses permet de dfinir la vitesse initiale pour chacun des deux sens de la raction : [3.85a] v 2 = k 2 [ EA ]
v 2 = k 2 [ EP ]
La vitesse nette est obtenue comme la diffrence :
[3.85b] [3.86]
vnette = k 2 [ EA ] k 2 [ EP ]
En utilisant les deux quilibres :
Km A =
[ EA ] =
[ A ][ E ] [ EA ]
[ E ][ A ] Km A
Km P =
[ EP ] =
nous obtenons :
[ P ][ E ] [ EP ]
[ P ][ E ] Km P
[3.87] [3.88]
vnette = k 2
[ E ][ A ] [ E ][ P ] k 2 Km A Km P
100
Lquation de conservation de lenzyme scrit comme suit :
[ A] [ P ] [ E ]0 = [ E ] + [ EA ] + [ EP ] = [ E ] 1 + + = [ E ]D Km A Km P
o et
[3.89] [3.90] [3.91]
D = 1+
[ A] [ P ] + Km A Km P
[E] =
[ E ]0 D
Les quations de conservation du substrat et du produit scrivent :
[ E ]0 << [ A ]0 [ E ]0 << [ P ]0
; [ A ] = [ A ]0 ; [ P ] = [ P ]0
[3.92a] [3.92b] [3.93a] [3.93b]
En utilisant les quations suivantes comme dfinition des vitesses limites :
V2 = k 2 [ E ]0 V2 = k 2 [ E ]0
et les quations [3.88] [3.91], nous obtenons lquation de vitesse finale : [ A] [P] [ A] [P] V2 V2 V2 V2 Km A Km P Km A Km P [3.94] = vnette = [ A] [ P ] D 1+ + Km A Km P Comme dans le cas le plus simple ( 3.6.1), si [ P ]0 = 0 ou si [ A ]0 = 0 , cette quation se simplifie et donne lquation de MICHAELIS et MENTEN [3.34] respectivement pour la direction directe ou pour la raction inverse.
3.6.3. La relation de HALDANE

Quand une raction a atteint lquilibre, sa vitesse nette devient nulle. Si [ A ] et [ P ] reprsentent les valeurs de [ A ] et de [ P ] lorsque lquilibre est atteint, nous obtenons les quations suivantes partir de lquation [3.94] : [ A ] [ P ] V2 V2 = 0 [3.95] Km A Km P et donc
k A [ E ]0 [ A ] kP [ E ]0 [ P ] = 0
[3.96]
Puisqu lquilibre, K = [ P ] [ A ] , nous pouvons rcrire respectivement les quations [3.95] et [3.96] comme suit :
K =
V2 Km P V2 Km A
[3.97]
101
K =
k2 K m P [ P ] kA = = [ A ] kP k 2 K m A
[3.98]
o K est la constante dquilibre de la raction. Cette quation constitue un rsultat important, connu sous le nom de relation de HALDANE (HALDANE, 1930). Ces galits sont vrifies pour nimporte quel mcanisme dcrit par lquation [3.81] et pas seulement pour le mcanisme simple deux tapes de MICHAELIS et MENTEN. Les quations de vitesse plus complexes, telles que celles qui seront dcrites pour des ractions plusieurs substrats, conduisent des relations de HALDANE plus complexes, mais parmi ces quations il en existe toujours au moins une qui relie les paramtres cintiques et la constante dquilibre globale de la raction.
John Burdon Sanderson H ALD ANE (1892-1964)

HALDANE a laiss son nom associ au moins deux lments importants de lenzymologie. Avec G.E. BRIGGS, il a dmontr que les ractions enzymatiques suivent les lois de la thermodynamique et a introduit le concept dtat stationnaire dans le traitement des cintiques enzymatiques. En utilisant des approches mathmatiques, il a calcul les vitesses auxquelles les ractions enzymatiques se droulent et a laiss son nom associ une quation encore largement utilise (quation [3.98]). La carrire scientifique dHALDANE, peut-tre plus encore que celles de Victor HENRI et de Leonor MICHAELIS, est un exemple frappant de multi-disciplinarit qui prouve que le transfert de comptence entre disciplines est extrmement rentable. En plus de ses qualits scientifiques, HALDANE avait galement de grandes qualits de vulgarisateur et il a crit de nombreux articles afin de faire connatre lhomme de la rue les avances scientifiques et techniques du dbut du XXe sicle. HALDANE nat Oxford, dans une ancienne famille cossaise. Son pre est le clbre physiologiste largement reconnu pour ses travaux de physiologie respiratoire, qui a mis en vidence leffet ltal du monoxyde de carbone, qui a dmontr que le monoxyde de carbone se fixe sur lhmoglobine et empche celle-ci de remplir pleinement son rle de transporteur de loxygne et qui, avec J.G. PRIESTLEY, a promu lide selon laquelle la ventilation pulmonaire est contrle par la pression partielle de dioxyde de carbone dans le sang artriel. Cest lui qui va initier son fils la physiologie. Aprs une ducation Eton, il tudie les mathmatiques et la biologie Oxford et quitte luniversit sans qualification scientifique. En 1919, il commence enseigner la physiologie au New College Oxford, marchant ainsi dans les traces de son pre, mais il commence, ds cette poque, sintresser la liaison des gnes. En 1921, il accepte un poste sous la direction de Frederick HOPKINS dans le dpartement de Biochimie Cambridge. L, il se concentre sur ltude des enzymes et publie une prsentation globale du mcanisme daction des enzymes dans son livre Enzymes (1932) mais il continue ses travaux de gntique et commence galement publier ses premiers travaux sur les mathmatiques de la slection naturelle. J.B.S. HALDANE doit en effet une grande partie de sa notorit sa participation avec R.A. FISHER et S. WRIGHT la synthse des thories de DARWIN et
102
de MENDEL et au dveloppement de la thorie synthtique de lvolution aussi connue comme la thorie no-darwinienne. Il crit une dizaine darticles influents sur le sujet et publie en 1932 une synthse dans son livre The Causes of Evolution. En 1933, HALDANE quitte Cambridge pour University College Londres o il est successivement titulaire des chaires de gntique et de biomtrie. En 1935, il publie une carte du chromosome X en localisant la position des gnes associs divers phnotypes comme le daltonisme et le dficit de vision nocturne. En 1957, en protestation contre linvasion franco-anglaise de Suez, il migre aux Indes. Il travaille dabord pour lIndian Statistical Office Calcutta et plus tard il sinstalle Orissa o il dirige un laboratoire de gntique et de biomtrie. Il steint Orissa en dcembre 1964 la suite dun cancer dont il sest moqu auparavant dans un court pome qui sintitulait Cancers a funny Thing. Rfrence R.W. CLARK - J.B.S. HALDANE, dans Dictionary of Scientific Biography, New-York, Scribners
3.6.4. Lquation de vitesse du mcanisme en trois tapes : cas ltat stationnaire

En principe, lquation de vitesse pour le mcanisme complet peut tre drive de la mme manire pour la situation dtat stationnaire. Cependant, il existe maintenant deux formes intermdiaires, EA et EP, et chacun des deux termes d [ EA ] dt et d [ EP ] dt doit tre nul. La ncessit de rsoudre simultanment deux quations, une en [ E A] et une en [ E P], complique la procdure de drivation. Comme nous dcrirons une mthode plus versatile de drivation de ces quations dans le chapitre 6, nous dirons simplement ici que le mcanisme en trois tapes conduit galement lquation [3.77], mais avec des dfinitions quelque peu diffrentes pour les paramtres de la raction directe :
k0 = kA = Km A =
et de la raction inverse :
k 2 k3 k 2 + k 2 + k3
[3.99a] [3.99b] [3.99c] [3.100a] [3.100b] [3.100c]
k1 k 2 k3 k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3 k 1 k 2 + k 1 k3 + k 2 k3 k1( k 2 + k 2 + k3 ) k 1 k 2 k 1 + k 2 + k 2
k 0 = kP = Km P =
k 1 k 2 k 3 k 1 k 2 + k 1 k3 + k 2 k3 k 1 k 2 + k 1 k3 + k 2 k3 ( k 1 + k 2 + k 2 )k 3
103
En dpit de leur apparence complexe, les expressions pour Km A et Km P se simplifient respectivement en constantes de dissociations relles pour les complexes EA et EP, KA et KP, si la seconde tape dans la direction approprie est ltape limitante de la vitesse : k Km A = 1 = K A si k 2 << ( k 2 + k3 ) [3.101] k1 et
Km P =
k3 = KP k 3
si k 2 << ( k 1 + k 2 )
[3.102]
Les deux simplifications sappliquent simultanment si les deux conditions sont satisfaites simultanment, c'est--dire si la conversion entre EA et EP est ltape qui limite la vitesse dans les deux directions. Dans les conditions ainsi dfinies, les constantes de MICHAELIS ont des valeurs gales aux constantes de dissociation mais il est instructif, dans le but de comprendre les arguments dvelopps la fin du 3.3.2, de se poser la question inverse : existe-t-il des conditions dans lesquelles les deux constantes de MICHAELIS sont simultanment diffrentes des constantes dquilibre correspondantes ? ATKINSON (1977) est un des rares stre pos la question et les rsultats de son analyse sont surprenants. Clairement, partir des quations [3.101] et [3.102], nous obtenons que k2 doit tre plus grand que k2 + k3, et que simultanment, k2 doit tre plus grand que k1 + k2. Puisque ces deux affirmations ne peuvent tre toutes deux correctes, il rsulte que dans au moins une des directions (et souvent dans les deux) la constante de MICHAELIS a une valeur raisonnablement proche de celle de la constante de dissociation correspondante. ATKINSON a conclu que nous ne devons pas hsiter infrer des affinits des enzymes pour leurs substrats partir des valeurs des constantes de MICHAELIS. Cette conclusion va cependant trop loin parce quil existe de nombreuses ractions en biochimie qui, dans des conditions physiologiques, se droulent uniquement dans une seule direction, et dans lesquelles la constante dquilibre est en faveur de la direction physiologique de la raction. Dans de tels cas, il est plus probable que nous serons intresss par la constante de MICHAELIS de la raction directe et cest cette constante de dissociation qui diffrera le plus probablement de la constante de dissociation correspondante puisque les constantes de vitesse directes doivent tre en moyenne plus grandes que les constantes de vitesse inverses pour des ractions dans lesquelles la constante dquilibre favorise la direction directe. Il est aussi possible que les deux constantes de MICHAELIS soient des constantes dquilibre sans quaucune des tapes de fixation ne soit lquilibre : si k1 = k3 (c'est--dire si A et P se dissocient de leur complexe respectif avec la mme constante de vitesse), alors les deux expressions ont un facteur commun, (k2 + k2 + k3), au numrateur et au dnominateur, qui slimine. Les deux simplifications prsentes dans les quations [3.101] et [3.102] sappliquent alors sans aucune hypothse sur les grandeurs de k2 et de k2 (CORNISH-BOWDEN, 1976).
104
En dpit de ces diffrents cas dans lesquels K m est quivalent une constante de dissociation du substrat, en gnral il nest pas conseill de faire une telle supposition, sauf si cette quivalence est confirme par une preuve vidente. Il est plus raisonnable de considrer K m comme une quantit empirique qui dcrit la dpendance de v vis--vis de [ A ] et non comme une mesure de la stabilit thermodynamique du complexe enzyme-substrat.
3.6.5. Utilisation du profil dnergie de GIBBS

Il peut tre utile de reprsenter le profil dnergie de GIBBS pour la raction dans des conditions dtat stationnaire.
G [AP] E
D2
D2
[EP]
D3
[EA]
D1 D1 DGint
E+A
DG ext
EP
D3
EA E+P Coordonnes de la raction
3.16 - Profil dnergie libre dune raction enzymatique
o Chaque i reprsente le DGi pour ltape i de la raction et le DGext reprsente la P. Puisque cette dernire ne variation globale dnergie libre de la raction A dpend pas de la prsence denzyme, elle peut tre appele variation dnergie libre externe, par opposition avec la variation dnergie libre pour la raction se droulant au sein du complexe avec lenzyme que nous appelerons variation o dnergie libre interne. Celle-ci est note DGint dans la figure 3.16. Cette variation dnergie libre interne est directement relie au mcanisme catalytique de lenzyme. [3.103] DG o = ( D D ) + ( D D ) + ( D D ) = RT ln K
ext 1 1 2 2 3 3
o DGint = D 2 D 2
[3.104]
3.6.6. Les enzymes unidirectionnels

Un principe essentiel de la catalyse enzymatique est que la prsence dun enzyme ne modifie pas la position de lquilibre chimique dune raction mais quelle
105
acclre simplement lvolution du systme vers cette position dquilibre. En dautres termes, les lois de la thermodynamique prvoient quun enzyme catalyse toujours une raction dans les deux directions. Dans un certain nombre de cas, cependant, la catalyse apparat beaucoup plus efficace dans une des deux directions, en apparente contradiction avec les lois de la thermodynamique. Un exemple frappant est celui de la mthionine adnosyltransfrase pour laquelle la vitesse limite de la raction directe est environ 2 . 105 fois suprieure la vitesse limite de la raction inverse, alors que la constante dquilibre est proche de lunit (MUDD et MANN, 1963). Malgr une discussion approfondie de ce cas par JENCKS (1975), beaucoup de biochimistes mconnaissent ce type de comportement et restent convaincus que cette raction enzymatique ne respecte pas les lois de la thermodynamique. Cependant, bien que lquation dHALDANE impose des limites sur le comportement cintique possible dun enzyme, elle laisse la porte ouverte lexistence dune large gamme de comportements. Si nous considrons lquation [3.81] qui dcrit le comportement dune raction rversible en fonction des constantes de spcificit et des constantes de MICHAELIS, il est vident que lune ou lautre des constantes de spcificit peut prendre une valeur quelconque condition que lautre saccorde aux exigences imposes par la constante dquilibre, et quaucune contrainte nest impose sur les constantes de MICHAELIS. Par exemple, si la catalyse de la direction directe est largement plus efficace que celle de la raction inverse, la constante de dissociation Km A doit tre beaucoup plus grande que Km P . Une petite valeur de Km P se manifeste gnralement par une inhibition par le produit de la raction directe. Alternativement, si lquation est crite en termes de constantes catalytiques et de constantes de MICHAELIS, comme cest la pratique courante, lanalyse parat plus complexe parce que ce type dcriture masque le fait que seules les constantes de spcificit sont soumises une contrainte thermodynamique. Si nous souhaitons examiner la gamme des comportements possibles, nous pouvons ignorer le rapport des constantes de spcificit parce que ce rapport est impos par la thermodynamique et quil ne peut pas tre ajust au cours de lvolution de lenzyme. De la mme manire, nous pouvons galement ignorer les grandeurs relles de ces constantes puisque celles-ci refltent uniquement le niveau gnral dactivit catalytique de lenzyme. Les seuls paramtres ajustables sont donc les constantes de MICHAELIS. Comme nous pouvons le voir dans la figure 3.17, si les valeurs de Km A et de Km P sont trs diffrentes, le graphique de v en fonction de log( [ P ] [ A ] ) est fortement asymtrique : si Km P << Km A (c'est--dire si le produit se fixe beaucoup plus fortement que le substrat, comme cest le cas par exemple pour de nombreuses deshydrognases qui convertissent NADox en NADred), la pente de la courbe est beaucoup plus accentue lorsque le systme approche de lquilibre dans la direction directe de la raction que lorsquil lapproche dans la direction inverse ; dans des conditions opposes cest videmment linverse qui est observ. En conclusion, un enzyme peut tre un bien
106
meilleur catalyseur dans une direction que dans lautre sans pour autant dsobir aux lois de la thermodynamique. Ltude de la figure 3.17 confirme que la vitesse lquilibre est nulle et que, dans tout autre tat davancement, la raction procde en direction de lquilibre : cest la seule contrainte impose par la thermodynamique ; aucune contrainte nimpose que les courbes soient symtriques autour du point dquilibre ni que lquilibre doive tre approch avec une pente similaire dans les deux sens de la raction.
v
1
v a - KmP = 0,01 KmA
b - KmP = 100 KmA
Vitesse nulle l'quilibre

1 0,01 1 0,01
Vitesse nulle l'quilibre
0,1
10
100
0,1
10
100
[P]/[A]
[P]/[A]
3.17 - Enzymes unidirectionnels Les deux courbes sont calcules pour une constante dquilibre gale 1, c'est--dire pour un quilibre o [P]/[A] = 1, mais o le rapport des constantes de MICHAELIS dans les directions directe et inverse est diffrent dans les deux cas. Quand Km,P << Km A (a), la courbe est trs pentue lorsque lquilibre est approch dans la direction directe, mais est trs plate lorsquil est approch dans la direction inverse ; mais linverse est vrai quand Km P >> Km A (b). Il faut noter que ces courbes nimpliquent aucune violation des principes de la thermodynamique, parce que, quelles que soient les circonstances, la raction volue toujours vers lquilibre.
Dun point de vue physiologique, lexistence denzymes unidirectionnels est entirement justifie, puisque dans la nature un grand nombre de ractions ne doivent pas tre catalyses dans la direction inverse et quil nexiste donc aucune pression volutive pour amliorer la catalyse de la raction inverse. Labsence dun dsavantage na pas le mme effet volutif que lexistence dun avantage, mme si nous pouvons toujours nous demander pourquoi un tel comportement a t slectionn. La rponse rside probablement dans la quantit limite dnergie de fixation qui est disponible pour la catalyse enzymatique, comme la discut JENCKS (1975). Un site actif strictement complmentaire de ltat de transition de la raction optimiserait lactivit catalytique de lenzyme dans les deux sens de la raction. Cependant, si seulement une des directions a une importance physiologique, lefficacit dans cette direction peut tre amliore aux dpends de celle dans lautre direction en dveloppant un site actif ayant une meilleure affinit pour les ractifs ou les produits que pour ltat de transition.
107
3.7. INHIBITION PAR LE PRODUIT

Linhibition par le produit est un cas spcial dinhibition qui sera discut en dtail dans le chapitre 5, mais parce quelle dcoule naturellement du paragraphe prcdent, il est utile de la mentionner brivement ici. Quand lquation [3.81] sapplique, la vitesse doit diminuer lorsque le produit saccumule, mme si la diminution de la concentration du substrat reste ngligeable, parce que le terme ngatif du numrateur augmente de plus en plus lorsque la raction sapproche de lquilibre et parce que le troisime terme du dnominateur augmente avec [ P ] . Dans nimporte quelle raction, le terme ngatif du numrateur devient significatif uniquement si la raction est significativement rversible. Cependant, linhibition par le produit est manifeste dans de nombreuses ractions qui sont essentiellement irrversibles, comme dans lexemple classique de lhydrolyse du sucrose catalyse par linvertase. Ce phnomne indique que le produit doit tre capable de se fixer sur lenzyme et est compatible avec le mcanisme le plus simple deux tapes uniquement si la premire tape est irrversible et que la seconde ne lest pas. Cette situation semble particulirement improbable, du moins comme un phnomne gnral. Dun autre ct, le mcanisme trois tapes prdit que linhibition par le produit peut avoir lieu dans une raction irrversible si la seconde tape, c'est-dire la transformation chimique, est irrversible. Dans un tel cas, laccumulation du produit provoque la squestration de lenzyme sous la forme du complexe EP qui nest donc plus disponible pour ragir avec le substrat. Pour une raction irrversible, lquation [3.81] peut scrire comme suit : k0 [ E ]0 [ A ] k A [ E ]0 [ A ] [3.105] v = = [ A] [ P ] [ P ] + 1+ Km A 1 + + [ A] Km A Km P KP Si la raction est irrversible, Km P peut tre lgitimement remplac par K P , c'est-dire par une constante dquilibre, parce que si k2 a une valeur approximativement gale zro, elle est ngligeable vis--vis du terme ( k 1 + k 2 ) . Comme nous le verrons dans le 5.2.1, lquation [3.105] a exactement la forme du type le plus commun dinhibition qui est appel inhibition comptitive. Bien videmment leffet du produit ajout devrait tre exactement le mme que celui du produit qui saccumule au cours de la raction, et donc il est possible de mesurer des vitesses initiales en prsence de diffrentes concentrations de produit. Pour chaque concentration de produit, la vitesse initiale pour diffrentes concentrations de substrat obit lquation de MICHAELIS et MENTEN, mais avec des app app valeurs apparentes k0 et Km ,A donnes par k0 = k0 et Km A = Km A 1 + ( [ P ] KP )
(comparer lquation [3.105] avec lquation [3.35]). Ainsi que Km A et augmente linairement avec [ P ] .
app k0
est constant et gal
app la valeur de k0 de la raction en absence dinhibition, mais Km A est plus grand
108
Les premires tudes approfondies de linhibition par le produit ont t ralises par MICHAELIS et RONA (1914) sur la maltase et par MICHAELIS et PECHSTEIN (1914) sur linvertase, bien que celles-ci aient t prcdes par les tudes de HENRI (1903) qui avait dj driv une quation quivalente lquation [3.105] (quation [3.1]). Avec certains produits, tel que le fructose, ces auteurs ont observ une inhibition comptitive de linvertase, mais avec dautres produits, tel que le glucose, le comportement est plus complexe. Ainsi, puisquil existe de nombreuses substances en plus du produit qui sont capables dinhiber lenzyme, il est clair quune thorie plus complte est ncessaire. Celle-ci sera dveloppe dans les chapitres suivants (en particulier dans le chapitre 5).
3.8. INTGRATION DES QUATIONS DE VITESSE

POUR LES RACTIONS ENZYMATIQUES
3.8.1. quation de MICHAELIS et MENTEN sans inhibition par le produit
Comme nous en avons discut au dbut de ce chapitre, les premiers chercheurs qui ont tudi la cintique enzymatique se sont heurts plusieurs difficults parce quils suivaient la raction sur des temps trop longs et analysaient leurs donnes en utilisant des quations intgres de vitesse similaires celles communment utilises en cintique chimique. Ces difficults ont t limines lorsque MICHAELIS et MENTEN (1913) ont montr que les enzymes pouvaient tre tudis plus simplement en mesurant des vitesses initiales, c'est--dire dans des conditions o laccumulation du produit et la disparition du substrat nont aucun effet. Une consquence malheureuse de ces premiers dveloppements est que les biochimistes sont devenus rticents utiliser les quations intgres de vitesse, mme quand elles pouvaient tre utilises de manire approprie. Il nest pas toujours possible de raliser une exprience dans des conditions dtat stationnaire dans laquelle la courbe davancement de la raction (c'est--dire le graphique de [ P ] en fonction du temps, t) soit essentiellement linaire pendant une priode de temps apprciable, et, dans ces cas, lestimation de la pente initiale et donc de la vitesse initiale, est subjective et susceptible dtre errone. Une grande partie de cette subjectivit peut tre limine en utilisant une forme intgre de lquation de vitesse, comme nous allons le dcrire. Si lquation de MICHAELIS et MENTEN est crite sous la forme suivante (voir quation [3.36]), d[ P ] V [ A] = [3.106] dt Km + [ A ] nous avons une quation trois variables, [ P ] , t et [ A ] . Dans cette forme, elle ne peut pas tre intgre directement, mais une des trois variables peut tre limine
109
en utilisant la relation stchiomtrique [ A ] + [ P ] = [ A ]0 . Nous obtenons alors lquation suivante : V ([ A ]0 [ P ]) d[ P ] = [3.107] dt Km + ([ A ]0 [ P ]) qui peut tre intgre en sgrguant les deux variables dans les deux parties de lquation : ( Km + [ A ]0 [ P ]) d [ P ] [3.108] = Vdt [ A ]0 [ P ] La partie gauche de cette quation nest pas immdiatement assimilable une intgrale simple, mais en la sparant en deux termes, nous obtenons :
Km d [ P ] [3.109] + d[P] = Vdt [ A ]0 [ P ] desquels le premier a une forme standard que nous avons dj utilise plusieurs reprises dans ce manuel (par exemple dans le 1.2) : Km d [ P ] = Km ln([ A ]0 [ P ]) [ A ]0 [ P ] et le second est trivial. Nous obtenons alors la forme intgre suivante : Km ln ([ A ]0 [ P ]) + [ P ] = Vt + a
[3.110]
[3.111]
o a est une constante dintgration qui peut tre value dans la condition limite de [ P ] = 0 quand t = 0, c'est--dire que a = Km ln [ A ]0 . En substituant cette valeur de a dans lquation [3.111] et en rarrangeant, nous obtenons :
[ A ]0 Vt = [ P ] + Km ln [ A ]0 - [ P ]
[3.112]
3.8.2. Inhibition par le produit

Bien que lquation [3.112] soit une forme intgre de lquation de MICHAELIS et MENTEN (quation [3.106]), lutilisation pratique de cette quation peut gnrer des erreurs importantes sur les valeurs des paramtres cintiques, si certaines prcautions ne sont pas prises. En effet, puisquil ne sagit pas de mesures ralises dans des conditions de vitesse initiale, linhibition par le produit ne peut plus tre nglige, puisque, quelle que soit la concentration initiale du produit, celui-ci saccumule au cours de la raction. Dans le cas le plus simple, nous devons remplacer lquation [3.107] par lquation qui tient compte dune possible inhibition comptitive par le produit P qui est caractrise par la constante dinhibition KP : V ([ A ]0 [ P ]) d[ P ] [3.113] = [ P ] dt Km 1 + + [ A ]0 [ P ] KP
110
Cette quation a une forme algbrique similaire lquation [3.107], ce qui a deux consquences importantes : premirement, il est impossible de dterminer partir de donnes exprimentales en accord avec lquation [3.112] si lquation [3.107] est le point de dpart correct plutt que lquation [3.113] ; deuximement, la mme logique qui a permis dintgrer lquation [3.107] peut tre utilise pour intgrer lquation [3.113]. Lquation obtenue de cette manire est la suivante :
Km 1 + ( [ A ]0 KP ) [ A ]0 Vt ln = [P ]+ [ A ]0 [ P ] 1 ( Km KP ) 1 ( Km KP )
[3.114]
Dans ses tudes de linvertase, HENRI (1903) avait obtenu une quation quivalente (voir quation [3.1]). Lquation [3.114] a exactement la mme forme que lquation [3.112] et peut aussi scrire de la manire suivante :
[ A ]0 app V app t = [ P ] + Km ln [ A ]0 [ P ]
avec
[3.115] [3.116]
V app =
app Km =
V 1 ( Km KP )
Km 1 + ( [ A ]0 KP ) 1 ( Km KP )
[3.117]
c'est--dire que lquation [3.112] a t crite en remplaant respectivement app V et K m par les valeurs apparentes V app et Km . Notons que le dnominateur 1 ( Km KP ) est commun aux deux expressions [3.116] et [3.117] indiquant que les valeurs apparentes peuvent diffrer de manire importante des valeurs relles des paramtres de MICHAELIS et MENTEN, sauf si la fixation du produit peut tre nglige. Nanmoins, les valeurs des paramtres apparents peuvent tre ngatives si le produit se fixe plus fermement que le substrat (c'est--dire si la valeur de KP est infrieure la valeur de K m ). Pour apprcier ce que signifie de ngliger la fixation du produit dans ce contexte, nous pouvons imaginer que nous souhaitons analyser un dcours complet de raction en utilisant [ A ]0 = 2 Km et que nous app dsirons que la valeur de Km ne diffre pas de celle de K m de plus de 5%. En remplaant de manire adquate les termes de lquation [3.117] nous obtenons que K m doit tre au maximum gale 0,03 KP, c'est--dire que le substrat doit se fixer au moins 33 fois plus fermement sur lenzyme que le produit. Cette situation nest pas impossible, nanmoins, elle est suffisamment improbable pour autoriser lutilisation de lquation [3.112] sans aucune prcaution.
3.8.3. Mesures prcises des vitesses initiales

app En dpit des complications discutes ci-dessus, les mesures de V app et de Km peuvent savrer trs utiles si nous considrons leur vritable valeur, non comme des mesures directes de V et de Km mais comme moyen de calculer des valeurs trs prcises de la vitesse initiale en les insrant dans lquation suivante :
111
v0 =
V app [ A ]0 app Km + [ A ]0
[3.118]
Cette quation dcoule de lquation [3.115] par diffrenciation, sans gard pour la app signification de V app et de Km . En rarrangeant lquation [3.115], nous obtenons :
app Km [P] + app V [ A ]0 ln [ A ]0 [ P ]
t = 1 V app [ A ]0 ln [ A ]0 [ P ]
qui montre quun graphique de
[3.119]
t en fonction de ln{ [ A ]0 ([ A ]0 [ P ] )}
[P] a la forme dune droite dont la pente est gale 1 V app et ln { [ A ]0 ([ A ]0 [ P ] )}

app app lordonne lorigine est gale Km V app . Les paramtres V app et Km peuvent facilement tre dtermins partir de ce graphique et v0 peut tre calcul partir de ces valeurs en utilisant lquation [3.118]. Nanmoins, la valeur de v0 peut galement tre obtenue directement sans passer par la dtermination de Vapp et de app Km , par une simple extrapolation de la droite : le rarrangement de lquation [3.118], sous la forme de lquation [3.56], indique que le point ([ A ]0 , [ A ]0 v ) doit se trouver sur une droite de pente gale 1 V app et dont lordonne lorigine app est gale Km V app , c'est--dire sur la mme droite que celle trace partir de lquation [3.119]. Cela signifie que si cette droite est extrapole jusquau point o [P] = [ A ]0 la valeur de lordonne doit tre gale [ A ]0 v . ln { [ A ]0 ([ A ]0 [ P ] )}
Lensemble de ce processus est illustr dans la figure 3.18. Le point extrapol peut tre trait comme un point ordinaire sur un graphique de [ A ]0 v0 en fonction de [ A ]0 (voir figure 3.11), et si plusieurs points sont obtenus partir de plusieurs dcours complets raliss diffrentes valeurs de [ A ]0 , les valeurs de V et de Km peuvent tre dtermines comme nous lavons dcrit prcdemment ( 3.5.2). Cette procdure, introduite par JENNINGS et NIEMANN (1955), peut apparatre comme une faon laborieuse et inutile de gnrer un graphique de [ A ]0 v0 en fonction de [ A ]0 , mais elle fournit en ralit des valeurs de [ A ]0 v0 beaucoup plus prcises que nimporte quelle autre mthode, et donc en consquence permet dobtenir des valeurs plus prcises des paramtres cintiques. Lextrapolation requise est trs courte et elle peut tre ralise de manire plus prcise et moins subjective que lestimation de la tangente une courbe extrapole au temps zro. Une tude de variants de la subtilisine dans laquelle cette approche a t utilise de manire satisfaisante est prsente par BRODE et al. (1996).
112
t ln{[A]0 /([A]0[P])}
Points provenant d'un dcours complet Points obtenus par extrapolation linaire des points exprimentaux jusqu' une valeur d'abscisse gale [A]0
[A]0 /v0 Kmapp/Vapp
Pente = 1/Vapp
Pente = 1/V Km /V
Km
[A]0 [P] ln{[A]0 /([A]0[P])}
3.18 - Dtermination des paramtres cintiques partir des dcours complets de raction t Les valeurs de sont portes en graphique pour plusieurs ln { [A]0 ([A]0 [P])} concentrations initiales de substrat [A]0 lorsque le temps augmente en fonction de [P] et chaque ensemble de tels points ( ) est extrapol vers une ln { [A]0 ([A]0 [P])} valeur dabscisse gale [A]0 pour donner des points (#) qui se localisent sur une droite de pente 1/V avec des intersections avec laxe des abscisses et celui des ordonnes qui donnent respectivement les valeurs de Km et de Km /V.
Une mthode plus simple, ncessitant seulement des calculs triviaux (sans logarithme), peut tre obtenue en utilisant une approximation du terme logarithmique. Pour introduire celle-ci, il est utile de dmarrer avec lquation intgre de vitesse pour une raction simple dordre un (quation [1.8]) et de noter quelle peut scrire de la manire suivante :
ln 1 ( [ P ] [ A ]0 ) = k t
(3.120)
o [ P ] reprsente la concentration du produit au temps t, k la constante de premier ordre et [ A ]0 la concentration du ractif au dpart. Pour des petites valeurs dune grandeur x, lexpression 2 x ( 2 + x ) est une excellente approximation de ln( 1 + x) , correspondant des erreurs infrieures 0,1% et 1% pour des valeurs de x respectivement infrieures 0,1 et 0,41. Ainsi, jusqu 40% de la raction, lquation [3.120] peut scrire de la manire suivante avec une prcision suprieure 1% :
( 2[ P ] [ A ]0 ) = kt 2 ( [ P ] [ A ]0 )
[3.121]
113
Lquation peut tre rarrange comme suit : k[ P ] [P] = k [ A ]0 2 t
[3.122]
Lquation [3.122] montre quun graphique de [ P ] t en fonction de [ P ] donne une droite dont lordonne lorigine vaut k [ A ]0 , qui correspond la vitesse initiale. BOEKER (1982) a montr que lordonne lorigine fournit la valeur de la vitesse initiale de manire plus gnrale que dans le cas des cintiques de premier ordre, quand par exemple [ P ] au temps zro est diffrente de zro ou quand il y a moins de 100% de conversion compltion de la raction, condition que laugmentation de [ P ] soit porte en graphique, c'est--dire que ([ P ] [ P ]0 ) t soit utilise comme la variable dpendante et non [ P ] t . Plus important encore pour la cintique enzymatique, elle a ralis que bien que cette thorie ne sapplique pas aussi simplement aux ractions enzymatiques, il nexiste pas de diffrence dans la pratique parce que la dviation par rapport aux prdictions est normalement trop faible pour tre dtecte. En appliquant la mme approximation lquation [3.112], nous obtenons lquation suivante :
[P] V [ A ]0 V[P] [ P ]2 = + t Km + [ A ]0 2( Km + [ A ]0 ) 2( Km + [ A ]0 )t
[3.123]
A cause du troisime terme de la partie droite, cette quation ne dfinit plus une droite, mais deux points importants doivent tre considrs. Premirement, ce troisime terme est nul au dbut de la raction, de sorte quil na aucun effet sur lordonne lorigine qui reprsente toujours la vitesse initiale de la raction. Deuximement, il est en gnral suffisamment petit pour ne produire quune dviation triviale de la linarit dans la premire partie de la raction, et en consquence na quun effet limit sur lutilisation du graphique de [ P ] t en fonction de [ P ] pour dterminer la vitesse initiale. Un dcours complet publi par SCHNHEYDER (1952) fournit un excellent exemple pour tester cette mthode (ou nimporte quelle autre) destimation de la vitesse initiale, puisquil consiste en 25 mesures couvrant la gamme de 2,5% 98% de compltion de la raction. Le graphique de BOEKER pour cet exemple est illustr dans la figure 3.19, avec le dcours complet original prsent dans lencart. Notons que dans lexemple de la figure 3.19, le graphique de BOEKER est linaire pendant les 15 premires minutes, correspondant environ 40% de la raction. Notons galement que bien que les erreurs systmatiques tendent vers zro lorsque le temps tend vers zro, il nen est pas de mme pour les erreurs alatoires, parce que, la limite de t = 0, la valeur de [ P ] t est gale 0 0 dont la valeur est indfinie. La consquence pratique est que nous devons tracer la droite lil en attribuant peu dimportance la dispersion des points correspondant aux temps les plus courts. Si nous appliquons navement une rgression linaire de manire obtenir la
114
meilleure droite, il est probable que nous obtenions une droite qui est loin dtre la meilleure parce quelle sera excessivement influence par les points les moins prcis.
[P] (%)
[P]/t (% / min)
6
Vitesse initiale
5
Les points proches de l'axe sont sujets d'importantes erreurs alatoires
100 80 60 40
20 0 0 20 40 60
t (min)
Les points aprs 40% d'avancement de la raction sont sujets des erreurs systmatiques plus importantes
0 20 40 60
t (min)
3.19 - Dtermination prcise des vitesses initiales par la mthode de BOEKER La valeur de [P]/t extrapole [P] = 0 fournit une valeur de la vitesse initiale. Il est important de noter que les erreurs alatoires deviennent trs importantes proximit des axes, de sorte que lextrapolation doit tre ralise lil et non par une rgression linaire. Linsert montre lensemble du dcours complet de la raction : notons que celui-ci est courbe sur lensemble de la raction et ne prsente donc aucune indication de lexistence dune phase linaire initiale.
3.8.4. Les dcours complets dans dautres cas

Dans le dveloppement initial des mthodes dintgration des quations de vitesse et danalyse des dcours complets, chaque mcanisme tait trait comme un cas spcial ; bien que de nombreux cas aient t analyss, incluant des ractions sujettes une inhibition comptitive par le produit (HENRI, 1903 ; HUANG et NIEMANN, 1951 ; SCHNHEYDER, 1952) et des ractions rversibles (LAIDLER et BUNTING, 1973), ceux-ci ne sintgraient pas de manire vidente dans un schma gnral. Plus tard, BOEKER (1984, 1985) a dvelopp une approche systmatique dans laquelle de nombreux mcanismes importants pour ltude des enzymes peuvent tre manipuls de la mme manire. A ce moment, cependant, les mthodes moins efficaces de vitesse initiale pour lanalyse des mmes mcanismes taient devenues tellement populaires que son travail na pas eu limpact quil mritait. Un exemple dapplication peut tre trouv dans ltude de variants de
115
laspartate aminotransfrase (SCHILLER, HOLMES et BOEKER, 1996). Plus rcemment, le principal travail danalyse des dcours complets de ractions catalyses par des enzymes a t ralis par DUGGLEBY et ses collaborateurs (DUGGLEBY, 1995 ; GOUDAR, SONNAD et DUGGELBY, 1999) et son rcent article (DUGGLEBY, 2001) sur le sujet devrait tre consult pour plus dinformation.
PROBLMES
3.1 - Pour un enzyme obissant lquation de MICHAELIS et MENTEN, calculer a - la concentration de substrat pour laquelle v = 0,1 V, b - la concentration de substrat pour laquelle v = 0,9 V, c - le rapport entre les deux. 3.2 - A lpoque de Victor HENRI, il ntait pas draisonnable de penser quun enzyme agissait uniquement par sa simple prsence, c'est--dire sans ncessairement se combiner avec le substrat. Driver une quation de vitesse pour le mcanisme ci-dessous, dans laquelle EA est form mais ne se trouve pas sur le chemin ractionnel allant de A P, et montrer que ce mcanisme conduit une quation de vitesse qui a la mme forme que lquation de MICHAELIS et MENTEN. Quelles sont les dfinitions de V et de Km en termes de K et de k ?
EA
3.20 - Mcanisme de catalyse nimpliquant pas la formation dun complexe enzyme-substrat, tel quil avait t suggr par Victor HENRI comme une alternative au type habituel de mcanisme
K E+A k E+P
3.3 - Un test dactivit pour un enzyme doit tre mis au point afin que la vitesse initiale mesure soit insensible aux petites erreurs commises sur la concentration de substrat. Quelle doit tre la grandeur de [ A ] Km pour quune erreur de 10% sur la concentration de substrat, [ A ] , se traduise par une erreur infrieure 1% sur la valeur de v ? (supposer que lquation de MICHAELIS et MENTEN est respecte). 3.4 - Dans une tude de la fumarase du cur de porc, les paramtres cintiques suivants ont t obtenus pour la raction directe : Vm = 1,7 mM, V = 0,25 mM1 s1, et Vm = 3,8 mM, V = 0,11 mM1 s1 pour la raction inverse. Estimer la constante dquilibre pour la raction entre le fuma rate et le malate. Pour un chantillon de fumarase provenant dune autre source, les paramtres cintiques suivants ont t obtenus : Km = 1,6 mM, V = 0,024 mM1 s1 pour la raction directe et Km = 1,2 mM, V = 0,012 mM1 s1 pour la raction inverse. Commenter la plausibilit de ces rsultats.
116
3.5 - Le tableau ci-dessous donne les valeurs des concentrations de produit, [ P ] , (en mM) diffrents temps (en min) pour 5 valeurs diffrentes de la concentration initiale de substrat, [ A ]0 (en mM). Estimer la vitesse initiale pour chaque concentration de substrat partir des graphiques de [ P ] en fonction de t. Ensuite, estimer K m et Vm , en supposant que la vitesse initiale est donne par lquation de MICHAELIS et MENTEN.
T
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
[ A ]0 = 1
0,095 0,185 0,260 0,330 0,395 0,450 0,505 0,555 0,595 0,630
[ A ]0 = 2
0,18 0,34 0,49 0,62 0,74 0,85 0,95 1,04 1,12 1,20
[ A ]0 = 5
0,37 0,71 1,01 1,29 1,56 1,80 2,02 2,22 2,40 2,58
[ A ]0 = 10
0,56 1,08 1,57 2,04 2,57 2,87 3,23 3,59 3,92 4,22
[ A ]0 = 20
0,76 1,50 2,20 2,88 3,50 4,12 4,66 5,24 5,74 6,24
3.6 - Si une raction est sujette une inhibition par le produit en accord avec lquation [3.105], la courbe dvolution de la raction obit une quation de la forme suivante :
[ A ] [ A ]0 K k0 [ E ]0 t = 1 mA ( [ A ]0 [ A ] ) + KmA 1 ln KP KP [ A ] o [ A ]0 est la valeur de [ A ] quand t = 0 et les autres symboles ont la

mme dfinition que dans l quation [3.105].
a - Montrer que lquation [3.105] est la forme diffrentielle de cette

quation.
b - Comparer lquation avec lquation [3.115] et crire les expressions app pour V app et K m (comme dfinies dans lquation [3.115]). app c - Dans quelles conditions V app et K m prendront-elles des valeurs
ngatives ? 3.7 - ATASSI et MANSHOURI (1993) ont rapport que des peptides synthtiques (ou pepzymes ), symboliss par ChPepZ et TrPepZ, catalysaient lhydrolyse du N-benzoyl-L-tyrosine thyle ester et du N-tosyl-L-arginine mthyle ester avec des constantes cintiques comparables celles respectivement de la chymotrypsine et de la trypsine, comme lindique le tableau ci-aprs :
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE - RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT Substrat 3 N-benzoyl-L-tyrosine thyle ester N-tosyl-L-arginine mthyle ester Catalyseur ChPepZ a-Chymotrypsine TrPepZ Trypsine
117
Km (mM) k0 (s1)
1,11 1,07 2,42 2,56 147 185 85 221
De quelle manire ces rsultats supportent-ils laffirmation que, clairement, les pepzymes devraient avoir un impact norme en biologie, en mdecine, dans lindustrie et pour dautres applications ? 3.8 - Trois isoenzymes catalysant la mme raction avec des valeurs de Km de 0,04, 0,2 et 5 mM ont t dcouverts dans un extrait cellulaire. Leurs valeurs de V sont respectivement gales 0,7, 1,2 et 0,8 (units arbitraires). Comment cette information peut-elle tre prsente dans un graphique couvrant une gamme de substrat allant de 0,01 20 mM ?
3. Lexactitude factuelle de linformation prsente dans le tableau a t remise en question (COREY et PHILIPS, 1994 ; WELLS et al., 1994). Nanmoins, bien que ces publications poussent considrer les rsultats DATASSI et MANSHOURI avec un scepticisme certain, elles naffectent pas la question pose dans lexercice, laquelle il est possible de rpondre en supposant que les rsultats sont corrects.
4 ASPECTS PRATIQUES DES TUDES CINTIQUES

Avant dentamer ce chapitre dans lequel nous discutons de plusieurs aspects pratiques considrer lors de la ralisation de mesures cintiques, il faut noter que la gnralisation de lutilisation de micro-ordinateurs dans les laboratoires la fin des annes 1980 a modifi considrablement les pratiques de ltude cintique. Le calcul assist par ordinateur permet, entre autres, de traiter plus rapidement les donnes brutes et permet de raliser des ajustements de paramtres avec des quations linaires ou non-linaires. Alors que lajustement manuel du dcours complet dune raction sur lquation intgre de MICHAELIS et MENTEN est quasiment impossible, cette procdure peut tre ralise aussi facilement quune rgression linaire avec laide dun ordinateur. Cette volution des mthodes danalyse permet dutiliser des approches exprimentales qui avaient t ngliges cause de leurs difficults dapplication.
4.1. MESURE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE

4.1.1. Mthodes continues et discontinues de mesure
La caractrisation des systmes enzymatiques repose sur la mesure de lactivit enzymatique et donc sur lexistence dune mthode exprimentale permettant de suivre lvolution de la raction au cours du temps. Quelle que soit la mthode analytique choisie, elle doit permettre de distinguer les substrats des produits et de mesurer leur concentration de manire quantitative. Parmi les mthodes de mesure utilises, on distingue les mthodes continues et les mthodes discontinues. Dans une mthode discontinue, des chantillons sont prlevs du mlange ractionnel intervalles successifs et sont analyss indpendamment afin de suivre lavancement de la raction. Lorsque cela est possible, il est toujours prfrable nanmoins dutiliser une mthode continue de mesure dans laquelle lavancement de la raction peut tre suivi en continu avec un appareil de mesure automatique. Par exemple, pour les ractions qui saccompagnent dun changement dabsorbance une longueur donde facilement mesurable, la cintique peut tre suivie laide dun spectrophotomtre (JOHN, 2002). Ainsi, de nombreuses ractions biochimiques impliquant la conversion entre le NADox et le NADred peuvent tre aisment suivies en mesurant la variation dabsorbance 340 nm. Dans les cas o une mthode
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spectroscopique nest pas utilisable, dautres alternatives existent qui permettent galement de suivre la raction en continu. Par exemple, il est parfois possible de coupler la raction tudie avec une raction facilement mesurable, comme nous en discuterons au 4.1.4. On parlera dans ce cas de systmes coupls . Dautres mthodes analytiques permettent galement une mesure en continu. Par exemple, parmi les ractions qui nimpliquent aucune variation de proprits spectroscopiques aisment mesurable, nombreuses sont celles qui saccompagnent de la libration ou de la fixation de protons. Ces ractions peuvent tre suivies dans des solutions non-tamponnes laide dun pH-stat , un instrument qui ajoute automatiquement une base ou un acide pour maintenir constant le pH de la solution (BROCKLEHURST, 2002). Si la stchiomtrie de la raction est connue, un enregistrement de la quantit ajoute de base ou dacide fournit galement une mesure continue de lavancement de la raction.
4.1.2. Estimation de la vitesse initiale

La mesure de la vitesse initiale dune raction peut poser de srieux problmes pratiques. Idalement, il est souhaitable de disposer de conditions dans lesquelles la courbe davancement de la raction est quasiment linaire pendant la priode de mesure, mais en thorie, une telle situation nexiste pas. Quel que soit le mcanisme de la raction, la vitesse de la raction varie au cours du temps (habituellement elle dcrot) pour diverses raisons, que ce soit parce que le substrat est consomm, parce que les produits qui saccumulent inhibent la raction ou parce que lenzyme perd progressivement son activit. Un exemple simple est prsent dans le 3.6 et quelques cas plus complexes, mais aussi plus ralistes, sont discuts dans larticle de CORNISH-BOWDEN (1975). En pratique, toutefois, si lavancement de la raction est mesur pour une variation infrieure 1% de la variation totale, la courbe davancement de la raction nest pas distinguable dune droite. Cette situation est cependant moins courante que ne le laisse supposer la littrature et de nombreux exprimentateurs refusent dadmettre les difficults inhrentes la mesure prcise de la tangente une courbe. Nombreux sont ceux qui prfrent se persuader que leur courbes davancement sont biphasiques, avec une partie initiale linaire (quils utilisent pour leur mesure) suivie dune partie o la vitesse est dcroissante. Cette pratique conduit presque toujours une sousestimation de la vritable vitesse initiale, pour des raisons qui apparaissent clairement si lon examine la figure 4.1. Mme si la droite est contrainte passer par lorigine, la mesure tendra sous-estimer la pente relle (bien que de manire moins exagre que dans la figure 4.1) si les quelques premiers points sont traits comme une droite. Pour viter ce problme, il est essentiel de bien le connatre et de se rappeler que lon essaie de mesurer la vitesse initiale et non la vitesse moyenne durant les quelques premires minutes de la raction, parce que cest la vitesse initiale qui est
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utilise dans lquation de vitesse. Ds lors, il faut tracer la tangente la courbe au temps zro et non la corde. Bien entendu, le recours ces raffinements dans la mesure de la vitesse initiale dpend de la prcision souhaite pour la mesure. Dans le cas o la mesure est utilise pour suivre les progrs de la purification dun enzyme, il nest pas ncessaire dobtenir une valeur extrmement prcise de la vitesse initiale. Par contre, lors de ltude cintique de lenzyme purifi, il est souhaitable dobtenir une mesure plus prcise quen traant la main la tangente au temps initial. Dans ces cas, une manire dobtenir une mesure prcise de la vitesse initiale repose sur lutilisation de lquation intgre (voir 2.8).
Produit form 20 (units arbitraires)
15
Vraie tangente initiale Pente = 5 Estimation partir des cinq premiers points Pente = 3,25
10
Temps (units arbitraires)

4.1 - Problmes lis lestimation de la vitesse initiale La droite continue passant par lorigine montre la vraie tangente initiale, qui a une pente suprieure de plus de 50% la droite en pointills qui a t dessine en traitant les cinq premires valeurs exprimentales comme si elles faisaient partie dune phase linaire hypothtique. En ralit, il ny a pas de phase linaire et lvolution de la raction est courbe sur la totalit de la gamme de temps.
4.1.3. Amlioration de la linarit dun dcours de raction

Puisque la vitesse dune raction catalyse par un enzyme est directement proportionnelle la concentration de cet enzyme, une proprit qui est facilement vrifiable exprimentalement, il est impossible de modifier la courbure dun graphique davancement en modifiant la concentration de lenzyme : il est uniquement possible de modifier lchelle de temps sur laquelle se droule la raction et tout autre changement apparent de la courbure nest quillusion. En effet, cette proprit est la base du test de linactivation de lenzyme dcrit dans le 4.2. En pratique, il est parfois avantageux de diminuer la concentration denzyme afin de diminuer la quantit de produit form durant la priode entre le mlange des ractifs et le
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moment auquel dbute lobservation de la raction (temps mort de la mthode), cest--dire de rduire la fraction de la raction qui nest pas directement observable. Par contre, il est possible damliorer la linarit de la courbe davancement de la raction en augmentant la concentration de substrat, condition que les produits ne se lient pas plus fortement que les substrats lenzyme (comme cest souvent le cas, par exemple, avec les ractions dans lesquelles le NADox est converti en NADred). Pour illustrer leffet de la concentration de substrat, nous considrerons le cas le plus simple, celui dune raction qui obit lquation de MICHAELIS et MENTEN et nest sensible ni une inhibition par le produit de la raction ni un ralentissement caus par un phnomne autre que la disparition du substrat. Dans ce cas, la forme intgre de lquation de MICHAELIS et MENTEN (cest--dire app lquation [2.56], avec V app = V et Km = Km ) dcrit la courbe davancement de la raction. Si la concentration initiale de substrat [ A ]0 est gale 5 K m, la vitesse initiale v0 est gale 0,83 V et est largement insensible une lgre erreur dans la concentration de substrat [ A ]0 . Mme si la valeur de [ A ]0 est augmente jusqu 10 K m, v0 augmente seulement de 9%, jusqu 0,92 V. A priori, ces considrations suggrent que laugmentation de la concentration de substrat napporte aucune amlioration apprciable la mesure, en dpit du fait quelle cote plus chre, puisquelle ncessite une plus grande quantit de substrat. Cependant un calcul simple utilisant lquation [2.56] montre que si [ A ]0 = 5 K m, le temps ncessaire pour que la vitesse diminue de 1% est de 0,34 Km /V, alors que si [ A ]0 = 10 K m le temps ncessaire pour obtenir le mme ralentissement est de 1,11 K m /V, cest-dire un temps 3 fois plus long. Ainsi, une augmentation de la concentration initiale de substrat tend la zone linaire . En pratique ce calcul est une simplification, parce que quasiment toutes les ractions catalyses par des enzymes sont sujettes une inhibition par le produit, mais le principe continue sappliquer qualitativement mme si les produits se fixent plus fortement sur lenzyme que les substrats. Une seconde raison dutiliser une concentration de substrat aussi leve que possible dans un test enzymatique, dans les limites permises par le cot, la solubilit et linhibition par le produit, est que cette pratique minimise la sensibilit du test aux erreurs commises sur la concentration du substrat, non seulement au cours de la raction comme nous venons den discuter, mais aussi dune exprience lautre. Dans le cas o [ A ]0 = 0,1 K m, par exemple, les solutions devraient tre prpares avec infiniment de prcision, car une erreur de 10% commise sur la concentration de substrat ( [ A ]0 ) se traduit par une erreur denviron 10% sur la valeur mesure de la vitesse ; inversement, dans le cas o [ A ]0 = 10 K m , une prcision moindre serait exige dans la prparation des solutions, puisquune erreur de 10% commise sur [ A ]0 se traduit par une erreur infrieure 1% sur la mesure de la vitesse. Si des prcautions sont prises pour augmenter la linarit de la courbe davancement de la raction, il est toujours recommand dobserver la raction suffisamment longtemps pour que la courbure devienne visible. Mme si ces
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derniers moments de la raction ne sont pas utiliss dans la dtermination de la vitesse, leur prsence dans la courbe rduira la probabilit derreur due au traitement dune partie de la courbe comme si elle tait linaire, cest--dire que cela permettra de rduire la probabilit dune erreur similaire celle prsente dans la figure 4.1.
4.1.4. Les systmes coupls

Lorsque la raction tudie ne donne pas lieu un signal spectroscopique facilement mesurable, il est parfois possible de suivre la raction de manire indirecte en la couplant une autre raction. Considrons, par exemple, la raction de transfert dun groupe phosphate partir de lATP vers le glucose, catalyse par lhexokinase : Glucose 6-phosphate + ADP [4.1] Glucose + ATP Cette raction ne saccompagne daucun changement spectral utilisable, mais elle peut tre suivie par spectrophotomtrie, en la couplant la raction catalyse par la glucose 6-phosphate dshydrognase : 6-phosphogluconate + NADPred [4.2] Glucose 6-phosphate + NADPox Si lactivit de lenzyme couple est suffisamment leve pour que le glucose 6-phosphate soit oxyd aussi vite quil se forme, la conversion du NADox en NADred, enregistre laide dun spectrophotomtre, se droulera exactement la mme vitesse que la premire raction. Les conditions ncessaires pour que le systme coupl soit utilisable, peuvent tre exprimes dans des termes simples mais gnraux en utilisant le schma suivant : A [ A] v1 B [B] v2 C [C ] [4.3]
dans lequel la conversion de A en B la vitesse v1 est la raction tudie, et la conversion de B en C est la raction couple qui se droule la vitesse v2 et qui peut facilement tre suivie exprimentalement. Evidement les mesures de v2 fourniront une information prcise sur la valeur initiale de la vitesse v1 uniquement si un tat stationnaire pour la concentration de B est atteint avant que v1 ne commence diminuer perceptiblement par rapport sa valeur initiale. La plupart des traitements de ce systme (par exemple celui de MC CLURE, 1969) supposent que v2 ait une dpendance du premier ordre vis--vis de [ B ] , bien que cette condition soit irraliste, ne soit pas ncessaire et puisse mme conduire un gaspillage de matriel. Puisque la raction couple est gnralement catalyse par un enzyme, il est plus appropri de supposer que v2 dpende de [ B ] en accord avec lquation de MICHAELIS et MENTEN : V2 [ B ] v2 = [4.4] Km 2 + [ B ]
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dans laquelle lindice 2 indique que les valeurs de V2 et de Km2 sont les paramtres cintiques de MICHAELIS et MENTEN pour la seconde raction (la raction couple). Si v1 est une constante (comme cest approximativement le cas pendant la priode initiale de la raction tudie), lquation [4.5] exprimant la vitesse de variation de [ B ] avec le temps peut rapidement tre intgre (pour plus de dtails, voir STORER et CORNISH-BOWDEN, 1974) : V2 [ B ] d[ B ] = v1 v 2 = v1 [4.5] Km 2 + [ B ] dt A partir de cette quation, nous pouvons conclure que le temps t requis pour que v2 atteigne une fraction spcifie de v1 est donne par une quation de la forme suivante f Km 2 t = [4.6] v1 dans laquelle le paramtre f est un nombre sans dimension dpendant uniquement des rapports v2/v1 et v1/V2. Les valeurs de f permettant la mise au point dun systme coupl sont donnes dans le tableau 4.1. Le seul paramtre ajustable, V2, (Km2 tant fix par le choix de lenzyme couple et des conditions de raction) doit tre suffisamment grand pour que t reprsente une partie rduite du temps de mesure. Les valeurs donnes dans le tableau ont t calcules en supposant que v2 devrait atteindre au moins 99% de v1, bien que pour certaines applications cette condition ne soit pas rigoureusement ncessaire. Par exemple, si lon cherche dans un processus de purification reprer les fractions actives au cours de llution dune colonne de chromatographie, une valeur de 90% est largement suffisante.
Tableau 4.1 - Temps requis pour quun systme coupl atteigne un tat stationnaire v1 /V2 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 f 0,00 0,54 1,31 2,42 4,12 v1 /V2 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 f 6,86 11,7 21,4 45,5 141
Le tableau montre la valeur de f qui doit tre insre dans lquation [4.6] pour donner le temps ncessaire pour que la vitesse v2 mesure avec un systme coupl atteigne 99% de la vitesse cible v1. Par exemple, supposons que v1 soit de 0.1 mM min1, V2, la vitesse limite de la raction couple, est de 0,5 mM min1 et Km2, la constante de MICHAELIS de lenzyme coupl dans les conditions du test, est de 0,2 mM. Avec ces valeurs, le tableau donne f = 1,31 ; ainsi, le temps ncessaire pour que la vitesse mesure atteigne 99% de 0,1 mM min1 est de 1,31 0,2/0,1 min ou 2,62 min. Le tableau est la version abrge de celle prsente par STORER et CORNISH-BOWDEN (1974).
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Larticle original de STORER et CORNISH-BOWDEN (1974) dcrit comment les valeurs sont calcules et donne galement les rsultats pour v2/v1 = 0,90 et 0,95, en plus de ceux pour v2/v1 = 0,99, ainsi que pour une plus large gamme de valeurs de v1/V2 . La validit de ce traitement peut tre vrifie en mesurant la raction de couplage sur une certaine priode de temps et en dmontrant que la valeur v2 augmente de manire attendue. Un exemple dun tel test est prsent dans la figure 4.2. Dans cette exprience, la valeur de V2 a t dlibrment mal choisie (trop petite) afin de rendre la priode dacclration clairement observable.
Produit form (mM)
0,10
V2 = 0,304 mM min1
0,08
0,06
V2 = 0,122 mM min1
0,04
0,02
V2 = 0,0313 mM min1
0 0 1 2 3 4 5
Temps (minutes)
4.2 - Phase dacclration dun test coupl Les donnes sont celles de STORER et CORNISH-BOWDEN (1974) et correspondent au test de lhexokinase en utilisant la glucose 6-phosphate dshydrognase comme enzyme coupl. Les points exprimentaux prsentent (pour des duplica de dcours ractionnels chaque valeur de V2) les concentrations de NADred, le produit de la raction couple, diffrents temps aprs le dbut de la raction et pour 3 valeurs diffrentes de V2 comme indiqu. Les trois courbes prsentes nont pas t ajustes sur les donnes mais elles ont t calcules indpendamment partir des valeurs connues de V2, en accord avec la thorie prsente dans le texte qui suit.
Dans certains cas, mme si la raction mesure peut tre suivie en direct, il est parfois souhaitable de coupler la raction une seconde raction. Par exemple, si un des produits de la premire raction est un puissant inhibiteur, ou si une raction rversible est tudie dans le sens le moins favorable, de sorte que lquilibre est atteint aprs quune faible partie du substrat ait ragit, la mesure prcise de la vitesse initiale peut savrer difficile. Des problmes de ce genre peuvent tre rsolus en couplant la raction une raction irrversible qui limine le produit inhibiteur ou dplace lquilibre. Dans ces cas, les contraintes nonces
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prcdemment sappliquent, mais en utilisant une dfinition plus stricte de ltat stationnaire. A ltat stationnaire, la valeur de [ B ] dans le schma considr cidessus est obtenue en fixant v1 = v2 et en rsolvant lquation [4.4] pour [ B ] . Cette approche donne [ B ] = (Km2 v1)/(V2 v1) et permet de dterminer simplement quelle doit tre la valeur de V2 pour que la valeur de [ B ] ltat stationnaire ne soit pas suffisamment leve pour crer des problmes. Quelquefois, il est ncessaire de coupler une raction avec deux ou plusieurs enzymes. Par exemple, la mesure couple mentionne ci-dessus pour lhexokinase ne pourrait pas servir pour ltude de linhibition de lhexokinase par le glucose 6-phosphate parce que le systme nlimine pas uniquement le glucose 6-phosphate gnr par la raction, mais aussi celui ajout par lexprimentateur. Dans ce cas, il est ncessaire de coupler la production dADP loxydation du NADred en utilisant deux enzymes, la pyruvate kinase et la lactate dshydrognase : Pyruvate + ATP ADP + Phosphonolpyruvate Pyruvate + NADred Lactate + NADox
[4.7] [4.8]
Une analyse rigoureuse des systmes coupls impliquant deux ou plusieurs enzymes est difficile mais, qualitativement, ils ressemblent au cas simple que nous venons de considrer : il est ncessaire de sassurer que lactivit des enzymes couples est suffisamment leve pour que la vitesse mesure atteigne 99% de la vitesse ncessaire pendant la priode durant laquelle la vitesse reste effectivement constante. Ceci peut tre facilement vrifi par lexprience : si les concentrations des systmes coupls sont suffisamment leves, il ne devrait y avoir aucun effet sur la vitesse mesure quand ces concentrations sont doubles, et la vitesse observe devrait tre proportionnelle la concentration de lenzyme tudi sur la totalit de la gamme utilise. Comme la discut EASTERBY (1981), les temps ncessaires pour que deux ou plusieurs enzymes coupls atteignent leur tat stationnaire, sadditionnent et il est ainsi possible destimer raisonnablement le temps total ncessaire pour ltablissement dun tat stationnaire global. Dans tous les cas, il existe des raisons autres que celle du cot financier pour ne pas dpasser la concentration denzyme coupl strictement ncessaire pour raliser une mesure efficace. Sauf si lenzyme coupl a t purifi de manire aussi extensive que lenzyme tudi, il y a toujours le risque que la prparation denzyme coupl contienne des impurets qui pourraient perturber la mesure, et mme si lenzyme est pur, il peut avoir des activits parasites quil est souhaitable de minimiser. Par exemple, la glucose 6-phosphate dshydrognase catalyse la raction prsente dans lquation [4.2], mais possde aussi une faible activit vis-vis du glucose. Des dangers potentiels du mme type sont possibles avec tous les systmes coupls puisquun enzyme choisi de manire agir sur un substrat peut toujours avoir la capacit de ragir avec le produit.
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4.2. DTECTION DE LINACTIVATION DUN ENZYME

De nombreux enzymes sont plus stables fortes concentrations qu faibles concentrations, de sorte quil est courant quun enzyme perde rapidement son activit lorsquil est dilu partir dune solution stock. Ceci peut videmment conduire des erreurs dans lestimation du niveau gnral dactivit, mais de manire moins vidente, cela peut aussi conduire de mauvaises apprciations du type de comportement de lenzyme. Il est courant quun complexe enzyme-substrat soit plus stable que lenzyme libre, et en consquence les enzymes perdent souvent plus lentement leur activit en prsence de fortes concentrations de substrat. Si un tel comportement nest pas identifi, il peut tre confondu avec un effet coopratif (chapitre 9), puisquil se caractrise par des dviations de la vitesse initiale par rapport aux cintiques de MICHAELIS et MENTEN. Mme si leffet nest pas aussi srieux, lutilisation de conditions qui minimisent linactivation de lenzyme sont susceptibles de donner des rsultats plus reproductibles et dans de nombreux cas, il est utile de savoir si la diminution dactivit observe est entirement ou partiellement provoque par une perte dactivit enzymatique (plutt que par la disparition du substrat ou par une inhibition par le produit). SELWYN (1965) a dcrit un test simple permettant dviter ce problme. Il a montr quaussi longtemps que la vitesse d [ P ] / dt reste proportionnelle la concentration initiale denzyme [ E ]0 , cette vitesse peut tre exprime comme le produit de la constante [ E ]0 et dune fonction dpendante des concentrations instantanes de substrat, de produit, dinhibiteur et de toute autre espce (autre que lenzyme) qui peut tre prsente dans le mlange. Ces concentrations peuvent tre calcules partir de la stchiomtrie de la raction et de la concentration de [ P ] nimporte quel temps. Ainsi lquation de vitesse peut tre crite sous une forme simple : d[ P ] [4.9] = [ E ]0 f ([ P ]) dt o f est une fonction qui peut en principe tre drive partir de lquation de vitesse. Le fait que f soit difficile driver ou que son expression soit complique na pas dimportance, parce que la connaissance de la forme exacte de la fonction nest pas ncessaire. Il est seulement ncessaire de savoir quelle est indpendante de [ E ]0 et de t, et donc que la forme intgre de lquation [4.9] doit tre
[ E ]0 t = F ([ P ])
[4.10]
o F est une autre fonction. Limportance pratique de cette quation est quelle montre que la valeur de [ E ]0 t , aprs quune quantit donne de produit se soit forme, est indpendante de [ E ]0 . En consquence, si des courbes davancement de raction sont mesures pour diverses valeurs de [ E ]0 mais en maintenant identique le reste des conditions, les graphiques de [ P ] en fonction de [ E ]0 t
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devraient tre superposables quelle que soit la valeur de [ E ]0 . Sils ne le sont pas, lhypothse initiale selon laquelle la vitesse doit tre proportionnelle la concentration initiale denzyme durant toute la raction, est incorrecte. La figure 4.3 montre deux exemples de ces graphiques, un dans lequel les rsultats sont ceux attendus pour un test satisfaisant, lautre dans lequel les rsultats ne le sont pas.
Avancement de la raction (%) Glutamyl-ARN (pmol)
5,6 g mL1
100
0,4 : 1 : 2
50
2,8 g mL1 b - Les points se rpartissent sur deux courbes distinctes
a - Tous les points se situent sur une seule courbe

0 1 2 3
10
[E]0 t (units arbitraires)
[E]0 t (units arbitraires)
4.3 - Test dinactivation de SELWYN Dans une raction pour laquelle il ny a pas dinactivation apprciable de lenzyme pendant la priode dobservation, des graphiques de ltendue de la raction en fonction de [E]0t devraient tre superposables, comme dans le graphique (a), qui prsente les donnes de MICHAELIS et DAVIDSOHN (1911) pour linvertase trois concentrations diffrentes denzyme dans un rapport 0,4 : 1 : 2 comme indiqu. Si lenzyme sinactive au cours de la raction ou si le rapport nest pas strictement proportionnel [E]0, les graphiques ne sont pas superposables, comme dans le graphique (b), qui prsente les donnes de DEUTSCHER (1967) pour la glutamyl-ARN synthtase des concentration de 5,6 et 2,8 mg mL1.
La raison la plus simple pour laquelle le test de SELWYN peut tre ngatif comme dans la figure 4.3b, est que [ E ]0 varie au cours de la raction en raison dune perte dactivit de lenzyme. SELWYN (1965) a cependant rpertori dautres causes possibles, qui expliquent que le test est insatisfaisant ou quil est compliqu de manire telle quune tude supplmentaire est ncessaire avant que son utilisation routinire ne soit possible. Le test de SELWYN nest pas couramment utilis. Pendant les annes 1970 et 1980, cela pouvait tre justifi par le dveloppement des moyens et des conditions dans lesquelles les enzymes devaient tre utiliss pour viter leur inactivation. Aujourdhui, le dveloppement des techniques de biologie molculaire permet de produire des protines recombinantes modifies, qui, dans certains cas, sont moins stables que la protine originale. Cela cre un rel besoin de tester linactivation de ces enzymes pendant la raction, afin dviter de comparer les cintiques de raction catalyse par un enzyme stable avec les cintiques de raction catalyse par des variants moins stables susceptibles dintroduire certains artfacts.
129
Le principe de base sur lequel repose le test de SELWYN tait dj bien connu aux premiers temps de lenzymologie : les donnes prsentes dans la figure 4.3a sont celles de MICHAELIS et DAVIDSOHN (1911) et des donnes similaires sont fournies par HUDSON (1908) ; il est clair, de plus, selon la discussion donne par HALDANE (1930) que de tels tests taient appliqus lpoque de nombreux enzymes. Ds 1890, OSULLIVAN et TOMPSON ont comment que le temps ncessaire pour atteindre un pourcentage donn dinversion (cest--dire dhydrolyse du sucrose) est inversement proportionnel la quantit prsente de matriel invers ; en dautres termes, le temps est inversement proportionnel la quantit dagent inversant. En dpit de cela, le test a t largement oubli jusqu ce que SELWYN (1965) adapte le traitement donn par MICHAELIS et DAVIDSOHN (1911) et discute les diverses raisons possibles de son chec. On peut se demander combien de techniques aussi utiles restent caches dans la littrature ancienne.
4.3. CHOIX DES CONDITIONS EXPRIMENTALES

4.3.1. Choix des concentrations de substrat
Un expos complet de la mise au point dexpriences de cintique enzymatique serait trop long pour tre trait ici, et donc dans ce paragraphe nous prsenterons uniquement un guide bref et simplifi. En gnral, les conditions optimales pour tester lactivit dun enzyme, cest--dire pour dterminer la quantit dactivit catalytique dans un chantillon, ne correspondent pas aux conditions idales permettant de dterminer les paramtres cintiques. La raison est que dans un test dactivit enzymatique, nous cherchons obtenir des conditions o la vitesse mesure dpend uniquement de la concentration denzyme, de sorte que de faibles variations des autres paramtres aient peu deffet ; par contre dans une tude des proprits cintiques dun enzyme, il est ncessaire de dterminer comment celuici rpond aux changements de conditions. Il est essentiel dans ce dernier cas de travailler sur une large gamme de concentrations de substrat pour laquelle la vitesse varie de manire apprciable. En pratique, pour un enzyme qui obit lquation de MICHAELIS et MENTEN, cela signifie que les valeurs de [ A ] stendent bien en dessous et bien au dessus de Km. Si le systme tudi obit lquation de MICHAELIS et MENTEN, il est seulement ncessaire de dterminer quelle gamme de [ A ] est suffisante pour dfinir K m et V prcisment. Il est facile de dcider comment on peut dfinir V prcisment, en rappelant que v tend vers V lorsque [ A ] augmente ( 3.3) ; clairement, il est utile de raliser des mesures de v des concentrations de [ A ] aussi leves que le cot, la solubilit ou toute autre contrainte (comme une absorbance leve dans le cas dune mesure utilisant un spectromtre) le permettent. En principe, plus la concentration [ A ] utilise sera grande et meilleure sera la mesure, mais en ralit
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il existe deux raisons pour lesquelles ceci nest pas toujours vrai. Premirement, le respect de lquation de MICHAELIS et MENTEN peut ne pas tre absolu : beaucoup denzymes se caractrisent par une inhibition par le substrat pour des valeurs leves de [ A ] , et en consquence les valeurs de v mesures des concentrations leves peuvent ne pas tre en accord avec les valeurs de Km et de V qui dfinissent les cintiques des valeurs faibles et modres de [ A ] . Deuximement, mme si lquation de MICHAELIS et MENTEN est prcisment respecte, lavantage dinclure des valeurs de [ A ] suprieures 10 Km est faible et peut tre invalid par le cot additionnel que ces mesures reprsentent. De plus, si le substrat est un ion, il peut tre difficile dviter une variation de la force ionique lorsque des concentrations excessives sont utilises. Une limite sur la concentration maximale de substrat qui peut tre utilise est souvent impose par labsorbance spcifique du substrat ou du produit utilis pour la mesure dactivit. Par exemple, de nombreuses mesures dactivit enzymatique sont bases sur labsorbance du NADred 340 nm, qui est denviron 0,9 dans une cuve de 1 cm pour une solution de 0,15 mM. Ceci suggre que des mesures des concentrations suprieures soient difficiles, bien que lutilisation dune cuve de 0,2 cm permette dtendre la gamme de concentration de substrat dun facteur 5. Curieusement, les cuves de 1 cm de trajet optique sont devenues tellement familires que certains utilisateurs semblent ignorer cette possibilit dutiliser dautres longueurs de trajet optique. A loppos, des cuves de 5 ou 10 cm peuvent tre utiles pour suivre des solutions qui absorbent trs peu, bien que celles-ci puissent tre plus difficiles utiliser si leur utilisation ncessite la modification du spectrophotomtre. De la mme manire que la vitesse haute concentration de substrat est dtermine par V, la vitesse faible concentration est dtermine par V/K m (voir 3.3). Ds lors, pour que V/K m soit correctement dtermin, il est ncessaire de raliser des mesures de v des valeurs de [ A ] infrieures K m . Il nest pas ncessaire de chercher utiliser des valeurs de [ A ] aussi petites que possible, puisque la condition v = 0 impose pour [ A ] = 0 fournit un point fixe par lequel le graphique de v en fonction de [ A ] doit obligatoirement passer. Ds lors, il y a peu dintrt mesurer des valeurs de v des valeurs de [ A ] infrieures 0,2 K m. Sil existe un intrt quelconque, il dpend de la manire dont les erreurs sur v sont distribues : si v a une dviation standard constante, une valeur optimale pour le bas de la gamme des valeurs de [ A ] est environ 0,8 K m (la valeur exacte dpendant de la valeur suprieure de la gamme), mais si v a un coefficient constant de variation, la valeur optimale pour le bas de la gamme est zro (ENDRENYI, 1981). La valeur de 0,2 Km est un bon compromis, gnralement satisfaisant, entre ces deux situations. La dtermination de Km ncessite des valeurs prcises aussi bien de V que de V/Km ; donc la gamme de [ A ] devrait stendre de 0,2 K m jusqu 10 K m ou jusqu la concentration de A la plus leve possible.
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Il est difficile de ne pas souligner que les remarques faites ci-dessus sont inhrentes au respect du mcanisme de MICHAELIS et MENTEN, ou du moins que lon ne se soucie pas du respect de ce modle en dehors de la gamme de lexprience. Si nous nous intressons une raction dans des conditions physiologiques, il ny a pas de raisons de nous soucier des dviations par rapport un comportement simple qui peuvent survenir dans des conditions non-physiologiques ; nanmoins, si nous nous intressons au mcanisme cintique de la raction, il est souhaitable dtendre autant que possible la gamme de conditions utilises, puisque des dviations dans le comportement de lenzyme dans les conditions extrmes peuvent tre utiles pour ltablissement du mcanisme. HILL, WAIGHT et BARDSLEY (1977) ont discut le fait que trs peu denzymes (si du moins ils en existent certains) obissent rellement lquation de MICHAELIS et MENTEN. Ils pensent que le nombre limit de conditions exprimentales, associ au manque de volont de rendre compte de lobservation de faibles dviations vis--vis du comportement attendu, ont conduit une supposition injustifie que les cintiques enzymatiques obissaient de manire presque universelle lquation de MICHAELIS et MENTEN. Pratiquement, tous les exemples standards et traditionnels de cintiques simples se sont rvls, selon eux, plus complexes lorsque des tudes soigneuses ont t ralises. Lquation de MICHAELIS et MENTEN reste sans nul doute utile en premire approximation dans les tudes cintiques, mme si quelques fois des mesures prcises conduisent son rejet. Cependant, il est toujours conseill de vrifier labsence des dviations les plus communes. La vitesse initiale est-elle nulle en absence de substrat (et denzyme) ? Si ce nest pas le cas, la dviation est-elle suffisamment petite pour tre explique par les erreurs exprimentales ? Sil y a une variation rsiduelle du signal en absence de substrat ou denzyme, est-il possible de lliminer par purification ? La vitesse tend-elle vers zro pour des concentrations de substrat largement diffrentes de zro ? Dans ce cas, il sera utile de vrifier la cooprativit de la raction (voir chapitre 9). Existe-t-il une indication de linhibition par le substrat ou par le produit, par exemple, une diminution de v lorsque [ A ] augmente ? Mme si la vitesse ne diminue pas, une augmentation de v avec une concentration [ A ] plus faible que celle prvue par lquation de MICHAELIS et MENTEN peut indiquer une inhibition par le substrat.
4.3.2. Choix du pH, de la temprature et des autres conditions

Mme sil nest pas dans votre intention dtudier les dpendances de la raction enzymatique au pH ou la temprature, il est ncessaire de bien choisir les conditions dans lesquelles la raction est tudie. Pour de nombreuses applications, il est appropri de travailler dans des conditions proches des conditions physiologiques par exemple pH 7,5 - 37C et une force ionique de 0,15 M pour la plupart des enzymes produites par des mammifres mais il existe aussi de nombreuses bonnes raisons dutiliser dautres conditions dans ltude des
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mcanismes catalytiques. De nombreuses enzymes se dnaturent rapidement 37C et peuvent tre plus stables 25C (bien quil y ait des exceptions, de sorte que cette proprit ne doit pas tre considre comme une rgle universelle). Il est galement recommand de choisir un p H auquel la vitesse de la raction soit relativement insensible de faibles variations. Ceci se traduit parfois par la recommandation de travailler au pH optimum de lenzyme, mais nous verrons au chapitre 8, que cette recommandation peut tre sans fondement sauf si la valeur de Km est indpendante du pH. Si K m varie avec le pH, mme si le mcanisme obit lquation de MICHAELIS et MENTEN, la valeur maximale de V/Km napparatra pas au mme pH que la valeur maximale de V ; en consquence, le pH optimum varie avec la concentration de substrat. Dans ltude des ractions plusieurs substrats, la mise au point des conditions exprimentales est encore plus complexe que celle ncessaire pour les ractions un seul substrat, mais les principes restent les mmes. Chaque concentration de substrat doit varier sur une gamme suffisamment large pour que son effet soit manifeste sur la vitesse de la raction. Si la raction obit lquation de MICHAELIS et MENTEN lorsque la concentration dun des substrats varie alors que celle de tous les autres est maintenue constante, les valeurs mesures des paramtres de MICHAELIS et MENTEN sont des valeurs apparentes et sont susceptibles de changer lorsque les conditions changent. Pour obtenir un maximum dinformation, il est ncessaire de choisir une gamme de concentrations de substrat en relation avec le Km apparent et non avec la valeur limite de Km obtenue lorsque les autres substrats sont des concentrations proches de la saturation, ce qui peut tre sans intrt. Nous reviendrons sur ce point au chapitre 6 aprs avoir introduit les quations de base pour les ractions deux substrats. Des conditions similaires sappliquent aux tudes des inhibitions et seront discutes au chapitre 5.
4.3.3. Rplication des mesures

Dans une tude cintique, il nest pas rare que le meilleur modle qui puisse tre obtenu ne reprsente pas parfaitement chaque observation. La question se pose alors de savoir si les diffrences observes peuvent tre attribues aux erreurs exprimentales ou si elles traduisent la ncessit de recourir un modle plus complexe. Pour rpondre cette question, il est ncessaire destimer la grandeur des erreurs commises sur les mesures exprimentales. La manire la plus simple destimer la valeur des erreurs consiste rpliquer les observations. Si les observations rpliques sont plus en accord les unes avec les autres quavec la courbe ajuste, cela peut indiquer que la courbe ajuste est rejeter et quil faut introduire plus de termes dans lquation. Si, au contraire, les points exprimentaux montrent autant de variation entre eux quavec la courbe ajuste, lquation utilise pour lajustement peut tre accepte jusqu ce que des mesures plus prcises soient obtenues.
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La thorie sur laquelle repose cette approche dpend du fait que cest uniquement en rptant une exprience que nous pouvons dterminer si les donnes exprimentales sont en accord avec la courbe ajuste en l'absence derreurs alatoires. Ds lors, une telle pratique mesure uniquement les erreurs alatoires, qui sont galement appeles les erreurs pures pour, dans ce contexte, les distinguer du mauvais ajustement qui peut rsulter de lutilisation dune quation inadapte dans la procdure dajustement paramtrique. Nanmoins, le dsaccord entre les observations et la courbe ajuste peut rsulter soit dune erreur de mesure, soit de linadquation de la thorie et plus couramment encore dune combinaison des deux ; cette procdure ne mesure donc pas des erreurs pures. Lutilisation de rpliquas des mesures prsente galement certains inconvnients. Pour donner un rsultat significatif, la diffrence entre deux rpliquas doit tre rellement reprsentative de lerreur alatoire dans lensemble de lexprience. Ceci sera vrai uniquement si les mesures rptes sont ralises exactement de la mme manire que toutes les autres mesures et non de manire particulire. La difficult peut tre mieux apprcie en examinant les trois cas prsents dans la figure 4.4.
a - Dispersion alatoire y b - Replicas trop proches les uns des autres y c - Profil similaire dans chaque groupe y
4.4 - Utilisation dobservations rpliques Quand des observations sont proprement reproduites, la dispersion des points autour de la courbe ajuste devrait tre irrgulire, comme dans lexemple (a). Une distribution rgulire, comme dans les exemples (b) et (c), suggre que lexprience na pas t correctement ralise, comme nous en discutons dans le texte.
Dans la figure 4.4a, les points sont distribus dans chacun des rpliquas de la mme manire que les points sont distribus autour de la droite ajuste ; cest la situation qui est attendue si lajustement est correct et si les rpliquas ont t correctement mesurs. Dans la figure 4.4b, la distribution des rpliquas apparat plus troite que la distribution des mesures autour de la droite, mme si la distribution des points de part et dautre de cette dernire semble plus alatoire que systmatique. Il existe diffrentes causes possibles cette situation insatisfaisante : la plus courante est certainement la mesure successive des diffrents rpliquas dun mme point, de sorte que le temps moyen entre deux de ces mesures est court par rapport au temps moyen de lexprience. Si les mesures sont faites de cette manire, toute variation lente des conditions au cours de lexprience peut produire des erreurs qui ne sont pas rpercutes de manire approprie dans les rpliquas, par exemple une
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variation de linstrumentation, une dtrioration des solutions stocks, une augmentation de la temprature ambiante ou la fatigue de lexprimentateur. La figure 4.4c illustre le problme contraire. Dans ce cas, les points sont espacs rgulirement de manire suspicieuse, avec une distribution plus large que la distribution autour de la droite ajuste. Ceci suggre que les rptitions surestiment lerreur alatoire relle, peut tre parce que la figure prsente les donnes provenant de trois expriences ralises des moments diffrents et avec des chantillons diffrents. La question de savoir combien de fois une mesure doit tre rpte, na pas une seule et unique rponse. Dans chaque cas individuel, la rponse dpend de la difficult raliser la mesure, du temps pendant lequel les solutions denzyme et de substrat peuvent tre conserves, de la grandeur des erreurs exprimentales et de la complexit de lquation utilise pour lajustement. Le premier point essentiel est dinclure suffisamment de concentrations de substrat (dinhibiteur) pour caractriser correctement la forme de la courbe. Pour un enzyme qui obit lquation de MICHAELIS et MENTEN, il est possible de nutiliser que 5 concentrations de substrat condition quelles soient adquatement espaces entre 0,5 Km et 5 Km. Nanmoins avec un enzyme deux substrats, qui suit un modle cintique simple, il est ncessaire denregistrer un minimum de 25 combinaisons diffrentes de concentrations. Pour les enzymes dont le comportement dvie de celui prvu par un modle simple, le nombre de mesure doit encore tre augment. Ces chiffres sont bass sur lhypothse que lanalyse complte des donnes fournira des graphiques aussi bien que des analyses statistiques par un ordinateur. De le cas de ces dernires, il nest pas ncessaire dorganiser les concentrations dans une grille, puisque la validit de lanalyse nest pas affecte mme si le calcul dune droite appartenant une famille de droites est bas sur un seul point ; ainsi une exprience deux substrats pourrait en principe fournir des rsultats satisfaisants en utilisant seulement huit combinaisons diffrentes de concentrations. Le point important est de concentrer les observations dans les rgions qui fournissent la meilleure information permettant de valider le modle propos. Nanmoins, lil humain peut facilement reprer sur un graphique un comportement inattendu qui serait nglig par le meilleur des logiciels, et pour cette raison, il nest pas raisonnable de se reposer entirement sur lanalyse faite par lordinateur. Ces impratifs placent une contrainte sur la mise au point dexprience puisque, pour obtenir un graphique satisfaisant, il est ncessaire de disposer dun certain nombre de points pour tracer chaque droite. Ce nest que lorsque le nombre de combinaisons diffrentes de concentrations ncessaires pour lexprience a t dtermin, que le nombre de rptitions raliser peut tre dcid. Supposons que 25 combinaisons de concentrations soient ncessaires et quil soit possible de mesurer jusqu 60 cintiques sur le temps imparti et en fonction de la stabilit de la solution denzyme. Dans un tel cas, il serait appropri de raliser en triple une dizaine de mesures (tales sur toute
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lexprience et non localises dans le temps) et de doubler le reste. Si, dun autre ct, il nest pas possible de raliser plus de 30 mesures, il faudra rduire le nombre de rptitions. Il est stupide de dfendre une rgle stipulant que chaque mesure doit tre effectue 3 fois, non seulement parce que cela simplifie le problme, mais aussi parce que cela peut conduire des expriences dans lesquelles trop peu de conditions sont tudies pour obtenir linformation attendue.
4.4. TRAITEMENT DES QUILIBRES IONIQUES

Dans beaucoup de ractions biochimiques, le substrat nest pas un compos bien caractris dont la concentration est directement mesurable, mais est un ion en quilibre avec dautres ions ayant leurs propres interactions avec les enzymes catalysant les ractions. Le plus notable de ces ions est le MgATP2, qui est le vrai substrat de la majorit des enzymes regroups dans la catgorie des enzymes dpendantes de lATP. Il est impossible de prparer une solution de MgATP2, parce que toute solution contenant du MgATP2 contient aussi de nombreux autres ions. Par exemple, un mlange quimolaire dATP et de MgCl2 pH 7 contient des proportions apprciables de MgATP2, dATP4, de HATP3 , de Mg2+ et de Cl, ainsi que des traces de MgHATP, de Mg2ATP et de MgCl+. De plus, leurs proportions varient avec les concentrations totales dATP et de MgCl2, avec le pH, la force ionique et les concentrations dautres espces molculaires ventuellement prsentes (comme par exemple des composs de tampons). Manifestement, si nous tudions leffet de la concentration de MgATP2 , par exemple, sur un enzyme, nous devons nous assurer que les effets sont dus la variation de la concentration de MgATP2 et non celles des concentrations de Mg2+ ou dATP4 qui l'accompagnent. Il est donc ncessaire de disposer dune mthode permettant de calculer la composition dun mlange dions et il est souhaitable de disposer dun moyen permettant de modifier la concentration dune des espces sans modifier substantiellement la concentration des autres espces. Les constantes de dissociation de nombreux ions dintrt biochimique ont t dtermines. Il est donc facile de dterminer la concentration des complexes condition de connatre la concentration des divers composants sous forme libre. Malheureusement, on est gnralement confront au problme inverse qui consiste dterminer la concentration des formes libres en connaissant les concentrations totales des diffrents composs. Par exemple, il peut tre ncessaire, connaissant les concentrations totales dATP et de MgCl2, le pH et toutes les constantes dquilibre, de calculer la concentration de MgATP2. Une manire simple et efficace de procder est la suivante : 1. Nous supposons initialement quaucun complexe nest form et que toutes les espces ioniques sont compltement dissocies. Par exemple, nous supposons
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2.
3.
4.
5.
que le mlange de 1 mM ATP, 2 mM MgCl2 et de 100 mM KCl contienne 1 mM ATP4, 2 mM Mg2+, 100 mM K+ et 104 mM Cl. Nous utilisons ces concentrations et les constantes de dissociation pour calculer les concentrations de tous les complexes qui contiennent du Mg2+. Quand ces concentrations seront additionnes, la concentration totale en Mg2+ excdera (trs certainement de manire importante dans le premier cycle de calcul) la concentration totale relle de cet ion. Nous corrigeons la concentration de Mg2+ libre en la multipliant par la concentration relle en Mg2+ totale et en divisant par la concentration totale en Mg2+ calcule. Nous rptons cette opration pour chacun des composants du mlange, cest-dire pour ATP4, K+ et Cl dans cet exemple. En principe la concentration de H+ peut tre traite de la mme manire mais dans la pratique, la concentration de H+ libre est contrle et mesure directement de telle sorte que la concentration de H+ ne devrait pas tre corrige durant les calculs mais maintenue constante sa valeur relle. Nous rptons lensemble du cycle, de ltape 2 ltape 4, jusqu ce que les rsultats soient consistants avec eux-mmes, cest--dire jusqu ce que les concentrations ne varient plus dun cycle lautre.
Cette procdure est celle, lgrement modifie, qui a t propose par PERRIN (1965) et par PERRIN et SAYCE (1967). Bien que le nombre requis de cycles soit certainement trop important pour permettre un calcul manuel, la mthode peut facilement tre implmente dans un programme dordinateur (STORER et CORNISH-BOWDEN, 1976), et peut tre utilise facilement et efficacement pour les problmes couramment rencontrs dans les tudes de cintique enzymatique. Lexprience de lutilisation dun tel programme a permis de mettre au point une manire de varier la concentration de MgATP2 en conservant le contrle des variations de la concentration des autres ions. Deux approches sont couramment utilises, dont lune donne dexcellents rsultats et lautre de mauvais rsultats. La bonne mthode consiste maintenir la concentration totale de MgCl2 constamment en excs par rapport la concentration totale dATP. Les meilleurs rsultats sont obtenus avec une concentration en excs de 5 mM MgCl2, mais si lenzyme est inhibe par le Mg2+ libre ou sil existe dautres raisons pour rduire la concentration de Mg2+ libre, lexcs peut tre rduit jusqu 1 mM sans perte defficacit. Si lexcs est suprieur 10 mM, des problmes peuvent apparatre cause de la prsence dune concentration significative de Mg2ATP. Avec cette mthode, la concentration dATP peut varier sur une large gamme (allant de 1 M jusqu 0,1 M) avec une proportion importante et presque constante de lATP existant sous la forme de MgATP2 et une concentration presque constante de Mg2+ libre. Donc les effets dus la variation de la concentration de MgATP2 peuvent tre clairement spars de ceux dus la variation de Mg2+ libre.
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La mauvaise mthode, qui est malheureusement tout aussi couramment rencontre dans la littrature, consiste faire varier les concentrations totales dATP et de MgCl2 en maintenant leur rapport constant. Si le rapport est 1 : 1 ou nimporte quelle autre valeur, cette mthode conduit de grandes variations dans la proportion dATP prsente dans lune ou lautre forme et ne peut pas tre recommande. Bien que moins critiquable, mais nanmoins peu recommandable, il existe galement une mthode qui consiste garder constante la concentration totale de MgCl2 une valeur excdant de 2 5 mM la plus haute concentration dATP. Bien que cette mthode assure que lATP existe largement sous la forme de MgATP2, elle peut conduire de grandes variations dans les concentrations de Mg2+ libre et de Mg2ATP. Bien que les conclusions soulignes dans les paragraphes prcdents dpendent dune certaine manire des valeurs numriques des constantes dquilibre pour les complexes de Mg2+, dATP4 et de H+, les principes sont gnraux. Comme rgle grossire, un compos A dun complexe binaire AB existe largement sous la forme complexe si B est maintenu en excs par rapport A dune quantit correspondant environ 100 fois la valeur de la constante de dissociation. Dans cette discussion, nous avons simplifi le problme en ignorant le fait que les constantes ioniques dfinissent des rapports dactivits plutt que de concentrations. En pratique, pour viter les complications inhrentes lutilisation des coefficients dactivit, il est recommand de travailler force ionique constante. Une valeur de lordre de 0,15 M est approprie, la fois parce quelle est proche de la force ionique de nombreuses cellules vivantes et parce que de nombreux quilibres dintrt biochimique sont insensibles aux variations de la force ionique dans cette gamme de valeur.
PROBLMES
4.1 - Lhexokinase A de cerveau de mammifre est fortement inhibe par le glucose 6-phosphate des concentrations suprieures 0,1 mM. Quelle devrait tre la vitesse limite V2 de la glucose 6-phosphate dshydrognase (Km = 0,11 mM pour le glucose 6-phosphate) si cet enzyme tait utilis comme enzyme coupl dans un test pour lequel des vitesses v1 nexcdant pas 0,1 mM min1 devraient tre mesures et si la concentration de glucose 6-phosphate nexcdait jamais 0,1 mM ? 4.2 - Maintenir une concentration totale de MgCl2 de 5 mM en excs de la concentration totale dATP assure que les effets dus au MgATP2 et au Mg2+ peuvent tre clairement spars, parce que cette procdure permet une variation de la concentration de MgATP2 qui saccompagne de faibles variations concomitantes de la concentration de Mg2+ libre.
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CINTIQUE ENZYMATIQUE Cependant, cette approche ne permet pas une distinction sans quivoque entre les effets de MgATP2 et ceux de ATP4, parce que leurs concentrations respectives sont maintenues dans un rapport constant. Suggrer une approche qui permettrait de faire varier la concentration de MgATP2 avec de faibles variations de la concentration dATP4.
4.3 - Les valeurs suivantes des concentrations de produit, [ PA ] et [ PB ] (en M) et de temps t (en min) se rapportent deux tests raliss avec le mme enzyme, avec des mlanges ractionnels de composition identique, except que deux fois plus denzyme a t ajout dans l'exprience qui fournit les valeur de [ PA ] que dans celle qui fournit les valeurs [ PB ] . Suggrer une cause possible au comportement observ.
t
0 2 4 6 8 10 12
[ PA ]
0,0 10,5 18,0 23,7 27,9 31,3 34,0
[ PB ]
0,0 4,3 8,3 11,7 14,5 16,8 19,0
5 INHIBITION ET ACTIVATION DES ENZYMES

5.1. INHIBITION RVERSIBLE ET IRRVERSIBLE
5.1.1. Les poisons de la raction catalytique
Les substances qui, lorsquelles sont prsentes dans le mlange ractionnel, ralentissent une raction catalyse par un enzyme sont appeles des inhibiteurs. Linhibition peut intervenir de diverses manires et il existe donc divers types dinhibiteurs. Notamment, deux grands types dinhibition sont distingus, les inhibitions rversibles qui peuvent tre leves en liminant linhibiteur du milieu ractionnel et les inhibitions irrversibles qui impliquent gnralement la modification covalente dun groupe essentiel de lenzyme et qui ne peuvent tre leves par dialyse ou dilution. Dans ce chapitre, nous discutons dabord brivement des inhibiteurs irrversibles ou poisons catalytiques. Ceux-ci sont des substances qui, en se combinant avec lenzyme, liminent compltement son activit. De nombreux enzymes sont empoisonns par des traces de mtaux lourds, et pour cette raison, les tudes cintiques sont couramment ralises en prsence dagents complexant comme lEDTA. Ceci est particulirement important lors de la purification des enzymes : dans lextrait brut, la concentration totale de protine est leve et les nombreuses protines contaminantes squestrent la majorit des ions mtalliques qui sont prsents, mais plus une prparation denzyme devient pure et moins ce dernier est protg par les autres protines et donc plus il devient important dajouter des agents alternatifs de complexation. Dans certains cas, ces inhibiteurs irrversibles peuvent aussi tre utiliss de faon positive. Par exemple, lempoisonnement par les composs de mercure (II) a souvent t utilis pour mettre en vidence limplication de groupes sulfhydryles dans le site catalytique des enzymes.
5.1.2. Analyse de la vitesse dinactivation

Les mesures prcises de la vitesse laquelle la perte dactivit seffectue dans un processus dinhibition irrversible, fournissent une information utile qui est plus simple, et donc plus facile interprter, que celle fournie par les expriences conventionnelles de cintique. La thorie communment applique dans ce type dtude est celle dcrite par KITZ et WILSON (1962), qui sintressaient leffet de
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divers composs sur lactivit de lactylcholinestrase. Ces auteurs ont fait essentiellement les mmes hypothses que MICHAELIS et MENTEN (1913) pour le processus catalytique, cest--dire quils ont suppos que linactivation de lenzyme E par linhibiteur I se droule par lintermdiaire dun complexe EI qui est en quilibre avec E et I pendant lensemble de la raction et qui se convertit irrversiblement en une forme E' inactive : E + [ Eact ] [ x ] I [I] K1 EI [ x] k2 E' [5.1]
[ Eact ] reprsente la concentration totale de lenzyme actif, cest--dire incluant E, EI mais pas E'. Avec ces hypothses, la concentration de EI chaque instant est ([ Eact ] [ x ])[ I ] et la vitesse dinactivation v est donne par : donne par Ki V[ I ] v = k2 [ x ] = [5.2] Ki + [ I ]
dans laquelle V = k 2 [ Eact ] est la vitesse limite de linactivation obtenue pour des concentrations saturantes dinhibiteur. Il faut noter cependant que V nest pas une constante, puisque [ Eact ] diminue au cours de linhibition. Si linhibiteur est suffisamment en excs de telle sorte que [ I ] puisse tre considr comme une constante, la perte dactivit suit une loi de pseudo-premier ordre, et lanalyse par la mthode dcrite dans le 1.2.7 donnera une constante apparente de premier k2 [ I ] ordre kapp = . Comme celle-ci a la forme dune quation de MICHAELIS ( Ki + [ I ]) et MENTEN, on peut utiliser nimporte quelle mthode dcrite dans le chapitre 3 pour estimer les valeurs de k2 et de Ki partir des valeurs de kapp mesures pour diffrentes concentrations de I ( [ I ] ). Une extension de la mthode de KITZ et WILSON au cas o le substrat dun enzyme inhiberait son inactivation irrversible trouve dimportantes applications pour la mesure de constants relles de dissociation. Cependant, nous reporterons cette discussion jusquau 5.4.3, cest--dire jusqu ce que les cas principaux dinhibition linaire rversible aient t dcrits.
5.1.3. Types dinhibition rversible

Le reste de ce chapitre est consacr aux inhibiteurs rversibles. Ce sont des substances qui forment avec lenzyme des complexes dynamiques dont les proprits catalytiques sont diffrentes de celles de lenzyme libre. Si lenzyme na aucune activit catalytique lorsquil est compltement satur par linhibiteur, linhibition peut tre qualifie de complte, mais elle est plus souvent dnomme inhibition linaire, par rfrence lapparence linaire des graphiques des valeurs apparentes de Km V et 1 V en fonction de la concentration dinhibiteur. Un cas
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plus rarement envisag (bien quil ne soit probablement pas aussi rare quil e s t gnralement suppos) est celui o le complexe enzyme-inhibiteur conserve une certaine activit catalytique : ce type dinhibition est dnomm inhibition partielle, puisquune activit rsiduelle persiste quand lenzyme est entirement satur par linhibiteur, ou il est dnomm inhibition hyperbolique par rfrence la forme des courbes obtenues lorsque les paramtres apparents de MICHAELIS sont ports en graphique en fonction de la concentration dinhibiteur. Les cas dinhibition linaire aussi bien que ceux dinhibition hyperbolique peuvent tre sous-classs en fonction des paramtres apparents de MICHAELIS qui sont affects, mais en pratique ces dnominations font ordinairement rfrence aux cas dinhibition linaire. Le type le plus commun est habituellement appel inhibition comptitive bien que le terme inhibition spcifique soit plus appropri (parce quil est neutre dun point de vue mcanique mais est descriptif dun point de vue algbrique) ; il se caractrise par une diminution du paramtre apparent V Km sans variation du paramtre apparent V. Parce que linhibition comptitive avait t dcouverte avant quil nait t reconnu que les paramtres fondamentaux de lquation de MICHAELIS et MENTEN sont V et V Km , ce type dinhibition est souvent dcrit comme impliquant une augmentation de K m . Comme cela apparatra plus clairement dans la suite du texte (voir tableau 5.1), la classification des inhibiteurs est beaucoup plus simple et plus directe si elle est base sur les paramtres V et V Km . Les autres types dinhibition sont linhibition anti-comptitive ou inhibition catalytique dans laquelle le paramtre apparent V diminue sans que le paramtre V Km ne soit modifi, ce qui peut aussi tre exprim en disant que les paramtres apparents V et Km diminuent par un facteur identique et linhibition mixte dans laquelle les deux paramtres apparents, V et V Km , diminuent. Un dernier type, connu sous le nom dinhibition non-comptitive pure dans laquelle le paramtre apparent V diminue sans que K m ne soit modifi, a t considr par le pass comme un type important dinhibition, mais il a ensuite t reconnu quil correspond simplement un cas particulier de linhibition mixte. Tous ces types dinhibition sont dcrits plus en dtails dans ce chapitre.
5.2. INHIBITIONS LINAIRES

5.2.1. Inhibition comptitive (ou inhibition spcifique)
Dans la raction catalyse par la succinate dshydrognase , le succinate est oxyd en fumarate, comme illustr dans la figure 5.1. Puisquil sagit dune raction du groupe dimthylne, elle ne peut avoir lieu avec le malonate, qui ne possde pas de groupe dimthylne. Dun autre ct, le malonate a
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une structure trs proche de celle du succinate et il nest ds lors pas surprenant quil puisse se fixer sur lenzyme, dans le site de fixation du substrat pour former un complexe abortif, incapable de ragir.
CO2 CH2 CH2 CO2 succinate CO2 HC CH CO2 CO2 CH2 CO2
Bien que le succinate et le malonate aient une structure suffisamment proche pour se fixer sur le mme site de lenzyme, le malonate ne possde pas le groupement dimthylne qui lui permettrait de subir la raction de dshydrognation.
fumarate malonate
5.1 - Raction catalyse par la succinate dshydrognase
Cest un exemple dinhibition comptitive, ainsi appele puisque le substrat et linhibiteur sont en comptition pour le mme site de fixation. De manire gnrale, le mcanisme peut tre reprsent par le schma de la figure 5.2, dans lequel EI reprsente un complexe en cul-de-sac . La seule raction que puisse subir EI est sa dissociation pour redonner E et I. Selon largument qui sera dvelopp dans le 6.3.6, la concentration de ce complexe est dfinie partir de la constante dquilibre, Kic = ([ E ][ I ]) [ EI ] , qui est appele la constante dinhibition, ou plus explicitement, la constante dinhibition spcifique. Elle est plus simplement reprsente par le symbole Ki lorsque le caractre comptitif est hypothtique. Il est cependant important de noter que le schma de la figure 5.2 nest pas le seul qui puisse reprsenter une inhibition comptitive et que la constante dinhibition est quivalente une constante dquilibre uniquement parce quelle drive du mcanisme choisi et non parce quil sagit dune inhibition comptitive : il est parfaitement possible davoir une inhibition comptitive sans que la constante dinhibition ne soit une constante dquilibre. Dans de nombreux types dinhibition plus complexe, incluant la majorit des cas dinhibition par le produit, la constante dinhibition nest pas une constante dquiEI libre relle parce que le complexe enzymeinhibiteur ne constitue pas un cul-de-sac .
Kic A+E + I EA E+P
5.2 - Mcanisme dune inhibition comptitive
Lquation qui dfinit une inhibition linaire comptitive et qui sapplique non seulement au mcanisme de la figure 5.2 mais tout autre mcanisme dinhibition comptitive, est celle de lquation [5.3] : V [ A] [5.3] v = [ I ] Km 1 + + [ A] Kic
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dans laquelle [ I ] est la concentration dinhibiteur libre et V et K m ont leur signification habituelle. Lquation a la forme de lquation de MICHAELIS et MENTEN, cest--dire quelle peut scrire sous la forme suivante :
v =
V app [ A ] app Km + [ A ]
[5.4]
app o V app et Km sont les valeurs apparentes des paramtres V et K m qui sont donnes par les quations suivantes :
V app = V
[ I ] app Km = Km 1 + Kic
[5.5] [5.6] [5.7]
V Km V app = app 1 + ( [ I ] Kic ) Km
En consquence, leffet de linhibiteur comptitif est de diminuer la valeur apparente de V Km dun facteur 1+ ( [ I ] Kic ) tandis que la valeur de V reste inchange. Puisque les quations [5.5] [5.7] dfinissent linhibition comptitive sans gard pour le mcanisme impliqu et quelles montrent que leffet essentiel de linhibiteur comptitif est de rduire la constante apparente de spcificit, il serait prfrable dutiliser le terme inhibition spcifique. Dans le contexte o lactivation est galement considre, cela reprsenterait une amlioration importante de la terminologie, mais il nest pas raliste de demander aux biochimistes dabandonner un terme utilis depuis plus de 80 ans pour viter une confusion avec un phnomne moins courant dactivation spcifique. Pour cette raison, nous continuerons dutiliser le terme inhibition comptitive dans ce livre, bien que nous attirons lattention sur le fait quil sagit dune dfinition oprationnelle1, et non pas dune dfinition base sur un mcanisme, en accord avec les recommandations de l'IUPAC (1981) et de lIUBMB (IUB, 1982) concernant la terminologie cintique.
5.2.2. Inhibition mixte

Les prsentations les plus lmentaires des phnomnes dinhibition de lactivit enzymatique ne considrent que deux types : linhibition comptitive et linhibition non-comptitive.
1. Une dfinition oprationnelle exprime une observation, sans aucun gard vis--vis de la manire dont le phnomne est interprt, alors quune dfinition mcanique repose sur une interprtation. Les dfinitions mcaniques de comportements cintiques sont trs couramment utilises, mais leur dsavantage est que des observations ne peuvent tre dcrites qu partir du moment o elles ont t interprtes, alors quen recherche, on est souvent amen dcrire les observations avant quune interprtation satisfaisante ne soit obtenue.
144
Linhibition comptitive est un mcanisme authentique dinhibition, particulirement important dans la nature, mais linhibition non-comptitive se rencontre essentiellement dans les manuels denzymologie et nous nen discuterons pas de manire dtaille dans ce livre. Cette situation est ne du fait que MICHAELIS et ses collaborateurs, qui taient les premiers tudier les phnomnes dinhibition, considraient que certains inhibiteurs pouvaient agir en diminuant la valeur apparente de V sans modifier la valeur de K m. Un tel effet reprsentait une alternative vidente linhibition comptitive et elle a t dnomme inhibition non-comptitive. Il est difficile dimaginer une explication raisonnable pour un tel comportement : il serait ncessaire de supposer que linhibiteur interfre avec les proprits catalytiques de lenzyme sans avoir aucun effet sur la fixation du substrat ; en dautres termes cela signifierait que deux molcules avec des proprits diffrentes auraient des constantes identiques de fixation par lenzyme. Un tel comportement est possible pour des inhibiteurs de trs petite taille, comme des protons ou des ions mtalliques, mais semble hautement improbable dans les autres cas. Linhibition ou lactivation non-comptitive par des protons est, en ralit, un phnomne courant. Il existe plusieurs exemples dinhibition non-comptitive par des mtaux lourds, bien que certains de ceux-ci (sinon tous), soient en ralit des exemples dinhibition irrversible partielle, que nous dcrirons ci-dessous. Linhibition non-comptitive par dautres espces molculaires est trs rare, et les exemples les plus couramment cits, tel que linhibition de linvertase par la-glucose (NELSON et ANDERSON, 1926) et linhibition de larginase par diffrents composs (HUNTER et DOWNS, 1945) sont apparus, aprs examen des donnes originales, comme des exemples dinhibition mixte ou rsultent de la confusion entre une inhibition rversible non-comptitive et une inactivation irrversible partielle. En gnral, il est prfrable de considrer linhibition noncomptitive comme un cas particulier et peu intressant de linhibition mixte. Dans le cas dune inactivation irrversible partielle, il nest pas particulirement important de dterminer si leffet primaire de linactivation se marque sur V, V Km ou K m , parce que, quoiquil en soit, le rsultat net est une disparition de molcules denzyme du systme, les molcules non-affectes se comportant normalement. Cependant, comme V = k0 [ E ]0 est le produit de la constante catalytique k0 et de la concentration denzyme active [ E ]0 , la valeur de ce paramtre diminuera, que ce soit la valeur de k0 qui diminue (inhibition noncomptitive authentique) ou que ce soit la concentration denzyme actif qui diminue (inactivation irrversible partielle). Linhibition linaire mixte est un type dinhibition qui implique la fois des effets app catalytiques et des effets spcifiques, cest--dire quaussi bien V app Km que app varient avec la concentration dinhibiteur en accord avec les quations V suivantes : V V app = [5.8] 1 + ( [ I ] Kiu )

app Km =
145
Km 1 + ( [ I ] Kic ) 1 + ( [ I ] Kiu )
[5.9] [5.10]
V Km V app = app 1 + ( [ I ] Kic ) Km
Le mcanisme le plus simple qui puisse expliquer ce comportement est celui dans lequel linhibiteur peut se fixer la fois sur lenzyme libre pour donner un complexe EI avec une constante de dissociation K ic, et sur le complexe enzymesubstrat pour donner le complexe EAI avec une constante de dissociation Kiu, comme montr dans le schma de la figure 5.3. Dans ce schma, les deux ractions de fixation de linhibiteur sont considres comme des voies en cul-de-sac et sont donc des quilibres ( 6.3.6.3), mais comme EI et EAI existent, aucune raison mcanique vidente ne permettrait dexpliquer que A ne puisse pas se fixer sur le complexe EI pour former EAI. Si cette raction est incluse dans le mcanisme, lquation de vitesse est plus complexe et implique des termes en [ A ] 2 et [ I ] 2 . De tels termes sannulent uniquement si toutes les tapes de fixation ont atteint lquilibre, cest--dire si toutes les tapes de dissociation des substrats et des produits sont rapides par comparaison avec ltape de conversion de EA en produits, et aucune raison ne justifie une telle situation. Cependant, la dviation prdite par rapport des cintiques simples est difficile dtecter exprimentalement et lobissance une cintique A + EI EAI simple nest pas une preuve irrfutable dmontrant que K m , K ic et Kiu sont de vraies Kic Kiu constantes dquilibre de dissociation.
A+E + I EA + I E+P
5.3 - Mcanisme produisant une inhibition mixte
Bien quil soit pratique de dfinir linhibition mixte partir de la figure 5.3, ce type dinhibition est souvent rencontr dans le processus dinhibition par le produit. Si un produit est libr dans une tape qui gnre une forme denzyme diffrente de celle qui fixe le substrat, les prdictions indiquent que linhibition par le produit obit aux quations [5.8] [5.10]. Cette conclusion ne dpend pas des hypothses dquilibre, cest--dire quelle est une consquence ncessaire du traitement ltat stationnaire, comme il est facile de le dmontrer partir des mthodes qui seront dcrites dans le 6.3. Le plus simple parmi divers mcanismes de ce type est celui dans lequel le produit est libr dans la deuxime tape dun mcanisme en comportant trois, comme dcrit dans la figure 5.4.
Dans ce mcanisme aucune des deux constantes dinhibition nest une vritable constante dquilibre.
A+E
k1 k1
EA k3
k2 k2
E' + P
5.4 - Mcanisme dinhibition mixte par le produit
146
Des exemples plus complexes abondent dans les ractions impliquant plus dun substrat ou dun produit, comme nous le verrons dans le chapitre 6. Dans ces cas, lassimilation des constantes Kic et Kiu avec des constantes de dissociation nest pas utile. Mme dans un exemple aussi simple que celui de la figure 5.4, dans lequel le produit P agit comme un inhibiteur mixte plutt que comme un inhibiteur comptitif, puisquil se lie une forme de lenzyme diffrente de celle qui fixe A, les constantes ( k + k )k (k +k ) dinhibition sont donnes par Kic = 1 2 3 et Kiu = 2 3 , dont aucune k 1k 2 k 2 nest une vritable constante dquilibre sauf si k3 << k2. La raret avec laquelle les authentiques inhibitions non-comptitives sont rencontres a conduit quelques enzymologistes gnraliser ce terme pour englober tous les cas dinhibition mixte. Il ne semble pas y avoir davantage procder de la sorte : except quun terme court et non ambigu est remplac par un terme plus long et ambigu, ne faisant quajouter de la confusion une nomenclature qui est dj confuse. Pour viter toute ambigut, il est prfrable de rserver le terme dinhibition non-comptitive pour les rares cas o lon souhaite faire rfrence linhibition non-comptitive pure.
5.2.3. Linhibition anti-comptitive 2 (inhibition catalytique)

Linhibition anti-comptitive se manifeste par des effets opposs ceux de linhibition comptitive ; il sagit du cas o linhibiteur diminue la valeur apparente de V sans avoir deffet sur la valeur de V K m :
V app =
app Km =
V 1 + ( [ I ] Kiu )
Km 1 + ( [ I ] Kiu )
[5.11] [5.12] [5.13]
V app = V app Km Km
La constante dinhibition anti-comptitive Kiu peut tre reprsente simplement par Ki quand le caractre anti-comptitif est tabli, mais comme cela nest gnralement pas le cas, il est prfrable dutiliser le symbole le plus explicite. La comparaison des quations [5.11] [5.13] avec les quations [5.8] [5.10], montre que linhibition anti-comptitive est un cas limite de linhibition mixte dans lequel Kic
2. Bien que le terme anti-comptitive soit galement utilis par les anglo-saxons, ceux-ci prfrent gnralement utiliser le terme uncompetitive pour dnommer ce type dinhibition. Cette dernire dnomination nayant pas de traduction franaise simple et non-ambigu, nous avons choisi dutiliser ici le terme anticomptitive qui marque lopposition des effets sur V et V/Km vis--vis de linhibition comptitive.
147
tend vers linfini ; cest--dire pour lequel [ I ] Kic est ngligeable quelle que soit la valeur de [ I ] , et donc pour lequel ce terme disparat des quations [5.8] [5.10]. Cest donc le contraire de linhibition comptitive qui reprsente lautre cas limite de linhibition mixte o Kiu tend vers linfini. Linhibition anti-comptitive est galement, du moins en principe, le pendant de linhibition comptitive au point de vue du mcanisme ractionnel, puisque les mcanismes prdits pour ce type dinhibition impliquent que linhibiteur se fixe sur le complexe enzyme-substrat et non sur lenzyme libre. Un exemple dune grande importance clinique est linhibition de la monophosphatase du myo-inositol par lion Li+. Cet ion est utilis pour traiter certains cas de dpression et sa slectivit pour les cellules prsentant une activit excessive de transduction du signal est consistante avec le caractre anti-comptitif de linhibition (POLLACK et al., 1994). De tels mcanismes ne sont cependant pas particulirement communs et linhibition anti-comptitive se rencontre principalement comme un type dinhibition par le produit qui est commun dans les ractions impliquant plusieurs substrats et plusieurs produits. Le Comit de Nomenclature de lIUB (1982) a choisi dutiliser le terme uncompetitve pour dnommer ce type dinhibition. Nanmoins, comme nous en avons discut dans la note [2], ce terme na pas de traduction simple en franais. La dnomination anti-comptitive utilise ici, marque mieux le fait que ce type dinhibition se trouve loppos de linhibition comptitive et de nombreux manuels en langue anglaise, tel que celui de LAIDLER et BUNTING (1973), utilisent galement le terme anti-comptitif . Toutefois, lappellation inhibition anti-comptitive nest pas aussi fermement tablie que son oppose, et il y a de bonnes raisons de labandonner au profit du terme inhibition catalytique : le terme anti-comptitif nest pas utilis dans le langage courant et en pratique il est gnralement confondu avec le terme non-comptitif , lui-mme utilis de diverses manires dans la littrature biochimique ; linhibition anti-comptitive est beaucoup moins courante que linhibition comptitive et donc le terme ne peut pas tre valid par un usage universel.
5.2.4. Rsum des types dinhibition linaire

Les proprits des diffrents types dinhibition linaire sont rsumes dans le tableau 5.1. Elles sont faciles mmoriser pour peu que les points suivants soient pris en compte : Les deux cas limites sont linhibition comptitive (spcifique) et linhibition anticomptitive (catalytique) ; linhibition non-comptitive pure est simplement un cas spcial dinhibition mixte dans lequel les deux constantes dinhibition K ic et Kiu ont la mme valeur. app Les effets des inhibiteurs sur V app Km et sur V app sont simples et rguliers ; si les grandeurs de ces paramtres sont diminues par la prsence de linhibiteur, elles le sont respectivement par des facteurs 1+ ( [ I ] Kic ) et 1+ ( [ I ] Kiu ) .
148
app Les effets des inhibiteurs sur Km sont confus ; ils sont le plus facilement app app mmoriss en assimilant Km V app ( V app Km ) et non un paramtre part entire.
Tableau 5.1 - Caractristiques des inhibitions linaires Type dinhibition Comptitive
V app
V
V 1 + ( [ I ] K iu ) V 1 + ( [ I ] K iu ) V 1 + ( [ I ] K iu )
app V app Km
app Km
V Km 1 + ( [ I ] K ic ) V Km 1 + ( [ I ] K ic ) V Km 1 + ( [ I ] K ic )
Km 1 +
[ I ] K ic
Mixte
K m 1 + ( [ I ] K ic ) 1 + ( [ I ] K iu )
Km
Non-comptitive pure 3
Anti-comptitive
V Km
Km 1 + ( [ I ] K iu )
5.3. PRSENTATIONS GRAPHIQUES

DES RSULTATS DES INHIBITIONS
Chaque graphique dcrit dans le 3.5 peut tre utilis pour diagnostiquer le type dinhibition, puisque chacun fournit une estimation de la valeur apparente des paramtres cintiques. Par exemple, si des graphiques de [ A ] v en fonction de [ A ] sont tracs pour diffrentes concentrations dinhibiteur I, lordonne loriapp gine Km V app varie avec [ I ] sil y a une composante spcifique dans linhibition, alors que la pente 1 V app varie avec [ I ] sil y a une composante dinhibition catalytique. Alternativement, si des reprsentations linaires directes de V app en app fonction de Km sont ralises pour chaque valeur de [ I ] , le point dintersection commun se dplace dans une direction qui est caractristique du type dinhibition : pour linhibition comptitive, le dplacement sopre vers la droite ; pour linhibition anti-comptitive, le dplacement sopre vers lorigine des axes ; pour linhibition mixte, le dplacement est intermdiaire entre ces deux extrmes. Des exemples de ces diffrentes possibilits sont prsents schmatiquement dans la figure 5.5, et un exemple de rsultats exprimentaux est prsent dans la figure 5.6.
3. Puisque linhibition non-comptitive pure est simplement un cas spcial de linhibition mixte dans lequel les deux constantes dinhibition sont identiques, Kic = Kiu, il nest pas strictement ncessaire dutiliser ces deux symboles dans cette ligne du tableau. Nous lavons fait, cependant, pour prserver la rgularit des
app colonnes pour V app et V app K m .
149
V app V
V app
Comptitive
0
app Km
Mixte
0
app Km
V app
V app
Non-comptitive pure
0
Anti-comptitive
0
app Km
Km
Km
app
5.5 - Effets des diffrents types dinhibition sur la localisation du point dintersection des droites dans le graphique linaire direct (voir figure 3.14)
V app (M min1)
16
12
non-inhib
8
inhib
0,8
0,4
0,4
0,8
app Km (mM)
5.6 - Graphiques linaires directs pour le cas dune inhibition comptitive La figure provient de larticle dEISENTHAL et CORNISH-BOWDEN (1974) et montre des donnes dinhibition par lactyl-L-phnylalanine D-phnylalanine de lhydrolyse catalyse par la pepsine de la N-actyl-3,5-dinitro-L-tyrosyl-L-phnylalanine. Pour chaque concentration de substrat, la vitesse la plus leve est observe en absence dinhibiteur et la plus faible en prsence de 0,525 mM dinhibiteur.
Dautres graphiques sont ncessaires pour dterminer les valeurs relles des constantes dinhibition. Lapproche la plus simple consiste estimer les constantes
150
cintiques apparentes pour plusieurs concentrations dinhibiteur en utilisant les app mthodes dcrites dans le 3.5, et ensuite de tracer les graphiques de Km V app et de 1 V app en fonction de [ I ]. Dans chaque cas, le rsultat devrait tre une droite, app qui croise laxe des [ I ] une valeur gale Kic dans le graphique o Km V app est reprsent et qui croise laxe des [ I ] une valeur gale Kiu dans le graphique o 1 V app est reprsent. Il peut sembler plus naturel de dterminer la app valeur de K ic en portant en graphique Km en fonction de [ I ] plutt que app Km V app , mais cette pratique nest pas recommandable pour deux raisons. Elle est seulement valable si linhibition est comptitive et elle donne une courbe plutt quune droite si linhibition est mixte ; mme si linhibition est strictement comapp ptitive, cette reprsentation est beaucoup moins prcise puisque la valeur de Km app ne peut jamais tre estime aussi prcisment que celle de Km V app . Une autre mthode permettant destimer Kic, introduite par DIXON (1953), est aussi couramment utilise. Lquation complte pour linhibition mixte peut tre crite de la manire suivante : V [ A] [5.14] v = [ I ] [ I ] Km 1 + + [ A ] 1 + Kic Kiu En prenant la rciproque des deux cts de lquation et en introduisant les indices 1 et 2 pour distinguer les mesures ralises deux concentrations diffrentes de substrat, [ A ]1 et [ A ]2, nous obtenons les deux quations :
K [ A ]1 [ I ] m + Kic Kiu 1 = Km + [ A ]1 + v1 V [ A ]1 V [ A ]1 K [ A ]2 [ I ] m + Kic Kiu 1 = Km + [ A ]2 + V [ A ]2 v2 V [ A ]2
[5.15]
[5.16]
Ces deux quations indiquent que le graphique de 1 v en fonction de [ I ] une valeur constante de [ A ] est une droite. Si deux de ces droites sont dessines, partir de mesures ralises deux concentrations diffrentes de A, le point dintersection peut tre dtermin en fixant 1 v1 =1 v 2 :
K K [ A ]2 [ A ]1 [ I ] m + [ I ] m + Kic Kic Kiu Kiu Km + [ A ]1 Km + [ A ]2 = + + V [ A ]1 V [ A ]1 V [ A ]2 V [ A ]2

ou
[5.17] [5.18]
[ I ] Km 1 1 1 + = 0 V [ A ]1 [ A ]2 Kic
et ainsi, [ I ] = Kic et 1 v =
1 ( Kic Kiu ) au point dintersection. V
151
En principe, si plusieurs droites sont traces pour diffrentes valeurs de [ A ] , elles devraient toutes se couper au mme point ; en pratique, les erreurs exprimentales provoquent habituellement quelques variations. Il faut noter que les termes renfermant Kiu sliminent dans lquation de [5.17] pour donner lquation [5.18]. En consquence, le graphique de DIXON fournit une valeur de Kic quelle que soit la valeur de Kiu, cest--dire quil donne une mesure de la composante spcifique de linhibition que celle-ci soit comptitive, mixte ou purement non-comptitive. La coordonne horizontale du point dintersection ne permet pas de distinguer parmi ces trois possibilits, mais puisque les deux constantes dinhibition contribuent la dfinition de la coordonne verticale, la position de ce point par rapport laxe des abscisses donne une information qualitative : lintersection au-dessus de laxe indique que la composante comptitive de linhibition est plus forte que la composante anti-comptitive et vice versa. Dans le cas dune inhibition anti-comptitive, quand Kic est infini, le graphique de DIXON produit des droites parallles. Bien que le graphique de DIXON ne fournisse pas la valeur de la constante dinhibition anti-comptitive Kiu, une drivation similaire montre que cette constante peut tre obtenue en traant le graphique de [A] v en fonction de [ I ] plusieurs concentrations de A (CORNISH-BOWDEN, 1974). Dans ce cas, un ensemble diffrent de droites est obtenu, qui se croisent en un point o [ I ] = Kiu [ A ] Km 1 ( Kiu Kic ) . et = v V
Les deux types de graphique sont reprsents schmatiquement pour les diffrents types dinhibition dans la figure 5.7, et un exemple de rsultats exprimentaux est prsent dans la figure 5.8.
5.4. RELATION ENTRE LES CONSTANTES DINHIBITION ET LA CONCENTRATION DE DEMI-INHIBITION

En biochimie, il est habituel de rapporter les caractristiques dun inhibiteur en termes du type dinhibition impliqu et des constantes dinhibition, comme nous lavons fait jusqu prsent dans ce chapitre. Dun point de vue mcanique, il sagit de lapproche approprie, puisquelle se rapporte directement au mcanisme dinhibition qui est impliqu. Nanmoins, linhibition des enzymes est galement dune importance cruciale en pharmacologie, et pour des raisons videntes, les pharmacologistes sont beaucoup plus intresss par les effets de linhibition que par le mcanisme cintique. En consquence, il est trs courant en pharmacologie de caractriser un inhibiteur par la concentration [ I ] 0.5 qui rduit la vitesse de la raction dans les conditions utilises 50% de la vitesse en absence dinhibiteur.
152
Cette concentration [ I ] 0.5 nest gale aucune des constantes habituelles dinhibition, except dans le cas dune inhibition non-comptitive pure, qui est trs rarement rencontre dans la pratique (voir 5.2.2) pour constituer un exemple utile : en gnral, il est plus prudent de dire que [ I ] 0,5 nest pas une constante dinhibition et quil est ncessaire de connatre le type dinhibition pour la convertir en lune de ces constantes. CHENG et PRUSOFF (1973) et BRANDT, LAUX et YATES (1987) ont prsent des analyses dtailles de ces relations qui dcoulent de lquation habituelle pour une inhibition mixte (quation [5.12]).
a Comptitive 1/v b Comptitive [A]/v
1/V Kic 1/v Mixte Mixte

0
[I] [A]/v
[I]
1/(1 Kiu /Kic)V

0
Kiu [I]
0
Km(1 Kiu /Kic)V [I]
Kic 1/v Anti-comptitive [A]/v Anti-comptitive
Km/V
0
[I]
Kiu
[I]
5.7 - Dtermination des constantes dinhibition comptitive et anti-comptitive a - La valeur de Kic est donn par les graphiques de 1/v en fonction de [ I ] pour diffrentes valeurs de [A] (DIXON, 1953b). b - La valeur de Kiu est dtermine par les graphiques de [A] /v en fonction de [ I ] pour diffrentes valeurs de [A ] (CORNISH-BOWDEN, 1974). Dans le cas dune inhibition mixte, le point dintersection peut tre au-dessus de laxe dans le premier graphique et en dessous dans le second ou vice et versa. Il peut galement se situer sur laxe dans les deux graphiques si Kic = Kiu.
153
1/v (mM1min)
100
[MgATP2]/v (min)
60 8,8 2,58 1,72 0,645 0,344
40
50
20
10
10
20
30
10
20
30
[Glucose 6-phosphate] (mM)
[Glucose 6-phosphate] (mM)
5.8 - Inhibition de lhexokinase D par le glucose 6-phosphate (STORER et CORNISH-BOWDEN, 1977) porte en graphique comme dans la figure 5.7 Les concentrations de MgATP2 sont 8,8 mM (), 2,58 mM ( ), 1,72 mM ( ), 0,645 ( ) et 0,344 mM ( ). La combinaison des droites scantes dans le graphique (a) et des droites parallles dans le graphique (b) indique une inhibition comptitive avec Kic = 11,5 mM.
Si nous rarrangeons celle-ci pour trouver la valeur de [ I ] pour laquelle 1 v (dans un graphique de DIXON) ou [A] v (dans un graphique de [A] v en fonction de [ I ] ) est gal zro, nous obtenons la valeur suivante (CORTS et al., 2001) : Km + [ A ] [I] = [5.19] ( K m K ic ) + ( [ A ] Kiu ) Ce rsultat nest pas par lui-mme dune importance immdiate, mais si nous ignorons le signe ngatif et substituons la valeur positive rsultante dans lquation [5.14], le rsultat est une vitesse gale la moiti de la vitesse v0 en absence dinhibiteur : V [ A] v = = 0 ,5 v0 [5.20] 2( Km + [ A ]) Il dcoule de cette quation que lintersection avec laxe des abscisse, dans un graphique de DIXON ou dans un graphique de [A] v en fonction de [ I ] , est gale [ I ] 0,5, et que laisser tomber le signe ngatif de lquation [5.19] montre la dpendance exacte de [ I ] 0,5 vis--vis de la concentration de substrat et des autres paramtres : Km + [ A ] [ I ]0 ,5 = [5.21] ( K m K ic ) + ( [ A ] Kiu ) Ce rsultat peut galement tre obtenu en substituant vi = 0,5 v0 dans lquation [5.18].
154
5.5. INHIBITION PAR COMPTITION AVEC UN SUBSTRAT

5.5.1. Spcificit de lenzyme
Les tudes exprimentales des enzymes sont gnralement ralises avec un seul substrat prsent dans le mlange ractionnel, cest--dire en absence de substrat alternatif capable de subir la mme raction 4. En effet, la prsence de substrats en comptition complique lanalyse sans apporter dinformation supplmentaire celle obtenue en tudiant les deux substrats sparment. Cependant, ceci implique une diffrence majeure entre la pratique exprimentale et les conditions physiologiques dans lesquelles lenzyme fonctionne habituellement : la plupart des enzymes ne sont pas parfaitement spcifiques pour un seul substrat et doivent souvent choisir parmi les quelques-uns (et mme parfois quelques millions, comme dans lexemple [5.10]) qui sont disponibles simultanment. Pour tre significative dans le contexte physiologique, la spcificit dun enzyme doit tre dfinie en terme de lefficacit avec laquelle lenzyme est capable de discriminer entre plusieurs substrats prsents dans le mme mlange ractionnel. Ceci ne signifie pas quelle ne peut pas tre dtermine partir des paramtres cintiques de lenzyme pour les diffrents substrats individuels, mais cela signifie que ces paramtres doivent tre interprts correctement. Le cas le plus simple considrer est celui dans lequel sont en comptition deux substrats qui individuellement donnent des cintiques de MICHAELIS et MENTEN quand ils sont tudis sparment (figure 5.9). Il sagit dune version lgrement simplifie du mcanisme qui sera dcrit k2 k1 dans le 6.3.4. E+A EA E+P
k1 k'1 k'1 E + A' EA' k'2 E + P'
5.9 - Comptition entre substrats pour le mme enzyme
Il fournit la paire suivante dquations de vitesse :
d[ P ] v = = dt
V [ A] V [ A] Km = [ A ] [ A' ] [ A' ] Km 1 + + [ A ] 1 + K + K' K'm m m
[5.22]
4. Cette situation doit tre soigneusement distingue de celle o lenzyme ncessite deux ou plusieurs substrats pour que la raction puisse avoir lieu. Par exemple, lhexokinase catalyse une raction entre le glucose et lATP, dans laquelle glucose et ATP ne sont pas des substrats alternatifs mais sont tous les deux ncessaires pour la raction. Par contre, lhexokinase accepte galement le fructose et dautres hexoses la place du glucose et donc, si du glucose et du fructose sont prsents simultanment dans le mlange ractionnel, ces deux substrats sont en comptition lun avec lautre pour interagir avec lenzyme.
155
d [ P' ] v = = dt
V ' [ A' ] V ' [ A' ] K'm = [ A ] [ A' ] [ A] K'm 1 + + [ A' ] 1 + K + K' Km m m
[5.23]
dans lesquelles V = k 2 [ E ]0 et V ' = k' 2 [ E ]0 sont les vitesses limites et Km = ( k 1 + k 2 ) k1 et K'm = ( k' 1 + k' 2 ) k'1 sont les constantes de MICHAELIS pour les deux ractions prises isolment. Chacune de ces quations a la forme de lquation [5.3], lquation caractristique de linhibition comptitive ; ainsi, si nous mesurons la constante dinhibition spcifique pour un substrat en comptition en le traitant comme sil sagissait dun inhibiteur, la valeur qui est obtenue est celle de la constante de MICHAELIS. Ceci est illustr dans le tableau 5.2 qui montre les valeurs de K m pour les mauvais substrats de la fumarase dtermines directement ou par comptition. Dans chaque cas, les valeurs de K m mesures par les deux mthodes sont en accord dans les limites des erreurs exprimentales.
Tableau 5.2 - Paramtres cintiques pour les substrats de la fumarase Substrat Fluorofumarate Fumarate Chlorofumarate Bromofumarate Iodofumarate Mesaconate L-Tartrate k0 (s1) 2 700 800 20 2,8 0,043 0,023 0,93 Km (mM) 0,027 0,005 0,11 0,11 0,12 0,51 1,3 Ki (mM) 0,10 0,15 0,10 0,49 1,0
k0 1 (s mM1) Km
100 000 160 000 180 25 0,36 0,047 0,72
Les donnes proviennent de mesures ralises 25C dans un tampon pH 7,3. Les valeurs de la constante catalytique k0 (cest--dire V/E0, voir 3.3.3) et de Km ont t mesures par des expriences cintiques conventionnelles. Les valeurs dans la colonne intitule Ki sont des valeurs de Km, pour de mauvais substrats, mesures en traitant ceux-ci comme des inhibiteurs comptitifs de la raction utilisant le fumarate comme substrat. Le tableau est adapt daprs TEIPLE, HAAS et HILL (1968). La constante k0/Km est aussi appele constante de spcificit (kA).
Un point plus important noter partir des quations [5.22] et [5.23], qui est galement illustr par les donnes du tableau 5.2, est quelles fournissent les bases pour une dfinition rigoureuse de la spcificit dun enzyme. Considrons les paramtres pour le fluorofumarate et pour le fumarate. Si les deux ractions sont considres isolment, la valeur de k0 pour le fluorofumarate est environ trois fois plus leve que celle pour le fumarate. Cependant, la situation est inverse aux faibles concentrations, parce que la valeur de k0 Km est environ 60% plus leve pour le fumarate que pour le fluorofumarate. Lequel de ces rsultats est le plus fondamental, en dautres termes, quel est le substrat le plus spcifique ? La question
156
peut apparatre comme un simple problme de dfinition, mais une rponse claire et satisfaisante ne peut tre apporte qui si nous ralisons quil est artificiel de considrer les deux substrats isols lun de lautre. Afin de dterminer la spcificit dans un contexte physiologique, nous devons considrer la proportion de la raction impliquant chaque substrat lorsque ceux-ci sont mlangs, une information qui peut tre dtermine en divisant lquation [5.22] par lquation [5.23] :
k0 V [ A] [ A] Km k [ A] v = d [ P ] = Km = A = k'0 V' k' A [ A' ] v' d [ P' ] [ A' ] [ A' ] K'm K'm
[5.24]
Jusqu prsent lutilisation du nom constante de spcificit pour dsigner le paramtre k A = k0 Km (introduit dans le 3.3.4) pouvait sembler arbitraire, mais lquation [5.24] rvle que cest ce paramtre qui dfinit le rapport des vitesses dans une situation o il y a une comptition entre substrats prsents simultanment dans le mlange ractionnel, et que donc il exprime la capacit dun enzyme discriminer les diffrents substrats. Ds lors, dans un mlange quimolaire de fumarate et de fluorofumarate, quelle que soit leur concentration, la vitesse dhydratation du fumarate catalyse par la fumarase est 60% plus rapide que celle du fluorofumarate. Le fumarate est le substrat le plus spcifique.
5.5.2. Test du droulement simultan de deux ractions

A partir des quations [5.22] et [5.23], la vitesse globale vtot = v + v' pour les deux ractions en comptition peut tre exprime de la manire suivante :
vtot
V' V [ A' ] [ A]+ K'm Km = v + v' = [ A ] [ A' ] 1+ + Km K'm
[5.25]
Supposons maintenant que des concentrations de rfrence, [ A ] = [ A ]0 et [ A' ] = [ A' ]0 , sont obtenues (exprimentalement) de telle sorte que :
V [ A ]0 V ' [ A' ]0 = = v Km + [ A ]0 K'm + [ A' ]0
[5.26]
cest--dire quil existe des concentrations de chacun des substrats qui donnent la mme vitesse ( la mme concentration denzyme) lorsque lautre substrat est absent. Si une srie de mlanges est prpare dans laquelle les concentrations sont interpoles linairement entre zro et leur concentration de rfrence, cest--dire :
[ A ] = ( 1 r )[ A ]0 [ A' ] = r [ A' ]0
[5.27]
157
alors lquation [5.26] prend la forme suivante :
vtot
V' V r [ A' ]0 ( 1 r )[ A ]0 + K'm Km = ( 1 - r )[ A ]0 r [ A' ]0 + 1+ Km K'm

V' V ( 1 r )[ A ]0 + r [ A' ]0 K'm Km = [ A' ]0 [ A ]0 ( 1 r ) 1 + + r 1 + K'm Km
vtot
vtot
[ A' ]0 [ A ]0 v0 ( 1 r ) 1 + + r 1 + Km K'm = v = [ A' ]0 [ A ]0 + r 1 + ( 1 r ) 1 + K'm Km
[5.28]
La troisime forme de cette quation provient de la seconde en utilisant lquation [5.26] pour substituer V [ A ]0 Km par v0 1+ ( [ A ]0 Km ) , et V ' [ A' ]0 K'm de
manire similaire. En conclusion, si les quations [5.22] et [5.23] sont valables, la vitesse totale pour les mlanges prpars en accord avec lquation [5.27] est indpendante des proportions de chacun des substrats dans le mlange. Un graphique de vtot en fonction de r, connu sous le nom de graphique de comptition, fournit alors un test permettant de dterminer si les deux substrats sont en comptition pour le mme site actif de lenzyme. Lexamen dune plus large gamme de modles possibles que celui dcrit par les quations [5.21] et [5.22], montre quil existe essentiellement trois possibilits (CHEVILLARD, CRDENAS et CORNISHBOWDEN, 1993) : 1. La comptition pour un seul site - Le graphique ne montre aucune dpendance de vtot sur r, cest--dire quil donne une droite horizontale, comme illustr dans la figure 5.10a dans le cas de la comptition entre le glucose et le fructose pour le site actif de lhexokinase de levure. 2. Les ractions se droulent dans des sites spars - Si les deux ractions sont compltement spares sans quil ny ait dinteraction entre un des enzymes et le substrat de lautre enzyme, le graphique apparat comme une courbe passant par un maximum. En ralit, il sagit l dun cas extrme, parce que si les deux substrats partagent quelques similarits, on sattend ce que chacun inhibe lenzyme pour lautre substrat. Cependant, tant donn que chaque substrat se fixe plus fortement sur son propre enzyme que sur lautre, le comportement est qualitativement identique, cest--dire que le graphique a la forme dune courbe passant par un maximum, comme illustr dans la figure 5.10b pour la phosphorylation du glucose et du galactose par un mlange dhexokinase et de galactokinase.
158
3. Les ractions sont antagonistes - Si les deux substrats ragissent sur des sites diffrents mais que chacun se fixe plus fortement sur le mauvais site que sur le bon, le graphique apparat comme une courbe passant par un minimum. Un tel cas nest cependant pas trs couramment rencontr dans la pratique.
a
1,5 0 0,5
[Glucose] (mM)
1 0,5 1 0
b
1,5 0
[Glucose] (mM)
1 1 0,5 0 2
[Fructose] (mM)
v (M/s) v (M/s)
0,4 0,4
[Galactose] (mM)
0,2
0,2
a - Le glucose et le fructose ragissent sur le mme site : la vitesse est identique pour des substrats purs ou pour un mlange.
0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0
b - Le glucose et le galactose ragissent sur des sites diffrents : la vitesse est plus leve avec un mlange qu'avec les substrats purs.
0,2 0,4 0,6 0,8 1
5.10 - Graphiques de comptition Les donnes de CHEVILLARD, CRDENAS et CORNISH-BOWDEN (1993) pour la phosphorylation de mlanges glucose/fructose par lhexokinase de levure (a), et de mlanges glucose/galactose pour un mlange dhexokinase et de galactokinase de levure (b). Dans les deux cas, les mlanges sont construits de sorte que la vitesse mesure est la mme pour les substrats purs (voir le texte pour plus de dtails). Si les deux substrats sont en comptition pour le mme site, la vitesse est indpendante de la proportion des substrats, comme dans (a) ; quand les ractions se droulent sur des sites distincts, avec peu ou pas dinhibition croise, la vitesse pour les mlanges dintermdiaires devrait tre suprieure celle pour les substrats purs comme dans (b).
5.5.3. Protection par le substrat

La prsence du substrat de lenzyme a souvent pour effet de protger lenzyme contre linactivation par un inhibiteur irrversible ; en dautres termes, le substrat agit comme un inhibiteur de la raction dinactivation. Si la raction normale du substrat est capable de se drouler (soit quil sagisse dun systme un seul substrat ou que les autres composants ncessaires, comme par exemple leau, soient galement prsents), le schma ractionnel prsent dans la figure 5.11 peut tre considr comme la combinaison dun schma reprsentant la comptition entre substrats et d'un schma de KITZ-WILSON pour linactivation de lenzyme (q. [5.1]).
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5.11 - Protection dun enzyme par son substrat
E+I E+A
EI EA
E' (inactive) E-P
De la mme manire, lquation de vitesse correspondante est obtenue comme la combinaison des quations [5.2] et [5.19] : V[ I ] [5.29] v = [ A] Ki 1 + +[ I ] Km La similitude entre cette quation et lquation [5.3] est manifeste, bien que pour viter toute confusion il faille souligner que, dans lquation [5.29] les rles habituels du substrat et de linhibiteur sont inverss, et que v reprsente la vitesse de la perte dactivit et non la vitesse de la raction catalyse par lenzyme. En consquence, il est possible de dterminer Km par les mthodes que lon utilise pour mesurer K ic dans les cas ordinaires dinhibition comptitive, condition que nous nous rappellions que V nest pas une constante, puisque la valeur de ce paramtre diminue au cours de linactivation : ainsi il faut dabord obtenir une valeur apparente de la constante dinhibition, Kiapp , par la mthode dcrite dans le 5.1.2 pour ensuite obtenir la valeur de Km partir de la dpendance linaire vis--vis de la concentration de substrat A, Kiapp = Ki 1 + ( [ A ] Km ) .
En tant que mthode permettant de dterminer la valeur de Km, celle-ci ne semble pas possder davantage particulier sur les mthodes conventionnelles. Son importance rside dans la possibilit de ltendre au cas o A est le premier substrat dune raction qui ne peut pas se drouler en absence des autres substrats (voir 6.5.1). Dans ce cas, la fixation du substrat dans lexprience dinactivation est un simple quilibre, et lanalyse fournit une mesure de la vraie constante de dissociation K, plutt que celle de Km. Cette approche ncessite seulement des quantits catalytiques denzyme et a t applique ltude de plusieurs enzymes (voir, par exemple, MALCOLM et RADDA, 1970 ; ANDERTON et RABIN, 1970) qui ntaient pas disponibles en quantits suffisantes pour utiliser la dialyse lquilibre ou une autres mthode de fixation lquilibre.
5.6. ACTIVATION DES ENZYMES

5.6.1. Diverses utilisations du terme activation
Toute discussion de lactivation des ractions catalyses par des enzymes est complique par le fait que ce terme a t utilis en enzymologie avec diverses significations. Nous lutilisons ici comme le contraire de linhibition rversible : un activateur est une espce molculaire qui, en se combinant avec lenzyme, a pour
160
effet daugmenter son activit, sans que lui-mme ne subisse de raction. Dautres processus qui sont couramment qualifis dactivation sont repris ci-dessous, mais ne seront pas discuts davantage dans ce manuel : 1. Plusieurs enzymes, principalement des enzymes cataboliques extracellulaires comme la pepsine, sont secrts sous la forme de prcurseurs inactifs, aussi appels zymognes, le pepsinogne dans le cas de la pepsine. Ces derniers sont convertis en enzyme actifs par protolyse partielle, un processus qui est quelquefois appel activation des zymognes . 2. Plusieurs enzymes importants dans les rgulations mtaboliques, comme les phosphorylases, existent dans la cellule dans des tats actif et inactif (dans ce cas, respectivement phosphorylase a et phosphorylase b). Ces tats diffrent gnralement par la prsence ou labsence dun groupement phosphate (voir 10.9.2). La conversion entre ces deux tats ncessite deux ractions spares, le transfert dun groupe phosphate partir de lATP dans une direction et llimination dun groupe phosphate par hydrolyse dans lautre : ces processus ne correspondent videmment pas lactivation et linhibition telles quelles sont dfinies dans ce livre. 3. De nombreuses ractions sont dites actives par un ion mtallique quand en ralit, lion mtallique fait partie du substrat. Par exemple, presque toutes les kinases ATP-dpendantes sont actives par le Mg2 +, non pas cause de leffet du Mg2+ sur lenzyme lui-mme, mais parce que le vrai substrat est lion MgATP2 et non lATP4 qui est la forme sans mtal la plus abondante en solution pH physiologique. Par exemple, bien que lhexokinase D de foie de rat utilise MgATP2 comme substrat, le Mg2+ libre est en ralit un inhibiteur et non un activateur, tout comme lATP4 est un inhibiteur et non un substrat (STORER et CORNISH-BOWDEN, 1977). Bien que ce type de confusion soit comprhensible, si nous considrons lATP comme un ractif dans des ractions qui normalement impliquent MgATP2 , il est prfrable dviter ce type de problme en exprimant les rsultats en termes des espces rellement impliques et en rservant lutilisation du terme activation pour dcrire les effets sur lenzyme. De part limportance du MgATP2 dans les ractions mtaboliques, nous avons consacr le 4.4 de ce livre la discussion des mthodes assurant le contrle de sa concentration.
5.6.2. Activation spcifique

Le type le plus simple dactivation vraie est lactivation spcifique (quelquefois appele activation obligatoire) dans laquelle lenzyme libre, sans activateur fix, na aucune activit et est incapable de fixer le substrat. Cette situation est reprsente dans la figure 5.12 o lactivateur est dsign par la lettre X. Les constantes de vitesse sont notes avec des primes pour souligner quelles font rfrence lenzyme ayant fix lactivateur.
161
Ce schma est similaire celui de linhibition spcifique (comptitive), et il donne une quation de vitesse de forme similaire : V' [ A ] v = [5.30] KX K'm ( 1 + )+ [ A] [X] dans laquelle V ' = k' 2 [ E ]0 et K'm = ( k' 1 + k' 2 ) k'1 sont respectivement la vitesse limite et la constante de MICHAELIS pour lenzyme activ EX, et [ X ] est la concentration de lactivateur. Cette quation diffre de celle de linhibition comptitive (Equation [5.3]) par le remplacement de [ I ] Kic par KX [ X ] . Ainsi, la vitesse est nulle en absence dactivateur, comme le mcanisme k'2 k'1 le laisse prvoir. A + EX EAX EX + P
k'1 KX
5.12 Mcanisme produisant une activation spcifique
E + X
En dpit de cette similitude de forme entre linhibition et lactivation spcifique, il existe cependant une diffrence importante quant leur plausibilit. Parce quun inhibiteur spcifique est conu pour se fixer la mme place que le substrat sur lenzyme, il est facile dimaginer que linhibiteur et le substrat ne peuvent pas se fixer simultanment sur lenzyme ; ds lors, on comprend aisment pourquoi linhibition spcifique est un phnomne commun. Par contre, il est moins facile de visualiser un enzyme qui ne puisse pas fixer son substrat en absence dactivateur. Surtout lorsque lon sait quun des activateurs les plus courants est le proton, dont lencombrement strique est trs faible. En consquence, lactivation spcifique simple est beaucoup moins frquente que linhibition spcifique ; elle est essentiellement utile comme introduction aux types plus complexes dactivation, qui malheureusement ncessitent des quations de vitesse plus complexes. Un point important noter dans cette discussion est quil ny a rien dans le modle de la figure 5.12 qui suggre une quelconque forme de comptition et donc en dpit de la similitude des quations, une dsignation telle qu activation comptitive est injustifie et introduirait une vritable confusion dans de nombreuses situations. Malheureusement, des expressions qui dnotent la relation algbrique sans introduire dabsurdit quant au mcanisme, comme activation analogue de linhibition comptitive ont tendance tre tellement incommodes que la tentation dutiliser une forme plus courte devient irrsistible. Dans ce cas, le terme comptitive appliqu lactivation devrait toujours tre plac entre guillemets, et son utilisation dans n'importe quel contexte devrait toujours saccompagner dune explication sur sa signification. Une meilleure solution consiste utiliser le terme spcifique
162
la fois pour lactivation et pour linhibition, quand les deux types deffets sont considrs, mme si le terme plus familier dinhibition comptitive est conserv lorsque lactivation nest pas considre. Le type le plus simple dactivation qui soit plausible dun point de vue mcanique est la contrepartie de linhibition mixte, comme prsent dans la figure 5.13. Dans ce cas, lactivateur nest pas ncessaire k'1 k'2 pour la fixation du substrat, mais seuleA + EX EAX EX + P ment pour la catalyse. k'1
KX A+E + X k1 k1 K'X EA + X
5.13 - Mcanisme produisant une activation mixte
Lquation de vitesse est analogue celle de linhibition mixte :
v =
V' [ A ] K K' K'm 1 + X + [ A ] 1 + X [ X ] [ X ]
[5.31]
et fournit des expressions analogues pour les paramtres apparents (voir quations [5.8] [5.10]) : V' V app = [5.32] K'X 1+ [X]
app Km
K Km 1 + X [ X ] = K' 1+ X [X]
app
[5.33]
V app Km
V' K'm = K 1+ X [X]
[5.34]
Essentiellement les mmes graphiques et les mmes mthodes peuvent tre utiliss pour tudier les phnomnes dactivation que ceux utiliss pour tudier les phnomnes dinhibitions linaires ( 5.3), en remplaant partout [ I ] par 1 [ X ] , Kic par 1 KX et K i u par 1 K'X . Par exemple KX peut tre dtermin partir dun graphique analogue du graphique de DIXON dans lequel 1 v est port en graphique en fonction de 1 [ X ] pour deux ou plusieurs concentrations de A ; labscisse du point dintersection des droites rsultantes donne 1 KX .
163
5.6.3. Activation et inhibition hyperboliques

En pratique, les activateurs se comportent souvent dune manire plus complexe que celle suggre par lquation [5.31], parce quune certaine activit peut persister en absence dactivateur. Si cela est le cas, mais que les constantes de vitesse des deux formes de lenzyme sont diffrentes, le mcanisme peut tre reprsent par le modle de la figure 5.14.
Ce mcanisme peut produire une inhibition ou une activation hyperbolique ou une combinaison des deux. Tous les mcanismes simples dinhibition et dactivation (except pour linhibition par le produit) sont des cas spciaux de ce type de mcanisme.
A + EX KX A+E + X
k'1 k'1 k1 k1
EAX K'X EA + X
k'2
EX + P
k2
E+P
5.14 - Mcanisme gnral de modification de lactivit
Plusieurs points importants sont noter au sujet de ce mcanisme. Premirement, les tapes de dissociation de lactivateur ne sont pas des culs-de-sac et donc ne sont pas obligatoirement lquilibre. Cependant si cela est pris en compte, le comportement cintique devient plus compliqu et donc pour la discussion qui suit, nous considrerons des quations de vitesse dans le cas o les tapes de dissociation du substrat et de lactivateur sont lquilibre. Deuximement, le schma ne reprsente pas obligatoirement un mcanisme dactivation : il peut galement reprsenter un mcanisme dinhibition si le complexe EX est moins ractionnel que lenzyme libre. En ralit, la situation est mme plus complexe puisque les conditions, qui dcident si X est un activateur ou un inhibiteur, peuvent varier en fonction de la gamme considre de concentration du substrat : si k 2 > k' 2 , alors X est inhibiteur aux concentrations leves de substrat ; si k1 k 2 ( k 1 + k 2 ) > k'1 k' 2 ( k' 1 + k' 2 ) alors X est inhibiteur aux concentrations faibles de substrat ; ce nest que si ces deux ingalits sont vrifies que le comportement est consistant sur toute la gamme de concentration du substrat. Pour tenir compte de cette dualit possible dans le comportement cintique, le modle de la figure 5.12 peut tre qualifi de mcanisme gnral de modification, o modification est un terme qui reprend la fois linhibition et lactivation. Une analyse complte du mcanisme fait apparatre que les graphiques de 1 V app app et de Km V app en fonction de la concentration dinhibiteur ( [ I ] ) ou de la rciproque de la concentration dactivateur ( 1 [ X ] ) ne sont pas des droites mais des hyperboles rectangulaires, et pour cette raison, ces comportements sont appels activation hyperbolique et inhibition hyperbolique 5. Tout ceci peut sembler trop
5. Les termes dactivation partielle ou dinhibition partielle sont quelquefois utiliss pour souligner le fait quune certaine activit persiste mme en absence complte dactivateur ou saturation dinhibiteur.
164
compliqu pour une prsentation lmentaire (mme sans se proccuper du fait que ltape de fixation ne devrait pas tre strictement traite comme un quilibre). Nanmoins les effets hyperboliques ne devraient pas tre oublis compltement et la figure 5.14 reprsente un mcanisme trs plausible que nous devrions nous attendre appliquer de nombreux cas rels. Le fait quextrmement peu dexemples (spcialement dinhibition hyperbolique) aient t publis, reflte plus probablement un manquement reconnatre ce type de comportement que lauthentique raret de ce comportement. Les effets hyperboliques ne sont pas difficiles reconnatre exprimentalement, mais les symptmes sont souvent carts comme une complexit mal accueillie. Il est important dutiliser une gamme suffisamment large de concentrations dinhibiteur ou dactivateur pour dterminer si la vitesse de la raction tend vers zro aux concentrations leves dinhibiteur ou aux concentrations faibles dactivateur. En particulier, il faut vrifier que les graphiques linaires attendus sont en ralit des droites ; toute courbure systmatique devrait tre vrifie et si elle est confirme, il est probable quelle indique des effets hyperboliques.
5.7. PRPARATION DES EXPRIENCES DINHIBITION

Avant de nous embarquer dans une discussion de la prparation des expriences dinhibition, nous devons commenter la raison pour laquelle cette section intervient aprs celle expliquant comment les expriences sont analyses ( 5.2 et 5.3). Comme la prparation doit obligatoirement prcder lanalyse dans la ralisation dune exprience, il semblerait plus logique de discuter de ces deux aspects du problme dans cet ordre. Cependant, lexprience montre que le moyen le plus efficace dapprendre comment prparer une exprience est dtre confront aux problmes poss par lanalyse de donnes provenant dexpriences mal prpares, qui ont t ralises sans quaucune attention nait t apporte au type dinformation recherche. De plus, il est ncessaire dacqurir une certaine connaissance des mthodes danalyse avant de matriser pleinement les principes de la prparation. Deux buts principaux sont recherchs dans des expriences dinhibition : identifier le type dinhibition et estimer les valeurs des constantes dinhibition. Si lexprience est soigneusement prpare, il est souvent possible datteindre ces deux buts simultanment. Nous supposerons initialement que linhibition est linaire et que les relations donnes dans le tableau 5.1 sappliquent, puisque celles-ci sappliqueront trs certainement en premire approximation et quil est toujours prfrable de caractriser le comportement simple avant dessayer de comprendre certaines complexits du mcanisme. Il est vident, partir du tableau 5.1, que toute composante comptitive de linhibition se manifestera principalement aux faibles concentrations de substrat, puisque les inhibiteurs comptitifs diminuent la valeur apparente de V Km , qui
165
caractrise les cintiques faibles concentrations de substrat ; inversement, toute composante anti-comptitive se manifestera principalement aux concentrations leves de substrat. Il est donc clair que linhibition ne peut tre compltement caractrise que si elle est mesure la fois pour des concentrations faibles et leves de substrat. En consquence, des conditions idales pour caractriser lactivit dun enzyme peuvent se rvler insatisfaisantes pour tudier sa rponse vis--vis dun inhibiteur. Par exemple, un calcul simple montre quun inhibiteur comptitif prsent une concentration gale sa constante dinhibition diminue la vitesse mesure par moins de 10% si [ A ] = 10 Km ; bien quun effet de cet ordre de grandeur devrait tre facilement dtect dans une exprience, il pourrait tre considr comme insignifiant sil nest pas ralis que cet effet est beaucoup plus important aux faibles concentrations de substrat. Tout comme dans une exprience simple ralise en absence dinhibiteur, il est prudent dinclure des valeurs de [ A ] allant de 0,2 Km jusqu des concentrations aussi leves que possible ( 4.3.1), il est souhaitable dans une exprience dinhibition dutiliser des concentrations dinhibiteur qui stendent de 0,2 K ic ou de 0,2 Kiu (dpendamment de celle dont la valeur est la plus faible) jusqu des concentrations aussi leves que possible, pour autant que la vitesse ne soit pas trop faible pour tre mesure prcisment. Pour chaque valeur de [ I ] , des valeurs de [ A ] doivent tre choisies comme dcrit dans le 4.3.1, mais en utilisant comme app rfrence Km et non K m. En effet, ce sont les valeurs apparentes des constantes cintiques qui caractrisent le comportement cintique pour chaque concentration dinhibiteur et non les valeurs relles. Un exemple simple du choix de conditions exprimentales est prsent dans le tableau 5.3, qui montre quil nest pas ncessaire dutiliser un mme ensemble de valeurs de [ A ] pour chaque concentration dinhibiteur ou un mme ensemble de valeurs de [ I ] pour chaque concentration de substrat. Une telle pratique signifierait trs certainement quune partie des expriences ralises fournirait peu dinformation utile. Malgr cela, pour prsenter les rsultats sous la forme dun des graphiques dcrits dans le 5.3, il est utile de raliser des mesures pour des gammes communes de valeurs de [ A ] et de [ I ] dans chaque exprience, de sorte quun nombre raisonnable de points apparaissent sur chaque droite, que [ A ] soit utilis comme abscisse (par exemple pour dterminer les paramtres apparents de MICHAELIS et MENTEN pour chaque valeur de [ I ] ) ou que [ I ] soit utilis comme abscisse (par exemple, dans les graphiques o 1 v ou [ A ] v est port en fonction de [ I ] ). Ainsi, le tableau 5.3 inclut plusieurs combinaisons qui ne seraient certainement pas incluses si chaque range du tableau tait considre sparment. Si ces recommandations sont suivies (comme guide, bien sr, puisque les nombres particuliers utiliss dans le tableau 5.3 ne sont vraisemblablement pas utilisables dans un autre exemple), la prsence dune composante hyperbolique dans linhibition devrait tre dcelable sans avoir recours des expriences supplmentaires. En consquence, il nest pas ncessaire dajouter de commentaire supplmentaire
166
ceux faits la fin du paragraphe 5.6.3. Le point essentiel consiste inclure des valeurs de [ I ] qui soient suffisamment leves et nombreuses pour dterminer si la vitesse tend ou non vers zro lorsque la concentration dinhibiteur approche de la saturation.
Tableau 5.3 - Prparation des expriences dinhibition
[ I ] 1+
0 0,5 1 2 5 10 20
[I] Kic
1,0 1,25 1,5 2,0 3,5 6,0
1+
[I] Kiu
1,0 1,05 1,1 1,2 1,5 2,0 3,0
app Km
Valeurs de [A] 0,2 0,2 0,2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 5 5 5 5 5 5 5 10 10 10 10 10 20 20 20 20 50
1,0 1,2 1,4 1,7 2,3 3,0 3,7
11,0
Le tableau reprsente le choix de concentrations de substrat [A] ncessaire pour dterminer les constantes dinhibition Kic et Kiu dans une exprience o les valeurs approximatives sont les suivantes : Km = 1, Kic = 2 et Kiu = 10, en units arbitraires (bien que les units pour Kiu et Kic sont les mmes). Les valeurs suggres pour [A] sont exprimes app dans les mmes units que Km, et sont choisies pour staler denviron 0,2 Km jusqu app environ 10 Km pour chaque valeur de la concentration dinhibiteur [ I ].
5.8. EFFETS INHIBITEURS DES SUBSTRATS

5.8.1. Fixation non-productive
La majorit des informations dont nous disposons sur les proprits gnrales des enzymes a t obtenue par ltude dun petit groupe denzymes, les enzymes extracellulaires catalysant des ractions dhydrolyse, qui comprend la pepsine, le lysozyme, la ribonuclase, et peut tre le plus notable, la-chymotrypsine. Bien que cette situation soit moins manifeste quil y a 30 ans, la frquence avec laquelle la-chymotrypsine est rencontre dans la littrature doit plus au fait que cet enzyme est considr comme un enzyme typique , que par limportance biologique quil peut avoir. Ces enzymes partagent certaines proprits qui justifient pleinement leur utilisation pour des tudes dtailles : ils sont trs abondants, facilement cristallisables, ils sont stables, monomriques, non-spcifiques et peuvent tre traits comme des enzymes un seul substrat, puisque le second substrat est leau. Nanmoins, toutes ces qualits les disqualifient en tant que reprsentant un enzyme typique , puisque les enzymes sont gnralement
167
prsents en faible quantit, sont difficiles purifier et cristalliser, sont instables, souvent oligomriques, hautement spcifiques et catalysent des ractions plusieurs substrats (hormis leau). Tous ces enzymes protolytiques partagent une autre caractristique, qui leur confre indubitablement un dsavantage : leurs substrats naturels sont des polymres mal dfinis, et en consquence, ils sont presque toujours tudis avec des substrats artificiels qui sont plus ou moins encombrants que les substrats naturels. Un problme important est quun enzyme qui est capable de fixer une macromolcule, est trs certainement capable de fixer une petite molcule de diffrentes manires. Donc plutt que de former un complexe unique enzymesubstrat qui se dissocie pour donner des produits, ces enzymes peuvent former diffrents complexes non-productifs additionnels qui ne donnent pas de produits. Cette situation est illustre dans la figure 5.15, dans lequel AE reprsente tous les complexes non-productifs qui peuvent tre produits.
AE
A est un substrat de la raction, mais en plus de son mode correct de fixation qui produit le complexe EA dans lequel A subit la raction de conversion en P, il peut galement se fixer incorrectement pour donner le complexe AE dans lequel A ne peut ragir.
Ki A+E + A k1 k1 EA k2 E+P
5.15 - Fixation non-productive
Ce schma est le mme que celui de linhibition linaire comptitive (figure 5.2) dans lequel linhibiteur est remplac par le substrat, et lquation de vitesse est analogue lquation [5.3] : k 2 [ E ]0 [ A ] [5.35] v = k 1 + k 2 [ A ] + [ A] 1 + k1 Ki Si les valeurs recherches des paramtres cintiques sont dfinies comme les valeurs que ceux-ci auraient si aucun complexe non-productif ntait form, cestexp -dire que V exp = k 2 [ E ]0 et Km = ( k 1 + k 2 ) k1 (voir les constantes pHindpendantes dans le 8.3.3), alors lquation [5.35] peut tre arrange sous la forme dune quation de MICHAELIS et MENTEN : V [ A] v = [5.36] Km + [ A ] avec les paramtres dfinis de la manire suivante :
V =
V exp K exp 1+ m Ki
[5.37]
168
Km =
V Km
exp Km K exp 1+ m Ki exp = V exp Km
[5.38]
[5.39]
Ainsi ce mcanisme obit lquation de MICHAELIS et MENTEN, et les cintiques observes ne fournissent aucune indication sur limportance de la fixation nonproductive. Malheureusement, les valeurs qui ont un intrt pour lexprience, sont gnralement celles qui concernent le chemin productif. Les valeurs mesures, V et K m , peuvent tre plus petites, dune quantit inconnue et non-mesurable, que les grandeurs recherches. Seul le paramtre V Km donne une mesure correcte des proprits catalytiques de lenzyme. Pour les enzymes hautement spcifiques, une fixation non-spcifique savre peu plausible et peut donc tre exclue, mais pour les enzymes non-spcifiques, comme la chymotrypsine, la comparaison des rsultats obtenus avec plusieurs substrats peut parfois fournir une preuve de lexistence dun tel phnomne. Ainsi par exemple, INGLES et KNOWLES (1967) ont mesur les vitesses dhydrolyse dune srie dacylchymotrypsines, en mesurant des valeurs de k0 pour lhydrolyse catalyse par la chymotrypsine des esters de p-nitrophnol correspondants, dans laquelle ltape de dacylation, cest--dire dhydrolyse de lintermdiaire acyl-chymotrypsine, est ltape qui limite la vitesse.
Tableau 5.4 - Complexes non-productifs dans la catalyse par la chymotrypsine Groupe acyle Actyl-L-tryptophanylActyl-L-phnylalanylActyl-L-leucylActylglycylActyl-D-leucylActyl-D-phnylalnylActyl-D-tryptophanyl-
k0 (s1)
52 95 5,0 0,30 0,034 0,015 0,0028
kOH (M1 s1)

0,16 0,54 0,35 0,51 0,35 0,54 0,16
k0 (M) kOH
330 150 14 0,58 0,097 0,027 0,018
Le tableau montre des donnes dINGLES et de KNOWLES (1967) pour lhydrolyse catalyse par la chymotrypsine desters de p-nitrophnol de divers acides amins actyls. Pour ces substrats, lhydrolyse des actyl-amino-acyl-chymotrypsines correspondantes limite la vitesse, et donc les valeurs mesures de la constante catalytique k0 sont en ralit des constantes de premier ordre pour cette raction dhydrolyse. Les valeurs sont compares avec les constantes de vitesse de second ordre kOH pour lhydrolyse catalyse par la base des esters de p-nitrophnol des drivs benzyloxycarbonyles des acides amins correspondants.
169
Lanalyse des rsultats (tableau 5.4) est complique par le fait que les divers groupes acyles nont pas la mme ractivit vis--vis des nuclophiles. INGLES et KNOWLES ont donc mesur les constantes de vitesse pour lhydrolyse de ces diffrents esters, catalyse par lion hydroxyde. En divisant la constante de vitesse pour la raction catalyse par la chymotrypsine par la constante de vitesse pour la raction catalyse par la base, un profile plus intressant est apparu : lordre de ractivit des substrats spcifiques de type L tait exactement linverse de celui des plus mauvais substrats de type D cest--dire : Ac-L-Trp > Ac-L-Phe >> Ac-L-Leu >> Ac-Gly >> Ac-D-Leu >> Ac-D-Phe > Ac-D-Trp. Lexplication la plus simple est lexistence dune fixation nonproductive : pour les groupes acyles ayant la configuration correcte L, les chanes latrales volumineuses et hydrophobes assurent une fixation ferme et rigide dans le mode correct, liminant la possibilit de former des complexes non-productifs, mais pour les groupes acyles de configuration D, les mmes chanes latrales favorisent une fixation ferme et rigide dans des modes non-productifs. La fixation non-productive nest habituellement pas voque dans le contexte de linhibition des enzymes et nest mme gnralement jamais considre, mais elle suit exactement le mme mcanisme que celui qui est le plus couramment considr pour reprsenter linhibition comptitive. Il est donc important de tenir compte de cette possibilit lorsque les rsultats obtenus avec diffrents substrats sont compars dans le cas dun enzyme non-spcifique. Le terme inhibition par le substrat est gnralement rserv pour lanalogue anti-comptitif de la fixation non-productive dont nous allons discuter dans la section suivante.
5.8.2. Inhibition par le substrat

Pour certains enzymes, il est possible quune seconde molcule de substrat se fixe sur le complexe enzyme-substrat, EA, pour AEA donner un complexe inactif, AEA, comme prsent dans la figure 5.16.
Ksi
5.16 - Mcanisme produisant une inhibition par le substrat, cest--dire une inhibition par excs de substrat
A+E
k1 k1
EA + A
k2
E+P
Le mcanisme est analogue celui qui est habituellement envisag pour expliquer linhibition anti-comptitive ( 5.2.3), et lquation de vitesse a la forme suivante :
v =
k 2 [ E ]0 [ A ] V' [ A ] = [ A] k 1 + k 2 [ A ]2 K'm + [ A ] + + [ A ] 1 + Ksi k1 Ksi
[5.40]
o V ' et K'm sont dfinis respectivement comme k 2 [ E ]0 [ A ] et ( k 1 + k 2 ) k1 , cest--dire quils satisfont aux dfinitions habituelles des paramtres de MICHAELIS et MENTEN pour le mcanisme simple deux tapes ( 3.3) ; nanmoins, ces
170
paramtres sont dsigns avec un prime parce quils ne sont pas des paramtres de MICHAELIS et MENTEN, puisque lquation [5.40] nest pas une quation de MICHAELIS et MENTEN. La prsence du terme en [ A ] 2 implique que la vitesse tend vers zro et non vers V ' pour des valeurs leves de [ A ] , et que K'm nest pas gal la concentration de A pour laquelle v = V ' 2 . La courbe de v en fonction de [ A ] est reprsente dans la figure 5.17, avec les graphiques correspondants de [ A ] v en fonction de [ A ] et de 1 v en fonction de 1 [ A ] ; ces deux derniers graphiques ne sont pas des droites mais adoptent lallure respectivement dune parabole et dune hyperbole. Toutefois, si K si est beaucoup plus grand que K'm (comme cest habituellement le cas), ils sont suffisamment linaires aux faibles valeurs de [ A ] pour que V ' et K'm soient estims partir de ceux-ci de la faon habituelle.
v
1,0
1/v Aucune inhibition par le substrat

3 2
0,8
0,6
Effet de l'inhibition par le substrat

1
1/[A]
0,4
[A]/v Maximun pour [A] = (K'mKsi
)1/2
6 4
0,2 2 0
[A]
[A]
5.17 - Inhibition par le substrat Les courbes en trait continu ont t calcules partir de lquation [5.40] en utilisant les valeurs suivantes : K'm = 1, V' = 1 ; Ksi = 30. Les pointills ont t calculs partir de lquation de MICHAELIS et MENTEN en utilisant les valeurs suivantes : Km = 1, V = 1, sans inhibition par le substrat. (a) Dans le graphique direct de v en fonction de [A], le maximum est obtenu quand [A] 2 = K'm Ksi. Les petits graphiques en insert montrent lapparence des graphiques (b) de 1/v en fonction de 1/[A] et (c) de [A]/v en fonction de [A]. Limpression selon laquelle le graphique (b) prsente linhibition plus clairement que le graphique (c) est une illusion, provenant du fait que la courbe (b) se prolonge jusque 1/[A] = 0,167, cest-dire une valeur de [A] = 60, alors que dans (c), elle sarrte une valeur de [A] = 5. En gnral, la probabilit de reconnatre lexistence dune inhibition par le substrat dpend plus de la gamme des donnes qui sont portes en graphique que du type de graphique utilis.
171
Pour raliser une analyse de lensemble du phnomne et dterminer les paramtres cintiques des diffrentes tapes, il est toutefois recommand dutiliser un ajustement paramtrique non-linaire en utilisant lquation [5.40]. Linhibition par le substrat nest gnralement pas importante si les concentrations de substrat sont maintenues infrieures ou gales aux concentrations physiologiques (bien quil existe dimportantes exceptions, comme par exemple avec la phospho-fructokinase), mais elle peut devenir prpondrante aux concentrations leves de substrat et fournir ainsi un lment diagnostique utile pour distinguer entre les chemins possibles de raction, comme nous en discuterons dans le 6.6.
5.9. LA MODIFICATION DUN GROUPE DE LENZYME COMME UN MOYEN DIDENTIFIER LES GROUPES ESSENTIELS
Lidentification des groupes essentiels dun enzyme constitue une tape importante dans la caractrisation du mcanisme catalytique et une pratique courante consiste dduire la nature des groupes impliqus dans la catalyse enzymatique en dterminant si lactivit de lenzyme est affecte lorsque certains rsidus sont modifis. Malheureusement, le fait quun rsidu particulier soit essentiel pour lactivit catalytique ne garantit pas quil joue un rle quelconque dans le processus catalytique ; il peut, par exemple, tre essentiel pour maintenir la structure active de lenzyme. Il existe aujourdhui, deux manires de modifier spcifiquement certains rsidus. La plus ancienne consiste le modifier chimiquement par raction avec un ractif spcifique. Cette mthode a rendu de trs grands services dans lidentification des rsidus essentiels des sites actifs et peut encore tre trs utile. De nombreux ractifs sont disponibles pour modifier spcifiquement certains rsidus dacide amin (MEANS et FEENEY, 1971), ainsi par exemple, de nombreuses protases extracellulaires comme la chymotrypsine ont un rsidu srine essentiel dans leur site actif qui peut tre mis en vidence par raction avec le diisopropyl-fluoro-phosphate (DFP). Aujourdhui cependant, grce aux dveloppements de lingnierie gntique, cette approche a t largement supplante par la mutagense dirige qui permet de remplacer spcifiquement un acide amin par nimporte quel autre acide amin. De nouvelles approches ont galement t dveloppes qui permettent lintroduction dacides amins non-naturels dans les protines (LIU et SCHULTZ, 1999 ; CHIN et al., 2003) et nous pouvons penser que le dveloppement commercial de ces techniques ne devrait pas tarder, ce qui donnera encore plus de libert dans ce type dexpriences. TSOU (1962) a tabli les bases thoriques pour interprter les rsultats dexpriences de modifications chimiques, mais cet article nest pas suffisamment connu et en pratique la logique utilise pour interprter ces expriences est souvent floue ou inexistante. Le cas le plus simple qui puisse tre considr est celui dans lequel
172
l groupes sur chaque monomre denzyme ragissent la mme vitesse avec lagent de modification et o m de ces l groupes sont essentiels pour lactivit catalytique. Aprs modification dun nombre moyen de g groupes par molcule, la probabilit que chaque groupe particulier ait t modifi est de g l , et la probabilit quil ne soit pas affect est de 1 ( g l ) . Pour que la molcule denzyme conserve son activit, aucun des m groupes essentiels ne doit tre modifi, une situation dont la probabilit est donne par 1 ( g l )
. Donc la fraction a de
lactivit qui persiste aprs la modification de g groupes par molcule denzyme est donne par :
= 1
Ds lors,
[5.38] [5.39]
1 m = 1
et un graphique de a1/m en fonction de g devrait tre linaire. Initialement, nous ne connaissons pas la valeur de m qui doit tre utilise pour tracer ce graphique, mais en traant les graphiques de a , a1/2, a1/3 en fonction de g il est possible de dterminer la valeur pour laquelle le graphique est le plus linaire. Une objection ce traitement est que toute les ractions de modification ne se droulent pas ncessairement la mme vitesse et quelles ne sont pas ncessairement indpendantes les unes des autres, cest--dire que la modification dun groupe peut affecter les vitesses auxquelles les groupes voisins sont modifis. Larticle de TSOU devrait tre consult pour une discussion complte des complications possibles, mais deux classes supplmentaires de groupes peuvent tre incorpores dans lanalyse sans quelle ne perde sa simplicit. Sil y a x groupes non-essentiels qui ragissent rapidement en comparaison des groupes essentiels, ceux-ci contribueront substantiellement dans la partie initiale du graphique (quelle que soit la valeur de m) dans laquelle la valeur de a1/m ne varie pas lorsque g augmente. De plus, des groupes, essentiels ou non, qui ragiraient beaucoup plus lentement que les autres groupes essentiels, ne seraient pas modifis de faon apprciable jusqu ce que la plus grande partie de lactivit ne soit perdue ; ceuxci sont difficiles ou impossibles dtecter. En pratique, un graphique de TSOU ressemblera probablement celui prsent dans la figure 5.18, qui a t utilis par PATERSON et KNOWLES (1972) afin de dmonter que deux groupes carboxyliques taient essentiels pour lactivit de la pepsine, que trois groupes non-essentiels taient modifis trs rapidement dans leurs expriences et que les deux groupes essentiels appartenaient une classe contenant 10 groupes qui taient modifis des vitesses similaires. La pepsine est un enzyme monomrique, mais lanalyse de TSOU peut tre facilement tendue ltude denzymes multimriques condition que les sous-units ragissent indpendamment avec lagent chimique et que linactivation dune sous-
173
unit naffecte pas lactivit des autres. En faisant ces hypothses, les enzymes multimriques peuvent tre traits de la mme manire que les enzymes monomriques, except que m reprsente alors le nombre de groupes essentiels par sous-unit, mme si l, g et x sont toujours dfinis par monomre (NORRIS et BROCKELHURST, 1976).
f 1/nessentiel
3 groupes non-essentiels rapidement modifis
nessentiel = 3 nessentiel = 2 nessentiel = 1
0,5
13 groupes modifis 0
12
15
Nombres de groupes modifis

5.18 - Le graphique de TSOU pour la dtermination du nombre de groupes essentiels dans un enzyme Le graphique prsente les donnes de PATERSON et KNOWLES (1972) pour linactivation de la pepsine par le trimethyloxonium fluoroborate, un ractif qui ragit spcifiquement avec les groupes carboxyliques. La variable F reprsente la fraction de lactivit persistant aprs la modification du nombre de groupes montrs, et est augmente une puissance 1/m, o m = 1, 2 ou 3. La droite observe avec m = 2 indique quau moins 2 groupes carboxyliques sont essentiels pour lactivit de la pepsine, parmi un total de 13 groupes modifis. La droite horizontale au dbut du graphique indique quil y a trois groupes ragissant rapidement qui ne sont pas ncessaires pour lactivit catalytique.
Les groupes importants du site actif peuvent galement tre mis en vidence dans des expriences de protection par un substrat ou par un inhibiteur comptitif. En effet, en prsence dun substrat ou dun inhibiteur comptitif une concentration suffisamment leve pour que lenzyme existe essentiellement sous la forme de complexe enzyme-substrat ou enzyme-inhibiteur, les rsidus du site actif sont protgs et la raction de modification par un agent chimique ne peut pas se drouler. Dans le pass, la tentative didentification dun groupe modifi tait souvent suivie par lhydrolyse partielle de la protine et le squenage du fragment peptidique contenant le rsidu modifi, dans lespoir dobtenir des informations sur la structure du site catalytique. Les techniques modernes dingnierie gntique ont
174
largement supplant cette approche chimique, mais il reste profitable de les complmenter par une analyse cintique des proprits des mutants artificiels qui sont produits. Avec des mutants de structure connue, il est possible de prdire exactement comment le graphique de TSOU devrait tre modifi par une mutation particulire et la vrification exprimentale quil est modifi de cette manire est une faon de confirmer lexactitude de linterprtation.
PROBLMES
5.1 - Les paramtres pour linactivation la plus rapide mesure dans les expriences de KITZ et WILSON (1962) taient k2 = 5 103 s1 , Ki = 0,1 mM, pour le mcanisme prsent dans lquation [5.1]. En supposant que K i peut tre exprim comme ( k 1 + k 2 ) k1 , quelle grandeur devrait avoir k2 pour que cette expression soit suffisamment diffrente de la constante dquilibre ( k 1 k1 ) suppos par KITZ et WILSON ? Quelle lumire est apporte par le fait que les constantes de vitesse de second ordre pour la fixation spcifique de petites molcules sur des protines ont typiquement des valeurs de lordre de 106 M1 s1 ou suprieures ? 5.2 - Les tudes initiales dune estrase utilisant un mlange racmique du substrat ont rvl que lnantiomre L est le rel substrat, puisquil tait entirement converti en produit alors que lnantiomre D pouvait tre rcupr la fin de la raction. Sur la base de ce rsultat, les cintiques de ractions ont t analyses en supposant que lnantiomre D na aucun effet sur lenzyme, et une valeur de 2 mM a t estime pour la constante de MICHAELIS de lnantiomre L. La suite du travail a tabli quil aurait t plus raisonnable de considrer lnantiomre D comme un inhibiteur comptitif avec K ic gal au K m pour lnantiomre L. Comment lestimation originale de K m peut-elle tre rvise pour tenir compte de cette information ? 5.3 - Les donnes suivantes montrent que les vitesses initiales (exprimes en units arbitraires) mesures pour une raction catalyse par un enzyme diffrentes concentrations respectivement dinhibiteur, [ I ] , et de substrat, [ A ] .
[ I ] (mM)
0 1 2 3 4
[ A ] = 1 mM
2,36 1,99 1,75 1,60 1,37
[ A ] = 2 mM
3,90 3,35 2,96 2,66 2,35
[ A ] = 3 mM
5,30 4,40 3,98 3,58 3,33
175
Quelle information peut tre dduite sur le type dinhibition implique ? Comment pourrions-nous raliser une exprience afin de mettre ceci plus clairement en vidence ? 5.4 - Le tableau suivant prsente les donnes de NORRIS et BROCKLEHURST (1976) pour leffet sur lactivit de lurase de la modification par le 2,2-dipyridyl-disulphide, un compos qui ragit spcifiquement avec les groupes thiols. Le nombre de groupes modifis par molcule et lactivit relative vis--vis de lenzyme non-trait sont respectivement donns par g et a. En supposant que lurase a six sous-units par molcule qui agissent indpendamment la fois pour la raction catalytique et pour la raction de modification, estimer a - le nombre de groupes thiols essentiels par sous-unit et b - le nombre de groupes thiols non-essentiels qui sont modifis rapidement par comparaison avec les groupes essentiels. g 0,0 2,0 4,0 18,0 20,0 22,0 a 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,982 g 23,0 24,0 25,0 25,5 26,0 26,5 a 0,957 0,896 0,853 0,799 0,694 0,597 g 27,0 27,5 28,0 28,5 29,5 30,0 a 0,547 0,442 0,353 0,198 0,104 0,011
5.5 - Les symboles Kis et Kii sont parfois utiliss pour reprsenter les constantes dinhibition qui sont symbolises dans ce chapitre respectivement par Kic et Kiu. Dans ce cas, les seconds indices s et i font respectivement rfrence la pente (slope en anglais) et lintersection avec laxe (intercept en anglais) puisque leur valeur sont obtenues en portant en graphique les pentes ou les ordonnes lorigine obtenues dans lun des graphiques dcrits dans le 3.5 en fonction de la concentration dinhibiteur. a - A quel graphique primaire ceci fait-il rfrence ? b - Quelle intersection (avec laxe des abscisses ou celui des ordonnes) doit tre utilise ? c - Sous quelle forme la constante dinhibition apparat-elle dans le graphique secondaire ? 5.6 - Le potage traditionnel japonais Katsuobushi doit sont parfum caractristique lacide 5-inosinique, un produit de dgradation de lARN qui rsulte de la fermentation dun poisson par un champignon. Les tudes dune nuclase provenant dune espce dAspergillus (ITO, MATSUURA et MINAMIURA, 1994) ont fourni les paramtres cintiques suivants pour lhydrolyse de diffrents monophosphates de dinuclotide :
176 C-A U-A 1,03 10,4 G-A 1,10 8,78 A-A 0,803 13,2 A-G
CINTIQUE ENZYMATIQUE A-C 0,495 11,6 A-U 2,61 11,8
Km (mM) V (M min )
1
1,00 11,5
0,437 9,81
En supposant que le comportement des liaisons dans les monophosphates de dinuclotide est reprsentatif de celui des mmes types de liaisons dans lARN, quel type de liaison (des sept prsents) serait hydrolys le plus rapidement durant la digestion de lARN par lenzyme ? 5.7 - Les donnes suivantes se rapportent lhydrolyse de diffrents tripeptides librant lacide amin N-terminal et le dipeptide C-terminal, catalyse par laminotripeptidase de lintestin pH 7,0 et 37C (donnes de DOUMENG et MAROUX, 1979) : Substrat
L-Pro-Gly-Gly L-Leu-Gly-Gly L-Ala-Gly-Gly L-Ala-L-Ala-L-Ala
k0 (s1) 385 190 365 298
Km (mM) 1,3 0,55 1,4 0,52
a - Quel substrat serait hydrolys le plus rapidement dans les premiers instants de la raction si un chantillon denzyme est ajout un mlange des quatre substrats des concentrations quimolaires ? b - Quand L-Ala-Gly-Gly est tudi en tant quinhibiteur de lhydrolyse de L-Pro-Gly-Gly, une constante dinhibition comptitive de 1,4 mM est mesure. Cette valeur est-elle en accord avec lide que lenzyme comporte un seul site actif o les deux substrats sont hydrolyss ? 5.8 - Pour un rapport donn de concentration dinhibiteur sur la constante dinhibition approprie, une inhibition comptitive rduit plus fortement la vitesse quune inhibition anti-comptitive si la concentration de substrat est infrieure au Km ; linverse est vrai si la concentration de substrat est suprieure au Km. Dmontrer cette relation de manire algbrique et l'expliquer conceptuellement, cest--dire sans faire rfrence lalgbre. 5.9 - Si deux inhibiteurs I et J agissent comme des inhibiteurs comptitifs avec des constantes dinhibition donnes respectivement par Ki et Kj quand ils sont tudis sparment, leur effet combin lorsquils sont prsents simultanment peut tre exprim par une quation du type de celle-ci :
v =
V [ A] [ I ] [ J ] [ J ] + Km 1 + 1+ + [ A] Ki K' j K' j
177
dans laquelle K'j est la constante de dissociation pour la libration de J partir dun complexe hypothtique EIJ. Si les graphiques de 1 v en fonction de [ I ] sont tracs pour plusieurs valeurs de [ J ] , quelle est la valeur de labscisse correspondant lintersection des diffrentes courbes ? Dans ltude de lhexokinase D dans laquelle I etait la N-actylglucosamine, VANDERCAMMEN et VAN SCHAFTINGEN (1991)ont obtenus des droites parallles dans de tels graphiques lorsque J tait la glucosamine, et des droites se croisant sur laxe des abscisses lorsque J tait une protine rgulatrice spcifique. Quimpliquent ces rsultats au sujet de la valeur de K'j dans ces cas et au sujet des sites de fixation des trois inhibiteurs ? 5.10- Les tyrosine kinases catalysent la phosphorylation de rsidus tyrosine particuliers dans les protines. SONGYANG et al. (1995) ont tudis leur slectivit pour des squences particulires autour du rsidu cible au moyen dune bibliothque de peptides Met-Ala-Xaa4-Ala-Lys3, dans laquelle Xaa reprsente nimporte quel acide amin lexception de Trp, Cys et Tyr. En considrant que les peptides dans la bibliothque ont une masse molculaire moyenne de 1,6 kDa et un chantillon de 1 mg dans un volume de 300 L, calculer a - le nombre de types diffrents de peptide contenu dans lchantillon ; b - le nombre moyen de molcules contenu dans celui-ci ; c - la concentration moyenne de chacun. En comparant cette concentration avec une valeur typique de K m de 5 M pour une tyrosine kinase agissant sur un bon substrat, discuter si lexprience fournit une indication utile sur la spcificit des enzymes.
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS

6.1. INTRODUCTION
La premire partie de ce livre est principalement consacre aux ractions enzymatiques simples n'impliquant qu'un substrat et qu'un produit. En ralit, de telles ractions sont rares et restent limites quelques ractions d'isomrisation, comme la conversion du glucose 1-phosphate en glucose 6-phosphate catalyse par la phosphoglucomutase. La majorit des ractions implique plusieurs substrats et libre plusieurs produits, mais le dveloppement de la cintique enzymatique de ces systmes est largement simplifi sur la base de deux constatations : premirement, de nombreux enzymes hydrolytiques peuvent tre traits comme des enzymes un seul substrat, parce que le second substrat, l'eau, est toujours prsent en large excs de sorte que sa concentration peut tre considre comme une constante ; deuximement, la majorit des enzymes se comporte comme des enzymes un seul substrat si la concentration d'un seul substrat varie, comme nous le montrerons partir des quations prsentes dans le 6.5.2. Une des raisons majeures pour entreprendre une tude de la cintique enzymatique est de dterminer le mcanisme ractionnel, qui, lorsqu'il s'agit d'tudes ralises dans des conditions d'tat stationnaire, fait gnralement rfrence l'ordre de fixation des substrats et de libration des produits. Il existe trois mthodes principales d'analyse des cintiques dans ces conditions qui permettent de dterminer l'ordre dans lequel les substrats sont fixs et l'ordre dans lequel les produits sont librs : la mesure des vitesses initiales en absence de produit, la caractrisation de la nature de l'inhibition par le produit et l'utilisation de substrats marqus. Nous traiterons les deux premires mthodes dans ce chapitre en utilisant une raction type deux substrats et deux produits : A + B P + Q [6.1] Ce type de raction est particulirement commun en biochimie : dans une compilation de toutes les ractions enzymatiques connues, prsente dans Enzyme Nomenclature (IUBMB, 1992), environ 60% des ractions appartiennent aux trois premires classes d'enzymes (ractions d'oxydorduction, de transfert de groupe et d'hydrolyse), qui sont toutes dcrites par le mcanisme de l'quation [6.1].
180
Des ractions plus complexes ont galement t identifies dans lesquelles quatre ou cinq substrats peuvent tre impliqus, mais celles-ci peuvent tre la plupart du temps tudies en gnralisant les principes tablis pour les ractions deux substrats et deux produits. De plus, mme pour la raction apparemment simple de l'quation [6.1], de nombreux mcanismes sont possibles et nous nous limiterons au traitement de quelques cas importants plutt que de traiter exhaustivement ce problme. Un traitement exhaustif des mcanismes enzymatiques plusieurs substrats est impensable cause de l'invraisemblable multiplicit des cas rencontrs dans la nature, mais il est galement inutile puisque le lecteur qui aura acquis les mthodes de base permettant de traiter les cas simples pourra aisment les adapter au mcanisme spcifique qu'il tudie.
6.2. CLASSIFICATION DES MCANISMES

6.2.1. Les mcanismes complexe ternaire
Un grand nombre de ractions deux substrats et deux produits sont des ractions de transfert de groupes et pour discuter des mcanismes possibles de cette raction, il est prfrable de reprsenter la raction de faon plus explicite que dans l'quation [6.1] : GX + Y X + GY [6.2] Ainsi, en remplaant A par GX et B par Y, il apparat clairement que la raction correspond au transfert du groupe G d'un donneur, GX, vers un accepteur, Y. Dans la majorit des cas, la ncessit de satisfaire la valence des atomes implique qu'un autre groupe soit transfr simultanment dans la direction oppose ; par exemple, lorsque l'hexokinase catalyse le transfert d'un groupe phosphate de l'ATP vers le glucose, un proton est transfr en sens inverse pour tre directement libr dans la solution. Gnralement, ce second transfert n'est pas explicitement indiqu dans l'quation reprsentant la raction. Le formalisme utilis dans l'quation [6.2] a t introduit par WONG et HANES (1962) dans un article important qui a tabli les fondements de la classification moderne des mcanismes cintiques. Bien que ce formalisme soit plus commode pour dcrire les mcanismes, l'criture des ractions peut devenir trs complexe et, dans la suite de ce manuel, nous continuerons de reprsenter les substrats et les produits par une seule lettre. En 1962, WONG et HANES ont montr que tous les mcanismes des ractions de transfert pouvaient tre considrs comme des cas particuliers d'un mcanisme gnral. Nanmoins, les enzymes qui ncessitent un mcanisme complet semblent tre trs rares et, dans les quelques cas o cette situation t rencontre, comme pour la pyruvate dcarboxylase, il est possible que les donnes aient t mal interprtes (voir WARREN et TIPTON, 1974). En consquence, nous discuterons les trois mcanismes les plus simples de transfert de groupe comme des cas spars.
181
La division principale est faire entre les mcanismes qui impliquent la formation d'un complexe ternaire, EGXY, ainsi dnomm parce qu'il rassemble l'enzyme et les deux substrats en un seul complexe, et ceux qui procdent en passant par une forme substitue de l'enzyme, EG, qui est constitue par l'enzyme et le groupe transfrer mais aucun des substrats complets. Les premiers chercheurs, comme WOOLF (1929, 1931) et HALDANE (1930) ont suppos que la raction passait par un complexe ternaire, et que ce dernier pouvait se former partir de l'un ou l'autre des complexes binaires EGX et EY. En d'autres termes, les substrats peuvent se lier l'enzyme dans un ordre alatoire, comme illustr dans la figure 6.1. L'quation d'tat stationnaire pour ce mcanisme est complexe, et inclut des termes en [ GX ] 2 et [ Y ] , mais GULBINSKY et CLELAND (1968) ont montr que la contribution de ces termes dans la dfinition de la vitesse est souvent si faible que l'quation de vitesse exprimentale ne peut tre distingue de celle drive en faisant l'hypothse que toutes les tapes du mcanisme sont l'quilibre l'exception de la raction de conversion de EXG-Y en EX-GY. Si cette hypothse est utilise, aucun terme de concentration n'apparat au carr dans l'quation de vitesse. Par souci de simplicit, nous adopterons cette hypothse de l'existence d'quilibres rapides pour discuter le mcanisme de cette raction, bien qu'il soit important de souligner que cette hypothse est habituellement incorrecte, mme si les observations exprimentales ne permettent en gnral pas de la rfuter. L'tape de conversion entre EXG-Y et EX-GY ne peut pas tre dtecte par des mesures l'tat stationnaire, mais il est logique de la faire apparatre explicitement dans un mcanisme alatoire parce que, dans la drivation de l'quation de vitesse, cette tape est traite comme l'tape limitante.
EXG GX E GX Y EY Complexe ternaire non-productif X EXY Y Y EXG-Y EX-GY
EGY X E GY EX X GY
Complexes ternaires productifs
6.1 - Mcanisme complexe ternaire alatoire La partie prsente en gris au bas de la figure reprsente la voie non-productive qui ne fait pas partie intgrante du mcanisme mais est souvent implique puisque rien ne l'empche.
182
Le complexe non-productif EXY n'intervient pas ncessairement dans un mcanisme alatoire, mais son existence peut tre suppose, parce que si EX et EY sont des intermdiaires significatifs, il n'y a aucune raison d'exclure la formation d'un complexe EXY. La formation d'un autre complexe non-productif (qui n'est pas montr dans la figure 6.1) est possible si le groupe transfr G n'est pas trop volumineux : EXG-GY peut rsulter de la fixation de GY sur EGX ou de GX sur EGY. Nanmoins, ceci est moins probable que la formation de EXY. Aujourd'hui, il est gnralement accept que de nombreux enzymes ne se comportent pas comme des matrices rigides, comme le schma de la figure 6.1 l'implique, mais qu'au contraire les conformations la fois de l'enzyme et du substrat sont modifies lors de la fixation, en accord avec l'hypothse de l'ajustement induit de KOSHLAND (1958, 1959 ; voir aussi 3.1.5 et 9.4). Il est ds lors possible que le site de fixation de l'un des deux substrats n'existe pas sur l'enzyme avant que l'autre substrat ne soit fix. Dans un tel cas, il y a un ordre obligatoire de fixation, comme l'illustre la figure 6.2. Si la fois les substrats et les produits sont pris en compte, il existe quatre ordres possibles, bien que les mcanismes obligatoires impliquant un ajustement induit suggrent que le second produit doive tre un analogue structural du premier substrat et que donc seulement deux des quatre possibilits soient vraisemblables. Pour les dshydrognases dpendant du NAD, par exemple, les formes du coenzyme correspondent souvent au premier substrat et au second produit. Pour les mmes raisons que dans le cas des mcanismes alatoires, le complexe nonproductif EXY a des chances de se former dans les mcanismes obligatoires.
EXG GX E Y EXG-Y EX-GY GY E X
Complexes ternaires productifs
Complexe ternaire non-productif EXY Y
EX
6.2 - Mcanisme complexe ternaire ordonn Formellement, il s'agit du mme mcanisme que le mcanisme alatoire de la figure 6.1 o des tapes sont supprimes. Pour expliquer pourquoi ces tapes n'ont pas lieu, c'est--dire pourquoi les substrats doivent se fixer dans un ordre particulier, nous pouvons supposer que la fixation du premier substrat GX induit un changement de conformation de la protine qui rend possible l'accs au site de fixation du second substrat Y.
183
6.2.2. Mcanismes enzyme modifi

Au dbut du dveloppement des cintiques plusieurs substrats, DOUDOROFF, BARKER et HASSID (1947) ont montr par des tudes d'change isotopique que les ractions catalyses par la saccharose glucosyltransfrase procdent par l'intermdiaire d'un enzyme substitu plutt que par un complexe ternaire. Depuis lors, des tudes ralises avec divers enzymes, incluant l'a-chymotrypsine, des transaminases et des flavo-enzymes, ont montr que le mcanisme enzyme modifi, illustr dans la figure 6.3, est largement rpandu. Dans la forme ordinaire de ce mcanisme, l'existence d'un complexe ternaire est structurellement impossible parce que les sites de fixation de X et de Y sont soit identiques, soit superposs.
E-GX EX X GX EG-X X
Complexes binaires non-productifs
EG
EY
GY E-GY EG-Y
6.3 - Mcanisme enzyme modifi Comme dans la figure 6.1, le chemin non-productif, prsent en gris gauche, ne fait pas partie intgrante du mcanisme.
Par exemple, l'aspartate transaminase catalyse une raction impliquant quatre anions dicarboxyliques de taille similaire :
glutamate + E-pyridoxal oxaloactate + E-pyridoxamine
2-oxoglutarate + E-pyridoxamine asparate + E-pyridoxal
[6.3]
Le complexe E-pyridoxal reprsente l'enzyme avec son coenzyme sous la forme de phosphate de pyridoxal (stricto sensu ce n'est pas un aldhyde mais une aldimine interne forme par la condensation entre un aldhyde et la fonction amine d'un rsidu lysine, mais ce dtail n'est pas important dans le cadre de notre discussion) et le complexe E-pyridoxamine reprsente l'enzyme avec le coenzyme sous la forme de phosphate de pyridoxamine. Puisque les quatre ractifs ont une structure similaire, il est raisonnable d'imaginer que les sites de fixation du 2-oxoglutarate et de l'oxaloactate (X et Y dans le cas gnral) sont virtuellement identiques et que la seconde moiti de la raction est essentiellement l'inverse de la premire moiti. Dans ce type de mcanisme, il est habituel que les substrats se fixent la mauvaise forme de l'enzyme ; ainsi, par exemple, dans l'quation [6.3] il est difficile
184
d'imaginer pour le complexe E-pyridoxal une structure qui permette la fixation du glutamate et exclue celle du 2-oxaloactate. Nous pouvons donc prvoir l'existence de phnomnes d'inhibition par le substrat en prsence de concentrations leves de substrat (voir 6.6.4). Ceci est presque toujours vrai pour E, X et Y, comme prsent dans la figure 6.3, mais peut tre vit par des interfrences d'ordre strique entre les deux groupes G dans les cas de EG, GX et GY. Le mcanisme enzyme modifi prsent dans la figure 6.3 est un mcanisme ordonn, mais cette caractristique est moins notable qu'avec les enzymes complexe ternaire puisqu'il existe un seul ordre possible en accord avec le mcanisme et qu'il n'existe pas d'alternative o la fixation soit alatoire : mme si X et Y se fixent sur E, il n'est pas possible que les complexes rsultants se dissocient en GX ou GY. Les proprits cintiques d'un mcanisme alatoire enzyme modifi ont nanmoins t analyses tout comme un ensemble d'autres mcanismes qui sont difficilement conciliables avec la raction chimique (FISHER et HOAGLAND, 1968 ; SWEENY et FISHER, 1968). La mthode de KING et ALTMAN (1956) pour la drivation des quations cintiques, que nous allons dcrire ci-dessous, peut tre applique aussi bien des mcanismes raisonnables qu' des mcanismes fantaisistes et si nous considrons la cintique comme une branche de l'algbre, essentiellement dconnecte de la chimie, il est probable que nous soyons confronts un grand nombre de possibilits. Pour cette raison, il est souhaitable de considrer l'algbre comme un outil au service de la cintique enzymatique et non l'inverse. Il est galement ncessaire de prciser que les mcanismes cintiques prsents ci-dessus sont parfois dnomms diffremment. Dans la nomenclature introduite par CLELAND, les mcanismes ractionnels sont diviss en deux groupes : les mcanismes squentiels et les mcanismes ping-pong. Dans les mcanismes squentiels, qui correspondent aux mcanismes complexe ternaire prsents dans les figures 6.1 et 6.2, l'tape de raction chimique n'intervient qu'aprs formation d'un complexe entre l'enzyme et l'ensemble des substrats. Dans les mcanismes ping-pong, qui correspondent au mcanisme enzyme modifi prsent dans la figure 6.3, la raction chimique se droule aprs la fixation du premier substrat. Le premier produit ainsi form est libr avant que le second substrat ne se fixe.
6.2.3. Comparaison entre la classification chimique et la classification cintique

Une fois qu'un mcanisme cintique a t dtermin, il est tentant de le convertir en un mcanisme chimique, en assimilant les diffrentes tapes cintiques aux diffrentes tapes de la raction. Cette pratique, si elle permet parfois d'expliquer simplement le droulement de la raction chimique, doit cependant tre applique avec prudence. Ainsi, dans les mcanismes enzyme modifi, le groupe G est transfr deux fois, premirement du substrat GX vers l'enzyme libre E et ensuite de l'enzyme substitu vers le second substrat Y. Pour cette raison KOSHLAND
185
(1954) a introduit le terme de raction double dplacement pour caractriser ce type de mcanisme. Par analogie, les mcanismes impliquant un complexe ternaire, dans lesquels le groupe G est transfr une seule fois, sont galement appels ractions dplacement unique. Cette terminologie est encore parfois utilise, particulirement dans des contextes autres que cintiques. Cela conduit naturellement considrer la strochimie des ractions de transfert de groupe, qui a t discute en dtails par KOSHLAND (1954) et qui constitue le sujet du problme [6.1] la fin de ce chapitre. L'ide centrale, illustre dans la figure 6.4, est que chaque substitution d'un centre chiral (habituellement un atome de carbone ou de phosphore) entrane une inversion de configuration de ce centre.
X Y X:
Y:
Y + EGX
EGY + X
a - Raction dplacement unique : une seule inversion de configuration
B:
X:
E + GX
EG + X
B:
:Y
E + GY EG + Y b - Raction double dplacement : deux inversions de configuration

6.4 - Aspects strochimiques de la raction de transfert de groupe Normalement chaque substitution entrane l'inversion de la configuration, et donc un double dplacement se traduit par la restauration de la configuration originale : exprimentalement cela se traduit par la conservation de la configuration.
Donc, les mcanismes impliquant un complexe ternaire devraient s'accompagner d'une inversion de configuration, alors que les mcanismes enzyme modifi devraient s'accompagner de la conservation de la configuration (puisque deux
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inversions successives restaurent la configuration initiale). Par exemple, les tudes de l'hexokinase D du foie par rsonance magntique nuclaire (POLLARD-KNIGHT et al., 1982) ont montr que la catalyse du transfert d'un groupe phosphoryle par cet enzyme s'accompagne d'une inversion de configuration en accord avec les arguments cintiques impliquant un mcanisme complexe ternaire. Une strochimie similaire a t dmontre pour d'autres kinases qui sont supposes suivre des mcanismes impliquant un complexe ternaire, mais certaines kinases, comme la kinase des nuclosides phosphate, constituent une exception significative : non seulement la raction se droule avec une rtention de la configuration de dpart (SHEU, RICHARD et FREY, 1979), mais elle se caractrise par un comportement cintique typique d'un mcanisme enzyme modifi (GARCS et CLELAND, 1969). Ainsi, le fait qu'un mcanisme complexe ternaire produise une inversion de configuration ne signifie pas qu'une inversion de conformation ne puisse tre explique qu'en terme de mcanisme complexe ternaire : comme SPECTOR (1982) l'a crit, un n'est pas le seul nombre impair, et tous les arguments strochimiques gnralement proposs pour valider un mcanisme un seul dplacement sont aussi bien expliqus par un mcanisme impliquant trois dplacements (ou cinq, ou sept). Dans le cas de l'actate kinase, l'existence d'un mcanisme impliquant un triple dplacement a t prouv de faon indubitable (SPECTOR, 1980). Au cours de l'histoire de l'tude de ces ractions plusieurs substrats et produits, il a pu sembler qu'il serait possible d'exprimer les rsultats exprimentaux en termes de quelques gnralisations, par exemple que les kinases suivent systmatiquement un mcanisme ordre alatoire impliquant un complexe ternaire, alors que les dshydrognases dpendant du NAD suivent un mcanisme ordre obligatoire impliquant un complexe ternaire (avec le NADox comme premier substrat et le NADred comme second produit) et que les transaminases suivent un mcanisme enzyme modifi. Ce type de classification n'est pas totalement incorrect et il peut servir de guide lors de la caractrisation d'un nouvel enzyme, mais il est certainement trop simpliste. Par exemple, l'alcool dshydrognase, obtenue partir du foie de cheval, a t considre comme l'archtype d'un enzyme suivant un mcanisme ordre obligatoire impliquant un complexe ternaire ; cependant, on considre aujourd'hui que cet enzyme fixe ses substrats de manire alatoire mais qu'il libre ses produits de manire ordonne (HANES et al., 1972). Dans le sens le plus strict du terme, les mcanismes ordonns complexe ternaire n'existent pas, mais ils restent utiles pour la discussion. Il est important de raliser que la squence des vnements suggre par la cintique, comme nous en discutons dans la suite de ce chapitre, ne s'accorde pas ncessairement avec le mcanisme chimique, c'est--dire avec la squence relle des vnements molculaires qui se droulent dans le site actif de l'enzyme. D'un point de vue cintique, un mcanisme complexe ternaire signifie que les deux substrats doivent tre fixs sur l'enzyme avant que le premier produit ne puisse tre libr, mais il est parfaitement plausible que le premier produit ne soit libr
187
qu'aprs que le second substrat se soit fix mme si l'enzyme suit un mcanisme enzyme modifi. Bien que ce genre de mcanisme semble improbable avec une raction du type de celle catalyse par une transaminase telle qu'elle est montre dans l'quation [6.3], o les quatre ractifs sont tellement similaires que l'on s'attend ce qu'ils se fixent tous sur le mme site, il est moins facile de l'exclure quand le groupe transfr est volumineux et que les quatre ractifs sont fortement diffrents les uns des autres. Bien que l'opration d'un mcanisme enzyme modifi puisse gnralement tre dmontre par des arguments positifs, comme par l'isolement d'un intermdiaire o l'enzyme est substitu (une procdure qui est facilement ralisable avec une transaminase), l'opration d'un mcanisme impliquant un complexe ternaire est gnralement dduite partir d'arguments ngatifs, comme l'impossibilit d'isoler un complexe o l'enzyme est substitu. SPECTOR (1982) suggre que cette conclusion est toujours vraie (et pas seulement courante). Comme not ci-dessus, il fait remarquer que les arguments strochimiques pour l'existence d'un mcanisme complexe ternaire peuvent s'expliquer par un mcanisme impliquant un triple-dplacement, et il considre comme nave la conclusion selon laquelle un mcanisme impliquant un seul dplacement est plus simple que celle en impliquant trois ou cinq. De nombreuses tches, dans la vie de tous les jours, sont simplifies en les divisant en plusieurs tapes et il est probable que cet argument s'applique galement la chimie des enzymes (cela est certainement vrai pour les ractions mtaboliques, ou des ractions difficiles comme le couplage de l'oxydation du palmitate avec la synthse d'ATP, sont toujours dcomposes en une squence de ractions plus simples). Conceptuellement, et chimiquement, le problme rencontr avec le mcanisme complexe ternaire est que l'enzyme n'est pas qu'un simple spectateur. Dans la figure 6.2, il a au minimum un travail de changement de conformation raliser, alors que dans le mcanisme de la figure 6.1, l'enzyme ne fait rien de plus que d'apporter quelques encouragements moraux aux ractifs. Inversement, dans un mcanisme enzyme modifi (figure 6.3), l'enzyme apparat comme un participant essentiel dans chaque tape de la raction et, sans l'enzyme, la raction ne serait pas possible. Il serait erron de penser que la thse de SPECTOR a t gnralement accepte ; en ralit elle a t reue essentiellement avec indiffrence et mme avec hostilit. Cependant, nous n'avons pas connaissance de l'existence d'une analyse srieuse de ses propositions qui justifierait de les carter, et nous pensons qu'elles doivent recevoir plus d'attention qu'elles n'en ont eu jusqu' prsent. Bien videmment, il n'est pas possible de rsumer un livre entier en quelques lignes et sa discussion est bien plus dtaille que nous n'avons pu le mentionner ici.
6.2.4. Reprsentation schmatique des mcanismes

Comme nous l'avons dj mentionn, la manire d'crire les ractions de transfert de groupe sous la forme GX et Y pour les substrats et X et GY pour les produits est
188
adquate pour prsenter explicitement le transfert du groupe et pour discuter les aspects chimiques des mcanismes, mais elle est moins pratique pour l'criture des quations de vitesse. Dans la suite de ce chapitre, nous reviendrons un systme plus courant qui consiste reprsenter les substrats par A et B et les produits par P et Q. Il est galement appropri de mentionner ce stade la manire schmatique de reprsenter les mcanismes des ractions deux ou plusieurs substrats qui a t introduite par CLELAND (1963). Dans ce systme, les diffrentes formes de l'enzyme sont crites sous une ligne horizontale et des flches verticales sont utilises pour reprsenter la fixation des substrats et la libration des produits (figure 6.5). Ce systme permet de reprsenter de manire simple et claire les mcanismes ordonns et il est largement utilis pour cette raison.
A k1 k1 E EA B k2 k2 EAB k3 k3 P k4 k4 EPQ EQ Q k5 k5 E
a - Mcanisme squentiel ( complexe ternaire) ordonn dans des conditions d'tat stationnaire A k1 k1 EA E EB k3 k3 B k4 k4 A k8 k8 Q EAB B k2 k2 k5 k5 P k6 k6 EP EPQ EQ k9 k9 P E Q k7 k7
b - Mcanisme squentiel ( complexe ternaire) alatoire dans des conditions d'tat stationnaire A k1 k1 E EA k2 k2 P k3 k3 FP F B k4 k4 FB k5 k5 Q k6 k6 EQ E
c - Mcanisme ping-pong ( enzyme modifi) dans des conditions d'tat stationnaire

6.5 - Reprsentation schmatique des mcanismes enzymatiques selon CLELAND
189
Cependant, il devient incommode s'il est ncessaire d'incorporer des branchements ou d'autres complications. Le systme propos par CLELAND utilise galement une nomenclature particulire qui permet de dfinir le nombre de substrats et de produits impliqus dans la raction. Pour une raction impliquant un ractif, le terme uni- est utilis. De la mme manire pour une raction impliquant deux ou trois ractifs les termes bi- et ter- sont utiliss. Ainsi si une raction deux substrats et trois produits cette raction est dfinie comme une raction bi-ter. CLELAND utilise galement des termes diffrents pour dfinir les diffrents types de mcanismes. Les mcanismes complexe ternaire sont appels mcanismes squentiels et les mcanismes enzymes modifis sont appels mcanismes ping-pong (figure 6.5).
6.3. DRIVATION DES QUATIONS DE VITESSE L'TAT STATIONNAIRE

6.3.1. Introduction
En principe, quel que soit le mcanisme, l'quation de vitesse dans des conditions d'tat stationnaire peut tre drive de la mme manire que pour le mcanisme deux tapes de MICHAELIS et MENTEN. En pratique cette mthode peut devenir extrmement fastidieuse et, sauf pour les mcanismes les plus simples, est susceptible de conduire des erreurs. KING et ALTMAN (1956) ont dcrit une mthode schmatique, simple et s'appliquant n'importe quel mcanisme, qui consiste en une srie de ractions entre diffrentes formes d'un enzyme. Elle n'est par contre applicable ni aux ractions non-enzymatiques, ni aux mlanges d'enzymes, ni aux mcanismes qui renferment des tapes non-enzymatiques. Nanmoins, elle est applicable la majorit des situations rencontres dans la catalyse enzymatique et est trs utile dans la pratique. Nous dcrivons et discutons brivement cette mthode dans les paragraphes suivants. La thorie sur laquelle repose la mthode de KING et ALTMAN, est beaucoup plus complexe que son application pratique et puisqu'il n'est pas ncessaire de comprendre la thorie pour l'appliquer, nous nous contenterons ici de donner une description de l'utilisation de cette mthode et nous renvoyons les lecteurs qui seraient intresss par la thorie d'autres ouvrages (ENGEL, 1981).
6.3.2. La mthode de KING et ALTMAN

La mthode de KING et ALTMAN est plus simplement expose en considrant un exemple. Nous avons choisi de considrer comme exemple un des mcanismes les plus importants parmi les mcanismes deux substrats, le mcanisme ordonn complexe ternaire qui peut tre crit comme suit, sous la forme d'une srie d'quations :
190
E + A
k1 k 1 k2 k 2
EA
EA + B EAB EPQ
EAB EPQ [6.4]
k3 k 3 k4 k 4
EQ + P
EQ
E + Q
Aucune constante de vitesse n'est indique pour la troisime raction parce que nous supposons que la vitesse de conversion de EAB en EPQ est suprieure celle des tapes de fixation. Cette simplification entrane que les mesures l'tat stationnaire ne fournissent aucune information sur les isomrisations entre intermdiaires qui sont uniquement des ractions de premier ordre. Pour analyser l'quation d'tat stationnaire, il est ds lors, ncessaire de traiter EAB et EPQ comme une seule et mme espce, mme s'il peut s'avrer plus instructif en regard du mcanisme de les considrer comme des espces distinctes. La premire tape de la mthode de KING et ALTMAN consiste incorporer le mcanisme dans un schma circulaire qui renferme l'ensemble des espces de l'enzyme et qui indique les ractions entre ces espces, comme prsent dans la figure 6.6a pour notre exemple de mcanisme ordonn complexe ternaire. Toutes les ractions doivent tre traites comme des ractions de premier ordre, ce qui EA, signifie que les ractions de second ordre, comme la raction E + A doivent tre caractrises par des constantes de pseudo-premier ordre ; ainsi dans notre exemple, la constante de second ordre k1 est remplace par la constante de pseudo-premier ordre k1 [ A ] en incluant la concentration de A. Dans une deuxime tape, un profil central (figure 6.6b) est dessin qui correspond l'ossature du schma ractionnel, dans ce cas il s'agit d'un carr. Il est alors ncessaire d'identifier l'ensemble des profils qui sont constitus de lignes appartenant au profil central uniquement, connectent chaque paire de formes de l'enzyme et ne contiennent aucune boucle ferme. Chacun de ces profils renferme une ligne de moins que le nombre de formes de l'enzyme ; dans l'exemple choisi, il existe quatre profils de ce type qui sont reprsents dans la figure 6.6c.
191
E+A k4 k4[Q]
k1[A] k1
EA k2 k2[B]
EQ
k3[P] k3
EAB EPQ b - Profil central driv du schma
a - Schma circulaire de la raction
c - Ensemble complet des profils de KING-ALTMAN drivs du profil central
d - Exemples de profils qui ne satisfont pas les rgles exposes dans le texte k1 k2 k3[P] k4 k1 k2 k4 k3 k1 k4 k2[B] k3
e - Profils avec addition de flches de sorte que chacun se termine en E et prcisant les constantes de vitesse
6.6 - La mthode de KING et ALTMAN pour driver les quations de vitesse Chacun de ces profils orients correspond au produit des constantes de vitesse prsent en dessous.
Dans cet exemple, l'application de ces rgles semble vidente, mais la situation peut tre diffrente avec des mcanismes plus complexes et pour viter tout malentendu il peut s'avrer utile de considrer trois profils errons, qui satisfont uniquement deux rgles sur trois. Ces profils sont prsents dans la figure 6.6d. Pour chaque forme de l'enzyme, des flches sont traces sur les lignes des profils acceptables, de telle sorte que chaque profil conduit la forme considre de l'enzyme sans considration pour l'endroit du schma o nous commenons. Ainsi, pour la forme libre de l'enzyme E, les quatre profils de la figure 6.6c sont reprsents comme dans la figure 6.6e. Chaque profil est alors interprt comme un produit de constantes de vitesse spcifies par les flches par rfrence au
192
mcanisme complet de la figure 6.6a, et l'ensemble des quatre profils est interprt comme la somme de quatre produits de ce type. Par exemple, dans la figure 6.6e, le premier profil donne le terme : k 1k 2 k 3 [ P ] , et l'ensemble complet des profils conduisant E donne le terme : ( k 1k 2 k 3 [ P ] + k 1k 2 k 4 + k 1k3k 4 + k 2 k3k 4 [ B ]) . Cette somme devient alors le numrateur d'une expression qui reprsente la fraction de la concentration totale d'enzyme [ E ]0 qui existe sous la forme E l'tat stationnaire :
( k 1k 2 k 3 [ P ] + k 1k 2 k 4 + k 1k3k 4 + k 2 k3k 4 [ B ]) [E] = [ E ]0 D
[6.5]
En procdant exactement de la mme manire pour les trois autres formes de l'enzyme, nous obtenons trois fractions supplmentaires :
(k1k 2k 3 [ A ][ P ] + k1k 2k 4 [ A ] + k1k3k 4 [ A ] + k 2k 3k 4 [ P ][ Q ] ) [ EA ] = [ E ]0 D

k1k 2 k 3 [ A ][ B ][ P ] + k1k 2 k 4 [ A ][ B ] + k 1k 3k 4 [ P ][ Q ] + k 2 k 3k 4 [ B ][ P ][ Q ] [ EAB ] + [ EPQ ] = D [ E ]0
[6.6]
[6.7]
(k1k 2k3 [ A ][ B ] + k 1k 2k 4 [ Q ] + k 1k3k 4 [ Q ] + k 2k3k 4 [ B ][ Q ] ) [6.8] [ EQ ] = [ E ]0 D

Puisque ces quatre formes sont les quatre seules formes de l'enzyme, la somme de ces quatre fractions doit tre gale 1, ce qui signifie que le dnominateur D dans chacune des fractions doit tre la somme des numrateurs, c'est--dire la somme des 16 produits obtenus partir des profils. La vitesse de la raction est alors donne par (la somme des vitesses des tapes qui gnrent un produit particulier) moins (la somme des vitesses des tapes qui consomment le mme produit). Dans notre exemple, il existe une seule tape qui EQ + P, et une seule tape qui consomme gnre le produit P, (EAB + EPQ) (EAB + EPQ), et donc : P, EQ + P d[ P ] v = dt
= k3 ( [ EAB ] + [ EPQ ] ) k 3 [ EQ ][ P ]
k1k 2 k3k 3 [ A ][ B ][ P ] + k1k 2 k3k 4 [ A ][ B ] + k 1k 3k3k 4 [ P ][ Q ] + k 2 k 3k3k 4 [ B ][ P ][ Q ] [ E ]0 k k k k [ A ][ B ][ P ] k 1k 2 k 3k 4 [ P ][ Q ] 1 2 3 3 k 1k 3k3k 4 [ P ][ Q ] k 2 k 3k3k 4 [ B ][ P ][ Q ] = D (k1k 2k3k 4 [ E ]0 [ A ][ B ] k 1k 2k 3k 4 [ E ]0 [ P ][ Q ] ) = D
[6.9]
193
Dans la plupart des cas, il est plus important de connatre la forme de l'quation de vitesse dans des conditions d'tat stationnaire que de connatre son expression dtaille en termes de constantes individuelles de vitesse. Il est donc commode d'exprimer l'quation de vitesse sous la forme de coefficients qui permettent de prdire directement les proprits exprimentales d'un mcanisme donn. Dans notre exemple, l'quation de vitesse peut tre crite de manire simplifie :
v =
[ E ]0 ( N1 [ A ][ B ] N 1 [ P ][ Q ]) D0 + D1 [ A ] + D2 [ B ] + D3 [ P ] + D4 [ Q ] + D5 [ A ][ B ] + D6 [ A ][ P ] + D7 [ B ][ Q ] + D8 [ P ][ Q ] + D9 [ A ][ B ][ P ] + D10 [ B ][ P ][ Q ]
[6.10]
o les coefficients prennent les valeurs suivantes :
N1 = k1k 2 k3k 4 ; N 1 = k 1k 2 k 3k 4 ; D0 = k 1( k 2 + k3 )k 4 ; D1 = k1( k 2 + k3 )k 4 ; D2 = k 2 k3k 4 ; D3 = k 1k 2 k 3 ; D4 = k 1( k 2 + k3 )k 4 ; D5 = k1k 2 ( k3 + k 4 ) ; D6 = k1k 2 k 3 ; D7 = k 2 k3k 4 ; D8 = ( k 1 + k 2 )k 3k 4 ; D9 = k1k 2 k 3 ; D10 = k 2 k 3k 4 .
6.3.3. La mthode de WONG et HANES

Bien que la mthode de KING et ALTMAN vite de gnrer au dnominateur de l'quation de vitesse des termes qui seraient simplifis par la suite par soustraction, et dispense ainsi d'un travail inutile (et des erreurs qui pourraient en dcouler), elle ne permet pas d'viter les simplifications dans le numrateur. Dans l'quation [6.9], par exemple, huit termes apparaissent initialement dans le numrateur qui se simplifient par soustraction entre eux pour ne laisser que deux termes. Il est surprenant que les deux termes du numrateur qui persistent, soient relativement concis par rapport aux six qui ont disparus : le terme positif du numrateur consiste dans le produit de la concentration totale d'enzyme, des concentrations des substrats pour la raction directe et des quatre constantes de vitesse qui dcrivent un cycle du mcanisme dans le sens direct ; le terme ngatif du numrateur correspond au produit de la concentration totale d'enzyme, des concentrations des substrats dans la raction inverse et des quatre constantes de vitesse qui dcrivent un cycle du mcanisme dans le sens inverse. Cette situation apparat clairement si nous reprsentons les flches correspondantes dans les profils d'une sorte de mthode inverse de KING et ALTMAN, comme dans la figure 6.7.
k1[A]
6.7 - Mthode de WONG et HANES pour dterminer le numrateur de l'quation de vitesse
k1 k4[Q] k2
k4
k2[B] k3
k3[P]
Cette proprit a t gnralise par WONG et HANES (1962) sous la forme d'une rgle structurale pour le numrateur de l'quation de vitesse. Initialement, le profil
194
central est dessin, exactement comme dans la mthode de KING et ALTMAN (figure 6.6b), mais ensuite ne sont considrs que les profils qui : contiennent uniquement des lignes du profil central, connectent chaque paire de formes de l'enzyme, renferment une flche partant de chaque forme de l'enzyme, renferment un seul cycle correspondant une raction complte dans le sens direct ou dans le sens inverse. Dans un mcanisme simple comme celui que nous avons considr jusqu' prsent, le cycle consiste dans le profil central dans sa totalit. Cependant, dans les cas plus complexes, des formes additionnelles de l'enzyme peuvent exister en dehors du cycle catalytique : les lignes connectant celles-ci au cycle doivent avoir des flches qui les conduisent au cycle. Finalement, nous crivons les termes du numrateur comme une somme algbrique, de sorte que chaque profil qui accomplit la raction directe donne un produit positif et chaque profil qui accomplit la raction inverse donne un produit ngatif. Si le cycle convertit plus d'un quivalent stchiomtrique, il doit tre pondr de manire adquate. Si le cycle de la figure 6.6b reprsente la raction 2A + 2B 2P + 2Q il sera incorpor dans l'quation de vitesse avec un coefficient stchiomtrique de 2.
6.3.4. Modifications de la mthode de KING et ALTMAN

La mthode de KING et ALTMAN comme nous l'avons dcrite est utile et facile appliquer n'importe lequel des mcanismes les plus simples. Cependant, les mcanismes complexes ncessitent souvent d'identifier un grand nombre de profils. La drivation est alors trs laborieuse et susceptible de gnrer des erreurs, et nous pouvons aisment interprter incorrectement un profil ou crire des termes incorrects. Bien qu'en principe, il soit possible de calculer le nombre total de profils (KING et ALTMAN, 1956 ; CHOU et al., 1979), cette procdure est laborieuse, sauf pour les mcanismes simples, parce que des corrections sont ncessaires pour tous les cycles du mcanisme. De plus, connatre le nombre de profils attendus peut s'avrer sans utilit pour les trouver et ne diminue en rien la quantit de travail ncessaire pour crire ces termes. En gnral, il est prfrable, pour les mcanismes complexes, de chercher simplifier la procdure. VOLKENSTEIN et GOLDSTEIN (1966) ont tabli certaines rgles pour raliser cela, dont les plus simples sont nonces ci-dessous : 1. Si deux ou plusieurs tapes impliquent la conversion de la mme paire de formes de l'enzyme, ces tapes peuvent tre condenses en une seule en additionnant les constantes de vitesse pour les tapes parallles. Par exemple, si le mcanisme de MICHAELIS et MENTEN est reprsent selon le schma de KING et ALTMAN (figure 6.8a), uniquement deux profils doivent tre considrs, et . Puisque ces deux ractions connectent la mme paire de formes de l'enzyme, celles-ci peuvent tre additionnes comme dans la figure 6.8b. Le
195
profil central qui rsulte, devient le seul profil reprsentant le mcanisme et ainsi les expressions pour [ E ] et [ EA ] peuvent tre drives immdiatement : [E] k 1 + k 2 = [6.11] [ E ]0 k 1 + k 2 + k1 [ A ] + k 2 [ P ]
[ EA ] k1 [ A ] + k 2 [ P ] = [ E ]0 k 1 + k 2 + k1 [ A ] + k 2 [ P ]
k1[A]
6.8 - Collapsus d'une paire d'tapes parallles (a) connectant la mme paire de formes de l'enzyme en additionnant les constantes de vitesse pour donner une seule tape (b)
[6.12]
k1 k2[P] k2 a
EA
k1[A] + k2[P] k1 + k2 b
EA
2. Si le mcanisme renferme diffrentes espces d'enzyme qui possdent des proprits identiques, la procdure est largement facilite en traitant ceux-ci comme une seule espce. Par exemple, si un enzyme renferme deux sites actifs identiques, le mcanisme peut tre reprsent comme dans la figure 6.9a. Trait de cette manire ce mcanisme ncessite 32 profils, mais si nous tirons parti de la symtrie par rapport la ligne en pointills, comme prsent dans la figure 6.9b, le traitement se simplifie et ncessite uniquement quatre profils, qui peuvent encore tre simplifis en utilisant la rgle (1) concernant l'addition des tapes parallles (figure 6.9c).
k2 E k1[A] k1 EA E k2 2 k1[A] k1 EA
k2 k1 k1[A] k3[A] k3
k3 k3[A] k4 EAA 2 k1[A] k1 + k2
2 k3 k3[A] 2 k4
EA
EA2 b - Prise en compte de la symtrie E EA k3[A] 2 (k3 + k4) EA2
k4 a - Mcanisme complet
c - Addition d'tapes parallles

6.9 - Simplification d'un modle complexe en utilisant les facteurs statistiques pour remplacer des tapes identiques Le mcanisme prsent en (a) est symtrique par rapport la ligne en pointills et possde exactement les mmes proprits l'tat stationnaire que le mcanisme plus simple prsent en (b).
196
En consquence, ce mcanisme ncessite uniquement deux profils et les expressions pour les concentrations peuvent tre crites directement :
2 k 1 + k 2 k 3 + k 4 [E] = [ E ]0 2 k 1 + k 2 k 3 + k 4 + 4k1 k 3 + k 4 [ A ] + 2k1k 3 [ A ] 2
)(
)( (
[6.13]
Les facteurs statistiques apparaissent toujours quel que soit l'avantage qui puisse EA tre tir de la symtrie du profil central. Dans cet exemple, la raction E peut se drouler de deux manires diffrentes, et donc la vitesse totale est la somme de deux vitesses, donnant une constante de vitesse 2 k1 [ A ] qui correspond au double de la constante de vitesse sur chacun des deux chemins individuels. La raction inverse EA E + A, d'un autre ct, peut se drouler d'une seule manire et se caractrise par un facteur statistique de 1. Ainsi, sa constante de vitesse reste k 1 . 3. Si le profil central consiste en deux ou plusieurs parties distinctes en contact au niveau d'une seule forme de l'enzyme, il est commode de traiter sparment chacune des parties. Un exemple simple de cette approche est fourni dans le cas de substrats comptitifs (figure 6.10), dans lequel un seul enzyme catalyse simultanment deux ractions distinctes avec des substrats diffrents.
EA' k'1[A'] k'2 k'2 k'3 EP' k'3[P'] E k3[P] k3 k'1 k1[A] k1 k2 k2 EA
6.10 - Mcanisme dans lequel deux parties indpendantes sont connectes entre elles par l'intermdiaire d'une forme unique de l'enzyme (dans ce cas, il s'agit de la forme E)
EP
Dans ce cas, les expressions pour chacune des formes de l'enzyme sont le produit des sommes correspondant aux moitis gauche et droite du profil central :
( k'1k'2 + k'1k' + k'2 k' )( k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3 ) [E] 3 3 = [ E ]0 D ( k'1k'2 + k'1k' + k'2 k' )( k1k 2 [ A ] + k1k3 [ A ] + k 2 k 3 [ P ]) [ EA ] 3 3 = [ E ]0 D ( k'1k'2 + k'1k3 + k'2 k3 )( k1k 2 [ A ] + k 1k 3 [ P ] + k 2 k 3 [ P ]) ' ' [ EP ] = [ E ]0 D ( k1 k'2 [ A' ] + k1 k3 [ A' ] + k'2 k'3 [ P' ])( k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3 ) ' ' ' [ EA' ] = [ E ]0 D ( k1 k'2 [ A' ] + k'1k'3 [ A' ] + k'2 k'3 [ P' ])( k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3 ) ' [ EP' ] = [ E ]0 D
[6.14] [6.15] [6.16] [6.17] [6.18]
197
Le numrateur dans l'expression de [ E ] [ E ]0 est le produit de deux sommes : la premire provient des profils qui conduisent E dans la moiti gauche du profil central et elle apparat inchange dans les numrateurs pour EA et EP ; la seconde somme provient des profils qui conduisent E dans la moiti droite du profil central et elle apparat inchange dans les numrateurs de EA' et de EP'. L a seconde somme du numrateur de EA provient de profils qui conduisent EA dans la moiti droite du profil central et de mme pour EP. La premire somme du numrateur de EA' provient des profils qui conduisent EA' dans la moiti gauche du profil central et de mme pour EP'.
6.3.5. Ractions renfermant des tapes l'quilibre

Certains mcanismes sont assez importants pour justifier une analyse dtaille, mais ils sont parfois tellement complexes que, mme en utilisant les mthodes dcrites ci-dessus, ils gnrent des quations de vitesse trop compliques pour tre manipules. Dans de tels cas, certaines simplifications doivent tre envisages et des simplifications importantes peuvent souvent tre obtenues si certaines tapes, telles les tapes de fixation de protons, sont supposes l'quilibre dans les conditions d'tat stationnaire. Ces suppositions peuvent bien sr se rvler fausses lors d'tudes plus approfondies, mais elles sont trs utiles en premire approximation. CHA (1968) a dcrit une mthode pour l'analyse des mcanismes renfermant des tapes l'quilibre qui est beaucoup plus simple que la mthode de KING et ALTMAN parce que chaque groupe de formes de l'enzyme en quilibre peut tre trait comme une seule espce. Par exemple, considrons le mcanisme de la figure 6.11, pour un enzyme dans lequel la forme non-protonne E0 et la forme protonne HE+ sont catalytiquement actives mais se caractrisent par des constantes cintiques diffrentes (dans le traitement habituel de l'influence du pH sur le comportement des enzymes que nous traiterons au chapitre 9, nous supposerons qu'un seul tat de protonation de l'enzyme est actif, mais ici nous supposons que EA0 et HEA+ peuvent ragir pour donner des produits sinon notre exemple est trivial et ne peut tre utilis pour illustrer la mthode de CHA). Si l'quilibre entre E0 et HE+ est maintenu au cours de l'tat stationnaire, les fractions KE [H+] et des formes E0 et HE+ sont donnes respectivement par KE + [ H + ] KE + [ H + ] de la forme composite E de l'enzyme, o [ H + ] reprsente la concentration d'ion hydrogne et KE est la constante de dissociation de la fonction protonable sur la forme libre de l'enzyme. La vitesse de fixation de A sur E0, qui est donne par k [ E ][ A ] KE et la fixation de A k1 [ E 0 ][ A ] , peut alors s'crire sous la forme 1 KE + [ H + ] sur EH+ peut de manire similaire s'crire
k1 [ E ][ A ][ H + ] ' ; la vitesse totale de KE + [ H + ]
198
fixation de A sur les diffrentes formes de E est donne par [ E ][ A ]( k1 KE + k1 [ H + ]) ' . En effet, les constantes individuelles de vitesse k1 et + KE + [ H ]
k1 KE + k1 [ H + ] ' : de KE + [ H + ] manire plus gnrale, la constante de vitesse composite est la somme des constantes individuelles de vitesse, pondres par la fraction de la forme correspondante de l'enzyme prsente dans le mlange l'quilibre. La libration de A partir de l'espce composite EA et la conversion de la mme espce en produit peuvent tre traites de la mme manire.
k1 ont t remplaces par la constante de vitesse composite '
A + HE+
k'1 k'1
Etapes
HEA+
k'2
HE+ + P
KE A + E0 + H+
KEA EA0 + H+
l'quilibre
KE E0 + P + H+
k1 k1
k2
6.11 - Traitement des tapes l'quilibre Si les tapes de fixation de protons (tapes verticales dans l'exemple donn) sont traites comme des quilibres, le mcanisme peut tre simplifi en traitant les groupes de formes d'enzyme l'quilibre comme des espces uniques.
Tout ceci semble compliquer l'analyse plutt que de la simplifier, mais la rsultante est que le mcanisme original qui aurait ncessit l'emploi de la mthode de KING et ALTMAN a t remplac par un mcanisme plus simple pour lequel nous connaissons dj la solution, c'est--dire le mcanisme de MICHAELIS et MENTEN, bien que les expressions pour les constantes de vitesse soient exceptionnellement complexes. L'quation de vitesse peut donc tre crite immdiatement, en k K + k1 [ H + ] ' et en procdant de la remplaant k1 dans l'quation [3.34] par 1 E KE + [ H + ] mme manire pour k1 et k2. La mthode de CHA est applicable tout mcanisme qui contient des tapes l'quilibre. En gnral, n'importe quel nombre de formes d'enzyme en quilibre les unes avec les autres peut tre trait comme une espce unique, et chaque constante de vitesse ki pour un composant constitue un terme ki fi dans la somme donnant la constante de vitesse pour l'espce composite, o fi reprsente la fraction du composant dans le mlange l'quilibre. Bien que la validit de cette mthode ait t mise en question (SEGEL et MARTIN, 1988), TOPHAN et BROCKELHURST (1992) ont dmontr que les objections mises n'taient pas fondes. L'analyse de ces auteurs
199
a plus d'un intrt, puisque, comme ils le font remarquer, d'autres auteurs ont commis des erreurs similaires et qu'il est important de comprendre comment les viter. Le point essentiel est que ds qu'une srie de ractions forme des cycles, il est ncessaire de tenir compte de toutes les routes parallles qui connectent chaque paire d'espces dans le mcanisme. Plus gnralement, quelle que soit la constante de vitesse suppose pour une des tapes du mcanisme, il est essentiel que le produit de tous les rapports de constantes de vitesse directe et inverse pour les tapes connectant une paire d'espces doivent correspondre la constante d'quilibre pour le processus net. Il devrait tre superflu d'ajouter que cette constante d'quilibre doit tre la mme pour chaque voie parallle correspondant la mme raction. Il s'ensuit qu'un cycle qui ne produit aucun changement net, tel HE+ HEA+ EA0 E0 dans la figure 6.11 doit que le cycle E0 avoir une constante nette d'quilibre gale 1. Le dfaut de comprhension de ce principe a produit quelques ides fausses concernant la manire dont la cooprativit cintique peut apparatre avec un enzyme monomrique avant qu'un modle valable, que nous dcrirons dans le 9.5, ne soit dvelopp. Une mise en garde doit toutefois tre faite au sujet de l'utilisation de la mthode de CHA dans le cas de mcanismes qui renferment des chemins parallles de fixation, tels que les mcanismes dans lesquels deux substrats, A et B, peuvent se fixer dans n'importe quel ordre pour former le complexe ternaire EAB. Puisque l'quation de vitesse pour un tel mcanisme est souvent trop complique pour tre manipule aisment, la pratique courante consiste utiliser des quations drives en supposant que les tapes de fixation sont l'quilibre. D'un point de vue mcanique, il n'existe pas plus de fondement cette hypothse qu'il n'en existe pour les mcanismes un seul substrat ( 3.3.2) mais les quations rsultantes sont souvent en accord avec l'exprience. Le problme provient du fait que les termes additionnels prsents dans la forme rigoureuse de l'quation de vitesse l'tat stationnaire peuvent tre numriquement trs petits ou qu'ils peuvent varier en proportion avec d'autres termes, si bien qu'ils sont quasiment impossibles dtecter comme l'ont discut GULBINSKY et CLELAND (1968) dans leur tude de la galactokinase. Il s'agit d'un point d'importance gnrale pour l'application correcte de l'analyse cintique : plus d'un ensemble d'hypothses peut conduire la mme quation de vitesse ou une famille d'quations de vitesse qui ne sont pas distinguables exprimentalement ; il n'est donc pas possible d'utiliser la concordance des rsultats exprimentaux avec une quation de vitesse comme critre pour valider les hypothses utilises pour driver cette quation.
6.3.6. Analyse des mcanismes par inspection

Raisonnement topologique Il est possible de penser en ralit, cela est tellement vident qu'il semble inutile de le mentionner que le rle essentiel de la mthode de KING et ALTMAN dans
200
l'enzymologie moderne est de driver des quations de vitesse. Cependant, imposer cette limite la mthode de KING et ALTMAN serait une erreur, parce qu'en dehors du contexte de l'enseignement de l'enzymologie il est rare que nous ayons driver des quations de vitesse et de nombreuses quations sont dj connues : de nombreux exemples, la fois des quations de vitesse et de leur drivation, peuvent tre trouvs dans les livres de PLAWMAN (1972), de SEGEL (1975) et de SCHULZ (1994). La vritable importance de la mthode de KING et ALTMAN se situe ailleurs, dans le fait qu'une fois familiaris avec cette mthode, l'utilisateur peut dduire certaines conclusions sur les proprits d'tat stationnaire des mcanismes enzymatiques sans avoir recours explicitement l'algbre, un procd que WONG (1975) a appel avec justesse un raisonnement topologique. Dans la mthode de KING et ALTMAN, chaque profil gnre un terme positif et chaque terme apparat dans le dnominateur de l'quation de vitesse. Puisqu'il n'existe aucun terme ngatif, aucun des termes ne peut s'liminer par soustraction et donc chaque terme correspondant un profil rpertori doit apparatre dans l'quation de vitesse. La seule exception cette rgle est que quelquefois le numrateur et le dnominateur partagent un facteur commun qui peut alors s'liminer par division, mais ceci a lieu uniquement s'il existe des symtries dans le mcanisme de sorte que certaines constantes de vitesse apparaissent plus d'une fois. Mcanismes avec des voies alternatives Dans les mcanismes pour lesquels il n'existe aucune relation entre les constantes de vitesse en plus de celles requises par la thermodynamique, il est prudent de supposer qu'aucune simplification n'est possible entre le numrateur et le dnominateur et que donc chaque profil gnre un terme qui apparat dans l'quation de vitesse. Considrons par exemple le mcanisme prsent dans la figure 6.11, mais sans supposer que les tapes de fixation de protons soient l'quilibre : n'y a-t-il pas certaines conclusions que nous puissions tablir au sujet de la manire dont l'quation de vitesse diffre de celle tablie partir de l'hypothse de l'quilibre et cela sans avoir driver l'quation ? Si aucune des tapes n'est l'quilibre, la mthode de KING et ALTMAN doit gnrer des termes en [ A ] 2 et [ B ] 2 , puisque nous pouvons facilement trouver des profils qui contiennent deux tapes de fixation de A ou deux tapes de fixation de H+, par exemple le profil qui se termine EA0 et HE+ HEA+ EA0. EA0 et qui consiste dans la raction E0 Ainsi, simplement en inspectant le mcanisme, nous pouvons dduire que l'quation de vitesse est du second ordre en [ A ] et en [ H + ] . Notons que cette dduction peut tre faite sans rien crire sur le papier, ni dessiner les profils, ni driver l'quation (bien que l'analyse serait facilite si nous rcrivions le mcanisme sous une forme circulaire comme dans la figure 6.6a, de sorte que E0 et HE+ n'apparaissent pas deux fois chacun).
201
Les tapes en cul-de-sac A ct de sa valeur d'inspection pour tudier des mcanismes particuliers, la mthode de KING et ALTMAN peut galement tre utilise pour tirer des conclusions importantes et significatives sur les mcanismes en gnral. Considrons par exemple l'effet de l'addition d'une tape au mcanisme de la figure 6.6a, dans laquelle B se fixe sur EQ pour former un complexe cul-de-sac EBQ qui est incapable de ragir autrement qu'en librant B pour reformer EQ, comme le montre la figure 6.12. Pour chaque forme de l'enzyme dans le mcanisme original, c'est-dire chaque forme l'exception de EBQ, chacun des profils de KING et ALTMAN EQ, et donc chacune des formes de l'enzyme doit renfermer la raction EBQ l'exception de EBQ doit avoir la mme expression que prcdemment sauf que cette dernire est multiplie par k5. Puisque la seule voie pour former EBQ part de EQ, il est vident que chaque profil pour EBQ doit tre le mme que pour EQ o la raction EBQ EQ est remplace par EQ EBQ, et ainsi l'expression pour EBQ doit tre la mme que celle pour EQ dans laquelle k5 est remplac par k5 [ B ] , c'est--dire que le rapport [ EBQ ] [ EQ ] doit tre k5 [ B ] k 5 . Puisque k5 k 5 est la constante d'association, cela signifie que ces tapes doivent tre l'quilibre dans les conditions d'tat stationnaire. L'quation de vitesse dans son ensemble doit tre la mme que pour le mcanisme sans l'inhibition par le complexe en cul-de-sac, except que tous les termes en EQ dans le dnominateur k [ B ] sont multiplis par 1 + 5 . k 5
Une tape en cul-de-sac (conversion de EQ en EBQ dans cet exemple) est toujours l'quilibre dans les conditions d'tat stationnaire.
Etape en cul-de-sac
k1[A] k1
EA
k4 k4[Q] k3[P] k3
k2 k2[B]
6.12 - Mcanisme avec un complexe en cul-de-sac
EBQ
k5 k5[B]
EQ
EAB EPQ
Une simple rflexion montre que la conclusion n'est pas particulire au mcanisme considr, mais qu'elle s'applique n'importe quel mcanisme qui renferme des tapes en cul-de-sac, mme si celles-ci forment une srie, c'est--dire mme si plusieurs tapes sont ncessaires pour connecter le complexe en cul-de-sac au reste du mcanisme : dans un mcanisme donn, les ractions en cul-de-sac sont l'quilibre dans les conditions d'tat stationnaire. Nous pouvons comprendre en terme de mcanisme (c'est--dire sans avoir recours l'algbre) pourquoi cette conclusion s'applique, en prenant conscience que la raison pour laquelle les ractions ordinaires l'tat stationnaire ne sont pas l'quilibre rside dans le fait que le flux de ractifs est un processus de dsquilibre perptuel : l'apport constant
202
de ractifs d'un ct et l'limination des produits de l'autre. Cependant, il n'y a aucun flux net des ractifs travers les ractions en cul-de-sac, et donc aucun dsquilibre correspondant qui interfre avec l'tablissement d'un quilibre.
6.3.7. Drivation des quations de vitesse par ordinateur

La drivation des quations de vitesse, que se soit par la mthode de KING et ALTMAN ou par toute autre mthode, est un processus purement mcanique et son succs ou son chec dpend de notre capacit viter les erreurs plutt que de notre aptitude prendre des dcisions intelligentes. Ce processus peut donc tre implment dans une procdure assiste par ordinateur et un certain nombre de programmes ont t dcrits pour la drivation d'quations de vitesse (RHOADS et PRING, 1968 ; HURST, 1967, 1969 ; FISHER et SHCULZ, 1969 ; RUDOLPH et FROMM , 1971 ; KINDELERER et AINSWORTH, 1976 ; CORNISH-BOWDEN, 1977 ; OLAVARRA, 1986). Malheureusement tous ces programmes ont t crits en FORTRAN ou dans d'autres langages qui ne sont plus couramment utiliss aujourd'hui, mais leur adaptation des systmes modernes ne doit pas poser de problme insurmontable une fois que la mthodologie est parfaitement comprise. Pour implmenter la mthode de KING et ALTMAN sur un ordinateur, il est commode de considrer le processus de drivation comme une srie d'oprations sur un tableau de constantes de vitesse plutt que comme l'quivalent algbrique d'un exercice de reconnaissance de profil, parce que l'interprtation de relations gomtriques est trs difficile raliser avec un ordinateur. Le tableau 6.1 reprsente le mme exemple que celui que nous avons considr dans le 6.3.2, c'est-dire celui de l'quation [6.4] et pour obtenir un produit correct des constantes de vitesse pour un profil se terminant E, nous pouvons prendre la premire constante de vitesse disponible pour chaque ligne du tableau l'exception de la premire, assure que le produit ne contient c'est--dire k 1k 2 k 4 : l'omission de la ligne E aucun terme correspondant la consommation de E et l'inclusion de toutes les autres lignes assure qu'il y a exactement une tape dmarrant de chacun des autres intermdiaires. Cependant, ceci est uniquement le premier de tous les produits possibles. Pour obtenir les autres, nous remplaons la constante de vitesse de la ligne EQ par chacune des autres possibilits dans cette ligne, ce qui donne k 1k 2 k 3 [ P ] comme l'unique nouveau produit possible. Nous passons alors la seconde position de la ligne prcdente, la ligne (EAB + EPQ) , et de nouveau, nous choisissons toutes les possibilits partir de la ligne EQ , ce qui donne k 1k3k 4 et k 1k3k 3 [ P ] . S'il y avait d'autres possibilits dans la ligne (EAB + EPQ) , nous ferions de mme pour chacune d'entre elles, mais il n'y a en aucune, et donc nous pouvons procder l'lment suivant de la ligne en prenant toutes les possibilits partir des lignes (EAB + EPQ) et EA EQ .
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS Tableau 6.1 - Drivation automatique des quations de vitesse a - Matrice de constantes de vitesse E EA (EAB + EPQ) Aucun
203
EQ
E EA (EAB + EPQ) EQ
Aucun
k1 [ A ]
Aucun
k 4 [ Q ]
Aucun
k 1
Aucun
k2 [ B ]
Aucun
k 2
Aucun
k3
Aucun
k4
k 3 [ P ]
b - Identification des produits cycliques E? Cyclique ? Non Non Non Oui Oui Oui Non Oui
k 1 k 2 k 4 k 1 k 2 k 3 [ P ] k 1 k3 k 4 k 1 k3 k 3 [ P ] k 2 [ B ] k 2 k 4 k 2 [ B ] k 2 k 3 [ P ] k 2 [ B ] k3 k 4 k 2 [ B ] k3 k 3 [ P ]
Oui Oui Oui Oui Oui Non Oui Non
Au total, huit produits peuvent tre gnrs de cette faon, comme indiqu dans la partie infrieure du tableau 6.1. Cependant, tous ceux-ci ne sont pas valables puisque certains ne contiennent pas d'tape vers E et que certains sont cycliques. En principe, il n'est pas ncessaire de vrifier si un produit renferme une tape vers une espce cible puisque n'importe quel produit non-cyclique doit satisfaire cette contrainte. Cependant, il est beaucoup plus facile de vrifier si le produit contient une tape vers E que de vrifier si celle-ci est cyclique, puisqu'un produit qui conduit E doit obligatoirement contenir au moins une constante de vitesse de la colonne E. Il est donc prfrable d'liminer les produits qui ne renferment pas une des constantes de vitesse de la colonne E avant de vrifier s'il n'y a pas de produit cyclique. Dans le cas du tableau 6.1, la reconnaissance de produits cycliques est triviale puisque le seul type de cycle possible dans ce mcanisme est celui qui comprend la constante de vitesse caractristique de la direction directe et de la direction inverse pour une mme tape, comme dans le terme k 1k3k 3 [ P ] qui renferme les constantes de vitesse directe et inverse pour l'tape 3. Toutefois, des cycles plus complexes peuvent faire partie de mcanismes plus compliqus, et un programme devrait tre capable de les reconnatre.
204
Conceptuellement, la manire la plus simple (mais peut tre pas la plus efficace) de dterminer si un produit est cyclique consiste dmarrer tour tour avec chacune des constantes de vitesse contenue dans le produit et suivre au moins n 1 tapes jusqu' ce que l'espce cible soit atteinte. Par exemple, considrons k 2 [ B ]k3k 4 et (EAB + EPQ) et donc commenons avec k 2 [ B ] : ceci provient de la colonne qui est nous devons trouver la constante de vitesse dans la ligne (EAB + EPQ) k3 ; celle-ci se situe dans la colonne EQ et donc nous cherchons la constante qui est k4 ; celle-ci est dans la colonne E et de vitesse dans la ligne EQ donc le processus est termin avec succs en 3 tapes (3 = n 1 dans notre exemple). Comme les deux autres lments dans ce produit avaient t tests dans la vrification de k 2 [ B ] , il n'est pas ncessaire de les tester nouveau. Cependant, si nous avions dmarr avec k3 la vrification ne serait pas passe par k 2 [ B ] et il aurait donc t ncessaire de le tester sparment. Cette mthode de vrification pour les produits cycliques peut sembler fastidieuse mais nous devons tre prudents et ne pas tre sduits par la possibilit de prendre des raccourcis qui ne garantissent pas toujours l'obtention de rsultats corrects. Par exemple, pour de nombreux mcanismes, tout produit qui renferme plusieurs fois la mme constante de vitesse ou qui renferme la fois les constantes de vitesse directe et inverse pour la mme tape, est cyclique. Cependant, nous ne pouvons pas supposer que cela est toujours vrai parce que certains types de symtrie dans le mcanisme enzymatique peuvent entraner l'apparition plusieures reprises d'une ou de plusieurs constantes de vitesse comme par exemple dans la figure 6.9a. Certaines des mthodes publies pour l'analyse des mcanismes par ordinateur (pas parmi celles cites ci-dessus) n'intgrent pas les prcautions ncessaires et fournissent des rsultats incorrects pour de tels mcanismes. Aprs limination des produits incorrects, la somme des autres termes donne l'expression pour [ E ] [ E ]0 , comme dans l'quation [6.5] :
(k 1k 2k 4 + k 1k 2k 3 [ P ] + k 1k3k 4 + k 2 [ B ]k3k 4 ) [E] = [ E ]0 D
[6.19]
La conversion de cette quation dans l'quation [6.6], c'est--dire l'expression correspondante pour [ EA ] [ E ]0 , ncessite maintenant d'analyser chaque produit dans la somme pour identifier le chemin de EA vers E qu'il renferme et de retourner les constantes de vitesse pour cette partie du produit tout en laissant le reste inchang. Dans le cas de k 1k 2 k 4 , par exemple, le chemin de EA E ncessite juste k 1 , celui-ci est remplac par k1 [ A ] . Le produit k 2 k 4 est laiss inchang et le produit dans sa totalit est remplac par k 1 [ A ]k 2 k 4 . En ralisant cette opration pour chaque produit l'un aprs l'autre et ensuite pour (EAB + EPQ) et (EQ) fournit des quations quivalentes aux quations [6.6] [6.8]. Cette approche fournit la base d'une mthode de drivation par ordinateur quivalente la mthode de KING et ALTMAN. Le numrateur peut tre trait en appliquant le mme type de logique que celle comprise dans les rgles de WONG et HANES ( 6.3.3) et il est alors ais d'obtenir l'quation complte de vitesse.
205
6.4. LES QUATIONS DE VITESSE

6.4.1. Mcanisme de type ordonn complexe ternaire
Les mesures cintiques dans des conditions d'tat stationnaire ont dmontr leur incontestable valeur pour permettre de distinguer les diffrents mcanismes ractionnels dans les ractions de transfert de groupe. Le dveloppement des mthodes cintiques reprsente un travail considrable en raison du nombre de possibilits et des diffrences minimes qui existent entre les divers mcanismes cintiques. SEGAL, KACHMAR et BOYER (1952) ont t parmi les premiers reconnatre l'importance d'une approche systmatique, et ils ont driv les quations pour plusieurs mcanismes. Ensuite, ALBERTY (1953, 1958) et DALZIEL (1957) ont fait largement progresser le champ des connaissances relatives aux ractions de transfert et ils ont introduit la plupart des mthodes dcrites dans ce chapitre. Puisque toutes les mthodes d'analyse cintique dans des conditions d'tat stationnaire qui permettent de distinguer les diffrents mcanismes reposent sur la comparaison des quations compltes de vitesse, nous allons commencer par introduire brivement ces quations et la procdure suivre pour les obtenir, avant de discuter des mthodes d'analyse proprement dites. L'quation pour un mcanisme ordonn complexe ternaire est prsente en premier puisqu'elle a t drive dans le 6.3.2 en utilisant la mthode de KING et ALTMAN (quation [6.10]) :
v =
[ E ]0 ( N1 [ A ][ B ] N 1 [ P ][ Q ]) D0 + D1 [ A ] + D2 [ B ] + D3 [ P ] + D4 [ Q ] + D5 [ A ][ B ] + D6 [ A ][ P ] + D7 [ B ][ Q ] + D8 [ P ][ Q ] + D9 [ A ][ B ][ P ] + D10 [ B ][ P ][ Q ]
[6.20]
Cette quation contient treize coefficients, mais ceux-ci sont dfinis partir de huit constantes de vitesse, de sorte qu'il doit exister des relations entre les coefficients qui ne sont pas explicitent dans l'quation. De plus, les coefficients n'ont pas de signification mcanique apparente. De nombreux systmes ont t utiliss pour rcrire les quations de vitesse dans des termes plus significatifs ; celui que nous utilisons dans ce manuel est celui prconis par l'IUBMB (IUB, 1982), et drive de la classification des constantes selon trois types introduite par CLELAND (1963) : les vitesses limites, les constantes de MICHAELIS et les constantes d'inhibition. En gnral, une constante de MICHAELIS KmA pour un substrat A correspond au Km dans une raction un seul substrat et une constante d'inhibition KiA est lie aux valeurs de Kic et de Kiu obtenues quand le substrat A est utilis comme un produit se comportant en inhibiteur de la raction inverse (mais n'est pas obligatoirement identique l'un de ceux-ci). Dans certaines circonstances, les constantes d'inhibition correspondent d'authentiques constantes de dissociation des substrats et dans ces cas, il est possible de mettre cette caractristique en vidence en utilisant un symbole du type KsA plutt que KiA Si les concentrations relles de l'enzyme sont connues, les vitesses limites peuvent tre converties en constantes catalytiques
206
et la dfinition des constantes de spcificit dcoule naturellement de la dfinition expose pour les ractions un seul substrat ( 3.3.4). Dans ce systme, l'quation [6.20] peut tre rcrite sous la forme suivante :
V1 [ A ][ B ] V1 [ P ][ Q ] KiA KmB KmP KiQ v = [ A ] KmA [ B ] KmQ [ P ] [ Q ] [ A ][ B ] KmQ [ A ][ P ] + + + + + 1+ KiA KiA KmB KmP KiQ KiQ KiA KmB KiA KmP KiQ KmA [ B ][ Q ] [ P ][ Q ] [ A ][ B ][ P ] [ B ][ P ][ Q ] + + + + KiA KmB KiQ KmP KiQ KiA KmB KiP KiB KmP KiQ
[6.21]
La comparaison avec les dfinitions donnes aprs l'quation [6.9] montre que les paramtres cintiques doivent avoir les valeurs donnes dans le tableau 6.2. Bien que cette quation semble complexe, elle renferme plus de rgularits qu'il n'apparat au premier coup d'il. Les termes qui contiennent [ Q ] sont gnralement similaires ceux qui contiennent [ A ] , alors que ceux qui contiennent [ P ] sont similaires ceux qui contiennent [ B ] . L'quation dans son ensemble satisfait videmment aux contraintes habituelles de respect des dimensions ( 1.2.5), mais il est possible d'analyser cette quation en ignorant pour le moment le fait que toutes les concentrations, constantes de MICHAELIS et constantes d'inhibition ont la mme dimension : si nous supposons que [ A ] , KmA et KiA possdent une dimension spciale A, [ B ] , KmB et KiB une dimension B (diffrente de A) , alors tous les termes du dnominateur n'ont pas de dimensions ; n'importe quel ractif qui apparat au numrateur d'un terme, soit sous la forme d'un terme de concentration, soit sous la forme d'un indice, apparat galement dans le dnominateur.
6.4.2. Mcanisme de type alatoire complexe ternaire

L'quation pour le mcanisme alatoire complexe ternaire dans des conditions d'quilibre rapide est la suivante :
V1 [ A ][ B ] V1 [ P ][ Q ] KiA KmB KmP KiQ v = [ A ] [ B ] [ P ] [ Q ] [ A ][ B ] [ P ][ Q ] 1+ + + + + + KiA KiB KiP KiQ KiA KmB KmP KiQ
[6.22]
Il peut sembler surprenant que l'quation la plus simple corresponde au mcanisme le plus complexe ; l'explication provient du fait que l'quation [6.22], au contraire de l'quation [6.21], a t drive en supposant que toutes les tapes, hormis la conversion des complexes ternaires EAB et EPQ, sont l'quilibre, une supposition qui provoque la disparition de nombreux termes, y compris des termes qui renferment des concentrations au carr.
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS Tableau 6.2 - Dfinitions des paramtres cintiques pour un mcanisme ordonn Mcanisme complexe ternaire Mcanisme enzyme modifi
207
k1[A] k1
EA
k1[A] k1
EA E'P k2[P] k2
k4 k4[Q] k3 k3[P]
k2 k2[B]
k4 k4[Q] k3 k3[P]
EQ
EAB EPQ
E'B EQ
E'E
V1 V1
k3k 4 [ E ]0 k3 + k 4 k 1k 2 [ E ]0 k 1 + k 2 k3k 4 k1( k3 + k 4 )

( k 2 + k3 )k 4 k 2 ( k3 + k 4 ) k 1( k 2 + k3 ) ( k 1 + k 2 )k 3
k 2 k 4 [ E ]0 k2 + k4 k 1k 3 [ E ]0 k 1 + k 3
( k 1 + k 2 )k 4 k1( k 2 + k 4 ) k 2 ( k 3 + k 4 ) ( k 2 + k 4 )k3 ( k 1 + k 2 )k 3 ( k 1 + k 3 )k 2 k 1( k 3 + k 4 ) ( k 1 + k 3 )k 4 k 1 k1
K mA K mB K mP
K mQ
k 1k 2 ( k 1 + k 2 )k 4 k 1 k1 k 1 + k 2 k2 k 1 + k 4 k1 k4 k 4
K iA K iB K iP
KiQ
k 3 k3 k2 k 2 k4 k 4
Le tableau montre les relations entre les paramtres qui apparaissent dans les quations [6.21] et [6.23] et les constantes de vitesse pour les tapes individuelles des deux principaux mcanismes ordonns pour les ractions de transfert de groupe. Bien que l'quation [6.23] ne contienne pas le paramtre KiA , il peut tre obtenu partir de l'identit suivante :
K K KiAKmB = mA iB . KmP KiQ KiP KmQ
208
Selon cette supposition, KiA, KiB, KiP et KiQ sont respectivement les constantes de dissociation des complexes EA, EB, EP et EQ ; KmP et KmQ sont respectivement les constantes de dissociation pour la libration de P et de Q partir du complexe EPQ. (Bien que KmA et KmQ n'apparaissent pas explicitement dans l'quation [6.22], ils peuvent tre introduits puisque dans ce mcanisme A et B sont interchangeables, ainsi KmA K iB est identique KiA K mB et KiP K mQ est identique KmP KiQ. Ces substitutions ne peuvent tre effectues dans l'quation [6.21] parce que le mcanisme ordonn n'est pas symtrique vis--vis de A et de B ou vis--vis de P et de Q, une complexit additionnelle qui explique la plus grande complexit de l'quation [6.21]). Dans la limite des erreurs exprimentales, l'quation [6.22] s'applique, que l'hypothse de l'quilibre rapide soit satisfaite ou non, et les constantes de MICHAELIS ou les constantes d'inhibition ne peuvent donc pas tre interprtes avec certitude comme des constantes de dissociation.
6.4.3. Mcanisme enzyme modifi

L'quation d'tat stationnaire pour un mcanisme enzyme modifi est la suivante :
V1 [ A ][ B ] V1 [ P ][ Q ] KiA KmB KiP KmQ v = [ A ] KmA [ B ] [ P ] KmP [ Q ] [ A ][ B ] + + + + KiA KiA KmB KiP KiP KmQ KiA KmB [ A ][ P ] KmA [ B ][ Q ] [ P ][ Q ] + + + KiA KiP KiA KmB KiQ KiP KmQ
[6.23]
o les paramtres cintiques sont galement dfinis dans le tableau 6.2. Dans sa reprsentation en terme de coefficient, cette quation est identique l'quation [6.20] sans la constante 1 et sans les termes [ A ][ B ][ P ] et [ B ][ P ][ Q ] du dnominateur, mais les relations entre les paramtres sont diffrentes, et l'quation [6.23] renferme le terme KiP KmQ alors que c'est le terme KmP KiQ qui serait attendu par analogie avec l'quation [6.20].
6.4.4. Calcul des constantes de vitesse partir des paramtres cintiques

Bien que le tableau 6.2 montre comment les paramtres cintiques des deux mcanismes ordonns peuvent tre exprims en termes de constantes individuelles de vitesse, il ne donne pas les relations inverses. Dans le cas du mcanisme enzyme modifi, aucune relation inverse unique n'existe, c'est--dire qu'il n'est pas possible de calculer les constantes de vitesse partir de la mesure des paramtres cintiques, parce qu'il existe une infinit d'ensembles de constantes de vitesse capables de donner les mmes paramtres cintiques. Toutefois, pour le mcanisme alatoire
209
complexe ternaire une relation unique existe (CLELAND, 1963) qui est prsente dans le tableau 6.3. Ces relations devraient cependant tre utilises avec prcaution puisqu'elles supposent que la forme la plus simple du mcanisme s'applique, c'est-dire que cette approche ne tient pas compte de la prsence ventuelle de plus d'tapes que ncessaire dans le modle minimum. Si l'un ou l'autre des complexes binaires ou tertiaires s'isomrise, l'quation d'tat stationnaire a la mme forme, mais l'interprtation des paramtres est diffrente et certaines des expressions du tableau 6.3 ne sont plus valables.
Tableau 6.3 - Calcul des constantes de vitesse partir des paramtres cintiques Constante de vitesse Expression Constante de vitesse Expression
k1 k2 k3 k4
V1 KmA [ E ]0
V1( k 2 + k3 ) k3 KmB [ E ]0
V1 V1 KiQ [ E ]0 ( V1 KiQ V1 KmQ ) V1 KiQ KmQ [ E ]0
k 1 k 2 k 3 k 4
V1 KiA KmA [ E ]0
V1 V1 KiA [ E ]0 ( V1 KiA V1 KmA ) V1( k 2 + k3 ) k 2 KmP [ E ]0 V1 KmQ [ E ]0
Ce tableau est obtenu en rarrangeant les dfinitions prsentes dans le tableau 6.1 pour les paramtres cintiques du mcanisme ordonn complexe ternaire. Un rarrangement analogue des dfinitions pour un mcanisme enzyme modifi n'est pas possible.
Pour un mcanisme alatoire complexe ternaire, il est vident qu'aucune des constantes de vitesse l'exception de celles pour la conversion des complexes ternaires ne peut tre dtermine partir des mesures d'tat stationnaire si l'hypothse de l'quilibre rapide est correcte (puisque ds que cette hypothse d'un quilibre rapide est pose, la possibilit disparat d'extraire une information sur la vitesse des tapes qui sont supposes l'quilibre). Cependant, si l'hypothse de l'quilibre rapide est faite et que le mcanisme ne dvie pas de celui prsent dans l'quation [6.22], il est ventuellement possible d'utiliser les techniques d'ajustement paramtriques pour dduire l'information au sujet des constantes de vitesses (CORNISH-BOWDEN et WONG, 1978).
210
6.5. LES MESURES DE VITESSE INITIALE

EN ABSENCE DE PRODUIT
6.5.1 Signification des paramtres
Si aucun produit n'est ajout au mlange ractionnel initial, l'quation pour la vitesse initiale d'une raction suivant un mcanisme ordonn complexe ternaire est obtenue partir de l'quation [6.21] en supprimant tous les termes qui contiennent [ P ] ou [ Q ] et en multipliant le reste par KiA KmB :
v =
V1 [ A ][ B ] KiA KmB + KmB [ A ] + KmA [ B ] + [ A ][ B ]
[6.24]
La signification de ces paramtres et leur relation avec les paramtres d'une quation de MICHAELIS et MENTEN un substrat devient apparente si l'quation est examine pour des valeurs extrmes de [ A ] et de [ B ] . Si [ A ] et [ B ] sont suffisamment grands pour que tout terme ne contenant pas les deux variables soit ngligeable, l'quation se simplifie pour donner v = V1 : donc V1 a exactement la mme signification que V pour une raction un seul substrat, c'est--dire qu'il dfinit la vitesse limite lorsque l'enzyme est satur. Il faut noter cependant que dans ce cas, satur signifie satur par les deux substrats . La constante catalytique, k0 = V1 [ E ]0 , de la mme manire, a la mme signification que pour une raction un seul substrat. La signification des constantes de MICHAELIS est obtenue en considrant les simplifications de l'quation dans les cas o la concentration d'un seul des deux substrats est trs leve. Par exemple, si [ B ] est suffisamment grande pour que les termes de l'quation ne contenant pas cette variable soient ngligeables, alors l'quation [6.24] se simplifie pour donner une quation similaire celle de MICHAELIS et MENTEN en terme de [ A ] , dans laquelle [ B ] n'apparat plus :
v =
V1 [ A ] KmA + [ A ]
[6.25]
et o KmA reprsente la constante de MICHAELIS limite pour le substrat A quand B est saturant. Un argument exactement parallle montre que KmB est la constante de MICHAELIS limite lorsque A est saturante. De manire plus gnrale, pour tout mcanisme impliquant un nombre arbitraire de substrats, la constante de MICHAELIS pour chaque substrat est dfinie comme la constante de MICHAELIS limite pour ce substrat lorsque tous les autres substrats sont des concentrations saturantes. Dans les quations ci-dessus, KiA est diffrent de K mA et sa signification peut tre apprhende en considrant la situation o [ B ] tend vers zro (mais reste diffrente de zro). Dans ce cas, le numrateur reste diffrent de zro mais tous les termes en [ B ] du dnominateur sont ngligeables et l'quation se simplifie de la manire suivante :
211
V1 [ B ] [ A] KmB ( kB [ B ])[ E ]0 [ A ] = v = KiA + [ A ] KiA + [ A ]
[6.26]
Dans cette quation, kB = k0 KmB est la constante de spcificit pour B alors que, de la mme manire, k A = k0 KmA est dfinie comme la constante de spcificit pour A. Il dcoule que KiA est la constante vraie de dissociation de EA, parce que quand [ B ] tend vers zro, la vitesse de la raction de B avec EA tend galement vers zro ; il n'y a rien dans cette situation qui empche l'tape de fixation de A sur E de s'approcher de l'quilibre et dans ce cas l'hypothse de MICHAELIS et MENTEN d'un quilibre de fixation est entirement justifie. KiB n'apparat pas dans l'quation [6.24] puisque B ne se lie pas l'enzyme libre. Ce paramtre apparat cependant dans l'quation [6.21] pour le mcanisme rversible complet et sa grandeur dtermine le rle inhibiteur de B sur la raction inverse. Bien que l'quation [6.24] ne soit pas symtrique en A et B, puisque KiA KmB n'est pas gal KmA KiB, sa forme est symtrique ; ds lors, la mesure des vitesses initiales en absence de produit ne distingue pas A de B, c'est--dire qu'elle ne permet pas de dterminer lequel des deux substrats se fixe en premier sur l'enzyme. Il est intressant d'examiner les dfinitions des constantes de spcificit dans la forme la plus simple d'un mcanisme enzyme modifi. A partir des dfinitions donnes dans le tableau 6.2, la constante de spcificit pour A peut tre exprime en fonction des constantes de vitesse de la manire suivante : k1k 2 kA = [6.27] k 1 + k 2 Il faut noter que cette dfinition inclut uniquement des constantes de vitesse de la moiti de la raction qui implique A ; les constantes de vitesse pour les tapes qui impliquent B sont absentes. De la mme manire, la constante de spcificit pour B est indpendante des tapes qui impliquent A. En principe, donc, nous pouvons penser que si le substrat B est remplac par un analogue B' dont la raction avec A est catalyse par le mme enzyme, la valeur de kA sera inchange. Les tests appropris ont t raliss avec trs peu d'enzymes, mais quand ils ont t raliss ces tests n'taient en gnral pas en accord avec la prdiction. L'aspartate transaminase (quation [6.3]), un des enzymes les plus tudis qui suit un mcanisme enzyme modifi, et qui est parfois considr comme un archtype de ce type de mcanisme, se comporte de la manire attendue (KATZ et WESTLEY, 1979), mais plusieurs autres enzymes tudis par le mme groupe ne le font pas (JARABAK et WESTLEY, 1974 ; KATZ et WESTLEY, 1979, 1980). Avec d'autres enzymes, la variation de kA avec la nature de B a souvent t considre comme une preuve que le mcanisme enzyme modifi ne peut pas s'appliquer (par exemple, voir MORPETH et MASSEY, 1982).
212
Comment pouvons-nous expliquer cette contradiction ? Celle-ci implique-t-elle que les relations du tableau 6.2 sont incorrectes ou qu'il y a une erreur dans les hypothses faites pour les analyser ? WESTLEY et ses collgues dfendent l'ide que l'erreur se situe dans l'hypothse implicite selon laquelle le mme enzyme substitu est produit, avec les mmes proprits cintiques, quelle que soit la demi-raction qui l'a produit. Ils considrent que l'enzyme conserve dans sa conformation, une mmoire de la raction qui s'est droule, suffisamment longue pour modifier les proprits cintiques de l'tape suivante. Il n'est pas ncessaire ici d'analyser cette ide en dtails ; le point important est que les modles du comportement enzymatique qui sont considrs dans ce manuel reposent communment sur les cas les plus simples, alors que les enzymes rels peuvent se comporter de manire plus complexe. Cela ne signifie pas que les modles simples ne sont pas utiles, mais seulement qu'ils devraient tre considrs comme des points de dpart pour analyser les mcanismes enzymatiques et non comme des descriptions compltes de ceux-ci. Comme nous en avons dj discut dans les chapitres 1 et 3, la dtermination des paramtres cintiques peut tre ralise par ajustement paramtrique d'un graphique de v en fonction de [ A ] pour diffrentes valeurs de [ B ] en utilisant l'quation [6.24]. Certains logiciels de traitement des donnes permettent d'ajuster les paramtres sur un ensemble de donnes coordonnes multiples. Nanmoins, nous prsentons ci-dessous l'analyse graphique des donnes qui permet une prsentation plus didactique du phnomne mme si un ajustement paramtrique non-linaire fournit de meilleures estimations des paramtres.
6.5.2. Paramtres apparents de MICHAELIS et MENTEN

Si la concentration d'un des substrats est modifie en maintenant constante la concentration du second substrat (sans pour cela que cette dernire ne soit ni trs leve, ni trs faible), l'quation [6.24] conserve la forme de l'quation de MICHAELIS et MENTEN vis--vis du substrat dont la concentration est modifie. Par exemple, si [ A ] est modifie et que [ B ] est maintenue constante, les termes qui ne renferment pas [ A ] sont constants et l'quation [6.24] peut tre rarrange de la manire suivante, si [ P ] = 0 et si [ Q ] = 0 :
V1 [ B ] [ A] KmB + [ B ] V app [ A ] = app v = KiA KmB + KmA [ B ] Km + [ A ] + [ A] KmB + [ B ]
[6.28]
Les valeurs des paramtres apparents de MICHAELIS et MENTEN sont des fonctions de [ B ] : V1 [ B ] V app = [6.29] KmB + [ B ]

app Km =
213
KiA KmB + KmA [ B ] KmB + [ B ]
[6.30]
V app Km
app
V1 [ B ] KmA = KiA KmB +[B] KmA
[6.31]
app Il faut noter que les expressions pour V app et V app Km ont la forme d'une quation de MICHAELIS et MENTEN vis--vis de [ B ] : cette proprit sera utilise ultrieurement pour construire des graphiques secondaires ( 6.5.4).
Cette rduction de l'quation [6.24] une quation de MICHAELIS et MENTEN avec des paramtres apparents est un cas particulier d'un type plus gnral de comportement ayant une implication tendue en enzymologie. Il signifie que mme si une raction implique deux ou plusieurs substrats, elle peut tre traite comme une raction un seul substrat condition que la concentration d'un seul substrat varie. Ceci explique l'importance de l'analyse cintique de ractions un seul substrat dans des conditions d'tat stationnaire, mme si en ralit comparativement peu d'enzymes ont un seul substrat.
6.5.3. Les graphiques primaires pour les mcanismes complexe ternaire

Une exprience typique permettant de caractriser une raction en accord avec l'quation [6.24] implique de raliser plusieurs sous-expriences, chacune une valeur diffrente de [ B ] . Chacune de ces sous-expriences est traite comme une exprience un seul substrat dans laquelle les paramtres apparents de MICHAELIS et MENTEN sont dtermins en analysant la dpendance de la vitesse vis--vis de la concentration de A, [ A ] . N'importe quelle mthode graphique introduite au chapitre 3 peut tre utilise pour analyser ces donnes, avec pour seule diffrence par rapport au cas d'un mcanisme un seul substrat que cette approche fournit des paramtres apparents et non des paramtres rels. De tels graphiques sont appels des graphiques primaires, pour les distinguer des graphiques secondaires dont nous allons discuter dans le 6.5.4. Dans le texte ci-dessous, nous nous rfrerons uniquement l'apparence des graphiques de [ A ] v en fonction de [ A ] , bien que les autres graphiques soient galement illustrs dans les figures pour comparaison. La figure 6.13 montre un ensemble typique de graphiques primaires pour un enzyme qui obit l'quation [6.24]. Les droites se coupent en un point unique pour lequel [ A ] = KiA et [ A ] v = ( KmA KiA ) V , qui se situe gauche de l'axe des [ A ] v , mais peut tre au-dessus ou au-dessous de l'axe [ A ] selon les valeurs relatives de KiA et de KmA . Ces coordonnes fournissent la valeur de KiA directement, mais la dtermination des autres paramtres ncessite des graphiques additionnels des paramtres apparents, comme discut dans le 6.5.4.
214
Pour le mcanisme alatoire complexe ternaire dans des conditions d'quilibre, l'quation de vitesse complte [6.22], se simplifie aussi sous la forme de l'quation [6.24] si les termes en [ P ] et [ Q ] sont omis. Donc les graphiques primaires sont les mmes que ceux du mcanisme ordonn et il est impossible de dterminer partir des mesures de vitesse initiale en absence de produit s'il existe un ordre obligatoire de fixation des substrats.
[A]/v 0,5 1/v 0,5 1 2 1/KiA 1 2 10 1/[A]
0 1/V(1 KmA/KiA)
v 10 KiA
0 (KmA KiA)/V
V 1 KmA/KiA)
10 0,5 [A]
V/(KmA KiA) 0
v/[A]
6.13 - Graphiques primaires pour des mcanismes squentiels (sans tenir compte de la possible inhibition par le substrat) Les droites sont marques par les valeurs de [ B ]/KmB (certaines valeurs sont omises pour viter de surcharger la figure ; la srie complte des valeurs est la suivante : 0,5 ; 1 ; 2 ; 3 ; 5 ; 10). L'apparence de chacun des trois graphiques linaires couramment utiliss est prsente dans la figure. Les graphiques primaires sont qualitativement similaires lorsque [ B ] est modifies pour plusieurs valeurs de [ A ].
6.5.4. Les graphiques secondaires

L'analyse secondaire des donnes permet de dterminer les valeurs relles des diffrents paramtres. Puisque les quations [6.29] et [6.31] ont la forme d'quaapp tions de MICHAELIS et MENTEN, les graphiques de V app ou de V app Km en fonction de [ B ] dcrivent des hyperboles rectangulaires passant par l'origine, qui peuvent tre analyses en utilisant les graphiques linaires habituels. Ces graphiques sont alors appels graphiques secondaires puisqu'ils reprsentent un traitement supplmentaire des paramtres apparents obtenus partir des graphiques primaires. Par exemple, les pentes des graphiques primaires de [ A ] v en fonction de [ A ] (ou des ordonnes l'origine des graphiques de 1 v en fonction de
215
1 [ A ] ) donnent des valeurs de 1 V app , dont l'expression est obtenue en crivant l'quation [6.29] de la manire suivante : 1 = KmB 1 + 1 [6.32] V1 [ B ] V1 V app
Un graphique de 1 V app en fonction de 1 [ B ] a donc la forme d'une droite dont la pente vaut KmB V1 et dont l'ordonne l'origine vaut 1 V1 .
app Un autre graphique secondaire est obtenu en utilisant Km V app comme variable app dpendante. Le paramtre Km V app correspond aux ordonnes l'origine des graphiques de [ A ] v en fonction de [ A ] (ou aux pentes des graphiques de 1 v en fonction de 1 [ A ] ) et son expression est obtenue en crivant l'quation [6.31] sous la forme suivante :
app Km K K K = iA mB 1 + mA app [ B ] V1 V1 V
[6.33]
app Ainsi, un graphique secondaire de Km V app en fonction de 1 [ B ] a donc la forme d'une droite dont la pente vaut KiA KmB V1 et dont l'ordonne l'origine vaut KmA V1 . Les quatre paramtres de l'quation [6.24], V1 , KiA , KmA et KmB peuvent tre aisment calculs partir des graphiques reprsents dans la figure 6.14.
1/Vapp
(pente du graphique primaire de [A]/v en fonction de [A])
Kmapp/Vapp
(ordonne l'origine du graphique primaire de [A]/v en fonction de [A])
Pente = KmB/V 1/V 1/KmB

0
KmA/V
Pente = KiAKmB/V
1/[B]
KmA KiAKmB
1/[B]
6.14 - Graphiques secondaires pour des mcanismes complexe ternaire Le graphique de [B] V app en fonction de [B] s'applique aussi aux mcanismes enzyme modifi.
app L'quation [6.30] pour Km dcrit galement une hyperbole rectangulaire, mais la app courbe ne passe pas par l'origine. Dans ce cas, Km approche KA lorsque [ B ] tend vers zro et approche KB lorsque [ B ] devient trs grand. Il s'agit donc d'une hyperbole trois paramtres, qui ne peut pas tre reprsente sous une forme app linaire. Comme dans d'autres cas, Km est un paramtre moins commode utiliser que KmA V1 .
216
Il est galement possible de considrer B plutt que A en tant que substrat dont la concentration est variable, et de tracer des graphiques de [ B ] v en fonction de [ B ] diffrentes valeurs de [ A ] ; en effet, tant que l'ordre de fixation des substrats n'a pas t dtermin, la dsignation des substrats est arbitraire. L'analyse est identique et il n'est pas ncessaire de la dcrire une seconde fois. La seule diffrence importante est que KiB n'apparat pas dans l'quation [6.24] mais que KiA KmB KmA apparat chaque fois que KiB est attendu sur la base du simple change entre A et B.
6.5.5. Graphiques pour les mcanismes enzyme modifi

Pour les mcanismes enzyme modifi, la vitesse initiale en absence de produit est donne par l'quation suivante : V1 [ A ][ B ] v = [6.34] KmB [ A ] + KmA [ B ] + [ A ][ B ] La caractristique la plus surprenante de cette quation est l'absence de constante au dnominateur (le problme [6.4] la fin du chapitre explore l'origine de cette absence). Cette caractristique induit un comportement aisment diffrentiable de celui observ avec les mcanismes complexe ternaire lorsque la concentration de l'un ou l'autre des substrats est modifie : par exemple, si [ A ] est modifie pour une valeur constante de [ B ] , les valeurs apparentes des paramtres de MICHAELIS et MENTEN sont les suivantes :
V app =
app Km =
V1 [ B ] KmB + [ B ] KmA [ B ] KmB + [ B ]
[6.35] [6.36] [6.37]
V app = V1 app KmA Km
Bien que l'quation [6.35] soit identique l'quation [6.29], l'quation [6.36] est plus simple que l'quation [6.30] et l'quation [6.37], contrairement l'quation [6.31] ne montre aucune dpendance vis--vis de [ B ] . Cela signifie que, dans ce cas, Vapp se comporte de la mme manire que pour les mcanismes complexe terapp naire, mais que le paramtre V app Km est indpendant de [ B ] et prend une valeur constante V1 KmA . Les graphiques primaires de [ A ] v en fonction de [ A ] ou de [ B ] v en fonction de [ B ] forment des sries de droites se coupant sur les axes de [ A ] v ou [ B ] v comme le montre la figure 6.15. Le profil est aisment reconnaissable par rapport celui des mcanismes complexe ternaire (figure 6.14) sauf si KiA est beaucoup plus petit que KmA .
217
[A]/v
0,5 1/v 0,5 1 5 1 Pente = KmA /V

0
2 5 v 5
1/[A]
0,5 KmA /V
0
KmA /V v/[A]
[A]
6.15 - Graphiques primaires pour un mcanisme enzyme modifi (en absence d'inhibition par le substrat) Les valeurs indiques sur les droites sont les valeurs correspondantes de [B] /KmB. L'apparence de chacun des trois types courants de graphique linaire est prsente. Les graphiques primaires sont qualitativement similaires quand [B] varie pour diverses valeurs de [A].
Le seul graphique secondaire utile pour les mcanismes enzyme modifi est celui de [ B ] V app en fonction de [ B ] qui a les mmes pente et ordonne l'origine que le graphique correspondant dans le cas des mcanismes complexe ternaire (figure 6.14).
6.6. INHIBITION PAR LE SUBSTRAT

6.6.1. Pourquoi y a-t-il une inhibition par le substrat ?
L'analyse prsente dans le 6.5 n'est strictement valable que pour des concentrations faibles de substrat, puisqu'en effet, dans n'importe quel mcanisme raisonnable, au moins un des quatre ractifs aura la capacit de se fixer fortement une mauvaise forme de l'enzyme. Dans le mcanisme enzyme modifi, le substrat et le produit qui ne possde pas le groupe transfr (respectivement dnomms Y et X dans le symbolisme utilis prcdemment) pourraient se fixer la mauvaise forme
218
de l'enzyme libre ; dans le mcanisme squentiel alatoire, un des ractifs peut se fixer un mauvais complexe binaire ; dans le mcanisme squentiel ordonn, le second substrat ou le premier produit peut se fixer au mauvais complexe binaire. Dans ce dernier cas, l'inhibition par le substrat peut avoir lieu soit dans la raction directe, soit dans la raction inverse, mais pas dans les deux directions, puisque seulement un des deux complexes binaires est disponible. Par souci pratique, nous choisirons B comme le substrat responsable de l'inhibition dans chacun des mcanismes, sachant que les rsultats peuvent facilement tre transposs l'autre situation si cela est ncessaire.
6.6.2. Mcanisme de type ordonn complexe ternaire

Le complexe non-productif EBQ impliqu dans le mcanisme squentiel ordonn a t invoqu dans le 6.2. Il peut tre introduit dans l'quation de vitesse en multipliant chaque terme du dnominateur qui se rapporte EQ par 1 + ( k5 [ B ] k 5 ) , o k 5 k5 reprsente la constante de dissociation de EBQ. L'quation [6.24] s'crit alors de la faon suivante :
v =
V1 [ A ][ B ] [ B ] KiA KmB + KmB [ A ] + KmA [ B ] + [ A ][ B ] 1 + KsiB
[6.38]
o KsiB est la constante qui dfinit la force de l'inhibition. Il ne s'agit pas de la constante de dissociation, k 5 k5 , parce que le coefficient [ A ][ B ] est driv non seulement du complexe EQ mais galement du complexe ternaire (EAB + EPQ), comme cela apparat clairement lors de la drivation de l'quation [6.20] dans le 6.3.2. En fonction des quantits relatives de ces deux complexes prsentes l'tat stationnaire, KsiB peut tre approximativement gale k 5 k5 , ou elle peut tre beaucoup plus grande. Donc, dans ce mcanisme, l'inhibition par le substrat n'est pas ncessairement dtectable aux concentrations de substrat B qui sont atteignables exprimentalement. En accord avec l'quation [6.38], l'inhibition par le substrat n'est effective que pour de fortes concentrations de A, c'est--dire qu'elle est exacerbe par A, et ressemble donc l'inhibition anti-comptitive. Les graphiques primaires de [ B ] v en fonction de [ B ] sont paraboliques, avec un point d'intersection commun situ KiA KmB [B] = . Les graphiques primaires de [ A ] v en fonction de [ A ] sont KmA linaires mais n'ont aucun point d'intersection. Ces graphiques sont illustrs dans la figure 6.16.
219
[A]/v
0,5 25 1 10 2 5
[B]/v
0,5 1 2 10
[A]
[B] [A] [B]

6.16 - Effet de l'inhibition par le substrat (avec KsiB = 10KmB) sur les graphiques primaires pour les mcanismes complexe ternaire
6.6.3. Mcanisme de type alatoire complexe ternaire

Dans le mcanisme alatoire complexe ternaire, la concentration de EQ est nulle en absence de Q si l'hypothse de l'quilibre rapide est valable. Puisque B ne peut pas se fixer une espce qui n'existe pas, l'inhibition par le substrat n'a pas lieu avec ce mcanisme sauf si Q est ajout. Si l'hypothse de l'quilibre rapide n'est pas vrifie, aucune raison n'empche l'existence d'un phnomne d'inhibition par le substrat, mais sa nature est difficile prdire cause de la complexit de l'quation de vitesse. Dans ce type de mcanisme, EBQ n'est pas un complexe cul-de-sac, puisqu'il peut tre form partir de EB ou de EQ, et ne doit pas ncessairement tre en quilibre avec l'un de ces complexes.
6.6.4. Mcanisme enzyme modifi

Dans le mcanisme enzyme modifi, le complexe non-productif EB rsulte de la fixation de B sur E (ou de la fixation de Y sur E dans le symbolisme du 6.2). Il constitue un complexe cul-de-sac et peut tre incorpor dans l'quation de vitesse en multipliant les termes qui contiennent E dans le dnominateur de cette quation par 1+ ( [ B ] KsiB ) , o KsiB reprsente la constante de dissociation de EB. L'quation [6.34] prend alors la forme suivante : V1 [ A ][ B ] [6.39] v = [ B ] KmB [ A ] + KmA [ B ] 1 + + [ A ][ B ] KsiB En accord avec cette quation, l'inhibition est la plus efficace quand [ A ] est faible, et donc elle ressemble une inhibition comptitive. Les graphiques primaires de [ B ] v en fonction de [ B ] sont paraboliques, avec un point
220
d'intersection commun situ sur l'axe [ B ] v , c'est--dire pour [ B ] = 0 . Les graphiques primaires de [ A ] v en fonction de [ A ] sont linaires, sans point d'intersection, mais les droites de chaque paire se coupent une valeur positive de [ A ] , c'est--dire droite de l'axe [ A ] v . Ces graphiques sont illustrs dans la figure 6.17.
[A]/v
0,5
[B]/v
[A]
0,5
1 2 5 10 2 5 1
[B]
0
10
[A]
[B]
6.17 - Effet de l'inhibition par le substrat (avec KsiB = 10KmB) sur les graphiques primaires pour les mcanismes enzyme modifi
6.6.5. Valeur diagnostique de l'inhibition par le substrat

L'inhibition par le substrat peut premire vue apparatre comme une complication inutile dans l'analyse des donnes cintiques. En ralit, elle est trs informative, puisqu'elle accentue la diffrence de comportement prdite entre les mcanismes complexe ternaire et les mcanismes enzyme modifi et qu'elle est gnralement simple interprter. Comme, en principe, un substrat se fixe plus fortement la bonne forme de l'enzyme qu' la mauvaise, l'inhibition par le substrat est rarement suffisamment importante pour perturber l'analyse dcrite dans le 6.5. L'inhibition par un substrat obtenue pour une concentration faible de l'autre substrat fournit une preuve positive de l'existence d'un mcanisme enzyme modifi. Par contre, app l'observation d'une valeur de V app Km qui soit indpendante de la concentration de l'autre substrat (q. [6.37]) ne constitue qu'un argument ngatif pour l'existence d'un mcanisme enzyme modifi, puisqu'un tel comportement est galement observ dans un cas spcial de mcanisme squentiel o la variation attendue app V app Km n'est pas dtecte. Dans un mcanisme ordonn complexe ternaire, l'inhibition par le substrat permet d'identifier le substrat qui se fixe en second sans avoir recours des tudes d'inhibition par le produit.
221
6.7. INHIBITION PAR LE PRODUIT

Les tudes d'inhibition par le produit font partie des mthodes les plus utiles pour la dtermination de l'ordre de fixation des substrats et de l'ordre de libration des produits, puisqu'elles sont la fois trs informatives et faciles comprendre. A condition qu'un seul des produits soit ajout au mlange ractionnel, le terme du numrateur qui correspond la raction inverse doit tre gal zro (except dans les ractions un seul produit, qui ne sont pas courantes). Le seul effet d l'addition du produit, est l'augmentation de la valeur du dnominateur de l'quation de vitesse, qui se traduit par une inhibition de la raction directe. La question de savoir si un inhibiteur particulier agit comme un inhibiteur comptitif, anti-comptitif ou mixte n'a pas de rponse absolue, puisque cela dpend du substrat dont la concentration est considre comme une variable. Une fois que ce choix est ralis, cependant, la rponse est directe : le dnominateur de l'quation de vitesse peut tre spar en termes constants et variables, selon que ceux-ci contiennent ou non la concentration du substrat variable ; l'expression de V app app dpend des termes variables, alors que l'expression de V app Km dpend des termes constants, comme dans le 6.5. Comme nous l'avons dcrit dans le 5.2 et rsum dans le tableau 5.1, les diffrents types d'inhibition sont classs selon qu'ils app affectent V app Km (inhibition comptitive), V app (inhibition anti-comptitive) ou les deux (inhibition mixte). Ainsi un produit se comporte comme un inhibiteur comptitif si sa concentration apparat seulement dans les termes constants, comme un inhibiteur anti-comptitif si elle apparat dans les termes variables et comme un inhibiteur mixte si elle apparat dans les termes constants et variables. Si le produit ne peut se combiner qu'avec une seule forme de l'enzyme, uniquement des termes linaires en concentration sont possibles, et donc l'inhibition est linaire ; mais l'inhibition non-linaire devient possible si le produit peut galement se fixer sur une mauvaise forme de l'enzyme pour donner un complexe de type cul-de-sac. Ces principes peuvent tre illustrs en utilisant comme exemple un mcanisme ordonn complexe ternaire dans des conditions o P est ajout au mlange ractionnel en absence de Q, et o A est le substrat dont la concentration est variable. L'quation complte de vitesse est l'quation [6.21], mais elle peut tre simplifie en liminant les termes qui renferment [ Q ] , et en rarrangeant le dnominateur D de sorte que les termes qui contiennent [ A ] soient spars des autres termes. Une fois cela ralis, le dnominateur peut tre crit de la manire suivante :
D = 1+
KmA [ B ] KmQ [ P ] [ A ] [ B ] KmQ [ P ] [ B ][ P ] 1+ + + + + [6.40] KiA KmB KmP KiQ KiA KmB KmP KiQ KmB KiP
Partie constante Partie variable
222
Comme dans cette expression, la fois la partie constante et la partie variable contiennent [ P ] , le produit P agit comme un inhibiteur mixte lorsque la concentration de A est modifie. Une analyse similaire montre que lorsque B est le substrat dont la concentration est modifie, la fois P et Q se comportent comme des inhibiteurs mixtes. Cependant, lorsque nous considrons l'inhibition par Q lorsque A est le substrat variable, les rsultats sont diffrents parce que le dnominateur de l'quation [6.21] ne contient aucun terme dans lequel [ A ] et [ Q ] soient multiplis l'un par l'autre, bien que [ Q ] apparaissent dans des termes qui ne contiennent pas [ A ] : K [ B ] [ Q ] KmA [ B ][ Q ] [ A ] [ B ] D = 1 + mA + + + [6.41] 1 + KiA KmB KiQ KiA KmB KiQ KiA KmB Partie constante Partie variable
Dans ce cas, Q se comporte comme un inhibiteur comptitif vis--vis de A. Ces rsultats ainsi que ceux correspondant aux mcanismes enzyme modifi, sont rsums dans le tableau 6.4. Les types d'inhibition prdits pour le mcanisme alatoire complexe ternaire sont considrs dans le problme 6.5 la fin du chapitre.
Tableau 6.4 - Inhibition par le produit dans les deux types principaux de mcanismes ordonns Type d'inhibition Complexe ternaire Enzyme modifi Mixte (anti-comptitive) Mixte (mixte) Comptitive (comptitive) Mixte (anti-comptitive) Mixte (pas d'inhibition) Comptitive (comptitive) Comptitive (comptitive) Mixte (pas d'inhibition)
Produit P P Q Q
Substrat variable A B A B
Ce tableau montre le type d'inhibition attendu pour chaque combinaison de produit et de substrat variable. Les descriptions entre parenthses montrent comment le type d'inhibition est modifi lorsque le substrat constant est prsent une concentration saturante.
Pour des concentrations leves du substrat constant, ces types d'inhibition par le produit sont modifis parce que les termes de l'quation de vitesse qui ne contiennent pas la concentration du substrat constant deviennent ngligeables. La partie constante de l'quation [6.40], par exemple, ne contient aucun terme en [ B ][ P ] , et donc devient indpendante de [ P ] si [ B ] est grande ; la partie variable, d'un autre ct, contient un terme en [ B ][ P ] et en consquence reste dpendante de [ P ] lorsque [ B ] est grande : ceci implique que lorsque A est le substrat dont la concentration est modifie, l'inhibition par le produit P devient une simple inhibition anti-comptitive lorsque la fixation de B s'approche de la
223
saturation. La mme analyse applique l'quation [6.41] montre que le terme constant continue dpendre de [ Q ] lorsque [ B ] est grande ; ainsi Q reste un inhibiteur comptitif vis--vis de A lorsque la fixation de B s'approche de la saturation. Ces rsultats, ainsi que ceux correspondants obtenus pour les autres combinaisons de substrats et de produits sont prsents dans le tableau 6.4. Il est ais de prdire les caractristiques de l'inhibition par le produit pour n'importe quel mcanisme. La mthode la plus fiable consiste tudier la forme de l'quation complte de vitesse, mais il est gnralement possible d'obtenir les rsultats par inspection du mcanisme en utilisant la mthode de KING et ALTMAN, comme dcrit dans le 6.3.6. Pour chaque combinaison de produit et de substrat variable, il faut rechercher le profil de KING et ALTMAN qui donne un terme contenant la concentration de produit mais pas la concentration de substrat variable ; si cela est possible, la concentration de produit doit se trouver dans la partie constante du dnominateur et il doit y avoir une composante comptitive dans l'inhibition. Il faut alors chercher dans un profil de KING et ALTMAN un terme qui contienne la fois la concentration du produit et celle du substrat variable ; si cela est possible, la concentration de produit doit apparatre dans la partie variable du dnominateur et il doit y avoir une composante anti-comptitive dans l'inhibition. En disposant de cette information, il devient simple de dterminer le type d'inhibition. En recherchant le profil de KING et ALTMAN utilisable, il faut se rappeler que les tapes de libration du produit sont irrversibles si le produit en question n'est pas prsent dans le mlange ractionnel. Dans une raction deux produits, l'inhibition anti-comptitive est largement limite au cas mentionn, l'inhibition par le premier produit dans un mcanisme squentiel comptitif quand la saturation par le second substrat est atteinte. Elle devient plus commune dans les ractions gnrant trois produits et plus, et a lieu avec au moins un des produits dans tous les mcanismes ordonns complexe ternaire de ce type ( 6.9).
6.8. PRPARATION DES EXPRIENCES

La mise au point d'une exprience pour tudier une raction deux substrats en absence de phnomne d'inhibition repose sur des principes similaires ceux utiliss pour l'tude des inhibitions simples ( 5.7). Les valeurs des constantes de MICHAELIS et des constantes d'inhibition pour les diffrents substrats ne sont videmment pas connues l'avance, et des tests prliminaires doivent tre raliss. Quelques expriences ralises dans des conditions o la concentration d'un des substrats est modifie pour deux concentrations donnes de l'autre substrat, une aussi grande que possible et une aussi faible que possible, devraient permettre de dterminer la gamme de concentrations dans laquelle se situe la valeur du Km pour le premier substrat. Une fois cette gamme connue, des concentrations de substrats
224
peuvent tre slectionnes pour la dtermination prcise de la valeur des paramtres cintiques. Les concentrations du second substrat peuvent tre slectionnes de manire similaire sur la base de l'exprience inverse. A chaque concentration du substrat fixe les concentrations du substrat, qui est modifi, devraient s'tendre app app idalement de 0,2 Km jusqu' 10 Km ou jusqu' la concentration la plus leve qu'il soit possible d'atteindre exprimentalement, comme dans les expriences d'inhibition imaginaires dcrites dans le tableau 5.3 ( 5.7). Il n'est pas ncessaire d'avoir les mmes valeurs de concentration du substrat variable aux diffrentes concentrations du substrat fixe. Toutefois, il est utile d'avoir des ensemble bass approximativement sur une grille (comme dans le tableau 5.3), parce que cela permet de porter en graphique les donnes d'une mme exprience de deux manires diffrentes, o chaque substrat est son tour dsign comme le substrat variable . Notons cependant que les termes variable et constant sont choisis arbitrairement et sont particulirement utiles pour l'analyse des rsultats et en particulier pour dfinir ce que nous dsignons par comptitif , anticomptitif dans les ractions plusieurs substrats. La prparation des expriences d'inhibition par le produit pour les expriences plusieurs substrats ne ncessite aucune discussion particulire autre que celle donne dans le 5.8 pour les tudes des inhibitions simples. Il devrait tre suffisant de souligner que les expriences doivent tre ralises de telle sorte qu'elles permettent de rvler l'existence de composantes significatives d'inhibition comptitive ou anti-comptitive.
6.9. UN EXEMPLE SIMPLE D'TUDE D'UN ENZYME DEUX SUBSTRATS ET DEUX PRODUITS : LA CRATINE KINASE
Le traitement cintique des ractions enzymatiques impliquant plusieurs substrats et plusieurs produits en conditions d'tat stationnaire est compliqu. Nanmoins, comme nous en avions dj discut au 3.3.6, les quations de vitesse d'un mcanisme enzymatique peuvent tre simplifies si les tapes de fixation/dissociation des substrats et des produits sont traites comme tant en quilibre rapide vis--vis de la raction chimique. Cette situation est couramment dnomme situation de quasi-quilibre . Le mcanisme cintique de la cratine kinase suit un tel mcanisme et peut servir pour initier les tudiants la drivation des quations de vitesse de mcanismes enzymatiques complexes mais galement pour la ralisation de travaux pratiques. La cratine kinase (CK) est un enzyme dimrique que l'on trouve chez l'homme, essentiellement dans les muscles et dans le cerveau. Il catalyse la phosphorylation de la cratine pour former la phosphocratine, qui est utilise pour le stockage et le transport d'nergie chimique.
225
Le mcanisme cintique de la cratine kinase est un mcanisme complexe ternaire dans lequel la fixation des substrats et des produits suit un ordre alatoire (MORRISON et JAMES, 1965 ; MORRISON et CLELAND, 1966) (dans de nombreux ouvrages ce mcanisme est appel mcanisme squentiel bi-bi-alatoire en quasi quilibre qui correspond une nomenclature tablie par CLELAND (1963)). Il peut tre simplement reprsent par le schma de la figure 6.18 o A reprsente le complexe MgATP, B reprsente la cratine, P reprsente la phosphocratine et Q reprsente le complexe MgADP. Les constantes K1, K2, K3, K4, K6, K7, K8 et K9 sont les constantes de dissociation des diffrents complexes qui s'crivent de la faon suivante pour la partie gauche du systme.
K1 =
[ E ][ A ] [ EA ] [ EA ][ B ] K2 = [ EAB ] [ E ][ B ] K3 = [ EB ] [ EB ][ A ] K4 = [ EAB ]
[6.42]
Les constantes de dissociation pour les complexes impliquant P et Q s'crivent de la mme manire.
A K1 EA E EB K3 B K4 A K8 Q EAB B K2 k5 k5 P K6 EP EPQ EQ K9 P E Q K7
6.18. Mcanisme ractionnel de la cratine kinase La cintique des ractions catalyses par la cratine kinase peut tre dcrite par un mcanisme complexe ternaire squentiel o la fixation des substrats et des produits est alatoire et en tat de quasi-quilibre. Le schma est dessin selon la procdure introduite par CLELAND. L'hypothse du quasi-quilibre simplifie la drivation des quations de vitesse.
Dans le cas o les quilibres de dissociation des substrats et des produits sont en quilibre rapide, nous pouvons utiliser les lois de la thermodynamique pour simplifier l'criture de l'quation de vitesse. En effet, dans un systme l'quilibre, la
226
variation d'nergie libre entre deux tats du systme ne dpend pas du chemin ractionnel suivi et correspond la somme des variations d'nergie libre des diffrentes tapes se succdant sur un chemin donn. Les parties gauche et droite du mcanisme de la cratine kinase, correspondant aux tapes de fixation des substrats et des produits, peuvent tre considres comme deux systmes l'quilibre et nous pouvons crire : [6.43] DG + DG = DG + DG
1 2 3 4
qui peut aussi s'crire :
RT ln K1 + RT lnK 2 = RT ln K3 + RT ln K 4
Aprs simplification, nous obtenons l'quation suivante :
[6.44] [6.45] [6.46]
ln ( K1 K 2 ) = ln ( K3 K 4 )
et finalement :
K1 K 2 = K3 K 4
Cette dernire quation est trs utile pour crire l'quation de vitesse. Si, par souci de simplification, nous considrons que [ P ] = [ Q ] = 0 , l'quation de conservation de l'enzyme peut s'crire comme suit :
[ E ]0
= [ E ] + [ EA ] + [ EB ] + [ EAB ] [ A ] [ B ] [ A ][ B ] = [ E ] 1 + + + K1 K3 K1 K 4 = [ E ]D
[6.47]
[ A ] [ B ] [ A ][ B ] D = 1 + + + K1 K3 K1 K 4
[6.48]
La vitesse de la raction s'crit :
= k5 [ EAB ] [ E ][ A ][ B ] = k5 K1 K 4 [ E ]0 [ A ][ B ] = k5 D K1 K 4
[6.49]
Si nous dfinissons la vitesse limite de la raction directe comme V1 = k5 [ E ]0 , nous pouvons crire : V [ A ][ B ] v = 1 [6.50] D K1 K 4 A partir de cette quation de vitesse, il est alors possible d'analyser la cintique de la raction en utilisant par exemple la linarisation selon la mthode introduite par LINEWEAVER et BURK ( 3.5.2.1) :
1 = 1 K1 K 4 D = 1 K1 K 4 + K 4 + K1 + 1 v V1 [ A ][ B ] V1 [ A ][ B ] [ B ] [ A ]
[6.51]
227
Si [ B ] est fixe, alors nous avons :
1 = 1 1 K1 K 4 + K + 1 K 4 + 1 3 V1 [ B ] [ A ] V1 [ B ] v
[6.52]
Un graphique primaire de 1 V1 en fonction de 1 [ A ] (graphique primaire en double inverse) ayant l'allure d'une droite peut tre trac pour chaque concentration de B (figure 6.19).
1/v [B]1 [B]2 [B]3 [B]4 [B]
1 K1
1/[A]
6.19 - Reprsentation du graphique primaire en double inverse pour diffrentes concentrations de B
Les droites pour chaque concentration de B se croisent toutes en point, dont l'abscisse permet de dterminer K1, comme nous le dmontronsci-dessous. Pour deux droites obtenues deux concentrations distinctes de B, [ B ]1 et [ B ]2 , nous pouvons crire : K K K y1 = x 1 1 4 + K3 + 1 4 + 1 V1 [ B ]1 V1 [ B ]1 [6.53] 1 K1 K 4 1 K4 + 1 + K3 + y2 = x V1 [ B ]2 V1 [ B ]2 Au point d'intersection, y1 = y2, ce qui nous permet d'crire :
K1 K 4 V1
K 1 K4 1 + 1 4 = 0 [ B ]1 [ B ]2 V1 [ B ]1 [ B ]2
[6.54] [6.55]
qui se simplifie pour donner :
x K1 K 4 + K 4 = 0
d'o nous obtenons la valeur de l'abscisse de l'intersection : K4 = 1 x = K 4 K1 K1
[6.56]
228
Un graphique secondaire dans lequel la V app pour chaque [ B ] (figure 6.20), correspondant l'intersection de chaque droite avec l'ordonne, permet alors de dterminer les autres paramtres du modle. En rptant cette procdure avec le systme fonctionnant en sens inverse, c'est--dire en fixant [ A ] = [ B ] = 0 et en faisant varier [ P ] et [ Q ] , il est 1 possible de dterminer k 5 et les Vapp constantes de dissociation interK4 venant dans la partie droite du V schma de la figure 6.18.
1 V
1 K4
1 [B]
6.20 - Graphique secondaire
En accord avec la relation de HALDANE ( 3.6.3), la constante d'quilibre globale de la raction peut tre calcule de la manire suivante : VK K K = 1 6 7 [6.57] V1 K1 K 2
6.9.1. Application pratique de la mesure des paramtres pour la cratine kinase

La cratine kinase et les diffrents enzymes utiliss pour la ralisation des systmes coupls, sont des enzymes disponibles commercialement. Ces expriences peuvent donc servir pour la ralisation de travaux pratiques pour les tudiants. L'tude des ractions catalyses par la cratine kinase permet de se familiariser avec les systmes enzymatiques complexes, mais galement avec l'utilisation de systmes coupls. En effet, la raction catalyse par la cratine kinase, n'implique pas de variation de signal spectroscopique facilement exploitable pour suivre la cintique de la raction. La solution ce problme consiste utiliser un systme coupl qui va lier la raction de conversion ATP/ADP la conversion NADred /NADox. La conversion NADred /NADox donne lieu une variation importante de l'absorbance 340 nm caractrise par un M = 6 200M1 cm1 (voir 4.1.1) qui peut donc facilement tre suivie par spectrophotomtrie. Le systme coupl choisi pour suivre la raction directe implique deux enzymes qui catalysent deux ractions successives. La pyruvate kinase utilise l'ADP et le phosphonolpyruvate pour former du pyruvate et de l'ATP. Ensuite, la lactate dshydrognase rduit le pyruvate en lactate et oxyde le NADred en NADox. Les
229
substrats de ces deux enzymes doivent tre utiliss des concentrations finales de l'ordre de 1 mM pour le phosphonolpyruvate et de 0,3 mM pour le NADred. Le systme coupl ne doit pas limiter la vitesse de l'ensemble du systme. L'ADP doit tre converti en ATP aussitt qu'il est produit et ne doit donc pas s'accumuler. Il en va de mme pour le NADred qui doit tre consomm simultanment la production d'ATP. De plus la raction doit tre suffisamment rapide pour permettre une mesure aise de la vitesse initiale. Il faut donc vrifier l'efficacit du systme coupl et dterminer sa vitesse afin de choisir la quantit adquate d'enzyme. La concentration de cratine kinase doit tre aussi leve que possible dans les limites de saturation du systme coupl. Il faut que la vitesse de disparition du NADred soit proportionnelle la quantit de cratine kinase prsente dans le mlange ractionnel. Pour obtenir des graphiques primaires et secondaires interprtables, il est ncessaire mesurer la vitesse initiale de la raction directe pour des concentrations de cratine allant de 1 20 mM pour diffrentes concentrations d'ATP allant de 1,5 12 mM. Les mesures de vitesse sont toutes effectues 25C, dans un tampon 50 mM Tris/HCl pH 7,1 contenant 5 mM d'actate de magnsium (le Mg2+ est ncessaire au fonctionnement de la cratine kinase, car les substrats de l'enzyme sont les complexes MgATP et MgADP (voir 4.4)), 0,5 mM de dithiothreitol (qui permet la rduction de la fonction thiol dans le site actif de la cratine kinase) et 0,5 mM d'EGTA (un agent chlateur des mtaux lourds, en particulier du Zn2+, qui sont des inhibiteurs de l'enzyme). Pour tudier la raction inverse, il est ncessaire d'utiliser un second systme coupl. Dans ce cas, l'ATP produit par la cratine kinase est utilis, d'abord par l'hexokinase. En prsence de glucose, cet enzyme convertit l'ATP en ADP et transforme le glucose en glucose 6-phosphate. Le glucose 6-phosphate est alors utilis par un second enzyme, la glucose 6-phosphate dshydrognase qui l'oxyde en 6-phosphogluconate tout en rduisant le NADox en NADred. Ce second systme a l'avantage d'utiliser le mme signal spectroscopique que le premier. L'utilisation de ce systme ncessite les mmes mises au point que celles dcrites pour le systme pyruvate kinase/lactate dshydrognase. Pour obtenir des graphiques primaires et secondaires interprtables, il est ncessaire de mesurer la vitesse initiale de la raction directe pour des concentrations de phosphocratine, allant de 0,25 5,0 mM pour diffrentes concentrations d'ADP allant de 0,05 1,0 mM.
6.10. Ractions trois substrats et plus

Les mthodes pour l'tude des ractions impliquant plus de deux substrats sont une extension logique de celles dcrites dans les paragraphes prcdents ; elles ne ncessitent donc pas une prsentation aussi dtaille que celle faite pour les ractions deux substrats. Les ractions de ce type ne sont ni rares, ni ngligeables en biochimie elles comprennent par exemple le groupe des ractions catalyses
230
par les aminoacyl-ARNt synthtases et dans ce paragraphe nous soulignerons quelques points importants, en mettant essentiellement l'accent sur les caractristiques qui n'ont pas t traites dans les cintiques deux substrats. Les ractions trois substrats n'ont pas automatiquement trois produits en effet, des ractions trois substrats et deux produits sont courantes mais pour maintenir notre discussion dans des limites raisonnables, nous considrerons uniquement le cas d'une raction trois substrats A, B et C et trois produits P, Q et R. Si le mcanisme est branch (c'est--dire que certaines tapes peuvent avoir lieu de manire alatoire), l'quation complte de vitesse renferme des termes de concentration levs au carr et ventuellement des puissances suprieures, mais si aucune dpendance de haut ordre n'est observe, la forme la plus gnrale de l'quation de vitesse en absence de produit est la suivante : V1 [ A ][ B ][ C ] v = [6.58] K ABC + KBC [ A ] + K AC [ B ] + K AB [ C ] +
KmC [ A ][ B ] + KmB [ A ][ C ] + KmA [ B ][ C ] + [ A ][ B ][ C ]

dans laquelle V1 est la vitesse limite quand les trois concentrations de substrats sont extrapoles jusqu' saturation. KmA , KmB et KmC sont les constantes de MICHAELIS pour les trois substrats quand la concentration des deux autres substrats est saturante, et K ABC , KBC , K AC et K AB sont des produits de constantes de MICHAELIS et d'autres constantes avec des significations particulires qui dpendent du mcanisme considr, mais qui sont analogues au produit KiA KmB que l'on trouve dans l'quation [6.24]. L'quation [6.58] s'applique dans son intgralit si la raction se droule par l'intermdiaire d'un complexe quaternaire EABC qui se trouve dans des conditions d'tat stationnaire ou d'quilibre avec l'enzyme libre E et avec tous les autres complexes binaires et ternaires, c'est--dire EA, EB, EC, EAB, EBC et EAC. En plus de ce mcanisme totalement alatoire en quilibre rapide, une gamme d'autres mcanismes quaternaires complexes est possible, dans lesquels l'ordre de fixation est totalement ou partiellement obligatoire. Le cas extrme est celui du mcanisme ordonn dans lequel il y a un seul complexe binaire, EA, et un seul complexe ternaire, EAB, entre E et EABC. Les cas intermdiaires plausibles sont ceux dans lesquels il y a deux complexes binaires et un complexe ternaire, par exemple EA, EB et EAB ou ceux dans lesquels il y a un complexe binaire et deux complexes ternaires, par exemple EA, EAB et EAC. La classification des mcanismes deux substrats en mcanismes complexe ternaire et mcanismes enzyme modifi peut tre tendue aux mcanismes trois substrats, mais avec une gamme plus large de possibilits. Le type extrme de mcanisme enzyme substitu est celui dans lequel uniquement des complexes binaires sont forms et dans lequel chaque tape de fixation du substrat est suivie par une tape de libration d'un produit. Alternativement, une raction trois substrats et trois produits peut combiner des aspects des deux types de mcanismes,
231
de sorte que deux molcules de substrats peuvent se fixer pour former un complexe ternaire partir duquel un premier produit est libr avant que le troisime substrat ne puisse se fixer. Par exemple, avec la plupart des aminoacyl-ARNt synthtases, l'acide amin et l'ATP ragissent avec l'enzyme pour librer du pyrophosphate et former un complexe ternaire compos de l'enzyme, de l'acide amin et de l'AMP ; ce complexe ragit alors avec l'ARNt pour terminer la raction. Dans le cas de la thronyl-ARNt synthtase, l'isolement d'un tel complexe (ALLENDE J.E. et al., 1964) a permis de raliser une analyse cintique qui a confirm l'interprtation initiale (ALLENDE C.C. et al., 1970). Depuis lors, de nombreuses tudes similaires ont t ralises avec d'autres enzymes du mme groupe. Il est clair que le nombre de mcanismes possibles est trs grand, et mme si certains peuvent tre exclus parce qu'ils ne sont pas plausibles chimiquement (une limination qui n'est pas toujours faite) il reste encore environ dix huit mcanismes possibles trois substrats et trois produits (dont la liste t tablie par WONG et HANES, 1969) sans considrer les complications possibles de formation de complexes non-productifs et d'isomrisation. Il est donc particulirement important de prendre en compte la plausibilit chimique des mcanismes dans l'tude cintique des ractions trois substrats. De plus, condition que la vitesse semble obir l'quation de MICHAELIS et MENTEN pour chacun des substrats considrs sparment, la pratique habituelle consiste utiliser des quations de vitesse drives en supposant que toutes les parties alatoires du mcanisme sont dans un tat de quasi-quilibre et que toutes les parties ordonnes sont l'tat stationnaire. Ceci empche videmment l'apparition de termes d'ordre lev dans l'quation de vitesse et fournit un argument pour l'utilisation de la mthode de CHA ( 6.3.6). D'un point de vue cintique, les diffrents types de mcanisme gnrent des quations de vitesse comparables l'quation [6.58] mais qui diffrent entre elles par l'absence de certains termes au dnominateur, comme l'a fait remarquer en premier FRIEDEN (1959). Par exemple, pour le mcanisme illustr dans la figure 6.21 il est vident que la constante et les termes en [ A ] et [ B ] sont absents du dnominateur de l'quation de vitesse (parce qu'il est impossible de trouver un profil de KING et ALTMAN qui ne contienne aucun terme de concentration ou qui contienne uniquement [ A ] ou uniquement [ B ] : voir 6.3.6). Ainsi l'quation de vitesse pour ce mcanisme s'crit comme suit :
v =
V1 [ A ][ B ][ C ] [6.59] K AB [ C ] + KmC [ A ][ B ] + KmB [ A ][ C ] + KmA [ B ][ C ] + [ A ][ B ][ C ]
Pour n'importe quelle concentration de substrat variable et dans des conditions o la concentration des deux autres substrats est maintenue constante, cette quation a la forme d'une quation de MICHAELIS et MENTEN, avec des constantes apparentes qui sont prsentes dans le tableau 6.5. Comme d'habitude, le comportement de app Km est trop complexe pour tre utilis directement, mais celui des deux autres paramtres est trs informatif.
232
A R B
EA EAB E'P
a Q
ER E'C ECQ
E' C
A b E EA
EAB
E'P
E'
E'C
EQR
ER
6.21 - Exemple d'un mcanisme trois substrats et trois produits, prsent (a) sous la forme explicite d'une srie d'tapes et (b) dans le symbolisme de CLELAND
app Nous discuterons uniquement le comportement de V app Km , mais il est galeapp ment instructif d'examiner les expressions de V et de les comparer avec celles app des quations [6.24] et [6.34]. Avec [ A ] variable, V app Km augmente avec [ B ] app app mais est indpendant de [ C ] ; avec [ B ] variable, V Km est constant, indpendant de [ A ] et de [ B ] . Ceci distingue immdia-tement A et B de C, mais ne distingue pas ces deux substrats l'un de l'autre. A et B peuvent tre distingus en considrant l'effet de l'addition d'un seul produit.
Bien que l'quation de vitesse ne renferme aucun terme en [ A ] uniquement, elle renferme un terme en [ A ][ P ] si P est ajout au mlange ractionnel. Des termes en [ A ][ Q ] ou en [ A ][ R ] ne peuvent cependant pas tre gnrs par addition de Q ou de R, et l'addition d'aucun des trois produits ne peut gnrer un terme en [ B ][ P ] , [ B ][ Q ] ou [ B ][ R ] . En traitant [ P ] comme une constante, nous pouvons, dans la terminologie de WONG et HANES (1969), dire que l'addition de P rappelle dans l'quation de vitesse, le terme en [ A ] manquant. D'un autre ct, Q et R ne peuvent pas rappeler le terme en [ A ] et aucun des trois produits ne peut rappeler le terme en [ B ] . La consquence pratique de ceci est que si P est prsent app dans le mlange ractionnel, V app Km pour [ B ] variable devient dpendant de app app Km pour [ A ] variable reste indpendant de [ C ] quel que soit [ C ] , mais V le produit prsent. L'inhibition par le produit dans les ractions trois substrats et trois produits obit des principes similaires ceux prsents dans le 6.7, avec la caractristique additionnelle que l'inhibition anti-comptitive devient un phnomne relativement
233
commun : elle a lieu avec au moins une paire de substrat-produit dans tous les mcanismes ordonns. Pour les mcanismes que nous venons de discuter, par exemple, Q doit tre un substrat anti-comptitif vis--vis de A et de B, parce que, en absence de P et de R, tous les profils de KING et ALTMAN prsentant une dpendance en [ Q renferment galement le produit [ A ][ B ] . De manire similaire, R doit tre un substrat anti-comptitif vis--vis de C. Cette brve discussion de quelques points importants dans l'tude des mcanismes d'enzymes trois substrats, ne peut tre considre autrement que comme une simple introduction au vaste sujet que ces mcanismes constituent. Pour plus d'information, nous vous renvoyons des revues spcialises comme celle de WONG et HANES (1969) et celle de DALZIEL (1969). DIXON et WEBB (1979) discutent de l'utilisation d'change d'isotopes ( 6.7) dans le cas de ractions trois substrats, bien que les commentaires de DALZIEL (1969), concernant des sources possibles d'erreur, doivent tre pris en compte. L'analyse des ractions quatre substrats a t introduite par ELLIOTT et TIPTON (1974). Elle suit des principes similaires celle des ractions trois substrats.
Tableau 6.5 - Constantes apparentes pour un exemple de mcanisme trois substrats
Substrat variable
app
V app app Km V1 [ B ] K AB + K mA [ B ] V1 [ A ] K AB + K mB [ A ] V1 K mC
app Km
A B C
V1 [ B ][ C ] K mC [ B ] + K mB [ C ] + [ B ][ C ] V1 [ A ][ C ] K mC [ A ] + K mA [ C ] + [ A ][ C ] V1 [ A ][ B ] K AB + K mB [ A ] + K mA [ B ] + [ A ][ B ]
( K AB + K mA [ B ] ) [ C ]
K mC [ B ] + K mB [ C ] + [ B ][ C ]
( K AB + K mB [ A ] ) [ C ]
K mC [ A ] + K mA [ C ] + [ A ][ C ]
K mC [ A ][ B ] K AB + K mB [ A ] + K mA [ B ] + [ A ][ B ]
Ce tableau donne les expressions pour les valeurs apparentes des paramtres de l'quation de MICHAELIS et MENTEN pour une raction trois substrats qui obit l'quation [6.59]
PROBLMES
6.1 - L'hydrolyse progressive de la liaison (1 4) glucosidique de l'amylose est catalyse par deux enzymes, l'a-amylase et la b-amylase. Dans le cas de l'a-amylase, le nouveau groupe rduit obtenu adopte la mme configuration (avant une mutarotation) que celle rencontre dans le polymre de dpart. Par contre, dans le cas de la b-amylase, le nouveau
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CINTIQUE ENZYMATIQUE groupe form adopte la configuration b. Proposer des mcanismes de raction pour les ractions de transfert de ces deux groupes qui permettent d'expliquer ces observations.
6.2 - En 1978, PETERSEN et DENG ont observ que lorsque la laccase de Rhus vernicifera catalyse l'oxydation de l'hydroquinone par l'oxygne molculaire, la vitesse de la raction augmente indfiniment alors que la concentration des deux substrats augmente selon un rapport constant, sans arriver saturation. Afin d'expliquer ces rsultats, ces deux scientifiques ont propos un mcanisme de substitution de l'enzyme dans lequel l'oxydation initiale de l'enzyme par l'oxygne se droule en une tape, suivie d'une seconde tape dans laquelle l'enzyme est rgnr, avec comme rsultat la rduction de l'enzyme oxyd par l'hydroquinone. Expliquer pourquoi ce mcanisme rend compte de l'impossibilit des substrats saturer l'enzyme. 6.3 - Driver une quation de la vitesse initiale en absence de produits ajouts pour une raction qui obit un mcanisme complexe ternaire ordonn avec A qui se lie en premier et B en second. Nous supposerons que les tapes de la fixation des deux substrats sont l'quilibre. Pour ce mme mcanisme, quelle est la diffrence de forme entre cette quation et une quation l'tat stationnaire ? Quelle serait l'apparence des graphiques primaires de [ B ] v en fonction de [ B ] ? 6.4 - La vitesse d'une raction mesure en fonction de la tout en gardant le rapport due du graphique de [ A ] catalyse par un enzyme deux substrats est variation des concentrations de [ A ] et de [ B ] [ A ] [ B ] constant. Quelle sera la forme attenv en fonction de [ A ] si la raction obit :
a - un mcanisme complexe ternaire, b - un mcanisme enzyme modifi ? 6.5 - Quelle sera le profil d'inhibition par le produit attendu pour un enzyme qui obit un mcanisme complexe ternaire alatoire en quilibre rapide ? 6.6 - Considrer une raction deux substrats A et B qui suit un mcanisme enzyme substitu. Sans driver l'quation de vitesse complte, dterminer le type d'inhibition attendu dans le cas d'un inhibiteur qui se fixe dans une raction en cul-de-sac la forme libre de l'enzyme qui fixe B mais qui n'affecte pas l'autre forme de l'enzyme libre (on suppose qu'aucun des produits n'est prsent). 6.7 - Les symboles de DALZIEL (1957) sont encore utiliss assez souvent dans la littrature. Dans ce systme, l'quation serait crite sous la forme suivante :
235
f f f [ E ]0 = f 0 + 1 + 2 + 12 v S1 S 2 S1S 2
dans laquelle [ E ]0 et v ont la mme signification que dans ce livre, S1 et S 2 reprsentent [ A ] et [ B ] respectivement et f 0 , f 1 , f 2 et f 12 sont des constantes qui sont parfois appeles coefficients de DALZIEL. Quelles sont les valeurs de ces constantes en terme de symboles utiliss dans l'quation [6.8] ? A quel point (exprim en termes de coefficients de DALZIEL) les droites obtenues en portant S1 v en fonction de S1 pour diffrentes valeurs S2 se croisent-elles ? 6.8 - Considrer une raction trois substrats et trois produits : P+Q+R A+B+C qui obit un mcanisme complexe quaternaire dans lequel les substrats se fixent et les produits sont relchs dans l'ordre indiqu dans l'quation ci-dessus. La vitesse initiale en l'absence de produits peut tre obtenue partir de l'quation [6.42] en supprimant un terme. Rpondre aux questions suivantes (sans driver l'quation de vitesse complte) : a - Quel terme de l'quation doit tre supprim ? b - Quel produit, s'il y en a un, rappelle ce terme dans l'quation de vitesse ? c - Quel produit se comporte comme un inhibiteur anti-comptitif (en absence des deux autres produits) indpendamment de la variation de la concentration du substrat ? d - Quel produit se comporte comme un inhibiteur comptitif quand A est le substrat variable ?
7 UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'TUDE

DES MCANISMES ENZYMATIQUES 7.1. ECHANGE ISOTOPIQUE ET EFFETS ISOTOPIQUES
Il n'est certainement pas exagr de considrer que l'utilisation d'isotopes a jou un rle aussi important dans le dveloppement de la biochimie classique que le spectrophotomtre. Aucune des voies mtaboliques connues aujourd'hui n'aurait pu tre lucide sans l'utilisation d'isotopes. Aujourd'hui, la spectrophotomtrie joue encore un rle important dans l'tude de la cintique enzymatique plus que dans d'autres domaines de la biochimie, mais si l'utilisation d'isotopes est moins courante, il existe toujours quelques applications importantes qui doivent tre considres. Avant de discuter de ce point, il est important de souligner que les deux principales classes d'application d'isotopes ne sont pas simplement diffrentes l'une de l'autre, mais qu'elles sont diamtralement opposes. L'change isotopique, et toutes les autres utilisations d'isotopes des fins de marquage, reposent sur l'hypothse que la substitution isotopique d'un atome dans une molcule n'affecte pas les proprits chimiques de cette dernire, et que tout effet sur ses proprits cintiques est suffisamment faible pour tre nglig dans l'analyse : le marquage isotopique est uniquement utilis comme une mthode d'identification de certaines molcules dans un ensemble de molcules identiques. D'un autre ct, l'analyse des effets isotopiques repose sur l'hypothse qu'il existe des diffrences mesurables entre les proprits cintiques ou d'quilibre de molcules substitues par des isotopes. Il est vident que ces deux hypothses ne peuvent pas tre correctes simultanment, mais en pratique, cette contradiction ne pose pas de problme puisque des conditions peuvent tre choisies dans lesquelles chacune de ces hypothses est valable. En ralit, les diffrences exprimentales entre les deux types d'application sont considrables, comme le montre le tableau 7.1. La nature nous a gnreusement fourni deux isotopes lourds d'hydrogne, l'lment le plus abondant, qui peuvent tre utiliss pour tudier les effets isotopiques. Ces effets dpendent des diffrences relatives de masse atomique ( 7.6 et 7.7), et celles-ci sont les plus grandes pour les lments les plus lgers. Des isotopes radioactifs de trois lments (hydrogne, carbone, phosphore) parmi les plus importants lments biologiques sont galement disponibles, alors que des isotopes radioactifs de l'azote et de l'oxygne se
238
manifestent par leur absence : bien que cette absence ait des consquences srieuses pour l'tude du mtabolisme, elle est moins importante pour l'change d'isotope en tant que sonde cintique des mcanismes enzymatiques, car presque toutes les molcules offrent la possibilit de raliser le marquage d'un carbone ou d'un hydrogne loign du site de la raction.
Tableau 7.1 - Utilisations cintique d'isotopes Condition Localisation d'une substitution Marquage isotopique Effets isotopiques Eloign du site ractionnel Liaison ractionnelle : effets isotopiques primaires Liaison voisine de la liaison ractionnelle : effets isotopiques secondaires Solvant : effets isotopiques du solvant 100% (idalement*) Masses atomiques diffrentes
2
Etendue de la substitution Isotopes typiques
Trace
3
Proprit utiles des isotopes Radioactivit H, 14C, 32P
H, 3H
* La substitution avec 3H est uniquement possible des niveaux de traces. Ceci signifie que les expriences qui ncessitent la saturation de l'enzyme avec des molcules substitues ne sont pas possibles avec 3H. L'utilisation d'isotopes dans des applications autres que cintiques n'est pas obligatoirement en accord avec les gnralisations donnes dans ce tableau. Par exemple les isotopes lourds de l'oxygne (17O et 18O) ont t utiliss avec succs pour tudier la strochimie de ractions de substitution sur les atomes de phosphore, mais puisque ces isotopes ne sont pas radioactifs ils ont t dtects par d'autres mthodes, comme la rsonance magntique nuclaire (JARVEST, LOWE et POTTER, 1981) ou par spectromtrie de masse (ABBOTT et al., 1979), qui ne sont pas suffisamment sensibles pour tre utilises avec des quantits en trace de marqueur isotopique.
7.2. PRINCIPES DE L'CHANGE D'ISOTOPE

Dans l'tude du mcanisme des ractions enzymatiques, l'analyse des vitesses initiales de raction plusieurs substrats dans les directions directe et inverse, et en prsence ou en absence de produits, limine gnralement de nombreux chemins ractionnels possibles et donne une bonne ide des caractristiques gnrales du mcanisme, mais elle ne rvle habituellement pas l'existence d'un chemin alternatif si celui-ci contribue de manire ngligeable la vitesse globale. Davantage d'information est alors ncessaire pour obtenir une image reprsentative de la raction dans son ensemble. Mme si un mcanisme clair merge des mesures de vitesse initiale et d'inhibition par le produit, il est utile de pouvoir confirmer indpendamment sa validit. La technique importante d'change d'isotope permet
7 UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'TUDE DES MCANISMES ENZYMATIQUES
239
souvent d'apporter cette vrification. Elle a t introduite pour l'tude des cintiques enzymatiques par BOYER (1959), bien que le principe fondamental ait t propos plus tt par MCKAY (1938) : mme si, par dfinition, une raction chimique est l'quilibre quand sa vitesse nette est gale zro, les vitesses unidirectionnelles de certaines tapes ou de certains groupes d'tapes peuvent tre mesures au moyen de traceurs isotopiques. L'utilisation de traceurs nonisotopiques est encore plus ancienne, remontant l'investigation de l'oxydation des acides gras par KNOOP (1904), mais, bien que des traceurs chimiques, comme le groupe phnyle, puissent fournir une information qualitative importante, l'utilisation de traceurs dans les expriences cintiques n'a t possible qu'avec l'apparition des isotopes. Utiliser la cintique des ractions d'changes d'isotopes, il est ncessaire de faire deux hypothses importantes. Elles sont habituellement vrifies et souvent simplement sous-entendues, mais il est aussi bien de les noncer clairement afin d'viter tout malentendu. La premire hypothse est qu'une raction impliquant des substrats radioactifs suit le mme mcanisme que la raction normale, avec les mmes constantes de vitesse. En d'autres termes, les effets isotopiques ( 7.6 et 7.7) sont supposs ngligeables. Cette supposition est gnralement vraie, condition que 3 H (Tritium) ne soit pas le marqueur radioactif. Mme dans ce cas, les effets isotopiques pourront tre ngligs si l'atome 3H n'est pas directement impliqu dans la raction ou dans la fixation du substrat sur l'enzyme. La seconde hypothse est que les concentrations de toutes les espces radioactives soient si faibles qu'elles n'ont aucun effet perceptible sur les concentrations des espces non marques. Cette hypothse peut habituellement tre satisfaite et constitue un point important car, dans ce cas, les espces marques peuvent tre ignores dans le calcul des concentrations des espces non-marques, simplifiant ainsi considrablement l'analyse. L'change d'isotopes est plus facilement compris l'aide d'un exemple, comme celui prsent dans le schma de la figure 7.1, qui reprsente le transfert d'un atome radioactif (reprsent par un astrisque) de A* vers P* dans le mcanisme ordonn complexe ternaire. Puisque cet change implique que A* se fixe E, il ne peut se raliser que si la concentration de E est suffisante.
EA* k1 k1[A*] E k1[A] k1 EA
k2 k2[B] k3 k3[P*]
k4 k 4[Q] k3[P] k3
k2 k2[B]
EA*B EP*Q
EQ
EAB EPQ
7.1 - Echange isotopique dans un mcanisme ordonn complexe ternaire Le schma montre les tapes ncessaires pour le transfert du marqueur de A* P*.
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La raction d'change doit donc tre inhibe par des concentrations leves de A ou de Q, puisque ces molcules sont en comptition avec A* pour se fixer sur E. Les effets de B et P sont plus subtils : d'un ct, la raction d'change implique la fixation de B sur EA*, et donc ncessite la prsence d'une concentration finie de B. D'un autre ct, si B et P sont prsents des concentrations trs leves, l'enzyme existera principalement sous la forme du complexe ternaire, (EAB + EPQ), et il n'y aura donc plus de E libre pour fixer A*. On s'attend alors ce que des concentrations leves de B et de P inhibent l'change, et il n'est pas difficile de montrer que cette prdiction se vrifie. Les vitesses d'change des concentrations d'intermdiaires peuvent tre crites de la faon habituelle et leur valeur fixe zro en accord avec l'hypothse de l'tat stationnaire : d [ EA*] = k1 [ A*][ E ] ( k 1 + k 2 [ B ])[ EA*] + k 2 [ EA * B ] = 0 [7.1] dt d [ EA * B ] = k 2 [ B ][ EA*] ( k 2 + k3 )[ EA * B ] + k 3 [ P*][ EQ ] = 0 [7.2] dt Celles-ci constituent une paire d'quations simultanes dont [ EA*] et [ EA * B ] sont les inconnues. La solution pour [ EA * B ] , avec [ P*] fixe zro, est la suivante : k1 k 2 [ A*][ B ][ E ] [ EA * B ] = [7.3] k 1( k 2 + k3 ) + k 2 k3 [ B ] La vitesse initiale d'change v* est donne par k3 [ EA * B ] :
v* =
k1 k 2 k3 [ A*][ B ][ E ] k 1( k 2 + k3 ) + k 2 k3 [ B ]
[7.4]
Cette dernire quation est indpendante de toute hypothse concernant l'effet des ractifs marqus radioactifs sur la raction non marque, mais avant de pouvoir l'utiliser, il est ncessaire d'obtenir une expression pour [ E ] qui puisse y tre insre. Comme nous l'avons indiqu plus haut, le traitement est grandement simplifi si nous supposons que les concentrations des ractifs non marqus ne sont pas affectes par la prsence de faibles quantits des espces marques ; de cette manire la valeur de [ E ] est la mme que s'il n'y avait pas de marquage. Si l'exprience est ralise avec la raction non marque dans des conditions d'tat stationnaire, l'expression pour [ E ] drive dans le 6.3.2 doit tre utilise, mais l'utilisation de celle-ci conduit des expressions complexes et n'est heureusement pas ncessaire. Il y a deux faons d'viter les complications : soit nous pouvons tudier l'change d'isotopes avec la raction non-marque dans ces conditions d'quilibre, comme nous en discutons dans le 7.3, ou, plutt que des vitesses relles d'change, nous pouvons discuter des rapports de ces vitesses, comme il en est question dans le 7.5.1. La mthode l'quilibre est de loin la meilleure mthode connue et la plus largement utilise des deux, mais les deux mthodes reprsentent des mthodes puissantes et utiles.
241
7.3. ECHANGE D'ISOTOPES L'QUILIBRE

Si la raction non-marque est l'quilibre, la concentration d'enzyme libre dans le mcanisme ordonn complexe ternaire est donne par : [ E ]0 [E] = [7.5] k1 [ A ] k1 k 2 [ A ][ B ] k1 k 2 k3 [ A ][ B ][ P ] 1+ + + k 1 k 1k 2 k 1k 2 k 3 Les quatre termes du dnominateur font rfrence aux quatre espces d'enzymes, E, EA, (EAB + EPQ) et EQ, et chacun est dans un rapport d'quilibre appropri vis--vis du prcdent, comme par exemple [ EA ] [ E ] = k1 [ A ] k 1 . Cette quation ne contient pas le terme [ Q ] car, si l'quilibre doit tre maintenu, uniquement trois parmi les quatre concentrations de ractif sont ncessaires. N'importe laquelle des concentrations [ A ] , [ B ] ou [ P ] peut tre remplace par [ Q ] , comme le montre l'identit suivante : [ P ][ Q ] k k k k Keq = 1 2 3 4 = [7.6] [ A ][ B ] k 1k 2 k 3k 4 Par exemple, si nous souhaitons examiner les effets de l'augmentation dans un rapport constant des concentrations de B et de P, [ B ] et [ P ] , pour quelques valeurs donnes de [ A ] et de [ Q ] , il serait appropri de remplacer [ P ] par [ Q ] en utilisant l'quation [7.6]. Si cela est fait, la substitution de l'quation [7.5] dans l'quation [7.4] donne la vitesse d'change d'isotope l'quilibre chimique :
v* =
k1 k 2 k3 [ E ]0 [ A*][ B ] k1 [ A ] k1 k 2 [ A ][ B ] k 4 [ Q ] + + 1 + k 1( k 2 + k3 ) + k 2 k3 [ B ] k 1 k 1k 2 k4
[7.7]
Puisque le numrateur de cette quation est proportionnel [ B ] alors que le dnominateur est du second degr en [ B ] , il est vident qu'elle a la mme forme que l'quation pour l'inhibition d'un enzyme un seul substrat, l'quation [5.38]. Ainsi, puisque [ B ] et [ P ] varient de 0 jusqu' la saturation, la vitesse d'change augmente jusqu' un maximum et ensuite diminue jusque zro. Les quations pour toute autre raction d'change peuvent tre drives de faon similaire. Dans le mcanisme ordonn complexe ternaire, l'change entre B* et P* ou Q* n'est pas inhib par A car des concentrations saturantes de A n'liminent pas EA du systme, mais, au contraire, amnent sa concentration un maximum. Des rsultats similaires sont obtenus avec la raction inverse (comme il est logiquement attendu pour un systme l'quilibre, puisque dans un tel systme la vitesse directe de n'importe quelle tape est la mme que la vitesse inverse) : l'change partir de Q* est inhib par un excs de P, mais l'change partir de P* n'est pas inhib par excs de Q.
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Le mcanisme alatoire complexe ternaire diffre du mcanisme ordonn par le fait qu'aucun change ne peut tre compltement inhib par le substrat qui n'est pas impliqu dans l'change. Par exemple, si B est prsent en excs, le chemin particulier pour l'change de A* en P* considr plus haut est inhib car E est limin du systme, mais l'change n'est pas compltement inhib car une voie alternative existe : des concentrations leves de B, A* peut entrer dans des ractions d'changes en se fixant sur EB pour donner EA*B. Puisque le comptage de la radioactivit peut tre ralis de manire trs sensible, il est possible de dtecter des chemins ractionnels mineurs par les mthodes d'change d'isotopes.
7.4. ECHANGE D'ISOTOPES

DANS DES MCANISMES ENZYME MODIFI
L'change d'isotope permet une simplification utile des mcanismes enzyme modifi car il permet d'tudier uniquement une moiti de la raction la fois (figure 7.2). Ce mcanisme a la mme forme que le mcanisme complet, avec P* et A* remplaant respectivement B et Q, mais les cintiques sont plus simples car les constantes de vitesse sont les mmes pour les deux moitis de la raction. Ce type d'change reprsente une diffrence qualitative majeure entre les mcanismes enzyme modifi et les mcanismes complexe ternaire, parce que dans les mcanismes complexe ternaire aucun change ne peut avoir lieu si le systme n'est pas complet. Cette mthode de distinction entre les deux types de mcanismes a t utilise et discute (DOUDOROFF, BOUKER et HASSID, 1947 ; KOSHLAND, 1955) bien avant l'introduction de l'change A d'isotopes comme une technique cintique.
E A* EA E'P
7.2 - Echange isotopique dans un mcanisme enzyme modifi Notons qu'avec ce type de mcanisme, l'change d'isotope peut avoir lieu mme si le mlange ractionnel est incomplet, c'est--dire qu'il n'est pas ncessaire que le second substrat ou le second produit soit prsent.
P EA* E'P* P* E'P
La possibilit d'tudier uniquement certaines parties d'un mcanisme est particulirement intressante dans le cas de mcanismes enzyme modifi plus complexes, impliquant trois substrats ou plus. Dans de tels cas, toute simplification des cintiques est videmment la bienvenue, et cette approche a t utilise avec un certain succs, par exemple par CEDAR et SCHWARTZ (1969) dans l'tude de l'asparagine synthtase.
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Cette capacit qu'ont de nombreux enzymes de catalyser des ractions partielles, implique que les expriences d'change d'isotopes ncessitent des enzymes mieux purifis que les expriences conventionnelles pour que les rsultats soient valables. La raison de cette ncessit est simple. Supposons que nous tudions l'aspartate transaminase, qui catalyse la raction suivante (que nous avons prsent avec plus de dtails dans l'quation [6.3]). Glutamate + Oxaloactate 2-oxoglutarate + Asparate [7.8] La prsence dans la prparation d'enzyme de faibles quantits d'enzymes contaminants comme par exemple d'autres transaminases, a peu d'importance si nous suivons la raction complte car il est improbable qu'un de ces contaminants soit capable de catalyser la raction complte. Toutefois, l'change entre le glutamate et le 2-oxoglutarate reprsente un autre problme, en particulier si nous utilisons une mthode trs sensible de dosage, et nous devons nous assurer qu'aucune autre transaminase n'est prsente si nous voulons obtenir des informations sur l'aspartate transaminase. Bien que cet avertissement s'applique en particulier aux enzymes qui oprent par un mcanisme enzyme modifi, il n'est pas inutile d'apporter une mme attention la puret de la prparation d'enzyme lors de l'tude d'autres enzymes, mme si ceux-ci ne sont pas susceptibles de catalyser des ractions partielles ; comme nous en avons discut la fin du 6.2.3, il pourrait y avoir plus d'enzymes qui ragissent selon un mcanisme enzyme modifi que ce qui n'est gnralement accept.
7.5. ECHANGE D'ISOTOPES HORS QUILIBRE

7.5.1. Rapports de flux chimiques
Comme nous l'avons not ci-dessus, les quations de vitesse pour l'change d'isotopes deviennent trs compliques si la raction non-marque n'est pas maintenue l'quilibre durant l'change. Nanmoins, il y a une bonne raison pour tudier des ractions enzymatiques qui ne sont pas l'quilibre. A l'quilibre chimique il est impossible de dmler les effets dus la fixation du substrat de ceux dus la libration du produit, et, sauf si l'enzyme est capable de catalyser une demi-raction ( 7.4), nous sommes obligs de considrer la raction entire. L'change d'isotopes hors d'quilibre, par contre, permet d'isoler et d'examiner sparment la partie d'un mcanisme qui est responsable d'un change en particulier. L'tape cruciale pour faire de la mthode d'change d'isotopes hors quilibre une technique utile, sans se laisser attirer par une complexit sans espoir, a t franchie par BRITTON (1966). Il a ralis que mesurer et comparer des transferts simultans entre un ractif et deux autres limine en grande partie la complexit des expressions de vitesse en divisant l'une par les deux autres. Cela s'explique par le fait que
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les caractristiques mcaniques, en dehors de la partie du mcanisme responsable des deux changes, affectent les deux vitesses de la mme manire et, par consquent, n'affectent pas leur rapport. Cette ide peut tre illustre en considrant un mcanisme capable de convertir deux substrats en un produit P, comme le montre le schma suivant :
A E v1 v1 EA B v2 v2 E'P v3 v3 P E'
[7.9]
Celui-ci peut reprsenter une raction complte, avec (E' identique E) ou il peut simplement reprsenter le fragment d'un schma plus large dont le reste peut tre arbitrairement compliqu sans que cela n'affecte l'analyse, condition qu'il ne comporte aucune voie alternative de conversion de A + B en P. Supposons maintenant que nous avons P* doublement marqu de faon telle qu'il soit possible de mesurer simultanment la conversion de A* et de B . Puisqu'il n'est pas ncessaire de mentionner explicitement les marqueurs pour driver les quations, ils seront omis : il est suffisant de se rappeler que lorsque nous nous rfrons une conversion unidirectionnelle de, par exemple, P en A, l'existence d'un marqueur adquat est implicite. Dans ce contexte, il est conventionnel de considrer une vitesse unidirectionnelle de ce type comme un flux, mais malheureusement cette distinction entre vitesses et flux est assez diffrente (presque oppose) de celle utilise dans l'analyse du contrle mtabolique ( 10.4). Pour cette raison, nous utiliserons ici le terme plus long de flux chimique recommand par l'IUPAC (1981) pour dsigner une vitesse unidirectionnelle, et nous utiliserons le symbole F (X Y) pour reprsenter le flux chimique de X vers Y. Le flux chimique de P vers E'P est clairement donn par v 3 = k 3 [ E' ][ P ] . Nanmoins, cela ne reprsente pas le flux chimique de P vers B, et encore moins celui de P vers A, parce que toutes les molcules de E'P produites par la fixation de P sur E' ne continuent pas dans la mme direction de la raction et ne librent pas B ; quelques-unes retournent pour rgnrer E' et P. En outre, certaines molcules de EA produites par la libration de B partir de E'P retournent galement vers E' et P (avec la capture d'une molcule diffrente de B) au lieu de librer A. Il est immdiatement vident que si le mcanisme est celui illustr par le schma de la figure 7.2, le flux chimique de P vers B est suprieur au flux chimique de P vers A, mais nous pouvons placer cela sur une base quantitative en considrant les probabilits chaque point du mcanisme de continuer dans la mme direction ou de s'inverser. Pour une molcule E'P produite par la fixation de P sur E', cette probabilit est donne par v 2 ( v 2 + v3 ) car il n'y a que deux solutions possibles, soit la continuation vers EA + B ou le retour vers E' + P, qui se droulent respectivement aux vitesses v2 et v3. Ainsi, le flux chimique de P vers B est :
F( P B ) =
F ( P E' P ) F ( E' P B ) v v k k [ E ][ P ] [7.10] = 2 3 = 2 3 v 2 + v3 k 2 + k3 F ( P E' P ) + F ( E' P B )
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Pour calculer le flux chimique de P vers A, nous notons premirement que F (P EA) est le mme que F (P B), donn dans l'quation [7.10]. Nous avons galement besoin du flux chimique inverse F (EA P) qui peut tre calcul de faon similaire de la manire suivante :
F ( EA P ) =
k k [ EA ][ B ] v 2 v3 = 2 3 v 2 + v3 k 2 + k3
[7.11]
Ensuite, le flux chimique de P vers A est construit d'une faon analogue celui utilis pour l'quation [7.10] : c'est le flux chimique de P vers EA multipli par la probabilit que la molcule de EA, une fois forme, libre A plutt que de retourner vers P : F ( P EA ) F ( EA A ) F( P A ) = F ( EA A ) + F ( EA P ) v 1v 2 v 3 = [7.12] v v v 2 + v3 ) v 1 + 2 3 ( v 2 + v3 k 1k 2 k 3 [ E ][ P ] = k k [ B ] ( k 2 + k3 ) k 1 + 2 3 k 2 + k3 A ce point, nous pouvons tre tents par le dsespoir : si l'expression pour un flux chimique dans un mcanisme simple trois tapes est aussi complique que cela, et qui plus est avant d'avoir substitu la concentration de E dans le but de produire une quation utilisable, quel espoir peut-il y avoir d'obtenir des quations manipulables pour des mcanismes de rel intrt ? Le point essentiel est qu'en dpit de la complexit de ces quations, si nous examinons chacune d'elle isolment, elles se simplifient considrablement si nous divisons l'une par l'autre pour obtenir l'expression d'un rapport de flux chimiques. Cela deviendra plus clair dans un moment, mais au pralable, nous devons nous dbarrasser d'une seconde question qui se posera probablement en relation avec des expressions du type de l'quation [7.12] : ne serait-il pas dans l'ordre des choses de commencer par multiplier numrateur et dnominateur de l'quation [7.12] par k2 + k3, et ensuite de distribuer les termes entre parenthses ? Cela s'avre tre une tentation laquelle il faut rsister : la simplification potentielle apporte par ce procd est en ralit tellement lgre qu'elle peut tre nglige, et si des expressions de flux chimique sont laisses dans leur forme non simplifie, il est facile (avec la pratique) de reconnatre par inspection visuelle la raison de la prsence de chaque terme dans l'quation, alors que cette logique est obscurcie en appliquant la simplification. De plus, les quations dans leur forme non-simplifie sont pratiques pour comparer les unes aux autres. Ainsi, il est vident en les observant que l'quation [7.12] diffre de l'quation [7.10] uniquement par le facteur k1 au numrateur
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et par le second terme entre parenthses au dnominateur. Le rapport de flux chimique peut donc s'crire sous la forme :
F( P B ) k 2 k3 [ B ] = 1+ F( P A ) k 1( k 2 + k3 )
[7.13]
Les caractristiques marquantes de cette quation sont que [ A ] , la concentration du substrat qui se fixe en premier dans la raction directe, n'apparat pas, et qu'elle exprime une simple dpendance linaire vis--vis de [ B ] , la concentration du substrat qui se fixe en second. Les conclusions qui peuvent tre tires partir de l'quation [7.13] dpendent de certaines hypothses. La raction peut progresser dans le sens A + B donne P ou dans le sens P donne A + B ou elle peut tre l'quilibre. Les concentrations [ A ] , [ B ] et [ P ] peuvent prendre n'importe quelle valeur et tre exprimes en valeurs absolues ou en valeurs relatives. Le recyclage de E' en E peut tre extrmement simple (c'est--dire qu'il peut s'agir de la mme espce) ou il peut tre arbitrairement compliqu (pour autant qu'il n'implique pas de chemin alternatif de conversion de A + B en P.) Cela signifie galement qu'aucune hypothse n'est faite concernant l'obissance de la raction globale au modle de MICHAELIS et MENTEN ou toute autre quation de cintique simple. Si d'autres ractifs sont impliqus, ils peuvent participer dans n'importe quel ordre et peuvent tre entremls avec les tapes prsentes dans l'quation [7.9] ; par exemple, la place de la raction une tape qui est prsente, la fixation de B sur EA peut tre un processus trois tapes dans lequel un autre substrat C se fixe galement et un autre produit Q est libr. Les ractions en cul-de-sac, qu'elles fassent ou ne fassent pas partie du fragment de raction correspondant la conversion de A + B en P, n'ont aucun effet sur la forme du rapport des flux chimiques. Il s'ensuit ds lors que la mesure du rapport des flux chimiques fournit une mthode remarquablement puissante d'tude des questions spcifiques d'ordre de fixation en s'affranchissant d'autres caractristiques complexes des mcanismes. Il est vident, par des considrations de symtrie, que l'quation [7.13] ne peut pas s'appliquer au cas o A et B peuvent se fixer l'enzyme dans un ordre alatoire, puisqu'il ne serait pas possible dans ce cas que le rapport des flux chimiques dpende d'un substrat mais pas de l'autre. L'analyse du mcanisme alatoire complet complexe ternaire montre que cela est correct, et que quand A et B se fixent dans un ordre alatoire, le rapport des flux chimiques partir de P se caractrise par une dpendance hyperbolique vis--vis des deux concentrations de substrat : un exemple d'un tel comportement est fourni par des expriences ralises avec la phosphofructokinase de muscle de lapin (MERRY et BRITTON, 1985). De plus amples dtails sur la thorie de ces expriences peuvent tre obtenus ailleurs (CORNISH-BOWDEN, 1981). L'hexokinase D de foie de rat fournit l'exemple d'un enzyme se comportant de la manire la plus simple (GREGORIOU, TRAYER et CORNISH-BOWDEN, 1981.) Bien
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que les cintiques n'obissent pas au modle de MICHAELIS et MENTEN vis--vis du glucose et qu'en consquence les expriences conventionnelles d'inhibition par le produit soient difficiles analyser, des mesures des flux chimiques du glucose 6-phosphate vers l'ATP et le glucose ont donn les rsultats prsents dans la figure 7.3 : exactement les rsultats attendus sur la base de l'quation [7.13] si le glucose est le substrat qui se fixe en premier.
F (Glucose-6P ATP) F (Glucose-6P Glucose) a
12 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6
[ATP] (mM) F (Glucose-6P Glucose) F (Glucose-6P ATP) b

0 0 5 10 15 20 25 50 2 1
[Glucose] (mM)
7.3 - Mesures de flux chimiques pour l'hexokinase D La figure montre les donnes de GREGORIOU, TRAYER et CORNISH-BOWDEN (1981) pour le transfert simultan de 32P vers l'ATP et de 14C vers le glucose partir de glucose6-phosphate marqu avec le 14C et le 32P. La thorie prdit une variation du rapport des flux chimiques avec la concentration du substrat qui se fixe en second dans une raction ordonne, mais aucune variation avec le substrat qui se fixe en premier, comme le montrent respectivement les parties (a) et (b) de la figure.
7.5.2. Cintiques d'isomrisation

Nous pourrions supposer que les types les plus simples d'exprience cintique seraient appropris avec les isomrases (qui incluent les mutases, les racmases, les pimrases), puisque ces enzymes catalysent d'authentiques ractions un substrat et un produit. Nanmoins, les isomrases prsentent une difficult spciale qui est vidente quand elle est souligne, mais qui peut facilement tre nglige : il est impossible de raliser des expriences conventionnelles d'inhibition par le
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produit avec ces enzymes car une raction ne peut pas tre irrversible si la solution contient simultanment le substrat et le produit. Par consquent, le terme ngatif du numrateur dans l'expression de la vitesse ne peut pas tre nglig, et l'hypothse cruciale qui permet de simplifier la plupart des quations cintiques jusqu'au point de permettre l'utilisation des mthodes graphiques et statistiques conventionnelles, est invalide. Cette limitation est particulirement srieuse pour les isomrases cause d'une caractristique mcanique importante de ces enzymes, qui peut tre plus raisonnablement ignore avec d'autres enzymes. Dans chaque mcanisme, nous pouvons postuler qu'il pourrait y avoir une tape obligatoire d'isomrisation de l'enzyme, c'est dire que la forme libre de l'enzyme qui est libre la fin de la raction peut tre diffrente de la forme implique dans la premire tape, de sorte qu'une isomrisation de l'enzyme est ncessaire pour complter le cycle. Toutefois, dans une raction impliquant plusieurs substrats et produits, il n'y a pas de raison particulire pour supposer l'existence d'un tel phnomne : si nous examinons le mcanisme enzyme modifi de l'quation [6.3], par exemple, il n'y a aucune de raison de supposer que le processus chimique soit facilit par l'introduction d'une telle tape. Par contre, dans le cas d'une isomrase, les avantages d'une telle tape sont plus clairs. Par exemple, une mutase, c'est--dire un enzyme qui catalyse le mouvement d'un groupe d'une position une autre dans la mme molcule, peut facilement tre imagine comme une protine existant sous deux formes, chacune complmentaire de l'un des deux ractifs, mais qui peut rapidement commuter entre ces deux tats. Ainsi, une partie essentielle de l'tude mcanique d'une isomrase doit tre de dterminer si celle-ci opre de cette manire ; dans leur argumentation ALBERY et KNOWLES (1987) vont jusqu' dire qu'aucune investigation cintique d'un enzyme ne peut tre considre comme complte tant que des expriences n'ont pas t conduites afin de dterminer si les tapes limitantes dans des conditions de saturation (par le substrat) dpendent de la modification du substrat ou de la conversion de l'enzyme libre. Ce point de vue est certainement justifi avec les isomrases, mme s'il peut paratre exagr avec d'autres enzymes. Les cintiques conventionnelles ne permettent pas de rpondre cette question. Si nous appliquons la mthode de KING et ALTMAN au mcanisme d'une raction un substrat et un produit impliquant une isomrisation de l'enzyme :
P E+A k1 k1 EA k2 k2 E' k3 k3 E
[7.14]
cela n'est pas immdiatement apparent, parce que l'quation de vitesse contient un terme en [ A ][ P ] , qui pourrait tre dtectable par des techniques ordinaires :
v =
k1 k 2 k3 [ E ]0 [ A ] k 1k 2 k 3 [ E ]0 [ P ] ( k 1 + k 2 )( k 3 + k3 ) + k1( k 2 + k3 )[ A ] + ( k 1 + k 3 )k 2 [ P ] + k1 k 2 [ A ][ P ]
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[7.15] Toutefois, la technique ordinaire en question est l'inhibition par le produit, qui, comme nous l'avons mentionn plus haut, est impossible dans des conditions d'irrversibilit de la raction avec un enzyme un seul produit. Le problme semble toujours tre accessible l'analyse par des techniques ordinaires si nous mesurons la vitesse en variant [ A ] et [ P ] dans un rapport constant, comme par exemple en fixant [ P ] = r [ A ] ou r est une constante, car dans ce cas l'quation de vitesse prend une forme simple avec un seul terme au numrateur :
v =
( k1 k 2 k3 k 1k 2 k 3r )[ E ]0 [ A ] [7.16] ( k 1 + k 2 )( k 3 + k3 ) + k1( k 2 + k3 ) + ( k 1 + k 3 )k 2 r [ A ] + k1 k 2 r [ A ] 2
Cette quation n'a pas la forme standard pour une inhibition par le substrat (quation [5.38]), et, en principe donc, si l'isomrisation de l'enzyme a lieu, la vitesse doit passer par un maximum quand elle est tudie en fonction des concentrations des deux ractifs, varies dans un rapport constant. Toutefois, l'observation d'un maximum dans une gamme accessible de concentrations, dpend des constantes de vitesse. Un cas est vident : si k3 et k3 sont toutes les deux trs grandes, alors E et E' ne sont pas distinguables cintiquement, de sorte que le mcanisme devient quivalent au mcanisme ordinaire une tape de MICHAELIS et MENTEN, et le terme en [ A ] 2 n'est pas dtectable. BRITTON (1973), cependant, a mis en vidence une seconde possibilit qui est moins vidente et qui reste surprenante et non-intuitive, mme aprs en avoir vrifi l'algbre : le terme en [ A ] 2 devient galement indtectable si k1 et k2 sont toutes deux trs grandes, ce qui signifie qu'il est impossible de dtecter si l'isomrisation de l'enzyme libre limite la vitesse pour des concentrations leves de substrat. Mme si elle est dtectable, BRITTON (1973) a montr que n'importe quel ensemble particulier de paramtres observs est consistant avec deux ensembles diffrents de constantes de vitesse, l'un donnant plus d'importance l'isomrisation de l'enzyme que l'autre. En rsum, l'analyse de ce type de cintiques, exprimes par les quations [7.15] et [7.16], reste ambigu sur l'importance de l'isomrisation de l'enzyme. Cette analyse a rcemment t conteste par REBHOLZ et NORTHROP (1993), qui affirment que BRITTON a fait plusieurs erreurs algbriques ; leur critique est toutefois sans fondements (CORNISH-BOWDEN, 1994 ; BRITTON, 1994), et ne doit pas tre considre davantage.
7.5.3. Perturbation par un traceur

La perturbation par un traceur est une technique d'change d'isotope qui limine le type de problmes d'interprtation discut dans le 7.5.2. Considrons une raction d'isomrisation qui suit le mcanisme reprsent par l'quation [7.14]. Dans un mlange l'quilibre entre des ractifs marqus A* et P*, E et E' existent dans de telles proportions que les flux chimiques de A* vers P* et de P* vers A* sont
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gaux. Si un large excs de A non marqu est ajout un tel mlange l'quilibre, la raction rsultante de A vers P perturbera l'quilibre entre E et E', de telle faon qu' la limite E disparat entirement du mlange ractionnel, ne laissant aucune forme d'enzyme capable de ragir avec A*, alors que E' reste disponible pour ragir avec P*. Ainsi, la seule direction possible pour la raction marque est de P* vers A*. Il s'ensuit alors, que si l'isomrisation de l'enzyme survient comme dans l'quation [7.14], modifier le systme avec un ractif non-marqu dplacera la raction entre ractifs marqus de l'quilibre dans une direction oppose celle dont il dplacera la raction entre ractifs non-marqus. Une analyse similaire d'un mcanisme de MICHAELIS et MENTEN deux tapes sans isomrisation de l'enzyme ne prsente pas un tel effet, parce que A et P ragissent avec la mme forme d'enzyme libre, et qu'aucun quilibre entre des formes diffrentes de l'enzyme ne peut tre perturb. Dans ce cas, l'addition de ractifs non-marqus n'a aucun effet sur l'quilibre entre ractifs marqus. Dans des cas plus complexes, l'isomrisation de l'enzyme peut provoquer un dplacement de la raction entre ractifs marqus dans la mme direction que la raction entre ractifs non-marqus. Nous avons tacitement suppos dans la discussion des ractions d'isomrisation que le produit P rsulte du rarrangement des atomes du substrat A en une structure diffrente. Cela n'est pas obligatoirement le cas, et cela n'est mme pas probable. Avec une mutase, par exemple, E et E' peuvent reprsenter des phosphoenzymes diffrents, de sorte que le complexe enzyme-substrat est un biphosphate o le groupe phosphoryle qui apparat sur P provient de E et non de A. Le transfert d'un groupe phosphoryle marqu de A ncessite deux cycles catalytiques, de A vers E' au cours du premier cycle, et de E vers P au cours du second. Puisque le second cycle ncessite la participation de A non-marqu, le processus en entier peut uniquement se drouler dans la mme direction que la raction entre ractifs non-marqus, quoique trs lentement, cause du manque de E pour ragir avec A*. Il s'ensuit que si une exprience de perturbation par un traceur est ralise en utilisant du 32P comme marqueur, il y aura une perturbation faible dans la direction de la raction non marque, alors que si le mme systme est tudi en utilisant du 1 4 C ou du 3H, il y aura une perturbation plus importante dans la direction oppose. La phosphoglucomutase du muscle de lapin se comporte exactement en accord avec ces prdictions (BRITTON et CLARKE, 1976.) Plus rcemment, la mthode de perturbation par un traceur a t utilise dans des tudes dtailles des cintiques de la proline racmase (FISHER, ALBERY et KNOWLES, 1986) et de la triose-phosphate isomrase (RAINES et KNOWLES,1987) ; encore une fois, les rsultats constituent une preuve d'un effet important de l'isomrisation de l'enzyme sur la cintique de la raction.
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7.6. LA THORIE DES EFFETS ISOTOPIQUES CINTIQUES

7.6.1. Effets isotopiques primaires
Pour la plupart des applications, nous pouvons considrer que les diffrents isotopes d'un lment ont exactement les mmes proprits thermodynamiques et cintiques. En effet, l'utilisation d'isotopes radioactifs comme traceurs, sur laquelle une grande partie de la biochimie moderne, s'est construite, repose prcisment sur cette hypothse. Nanmoins, elle n'est pas exactement correcte, et dans des ractions o l'tape limitante implique la rupture d'une liaison entre l'hydrogne et un atome plus lourd, les diffrences de proprits entre les isotopes d'hydrogne deviennent suffisamment grandes pour tre l'origine de srieuses erreurs si cellesci ne sont pas prises en compte. Ce phnomne a des consquences positives et ngatives. La consquence ngative est que lors de l'utilisation de 3H comme un traceur radioactif, nous devons avoir la prudence de nous assurer que celui-ci est loign du site de raction. En pratique, ceci est gnralement facile raliser, car loign signifie simplement spar par au moins deux atomes ; nanmoins, cette prcaution ne doit pas tre nglige.
Energie C1H Etat de transition Energie C2H Etat de transition
Etat fondamental
Etat fondamental
4,8 kJ.mol1 Longueur de liaison Longueur de liaison
7.4 - Interprtation lmentaire des effets isotopiques primaires Puisque essentiellement toutes les molcules se trouvent dans leur niveau de vibration le plus bas aux tempratures ordinaires, et que cet tat est plus bas d'environ 4,8 kJ mol1 pour une liaison C2H que pour une liaison C1H, la liaison C2H ncessite un apport suprieure d'nergie de 4,8 kJ mol1 pour atteindre l'tat de transition.
252
La consquence positive des effets isotopiques sur les cintiques est qu'ils peuvent tre utiliss pour obtenir des informations mcaniques qui seraient difficiles obtenir d'une autre faon. A cause de cet aspect utile, nous donnerons une brve description de leur origine dans cette section. Il sera invitablement simplifi, mais des prsentations plus rigoureuses ont t faites par JENCKS (1969) et BELL (1973). L'nergie d'une liaison C H en fonction de la distance sparant les deux atomes dpend uniquement des nuages d'lectrons entourant les deux atomes et est la mme pour tous les isotopes du carbone et de l'hydrogne. Cependant, comme la liaison vibre, les nergies disponibles sont quantifies, et les niveaux quantiques spcifiques disponibles pour une liaison dpendent des masses des atomes vibrants, c'est dire que ceux-ci sont diffrents pour diffrents isotopes. Cela ne serait pas important si la temprature tait suffisamment grande pour que les liaisons dans un chantillon donn aient des nergies vibrationnelles distribues de manire alatoire entre les diffrents tats. A des tempratures ordinaires, quasiment toutes les liaisons C H se trouvent dans leur tat vibrationnel fondamental, qui ne correspond pas au minimum rel de la courbe d'nergie potentielle, mais l'nergie au point zro de la liaison, qui reflte le fait que la vibration persiste mme au zro absolu. Il en dcoule que l'tat fondamental pour une liaison C 2H se trouve un niveau d'nergie environ 4,8 kJ mol1 plus bas (plus profond dans ce puits de potentiel) que pour une liaison C 1H. En premire approximation, nous pouvons supposer que lorsqu'une liaison C H est rompue au cours de l'tape limitante d'une raction, l'tat de transition de la molcule est celui dans lequel la liaison qui doit tre rompue, est tire jusqu'au point o elle a perdu un degr de libert de vibration, mais o toutes les autres liaisons sont dans leur tat fondamental. Ceci sous-entend que l'tat de transition est le mme pour C 2H et pour C 1H mais, comme l'tat de base est plus bas pour C 2H, il faut 4,8 kJ mol1 d'enthalpie d'activation en plus pour l'atteindre, comme l'illustre la figure 8.2. En insrant cette valeur dans l'quation [1.45], nous obtenons :
e qui vaut environ 6,9 298 K (25C). Dans les limites o ce modle simple s'applique, nous prvoyons que les ractions impliquant la rupture de liaisons seront peu prs sept fois plus lentes pour les liaisons C 2H que pour les liaisons C 1H.
Le type d'effet isotopique que nous venons de considrer est appel un effet isotopique primaire et dans la thermologie communment utilise, nous pouvons dire que les calculs nous amnent prvoir que l'effet isotopique primaire du deutrium pour une liaison C H devrait tre d'environ 7. Des calculs similaires indiquent que l'effet isotopique correspondant pour le tritium vis--vis du proton devrait tre d'environ 16,5, et que tout les autres effets isotopiques primaires (comme par exemple pour 17O compar 16O) devraient tre bien infrieurs. Ces calculs sont
k 1H = k 2H
e
( DH
DH RT + 4 ,8 kJ mol RT
1
4 ,8 kJ mol = e RT
[7.17]
253
sujets d'importantes erreurs, car la thorie complte de l'origine isotopiques sur les cintiques est beaucoup plus complique que nous dcrite ci-dessus. Toutefois, il apparat que les effets du deutrium et dvient souvent de manire consistante des valeurs prdites, mais toujours relies entre elles par la relation suivante (SWAIN et al., 1958) :
des effets ne l'avons du tritium elles sont
k1 k 1H = H k 3H k 2H
1, 442
[7.18]
7.6.2. Effets isotopiques secondaires

En discutant la raison des effets primaires d'isotopes, nous avons suppos que la conversion de l'tat fondamental en un tat de transition affecte uniquement la liaison qui est tire dans la raction, mais cette vision est trop simpliste. En ralit, la molcule entire est affecte, mais dans des proportions qui diminuent rapidement mesure qu'on s'loigne du site de raction. Pour les liaisons adjacentes celle qui est rompue, les niveaux d'nergie de vibration sont un peu plus proches les uns des autres pour les diffrents isotopes qu'ils ne le sont dans l'tat fondamental. Ainsi, alors que les diffrences isotopiques s'liminent presque entirement, une faible diffrence rsiduelle persiste dans l'enthalpie d'activation entre 1H et 2H. Celle-ci provoque une faible diffrence dans la vitesse, appele un effet isotopique secondaire. De tels effets sont typiquement de l'ordre de 1,3, c'est--dire que les ractions impliquant un 2H fix l'un des atomes ragissant sont typiquement environ 30% plus lentes que les ractions correspondantes impliquant 1H. La grandeur de ces effets isotopiques secondaires les rend plus difficiles mesurer que les effets primaires, et probablement pour cette raison, ils ont t assez peu utiliss en enzymologie. Ils peuvent cependant fournir des informations mcaniques utiles, difficilement accessibles par d'autres mesures. De nombreux mcanismes proposs la fois pour des ractions chimiques ordinaires et pour des ractions catalyses par des enzymes, impliquent un changement de coordination du carbone (comme par exemple le passage d'un tat ttradrique un tat trigonal) quand l'tat de transition est form, et ce changement peut tre dtect comme un effet isotopique secondaire par la substitution isotopique d'un atome d'hydrogne fix l'atome de carbone qui est impliqu dans la raction, mme si la liaison C H, responsable de l'effet isotopique n'est pas modifie par la raction. Ce type d'approche a t utilis, par exemple, dans l'tude de la -galactosidase (SINNOTT et SOUCHARD, 1973).
7.6.3. Effets isotopiques sur les quilibres

Essentiellement les mmes arguments s'appliquent aux effets isotopiques sur les quilibres qu'aux effets isotopiques secondaires : les effets de substitutions isotopiques sur les niveaux d'nergie s'oprent dans des directions opposes sur les
254
deux cts d'un l'quilibre, et, bien qu'ils ne puissent pas exactement s'annuler mutuellement, l'effet net est normalement faible, et les effets isotopiques sur les quilibres sont typiquement proches de 1.
7.7. EFFETS ISOTOPIQUES PRIMAIRES

SUR LES CINTIQUES ENZYMATIQUES
La mesure des effets isotopiques a trouv une utilisation croissante dans les tudes d'enzymes comme moyen d'tude des mcanismes. La thorie essentielle est prsente dans un article de NORTHROP (1977), et dans d'autres articles parus dans ce mme ouvrage, et une application trs fournie de cette thorie l'tude de la triosephosphate isomrase a t dcrite par ALBERY et KNOWLES (1976.) Bien que l'analyse dtaille puisse devenir trs complique, l'ide de base est suffisamment simple pour tre rsume dans un texte lmentaire. Il peut tre prsent en rfrence au mcanisme de MICHAELIS et MENTEN trois tapes de l'quation [3.87], discut dans le 3.6, pour lequel les dfinitions de la constante catalytique et de la constante de spcificit, dj introduite dans l'quation [3.99a,b] sont les suivantes : k 2 k3 k0 = [7.19] k 2 + k 2 + k3
kA =
k1 k 2 k3 k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3
[7.20]
avec des expressions similaires pour la raction inverse, donnes par les quations [3.100a,b]. Puisque les expriences ralises dans des conditions d'tat stationnaire permettent uniquement de dterminer les quatre paramtres de MICHAELIS et MENTEN, alors que le mcanisme comprend six constantes de vitesse, il pourrait sembler impossible de dterminer les contributions relatives des diffrentes constantes de vitesse prsentes dans les quations [7.19] et [7.20] partir de ces expriences. Toutefois, la possibilit d'effectuer des mesures avec des ractifs isotopiquement marqus permet de complter utilement ces rsultats. Si nous faisons l'hypothse raisonnable qu'une substitution isotopique faite dans une liaison qui est rompue lors de la raction va vraisemblablement produire un effet isotopique primaire dans l'tape chimique, mais avec des effets isotopiques faibles ou nuls sur les tapes de fixation, nous pouvons prvoir des effets isotopiques substantiels sur k2 et k2, mais des effets ngligeables sur les autres constantes de vitesse. Ceci sousentend que les rapports des constantes catalytiques et des constantes de spcificit pour les ractifs contenant 1H et 2H peuvent tre crits comme suit, o l'exposant D (deutrium) indique 2H et o l'absence d'exposant fait rfrence 1H :

D k ( k D + k 2 + k3 ) k0 = 2 2 D D k0 k 2 ( k 2 + k 2 + k3 )
D k ( k k D + k 1k3 + k 2 k3 ) kA = 2 1 2 D D kA k 2 ( k 1k 2 + k 1k3 + k 2 k3 )
255
[7.21] [7.22]
Si aucun effet isotopique n'est observ avec les constantes de vitesse pour la fixation, le rapport des effets isotopiques sur k2 et k2 doit tre gal l'effet isotopique sur l'quilibre pour la raction globale. Par simplicit, nous considrerons que l'effet isotopique sur l'quilibre est exactement gal l'unit, mais comme ce dernier est de toute manire mesurable indpendamment, l'analyse qui suit peut tre facilement corrige pour prendre en compte les effets sur l'quilibre si cela est D D ncessaire. En supposant que k 2 k 2 = k 2 k 2 , l'quation [7.21] peut tre rarrange pour donner une expression du rapport k3 ( k 2 + k 2 ) en termes de l'effet isotopique mesur sur k0 et des effets isotopiques inconnus sur k2 et k2 :
k3 k 2 + k 2
k0 1 D k0 = k 2 k0 D D k 2 k0
[7.23]
D Etant donn que k 2 k 2 est inconnu, la valeur de ce rsultat peut sembler douteuse. Nanmoins, mme si la valeur exacte est inconnue, la thorie brivement prsente dans le 7.6.1, associe au large ensemble d'informations exprimentales dont nous disposons concernant les effets isotopiques dans les systmes chimiques, nous donnent une bonne ide de la gamme de valeurs probables. Ainsi, si nous supposons une valeur de 7, il est clair qu'un effet isotopique mesur de l'ordre de 7 (ou plus) sur k0 fournit une preuve solide que l'tape chimique est suffisamment lente pour contribuer de manire apprciable aux cintiques observes saturation, alors qu'une valeur de l'ordre de 1 indique que c'est la libration du produit qui limite la vitesse.
Des arguments similaires peuvent tre appliqus l'quation [7.22], mais dans ce cas, la grandeur de l'effet isotopique sur la constante de spcificit kA fournit une mesure de l'importance relative de l'tape chimique en comparaison non pas avec k3 uniquement, mais avec k 1 et k3. Bien que cette analyse soit quelque peu plus complique que pour k0, elle a l'avantage de pouvoir tre applique 3H aussi bien qu' 2H, alors que les effets isotopiques de 3H sur k0 ne peuvent pas tre mesurs, car un enzyme ne peut pas tre satur par une espce qui est uniquement prsente sous forme de traces. Si l'quation [7.18], la relation entre les effets isotopiques de 2H et 3H, pouvait tre considre comme fiable, elle fournirait un moyen pour s'affranchir de la difficult D rencontre dans cette analyse qui est due au fait que la valeur exacte de k 2 k 2 est inconnue. La comparaison des effets isotopiques mesurs pour les deux isotopes permettrait de la calculer. Malheureusement, il n'est pas clair si cette relation
256
s'applique suffisamment prcisment aux ractions enzymatiques pour qu'un tel calcul offre un avantage dans l'analyse plus qualitative suggre plus haut. Les effets isotopiques du solvant sont considrs comme des effets environnementaux, et sont traits dans le 8.8.
PROBLMES
7.1 - La saccharose glucosyltransfrase catalyse les ractions suivantes : glucose 1-phosphate + fructose sucrose + phosphate inorganique
En absence la fois de sucrose et de fructose, l'enzyme catalyse l'change rapide de 32P entre le glucose 1-phosphate et le phosphate inorganique marqu. Cet change est inhib fortement et de manire comptitive par le glucose. L'enzyme est un catalyseur plutt mauvais pour l'hydrolyse du glucose 1-phosphate. Proposer une explication pour ces rsultats. 7.2 - La mthode dcrite dans le 7.7 fournit des informations concernant les grandeurs relatives des constantes de vitesse pour les tapes de fixation et pour l'tape chimique du mcanisme tudi. Une substitution chimique dans la liaison ractive devrait galement modifier les constantes de vitesse pour l'tape chimique. Pourquoi ce type de substitution ne peut-il tre utilis pour obtenir le mme type d'information que celle obtenue par substitution isotopique des substrats ? Pourquoi la mthode dpend-elle de la substitution isotopique ?
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT
SUR LES ENZYMES 8.1. EFFET DU PH SUR LES CINTIQUES ENZYMATIQUES
Parmi les nombreux problmes rencontrs lors des premires tudes des cintiques enzymatiques, le plus important tait certainement labsence de comprhension de leffet de la concentration en ion hydrogne, H+. En solution aqueuse, la concentration de proton varie entre 1 M et 1014 M, une gamme extrmement large qui est communment exprime laide dune chelle logarithmique, pH = log [ H + ] , de manire rduire la taille des chiffres manipuls. Tous les enzymes sont profondment influencs par le pH, et aucun progrs substantiel na pu tre ralis jusqu ce que MICHAELIS et ses collaborateurs fassent du contrle du pH une opration de routine de toute tude enzymatique srieuse. Le concept de tampon pour contrler la concentration de proton libre et lchelle de pH qui permet de lexprimer, ont t introduits par SRENSEN (1909), dans une publication dmontrant limportance de la concentration de lion hydrogne dans les tudes enzymatiques. MICHAELIS, cependant, avait dj commenc travailler dans cette direction (voir MICHAELIS, 1958) et ce nest que peu de temps aprs quapparu le premier papier dune longue srie sur les effets du pH sur les enzymes (MICHAELIS et DAVIDSON, 1911). Bien quil existe encore certains dsaccords concernant linterprtation des effets du pH sur la cintique enzymatique, limportance pratique du pH reste immuable : il est impossible denvisager une tude cintique sans contrle adquat du pH.
Leonor M ICHAELIS (1875-1949)

Leonor MICHAELIS est n Berlin. Comme HENRI, lextraordinaire fertilit de son esprit la conduit lexcellence dans de multiples domaines. Aprs avoir pass un an dans le laboratoire de Paul ERLICH, il tudie la mdecine clinique et sintresse au contrle de la concentration de lion hydrogne et son influence sur les proprits des solutions de protines et denzymes. Il dveloppe lutilisation de llectrode hydrogne pour mesurer les effets de la concentration en proton sur lactivit des enzymes. Il ralise ces travaux la mme poque que le danois Sren SRENSEN, mais ce
258
dernier publie ses conclusions (1909) plus rapidement que MICHAELIS et se voit accorder la priorit sur ces travaux. Nanmoins, MICHAELIS dmontre que la dpendance au pH de la catalyse enzymatique ressemble celle de la dissociation dun acide faible. Il dmontre galement que le point isolectrique des protines nest pas uniquement une rfrence dans la variation des proprits lectriques de la protine mais quil correspond galement un minimum ou un maximum pour dautres proprits comme la solubilit ou la viscosit. Il dveloppe une mthode dlectrophorse qui permet de dterminer le pI. Sa matrise dans ce domaine le conduit devenir lun des leaders de lpoque dans ltude des ractions catalyses par des enzymes. Les quelques annes qui ont prcd la premire guerre mondiale ont t trs productives. Sa fameuse publication ralise avec Maud MENTEN ntait quune parmi les 94 publications, dont 5 livres, quil a produites entre 1910 et 1914. Plusieurs de ses travaux sont rgulirement cits et notamment son livre, Die Wassertoffionen-konzentration, est lpoque un ouvrage de rfrence sur le pH et les tampons. En 1920, il passe trois annes comme professeur de biochimie Nagoya, au Japon et se rend ensuite aux Etats-Unis o il meurt en 1949. Il est rest scientifiquement actif jusqu sa mort, notamment dans le domaine de ltude des radicaux libres.
Cela peut paratre surprenant que ce soient les enzymologistes qui aient attir lattention sur limportance de contrler la concentration de protons et aient introduit lutilisation de tampons. Nous pouvons donc nous demander quelles sont les proprits spciales des enzymes qui rendent impratif de contrler le pH alors quaucun besoin ne stait fait sentir dans ltude dj bien dveloppe lpoque de la cintique chimique. A lexception de la pepsine et de la phosphatase alcaline, les enzymes qui ont t le plus largement tudis sont actifs en solution aqueuse des valeurs de pH comprises entre 5 et 9. Dans cette gamme, les concentrations de proton et dion hydroxyde varient dans la gamme de 105 109 M, qui correspondent de trs faibles variations, et qui sont donc trs sensibles la prsence dimpurets. Des extraits cellulaires et des prparations brutes denzyme sont en gnral, bien tamponnes par les enzymes et par les polylectrolytes prsents sous la forme dimpurets, mais ces tampons naturels sont limins lorsque les enzymes sont purifis et doivent tre remplacs par dautres tampons. Jusqu ce que ce fait soit reconnu, peu de progrs tait possible. Cette situation contraste avec celle rencontre en chimie : peu de ractions sont tudies en solution aqueuse et parmi celles-ci, nombreuses sont celles qui sont tudies des valeurs de pH, trs leves ou trs faibles, dans des conditions o les concentrations de proton ou dion hydroxyde sont suffisamment leves pour tre considres comme constantes. En consquence, les premires tudes de cintique chimique ont peu souffert du manque de comprhension du pH. Le type le plus simple deffet du pH sur les enzymes impliquant un seul groupe acide ou un seul groupe basique, nest pas diffrent du cas gnral dinhibition ou dactivation hyperbolique qui a t considr dans le 5.6.3. Conceptuellement, la protonation du groupe basique dun enzyme est simplement un cas spcial de fixation dun groupe effecteur sur un site spcifique et il nest ds lors nul besoin de rpter la rsolution des quations pour ce cas simple. Nanmoins, il existe
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT SUR LES ENZYMES
259
plusieurs diffrences entre les protons et les autres effecteurs qui rendent utiles dexaminer sparment la fixation des protons. Premirement, quasiment tous les enzymes sont affects par les protons, de telle sorte que les protons sont des effecteurs beaucoup plus importants que nimporte quel autre effecteur. Ils sont beaucoup plus petits que nimporte quel autre compos chimique et nont aucun effet strique ; cela signifie que certains phnomnes, telle linhibition non-comptitive pure ( 5.2.2), sont courants avec les protons alors quils sont particulirement rares en gnral. La concentration de proton peut tre mesure et contrle sur une gamme beaucoup plus grande que celle accessible tout autre effecteur et donc nous pouvons nous attendre observer nimporte quel effet possible. Finalement, les protons se fixent normalement sur de nombreux sites sur un enzyme, de sorte quil est souvent insuffisant de considrer la fixation sur un seul site.
8.2. LES PROPRITS ACIDE-BASE

8.2.1. Les quilibres dionisation
Dans leurs cours de chimie et de biochimie, les tudiants sont confronts plusieurs dfinitions des acides et des bases. Pour comprendre les proprits des enzymes et de la plupart des autres molcules biologiques, il est prfrable de considrer la dfinition propose par BRNSTED (1923) : un acide est une espce ayant tendance perdre un proton, alors quune base est une espce ayant tendance fixer un proton. Mise part limportance prpondrante quelle accorde au proton, cette dfinition prsente lavantage de se rfrer une espce , et donc elle inclut les atomes aussi bien que les molcules. Une manire dexprimer cette dfinition est de considrer quun acide est un donneur de proton sous la forme : AH A + H + quand AH est un acide neutre, ou sous la forme : [8.1]
BH + B + H+ [8.2] + quand BH est un acide cationique. De la mme manire, une base est dfinie comme un accepteur de proton. Les formes A et B dans les quations [8.1] et [8.2] sont des bases et sont gnralement dsignes comme les bases conjugues de lacide correspondant. Pour les ractions biochimiques qui se droulent en solution aqueuse, il est important de noter que leau participe la raction de dissociation. En effet en solution aqueuse, la raction dcrite par lquation [8.1] scrit de la manire suivante pour un acide possdant un seul groupe ionisable : AH + H2O A + H3O + [8.3]
260
Il sagit dune raction acide-base o lacide HA ragit avec une base, H2O, pour donner la base conjugue de lacide, A, et lacide conjugu de la base, lion H3O+. Le proton hydrat, H3O+, est appel lion hydronium. La dissociation de leau a t mise en vidence par des mesures de conductivit lectrique de leau pure. Langlais Henry CAVENDISH, avait remarqu que la conductivit de leau tait fortement augmente si on dissolvait du sel dans celle-ci. Mais, cest Svante ARRHENIUS que nous devons la thorie de la dissociation des ions en phase aqueuse et linterprtation de ces mesures de conductivit lectrique. Selon sa thorie, un courant lectrique est transmis travers une solution aqueuse parce que les sels se dissocient en ions de charges opposes et se dplacent dans la solution, transportant ainsi les charges lectriques. Ainsi, une charge lectrique est transfre travers une solution parce que les cations sont attirs par la cathode et se dplace dune rgion entourant lanode vers une rgion entourant la cathode, et de la mme manire, les anions sont attirs par lanode et se dplacent dune rgion entourant la cathode vers une rgion entourant lanode. Si leau pure ne contenait pas dions, cette conductivit lectrique serait nulle. Quand de leau, la plus pure possible, est prpare par des distillations successives, la conductivit lectrique approche une valeur limite qui est environ gale celle dune solution dacide chlorhydrique 1 107 M. Ainsi leau pure ne contient pas simplement des molcules de H2O mais elle contient galement des ions hydronium une concentration de 1 107 moles par litre ( 25C) et des ions hydroxyde la mme concentration. Leau est une molcule amphiprotique, cest--dire une substance capable la fois de donner et daccepter un proton, qui agit donc simultanment comme un acide et comme une base. Leau pure a donc la proprit de se dissocier en ions hydronium, H3O+, et hydroxyde, OH (q. [8.4]). Cest un exemple dautoprotolyse puisque cest une molcule deau qui, agissant comme un acide, fournit un proton une autre molcule deau, agissant comme une base qui fixe le proton : H2O + H2O
+
H3O + + HO
[8.4]
Bien que ce soit lion hydronium, H3O , qui soit prsent dans leau et qui confre celle-ci ses proprits acides, il est habituel dutiliser le symbole H+ la place de H3O+ et de parler dion hydrogne plutt que dion hydronium, une pratique que nous suivrons dans la suite de notre manuel. Lactivit de lion hydrogne joue un rle central dans de nombreux processus biologiques et sa valeur varie sur une large gamme. Cette large gamme de valeurs justifie lutilisation dune chelle logarithmique, lchelle de pH. Ainsi plutt que dutiliser lactivit de lion hydrogne, il est habituel dutiliser le pH, qui est dfinit comme moins le logarithme dcimal de lactivit de lion hydrogne .
pH = log a [ H + ]
[8.5]
Il faut noter que, pour des solutions trs dilues, lactivit peut tre assimile la concentration et donc par souci de simplification, le pH est dfini dans la plupart des manuels de biochimie en terme de concentration dion dhydrogne :
261
pH = log [ H + ]
[8.6]
Nous suivrons galement cette pratique en insistant sur le fait quil est bon de se rappeler dans certaines circonstances que la dfinition exacte du pH est base sur lactivit. Selon cette dfinition [8.6], le pH dune solution contenant 1 mole dions hydrogne par litre, a un pH de 101 cest--dire zro. Lquilibre de dissociation de leau peut tre caractris par une constante dquilibre : [ H + ][ OH ] K = [8.7] [ H 2O ] o [ H 2 O ] reprsente la concentration de leau dans la solution. Puisque, comme nous lavons dj mentionn ci-dessous, la concentration (lactivit) de leau dans une solution dilue est quasiment identique celle de leau pure, il est habituel domettre ce terme dans lexpression des quilibres de dissociation pour des solutions dilues. Ainsi le produit de la constante K et de [ H 2 O ] est assimil une constante KW, dnomme le produit de dissociation de leau et nous pouvons rcrire lquation [8.7] sous la forme :
KW = [ H + ][ OH ]
[8.8]
Cette quation montre qu une temprature donne le produit de la concentration dion hydrogne et de la concentration dion hydroxyde est une constante. La valeur de KW est de 1 1014 M2 25o C, en accord avec les concentrations de 1 10 7 M des ions hydrogne et hydroxyde mesures dans leau pure (voir cidessus). Une solution neutre contient autant dions hydrogne que dions hydroxyde, alors quune solution lgrement acide, contenant 10 fois plus dions hydrogne quune solution neutre, contiendra 10 fois moins dions hydroxyde. Tout comme la raction de dissociation de leau, la raction de dissociation dun acide contenant un seul groupe ionisable, est caractrise par une constante dquilibre. La raction rversible dcrite par lquation [8.3] est caractrise par une constante de dissociation : [ H 3O + ][ A ] K = [8.9] [ HA ][ H 2 O ] Si nous considrons uniquement des solutions dilues, lactivit de leau est proche de celle de leau pure dont la valeur est gale 1. Toutefois, dans la pratique, les constantes dquilibre de dissociation sont exprimes en termes de concentration. Cette simplification persiste et lquilibre de dissociation peut tre exprim en terme de constante dacidit :
Ka = K [ H 2 O ] =
[ H 3O + ][ A ] [ H + ][ A ] [ HA ] [ HA ]
[8.10]
262
La valeur de la constante dacidit, Ka, est une mesure de laffinit pour le proton des paires acide-base, HA/A et H2 O/OH, et donne ainsi une mesure de la force dun acide ou dune base par rapport leau. Les acides sont classs en fonction de cette force relative. Ceux dont la constante de dissociation est infrieure 1 ne sionisent que partiellement en solution et sont appels des acides faibles (Ka < 1). Ceux dont la constante de dissociation est suprieure 1 sont compltement ioniss en solution (Ka > 1). Ainsi, une solution 0,1 M dun acide fort comme lacide chlorhydrique contient 0,1 M dion hydrogne. Par contre, une solution dun acide faible, comme lacide actique, qui nest pas compltement dissoci, contient une concentration dion hydrogne plus faible quune solution dacide fort une concentration identique. La force dune base peut galement tre estime par une mesure de sa constante de dissociation, Kb, mais celle-ci est rarement utilise. Afin dhomogniser les mesures, on utilise pour classer les bases, la constante de dissociation de leur acide conjugu :
Ka =
[ B ][ H + ] [ BH + ]
[8.11]
Les acides et les bases faibles sont celles dont la constante Ka est comprise entre 1 et 1014 M. De la mme manire que le pH est dfini partir de la concentration de proton, le pKa dun acide ou dune base est dfini comme moins le logarithme dcimal de la constante de dissociation de lacide . [ A ][ H + ] pKa = log Ka = log [8.12] [ AH ] La relation entre le pH et les concentrations dun acide et de sa base conjugue prsentes dans une solution peut aisment tre obtenue en rarrangeant cette quation :
log Ka = log
[ A ] + log [ H + ] [ AH ]
[8.13]
En se rappelant la dfinition du pH donne dans lquation [8.6], nous obtenons lquation dHENDERSON-HASSELBALCH, qui donne le pH dune solution dacide ou de base faible partir du pKa et des concentrations de la forme acide (AH dans lexemple choisi) et de la forme base [ A ] prsentent dans la solution :
pH = pKa + log
[ A ] [ AH ]
[8.14]
Cette quation montre que pour un compos ne contenant quun seul groupe ionisable, les concentrations de la forme acide et de la forme base seront identiques lorsque le pH sera gal au pKa. La forme de la courbe de titrage prsente dans la figure 8.1 qui montre la relation entre le pH et la fraction de forme ionise de la molcule, [ A ] ([ A ] + [ AH ]) , indique que dans une rgion correspondant
263
pH = pKa 0,5, le pH est relativement insensible laddition ou llimination dions hydrognes. Ce phnomne est dnomm effet tampon et un acide ou une base faible un pH proche de son pKa constitue un tampon.
pH 14
12 10 8 6 4 2 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
[A]/([A]+[AH])
8.1 - Effet tampon La figure montre la variation du pH en fonction du rapport des concentrations de la forme base et de la forme acide dune molcule portant un seul groupe ionisable dont le pKa = 4,5 (trait en pointills). La zone grise stendant sur la gamme de pH = pKa 0,5, correspond une variation du rapport [ A ] /([ A ] + [ AH ]) allant de 0,25 0,75.
8.2.2. Les tampons

Les tampons sont couramment utiliss pour maintenir un systme aqueux un pH constant. En absence de tampon, nimporte quel processus biochimique qui consomme ou libre des protons modifie la concentration dion hydrogne dans la solution et donc son pH. Nous avons vu dans le chapitre 3 que lignorance de ce phnomne a pos des problmes de reproductibilit aux premiers enzymologistes. Afin de simplifier le traitement des quations, il est utile de rduire les deux variables [ A ] et [ AH ] une seule variable :
R =
[H+] [ AH ] = Ka [ A ]
[8.15]
Comme la concentration de protons, la variable R est plus pratiquement reprsente sur une chelle logarithmique. [8.16] pR = log R
264
Cette chelle correspond lchelle de pH avec le point zro dplac la valeur du pKa de lacide.
pR = pH pKa
[8.17]
Le degr de dissociation de lacide, a, peut tre facilement exprim en fonction de cette variable R :
a =
[ A ] = 1 1+ R [ A ] + [ AH ]
[8.18]
Les tampons ont t dfinis par VAN SLYKE (1922) comme des substances qui, par leur prsence en solution, augmentent la quantit dacide ou de base qui doit tre ajoute pour provoquer une variation du pH dune unit. Lefficacit dun tampon, cest--dire sa capacit rsister au changement de pH nest pas infinie et peut tre dfinie par le pouvoir tampon molaire, soit partir de a, soit partir de R :
B = da dpH
B = d ( R + 1 ) 1 d ( R + 1 ) 1 dR dR 1 = = dpH dR dpH ( R + 1 ) 2 dpH
[8.19a] [8.19b]
En utilisant la drivation suivante :
dR = R ln10 dpH
[8.20]
le pouvoir tampon molaire dun acide ou dune base simple est donn par lquation suivante : R B = ln 10 [8.21] ( R + 1 )2 Cette fonction B (quation [8.21]) a un maximum R = 1 dont la valeur est donne par :
Bmax =
ln10 4
[8.22]
Il est donc possible de dfinir le pouvoir tampon molaire relatif, b, en divisant lquation [8.21] par lquation [8.22] : 4R b = [8.23] ( R + 1 )2 La forme de cette fonction est reprsente dans la figure 8.2. Elle a une valeur maximale de 1 pR = 0 et diminue symtriquement de part et dautre.
265
Pouvoir tampon molaire relatif
0,8
0,6
0,4
0,2
0 0 4 2 2 4 0 6 2 8 4 10 6 12 8 14
pH pR
8.2 - Pouvoir tampon molaire relatif La courbe a t calcule partir de lquation [8.23] pour une molcule une seul groupe ionisable de pKa = 4,5.
8.2.3. Les proprits acide-base des protines

Dans la dfinition des acides et des bases (voir 8.2), BRNSTED utilise le terme espce , qui inclut les ions aussi bien que les molcules. Malheureusement, les biochimistes ont, par convention, class les groupes ionisables rencontrs dans les protines en fonction des proprits des acides amins dans leur tat compltement non-charg. Ainsi, laspartate et le glutamate, qui sont largement responsables des proprits basiques des protines dans des conditions physiologiques, sont communment classs comme des acides . Parmi les acides amins dits basiques, lhistidine peut agir comme un acide ou comme une base dans des conditions physiologiques, la lysine agit principalement comme un acide et larginine est quasiment sans importance dans la dfinition des proprits acide-base des protines, puisquelle ne perd son proton qu des valeurs de pH, suprieures 12. Dun autre ct, deux des acides amins gnralement classs comme neutres, la cystine et la tyrosine, contribuent de manire significative aux proprits acidebase des protines. Si le but de la terminologie standard tait de compliquer les discussions de ces proprits, un meilleur rsultat naurait pas pu tre obtenu. Bien que nous ne proposions pas de modifier lappellation communment utilise de ces groupements, il est bon de garder ce point en mmoire lorsque nous nous intressons aux mcanismes catalytiques des enzymes. A cet usage, nous proposons
266
dans la figure 8.3 une tentative de classification plus rationnelle, qui na quasiment rien de commun avec celle qui est gnralement rencontre dans les manuels de biochimie et qui est base sur la dfinition de BRNSTED.
3,4 4,1 4,5 6,3 N-terminal (ammonium) Cystine (thiol) Tyrosine (phnol) Lysine (ammonium) Arginine (guanidinium)
1 3 5 7 9 11
C-terminal (carboxylate) Aspartate (carboxylate) Glutamate (carboxylate) Histidine (imidazole) 7,5 8,3 9,6 10,4 > 12
13
} }
Basique
Principalement basique Principalement acide
Acide
Aucun (voir texte)
pH
8.3 - Groupes ionisables dans une protine
Quelques-uns des groupes inclus dans la figure 8.3 comme le groupe carboxylique C-terminal ou le groupe -amin de la lysine, ont des valeurs de pKa si loignes de 7 quil semble improbable que ces groupes contribuent aux proprits catalytiques des enzymes. Nanmoins, les valeurs de pKa donnes dans la table sont des valeurs moyennes pour des groupes se trouvant dans un environnement typique, mais ces valeurs peuvent varier normment par rapport aux valeurs de pKa de groupes individuels dans des environnements particuliers, comme ceux rencontrs dans les sites actifs de certains enzymes. Les valeurs de pKa de ces groupes peuvent tre perturbes . Un exemple frappant est celui de la pepsine, qui a un point isolectrique de 1,4. Puisque cet enzyme renferme quatre groupes qui sont chargs positivement pH acide, il doit y avoir au moins quatre groupes avec des valeurs de pKa bien infrieures celles communment rencontres pour des groupes carboxyliques. Bien que lenzyme renferme une srine phosphoryle, celle-ci ne peut expliquer quen partie la faible valeur du point isolectrique et il doit y avoir au moins trois groupes carboxyliques perturbs. Une explication possible repose sur lide que si deux groupes acides sont placs proximit lun de lautre, ltat une fois proton de cet ensemble de deux groupes devrait tre beaucoup plus stable que les tats deux fois protons et deux fois dprotons. Comme nous venons de le voir, une protine contient en gnral un nombre important dacides amins acides et basiques. Puisque ces acides amins ont la capacit de sioniser, les protines sont considres comme des polylectrolytes, cest--dire que se sont des molcules qui contiennent un trs grand nombre de groupes ionisables, acides et bases. Le titrage de ces molcules est plus
267
complexes que celui dacides un seul groupe ionisable, car les pKa des groupes acides-bases ne sont gnralement pas indpendants. La charge ionique qui rsulte de la dissociation dun proton influence la dissociation ultrieure des autres protons, modifiant ainsi la valeur du pKa de ces groupes. Exprimentalement, le titrage de ces macromolcules permet dobtenir une courbe donnant le nombre de protons fixs sur la macromolcule, J, en fonction du pH de la solution, en prenant comme point de rfrence (pH = 0) ltat de la macromolcule dans lequel le nombre de protons fixs correspond au nombre maximum de protons qui peut tre fix (figure 8.4).
J
40 35 30 25 20 15 10 5 0 5 10 15 20 2 4 6 8 10 12
pH
8.4 - Courbe de titrage dune protine La valeur de J reprsente la charge nette de la protine qui dpend du nombre de protons fixs. Le pH pour lequel la charge nette est gale zro correspond au point isolectrique de la protine. La courbe a t calcule pour une protine contenant 7 Asp, 14 Glu, 1 C-terminal, 12 His, 3 Tyr, 19 Lys, 4 Arg, et 1 N-terminal en utilisant les valeurs typiques de pKa pour les diffrents acides amins qui sont prsentes dans la figure 8.3.
8.2.4. Analyse sur la base des constantes de dissociation des groupes

Linterprtation de ces courbes peut nanmoins savrer complexe. Considrons par exemple, le titrage dune substance simple contenant deux fonctions acidebase, comme la glycine. Les deux sites de fixation des protons ne sont pas quivalents, puisquil sagit dune part dune fonction acide carboxylique et dautre part dune fonction amide. Leffet du pH sur lactivit de nombreux enzymes peut, en premire approximation, tre interprt en terme dun modle simple, introduit par MICHAELIS (1926), dans lequel seulement deux groupes ionisables sont considrs comme dans le cas de la glycine. Dans ce cas, lenzyme est reprsent comme un
268
di-acide, HEH, avec deux groupes diffrents, comme prsent dans la figure 8.5. Si les sites de fixation ne sont pas indpendants, les 4 constantes de dissociation dans la figure 8.5 sont toutes difEH + H+ frentes les unes des autres. K11 K22
HEH K12 K21 E2 + 2 H+ 8.5 - Dissociation dun acide amin ou dun enzyme possdant deux groupes ionisables
HE + H+
En utilisant les constantes de dissociation telles quelles sont dfinies dans la figure 8.5, les concentrations des diffrentes formes de lenzyme peuvent tre dtermines en fonction du pH. K [ EH ] = [ HEH ] 11 [8.24a] [H+]
[ HE ] = [ HEH ] [ E 2 ] = [ HEH ]
K12 [H+]
[8.24b] [8.24c]
K K K11 K 22 = [ HEH ] 12 + 21 + 2 [H ] [ H ]2
Deux points sont notables lorsque nous considrons ces relations. Premirement, bien que K11 et K21 dfinissent la dissociation dun proton partir du mme groupe, EH porte une charge ngative supplmentaire par rapport HEH et donc il est moins acide, cest--dire que K11 > K21 ; pour la mme raison, K12 > K22. Deuximement, la concentration de E2 est la mme, quelle soit dfinie partir de la voie passant par EH ou de celle passant par HE ; les deux expressions exprimant [ E 2 ] dans lquation [8.24c] sont quivalentes, cest--dire que K11K22 = K12K21. La constante dquilibre pour la dissociation de deux protons est donne par le produit des constantes de dissociation et doit donc tre indpendante du chemin suivi. Il en dcoule quil ny a que trois constantes indpendantes puisque la connaissance de trois de ces constantes fournit automatiquement la valeur de la quatrime. Si la concentration totale dacide est donne par :
[ E ]0 = [ HEH ] + [ EH ] + [ HE ] + [ E 2 ]
alors
[8.25] [8.26a]
[ HEH ] =
[ E ]0 K11 + K12 K11 K 22 + 1+ [H+] [ H + ]2
K11 [H+] [ EH ] = K +K K K 1 + 11 + 12 + 11 + 22 [H ] [ H ]2 [ E ]0
[8.26b]
269
K12 [H+] [ HE ] = K +K K K 1 + 11 + 12 + 11 + 22 [H ] [ H ]2 [ E ]0 K11 K 22 [ H + ]2 [ E2 ] = K +K K K 1 + 11 + 12 + 11 + 22 [H ] [ H ]2 [ E ]0
[8.26c]
[8.26d]
Ces quatre expressions montrent comment les concentrations des diffrentes espces varient avec la concentration de protons libres et donc avec le pH ; un ensemble typique de courbes est prsent dans la figure 8.6, pour des valeurs arbitraires de constantes de dissociation.
Concentration de la forme de l'enzyme
1
HEH
0,8
E2 EH
0,6
0,4
0,2
HE
0 4 5 6 7 8 9 10
pH
8.6 - Concentrations relatives des diffrentes formes de lenzyme en fonction du pH Les courbes sont calcules pour un enzyme HEH dont les constantes de dissociation pour les deux groupes ionisables sont les suivantes : pK11 = 6,1, pK12 = 6,9, pK21 = 7,0, pK22 = 7,8.
8.2.5. Analyse sur la base des constantes de dissociation molculaires

Dans une exprience relle, il est impossible de dfinir les courbes aussi prcisment que celles de la figure 8.5, parce quil nest pas possible destimer la valeur des quatre constantes de dissociation. La raison de cette impossibilit rside dans le fait que le rapport [ EH ] [ HE ] = K11 K12 est une constante et est donc indpendant de [ H + ] . Ainsi, aucune variation de [ H + ] ne produira un changement de [ EH ] qui ne sera pas accompagn dun changement proportionnel de [ HE ] . Il est par consquent impossible de savoir quelles sont les contributions respectives de EH et de HE une proprit mesure.
270
Pratiquement, nous devons donc traiter EH et HE comme une seule espce, dont la concentration est donne par : K +K [ E ]0 11 + 12 [H ] [ EH ] + [ HE ] = K11 + K12 K11 K 22 1+ + [8.27] [H+] [ H + ]2 [ E ]0 = K11 K 22 [H+] +1+ K11 + K12 ( K11 + K12 )[ H + ] Cette quation peut tre crite sous la forme :
[ EH ] + [ HE ] =
[ E ]0 K2 [H+] +1+ K1 [H+]
[8.28]
si deux nouvelles constantes, K1 et K2, sont dfinies comme suit :
K1 = K11 + K12 = K2 =
([ EH ] + [ HE ])[ H + ] [ HEH ]
[8.29] [8.30]
K11 K 22 K 22 K 21 [ E 2 ][ H + ] = = K11 + K12 K 22 + K 21 [ EH ] + [ HE ]
Ces constantes sont appeles les constantes de dissociation molculaires , pour les distinguer des constantes microscopiques de dissociation de chacun des groupes, K 11, K 12, K 21 et K22. Elles prsentent lavantage pratique de pouvoir tre mesures, alors que les constantes microscopiques ne le sont pas. Des expressions pour [ HEH ] et pour [ E 2 ] peuvent galement tre crites en terme de constantes molculaires de dissociation : [ E ]0 [ HEH ] = [8.31] K1 KK + 1 + 22 1+ [H+] [H ]
[ E2 ] =
[ E ]0 [H ] [H+] + +1 K1 K 2 K2
+ 2
[8.32]
8.2.6. Les fonctions pH de MICHAELIS

Les quations [8.28], [8.31] et [8.32] expriment les concentrations des diffrentes formes ioniques de lenzyme en fonction de la concentration totale denzyme, [ E ]0 . Les dnominateurs de ces quations sont des fonctions ne dpendant que de la concentration en proton libre et des constantes molculaires K1 et K 2 , qui sont appeles les fonctions pH de MICHAELIS :
271
[ HEH ] =
[ E ]0 f [ E ]0 f
[8.33a] [8.33b] [8.33c]
[ HE ] + [ EH ] = [ E2 ] =
o les fonctions de MICHAELIS, f, f suivantes :
[ E ]0 f 2
2
et f
, sont donnes par les expressions [8.34a] [8.34b] [8.34c]
f = 1+
f f
K1 KK + 1 2 [ H + ] [ H + ]2
K2 [H+] + K1 [H+] [ H + ] [ H + ]2 + K2 K1 K 2
= 1+ = 1+
8.2.7. Les courbes en cloche

Nous allons prsent examiner en dtails lquation [8.28] parce que de nombreux enzymes se caractrisent par un profil dactivit en fonction du pH qui a la forme dune courbe en cloche. Les courbes reprsentant les concentrations relatives des espces HE et EHont cette forme caractristique (fig. 8.6). La figure 8.7 reprsente un ensemble de courbes en cloche pour diffrentes valeurs de (pK2 pK1).
Fraction de l'enzyme dans la forme ionise une fois
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
1
4 6
1
8
3
10
5
12
pH
8.7 - Courbes en cloche Les courbes ont t calcules partir de lquation [8.28] avec pK1 = 6,0 et pK2 allant de 5,0 11,0. Les chiffres indiqus dans la figure reprsentent les valeurs de pK2 pK1, la quantit qui dtermine la forme de cette courbe. (Notons que le plateau aux alentours du maximum est plus aplati pour les diffrences de pKa les plus importantes).
272
Notons que les formes de ces courbes ne sont pas toutes identiques : le maximum forme un plateau lorsque la valeur de (pK2 pK1) augmente, alors que le profil ressemble un V invers lorsque cette valeur diminue ou devient ngative. La valeur du maximum est infrieure 1 sauf si la valeur de (pK2 pK1) est suprieure 3. En consquence, les valeurs de pH pour lesquelles [ EH ] + [ HE ] prend une valeur quivalant la moiti de sa valeur maximale ne correspondent pas pK1 et pK2. La relation entre la largeur mi-hauteur de la courbe et la valeur de (pK2 pK1) est donne dans le tableau 8.1. Ce tableau permet de convertir les mesures du pH pour lesquelles la valeur de lordonne est gale la moiti de sa hauteur maximale en valeurs de pKa molculaire. Nanmoins, mme si les valeurs de pK1 et pK2 sont estimes correctement, les valeurs des constantes individuelles de dissociation restent indtermines, sauf si des arguments de plausibilit sont invoqus, qui impliquent des hypothses invrifiables (DIXON, 1976)
Tableau 8.1 - Relation entre la largeur mi-hauteur et la valeur de pK2 pK1 pour des profils de pH ayant des formes de courbe en cloche La mthode la plus pratique pour calculer la diffrence de pKa partir de la largeur mihauteur est celle suggre par DIXON (1979) : elle dfinit la largeur mi-hauteur comme 2 log q ; alors pK2 pK1 = 2 log (q 4 + 1/q). Largeur mi-hauteur 1,14* 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 pK2 pK1 Largeur mi-hauteur 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3,0 pK2 pK1 1,73 1,88 2,02 2,15 2,28 2,41 2,53 2,65 2,77 2,88 Largeur mi-hauteur 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 3,9 4,0** pK2 pK1 3,00 3,11 3,22 3,33 3,44 3,54 3,65 3,76 3,86 3,96
1,27 0,32 0,17 0,51 0,78 1,02 1,22 1,39 1,57
* La largeur mi-hauteur de la courbe dfinie par lquation [8.28] ne peut pas tre infrieure 1,14. ** Lorsque la largeur mi-hauteur est suprieure 4, la diffrence de pKa ne diffre pas de cette largeur par plus de 1%.
Bien que le tableau 8.1 autorise des valeurs ngatives de (pK2 pK1), celles-ci sont seulement possibles si la libration des protons est cooprative, cest--dire si la perte dun proton par un groupe augmente la tendance de lautre groupe perdre son proton. Ce comportement nest pas impossible, mais pour des raisons lectrostatiques celui-ci est improbable. En ralit, la plus petite valeur que (pK2 pK1) puisse prendre sans impliquer de cooprativit est +0,6, qui correspond une largeur mi-hauteur de 1,53. En pratique donc, des courbes en cloche plus abruptes que cela sont trs rares.
273
8.3. LEFFET DU PH SUR LES CONSTANTES

CINTIQUES ENZYMATIQUES
8.3.1. Hypothses sous-jacentes
Les courbes dactivit en cloche qui sont souvent observes pour les paramtres enzymatiques V et V Km peuvent tre expliques par une simple extension de la thorie de lionisation dun acide dibasique (le traitement du K m est plus com plexe, comme nous le verrons). Le mcanisme fondamental est prsent dans la figure 8.8. Lenzyme libre est encore trait comme un acide dibasique, H2E, avec deux constantes de dissociation, KE1 et KE2, et le complexe enzyme substrat H2EA se dissocie de manire similaire, impliquant galement deux constantes de dissociation, KEA1 et K EA2. Uniquement le complexe ionis une fois, HEA, est capable de ragir pour former les produits. Comme nous allons partir de maintenant travailler uniquement avec des constantes de dissociation molculaire, il nest plus ncessaire de faire la distinction entre les deux formes possibles denzyme ionis une fois, cest--dire que HE fait rfrence aux deux espces qui sont reprsentes par HE et EH dans la figure 8.5 et dans les quations prcdentes. Il en va de mme pour le complexe enzyme-substrat HEA.
A + H2E H2EA
KE1 k1 k1
KEA1 k2
A + HE
HEA
HE + P
KE2
KEA2
A + E2
EA2
8.8 - Enzyme avec deux groupes ionisables Seules les espces dissocies une fois sont supposes disposer dune activit catalytique.
Avant de continuer, nous souhaitons faire remarquer au lecteur que le schma de la figure 8.8 comprend plusieurs suppositions implicites qui peuvent constituer des simplifications. Premirement, lomission de ltape de fixation du substrat pour H2E et E2 implique que les tapes de fixation de protons sont des culs-de-sac, de sorte quelles peuvent tre traites comme des quilibres ( 6.3.5). Nanmoins, dans la plupart des cas, il nexiste aucune justification relle pour supposer que le
274
substrat ne puisse pas se fixer directement sur diffrentes formes ioniques de lenzyme et donc lhypothse est faite dans le but de simplifier le systme plutt que de reprsenter la ralit. Si ces tapes sont incluses dans le mcanisme, les tapes de fixation des protons ne sont pas des culs-de-sac et elles ne peuvent tre traites comme des quilibres que si elles sont supposes trs rapides par rapport aux autres tapes de la raction. Cela constitue une hypothse raisonnable, la simple vue de la nature de la raction, mais qui nest pas toujours vrai, en particulier si la raction de fixation de protons implique un changement obligatoire de conformation de la protine. Deuximement, le schma de la figure 8.8 implique aussi que la raction catalytique comprend uniquement deux tapes, comme dans le mcanisme simple de MICHAELIS et MENTEN. Si nous postulons lexistence de plusieurs tapes, o chaque intermdiaire est capable de fixer ou de librer des protons, la forme de lquation de vitesse nest pas affecte, mais linterprtation des rsultats exprimentaux devient plus complique puisque chaque constante de dissociation mesure exprimentalement est la moyenne des valeurs pour les diffrents intermdiaires, pondre en faveur des formes prdominantes (comparez avec leffet de lintroduction dune tape supplmentaire dans le mcanisme simple de MICHAELIS et MENTEN, 3.6). Finalement, il nest pas toujours vrai que seul le complexe HEA puisse catalyser la raction chimique et donner les produits, mais cest une supposition vraisemblable pour de nombreux enzymes puisque lactivit de la plupart des enzymes tend vers zro pour des valeurs extrmes de pH.
8.3.2. La dpendance au pH des paramtres V et V /Km

Si nous considrons que le schma de la figure 8.8 est une reprsentation satisfaisante dun mcanisme rel, nous pouvons tablir les quations de vitesse qui en dcoulent. Sil ny a pas dtape dionisation et que HE et HEA sont les seules formes de lenzyme, le mcanisme correspond un mcanisme ordinaire de MICHAELIS et MENTEN, caractris par lquation de vitesse : V [ A] k 2 [ E ]0 [ A ] = v = [8.35] k 1 + k 2 Km + [ A ] + [ A] k1 dans laquelle V = k [ E ] et K = ( k + k ) k sont des paramtres indpendants du pH. Dans le modle de la figure 8.8, cependant, lenzyme libre nexiste pas uniquement sous la forme HE et le complexe enzyme-substrat nexiste pas uniquement sous la forme HEA. Lquation complte de vitesse a la mme forme que celle de lquation [8.14], cest--dire : V [ A] v = [8.36] Km + [ A ]
2 0
m 1 2 1
275
mais les paramtres V et K m ne sont pas quivalent V et Km ; au contraire, ces paramtres sont des fonctions de la concentration en proton, [ H + ] .
La drivation de lquation de vitesse peut tre effectue dans le cas de lhypothse dun tat stationnaire en utilisant la procdure dcrite dans le 3.3.2. Cette procdure est toutefois facilite par lutilisation des fonctions pH de MICHAELIS. Ainsi, dans le cas du modle [8.8], lquation de conservation de lenzyme (quation [3.25]) scrit de la manire suivante :
[ E ]0 = [ H 2 E ] + [ HE ] + [ E 2 ] + [ H 2 EA ] + [ HEA ] + [ EA2 ]
[8.37]
Cette forme contient six termes de concentrations, mais en utilisant les fonctions pH de MICHAELIS [8.34b], nous pouvons lcrire plus simplement sous la forme suivante : [8.38] [ E ]0 = [ HE ] f E + [ HEA ] f EA
o f E et f EA reprsentent respectivement les fonctions pH de MICHAELIS correspondant lquation [8.34b] pour lenzyme libre et pour le complexe enzymesubstrat. K [H+] f E = 1 + + E+2 [8.39a] KE 1 [H ]
f EA = 1 +
[ H + ] KEA 2 + KEA1 [ H + ]
[8.39b]
En utilisant, lhypothse dun tat stationnaire (quation [3.27]) :
d [ HEA ] = k 2 [ HE ][ A ] ( k 1 + k 2 )[ HEA ] = 0 dt
[8.40]
nous obtenons une expression reliant [ HE ] et [ HEA ] (quation [3.29]) : k1 [ HEA ] = [ HE ][ A ] [8.41] ( k 1 + k 2 ) et nous pouvons rcrire lquation de conservation de E (quation [8.38]) sous la forme suivante : k1 [ E ]0 = [ HE ] f E + [ A ] f EA [8.42] ( k 1 + k 2 ) Nous obtenons une expression simple reliant la concentration de la forme libre de lenzyme la concentration totale denzyme, qui peut scrire sous une forme similaire lquation [3.31] : [ E ]T [8.43] [ HE ] = D k1 [ A ] f EA D = f E + [8.44] o ( k 1 + k 2 )
276
En appliquant la suite de la procdure dcrite dans le 3.3.2, nous obtenons une quation de vitesse qui a la mme forme que celle de lquation [3.33] : k 2 [ E ]0 k1 [ E ]0 v = k2 [ A ]0 = [8.45] k 1 + k 2 k 1 + k 2 D f E + f EA [ A ] k1
En utilisant les expressions pour les paramtres V et Km donnes ci-dessus, nous obtenons des expressions pour V et V Km qui ont une forme similaire celle des quations [8.28] et [8.33b] : V [8.46] V = V = + [ H ] KEA 2 f EA + 1 + KEA1 [ H + ] V V m m K V = K = [8.47] + [H ] Km fE KE 2 + 1 + KE 1 [ H + ]
Il faut noter que le comportement vis--vis du pH de V reflte lionisation du complexe enzyme-substrat, alors que celui de V Km reflte lionisation de lenzyme libre (ou du substrat libre, voir 8.4). Quel que soit le cas, la dpendance au pH suit une courbe en cloche du type de celle dont nous avons discut dans le prcdent.
8.3.3. Les paramtres indpendants du pH et leur relation avec les paramtres apparents
La relation entre les paramtres rels et les paramtres indpendants du pH qui viennent dtre introduits est similaire celle qui relie les valeurs relles et les valeurs attendues que nous avons considres dans le traitement de la fixation nonproductive ( 5.8.1) ; mais elle est galement similaire la distinction faites entre valeurs apparentes et relles (respectivement) dans de nombreux contextes. Ceci peut sembler inconsistant : pourquoi disons-nous que les valeurs relles des paramtres de MICHAELIS et MENTEN dans une exprience dinhibition sont celles qui sappliquent en absence dinhibiteur, alors que dans une tude de la dpendance au pH, ce sont les valeurs qui sappliquent un pH particulier ? Il serait raisonnable desprer une plus grande consistance dans ces appellations, mais cela crerait plus de problmes que den rsoudre et, comme dans dautres domaines, il est prfrable de sacrifier la consistance au pragmatisme. En thermodynamique, par exemple, nous dfinissons ltat standard de la plupart des espces en solution une concentration de 1 M, mais nous faisons une exception pour le solvant en fixant sa concentration standard gale la concentration laquelle il se trouve ; en biochimie, mais pas en chimie, nous tendons ces considrations au
277
proton, en admettant que les constantes dquilibre et les variations standards dnergie de GIBBS ont beaucoup plus de sens lorsquelles sont dfinies pour un tat standard pH 7 (pour une discussion plus dtaille de ce point, voir ALBERTY et CORNISH-BOWDEN, 1993.) En appliquant cette ide la dpendance au pH des paramtres de MICHAELIS et MENTEN, nous rencontrons une diffrence importante entre le proton et les autres inhibiteurs. Pour la plupart des inhibiteurs, il est parfaitement possible dtudier la raction en absence de linhibiteur, et parfaitement raisonnable, donc, de dfinir les paramtres rels comme ceux qui sappliquent dans ce cas. Il nest pas possible, par contre, dobserver une raction catalyse par un enzyme en absence de protons, et le fait que les protons activent les enzymes aussi bien quils ne les inhibent (alors que les autres effecteurs de lactivit enzymatique inhibent plus souvent quils nactivent) signifie que nous ne pouvons mme pas dterminer le comportement en absence de proton par extrapolation. Finalement, en biochimie, toutes les distinctions entre constantes et variables sont plutt des questions de pragmatisme que des lois imposes par la nature et lexception de quelques constantes physiques fondamentales, cette remarque sapplique pour la plupart des constantes en science : mme en chimie-physique, la temprature par exemple, ne fait pas partie de la dfinition dun tat standard et donc les constantes dquilibre varient avec la temprature.
8.3.4. La dpendance au pH de Km
La variation de K m avec le pH est plus complexe que celle des autres paramtres, puisque sa valeur dpend des quatre valeurs de pKa :
Km =
Km f E f EA
+ [ H ] + KE 2 Km 1 + KE 1 [ H + ] = [ H + ] KEA 2 + 1 + KEA1 [ H + ]
[8.48]
Nanmoins, il est possible en principe dobtenir les 4 valeurs de pKa en portant en graphique log K m en fonction du pH et en appliquant la thorie dveloppe par DIXON (1953a). Pour comprendre ce graphique, il est prfrable de considrer K m comme V divis par V Km , cest--dire de considrer log K m comme log V log (V Km ) . Ainsi, une analyse de la manire dont log V et log (V Km ) varient avec le pH permet de comprendre naturellement la manire dont le Km varie avec le pH. Il apparat clairement que, pour des concentrations leves de proton (valeurs faibles de pH), lquation [8.46] se simplifie pour donner V = V KEA1 [ H + ] et que pour des concentrations faibles (valeurs leves de pH), elle se simplifie pour donner V = V [ H + ] KEA 2 . Si les valeurs de KEA1 et de KEA2 sont significativement diffrentes lune de lautre, il existe galement une rgion
278
intermdiaire dans laquelle V V . Il sensuit que le graphique de log V en fonction du pH devrait avoir la forme prsente dans la partie suprieure de la figure 8.9, correspondant approximativement trois segments linaires se coupant pH = pKEA1 et pH = pKEA2. Le comportement de V Km prsent dans la partie centrale de la figure 8.9 est similaire, except que les intersections sont localises pH = pKE1 et pH = pKE2. En dpit de la complexit de lquation [8.18], le graphique de log Km en fonction du pH sobtient simplement par soustraction, et sa forme est reprsente dans la partie infrieure de la mme figure 8.9.
logV pKEA1 pKEA2 a
pH log(V/Km) pKE1 pKE2 b
pH log(Km) pKEA1 pKEA2 pKE1 pKE2 pH

8.9 - Interprtation des profils de pH en accord avec la thorie de DIXON (1953a) Bien que les graphiques du logarithme de nimporte lequel des paramtres cintiques donne toujours des courbes lisses, comme le montre les courbes en pointills, elles peuvent tre utilement interprtes comme si elles taient constitues de segments de droites. (a) Des variations de la pente du graphique de log V en fonction du pH refltent des ionisations dans le complexe enzyme-substrat ; (b) des variations de la pente du graphique de log (V /Km) en fonction du pH refltent des ionisations dans lenzyme libre ; (c) en principe toutes les ionisations affectent Km dune manire qui est le plus facilement rationalise en considrant le graphique de log Km comme le graphique de log V log( V /Km).
279
Le graphique correspond approximativement une srie de segments de droite, chacun ayant une pente de + 1, 0 ou 1 (des pentes de + 2 et de 2 sont galement possibles, bien que lon nen trouve pas dans la figure 8.9). En suivant ces segments de droite gauche sur le graphique, chaque augmentation de pente indique le pKa dun groupe dans lenzyme libre, soit pKE1 ou pKE2, et chaque diminution indique le pKa dun groupe dans le complexe enzyme-substrat, soit pKEA1 ou pKEA2. Les graphiques prsents dans la figure 8.9 sont idaliss, dans le sens o les valeurs de pKa sont bien spares les unes des autres (par au moins une unit de pH) et o les donnes couvrent une gamme suffisamment large de pH pour que les quatre changements de pente soient facilement observables. Dans une exprience relle, il serait inhabituel davoir des donnes prcises sur une gamme suffisamment large pour estimer les quatre valeurs de pKa. Toutefois, linterprtation dun changement de pente reste valable mme si seulement une partie du graphique est disponible.
8.3.5. Prparation des expriences

Afin de fournir des informations significatives sur le mcanisme ractionnel, les courbes de dpendance au pH devraient faire rfrence aux paramtres de lquation de MICHAELIS et MENTEN ou dune autre quation qui dcrit le comportement chaque pH. (Mieux encore, elles devraient faire rfrence des tapes individuelles identifies dans le mcanisme, bien que cela ne soit pas souvent ralisable). En dautres termes, une srie de vitesses initiales devrait tre mesure pour chaque valeur de pH, telle que V et V Km puissent tre dtermines pour chaque valeur de pH. La dpendance de v au pH na que peu de valeur cause des effets compensatoires sur V et sur V Km qui peuvent rendre trompeuses toutes les valeurs de pKa obtenues partir de ces mesures. Ainsi, les mesures des effets du pH devraient suivre les mmes principes que les mesures des effets sur lenzyme de la variation de nimporte quel paramtre environnemental, comme la temprature, la force ionique, les concentrations dinhibiteur et dactivateur La caractrisation prliminaire du comportement dun enzyme en fonction du pH est parfois ralise dune manire qui est encore moins utile que celle qui consiste mesurer la variation de v avec le pH, en mesurant lavancement de la raction aprs un temps fixe en fonction du pH. Fort heureusement il est de plus en plus rare de trouver des rsultats publis sous cette forme, mais dans la littrature ancienne, des informations potentiellement intressantes sont rendues totalement inutilisables cause dune telle pratique exprimentale (voir INOUYE et al., 1966). Au mieux, une mesure de lavancement de la raction un temps fixe, peut donner une indication de la vitesse initiale, mais cette estimation risque dtre complique par la variation de la courbure (quelle quen soit la cause, par exemple linactivation de lenzyme) entre les diffrentes expriences.
280
8.4. IONISATION DU SUBSTRAT

De nombreux substrats sionisent dans la gamme de pH utilise pour les expriences de cintique. Si le substrat sionise, il est ncessaire de se demander si les valeurs observes de pKa se rapportent des groupes de lenzyme ou du substrat. La thorie de ce cas, est la mme que pour lionisation de lenzyme et la thorie prsente ci-dessus doit seulement tre lgrement modifie. La dpendance de V au pH, et la diminution de la pente des graphiques de log Km en fonction du pH, se rapportent toujours au complexe enzyme-substrat ; mais la dpendance de V Km au pH, et les augmentations de la pente dans les graphiques de log K m en fonction du pH peuvent se rapporter soit lenzyme libre, soit au substrat libre. Dans certains cas, il est possible de choisir parmi ces deux interprtations en utilisant un substrat qui ne sionise pas. Par exemple (figure 8.10a), la dpendance de kcat Km au pH pour lhydrolyse de lactyl-L-phnylalanine-L-phnylalanylglycine catalyse par la pepsine se caractrise par des valeurs de pKa de 1,1 et de 3,5, parmi lesquelles la dernire pourrait tre attribue un groupe du substrat. Cette interprtation a t confirme en considrant un substrat qui ne sionise pas, lactyl-Lphnylalanine-L-phnylalaninamide : la dpendance au pH de la raction avec ce dernier se caractrise par une valeur de pKa,1 essentiellement identique, de 1,05, mais par une seconde valeur de pKa,2 plus leve, de 4,75 (figure 8.10b), qui se rapporte probablement lionisation dun groupe de lenzyme.
8.5. EFFETS COMPLEXES DU PH

Une des raisons principales des tudes de dpendance au pH est de mesurer les valeurs de pKa et partir de l, de dduire la nature chimique des groupes de lenzyme qui participent la catalyse. Bien que cette pratique soit largement rpandue, elle demande plus de prcautions quil ny parat, parce que les traitements simples des effets du pH reposent sur des hypothses qui ne sont pas toujours vrifies. KNOWLES (1976) a discut de manire critique les hypothses qui sont couramment faites lors de linterprtation des profils de pH et a montr comment on peut tre amen en tirer des conclusions errones ; sa revue devrait tre lue par quiconque sintresse srieusement aux effets du pH sur les enzymes. Ce ne sont pas seulement les hypothses quantitatives qui sont suspectes ; linterprtation qualitative dun profil de pH peut aussi tre trompeuse. Par exemple, bien quune courbe en cloche puisse indiquer la ncessit pour deux groupes dexister dans une forme ionique particulire, comme nous en avons discut dans les 8.3 et 8.4, ce nest pas la seule possibilit : dans certaines circonstances un groupe unique impliqu dans diffrents tats dionisation dans deux tapes distinctes de la raction peut donner un comportement similaire (DIXON, 1973 ; CORNISH-BOWDEN, 1976a).
281
kcat/Km 300 (M1s1)

200
a - Ac-Phe-Phe-Gly
100
pK1
0
pK2
kcat/Km (M1s1) 20 b - Ac-Phe-PheNH2

10
pK1
0 0 1 2 3 4
pK2
5 6
pH
8.10 - Dpendance au pH du paramtre kcat /Km pour les ractions dhydrolyse catalyses par la pepsine, (a) de lactyl-L-phnylalanine-L-phnylalanylglycine et (b) lactyl-L-phnylalanine-L-phnylalanin-amide (CORNISH-BOWDEN et KNOWLES, 1969)
La courbe en cloche obtenue rsulte dans ce cas dun changement dtape limitante avec le pH (JENCKS, 1969) et au moins une des valeurs de pKa ne correspond aucun groupement chimique. Ce type de pKa est gnralement appel pKa cintique et ne donne aucune indication prcise quant au groupement impliqu dans le mcanisme ractionnel. Dautres complications sont que la protonation ou la dprotonation dun seul groupe dans ltat totalement actif peut conduire une perte partielle dactivit, et que la perte totale de lactivit peut ncessiter plus dune protonation ou dprotonation. Pour une discussion plus dtaille de ces effets complexes du pH, nous renvoyons nos lecteurs larticle de TIPTON et DIXON (1979).
8.6. EFFETS DE LA TEMPRATURE SUR LES RACTIONS

CATALYSES PAR DES ENZYMES
8.6.1. Dnaturation thermique
En principe, le traitement thorique discut dans le 2.5 de la dpendance la temprature des ractions chimiques simples sapplique galement aux ractions
282
catalyses par des enzymes, mais en pratique, il y a plusieurs complications qui doivent tre correctement apprhendes si une information utile doit tre obtenue partir de mesures dactivit enzymatique en fonction de la temprature. Premirement, tous les enzymes se dnaturent lorsquils sont chauffs au-del des tempratures physiologiques, et la conformation des enzymes est altre, souvent irrversiblement, entranant une perte de leur activit catalytique. La dnaturation est un processus chimiquement complexe, qui nest encore que partiellement comprise, et nous donnerons ici un compte-rendu simplifi de ce phnomne. Nous limiterons notre discussion la dnaturation rversible, nous supposerons quun quilibre existe en permanence entre la forme dnature et la forme active de lenzyme, et quil nexiste quune seule espce dnature. Cependant, nous insistons sur le fait que la limitation au cas rversible est motive par la simplification du traitement et non pas parce que les effets irrversibles sont ngligeables dans la pratique. Lexemple discut dans le 8.6.2 traitera dune dnaturation irrversible, mais de manire qualitative. La dnaturation rversible nimplique pas la rupture de liaisons covalentes, mais seulement de liaisons de faible nergie, comme par exemple de liaisons hydrognes, qui sont impliques dans le maintien de la conformation active de lenzyme. Bien quune liaison hydrogne soit beaucoup moins forte quune liaison covalente (environ 20 kJ mol1 pour une liaison hydrogne par rapport environ 400 kJ mol1 pour une liaison covalente), la dnaturation implique gnralement la rupture de nombreuses liaisons de faible nergie. Plus exactement, elle implique le remplacement de nombreuses liaisons hydrogne intramolculaires par des liaisons hydrognes entre la molcule denzyme et les molcules du solvant. Lenthalpie standard dune raction de dnaturation, DH ' , est souvent trs leve, typiquement entre 200 et 500 kJ mol1, mais la rupture de nombreuses liaisons de faible nergie saccompagne dune augmentation considrable du nombre de conformations accessibles par la molcule denzyme, et donc la dnaturation se caractrise aussi par une entropie standard de raction, DS' , trs leve.
E' K A+E k
Leffet de la dnaturation sur les constantes de vitesse observes peut tre visualis en considrant lexemple simple dun enzyme actif E en quilibre avec une forme inactive E', comme prsent dans le schma de la figure 8.11.
E+P
8.11 - Mcanisme simple de dnaturation rversible de lenzyme
Par souci de simplicit, la raction catalytique est reprsente comme une simple raction de second-ordre avec une constante k, telle que nous lobservons habituellement pour de faibles concentrations de substrat. La constante dquilibre pour la dnaturation varie avec la temprature en accord avec lquation de VANT HOFF ( 2.5.2) :
RT ln K = DG ' = DH ' TDS '
[8.49]
283
o R est la constante des gaz parfaits, T est la temprature absolue et DG' , DH ' et DS' sont respectivement lnergie standard de GIBBS, lenthalpie standard et lentropie standard de la raction. Cette relation peut tre rarrange pour donner une expression de K :
K =
DS ' DH ' e R RT
[8.50]
La constante de vitesse k pour la raction catalytique peut tre dfinie par lquation dEYRING :
k =
kB T e h
DG ' RT
[8.51]
o DG' est lnergie de GIBBS dactivation. La vitesse de la raction catalytique est donne par v = k [ E ][ A ] , mais pour utiliser cette quation, la concentration [ E ] de lenzyme actif doit tre exprime en termes de la concentration totale [ E ]0 = [ E ] + [ E' ] et ainsi, k [ E ]0 [ A ] [8.52] v = 1+ K La constante de vitesse observe, kobs, peut alors tre assimile k ( 1+ K ) , et elle varie avec la temprature en accord avec lquation suivante : DG o' k BT exp RT h k obs = [8.53] o o DS ' DH ' 1 + exp RT R Aux tempratures faibles, quand DS ' R est petit par rapport DH ' RT , le terme exponentiel du dnominateur est insignifiant, et donc kobs varie avec la temprature de la manire ordinaire prdite par lquation dEYRING. A des tempratures suprieures DH ' DS ' , nanmoins, le dnominateur augmente fortement avec la temprature et la vitesse de la raction diminue et tend rapidement vers zro.
8.6.2. L optimum de temprature

Bien que le modle soit simplifi, il montre pourquoi lquation dEYRING ne dcrit pas le comportement des ractions enzymatiques hautes tempratures. Dans la littrature ancienne, il tait habituel de rapporter loptimum de temprature des enzymes, et cela se rencontre encore occasionnellement de nos jours. Cependant, la temprature laquelle kobs est maximum na aucune signification particulire, puisque le dpendance la temprature des ractions catalyses par les enzymes varient souvent avec les conditions exprimentales. En particulier, plus longtemps le mlange ractionnel est incub avant lanalyse et plus l optimum de
284
temprature est bas (figure 8.12). Cet effet s'explique parce que la dnaturation est souvent une raction lente, de telle sorte quelle ne peut tre correctement traite comme un quilibre. Lavancement de la dnaturation ds lors augmente avec le temps dincubation. Ceci ne devrait nanmoins plus poser de problmes avec les techniques exprimentales modernes, puisque dans les mesures en continu, les processus dpendants du temps sont aisment mis en vidence.
Avancement de la raction (%)
15
Vitesse (%/min)
4 2 0
1 min 2 min 4 min 7 min 0 20 40 60
10
Temprature (C)
70 60 50 40 30 20 10 0
8
0 0 2 4 6
Temps (min)
8.12 - Effet de linactivation par la chaleur sur la dpendance la temprature des vitesses des ractions catalyses par un enzyme Si la vitesse initiale est considre comme la vitesse moyenne mesure pendant une priode fixe, comme par exemple 1, 2, 4 ou 7 minutes (indique par les lignes en pointills), la dpendance la temprature aura lallure dune courbe en cloche passant par un maximum une temprature qui varie avec la priode utilise, comme illustr dans linsert.
8.6.3. Application de lquation dEYRING aux enzymes

A cause de la dnaturation, les tudes de la dpendance la temprature des enzymes peuvent habituellement tre ralises uniquement dans une gamme troite de temprature, approximativement entre 0 et 50C et mme dans cette gamme plusieurs piges doivent tre vits. Premirement, la dpendance la temprature de la vitesse initiale donne habituellement un graphique dARRHNIUS nonlinaire, partir duquel peu dinformation utile peut tre obtenue. De tels graphiques constituent la plupart du temps des artfacts (voir par exemple SILVIUS, READ et MCELHANEY, 1978), et un minimum requis pour raliser une tude srieuse de la dpendance la temprature ncessite de mesurer une srie de vitesses chaque temprature, de sorte que les graphiques dARRHNIUS peuvent tre tracs pour chacun des paramtres du modle de MICHAELIS et MENTEN, V, Km et V Km . Ces graphiques sont galement souvent non-linaires, et il existe plusieurs explications possibles ce phnomne par exemple, un changement de la conformation de lenzyme, la prsence de lenzyme sous la forme dun mlange disoenzymes, un effet de la temprature sur le substrat de sorte quil est
285
dangereux de tirer des conclusions partir de la forme du graphique dARRHENIUS moins que celui-ci ne puisse tre corrl avec dautres effets de la temprature, mesurables indpendamment. MASSEY, CURTI et GANTHER (1966), par exemple, ont observ des variations nettes environ 14C de la pente des graphiques dARRHENIUS pour loxydase des acides amins D ; la mme temprature, dautres techniques, telle que la sdimentation de vitesse et la spectroscopie dabsorbance dans lUV, indiquaient un changement de conformation de lenzyme. Dans un tel cas, il est raisonnable dinterprter le comportement cintique comme une consquence de ce changement de conformation. En gnral, peu dimportance est accorde aux tudes de la dpendance la temprature de quelque paramtre de MICHAELIS et MENTEN que ce soit sans que la signification de ce paramtre en termes de mcanisme catalytique ne soit connue. Si K m est une fonction de plusieurs constantes individuelles de vitesse, sa dpendance la temprature sera trs vraisemblablement une combinaison complexe deffets compensatoires, et donc peu significative ou sans intrt ; par contre, si K m est selon toute vraisemblance quivalent une constante de dissociation, sa dpendance la temprature peut fournir des informations thermodynamiques utiles au sujet de lenzyme. La majorit des nergies de GIBBS dactivation pour les ractions catalyses par des enzymes qui ont t publies, ont peu de valeur, mais il serait faux de suggrer quaucune information utile ne peut tre obtenue partir de ce genre dtude ; si elles sont ralises avec discernement, une information trs utile pour la comprhension du mcanisme catalytique peut tre obtenue. Une tude classique est celle ralise par BENDER, KZDY et GUNTER (1964) sur l-chymotrypsine. Ce travail diffre en de trs nombreux points des tudes typiques de la dpendance la temprature. Il incluait des preuves convaincantes de lidentification des tapes particulires qui taient ainsi tudies dans le mcanisme de la raction, il comparait les rsultats obtenus avec de nombreux substrats, il se rapportait un enzyme dj trs bien connu, et il tait correctement interprt en terme de chimie.
8.7. EFFETS DE LA PRESSION SUR LES RACTIONS

CATALYSES PAR DES ENZYMES
8.7.1. Effets de la pression sur les quilibres et les vitesses de raction
Dj en 1914, BRIDGMAN avait dmontr quune pression de 700 MPa induisait la dnaturation des protines du blanc duf dune manire similaire mais nanmoins diffrente, celle observe lors dune augmentation de la temprature (BRIDGMAN, 1914). Depuis ces premires tudes, ltude des effets de la pression sur les macromolcules sest dveloppe et il est clair quune caractrisation complte des proprits thermodynamiques et cintiques dun systme passe par ltude des
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effets de la pression qui permet de dterminer les variations de volume que subit le systme lors dune raction. Les effets de la pression 1 sont gouverns par le principe de LE CHATELIER qui dit quun systme lquilibre soumis une perturbation, ragit dune manire qui tend minimiser les effets de cette perturbation. Une augmentation de la pression favorise donc la rduction du volume du systme. Lquation [2.18] indique que lnergie libre dun systme dpend du produit de la pression et du volume. A temprature constante, la variation de volume, qui est dfinie comme la diffrence entre le volume final et le volume initial, est donne par lquation suivante :
ln K DV = V p VA = DG = RT p T p T
[8.54]
Une expression similaire peut tre obtenue pour la constante de vitesse k dun processus lmentaire, qui relie k aux paramtres dactivation, avec DV reprsentant la diffrence entre le volume de ltat de transition et celui de ltat fondamental. Les valeurs de DV et de DV peuvent tre obtenues en portant en graphique respectivement ln K ou lnk en fonction de la pression, p. Les tudes de leffet de la pression sur des systmes biologiques sont moins courantes que celles de leffet de la temprature, dune part parce quelles ncessitent un quipement moins courant quun bain thermostatique et dautre part parce que les concepts de base des effets de la pression sur les ractions chimiques et sur la structure des macromolcules sont moins bien apprhends, que ceux des effets de la temprature. Cependant, ltude des effets de la pression prsente lavantage que cette dernire naffecte que le volume du systme tudi, contrairement la temprature qui affecte la fois lnergie interne et le volume du systme. Linterprtation des volumes de raction et dactivation est gnralement prsente en termes de contributions intrinsques et de contributions du solvant. Des effets de compensation peuvent alors masquer certains changements et compliquer lanalyse de ractions complexes comme les ractions enzymatiques. Les contributions intrinsques peuvent rsulter de changements dans la densit de compaction de la protine ou de la formation ou de la rupture de liaisons covalentes. La formation des liaisons covalentes a un DV de lordre de 10 mL mol1, alors que les valeurs de DV pour les changes de liaison ou les changements dangles sont pratiquement nulles. Les variations de volume provenant de modifications de la densit de compaction sont difficiles mesurer mais sont considres comme faibles. Ainsi en absence de formation ou de rupture de liaisons covalentes, les contributions les plus importantes proviennent de changements de ltat dhydratation des interactions non-covalentes.
1. Dans le systme international (S.I.) lunit de pression est le Pascal et typiquement la pression est exprime en mgaPascals (MPa). En pratique, diffrentes units de pressions sont couramment utilises : 1 MPa est quivalent 10 bars et 9,87 atm.
287
8.7.2. Effet de la pression sur les interactions non-covalentes

Un facteur important qui contribue aux variations de volume des macromolcules est li lhydratation des interactions lectrostatiques. Quand un ion est form en solution, les molcules deau qui lentourent sont attires par lion (interactions ion-diple), un phnomne connu sous le nom dlectrostriction et qui conduit une rduction du volume du systme. Pour la solvatation dun ion portant une seule charge, la variation du volume est de lordre de 10 mL mol1. La dissociation dune molcule neutre en deux ions saccompagne ainsi dune variation de volume de lordre 20 mL mol1, qui correspond au volume dionisation de leau pure. Le phnomne dlectrostriction est proportionnel au carr de la charge de lion et donc, la variation de volume est plus importante pour les ions plusieurs fois chargs. Sur la base de ces informations, nous pouvons conclure que les interactions lectrostatiques dans les macromolcules sont affaiblies lorsque la pression augmente. Par exemple, la chymotrypsine est inactive de manire rversible par une augmentation de pression cause de la dissociation dun pont salin dans la rgion du site actif (HEREMANS et HEREMANS, 1989). Un second facteur est li leffet de la pression sur les liaisons hydrogne. Des tudes ralises avec des composs modles indiquent que les liaisons hydrogne sont stabilises par une augmentation de la pression (VAN ELDIK et al., 1989), en raison dune rduction des distances inter-atomiques. Nanmoins, des ractions impliquant des changes entre des liaisons hydrogne existantes se caractrisent par une trs faible variation de volume (VAN ELDIK et al., 1989). Finalement, la formation dinteractions hydrophobes saccompagne dune augmentation de volume (DV > 0) et ces interactions sont donc affaiblies par une augmentation de la pression. Nanmoins, limportance de cet effet dpend du modle tudi et varie entre + 1 et + 20 mL mol1 pour un groupe CH2. Dautre part les interactions par empilage des cycles aromatiques sont caractrises par un volume de raction ngatif et sont donc stabilises par une augmentation de pression.
8.7.3. Effets de la pression sur les ractions enzymatiques

Ltude des changements de volume dans les diffrentes tapes dun processus catalytique fournit des donnes complmentaires celles obtenues par dautres mthodes. Toutefois, la variation du volume dactivation pour les ractions enzymatiques impliquant plusieurs tapes peut tre complexe et inclure des changements de volume dans ltape qui dtermine la vitesse mais aussi dans ltape de fixation du substrat et dans toutes les tapes qui prcdent ltape limitant la vitesse. Une tude dtaille des variations de volume accompagnant les diffrentes tapes dune raction enzymatique a t ralise pour la raction de conversion du
288
fumarate (F) en L-malate (M) catalyse par la fumarase (BUTZ et al., 1988). Cette raction suit un mcanisme ractionnel simple : E+F EF EM E+M [8.55] La formation des tats de transition des ractions de fixation des ractifs sur lenzyme saccompagne dune rduction du volume du systme alors que la formation de ltat de transition partir du complexe enzyme-substrat ou du complexe enzyme-produit saccompagne dune augmentation du volume (figure 8.13). Ces variations peuvent sexpliquer par lexistence dun changement de conformation de lenzyme qui permet au substrat de pntrer dans le site actif. De plus, des molcules deau sont libres parce que lorientation correcte du substrat dans le site actif implique la formation de paires dions qui rsultent dune augmentation du volume en passant de ltat de transition au complexe EF ou EM. Finalement le volume dactivation pour la raction de conversion du fumarate en L-malate au sein du complexe enzyme-substrat a un volume suprieur celui du systme de dpart. Cette augmentation additionnelle du volume associe lhydratation du fumarate et la dshydratation du L-malate, indique que ltat de transition a un volume plus grand. Dans ce systme, le volume passe par un maximum ou un minimum dans les tats de transition, alors que le volume des complexes enzyme-substrats est similaire celui de lenzyme libre. Il faut nanmoins noter que les changements de volume au cours de la raction enzymatique sont faibles par rapport au volume total de lenzyme (environ 0,3%).
Volume 40 (mL.mol1)
20
[EA][EB] V2 EA V1 V1 V2 EB V3 V3
E+A
E+B
20
40
60
[EA]
[EB]
Coordonnes de la raction
8.13 - Effets de la pression sur une raction enzymatique Les variations de volume pour les deux tapes de fixation des substrats et des produits et pour la raction chimique sont celles mesures pour la raction de conversion du fumarate en L-malate. La figure est dessine partir des donnes de BUTZ et al. (1988).
289
8.8. EFFETS ISOTOPIQUES DU SOLVANT

Bien que les effets isotopiques aient t traits dans le chapitre 7 ( 7.6 et 7.7), les effets dus la substitution isotopique du solvant (SCHOWEN, 1972) sont discuts ici puisquil est plus appropri de les considrer comme des effets de lenvironnement, en particulier parce que les processus rellement responsables des effets isotopiques du solvant sont les mmes que ceux qui dterminent le comportement du pH, cest--dire les quilibres impliquant les hydrons dfinition 2. Ltude de ces effets partage galement quelques autres proprits avec les tudes de dpendance la temprature, tant exprimentalement simple raliser, mais difficile interprter correctement sauf si ltape tudie du mcanisme est clairement identifie. Une simple mesure de la vitesse de la raction dans 1H2O et dans 2H2O ne rvle quasiment rien du mcanisme, mais la mesure de la vitesse en fonction de la fraction molaire de 2H2O dans des mlanges isotopiques de composition varie peut tre beaucoup plus informative. Navement, nous pourrions nous attendre ce que la valeur dune constante de vitesse dans de tels mlanges puisse tre obtenue par interpolation linaire entre les valeurs mesures dans 1H2O et dans 2H2O, mais la dpendance est presque toujours non-linaire, et la forme de la courbe peut rvler des informations sur le mcanisme. Considrons un mlange de 1H2O et de 2H2O dans lequel la fraction molaire de 2 H2O est n, de telle sorte que le rapport [ 2H 2 O ] [ 1 2 O ] est gal n ( 1 n ) . H Pour un hydron changeable dans une molcule de ractif AH, le rapport deutron proton sera aussi donn par [ 2H 2 O ] [ 1 2 O ] = n ( 1 n ) si les consH tantes dquilibre pour les protons et les deutrons sont les mmes. Une slection sexercera cependant de telle sorte que le rapport rel est f n ( 1 n ) o est le facteur de fractionnement pour la position changeable. De tels changes dhydrons peuvent se drouler non seulement dans les molcules de ractifs mais galement dans ltat de transition de la raction : dans cet tat de transition il existe un rapport similaire deutron/proton, f n ( 1 n ) o f reprsente le facteur de fractionnement pour la mme position changeable. La vitesse totale de la raction est alors donne par la somme des vitesses pour les espces protones et deutres de telle sorte que la vitesse est proportionnelle
2. En chimie, dans la plupart des cas, le terme proton est utilis pour dsigner la fois le noyau 1H et le noyau de nimporte lequel des isotopes de lhydrogne, mais cette pratique nest plus satisfaisante lorsquil sagit de discuter les effets des isotopes de lhydrogne. Dans les contextes o une plus grande prcision est ncessaire, la Commission de Chimie Organique Physique de lIUPAC (1988) a recommand le terme hydron pour dsigner nimporte quel noyau dhydrogne sans aucune considration pour lisotope, rservant le terme proton pour le noyau 1H et le terme deutron pour le noyau 2H. Nous suivrons cette recommandation dans la suite de cette section.
290
n 1 + f ( 1 n )
(1 n + f n) . Il en dcoule que la constante de vitesse observe k

(1 n + f n)
k0 ( 1 n + nf ) 1 n + nf
n qui peut scrire plus simplement sous la forme 1 + f ( 1 n )

n
pour une
fraction molaire n de 2H2O peut tre exprime comme une fonction de n et de la constante de vitesse ordinaire k0 dans l1H2O pure :
kn =
[8.56]
Jusqu prsent nous navons considr quun seul hydron, mais une molcule typique denzyme contient un grand nombre dhydrons changeables, chacun pouvant en principe contribuer leffet isotopique du solvant. Si tous les hydrons (incluant les deux hydrons prsents dans chaque molcule de solvant) schangent indpendamment, de telle sorte que la distribution des protons et des deutrons peut tre calcule simplement partir des lois de la statistique, les effets de tous les hydrons sont multiplicatifs et lquation [8.56] peut tre gnralise sous la forme de lquation de GROSS-BUTLER : k 0 ( 1 n + nfi ) kn = [8.57] ( 1 n + nfi ) dans laquelle les deux produits sont appliqus lensemble des hydrons changeables du systme. A la vue du grand nombre dhydrons changeables, et donc du grand nombre de terme dans chacun des produits de lquation [8.57], cette quation peut paratre dsesprment trop complique pour fournir des informations utiles. Cependant, une simplification importante rsulte de deux considrations. Premirement, les effets isotopiques lquilibre sont normalement petits ( 7.6.3), parce que les effets sur les niveaux dnergie se compensent largement entre les deux cts dun quilibre. Cela signifie que la plus large part ou la totalit des facteurs de fractionnement i, dans le dnominateur de lquation [8.48] sont proches de lunit. Deuximement, pour les hydrons qui ne sont pas directement affects lors de la raction, ces effets sannulent lors de la comparaison de ltat fondamental avec ltat de transition, en grande partie pour les effets isotopiques secondaires ( 7.6.2) et compltement pour les hydrons les plus loigns. Cela signifie que les facteurs de fractionnement du numrateur de lquation [8.57] sont aussi proches de lunit. A la fin, donc, la plus grande partie des contributions lquation [8.57] viennent dun petit nombre dhydrons qui sont modifis dans ltat de transition, et une bonne approximation est obtenue en crivant lquation comme suit :
k n = k 0 ( 1 n + nfi )
[8.58]
o le produit est calcul pour les hydrons dont les valeurs de f sont significativement diffrentes de lunit (les autres peuvent toujours tre incluses mais elles
291
naffectent pas les rsultats). Pour un tat de transition impliquant un hydron, lquation donne une dpendance linaire de kn sur n ; pour un tat de transition impliquant deux hydrons, lquation donne une dpendance quadratique Donc dans les cas les plus simples, la forme de la courbe mesure fournit un moyen de compter les hydrons impliqus dans ltape limitant la vitesse de la raction. Pour cette raison, ce type dexprience est souvent appel un inventaire de protons ou plus prcisment un inventaire dhydrons. La prudence simpose pour tendre cette thorie plus avant, puisque plusieurs hypothses ont t ncessaires pour obtenir lquation [8.57] et dautres encore pour obtenir lquation [8.58]. De plus, la thorie a t dveloppe pour une constante lmentaire de vitesse, mais dans les applications enzymatiques, elle doit souvent tre applique des grandeurs moins fondamentales. Beaucoup dautres complications peuvent surgir dans les ractions enzymatiques, de sorte quen aucune manire les effets isotopiques lquilibre ne sont pas toujours ngligeables ou que les ractions dans 2H2O ne sont pas toujours plus lentes que dans 1 H2O. Une tude des effets isotopiques du solvant sur lactivit de lhexokinase D (POLLARD-KNIGHT et CRONISH-BOWDEN, 1984) offre des exemples de chacune de ces exceptions : faibles concentrations de glucose la raction est environ 3,5 fois plus rapide dans 2H2O que dans 1H2O, et puisque cet effet isotopique inverse persiste (et mme augmente) pour de faibles concentrations de MgATP, il doit avoir un effet sur lquilibre.
PROBLMES
8.1 - Pour un enzyme dont le Km dpend dun seul groupe ionisable, avec des valeurs de pKa, pKE dans lenzyme libre et pKEA dans le complexe enzyme-substrat, lquation [8.48] se simplifie sous la forme suivante :
+ ( K E + [ H ]) . Km = Km ( K EA + [ H + ])
a - A quel pH le graphique de Km en fonction du pH prsente-t-il un point dinflexion ? b - A quel pH le graphique de 1 Km en fonction du pH prsente-t-il un point dinflexion ? [Si vous avez des difficults admettre ce rsultat, calculez K m et 1 Km plusieurs valeurs de pH dans la gamme comprise entre 3 et 10, en supposant que pKE = 6,0 et que pKEA A = 7,0, et tracez les graphiques de ces paramtres en fonction du pH. Pour une discussion des principes qui sont lorigine de ce problme, voir FERSHT (1985)]. 8.2 - Linterprtation dun graphique de log K m en fonction du pH est simplifie en utilisant la relation log Km = logV log (V Km ) dans laquelle K m, V
292
CINTIQUE ENZYMATIQUE et V Km sont non seulement des grandeurs possdant des dimensions mais ont des dimensions diffrentes. Cette relation viole-t-elle les rgles discutes dans le 1.2 et si cela est le cas, jusqu quel point lanalyse dcoulant de la figure 8.9 est-elle incorrecte ?
8.3 - Un profil pH en cloche se caractrise par des valeurs dordonnes pour les demi-maxima des valeurs de pH gales 5,7 et 7,5. Estimer les valeurs de pKa molculaires. Sil existe une raison indpendante de penser que la valeur du pKa dun groupe est gale 6,1, que pouvonsnous dduire au sujet du pKa des trois autres groupes ? [Ce problme est moins trivial quil napparat premire vue]. 8.4 - Dessiner un schma plus raliste de la dpendance au pH de lactivit dun enzyme en modifiant le schma de la figure 8.8 comme suit : a - permettre au substrat et au produit de se fixer sur les trois formes de lenzyme libre et supposer que les constantes de vitesse pour ces ractions de fixation sont indpendantes de ltat de protonation ; b - En supposant que le processus catalytique est une raction trois tapes dans lequel chaque tape est rversible et dans lequel la seconde tape, la conversion entre HEA et HEP, se droule pour les complexes une seule fois protonn, et en supposant que toutes les ractions de protonation sont lquilibre dans les conditions dtat stationnaire, utiliser la mthode de CHA ( 6.) pour driver une expression de K m en fonction de la concentration dion hydrogne. La solution a une apparence complexe qui peut tre simplifie en dfinissant f ([ H + ]) =
1 . Dans quelles circonstances [H ] K2 1+ + K1 [H+] Km est-il indpendant du pH ? Si ce paramtre est indpendant du pH

+
quelle valeur prend-il ? 8.5 - Les mesures suivantes de V une temprature T ont t ralises pour une raction catalyse par un enzyme sur une gamme de temprature dans laquelle aucune inactivation thermique ne peut tre mise en vidence. Ces donnes sont-elles consistantes avec linterprtation selon laquelle V est donn par k 2 [ E ]0 o [ E ]0 est constante et k 2 est la constante de vitesse pour une tape simple du mcanisme ?
T (C)
5 10 15 20 25
V (mM min1)
0,32 0,75 1,67 3,46 6,68
T (C)
30 35 40 45 50
V (mM min1)
11,9 19,7 30,9 46,5 68,3
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE

9.1. FONCTION DES INTERACTIONS COOPRATIVES
ET ALLOSTRIQUES
9.1.1. Cycles futiles
S'il est clair que tous les organismes vivants ncessitent un contrle efficace des processus mtaboliques afin de permettre des changements ordonns tout en vitant une progression catastrophique vers lquilibre thermodynamique, il est moins vident de raliser que les enzymes dcrites dans les chapitres prcdents ne sont pas capables de fournir le degr de contrle ncessaire. La conversion du fructose 6-phosphate en fructose 1,6-biphosphate fournit une excellente illustration de ce problme essentiel permettant de discuter des proprits de lenzyme qui sont ncessaires pour quune rgulation efficace soit possible. La conversion du fructose 6-phosphate en fructose 1,6-biphosphate ncessite de lATP : Fructose 6-phosphate + ATP Fructose-1,6-biphosphate + ADP [9.1] Cette raction est catalyse par la phosphofructokinase et constitue la premire tape de la glycolyse qui soit unique cette voie mtabolique cest--dire qu'elle ne fait partie daucune autre voie mtabolique. Elle reprsente donc une tape adapte pour la rgulation de la glycolyse, et, bien qu'aujourd'hui ( 10.5) la recherche dun site unique de rgulation dune voie mtabolique soit considre comme une simplification, il ne fait aucun doute que la phosphofructokinase contribue de manire importante au contrle de la glycolyse dans la plupart des cellules. Dans des conditions physiologiques la raction catalyse par la phosphofructokinase est essentiellement irrversible, et comme le fructose 1,6-biphosphate doit tre convertit en fructose 6-phosphate lors de la noglucogense, une raction diffrente doit tre utilise, une raction hydrolytique catalyse par la fructose biphosphatase : Fructose 1,6-biphosphate + H2O Fructose 6-phosphate + Pi [9.2]
294
Cette raction est aussi quasiment irrversible. Lexistence de deux ractions irrversibles parallles revt une grande importance dans le contrle mtabolique : elle signifie que la direction du flux entre les deux mtabolites peut tre dtermine par une rgulation diffrentielle de lactivit des deux enzymes. Une simple raction rversible ne pourrait pas tre contrle de cette manire, parce quun catalyseur ne peut pas modifier la direction du flux dune raction, qui est dtermin uniquement par des considrations thermodynamiques. Les catalyseurs modifient uniquement la vitesse laquelle lquilibre est atteint. Si la phosphofructokinase et la fructose biphosphatase se comportaient de manire non-contrle, en catalysant les ractions la mme vitesse, il ny aurait aucune conversion nette du fructose 6-phosphate et du fructose 1,6-biphosphate, mais une hydrolyse continue de lATP, qui conduirait ventuellement la mort de lorganisme. Cette situation est connue sous le nom de cycle futile. Pour lviter, soit les deux processus doivent avoir lieu dans des cellules diffrentes (ou dans des compartiments cellulaires diffrents), soit les deux enzymes doivent tre contrls de manire telle que lun nest actif que lorsque lautre est inhib. De nombreux cycles potentiels sont contrls par la compartimentation, mais ce nest pas toujours possible et donc un contrle alternatif est ncessaire. Cest par exemple le cas de tissus comme le foie qui catalysent la fois la glycolyse et la noglucogense. Le terme cycle futile a t dlaiss dans les trois dernires dcennies, en raison de la dcouverte de lexistence de nombreux cycles et parce que ceux-ci ne sont pas ncessairement prjudiciables la cellule. Comme nous en discuterons dans le 10.9.2, les cycles entre formes actives et inactives des enzymes peuvent constituer un mcanisme extrmement sensible de rgulation de lactivit catalytique qui compense trs largement le faible cot d lhydrolyse de lATP. Mme lorsque le rsultat principal dun cycle est de produire de la chaleur, il peut difficilement tre qualifi de futile sil permet un animal sang chaud de maintenir la temprature ncessaire la vie ou sil permet au bourdon de voler (et de collecter le nectar) par temps froid.
9.1.2. Mcanismes de rgulations de lactivit enzymatique

Dans le contexte cellulaire, il est vident que lactivit des protines et des enzymes en particulier, doit tre strictement rgule de sorte que ceux-ci remplissent leur fonction au bon moment et au bon endroit. Tout dabord, il faut rappeler que lactivit dun enzyme est dtermine par sa structure et donc par sa squence. Nanmoins lactivit biologique des protines peut tre rgule diffrents niveaux et par diffrents mcanismes. Il est possible de distinguer des mcanismes extrinsques de rgulation, qui nagissent pas directement sur lactivit dun enzyme donn, et des mcanismes intrinsques qui modifient directement lactivit dun enzyme donn.
295
Un premier mode de rgulation extrinsque de lactivit dun enzyme consiste dans lexistence au sein dun mme organisme, de multiples formes dun mme enzyme, qui sont appeles des isoenzymes. Lexpression diffrentielle de ces isoenzymes dans des tissus distincts ou des organelles distincts ou des stades diffrents du dveloppement fournit un moyen simple de rguler dans le temps et dans lespace une activit enzymatique. Les isoenzymes sont des protines homologues qui catalysent dans un mme organisme la mme raction chimique, mais dont les paramtres cintiques et les mcanismes intrinsques de rgulation sont diffrents. Comme nous lavons vu dans le chapitre 3, lactivit dun enzyme dpend de sa concentration. Le mcanisme le plus vident de rgulation de lactivit consiste donc dans la rgulation de la concentration de la protine. Une diminution ou une augmentation de la quantit denzyme, entrane une modification de lactivit puisque celle-ci est directement proportionnelle la concentration denzyme. La quantit d'un enzyme prsente dans une cellule un moment donn dpend de la balance entre la synthse et la dgradation de cette protine. La biosynthse des protines est contrle aux diffrents stades de la transcription, de la traduction ou de leurs modifications post-traductionnelles mais la dgradation cellulaire des protines est galement un processus rgul dont la vitesse est module notamment par la nature de lacide amin N-terminal. La complexit des machineries cellulaires impliques dans les processus de synthse et de dgradation des protines implique que ce mode de rgulation est lent. Il ne permet pas une cellule de ragir rapidement un changement de conditions, mais il permet certainement une rgulation long terme. Plusieurs modes de rgulation intrinsques de lactivit des enzymes permettent une adaptation plus rapide un changement intervenant dans les conditions cellulaires. Un premier type de modification directe de lactivit de lenzyme consiste dans la modification covalente et rversible de la protine. Les proprits catalytiques de nombreux enzymes sont affectes par la modification covalente dun groupe de la protine, comme par exemple la fixation dun groupe phosphate. Gnralement ces modifications sont elles-mmes catalyses par un enzyme (kinase) et les ractions inverses sont catalyses par un autre enzyme (phosphatase). Celles-ci permettent de restaurer ltat initial de la protine. Un second mode de rgulation intrinsque de lactivit est lactivation protolytique. Ce mode dactivation irrversible permet de convertir la forme inactive dun enzyme en une forme active. Il est largement utilis dans la production de protases dont lactivit doit s'exercer lextrieur de la cellule, comme dans le cas des enzymes digestives (trypsine, chymotrypsine) ou des enzymes de rgulation de la coagulation du sang ou de lapoptose. Finalement, lactivit enzymatique peut tre rgule par la fixation dun ligand sur la protine. Nous avons dj discut des mcanismes dinhibition mais il
296
existe galement un mcanisme de contrle allostrique reposant sur la fixation dune petite molcule sur un site distinct du site actif qui induit un changement de lactivit de lenzyme. La rgulation par la fixation de petites molcules reprsente un moyen important de contrle de lactivit de nombreux enzymes dont nous allons discuter dans ce chapitre.
9.1.3. Inadquation de lquation de MICHAELIS et MENTEN pour dcrire les mcanismes de rgulation
Nous devons maintenant nous demander si un enzyme qui obit aux lois ordinaires de la cintique enzymatique peut tre rgul suffisamment prcisment pour viter les cycles futiles. Pour un enzyme qui obit lquation de MICHAELIS et MENTEN, v = V [ A ] ( Km + [ A ]) , un simple calcul montre que la vitesse est gale 0,1 quand [ A ] = Km 9 et quelle est gale 0,9 V quand [ A ] = 9 Km . En dautres termes, une norme augmentation de la concentration de substrat, 81 fois, est ncessaire pour provoquer une augmentation modeste de la vitesse de 10% 90% de la vitesse limite. Un rsultat essentiellement similaire est obtenu pour linhibition simple. Supposons quune raction soit inhibe de manire comptitive en accord avec lquation V [ A] . Le rapport des vitesses en prsence (n ) et en absence v= [ I ] Km 1 + + [ A] Kic Km + [ A ] qui a une valeur de 0,1 (n0) dinhibiteur peut scrire v = [ I ] v0 Km 1 + + [ A] Kic
[ A] Kic [ A ] quand [ I ] = 9 Kic 1 + et de 0,9 quand [ I ] = : encore une 1 + 9 Km Km fois, une variation de la concentration de 81 fois est ncessaire pour balayer la gamme allant de 10% 90% de la vitesse limite.
Mme si nous considrons leffet de deux ou de plusieurs inhibiteurs agissant en parallle, la mme conclusion quantitative simpose : une grande variation de lenvironnement a des effets modestes sur la vitesse de la raction. Cest pourtant exactement loppos de ce qui est ncessaire pour une rgulation efficace du mtabolisme ; dun ct la concentration des principaux mtabolites doit tre maintenue dans des limites troites, et dun autre ct les vitesses de raction doivent tre susceptibles de varier normment probablement plus que la gamme allant de 10 90% que nous venons d'voquer en rponse des fluctuations lintrieur de ces limites troites.
297
9.1.4. La cooprativit
Clairement, les lois ordinaires de la cintique enzymatique sont inadaptes pour permettre le contrle ncessaire du mtabolisme. Au contraire, de nombreux enzymes qui semblent jouer un rle important dans la rgulation mtabolique prsentent la proprit de rpondre avec une exceptionnelle sensibilit aux changements de concentration des mtabolites. Cette proprit est connue sous le nom de cooprativit, parce quelle peut tre considre comme provenant dune coopration entre les sites actifs denzymes polymriques. Comme illustr dans la figure 9.1, le graphique de la vitesse en fonction de la concentration de substrat prsente une forme sigmode (en forme de S) caractristique, trs diffrente des hyperboles rectangulaires dcrivant lquation de MICHAELIS et MENTEN. Il faut noter en particulier que la partie la plus pentue de la courbe est dcale par rapport lorigine, vers une concentration positive, typiquement une concentration comprise dans la gamme des concentrations physiologiques du mtabolite concern. Un thme majeur de ce chapitre est dexaminer les thories qui ont t proposes pour rendre compte de la cooprativit ou, en dautres termes, pour expliquer la forme des courbes telles que celles de la figure 9.1. Evidemment, avant dappliquer une de ces thories un exemple exprimental de courbe sigmode, chacun devrait sassurer que celle-ci est relle et non un artfact, comme dans le cas prsent dans le 7.5.2 et discut en dtails par DUGGLEBY (1994).
v/V 1 Hyperbolique (MICHAELIS-MENTEN)
0,8
0,6
Sigmodal (cooprative)
v/V 1 MICHAELIS-MENTEN
0,4
0,5
cooprative
0,2
1 8
log[A]
10
[A] (units arbitraires)

9.1 - Comparaison dune courbe hyperbolique de la vitesse en fonction de la concentration de substrat avec deux courbes sigmodes (coopratives), calcules avec des coefficients de HILL (voir 9.2.1 ci-dessous) de 2 et de 4 Il faut noter que toutes ces courbes sont sigmodes quand elles sont retraces comme une fonction du log [ A ] (insert) mais les courbes coopratives sont plus pentues.
298
9.1.5. Interactions allostriques

La conversion du fructose 6-phosphate en fructose 1,6-biphosphate illustre un autre aspect important de la rgulation mtabolique, nommment que les produits immdiats et ultimes dune raction sont habituellement diffrents. Bien que lATP soit un substrat de la phosphofructokinase, leffet de la glycolyse dans sa totalit est de produire de lATP, et cela en trs grande quantit si nous considrons que la glycolyse est une voie menant au cycle des acides tricarboxyliques et aux phosphorylations oxidatives. Donc, lATP doit tre considr comme un produit de la glycolyse, mme sil est un substrat de lun des principaux enzymes rgulant la glycolyse. En consquence, linhibition ordinaire par le produit de la phosphofructokinase fonctionne de manire oppose ce qui est ncessaire pour une rgulation efficace. Pour permettre un apport constant dnergie mtabolique, la phosphofructokinase doit galement tre inhibe par le produit final de la voie mtabolique, lATP, comme cest le cas dans la ralit. Ce type dinhibition ne peut toutefois pas se raliser par les mcanismes habituels, cest--dire par lintermdiaire de la fixation de linhibiteur agissant comme un analogue du substrat. Dans un certain nombre de cas, cela entranerait un effet oppos celui recherch ; dans dautres cas, le produit final de la voie mtabolique peut avoir une ressemblance structurale limite avec les ractifs de lenzyme rgul ; par exemple, lhistidine partage peu de similarits structurales avec le phosphoribosyl-pyrophosphate, son prcurseur mtabolique. Pour permettre une inhibition ou une activation par des effecteurs appropris la voie mtabolique, de nombreux enzymes rguls ont acquis des sites pour la fixation de linhibiteur qui sont distincts des sites catalytiques. MONOD, CHANGEUX et JACOB (1963) ont propos que ceux-ci sappellent des sites allostriques, du Grec signifiant une forme diffrente 1, pour mettre en vidence la diffrence structurale entre substrat et effecteur, et que les enzymes qui possdent de tels sites sappellent des enzymes allostriques. De nombreux enzymes allostriques sont galement coopratifs, et vice versa. Cette dualit nest pas surprenante puisque les deux proprits sont importantes pour la rgulation mtabolique, mais elle ne signifie pas que les deux termes sont interchangeables : ces deux termes dcrivent deux proprits diffrentes qui devraient tre clairement distingues. Dans de nombreux cas, elles ont t identifies sparment : la cooprativit de lhmoglobine tait connue depuis plus de 60 ans lorsque leffet allostrique du 1,2-biphosphoglycrate a t dcrit ; le premier enzyme dans la voie de biosynthse de lhistidine a t un des premiers enzymes allostriques reconnus, mais aucune phnomne de cooprativit na pu tre observ.
1. La traduction littraire est un autre solide , mais une forme diffrente transmet mieux lide essentielle que linhibition ne rsulte pas dune quelconque similarit structurale entre le substrat et leffecteur.
299
9.2. LE DVELOPPEMENT DE MODLE

EXPLIQUANT LA COOPRATIVIT
9.2.1. Lquation de HILL
Il est souvent pratique dexprimer le degr de cooprativit dun enzyme en terme de lquation suivante :
v =
V [ A ]h h K0 ,5 + [ A ]h
[9.3]
Celle-ci est connue sous le nom dquation de HILL, puisquune quation similaire avait t propose par HILL (1910) pour dcrire de manire empirique la fixation cooprative de loxygne sur lhmoglobine. Le paramtre V joue le mme rle que la vitesse limite dans lquation de MICHAELIS et MENTEN, et est connu sous le mme nom. Par contre, bien que K0,5 comme K m dans lquation de MICHAELIS et MENTEN, dfinit la valeur de la concentration de substrat [ A ] pour laquelle v = 0,5 V, ce paramtre ne doit tre ni appel constante de MICHAELIS, ni dsign par le symbole Km, parce que ceux-ci font spcifiquement rfrence lquation de MICHAELIS et MENTEN, et que lquation [9.3] nest pas quivalente lquation de MICHAELIS et MENTEN (sauf dans le cas trivial o h = 1). Lquation de HILL h est souvent crite avec le symbole K0 ,5 remplac par une constante qui nest pas leve la puissance h : bien que cette pratique ne pose aucun problme pratique dutilisation de lquation, elle a le dsavantage de produire une constante qui a les dimensions d'une concentration leve la puissance h, laquelle il est difficile de donner une interprtation physique. HILL considrait son quation comme purement empirique et dniait toute signification physique au paramtre h, qui est maintenant couramment appel le coefficient de HILL. Bien que lon trouve parfois des tentatives de driver cette quation partir dun modle, il est prfrable de sen tenir son exemple. Lquation de HILL, avec une valeur entire de h, peut correspondre au cas limite dun modle physique de fixation de substrat, mais le h obtenu exprimentalement est rarement un nombre entier, et, sauf dans les limites de modles ralistes, ne doit pas prendre une valeur entire. Il est donc incorrect de traiter ce paramtre comme une estimation du nombre de sites de fixation du substrat sur lenzyme, bien que pour certains modles, il fournisse une valeur maximale pour ce nombre. Les valeurs typiques de h pour lhmoglobine sont denviron 2,7, alors que le nombre de sites de fixation de loxygne (nombre qui tait inconnu de HILL) est de quatre. Si lquation [9.3] est rarrange comme suit :
v = [ A ]h h V v K0 ,5
[9.4]
300
le rapport v ( V v ) peut tre considr en absence de mesure directe de la fixation comme une mesure du rapport [ EA ] [ E ] , et si nous prenons le logarithme de chaque ct de lquation, nous obtenons :
log
v = h log [ A ] h log K0 ,5 V v
[9.5]
Lquation [9.5] montre quun graphique de log v ( V v ) en fonction de log [ A ] est linaire avec une pente gale h. Ce graphique, illustr dans la figure 9.2, est appel un graphique de HILL. Il fournit un moyen simple dvaluer les valeurs de h et de K 0h,5 . Ce graphique de HILL permet de reprsenter une grande varit de donnes de cintique cooprative pour des valeurs de v V comprises entre 0,1 et 0,9, malgr que des dviations soient toujours visibles aux extrmits du graphique (comme le montre la figure 9.2) parce que lquation [9.3] nest seulement quune approximation acceptable dune relation plus complexe.
log [v/(V v)]
2
v/V 1
0,5
8 [A] Asymptotes de pente = 1 90% saturation
0 Aux extrmits les points s'cartent de la droite de pente = 1
10% saturation 2 1 0 1
log[A]
9.2 - Graphique de HILL en insert, le graphique correspondant en coordonnes linaires Les droites sont calcules partir de lquation de HILL [9.13] mais les points sont calculs partir dune fonction raliste de fixation. Comme lquation de HILL reprsente au mieux une approximation, nous devrions toujours nous attendre ce que les valeurs observes tendent vers une pente de un aux extrmits de la gamme de [ A ], quelle que soit la pente de la rgion centrale. Cependant, mme en absence derreur exprimentale, les dviations de la linarit sont souvent faibles, en particulier dans la partie de la courbe comprise entre 10 et 90% de la saturation, qui correspond la partie non-ombre du graphique.
Le coefficient de HILL est largement utilis comme un index de la cooprativit, une augmentation du degr de cooprativit allant de paire avec une augmentation de la valeur de h. Pour un enzyme non-coopratif (modle de MICHAELIS et
301
MENTEN), h = 1 et donc une cooprativit positive signifie que h est plus grand que 1. Une cooperativit ngative, avec h infrieur 1, est aussi observe avec certains enzymes, bien que cette situation soit moins commune (du moins pour des enzymes purifis), et que son rle physiologique soit moins clair.
9.2.2. Un autre index de cooprativit

Lindex de cooprativit, Ra, introduit par TAKETA et POGELL (1965) est moins couramment utilis que le coefficient de HILL, mais il prsente les avantages davoir une signification exprimentale plus claire et dtre toujours trait comme un paramtre purement empirique, ce qui vite toute confusion avec des paramtres issus de modles dont la validit est douteuse. Ce paramtre est dfini comme le rapport des valeurs de [ A ] pour lesquelles v V = 0,9 et v V = 0,1. La relation entre Ra et h est obtenue en substituant successivement ces deux valeurs de v V dans lquation [9.3] : h [ A ]0 ,9 0 ,9 = [9.6] h h ( K0 ,5 + [ A ]0 ,9 )
0 ,1 =
h [ A ]0 ,1 h h ( K0 ,5 + [ A ]0 ,1 )
[9.7]
et en rsolvant pour les deux valeurs de [ A ] :
[ A ]0 ,9 = 91 h K0 ,5
[ A ]0 ,1 = K0 ,5 91 h
[9.8] [9.9]
Ensuite, la valeur de Ra est facilement obtenue comme le rapport [ A ]0 ,9 [ A ]0 ,1 :
Ra = 811 h
[9.10]
Les enzymes non-coopratifs se caractrisent par une valeur de Ra = 81, alors que les enzymes coopratifs ont des valeurs de Ra, infrieures 81 et les enzymes cooprativit ngative ont des valeurs suprieures 81. Cette relation nest pas plus prcise que lquation [9.3], bien entendu, mais elle est adapte la plupart des situations rencontres. Quelques valeurs reprsentatives de Ra sont prsentes dans le tableau 9.1.
9.2.3. Hypothse dun quilibre de fixation dans les cintiques coopratives

En discutant les cintiques non-coopratives, nous avions soulign ( 3.6.1) que limpossibilit de prsumer que la fixation du substrat est lquilibre, empche dassimiler la constante de MICHAELIS, Km , la constante de dissociation thermodynamique du substrat.
302
CINTIQUE ENZYMATIQUE Tableau 9.1 - Relation entre deux index de cooprativit h Ra 6560 1520 533 243 132 81 18,7 9,00 5,80 4,33 3,51 3,00 2,41 2,08 1,73 1,55 1,34 1,25 1,092 1,045 1,0044 Description
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 5,0 6,0 8,0 10 15 20 50 100 1000
Cooprativit ngative
Non-coopratif
Cooprativit positive (gamme normale pour des enzymes individuels)
Cooprativit extrme (en dehors de la gamme accessible pour des enzymes individuels)
Le tableau montre la relation entre le coefficient de HILL, h, et lindex de cooprativit Ra. Les valeurs sont calcules en faisant lhypothse que lquation de HILL (quation [9.3]) est valable. Trs peu denzymes individuels prsentent une cooprativit suprieure celle obtenue pour 4. Cependant, il ny a presque aucune limite la sensibilit de la rponse qui rsulte de laction de cascades denzymes convertibles et la partie infrieure du tableau est ajoute pour faciliter la discussion de systmes de ce genre.
En principe, les mmes arguments sappliquent aux enzymes qui nobissent pas aux lois de MICHAELIS et MENTEN. Une seule concession peut tre faite dans le cas des enzymes coopratifs. Nous pouvons supposer que lacquisition dune activit catalytique leve a eu moins dimportance au cours de lvolution que lacquisition dun comportement rgul. Ainsi, il est un peu moins vident que les constantes de vitesse catalytiques de ces enzymes aient volu jusqu atteindre les limites imposes par la chimie tout en restant lintrieur des contraintes imposes par la structure. De toute manire, il est virtuellement impossible dobtenir des quations de vitesse utilisables pour un systme coopratif, moins que des hypothses soient introduites pour simplifier le systme. Lhypothse de ce type la plus couramment utilise consiste considrer que la fixation du substrat est
303
lquilibre. Normalement la seule occasion o cette hypothse nest pas invoque, est celle o la cooprativit est entirement dorigine cintique ( 9.6.) En dehors, de ce cas particulier, RICARD et ses collaborateurs ont essay de dvelopper un authentique traitement de la cintique dinteractions entre les sites (RICARD et CORNISH-BOWDEN, 1987), mais cette proposition na pas t adopte par dautres groupes, certainement parce que ce traitement gnre des quations complexes, et quil est presque impossible dobtenir des donnes exprimentales suffisamment prcises pour justifier cette complexit Un exemple des efforts consentis pour appliquer ces ides un enzyme ttramrique, comme la fructose bisphosphatase des chloroplastes dpinards, est prsent dans la publication de GIUDICI-ORTICONI et al. (1990.) En rsum, bien que nous considrions que lhypothse de fixation lquilibre repose sur une base thorique limite, nous lutiliserons, par souci de simplification, dans le reste de ce chapitre pour discuter des cintiques denzymes oligomriques.
9.2.4. Lquation dADAIR

Supposons quun enzyme possde deux sites actifs qui fixent le substrat indpendamment et lquilibre, avec des constantes de dissociation Ks1 et Ks2, comme le montre le schma de la figure 9.3.
9.3 - Fixation du substrat sur deux sites indpendants
A + A+E
Ks1
A + EA
Ks2
Ks2
A EA
A + EA
Ks1
Si la mme raction chimique se droule indpendamment dans les deux sites avec des constantes de vitesse k1 et k2, chaque site obira alors de faon indpendante au modle de MICHAELIS et MENTEN avec une constante de MICHAELIS gale la constante de dissociation approprie, et avec une vitesse globale correspondant la somme des vitesses pour les deux sites : k [ E ]0 [ A ] k 2 [ E ]0 [ A ] v = 1 + [9.11] Ks 1 + [ A ] Ks 2 + [ A ] La vitesse limite est la somme des vitesses limites pour chacun des deux sites, c'est--dire V = k1 [ E ]0 + k 2 [ E ]0 . Si nous supposons, par simplicit, que les constantes catalytiques sont gales, alors nous pouvons crire que k1 [ E ]0 = k 2 [ E ]0 = V 2 , et lquation [9.11] peut tre crite de la faon suivante :
v V 2
[ A] [ A] + Ks 1 + [ A ] Ks 2 + [ A ]
[9.12]
Cette quation correspond lanalyse de la dissociation de proton en termes de constantes de dissociation ( 8.2.4), mais le mme modle peut tre exprim en fonction des constantes de dissociation molculaire ( 8.2.5) :
304
[ A ] [ A ]2 + K1 K1 K 2 v = V 2[ A ] [ A ] 2 + 1+ K1 K1 K 2
[9.13]
Dans lquation [9.13], K1 caractrise la fixation de la premire molcule de substrat (sans tenir compte du site) et K2 caractrise la fixation de la seconde molcule, c'est--dire K1 = ( 2[ E ][ A ]) [ EA ] et K 2 = ([ EA ][ A ]) 2[ EA2 ] . La relation entre ces constantes et les constantes de dissociation pour chaque site est donne ci-dessous dans lquation [9.16]. Lquation [9.13] est connue sous le nom dquation dADAIR, puisque ADAIR (1925) a exprim la fixation de loxygne sur lhmoglobine en utilisant une quation de la mme forme gnrale. Cette premire quation tait nanmoins crite pour quatre sites de fixation plutt que pour deux, puisque lhmoglobine peut fixer jusqu quatre molcules doxygne :
[ A ] 3[ A ] 2 [ A ]4 3[ A ]3 + + + K1 K1 K 2 K1 K 2 K3 K1 K 2 K3 K 4 Y = 2 [ A ]4 4[ A ] 6[ A ] 4[ A ]3 1+ + + + K1 K1 K 2 K1 K 2 K3 K1 K 2 K3 K 4
[9.14]
En plus dtre crite pour quatre sites de fixation, lquation [9.14] se caractrise par le remplacement du paramtre v V par un paramtre Y, appel fraction de saturation parce quil reprsente la fraction des sites de fixation qui sont occups par le ligand. Tout ceci dcoule du fait que dans une authentique exprience de fixation, il ny a pas de vitesse, et par consquent pas de vitesse limite. Nanmoins, parce quil est difficile de mesurer directement la fixation dun ligand avec une prcision suffisante, une pratique courante consiste mesurer dautres variables, que se soient des vitesses ou des signaux spectroscopiques, pour ensuite les interprter comme des mesures de fixation. Dans le cas de la mesure de vitesses, nous avons dj discut dans le prcdent du problme de dterminer si la raction de fixation peut tre considre dans un tat dquilibre ou dans un tat stationnaire, et nous ne reviendrons donc pas sur ce point. Un second problme est de savoir si une mesure de v V peut tre assimile une mesure de Y. Cette assimilation revient supposer que tous les sites actifs ont la mme constante catalytique : nous avions fait cette hypothse pour passer de lquation [9.11] lquation [9.12], mais aucune raison ne permet daffirmer que cette supposition est gnralement vraie, dautant quelle devient de moins en moins plausible lorsque nous considrons des modles comportant un plus grand nombre de sites de fixation et des diffrences plus marques entre leurs constantes de fixation. La mme complication survient si un signal spectroscopique est trait comme une mesure de fixation ; le problme est nanmoins moins critique puisque, si la variation entre les constantes catalytiques pour diffrents sites peut tre importante, il est raisonnable de supposer que les effets spectroscopiques de la fixation sont similaires pour les diffrents sites concerns, mme sils ne sont pas tout fait identiques.
305
Il est utile dexaminer lquation [9.14], lquation pour quatre sites de fixation, puisquelle illustre mieux que lquation [9.13] la forme gnrale de lquation dADAIR pour un nombre arbitraire n de sites, et quelle montre de manire plus explicite que les coefficients numriques du numrateur (1,3,3,1) et du dnominateur (1,4,6,4,1) sont respectivement les coefficients binomiaux de n 1 et de n. ( n 1 )! pour i allant de 0 Les coefficients du numrateur sont donns par i!( n 1 i )! ( n )! n 1, et les coefficients du dnominateur sont donns par pour i allant i!( n i )! de 0 n. Ces coefficients sont souvent considrs comme des facteurs statistiques . Ainsi, il existe quatre faons de fixer une molcule de substrat sur une molcule denzyme possdant quatre sites vacants, mais une seule faon de dissocier une molcule de substrat partir dun complexe ayant fix une seule molcule de substrat : de cette situation rsulte le facteur 4/1 (cest--dire 4) du dnominateur. De la mme manire, il existe trois faons de fixer une seconde molcule de ligand, mais uniquement deux faons de dissocier une molcule partir dun complexe ayant fix deux molcules. Il en rsulte que le facteur 4 prcdent est multipli par 3/2, donnant un facteur 6, et ainsi de suite. La manire particulire utilise ici pour crire lquation dADAIR, dans les quations [9.13] et [9.14], est choisie de sorte que les constantes de dissociation soient gales si tous les sites sont identiques et ninteragissent pas. Cette proprit est trs utile si nous souhaitons quantifier le degr de divergence par rapport cette simple supposition. Les constantes dfinies de cette manire sont parfois appeles des constantes intrinsques, mais parce que ce nom est galement employ pour dsigner les paramtres que nous avons appels constantes de dissociation dun groupe, nous viterons son emploi. Diverses variantes dans lcriture de lquation d'ADAIR sont rencontres dans la littrature, qui utilisent des coefficients numriques diffrents (de telle sorte que les constantes de dissociation ne sont plus gales les unes aux autres, mme dans le cas le plus simple), ou qui utilisent des constantes dassociation plutt que de dissociation, ou encore dans lesquelles les produits de constantes dassociation sont remplacs par des symboles spciaux, 1 comme par exemple : Y3 . Lutilisation des constantes dassociation est K1 K 2 K3 une pratique courante dans la littrature concernant lhmoglobine et dans dautres publications dont laccent est mis sur la fixation plutt que sur la cintique. Considrant, dans un souci de simplicit, le cas dun enzyme deux sites de fixation, la relation entre les constantes molculaires de dissociation de lquation [9.13] et les constantes de dissociation des deux groupes de lquation [9.12] peut tre obtenue en comparant lquation [9.13] avec une autre version de lquation [9.12] :
306
( Ks 2 + Ks1 )[ A ] [ A ] 2 + 2 Ks 1 Ks 2 Ks 1 Ks 2 v = ( Ks 2 + Ks1 )[ A ] [ A ] 2 V + 1+ Ks 1 Ks 2 Ks 1 Ks 2
Ainsi :
[9.15]
1 = 1 1 + 1 2 Ks 1 Ks 2 K1
[9.16a]
[9.16b] K 2 = 1 ( Ks 1 + Ks 2 ) 2 c'est--dire que K1 est la moyenne harmonique et K2 la moyenne arithmtique des constantes de dissociation de chaque groupe. Il est vident, partir de la conception ordinaire de la moyenne, que les valeurs de K1 et K2 sont gales lune lautre et aux constantes de dissociation des groupes, si ces dernires sont gales lune lautre. Une relation plus intressante est celle obtenue lorsque les constantes de dissociation de chacun des groupes sont diffrentes. Celle-ci est obtenue en considrant le rapport K 2 K1 obtenu partir des quations [9.16a] et [9.16b] :
K2 K K = 1 2 + s 2 + s1 K1 Ks 1 Ks 2 4
[9.17]
Puisque le deuxime et le troisime termes de cette quation varient de manire oppose quand le rapport Ks 2 Ks1 varie, nous pourrions imaginer, premire vue, que la valeur du rapport K 2 K1 peut tre soit plus grande, soit plus petite que 1. En fait, la situation est plus simple parce que pour un nombre positif et sa rciproque, le nombre le plus grand est plus loign de 1 que ne lest le plus petit (par exemple 3 est plus loign de 1 que ne lest 1/3) et, en consquence, la somme dfinie par lquation [9.17] ne peut pas tre infrieure 1 ou :
K1 K 2
[9.18]
Pratiquement, cela signifie que la seconde molcule se fixera toujours moins fermement que la premire, exactement comme nous le prsentons dans les expriences de la vie courante avec des objets notre chelle : il est plus facile de dtacher quelque chose qui est attach de manire peu solide que quelque chose qui est fix plus fermement. Les implications de lquation [9.18] pour la cooprativit ne sont pas faciles driver algbriquement, mme en utilisant lindex de cooprativit de TAKETA et POGELL ( 9.2.2), parce que, rsoudre lquation 9.13 pour [ A ] aprs avoir fix v V gal 0,1 ou 0,9, conduit des expressions dont les significations ne sont pas claires. Nanmoins, il est facile de dmontrer numriquement, en calculant les courbes pour diffrentes valeurs de K 2 K1 , quaussi longtemps que lquation [9.18] est respecte, le rsultat est toujours une cooprativit ngative, c'est--dire que Ra > 81 ou que h < 1 (voir lquation [9.10]). En conclusion, lhypothse
307
implique dans le schma de la figure 9.3 ne permet pas dexpliquer une cooprativit positive. Le problme ne rside pas dans l'hypothse dune fixation sur deux sites, qui est raisonnable, mais rside dans l'hypothse que la fixation est indpendante, c'est--dire quun processus de fixation na pas dinfluence sur lautre. En exprimant cela de manire oppose, nous pouvons dire que lorsque nous observons une cooprativit positive, nous pouvons tre certain que la fixation sur des sites diffrents nest pas indpendante. (La cooprativit ngative peut galement impliquer des interactions entre les sites, mais, linverse de la cooprativit positive, cette implication nest pas obligatoire.)
9.2.5. Dfinitions mcaniques et oprationnelles de la cooprativit

Lquation dADAIR, [9.13], est plus gnrale que le modle partir duquel nous lavons drive, puisquelle peut toujours dfinir le comportement du systme mme si lquation [9.18] nest pas respecte. En pratique, elle est le plus souvent utilise pour dcrire une cooprativit positive quune cooprativit ngative. Elle permet de donner une dfinition mcanique de la cooprativit qui peut tre compare avec la dfinition purement empirique en terme de Ra ( 9.2.2) ou avec la dfinition pseudo-mcanique en termes de h ( 9.2.1). Dun point de vue qualitatif, les trois dfinitions sont quivalentes, du moins si nous considrons uniquement des enzymes deux sites de fixation : si nous dfinissons la cooprativit positive par la relation K2 < K1, alors cela implique que Ra < 81 et que h > 1. Les choses se compliquent lorsquil existe plus de deux sites de fixation, puisquil est possible, avec des quations telles que lquation [9.14], davoir des relations telles que K1 > K2 K3 < K4 comme cest le cas pour la fixation du NADox sur la glycraldehyde-3-phosphate dshydrognase de la levure (COOK et KOSHLAND, 1970). Dun point de vue mcanique, cest clairement un mlange de cooprativit positive et de cooprativit ngative, mais un tel mlange nest pas possible avec le paramtre Ra, puisque ce dernier est un nombre unique qui doit tre soit suprieur, soit infrieur 81, mais qui ne peut pas tre simultanment suprieur et infrieur. Cette situation nest donc pas satisfaisante, et nous pouvons nous demander sil nest pas possible de donner une dfinition oprationnelle de la cooprativit qui rende compte de la complexit rencontre dans la nature. WHITEHEAD (1978) a fait remarquer que le coefficient de HILL fournit une telle dfinition. Considrons la (1 y ) , qui est une constante quivalente la constante de quantit Q = [ A ] y dissociation si le systme ne comprend quun seul site de fixation, ou sil comprend n sites identiques et indpendants (c'est--dire si toutes les constantes dADAIR satisfont la relation K1 = K2 = = Kn). Toutefois, si Q diminue lorsque [ A ] augmente, c'est--dire si dQ d [ A ] est ngatif, alors il est clair que la fixation devient progressivement plus forte lorsqu'une plus grande proportion de ligand se fixe ; il est alors raisonnable de dire que le systme prsente une cooprativit positive la
308
valeur particulire de [ A ] laquelle une valeur ngative de dQ d [ A ] a t observe. Les systmes non coopratifs et cooprativit ngative peuvent tre dfinis de faon similaire. Pour toute fonction de fixation, le signe de dQ d [ A ] est oppos celui de (h 1) ; c'est--dire que dQ d [ A ] est ngatif, gal zro ou positif selon que la valeur de h est suprieure, gale ou infrieure 1 ; en consquence, une dfinition de la cooprativit en termes de coefficient de HILL est exactement quivalente la dfinition plus rationnelle propose par WHITEHEAD. Cette conclusion est entirement indpendante de toute considration concernant la validit physique ou descriptive de lquation de HILL. La dfinition de la cooprativit, tablie sur la base du coefficient de HILL nest pas ncessairement quivalente une dfinition tablie sur la base des constantes dADAIR, sil existe plus de deux sites. Il est alors ncessaire de considrer quelle relation relie ces deux dfinitions. CORNISH-BOWDEN et KOSHLAND (1975) ont explor cette question un niveau purement descriptif, et ils ont dcouvert quil existe une correspondance proche mais pas exacte, entre elles. En guise dexemple, considrons les donnes prsentes dans la figure 9.4. La courbe a une pente suprieure 1 pour les faibles concentrations de ligand, en accord avec la relation K1 > K2 K3 < K4 mentionne au dbut de ce paragraphe, qui avait t obtenue en ajustant les donnes sur lquation dADAIR.
log[y(1 y)] 1
2 6 5 4 3
log[NADox]
9.4 - Graphique de HILL pour la fixation du NADOX sur la glycraldhyde 3-phosphate dshydrognase Le graphique prsente les donnes de COOK et KOSHLAND (1970) recalcules comme dcrit par CORNISH-BOWDEN et KOSHLAND (1975). La forme de la courbe suggre que les constantes dADAIR (dans lquation [9.15]) satisfont la relation K1 > K2 K3 < K4, en accord avec les valeurs suivantes obtenues par ajustement de la courbe (CORNISH-BOWDEN et KOSHLAND, 1975) : K1 = 0,217 mM, K2 = 0,0067 mM, K3 = 0,013 mM, K4 = 0,286 mM.
309
CORNISH-BOWDEN et KOSHLAND ont examin de nombreux graphiques de HILL, et ont observ que ce type de correspondance sappliquait dans la plupart des cas. En rsum, bien que les dfinitions de la cooprativit bases sur le graphique de HILL et sur lquation dADAIR ne soient pas exactement quivalentes, elles sont qualitativement similaires et il ny a aucune difficult continuer de les utiliser comme des dfinitions acceptables : la dfinition du graphique de HILL sapplique de manire plus gnrale, mais la dfinition de lquation dADAIR a une meilleure signification physique dans les circonstances o elle peut tre utilise. Malheureusement, il nexiste aucune procdure simple qui permette partir dun ensemble de constantes dADAIR dobtenir les paramtres de lquation de HILL qui reprsentent au mieux les donnes. Non seulement il nexiste pas de correspondance exacte entre les mesures de la cooprativit, comme nous venons den discuter, mais il nest mme pas facile de calculer la concentration de demi-saturation (K0.5 dans lquation [9.3]), except dans certains cas ; le mieux que lon puisse dire est que la valeur ainsi calcule se trouve dans la gamme des constantes dADAIR (elle est plus petite que la plus grande et plus grande que la plus petite). Ce constat est particulirement dcevant si nous considrons que la concentration de demisaturation, comme le coefficient de HILL lui-mme, est un paramtre exprimental important qui est trs utile pour comparer les courbes entre elles.
9.3. AJUSTEMENT INDUIT

Les premires thories dcrivant la cooprativit de lhmoglobine supposaient que les sites de fixation de loxygne sur chaque molcule devaient tre suffisamment proches les uns des autres pour interagir lectroniquement. Cette hypothse a t expose explicitement par PAULING (1935), mais elle tait dj contenue dans les ides de HILL et dADAIR. En effet, si les sites de fixation sont proches les uns des autres, il ny a pas de problmes mcaniques pour expliquer la cooprativit : il nest pas ncessaire, par exemple, de considrer un mcanisme de changement de conformation ou tout autre mcanisme exotique pour expliquer qu'une molcule de quinone fixe 0 ou 2 atomes dhydrogne, et non 1, c'est--dire pour expliquer que la fixation des atomes dhydrogne sur la quinone est caractrise par un coefficient de HILL gal 2. Toutefois, quand la structure tridimensionnelle de lhmoglobine a t dtermine (PERUTZ et al., 1960), il est clairement apparu que les groupes hminiques sont distants de 2,5-4,0 nm, c'est--dire quil sont trop loigns pour interagir par nimporte laquelle des manires qui avaient t envisages. Malgr tout, des interactions longue distance se produisent dans toutes les protines cooprativit positive, et probablement dans la plupart des autres cas galement, et toutes les thories modernes expliquent celles-ci par la flexibilit de la protine. Dans ce sens limit, elles drivent de la thorie de lajustement induit de KOSHLAND (1958, 1959), et le thme de ce est dexaminer les bases exprimentales et conceptuelles de cette thorie.
310
Le haut degr de spcificit que les enzymes montrent pour leur substrat a impressionn les biochimistes depuis le dbut de l'tude des enzymes, longtemps avant que ne soient connues leurs structures physiques et chimiques. FISCHER (1894) tait particulirement impressionn par la capacit des organismes vivants distinguer totalement des molcules de sucre qui diffrent lgrement et des positions trs loignes des sites de raction. Pour expliquer cette capacit, il proposa que le site actif dun enzyme soit lemprunte ngative de son (ses) substrat(s), et quil catalyse les ractions uniquement avec les composants qui sy insrent prcisment. Cela est similaire au mode dinteraction par lequel une clef sinsre dans une serrure, et cette thorie daction enzymatique est connue sous le nom de modle clef-serrure de FISCHER ( 3.1.2 et figure 3.2). Pendant de nombreuses annes, cette thorie semblait expliquer tous les faits connus de la spcificit enzymatique, mais lorsque des recherches plus dtailles furent effectues, il y eut de plus en plus dobservations qui taient difficiles expliquer avec un site actif rigide, comme FISCHER lavait envisag dans sa thorie. Par exemple, lexistence denzymes pour des ractions impliquant deux substrats, dans lesquelles les substrats doivent se fixer dans un ordre prcis, fournit une preuve de ce problme, comme nous en avons discut dans le 6.2.1. Un exemple plus frappant, remarqu par KOSHLAND, tait labsence de ractivit de leau dans diffrentes ractions catalyses par des enzymes, o le modle clef-serrure prdit une raction. Considrons, par exemple, la raction catalyse par lhexokinase de levure : Glucose + MgATP Glucose 6-phosphate + MgADP [9.21] Lenzyme de levure nest pas particulirement spcifique pour son substrat : il accepte non seulement le glucose, mais galement dautres sucres, comme le fructose ou le mannose. Toutefois, leau ne ragit pas, mme si elle peut difficilement ne pas saturer le site actif de lenzyme, avec une concentration de 55 M, environ 7 106 fois suprieure la constante de MICHAELIS pour le glucose, et que chimiquement, elle est au moins aussi ractive que les sucres qui ragissent. KOSHLAND proposa que cette observation et dautres constituaient une preuve vidente dun site actif flexible ; il proposa que le site actif dun enzyme a la capacit de sajuster prcisment au substrat, mais quil nadopte cette conformation complmentaire du substrat que lorsque ce dernier se fixe. Cet ajustement de conformation accompagnant la fixation du substrat conduit lalignement correct des groupes catalytiques de lenzyme avec le site de raction du substrat. Avec cette hypothse, les proprits de lhexokinase de levure peuvent tre facilement expliques : la molcule deau peut certainement se fixer dans le site actif de lenzyme, mais elle na pas une taille suffisante pour induire le changement de conformation ncessaire la catalyse. La thorie de KOSHLAND est connue sous le nom dhypothse de lajustement induit (figure 3.5), pour souligner ses diffrences avec la thorie de FISCHER, qui suppose que la complmentarit entre lenzyme et le substrat prexiste, et ne doit pas tre
311
induite. Lanalogie avec la complmentarit clef-serrure peut tre tendue, en assimilant le concept de KOSHLAND une serrure de type YALE, dans laquelle la clef ne peut sinsrer quen ralignant les gorges de la serrure, permettant ainsi, louverture de celle-ci. Nanmoins, une meilleure analogie est probablement celle dun gant, qui est capable de sajuster exactement une main, mais qui ne sajuste en ralit que lorsque la main est insre dans le gant. Cette analogie a le mrite additionnel dillustrer le caractre strochimique essentiel de la structure dun enzyme : mme si un gant gauche et un gant droit peuvent sembler similaires, un gant gauche ne peut pas sajuster une main droite. La thorie de lajustement induit a eu dimportantes consquences dans de nombreuses branches de lenzymologie (voir par exemple le 6.2.1), mais elle a t particulirement importante pour la comprhension des proprits allostriques et coopratives des protines, car elle fournit une explication simple et plausible des interactions longues distances. En considrant quune protine combine la rigidit avec une flexibilit contrle, comme une paire de ciseaux, un changement de conformation induit par le substrat se droulant dans une partie de la molcule peut se transmettre sur quelques nanomtres vers une autre partie.
9.4. MODLES MODERNES DE COOPRATIVIT

9.4.1. Le modle symtrique de MONOD, WYMAN et CHANGEUX
Les interactions coopratives observes avec lhmoglobine ne reprsentent pas un cas unique o des interactions existent entre des sites largement spars dans lespace ; des interactions longues distances existent aussi avec dautres protines coopratives, et avec de nombreux enzymes impliquant des effets allostriques. Un exemple frappant est celui de linhibition allostrique de la phosphoribosyl-ATPpyrophosphorylase par lhistidine. MARTIN (1963) a dcouvert quun traitement doux de cet enzyme par les ions Hg2+ dtruit la sensibilit de lactivit catalytique lhistidine, mais naffecte ni lactivit non-inhibe, ni la fixation de lhistidine. En dautres termes, lion mtallique ninterfre ni avec le site catalytique, ni avec le site allostrique, mais avec la connexion qui les relie entre eux. MONOD, CHANGEUX et JACOB (1963) ont tudi de nombreux exemples de phnomnes coopratifs et allostriques, et ont conclu que ces phnomnes sont fortement apparents et quils peuvent vraisemblablement sexpliquer par la flexibilit de la conformation de lenzyme. Plus tard, MONOD, WYMAN et CHANGEUX (1965) ont propos un modle gnral permettant dexpliquer les deux phnomnes par un simple ensemble de postulats. Il est souvent fait rfrence ce modle sous le nom de modle allostrique, mais le terme de modle symtrique est prfrable parce quil met en vidence la diffrence principale avec les modles alternatifs, et parce quil vite lassociation contestable des effets allostriques et coopratifs.
312
Le modle symtrique tire son origine de lobservation que chaque molcule dune protine cooprative typique contient plusieurs sous-units. En effet, cette caractristique est ncessaire pour expliquer la cooprativit de fixation lquilibre, mme si elle nest pas requise pour expliquer la cooprativit cintique, comme nous en discuterons dans le 9.6. Par souci de simplicit, nous dcrirons le modle symtrique pour la fixation dun substrat A sur une protine dont le nombre n de sous-units est 2 et en mentionnant les rsultats pour un nombre non-spcifi de sous-units, lorsque ceux obtenus avec n = 2 ne reprsentent pas de manire adquate le cas gnral. Tout nombre de sous-unit plus grand que 1 est possible, et nimporte quel autre type de ligand (inhibiteur ou activateur) peut remplacer un substrat. Le modle symtrique est bas sur les postulats suivants : Chaque sous-unit peut exister dans deux conformations distinctes, dsignes par R et par T. A lorigine, ces dnominations signifiaient respectivement relax et tendu, et dcoulaient de lide que la protine devait se relaxer afin de fixer le substrat, mais elles sont considres de nos jours uniquement comme des symboles. A tout moment, toutes les sous-units dune molcule doivent tre dans la mme conformation ; pour une protine dimrique, seules les conformations R2 et T2 sont permises. La conformation mixte RT est interdite. Cette condition devient beaucoup plus restrictive pour les enzymes contenant plus de deux sous-units. Par exemple, pour n = 4, les tats permis sont R4 et T4, alors que R3T, R2T2, et RT3 sont interdits. Les deux tats de la protine sont relis par un quilibre dcrit par une constante dquilibre L = [ T2 ] [ R2 ] . Un ligand peut se fixer sur une sous-unit quelle que soit sa conformation, mais les constantes de dissociation sont diffrentes : KR = [ R ][ A ] [ RA ] pour chaque sous-unit dans la forme R, KT = [ T ][ A ] [ RA ] pour chaque sous-unit dans la forme T. Le rapport KR KT est parfois reprsent par c, mais ici nous utiliserons la forme plus explicite. Ces postulats impliquent un ensemble dquilibres entre les diffrents tats comme le montre le schma de la figure 9.5, et les concentrations des six formes de la protine sont relies entre elles par les expressions suivantes :
[ R2 A ] =
2[ R2 ][ A ] KR
[9.22] [9.23] [9.24] [9.25]
[ R2 A2 ] =
1 2
[ R2 A ][ A ] KR
[ R2 ][ A ] 2 2 KR
[ T2 ] = L [ R2 ]
[ T2 A ] = 2[ T2 ][ A ] 2 L [ R2 ][ A ] = KT KT
313
[ T2 A2 ] =
1 2
[ T2 A ][ A ] KT
L [ R2 ][ A ] 2 KT2
R2 L T2
[9.26]
9.5 - Modle symtrique de MONOD, WYMAN et CHANGEUX (1965) illustr ici pour le cas dune protine possdant deux sites de fixation
2[A]/KR
2[A]/KT
Dans chaque quation, le facteur statistique 2, 1/2 ou 1 provient du fait que les constantes de dissociation sont dfinies pour 1/2[A]/KR 1/2[A]/KT des sites individuels mais que les expressions sont crites pour les molcules compltes. [ R ][ A ] 2[ R2 ][ A ] R2A2 T2A2 = Par exemple, KR = [ RA ] [ R2 A ] parce quil existe deux sites vacants sur chaque molcule R2 et un site occup sur chaque molcule R2A. La fraction de saturation, Y, est dfinie, comme prcdemment, comme la fraction des sites occups par un ligand, et prend la forme suivante :
R2A
T2A
Y =
[ R2 A ] + 2[ R2 A2 ] + [ T2 A ] + 2[ T2 A2 ] 2( [ R2 ] + [ R2 A ] + [ R2 A2 ] + [ T2 ] + [ T2 A ] + [ T2 A2 ] )
[9.27]
Au numrateur, la concentration de chaque forme de la molcule est comptabilise en accord avec le nombre de sites occups quelle contient (et donc les molcules vides ne sont pas prises en compte), mais au dnominateur, chaque forme de la molcule est comptabilise en accord avec le nombre total de sites quelle contient, quils soient ou non occups, et donc chaque terme de concentration est multipli par le mme facteur 2. En substituant les concentrations par les quations [9.22] [9.26], nous obtenons :
[ A ] [ A ] 2 L[ A ] L[ A ] 2 + + + 2 KR KT KR KT2 = [ A ] [ A ]2 2 L[ A ] L[ A ] 2 + + L+ + 1+ 2 2 KT KR KT2 KR [ A] [ A] [ A] [ A] + L 1 + 1 + KR KR KT KT = 2 2 [ A] [ A] 1 + + L 1 + KR KT
[9.28]
314
Puisque la faon de gnraliser ces quations pour les cas impliquant plus de deux sous-units peut ne pas sembler vidente, nous prsentons ci-dessous lquation correspondante pour une valeur non-prcise de n :
Y =
[ A] 1 + KR
n 1
[ A] [ A] + L 1 + KR KT
n
n 1
[ A] KT
[ A] [ A] + L 1 + 1 + KR KT
[9.29]
La forme de la courbe de saturation dfinie par lquation [9.29] dpend des valeurs de n, de L et de KR KT , comme nous pouvons lillustrer en attribuant des valeurs extrmes ces constantes. Si n = 1, c'est--dire sil ny a quun seul site de [ A] fixation par molcule, lquation se simplifie pour donner Y = avec KRT + [ A ] KRT = 1 + L qui est une constante de dissociation composite, qui tient compte 1 + 1 KR KT du fait que les formes R et T participent dans la fixation. La complexit de cette constante de dissociation ne doit cependant pas faire oublier quil sagit dune constante, et donc quaucune cooprativit nest possible si n = 1. Si L = 0, la forme T de la protine nexiste pas, quelles que soient les conditions, et
[ A] le facteur 1 + KR
n 1
sannule au numrateur et au dnominateur, laissant une
[ A] qui prdit une fixation hyperbolique (non KR + [ A ] cooprative) avec une constante de dissociation KR. Une simplification similaire peut tre faite si L tend vers linfini, c'est--dire si la forme R nexiste pas : dans ce [ A] cas, Y = . Il apparat ainsi que la prsence des deux formes, R et T, est KT + [ A ] ncessaire pour que la cooprativit soit possible.
quation de la forme Y = Il est galement ncessaire, que les deux formes soient fonctionnellement diffrentes lune de lautre, c'est--dire que KR KT . Si KR = KT , il est encore possible
[ A] dannuler le facteur commun 1 + , ce qui conduit une expression hyper KR bolique. Ceci indique que dans le cas o le ligand se fixerait de manire identique sur les deux formes de la protine, les proportions relatives dans lesquelles celles-ci existent ne seraient pas affectes par la fixation.
A lexception de ces cas spciaux, lquation [9.29] prdit une cooprativit positive, comme nous pouvons le constater en multipliant entre eux les facteurs
n 1

n 1 n 1
315
[ A] [ A] et 1 + et en rarrangeant le rsultat sous la forme de lqua1 + KR KT tion dADAIR. Dans le cas du dimre, lquation [9.28] devient : 2 1 KR + L KT2 1 KR + L KT 2 [ A] + [ A] 1+ L 1+ L Y = [9.30] 2 1 KR + L KT2 1 KR + L KT 2 1 + 2 [ A] + [ A] 1+ L 1+ L
En comparant cette quation avec lquation [9.13], nous obtenons les expressions suivantes pour les deux constantes dADAIR :
K1 =
K2 =
et leur rapport est donn par :
1+ L ( 1 KR ) + ( L KT )
( 1 KR ) + ( L KT ) 2 ( 1 KR ) + ( L KT2 )
[9.31a] [9.31b]
K2 K1
1 + 2 L + L2 2 ( 1 KR ) + ( L KT ) KR KR KT KT2 = = 2 1 + L + L + L2 ( 1 + L ) ( 1 KR ) + ( L KT2 ) 2 2 KR KT2 KR KT2
][
[9.32]
Puisque les termes extrieurs dans lexpression distribue du numrateur et du dnominateur sont les mmes, il est seulement ncessaire dexaminer les termes centraux et comme 2xy est plus petit que x2 + y2 quelles que soient les valeurs de x et de y. Il en dcoule que K1 K2, c'est--dire que le modle prdit une cooprativit positive dans les termes de lquation dADAIR. Des relations similaires sappliquent entre toutes les paires de constantes dADAIR dans le cas gnral o la valeur de n nest pas prcise, et donc le modle prdit une cooprativit positive tous les stades du processus de fixation. Parce que cette conclusion est algbrique et non intuitive, il est utile dexaminer un dernier cas spcial, dans lequel KT est infini, c'est--dire que A se fixe uniquement sur ltat R. Cest une application naturelle de lide de lajustement induit, bien que ce ne soit pas une caractristique essentielle du modle symtrique comme le proposait MONOD, WYMAN et CHANGEUX. Quand KT est infini, lquation [9.28] se simplifie sous la forme suivante : [ A] [ A] 1 + KR KR Y = [9.33] 2 [ A] L + 1 + KR qui ne correspond pas une quation hyperbolique de fixation uniquement cause de la prsence de la constante L au dnominateur. Quand [ A ] est suffisamment
316
leve, cette constante devient ngligeable vis--vis du reste du dnominateur, et la courbe tend vers une hyperbole. Mais quand [ A ] est faible, la constante domine le dnominateur et se traduit par une augmentation faible de Y partir de lorigine lorsque [ A ] augmente partir de zro. En dautres termes, aussi longtemps que la valeur de L est significativement diffrente de zro, la courbe de Y en fonction de [ A ] est sigmode. Quand KR KT , la pente de la courbe, c'est--dire le degr de cooprativit, naugmente pas indfiniment quand L augmente, mais elle passe par un maximum pour n n L2 = KT KR (RUBIN et CHANGEUX, 1966). Quand cette relation est respecte, la concentration demi-saturation (K0,5 de lquation [9.3]) est galement donne par une expression simple : K0,5 = KR KT . Nanmoins, comme nous pouvons le voir partir des courbes de fixation reprsentatives calcules partir de lquation [9.28], et prsentes dans la figure 9.6, il sagit en gnral dune estimation peu fiable ; le mieux que nous puissions dire, est que la concentration de demi-saturation est comprise entre KR et KT .
Y
1 1
Y/[A]
0,8 0,5
0,6
0,5
L = 0 (tat R) L=1 L = 10 L = 100 L = 103 L = 104 L = (tat T) Y1
0,4 0,5 0,2 0 0 0 3 2 1 0 1 2 3 1000 2000 [A]
log [A]
9.6 - Courbes de fixation pour le modle symtrique Les courbes sont calcules partir de lquation [9.28], en utilisant un rapport KT /KR = 100 et des valeurs de L comme indiqu. Dans les graphiques de SCATCHARD correspondants, prsents dans linsert suprieur gauche pour des valeurs faibles de L, les cas extrmes (L = 0 pour une forme R pure et L = pour les formes pures R et T) sont des droites alors que les cas intermdiaires sont des courbes dont la courbure est dirige vers le bas. Les courbes extrmes sont hyperboliques lorsque Y est port en fonction de [ A ], alors que les courbes intermdiaires sont sigmodes, comme illustr pour des valeurs faibles de L dans linsert infrieur droit.
317
MONOD, WYMAN et CHANGEUX ont distingu les effets homotropes ou interactions entre des ligands identiques, et les effets htrotropes ou interactions entre des ligands diffrents, comme un substrat et un effecteur allostrique. Comme nous lavons vu, le modle symtrique implique que les effets homotropes se manifestent obligatoirement par une cooprativit positive, mais il nimpose aucune restriction sur les effets htrotropes, quil peut accommoder sans complexit supplmentaire ; cest en ralit une de ses caractristiques les plus intressantes. Si un second ligand B se fixe prfrentiellement sur ltat R de la protine, c'est-dire sur ltat galement prfr par A, mais sur un site diffrent de celui de A (de sorte quil ny a aucune comptition entre eux), il facilitera la fixation de A en augmentant la disponibilit des molcules dans ltat R ; il agira ainsi en tant queffecteur htrotrope positif ou activateur allostrique. Dun autre ct, un ligand C, qui se lie prfrentiellement ltat T, qui fixe A faiblement ou pas du tout, aura leffet oppos : il empchera la fixation de A en rduisant la disponibilit des molcules dans ltat R, et agira ainsi en tant queffecteur htrotrope ngatif ou inhibiteur allostrique. Si chaque fixation est exclusive, c'est--dire si chaque ligand se fixe soit sur ltat R, soit sur ltat T, mais pas sur les deux, lquation de fixation rsultante pour A, modifie par la prsence de B et C, est particulirement simple, et peut tre crite de la manire suivante :
Y =
[ A] [ A] 1 + KR KR [ A] Lapp + 1 + KR
2
[ A] [ A] 1 + KR KR 1 + [ C ] KCT [ A] L + 1 + 1 + [ B ] KBR KR
2 2
[9.34]
La constante allostrique L est alors remplace par une valeur apparente, Lapp, qui augmente avec la concentration dinhibiteur et diminue avec la concentration dactivateur, refltant la capacit respective des inhibiteurs et des activateurs dplacer lquilibre par rapport ltat qui favorise la fixation du substrat. Dans le cas gnral o les ligands ne se fixent pas de faon exclusive lun ou lautre tat, le comportement est naturellement plus compliqu, mais nous pouvons toujours obtenir une ide raisonnable du comportement du systme en examinant la figure 9.6 la lumire de lquation [9.34]. Des concentrations leves deffecteur allostrique de nimporte quel type contribuent clairement rduire la cooprativit, puisque ceux-ci poussent la protine ressembler soit la forme R, soit la forme T, mais il peut y avoir des effets dans la direction oppose de faibles concentrations si la valeur de L (la valeur de Lapp en absence deffecteur) nest pas optimale. Considrons, par exemple, les constantes utilises pour construire la figure 9.6 avec L = 10. Nimporte quelle concentration dactivateur tendra rduire la valeur de Lapp, lloignant de plus en plus de la valeur Lapp = 100 (la racine carre de 104, et donc la valeur donnant une cooprativit maximale) et rendant la fixation moins cooprative. Toutefois, lajout dun inhibiteur allostrique augmentera initialement la cooprativit, passant par un
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maximum pour Lapp = 100, mais une fois ce maximum atteint, laugmentation supplmentaire de la concentration dinhibiteur tendra rduire la cooprativit. Si la valeur de L est suprieure 100 plutt quinfrieure, lactivateur augmentera la cooprativit faibles concentrations, alors que linhibiteur diminuera la cooprativit quelle que soit sa concentration. Une complication survient si nous considrons quun inhibiteur comptitif ordinaire (non-allostrique) se fixe sur ltat R au mme site que le substrat A. Ce cas est considr dans le problme 9.4 la fin de ce chapitre. Les proprits de fixation de la phosphofructokinase dE. coli ont t tudies de manire extensive par BLANGY, BUC et MONOD (1968) : sur une large gamme de concentrations dADP et de phosphonolpyruvate, qui sont respectivement un activateur et un inhibiteur allostriques de lenzyme, la fixation du substrat, le fructose 6-phosphate, sest avre en parfait accord avec les prdictions du modle symtrique. Nanmoins, celui-ci ne peut tre considr comme une explication complte de la cooprativit de fixation, parce quil ne permet pas dexpliquer un certain nombre de phnomnes observs, comme la cooprativit ngative, et que certains de ces postulats ne sont pas convaincants. Par exemple, lhypothse centrale de symtrie de conformation nest pas aisment explicable en termes de structure. De plus, pour beaucoup denzymes, il est ncessaire de postuler lexistence dun systme K parfait, qui signifie que les tats R et T de lenzyme ont des proprits catalytiques identiques en dpit du fait quils ont des proprits de fixation largement diffrentes. Ces aspects problmatiques du modle symtrique ont conduit la proposition de modles alternatifs.
9.4.2. Le modle squentiel de KOSHLAND, NMETHY et FILMER

Bien que le modle symtrique incorpore lide dun certain dterminisme dans la flexibilit de la conformation, il scarte de la thorie de lajustement induit, en autorisant la fixation des ligands aux conformations R et T bien quavec des constantes de fixation diffrentes. KOSHLAND, NMETHY et FILMER (1966) ont montr quune application plus orthodoxe de lajustement induit, connue sous le nom de modle squentiel, peut galement rendre compte de la cooprativit. Comme MONOD, WYMAN et CHANGEUX, ils ont postul lexistence de deux conformations, quils ont appeles les conformations A et B, et qui correspondent respectivement aux conformations T et R. Cette inversion de lordre dans lequel ces conformations taient dsignes, a quelques fois t une source de confusion. Pour cette raison mais galement pour nous permettre de continuer utiliser le symbole A pour dsigner le substrat, nous utiliserons ici les symboles T et R 2. A loppos de MONOD,
2. KOSHLAND, NMETHY et FILMER ont galement suivi la convention de lhmoglobine consistant exprimer leur modle en terme de constante dassociation, mais pour faciliter la comprhension du modle de MONOD, WYMAN et CHANGEUX, et pour rester consistant avec le reste de cet ouvrage, nous emploierons ici des
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WYMAN et CHANGEUX, KOSHLAND, NMETHY et FILMER ont suppos que la conformation R est induite par la fixation dun ligand, de telle sorte que le substrat ne se lie que sur la conformation R, que la conformation R existe uniquement lorsquun substrat est fix sur la protine, et que la conformation T nexiste que si le substrat nest pas fix. KOSHLAND, NMETHY et FILMER ont postul que la cooprativit existe parce que les proprits de chaque sous-unit sont modifies par la conformation des sousunits voisines. La mme hypothse est implicite dans le modle symtrique, mais elle est mise en vidence dans le modle squentiel, qui met plus laccent sur les dtails de linteraction, et vite lhypothse arbitraire selon laquelle toutes les sousunits dune mme molcule doivent tre simultanment dans la mme conformation. Par consquent, lexistence de formes hybrides, tels que TR dans le cas dun dimre ou T3R, T2R2 et TR3 dans le cas dun ttramre, nest pas simplement autorise mais est rendue obligatoire par lhypothse dun mcanisme strict dajustement induit. Parce que le modle symtrique ne prend pas en compte les dtails des interactions entre les sous-units, il ntait pas ncessaire dans le 9.4.1 de considrer la gomtrie de lassociation des sous-units, c'est--dire la structure quaternaire de la protine. Inversement, le modle squentiel ncessite de considrer la gomtrie de la molcule pour toute protine ayant plus de deux sous-units, puisque diffrents arrangements de ces sous-units entranent diffrentes quations de fixation. Par souci de simplification, nous considrerons ici le cas dun dimre, et nous ignorerons la question de gomtrie, mais il faut garder lesprit quelle devra obligatoirement tre prise en compte si le traitement est tendu des trimres, des ttramres Laccent mis sur la gomtrie et la ncessit de traiter chaque gomtrie sparment ont conduit lide largement rpandue, mais fausse, que le modle squentiel est plus gnral et plus compliqu que le modle symtrique. Pour une gomtrie donne, les deux modles sont peu prs aussi complexes, et aucun ne peut tre considr comme un cas particulier de lautre. Les deux modles peuvent tre gnraliss sous la forme dun modle unique gnral (HABER et KOSHLAND, 1967), en liminant la contrainte de symtrie impose par le modle symtrique, et la contrainte dun ajustement induit strict impose par le modle squentiel. Il faut nanmoins sinterroger sur lutilit dun tel modle, car lquation qui en rsulte est trop complique pour tre utilise. Pour avoir une ide de la manire dont une quation de fixation est construite dans le modle squentiel, considrons les changements qui surviennent quand une molcule T2 fixe une molcule de A pour devenir RTA :
constantes de dissociation. Ainsi, la plupart des constantes dquilibre sont la rciproque des constantes dquilibre donnes dans la publication originale.
320
R, un changeUne sous-unit doit subir un changement de conformation T ment reprsent par la constante dquilibre Kt = [ T ] [ R ] pour une sous-unit isole. Dans la version la plus simple du modle squentiel, une valeur leve de Kt est tacitement postule, de telle faon que ltendue du changement est ngligeable sil nest pas induit par la fixation dun ligand. Une molcule de A se fixe sur une sous-unit dans la conformation R, reprsente par [ A ] K A , o K A est la constante de dissociation [ R ][ A ] [ RA ] pour la fixation de A sur une sous-unit isole dans la conformation R. Dans un dimre, il existe une interface par laquelle les deux sous-units peuvent interagir. Dans la molcule initiale T2, il y a videmment deux sous-units T, de sorte quil y a une interface T:T, mais dans le complexe RTA, cette interface devient une interface T:R, un changement reprsent par la constante dquilibre KR :T = [ R: T ] [ T : T ] . Dans la discussion originale de KOSHLAND, NMETHY et FILMER, il nest pas clairement prcis si les termes dinteraction entre les sous-unit doivent tre considrs comme des mesures absolues de la stabilit des interfaces (ce qui signifierait que des dimensions sont impliques et que logiquement, une constante KT:T doit tre introduite pour reprsenter la stabilit de linterface T : T), ou sils doivent tre considrs comme des mesures de la stabilit relative vis--vis dun tat standard (linterface T : T). La seconde interprtation est aussi rigoureuse, plus simple appliquer (parce quelle conduit dfinir des constantes sans dimensions, de sorte quil ny a pas de problme doubli des dimensions) et produit des quations plus simples avec moins de constantes ; nous utiliserons cette interprtation. Finalement, un facteur statistique de 2 est ncessaire, parce quil y a deux faons quivalentes de fixer A sur une des deux sous-units (ladjectif quivalente est essentiel ici, car des choix non-quivalents conduisent des molcules distinguables, qui devraient tre traites sparment). En considrant lensemble de ces points, nous pouvons crire lexpression suivante pour la concentration de RTA en termes de celles de T2 et de A :
[ RTA ] =
2[ T2 ][ A ] KR :T Kt K A
[9.35]
Bien que le choix dun dimre comme exemple permette dexpliquer le modle squentiel sans introduire une trop grande complexit, il ne permet pas dexpliquer un ou deux aspects essentiels du modle squentiel, de sorte quil est utile de se demander quelle expression serait obtenue si les mmes rgles taient appliques la formation dune molcule R2T2A2 partir d'un ttramre T4. Dans ce cas, nous ne pouvons pas ignorer la gomtrie, parce quil existe au moins trois rarrangements possibles. Ici, nous supposerons que les sous-units interagissent comme si elles taient disposes aux quatre coins dun carr, et que parmi les deux manires diffrentes de fixer deux molcules de ligand sur une telle molcule, nous considrons uniquement celle dans laquelle les deux molcules de ligand se
321
trouvent sur des sous-units adjacentes (plutt quen diagonale.) Cette simplification fournit une expression simple de la concentration du complexe :
[ R2 T2 A2 ]adjacent =
2 4[ T4 ][ A ] 2 KR :T KR :R 2 Kt2 K A
[9.36]
Puisque ceci implique lexistence dune nouvelle interface entre les deux sousunits adjacentes dans la conformation R qui ont fix un ligand, nous devons considrer une nouvelle constante dinteraction entre ces sous-units, K R:R, pour reprsenter sa stabilit relative vis--vis de celle de linterface T : T, mais mis part cela, lquation [9.36] est construite exactement de la mme faon et partir des mmes composants que lquation [9.35]. Revenant maintenant au cas du dimre, nous pouvons crire une expression pour la concentration de R2A2, en accord avec les mmes principes :
[ R2 A2 ] =
[ T2 ][ A ] 2 KR :R 2 Kt2 K A
[9.37]
En substituant les quations [9.35] et [9.37] dans lexpression de la fraction de saturation, nous obtenons : [ A ] KR :T [ A ] 2 KR :R + 2 Kt K A Kt2 K A [ RTA ] + 2[ R2 A2 ] [9.38] Y = = 2([ T2 ] + [ RTA ] + [ R2 A2 ]) 2[ A ] KR :T [ A ] 2 KR :R + 1+ 2 Kt K A Kt2 K A Le modle squentiel repose fondamentalement sur les interactions entre sousunits, et la question essentielle laquelle rpond une quation telle que lquation [9.38] est comment la fixation dun ligand est affecte par la stabilit relative de linterface mixte R : T vis--vis des interfaces R : R et T : T entre des sous-units existant dans une mme forme ? Lanalyse de lquation [9.38] permet de voir quune diminution de KR:T, se traduit par une augmentation de limportance des termes externes par rapport aux termes internes, mais cela apparat plus clairement 2 en dfinissant une constante c 2 = KR :T KR :R pour exprimer cette stabilit relative. (Il peut sembler surprenant, premire vue, quil ne soit fait aucune mention de linterface T : T dans cette dfinition, mais il faut se rappeler que KR:T et KR:R dfinissent dj les stabilits des interfaces R : T et R : R par rapport celle de linterface T : T.)
1 Si, en utilisant cette dfinition, KR:T est remplace par c KR :2 , il devient alors clair R Kt K A que le terme K = 1 2 est toujours gal lunit ; bien que ses trois composantes KR :R soient conceptuellement distinctes, elles ne peuvent tre distingues exprimentalement par des mesures de fixation. Lquation peut donc tre simplifie en apparence sans perdre de sa gnralit en lcrivant en termes de c et K :
322
[ A ] [ A ]2 + K K2 Y = [ A ] [ A ]2 + 1 + 2c K K2 c
[9.39]
La dfinition de c est la mme pour toutes les structures quaternaires : elle sapplique non seulement aux dimres, mais galement aux trimres, aux ttramres, sans gard pour la manire dont les sous-units sont organises. La dfinition de K est un peu plus complique : elle contient toujours Kt KA comme une unit insparable (en accord avec les tapes 1 et 2 dans la description ci-dessus qui montrent que tout processus de fixation est dcompos en diffrentes composantes) ; dun autre ct, le puissance laquelle KR:R est porte au dnominateur varie avec le nombre de sous-units et le nombre dinterfaces R : R que contient la molcule compltement sature. Toutefois, ceci na que peu dimportance : le point important est que, sans tenir compte ni de la structure quaternaire ni de sa gomtrie, la gamme de comportements possibles pour la fixation dun ligand unique dans le modle squentiel est dtermine par deux paramtres, un qui reprsente la stabilit de linterface R : T par rapport aux interfaces R : R et T : T, et lautre qui est une constante de dissociation moyenne pour le processus de fixation qui relie la forme compltement libre la forme compltement complexe de la protine. Cest, en ralit, la moyenne gomtrique des constantes de dissociation dADAIR, comme nous le voyons dans le cas dun dimre en les crivant explicitement, aprs comparaison de lquation [9.39] avec lquation [9.13] :
K1 = K c
[9.40a] [9.40b] [9.41]
K2 = c K
avec le rapport suivant :
K2 = c2 K1
Il est maintenant clair que le degr de cooprativit, et donc lallure de la courbe de fixation, dpendent uniquement de la valeur de c. Comme lillustre la figure 9.7, les valeurs de c < 1 gnrent une cooprativit positive, et les valeurs de c > 1 gnrent une cooprativit ngative. Leffet de la variation de K nest pas prsent (pour viter de surcharger la figure), mais peut tre nonc simplement : il na aucune influence sur la forme des courbes quand log [ A ] est port en abscisses (et affecte uniquement lchelle lorsque dautres variables sont portes en abscisses), mais provoque simplement leur dplacement vers la droite (si K augmente) ou vers la gauche (si K diminue) ; en dautres termes, K na aucun effet sur le degr de cooprativit. Lexistence dune correspondance simple entre les paramtres du modle squentiel et ceux de lquation de HILL (quation [9.3]) serait apprciable. Toutefois, comme nous lavons vu, le degr de cooprativit dpend uniquement de c et il
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nexiste pas de manire simple de convertir une estimation de h en une valeur de c, ou vice versa. Inversement, la relation entre K et K0.5, la concentration de demisaturation, est aussi simple que nous puissions le dsirer puisque ces deux paramtres sont identiques.
Y
1 2
Y/[A]
0,8 1
0,6
0 0 0,5
c = 0,1 c = 0,3 c=1 c=3 c = 10 Y

1
Y1
0,4 0,5 0,2 0 0 0 3 2 1 0 1 2 3 2 4
[A] log [A]
9.7 - Courbes de fixation pour le modle squentiel Les courbes sont calcules partir de lquation [9.39] pour K = 1 000 et les valeurs de c indiques dans le graphique. La valeur de K naffecte pas la forme de la courbe, mais uniquement sa position le long de laxe des abscisses. Les graphiques de SCATCHARD correspondants sont prsents dans linsert en haut, gauche.
Parce que certaines affirmations incorrectes sont parfois rencontres dans la littrature, il est bon de noter que, dans le modle squentiel, la forme de la courbe est dfinie par moins de paramtres que dans le modle symtrique (un au lieu de deux.) Ainsi, le fait que le modle squentiel permet dexpliquer une cooprativit ngative alors que le modle symtrique ne le permet pas, nest pas une consquence du grand nombre de constantes considres en drivant le modle squentiel (Kt, KA, KR:T et KR:R). Dautres erreurs plus subtiles concernant le modle squentiel sont implicites lorsque des dsignations telles que modle dADAIR-KOSHLAND ou modle de PAULING-KOSHLAND sont utilises par certains auteurs. Le premier de ces termes est trompeur parce quil implique que le modle squentiel est un cas spcial du modle dADAIR, alors que le modle symtrique ne lest pas. En ralit, les deux modles peuvent tre exprims en termes des constantes dADAIR (quations [9.31] et [9.40]) comme doit ltre toute quation permettant de dcrire la fixation lquilibre dun ligand sur une macromolcule. Le test le plus simple de la signification qui puisse tre applique une quation crite avec cet objectif,
324
est ladhrence lquation dADAIR ; les quations qui ne sont pas des cas spciaux de lquation dADAIR, tout comme celles, proposes pour la lactate dshydrognase (WEBER et ANDERSON, 1965 ; ANDERSON et WEBER, 1965), violent gnralement les principes de la thermodynamique. La rfrence PAULING est trompeuse pour une raison diffrente. Malgr que les mathmatiques du modle squentiel soient les mmes que celles appliques lhmoglobine par PAULING, les concepts fondamentaux sont diffrents ; PAULING a tudi lhmoglobine une poque o les sites de fixation de loxygne sur lhmoglobine taient supposs suffisamment proches dans lespace les uns des autres pour interagir dune faon chimique ordinaire, et il ny avait aucune implication de modification de conformation. Dans le cas dun dimre cooprativit positive, il ny a aucune diffrence entre les courbes de fixation prdites par les deux modles, puisque toute valeur infrieure 1 que puisse prendre le rapport des constantes dADAIR ( K 2 K1 ), est galement en accord avec lautre modle. Il est donc impossible de les distinguer sur la base dexpriences de fixation avec un dimre. En principe, celles-ci deviennent diffrentes pour les trimres ou pour des oligomres de plus grande taille, car les courbes de fixation pour le modle symtrique, telles que celles qui sont prsentes dans les figures 9.6 et 9.7, deviennent asymtriques par rapport au point de demi-saturation, alors que les courbes gnres par le modle squentiel restent symtriques par rapport une rotation de 180 autour de ce point. Cependant, les dviations de la situation symtrique sont faibles, et des donnes trs prcises sont ncessaires pour les dtecter. De plus, le plus grand degr de n n cooprativit est obtenu avec le modle symtrique lorsque L2 = KT KR (RUBIN et CHANGEUX, 1966), et puisque ce sont galement les conditions pour lesquelles le modle symtrique prdit une courbe de fixation symtrique, il faut sattendre ce que, dans certains cas, lvolution limine une asymtrie qui aurait pu exister. Une revue rcente de ltat actuel de ces modles (et ceux discuts dans le 9.6), est prsente dans l'article de NEET (1995).
9.4.3. Modles association-dissociation

Diffrents groupes (FRIEDEN, 1967 ; NICHOL, JACKSON et WINZOR, 1967 ; KURGANOV, 1968) ont suggr indpendamment que la cooprativit puisse dans certaines circonstances rsulter de lexistence dun quilibre entre diffrentes formes de la protine dans diffrents tats dagrgation, tel quun monomre et un ttramre. Si la fixation dun ligand sur les deux formes de la protine est caractrise par des constantes de dissociation diffrentes, ce modle prdit une cooprativit mme sil ny a aucune interaction entre les sites de fixation du ttramre. Conceptuellement, ce modle est similaire au modle symtrique, et donc la cooprativit une origine similaire, mais les quations sont plus complexes, parce
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quelles doivent rendre compte de la dpendance du degr dassociation vis--vis de la concentration de protine. En consquence, contrairement aux quations pour les modles squentiel et symtrique, cette concentration ne sannule pas des expressions dcrivant les courbes de saturation. Ce type de modle est beaucoup plus facile vrifier exprimentalement que les autres modles que nous avons considrs, parce que les effets de la concentration de protine devraient tre facilement observables. Ils sont, en effet, observs avec de nombreux enzymes, comme la glutamate dshydrognase (FRIEDEN et COLMAN, 1967) et la glycraldhyde 3-phosphate dshydrognase (OVDI et al., 1979) et dautres exemples sont dcrits par KURGANOV (1982) qui discute en dtails les modles dassociation-dissociation.
9.5. COOPRATIVIT CINTIQUE

Tous les modles dcrits dans la premire partie de ce chapitre sont essentiellement des modles lquilibre qui ne peuvent tre appliqus aux expriences cintiques que si nous faisons lhypothse que le paramtre v V reprsente une vraie mesure de Y. Nanmoins, la cooprativit peut galement apparatre pour des raisons purement cintiques, avec des mcanismes qui ne prsenteraient aucune cooprativit si la fixation pouvait tre mesure lquilibre. Des observations de ce type ont t dcrites par FERDINAND (1966), par RABIN (1967) et par dautres lpoque o les modles classiques de cooprativit taient dvelopps, mais elles ntaient pas apparues ce moment comme des exemples exprimentaux de cooprativit avec des enzymes monomriques. Ds lors, on a considr que mme si la prsence de plusieurs sites de fixation nest pas strictement ncessaire pour produire la cooprativit, elle fournit le seul mcanisme rellement rencontr dans la nature, et les modles purement cintiques ont reu peu dattention. Ce nest quavec les travaux dAINSLIE, SHILL et NEET (1972) et de SHILL et NEET (1975) sur lhexokinase de levure, et ceux de MEUNIER et al. (1974) sur lhexokinase LI du germe de bl, quil est apparu que les modles dcrivant une cooprativit avec des enzymes monomriques doivent tre srieusement considrs. Ceux-ci sont des exemples de cooprativit ngative, mais le cas de lhexokinase D du foie de rat montre quune cooprativit positive peut aussi tre obtenue avec un enzyme monomrique. Lhexokinase D est un enzyme prsent dans le foie et dans les lots pancratiques des vertbrs. A cause de la perception fausse que cet enzyme est plus spcifique pour le glucose que les autres hexokinases de vertbrs (voir CRDENAS, RABAJILLE et NIEMEYER, 1984 ; CRDENAS, 1995), il est souvent dnomm glucokinase dans la littrature mais ce nom ne sera pas utilis ici. Cet enzyme est monomrique sur une large gamme de concentration, incluant celles utilises dans le test (HOLROYDE et al., 1976 ; CRDENAS, RABAJILLE et NIEMEYER, 1978), mais il prsente des dviations importantes vis--vis des cintiques de MICHAELIS et
326
MENTEN quand la concentration de glucose varie en maintenant constante la concentration de lautre substrat, le MgATP2 (NIEMEYER et al., 1975 ; STORER et CORNISH-BOWDEN, 1976). Quand elles sont utilises pour tracer une srie de graphiques de HILL, les donnes montrent des valeurs de h variant entre 1,5 pour des concentrations saturantes de MgATP2 et une valeur faible, probablement gale 1,0, pour de faibles concentrations de MgATP2. Dun autre ct, lenzyme ne prsente aucune dviation des cintiques de MICHAELIS et MENTEN vis--vis du MgATP2 lui-mme. Le comportement de lhexokinase LI du germe de bl (MEUNIER et al., 1974) est en gnral similaire, except que la cooprativit est ngative plutt que positive. Les exemples de cooprativit avec des enzymes monomriques ne sont pas trs abondants, mais ils existent (voir CORNISH-BOWDEN et CRDENAS, 1987), et ils indiquent que les mcanismes qui gnrent la cooprativit cintique ne peuvent plus tre ignors. Nous considrerons deux de ces mcanismes dans ce . Le plus ancien a t propos par FERDINAND (1966), qui soulignait que lquation de vitesse ltat stationnaire pour le mcanisme alatoire complexe ternaire ( 6.4.2) est plus complexe que lquation [6.22] si elle est drive sans supposer que les tapes de fixation des substrats sont lquilibre ; il a suggr quun modle de cette sorte, quil a appel mcanisme ordre prfrentiel, peut fournir une explication de la cooprativit de la phosphofructokinase. Bien que la drivation des quations de vitesse indique clairement que des dviations par rapport aux cintiques de MICHAELIS et MENTEN doivent avoir lieu avec ce mcanisme, cette explication est plutt abstraite et algbrique, et peut difficilement tre exprime dans des termes conceptuellement simples. Le point crucial est que les deux voies pour la fixation du substrat peuvent contribuer de manire significative au flux total de la raction, mais les grandeurs relatives de ces contributions varient avec les variations de la concentration de substrat. Donc le comportement observ correspond approximativement une voie pour les concentrations faibles et une autre voie pour les concentrations leves. RICARD, MEUNIER et BUC (1974) ont dvelopp un modle alternatif pour expliquer la cooprativit cintique partir des ides de RABIN (1967) et de WHITEHEAD (1970). Leur modle est connu comme le modle E' mnmonique (du nom grecque pour mmoire), parce quil dpend de lide que lenzyme change Lent de conformation relativement lentement, et donc A est capable de se rappeler la conformation, quil a eu durant un cycle catalytique. Il est prE EA sent (sous une forme simplifie) dans le schma de la figure 9.8.
Produits Rapide B
9.8 - Modle mnmonique pour la cooprativit cintique
EAB
327
Ses caractristiques essentielles sont les suivantes : il postule quil existe deux formes de lenzyme libre, E et E', qui diffrent par leur affinit pour A, le premier substrat qui doit se fixer ; en plus, lquilibration entre E, E', A et EA doit tre lente par rapport au flux maximum de la raction. Avec ces postulats, le comportement de lhexokinase D est facilement expliqu. Quand la concentration de B est diminue, la vitesse laquelle EA est converti en EAB et ensuite en produits doit devenir suffisamment lente pour que E, E', A et EA atteignent lquilibre. En consquence des concentrations extrmement faibles de B, la fixation de A devrait se comporter comme un quilibre ordinaire, sans cooprativit, parce quil y a un seul site de fixation. A des concentrations leves de B, dun autre ct, il devient possible que EA disparaisse si rapidement que lquilibre ne peut stablir et que donc les lois dquilibre ne sappliquent plus (STORER et CORNISHBOWDEN, 1977). Des dviations par rapport aux cintiques de MICHAELIS et MENTEN sont alors possibles parce que, faibles concentrations de A, les deux formes de lenzyme libre peuvent atteindre un quilibre mais qu fortes concentrations, cela nest pas possible. Dans le mcanisme mnmonique propos par RICARD et ses collaborateurs la mme forme du complexe EA est produite partir des deux formes de lenzyme libre quand le substrat se fixe sur celles-ci. Cependant, il ne sagit pas dune caractristique ncessaire du modle, et le modle de transition lente dvelopp un peu plus tt par AINSLIE, SHILL et NEET (1972) suppose que les deux conformations diffrentes existent durant lensemble du cycle catalytique, avec des transitions entre celles-ci qui sont possibles nimporte quel moment et une vitesse plus lente que la vitesse catalytique. En gnral, tout modle qui permet au substrat de se fixer de deux ou plusieurs manires parallles gnrera une quation de vitesse contenant des termes de concentration du substrat concern levs au carr ou une puissance suprieure, de sorte quil ny a aucune limite sur les modles de cooprativit cintique qui peuvent tre drivs. Malheureusement, il est difficile en pratique de les distinguer entre eux ou de dterminer avec confiance si lun reprsente mieux les donnes que lautre. Il est certain que le modle mnmonique et le modle de transition lente permettent dexpliquer adquatement le comportement de lhexokinase D. NEET (1995) donne un rcent compte-rendu de lapplication du dernier modle lhexokinase D.
PROBLMES
9.1 - WATARI et ISOGAI (1976) ont propos un graphique de log
v [ A ]( V v )
en fonction de log [ A ] comme une alternative au graphique de HILL. Quelle est la pente de ce graphique (exprime en terme du coefficient de HILL h) ? Quel est lavantage de ce graphique par rapport au graphique de HILL ?
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9.2 - Ecrire une quation pour la vitesse dune raction catalyse par un mlange de deux enzymes, chacun obissant la cintique de MICHAELIS et MENTEN, un avec une vitesse limite V1 et une constante de MICHAELIS Km1 et lautre avec V2 et Km2. Diffrencier cette quation deux fois par rapport [ A ] et montrer que la drive seconde rsultante est ngative pour toutes le valeurs de [ A ] . Quelle est limplication de cela sur la forme du graphique de v en fonction de [ A ] ? 9.3 - Driver une expression pour le coefficient de HILL en termes de K1 et de K2 pour un enzyme qui obit lquation [9.13], et donc montrer que la dfinition de la cooprativit en termes de h est identique une dfinition en termes de K1 et de K2 pour ce systme. A quelle valeur de [ A ] h est-il un maximum ou un minimum et quelle est sa valeur extrme ? 9.4 - La quasi-concidence des deux asymptotes dans la figure 9.3 est suppose tre une simple concidence. Quelle relation entre les constantes de dissociation (telles quelles sont dfinies dans lquation [9.14]) cela implique-t-il ? 9.5 - Considrer un inhibiteur qui se fixe sur une protine qui obit la forme la plus simple du modle symtrique (quation [9.33]) comme un analogue simple (non-allostrique) du substrat, c'est--dire qu'il se fixe uniquement sur la forme R, dans le mme site que le substrat et dune manire qui le substrat et linhibiteur de se fixer simultanment au mme site. Que pouvez-vous prdire de leffet dun tel inhibiteur sur la fixation du substrat, pour des concentration (a) faibles et (b) leves des deux molcules ?
10 CINTIQUES DES SYSTMES MULTI-ENZYMATIQUES

10.1. LES ENZYMES DANS LEUR CONTEXTE BIOLOGIQUE
Dans la majeure partie de ce manuel, nous nous sommes intresss aux proprits des enzymes isols, mme si dans les organismes vivants tous les enzymes agissent virtuellement comme les composants d'un systme complexe ; les substrats d'un enzyme sont les produits d'autres enzymes et les produits d'un enzyme sont galement les substrats d'autres enzymes. Dans l'histoire de l'enzymologie, peu d'efforts ont t consentis pour connecter les mesures cintiques ralises in vitro avec les proprits physiologiques des enzymes tudis ; aprs qu'un enzyme a t identifi partir de quelques observations physiologiques, un enzymologiste commence par purifier celui-ci ou au moins par le sparer de ses partenaires physiologiques. Pratiquement, toutes les tudes cintiques des enzymes sont ralises avec des enzymes qui sont dlibrment isols de leur contexte physiologique. Cette approche est ncessaire si nous souhaitons lucider le mcanisme catalytique de l'enzyme, mais il n'est pas possible d'obtenir une comprhension complte de la manire dont l'enzyme rempli son rle dans les voies mtaboliques si nous l'examinons uniquement dans des conditions o tous les autres aspects de cette voie ont t limins. On aurait pu s'attendre ce que la dcouverte de l'inhibition par contrle rtroactif et des proprits associes de cooprativit et d'interaction allostrique ait rtabli l'importance des enzymes en tant qu'lment physiologique. En ralit cette dcouverte a exacerb la sparation entre la pratique de l'enzymologie et celle de la physiologie des enzymes, parce qu'il est devenu naturel de penser que quelques enzymes comme la phosphofructokinase peuvent tre considrs comme des enzymes rguls et que les autres peuvent tre ignors dans les discussions de la rgulation physiologique. La forme la plus extrme de cette ide consiste penser que, pour comprendre la rgulation d'une voie mtabolique, il suffit simplement d'identifier l'tape rgulatrice, habituellement suppose unique, et d'tudier toutes les interactions de l'enzyme qui catalyse cette tape. Les mcanismes discuts dans le chapitre prcdent constituent une partie importante dans la comprhension de la physiologie des enzymes, mais ils laissent une question sans rponse : comment pouvons-nous savoir qu'un effet sur l'activit d'un
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enzyme se traduira par un effet sur le flux des mtabolites dans une voie mtabolique ? La seule faon de rpondre cette question est de remplacer l'tude des enzymes isols par un traitement systmique, c'est--dire un traitement qui s'intresse la manire dont les composants d'un systme s'influencent mutuellement. Il ne s'agit pas d'un problme trivial, mme dans des conditions d'tat stationnaire, et mme si nous considrons que l'analyse du comportement cintique d'enzymes individuels isols dans des conditions d'tat stationnaire est un problme rsolu. En gnral, il n'existe pas d'expressions analytiques pour les vitesses l'tat stationnaire de systmes multi-enzymatiques, mme pour des systmes deux enzymes, et les difficults s'accroissent rapidement pour les systmes impliquant plus de deux enzymes. Rien dans les cintiques enzymatiques ordinaires ne permet de justifier l'hypothse selon laquelle une connaissance complte de l'quation de vitesse d'un enzyme rgul permettrait de prdire de faon quantitative comment un changement de son activit affecterait le flux travers la voie mtabolique dans laquelle l'enzyme est insr. Dans ce chapitre, nous examinerons les relations entre les cintiques des voies mtaboliques et les proprits cintiques des enzymes qui les composent.
10.2. ANALYSE DU CONTRLE MTABOLIQUE

Plusieurs systmes se recoupant les uns avec les autres ont t dvelopps au cours des 20 dernires annes pour analyser le comportement des systmes mtaboliques, mais nous discuterons uniquement un seul de ceux-ci, l'analyse du contrle mtabolique qui dcoule des travaux de KACSER et BURNS (1973) et d'HEINRICH et RAPOPORT (1974), et qui est actuellement le plus connu et le plus utilis. Dans sa forme la plus simple, il implique de considrer les tats stationnaires de systmes d'enzymes qui relient une srie de mtabolites. Il utilise deux ou plusieurs rservoirs de mtabolites dont les concentrations sont fixes indpendamment des enzymes du systme, et peuvent donc tre considrs comme externe vis--vis de ce systme. Ces rservoirs contiennent au moins une source, partir de laquelle les mtabolites s'coulent, et au moins un drain vers lequel ils s'coulent. Aucun de ces flux ne doit tre irrversible et la classification comme source ou comme drain, n'est pas absolue : dans des circonstances diffrentes, les deux pourraient tre considrs comme des mtabolites internes d'un systme plus important. Nanmoins, dans toute analyse il est essentiel d'tre prcis quant aux mtabolites qui sont considrs comme internes et ceux qui sont considrs comme externes, et il est utile d'utiliser des symboles qui indiquent cette diffrence : en accord avec de nombreuses publications nous utiliserons respectivement S (Substrat) et X (eXterne). Dans l'exemple prsent dans la figure 10.1, le systme correspond la voie allant d'une sourcee X0 vers un drain X5, avec des mtabolites internes S1, S2, S3 et S4 :
331
la partie fortement ombre du schma, incluant les connections externes vers ces mtabolites et vers S3, est considre comme tant en dehors du systme1.
Externe Systme Local
2 2 [S1] > 0 [S2] < 0 2 [S4] < 0
X0
E1
S1
E2
S2
E3
S3
E4
S4
E5
X5
10.1 - Exemple d'une voie mtabolique compose de cinq enzymes Bien qu'un systme mtabolique corresponde la cellule entire ou mme un organisme entier, il est ncessaire d'en isoler une partie pour permettre son analyse. Dans l'exemple prsent, la partie fortement ombre du diagramme, montrant les connections vers X0, S3 et X5, est considre comme externe au systme, de sorte que X0 est considr comme une source mtabolique et X5 comme un drain mtabolique mme si, dans un systme plus important, ces deux mtabolites correspondraient des intermdiaires. Un plus grand degr d'isolement, reprsent par la partie lgrement ombre dans le diagramme, est ncessaire pour comprendre comment l'activit d'un seul enzyme, E2 dans cet exemple, dpend des interactions avec diffrents mtabolites. Les lasticits reprsentes par le symbole sont discutes dans le 10.3.
En plus des mtabolites relis entre eux par les enzymes, il peut y avoir un nombre indfini d'effecteurs externes des concentrations fixes. Dans un organisme vivant, bien sur, trs peu de ractifs sont externes, mais il y a tellement de ractions considrer que le systme complet est difficile comprendre. Pour rendre le mtabolisme accessible l'analyse, le systme doit donc tre dfini simplement comme une partie de l'organisme complet, et les mtabolites prsents aux interfaces avec le reste de l'organisme doivent tre dfinis comme externes. Dans la version la plus simple de l'analyse du contrle mtabolique considre ici, chaque vitesse doit tre proportionnelle la concentration d'un seul enzyme, et aucun enzyme ne peut agir sur plus d'une raction du systme. Cependant, ces restrictions ne sont pas absolues puisqu'elles peuvent tre facilement limines en augmentant la complexit de l'analyse. Plusieurs revues rcentes (par exemple, FELL, 1992 ; CORNISH-BOWDEN, 1995a) peuvent tre consultes pour davantage d'information, ainsi qu'un livre
1. Dans ce manuel, nous avons reprsent les substrats d'un enzyme par les lettres A, B Lorsque nous considrons une voie dans sa totalit, un mtabolite interne est la fois substrat et produit. Afin de marquer cette distinction mais galement pour utiliser une notation communment accepte, nous utilisons le symbole SI lorsque nous considrons un systme mtabolique, mais conservons les symboles A, B lorsque nous discutons des proprits d'enzymes isols..
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rcent (CORNISH-BOWDEN et CRDENAS, 1990) qui regroupe les contributions de nombreux groupes actifs dans ce domaine.
10.3. ELASTICITS
10.3.1. Dfinition de l'lasticit
Le comportement cintique des enzymes est habituellement exprim en termes d'quations de vitesse comme l'quation de MICHAELIS et MENTEN pour un systme rversible (quation [3.81]) : k [ E ]0 [ A ] kP [ E ]0 [ P ] v = A [10.1] [ A] [ P ] [ I ] 1+ + + KmA KmP KI prsente ici pour la conversion des mtabolites A et P en prsence de l'inhibiteur I dont la concentration est [ I ] et la constante d'inhibition (comptitive) est KI. La forme rversible de l'quation devrait tre prfre dans le contexte d'tudes physiologiques, puisque les produits sont normalement toujours prsents. Dans les simulations mtaboliques, il faut tre trs prudent avant d'crire des quations irrversibles, car une telle pratique peut gnrer des rsultats entirement errons quant au comportement d'une voie mtabolique ; par exemple, des quations irrversibles peuvent suggrer que l'tablissement d'un tat stationnaire ne soit pas possible dans des conditions o des quations plus ralistes quoique plus complexes indiquent un tat stationnaire stable. Ceci contraste avec le cas habituel de l'tude in vitro dans une cuvette, o il est ais de crer des conditions d'irrversibilit. Pour tudier les mcanismes enzymatiques par le type d'analyse qui est prsent dans la majeure partie de cet ouvrage, en particulier dans le chapitre 6, il est ncessaire d'exprimer le comportement cintique en termes d'une quation qui ressemble l'quation [10.1]. Nanmoins, l'intrt de l'analyse du contrle mtabolique n'est plus de comprendre les mcanismes enzymatiques, non pas parce qu'ils ne sont pas importants, mais parce que l'objectif est de comprendre un autre aspect du systme. Le genre de question qui est pose n'est pas comment pouvons-nous expliquer la variation de v en fonction de [ A ] ? , mais plutt quelle sera la variation de v en rponse une faible variation de [ A ] ? ou mme quelle sera la variation de [ A ] en rponse une faible variation de la vitesse v ? . Cette dernire forme de la question nous rappelle que dans un systme vivant la distinction entre variable dpendante et variable indpendante est moins clairement tablie qu'au laboratoire. Dans une exprience typique de cintique l'tat stationnaire, nous dcidons en principe des concentrations utilises et nous mesurons la vitesse des ractions qui rsulte de ce choix ; dans la cellule, la fois la vitesse et les concentrations sont des proprits du systme dans son ensemble, et bien que dans certains cas, il soit
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possible de considrer que les vitesses sont dtermines par les concentrations de mtabolites ou que les concentrations de mtabolites sont dtermines par les vitesses, la ralit est que ces deux variables sont dpendantes. Ce point sera considrer plus en dtails dans le 10.3.4. Les quations cintiques ordinaires comme l'quation [10.1] peuvent certainement rpondre la question de comment la vitesse rpond une variation faible de concentration, mais elles prsentent l'inconvnient de le faire d'une manire indirecte. Nanmoins, une diffrentiation partielle par rapport [ A ] fournit l'expression :
v = [ A ]
kP [ I ] k A [ E ]0 1 + [ P ] 1 + + KmP k A KmA KI [ A] [ P ] [ I ] + + 1 + KmA KmP KI

2
[10.2]
Dans cette forme, la drive a les dimensions de la rciproque d'un temps, et comme il est prfrable d'utiliser des drives relatives plutt que des drives absolues, il est courant de convertir [ A ] v en une forme relative en la multipliant par ces dernires : kP [ I ] 1 + [ P ] 1 + + KmP k A KmA KI ln v [ A ] v = = v [ A ] kP [ P ] [ A ] [ P ] [ I ] ln [ A ] + + 1 + 1 k A [ A ] KmA KmP KI [ A] KmA 1 = [10.3] k [P] [ A] [ P ] [ I ] + + 1 P 1+ KmA KmP kA [ A ] KI a 1 = G 1+ a + p + i 1 Keq o G = [ P ] [ A ] est le rapport d'action de masses, Keq est la constante d'quilibre dfinie en vertu de la relation d'HALDANE ( 3.6.3), et a = [ A ] KmA , p = [ P ] KmP et i = [ I ] KI sont les concentrations talonnes de manire approprie par les constantes de MICHAELIS ou d'inhibition. Cette quation peut sembler complexe, mais lorsqu'elle est rarrange sous la forme d'une diffrence entre deux fractions, comme dans les dernires formes prsentes, il est apparent que les deux fractions peuvent tre interprtes simplement : la premire mesure le dsquilibre , c'est--dire l'cart de la raction par rapport sa position d'quilibre ; la seconde mesure le degr de saturation de l'enzyme par le ractif considr. Nanmoins, complexe ou non, l'analyse du contrle mtabolique n'est pas concerne par la forme algbrique de cette drive mais par sa valeur numrique : si elle est gale zro, v ne varie pas avec [ A ] ; si elle est positive, v augmente lorsque [ A ] augmente ; si elle est ngative, v diminue lorsque [ A ] augmente. En consquence, un
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nom est attribu cette valeur, l'lasticit, qui est reprsente par le symbole , pour exprimer son importance centrale dans l'analyse du contrle mtabolique :
e [v A ]
[ A ] v ln v v [ A ] ln [ A ]
[10.4]
L'exposant v dans le symbole peut sembler suffisamment vident pour tre superflu, mais l'analyse du contrle mtabolique est toujours applique des systmes qui contiennent plusieurs enzymes, et un exposant est donc ncessaire pour spcifier quelle vitesse est considre. Si nous examinons l'quation [10.4] en relation avec le 1.2.3 de ce manuel, nous pouvons raisonnablement avoir le sentiment qu'il s'agit l d'une manire dtourne d'introduire un nouveau nom pour reprsenter un ancien concept, puisque l'lasticit d'une raction est connue de tous les biochimistes comme l'ordre de la raction. La seule diffrence est que, alors que les recommandations de l'IUBMB (IUB, 1992) dcouragent l'utilisation de ce terme lorsque les valeurs ne sont pas des entiers et proposent d'utiliser le terme d'ordre apparent, rien, ni dans l'quation [10.4], ni dans la manire dont elle est drive, ne suggre que la quantit ainsi dfinie doive tre un entier. Cependant, cette recommandation n'a pas t collgialement suivie ; elle a t cre pour viter les conflits avec les nouvelles recommandations de l'IUPAC (1981), mais peu de biochimistes s'opposent l'existence d'ordres variables. La courbe dfinie par l'quation de MICHAELIS et MENTEN dans le 3.3.4 peut tre interprte comme une transition graduelle partant d'un ordre un vis--vis du substrat pour les faibles concentrations de substrat, passant par des ordres intermdiaires et approchant un ordre zro saturation, avec un passage par un ordre 0,5 pour une concentration de A correspondant la demi-saturation de E. Il est facile de confirmer, en fixant [ P ] = 0 dans l'quation [10.3], que l'lasticit se comporte exactement de la mme manire ; elle est, en ralit, identique la quantit normalement dsigne par les biochimistes comme l'ordre de la raction. Le terme lasticit a t emprunt l'conomtrie, o il dsigne une quantit similaire celle utilise dans l'analyse du contrle mtabolique, mais avec un signe oppos : l'lasticit pour une marchandise reprsente un pourcentage de diminution dans la demande divis par le pourcentage d'augmentation de son prix qui est l'origine de la diminution de la demande. Il s'agit d'une origine obscure pour dfinir un terme biochimique et le terme d'ordre cintique utilis dans la thorie des systmes biochimiques (SAVAGEAU, 1976), une approche alternative qui couvre environ le mme domaine que l'analyse du contrle mtabolique, est bien meilleur. Nanmoins, nous continuerons d'utiliser le terme lasticit dans ce chapitre, puisque avec son synonyme le coefficient d'lasticit, il est utilis universellement dans le domaine de l'tude du contrle mtabolique. En revenant l'quation [10.1], nous pouvons la diffrencier vis--vis de chaque concentration pour obtenir l'ensemble complet des lasticits, qui seront maintenant exprimes comme des diffrences entre les termes d'cart par rapport l'quilibre
335
et les termes de saturation (comme dans la dernire forme de l'quation [10.3]), puisqu'elles sont plus faciles comprendre sous cette forme : 1 a e [v A ] = [10.5] 1+ a + p + i 1 G Keq
e [vP ]
G Keq a = G 1+ a + p + i 1 Keq
[10.6]
1 si E catalyse la raction e [vE ] 0 = 0 si E ne catalyse pas la raction i e [vI ] = 1+ a + p + i
[10.7] [10.8]
La seconde forme de l'quation [10.7] ne dcoule pas de l'quation [10.1], qui ne permettait pas de considrer l'existence de plus d'une forme d'enzyme dans le systme. Elle indique uniquement qu'un enzyme a une lasticit nulle vis--vis d'une raction qu'il ne catalyse pas : un point qui peut sembler vident, mais qu'il est ncessaire de prciser explicitement puisqu'il joue un rle important dans la thorie du contrle mtabolique.
10.3.2. Proprits communes des lasticits

Bien que les quations [10.5] [10.8] aient t drives partir d'un modle spcifique, l'quation rversible de MICHAELIS et MENTEN, et que leur formes exactes soient dpendantes de ce modle, elles illustrent un nombre de points qui s'appliquent gnralement dans un certain nombre de cas : Les lasticits des ractifs sont normalement positives quand la direction impose par le dsquilibre est telle que le ractif est un substrat, et ngatives quand il s'agit d'un produit ( normalement signifie que l'inhibition par le substrat et l'activation par le produit sont des phnomnes exceptionnels). Notons cependant que le passage d'une valeur positive une valeur ngative lorsque la raction passe d'un ct l'autre de la position d'quilibre ne passe pas par zro, comme nous pourrions navement le penser, mais par l'infini : les lasticits des ractifs sont infinies l'quilibre ! Cette caractristique souligne le danger d'incorporer des quations irrversibles de vitesse dans une simulation sur ordinateur. Avec des ractions irrversibles, en absence de cooprativit et d'inhibition par le substrat, les lasticits des substrats se situent normalement dans une gamme allant de 0 1 : des valeurs proches de zro sont caractristiques des concentrations leves de substrat, et des lasticits infinies sont impossibles. Il en dcoule que les valeurs numriques des lasticits pour de telles ractions sont entirement diffrentes de celles vraisemblablement rencontres dans les cellules vivantes.
336
Les enzymes ont des lasticits gales 1 pour leurs propres ractions (et des lasticits nulles pour les autres ractions, bien que ce ne soit pas illustr dans l'quation [10.7]). Ces gnralisations ne sont pas universelles, puisqu'elles dpendent de l'hypothse selon laquelle chaque vitesse est proportionnelle la concentration totale d'un seul enzyme. Elles ne sont plus valables si un enzyme s'associe (avec lui-mme o avec un autre enzyme du systme) pour produire des espces dont les proprits cintiques sont diffrentes. Une grande partie de l'analyse du contrle mtabolique repose sur l'hypothse que ces gnralisations sont vrifies et les quations deviennent beaucoup plus compliques dans le cas contraire. Les lasticits pour les inhibiteurs non-ractionnels sont toujours ngatives. Inversement, les lasticits des activateurs non-ractionnels sont toujours positives. La qualification de non-ractionnel peut tre ignore si nous nous rappelons qu'un produit inhibiteur est transform en un substrat quand la direction du flux s'inverse. De plus, les lasticits des inhibiteurs et des activateurs non-ractionnels sont indpendantes du degr de dsquilibre du systme (la qualification est dans ce cas indispensable).
10.3.3. Les cintiques enzymatiques vues travers l'analyse du contrle

Du point de vue de l'analyse du contrle mtabolique, la mesure des lasticits est ce que les enzymologistes ralisent depuis l'poque de MICHAELIS et MENTEN, mme si ce terme reste peu familier. Nanmoins, certaines diffrences doivent tre mises en vidence, et les mesures ralises dans les expriences traditionnelles peuvent s'avrer inutiles pour l'analyse du contrle mtabolique. Dans les tudes ordinaires des enzymes, les expriences sont habituellement mises au point pour fournir une information concernant le mcanisme d'action de l'enzyme. Mme les exprimentateurs dont les objectifs sont de comprendre la physiologie d'un systme biologique suivent les procdures initialement tablies pour caractriser le mcanisme d'action des enzymes. Puisque diffrents mcanismes d'action prdisent des comportements qui ne diffrent entre eux que de faon minimale, s'ils diffrent d'une quelconque manire, nous sommes souvent forcs de mettre soigneusement au point des expriences permettant de mettre en vidence les petites dviations de comportement qui peuvent exister, et les expriences elles-mme doivent tre ralises avec la plus grande prcision. L'analyse cintique implique frquemment de raliser une extrapolation des donnes exprimentales vers des concentrations infinies ou nulles (voir 6.5.1). De plus, les expriences sont rarement faites avec un systme qui s'approche, ne fusse que de loin, d'un systme biologique complet, c'est--dire qu'il est rare qu'un enzyme dans une cuvette ait la possibilit de rencontrer les mtabolites qui pourraient influencer son activit dans la cellule ; si mme certains enzymes supplmentaires sont prsents, il s'agit en gnral de contamination en traces dont l'effet est ngligeable sur l'enzyme d'intrt ou il s'agit d'enzymes composant un systme coupl qui sont ajouts dlibrment en quantit
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optimale pour le test, sans aucune relation avec les concentrations qui pourraient exister dans la cellule. Toutes ces caractristiques sont totalement inappropries pour l'analyse du contrle mtabolique. Bien que nous soyons toujours intresss par dcrire le comportement cintique d'un enzyme, l'objectif dans ce cas n'est pas de comprendre le mcanisme mais d'intgrer la description cintique dans une description du comportement cintique d'un systme au niveau le plus simple, un systme de quelques enzymes constituant une voie mtabolique et au niveau le plus complexe un organe entier ou un organisme. En premire approximation, nous pouvons considrer que les proprits qui sont la limite de la prcision de l'quipement dont nous disposons et qui, en consquence, sont difficiles mesurer, ne sont pas importantes dans le comportement du systme : si les diffrences mcaniques ne produisent pas de diffrences majeures dans le comportement cintique, elles sont sans importance. D'un autre ct, nous ne pouvons plus nous permettre de simplifier l'exprience en omettant certains mtabolites qui affectent la cintique : tous les ractifs et tous les effecteurs doivent tre prsents des concentrations aussi proches que possibles de celles rencontres dans les cellules. Ceci inclut les produits, et implique que les ractions doivent tre tudies dans des conditions o elles sont rversibles. Mme si la constante d'quilibre favorise fortement la raction dans une direction, les conditions devraient permettre au systme, au moins dans le principe, d'tre rversible ; en dehors de tout autre chose, l'inhibition par le produit peut tre significative, mme si la raction inverse dans son entiret ne l'est pas. En dpit de l'importance accorde l'utilisation d'un mlange ractionnel raliste, les mesures d'lasticit restent artificielles pour une raison : elles font rfrence un enzyme isol de sa voie mtabolique, c'est--dire qu'elles traitent comme des constantes toutes les concentrations de mtabolites qui influencent son activit, ignorant les effets que d'autres enzymes dans la voie pourraient avoir sur ces concentrations.
10.3.4. Considration des vitesses et des concentrations comme des effets et non comme des causes
Comme nous en avons discut, les vitesses et les concentrations d'intermdiaires sont toutes deux des proprits du systme mtabolique dans son ensemble et nous ne pouvons considrer l'une d'elles comme variable indpendante sauf si elles sont dfinies de cette manire quand le systme tudi est dfini. Nous pouvons mieux comprendre l'importance de ce point en considrant une situation oppose celle qui est gnralement envisage pour une tude par spectroscopie. Supposons qu'un enzyme se comporte de manire ordinaire (c'est--dire qu'il suive une cintique de MICHAELIS et MENTEN), mais une exprience est imagine dans laquelle la vitesse est fixe par l'exprimentateur et la concentration de substrat qui en rsulte est alors mesure. Il est dans ce cas appropri d'crire l'quation de MICHAELIS et MENTEN
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comme une expression de [ A ] en fonction de v plutt que l'inverse comme dans l'quation [3.36] : Km [ A] = [10.9] V 1 v Pour prsenter les rsultats d'une telle exprience, nous inverserons les axes habituels, c'est--dire que nous tracerons le graphique de [ A ] en fonction de v plutt que l'inverse. Ainsi, la place de la figure 3.7, nous devons tracer l'hyperbole de MICHAELIS et MENTEN comme dans la figure 10.2. Celle-ci est exactement la mme courbe que celle de la figure 3.7, mais son impact psychologique est diffrent, comme nous pouvons le voir en essayant de dcrire le comportement de l'enzyme pour des concentrations de substrat proches de 5K m ou pour des vitesses au environ de 0,8 V. Si nous considrons la courbe de la figure 3.7, nous pourrions dire que cette rgion du graphique est plutt inintressante puisque rien ne s'y passe si les conditions sont modifies, c'est--dire si [ A ] varie. Mais en partant du mme point dans la figure 10.2, nous sommes proches d'une catastrophe, puisqu'une augmentation de seulement 20% de v amnerait le mme enzyme, dot des mmes proprits cintiques, vers un tat o aucun tat stationnaire n'est possible, puisque v atteindrait V.
[A]/Km
5
12,6% v/V
1
3 0,5 2 0 1
0,64%
2,5% 0 1 2 3 4 5
[A]/Km
2,5%
0,4 0,6 0,8
0,2
v/V
10.2 - Reprsentation diffrente de la relation de MICHAELIS et Menten L'insert (une forme modifie de la figure 3.7) montre la reprsentation habituelle o v (normalise par V) est trac en fonction de [ A ] (normalise par Km). Dans cette reprsentation, la rgion proche de la saturation est celle dans laquelle de faibles variations de [ A ] conduisent de faibles variations de v. Cependant, dans un systme mtabolique il n'est pas moins correct de considrer [ A ] comme une fonction de v. Dans ce cas, nous pouvons considrer la mme rgion comme proche d'une catastrophe, puisque de faibles variations de v produisent de trs grandes variations de [ A ].
339
Ni la figure 3.7, ni la figure 10.2 ne reprsente rellement la situation dans la cellule puisque ni [ A ] , ni v ne peut rellement tre manipul indpendamment de l'autre. Cependant, la figure 10.2 peut souvent tre plus proche de la ralit, parce que beaucoup d'enzymes impliqus dans des tapes centrales des voies mtaboliques ne peuvent que transformer les substrats aussi vite ou aussi lentement qu'ils les reoivent, c'est--dire que de tels enzymes peuvent oprer la vitesse ncessaire, ajustant les concentrations autour d'eux. Donc, nous ne devons pas considrer un tat proche de la saturation comme une situation ennuyeuse o rien ne se passe, mais comme la proximit d'une catastrophe, un point de vue qui a t particulirement mis en vidence par ATKINSON (1977). Un cas encore plus frappant est fourni si nous considrons les types simples d'inhibition (chapitre 5) (CORNISH-BOWDEN, 1986). Pour autant que nous considrions une quation cintique comme une expression de la dpendance de la vitesse vis--vis d'une ou de plusieurs concentrations, la diffrence est trs faible mme entre les cas extrmes d'inhibition que sont l'inhibition comptitive et l'inhibition anti-comptitive ; les diffrences entre les divers niveaux de l'inhibition mixte sont mme encore plus faibles. En consquence, la majorit des inhibiteurs sont dcrits dans la littrature comme des inhibiteurs comptitifs, sans aucune attention pour une ventuelle composante anti-comptitive, puisque celle-ci passe inaperue pour la plupart des exprimentateurs. Ds que nous considrons un enzyme dont le rle est d'ajuster les concentrations autour de lui afin de satisfaire la vitesse qui est fixe extrieurement, la situation change dramatiquement et mme le plus inattentif des exprimentateurs remarquerait facilement la diffrence entre une inhibition comptitive et une inhibition anti-comptitive. Les quations correspondant l'quation [10.9] sont
[ I ] Km 1 + Kic [ A] = V 1 v
pour l'inhibition comptitive et
[10.10]
[ A] =
Km V 1 [ I ] v Kiu
[10.11]
pour l'inhibition anti-comptitive. Ces deux quations ne prsentent pas simplement une variation mineure l'une par rapport l'autre ; elles sont compltement et irrmdiablement diffrentes l'une par rapport l'autre. Puisque [ I ] a un effet linaire sur [ A ] dans l'quation [10.10], quelle que soit la variation de [ I ] , la variation correspondante de [ A ] sera toujours proportionnellement plus petite. Dans l'quation [10.11], la prsence de [ I ] dans un terme ngatif du dnominateur signifie que le dnominateur peut prendre une valeur nulle et donc qu'il est impossible pour le systme d'atteindre un tat stationnaire. Cette situation peut tre rencontre pour
340
des concentrations modres d'inhibiteur. Si l'enzyme est moiti satur en absence d'inhibiteur, par exemple, alors V v = 2 et l'ajout d'une concentration d'inhibiteur telle que [ I ] = Kiu est suffisant pour que l'tat stationnaire ne puisse tre atteint. Cela signifie que si [ I ] est suprieure Kiu, la concentration de substrat augmentera indfiniment et aucun tat stationnaire ne sera atteint par le systme. Il dcoule de ces considrations que dans une cellule vivante l'inhibition comptitive est presque sans intrt, puisqu'une petite variation de la concentration de substrat peut compenser les variations de la concentration d'inhibiteur. Pour cette raison, les efforts consentis pour produire des composs pharmacologiques utiles en recherchant des analogues de substrats naturels (c'est--dire des substances susceptibles d'tre des inhibiteurs comptitifs) seront probablement vous l'chec. Des inhibiteurs anti-comptitifs, au contraire, pourraient avoir des effets potentiellement plus dvastateurs sur les cellules vivantes, et ceci peut expliquer pourquoi il est difficile de trouver des exemples clairs d'inhibiteurs anti-comptitifs naturels. Il est probable que ceci explique aussi l'efficacit de l'herbicide commercial Glyphosate (ou Roundup ) qui est un inhibiteur anti-comptitif de la 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransfrase (BOOCOCK et COGGINS, 1983). Il est galement bon de noter que la diffrence qualitative entre les quations [10.10] et [10.11] provient du coefficient du terme ngatif en [ I ] dans l'quation [10.11] ; la diffrence entre les numrateurs est de moindre importance. Nous pouvons nous attendre ce que la question importante soit de savoir si une composante anti-comptitive est ou non prsente : si cela est le cas, mme si celleci est quantitativement plus faible que la composante comptitive dans les conditions ordinaires concentration fixe du substrat, elle produira des effets anticomptitifs vidents.
10.4. LES COEFFICIENTS DE CONTRLE

Jusqu'ici nous avons uniquement discut du comportement cintique ordinaire d'enzymes isols, mme si nous avons utilis une terminologie quelque peu diffrente de celle utilise dans l'tude des mcanismes enzymatiques. L'objectif de l'analyse du contrle mtabolique est maintenant de dterminer comment le comportement cintique d'une squence d'enzymes composant une voie mtabolique peut tre expliqu en termes des proprits des enzymes individuels isols. Si un systme tel que celui dfini dans la figure 10.1 est choisi, les concentrations des rservoirs X0 et X5 sont constantes, comme le sont les proprits cintiques des enzymes, mais les vitesses des enzymes individuels vi et les concentrations des mtabolites internes [ Si ] 2. sont libres de varier. Mme si, initialement, ces concentrations sont arbitraires, elles varient de sorte que chacune se rapproche de l'tat
2. Voir note [1], page 329.
341
stationnaire. (Notons que l'tat stationnaire peut ne jamais tre atteint et que s'il en existe un, il n'est pas ncessairement unique : par souci de simplicit, cependant, nous supposerons qu'il n'existe qu'un seul tat stationnaire possible). Si nous considrons S1, par exemple, il est vident que l'tat stationnaire implique que la vitesse v1 laquelle il est produit doit tre gale la vitesse v2 laquelle il est consomm. Un tat stationnaire pour S2 de la mme manire implique que v2 = v3 et ainsi de suite ; quand tous les mtabolites sont l'tat stationnaire toutes les vitesses enzymatiques doivent tre gales les unes aux autres, une situation qui est caractrise par une valeur J, qui est le flux travers la voie mtabolique. Cette galit de toutes les vitesses provient du fait que la figure 10.2 dfinit une voie non-branche. Si la voie mtabolique est branche, les relations sont plus complexes, mais les principes sont directs et vidents : le flux total entrant au niveau de chaque mtabolite situ un branchement est gal au flux sortant. Les vitesses enzymatiques sont des proprits locales, parce qu'elles font rfrence des enzymes isols du systme. Les flux l'tat stationnaire et les concentrations de mtabolites, par contre, sont des proprits systmiques 3. Les lasticits sont galement des proprits locales, mais elles sont analogues des proprits systmiques appeles coefficients de contrle. Supposons qu'un changement quelconque d'un paramtre externe p (non dfini pour le moment prsent) provoque le changement d'une vitesse locale vi quand l'enzyme Ei est isol, quel sera l'effet correspondant sur le flux du systme quand Ei est intgr dans le systme ? Ce rsultat n'est pas connu a priori et le iime coefficient de contrle du flux est dfini par le rapport suivant de drives : ln J ln p ln J [10.12] = CiJ = ln vi ln vi ln p La forme la plus simple prsente ici droite n'est pas strictement correcte parce que vi n'est pas une vritable variable indpendante du systme, mais elle reste acceptable pour autant que nous rappelions qu'il existe toujours un paramtre externe p qui est impliqu, mme s'il n'apparat pas explicitement. Cette dfinition correspond la manire dont HEINRICH et RAPOPORT (1974) ont dfini leur force de contrle. Par opposition, le coefficient de sensibilit de KACSER et BURNS (1973) a t dfini en termes de l'effet des changements de la concentration d'enzyme sur le flux (ces deux termes ont t supplants dans les tudes modernes par le coefficient de contrle) : ln J CiJ = [10.13] ln [ Ei ]
3. La distinction entre flux et vitesse faite dans l'analyse du contrle mtabolique n'a pas de correspondance vidente avec la distinction entre vitesse et flux faite dans les expriences de marquage radioactif ( 7.5.1).
342
Ces dfinitions peuvent paratre diffrentes, mais si l'quation [10.7] est vrifie, c'est--dire si chaque vitesse enzymatique est proportionnelle la concentration totale d'enzyme, les quations [10.12] et [10.13] sont quivalentes. L'quation [10.12] a l'avantage d'viter l'erreur de comprhension largement rpandue qui est de considrer que l'analyse du contrle mtabolique est limite aux effets des changements de concentration d'enzyme. Initialement, il tait habituel de suivre KACSER et BURNS et d'utiliser des dfinitions similaires celles de l'quation [10.13], mais il est maintenant gnralement accept que les coefficients de contrle ne doivent pas tre dfinis en terme d'un paramtre spcifique, et que l'quation [10.12] doit tre considre comme la dfinition fondamentale du coefficient de contrle. La quantit dfinie par l'quation [10.13] peut alors plus correctement tre dsigne comme un exemple de coefficient de rponse, qui est numriquement gale au coefficient de contrle correspondant uniquement parce que l'lasticit qui les relient est suppose tre gale 1 (voir 10.7 ci-dessous). Un coefficient de contrle de la concentration est la quantit correspondante qui dfinit les effets sur les concentrations de mtabolites, par exemple pour un mtabolite Sj une concentration [ S j ] :
Ci
[S j]
ln [ S j ] ln [ S j ] ln p = = ln vi ln vi ln p
[10.14]
Dans cette quation la forme la plus simple droite est sujette aux mme rserves que celles formules pour l'quation [10.12], c'est--dire qu'elle implique l'existence d'un paramtre p mme si celui-ci n'apparat pas explicitement.
10.5. RELATIONS D'ADDITION

Les proprits fondamentales des coefficients de contrle sont exprimes par deux relations d'addition, parmi lesquelles la premire, due KACSER et BURNS (1973), dfinit la somme des coefficients de contrle de flux :
i =1CiJ
n
= 1
[10.15]
et la seconde, due HEINRICH et RAPOPORT (1975), dfinit la somme des coefficients de concentrations :
i =1Ci
n
[S j]
= 0
[10.16]
dans lesquels n est le nombre d'enzymes prsents dans le systme et [ Si ] est la concentration de n'importe quel mtabolite interne. Si la voie mtabolique est branche il y aura plus d'un flux : dans ce cas l'quation [10.15] reste valable, mais J est dfini comme un de ces flux.
343
Diverses preuves de la validit de ces relations existent, parmi lesquelles celle de REDER (1998) est probablement la plus rigoureuse et la plus gnrale. Cependant, comme celle-ci suppose une connaissance de l'algbre linaire, nous ne la dvelopperons pas ici, mais nous prfrerons l'exprience thorique originale de KACSER et BURNS (1973) qui est plus facile comprendre. Supposons que nous faisons un petit changement d [ Ei ] dans la concentration de tous les enzymes d'un systme donn dans lequel les vitesses de raction sont toutes proportionnelles aux concentrations des enzymes qui les catalysent. L'effet total sur le flux J peut tre crit comme la somme de tous les effets individuels :
dJ =
J d [ E ] + J d [ E ] + J d [ E ] + 1 2 3 [ E1 ] [ E 2 ] [ E3 ]
[10.17]
En divisant tous les termes par J, en multipliant chaque terme de la partie droite de l'quation par 1 (exprim comme un rapport de concentrations gales d'enzyme) et en introduisant les dfinitions des coefficients de contrle de flux, nous obtenons :
dJ J
= =
[ E1 ] J d [ E1 ] [ E2 ] J d [ E2 ] [ E3 ] J d [ E3 ] + + + J [ E1 ][ E1 ] J [ E2 ][ E2 ] J [ E3 ][ E3 ] ln J d [ E2 ] ln J d [ E1 ] ln J d [ E3 ] + + + ln [ E1 ][ E1 ] ln [ E2 ][ E2 ] ln [ E3 ][ E3 ] d [ E1 ] J d [ E2 ] J d [ E3 ] + C2 + C3 + [ E1 ] [ E2 ] [ E3 ]
[10.18]
= C1J
Puisque nous n'avons fait aucune supposition concernant les grandeurs des changements d [ Ei ] , except qu'ils sont petits, nous pouvons leur donner n'importe quelle petite valeur et donc nous pouvons supposer que chaque concentration d'enzyme change dans la mme proportion, de sorte que chaque d [ Ei ] [ Ei ] a la mme valeur a. Une brve rflexion nous permet de raliser qu'un tel changement est quivalent modifier l'chelle de temps sur laquelle la mesure est ralise : donc ce changement devrait modifier tous les flux d'tat stationnaire travers le systme d'un mme facteur a. Il s'ensuit alors que l'quation [10.18] peut tre crite de la manire suivante : J J [10.19] a = C1J a + C 2 a + C3 a + ou de la manire suivante :
J J 1 = C1J + C 2 + C3 +
[10.20]
qui est quivalente l'quation [10.16]. En appliquant la mme logique aux coefficients de contrle des concentrations, la seule diffrence est qu'un changement de l'chelle de temps devrait laisser inchanges toutes les concentrations et donc nous devons avoir zro dans la partie gauche de l'quation : [ [ [10.21] 0 = C1[ S J ] + C 2 S J ] + C3 S J ] + qui est quivalente l'quation 10.16.
344
L'essence de l'quation [10.15] est que le contrle du flux travers une voie mtabolique est partag par tous les enzymes du systme et qu'il n'y a aucune raison de considrer l'existence d'une tape limitante dans le systme, c'est--dire d'une tape catalyse par un enzyme dont les proprits dterminent le comportement cintique de l'ensemble du systme. Si tous les coefficients de contrle de flux sont positifs, l'ide de partage du contrle est directement vidente : aucun enzyme ne peut avoir un coefficient de contrle de flux suprieur 1, et si un des enzymes a un coefficient proche de 1, les autres doivent avoir des coefficients beaucoup plus petits. Ceci est normalement le cas pour les voies non-branches, bien que certaines exceptions existent, si une inhibition par le substrat ou une activation par le produit domine le comportement de certains enzymes. Avec des voies branches, l'ide du partage est moins claire parce que les coefficients de contrle de flux sont souvent ngatifs et qu'ils peuvent galement tre suprieurs 1. Cependant, les gnralisations suivantes s'appliquent le plus souvent (bien que pas de manire universelle) : chaque enzyme possde un coefficient de contrle de flux positif pour sa propre raction ; les coefficients de contrle de flux ngatifs numriquement significatifs ne sont pas trs communs, se prsentant principalement pour des enzymes et des flux qui se droulent dans des branches diffrentes, immdiatement en aval d'un point de branchement. Dans la mesure o ces gnralisations sont applicables, il s'ensuit que la somme des coefficients de contrle de flux pour tous les enzymes d'une voie mtabolique linaire sera approximativement gale 1, mme si cette voie constitue seulement une partie du systme qui est tudi. Donc l'ide selon laquelle le contrle du flux travers une voie est partag par l'ensemble des enzymes qui catalysent les ractions de cette voie, et celle selon laquelle l'existence d'une seule tape limitante est improbable, restent suffisamment significatives pour tre utiles mme dans le cas de l'analyse de systmes branchs.
10.6. RELATIONS ENTRE LES LASTICITS

ET LES COEFFICIENTS DE CONTRLE DE FLUX
10.6.1. Proprits de connectivit
Pour une voie non-branche de n enzymes, il existe une seule relation d'addition des coefficients de contrle de flux et (n 1) relations d'addition entre les coefficients de contrle des concentrations, mais il existe n coefficients de contrle de flux et n (n 1) coefficients de contrle de concentrations, ce qui au total donne n2 coefficients. En effet, les relations d'addition fournissent n quations reliant n2 inconnues. Pour calculer toutes ces inconnues, n (n 1) quations supplmentaires sont ncessaires. Celles-ci sont obtenues partir des proprits de connectivit, que nous allons dcrire maintenant.
345
Si la concentration d'un enzyme [ Ei ] et celle d'un mtabolite [ Si ] changent simultanment et respectivement de d [ Ei ] et d [ Si ] de telle sorte que ces changements ne produisent aucun effet sur la vitesse vi travers l'enzyme impliqu, les changements doivent tre relis entre eux de la manire suivante :
d[ Sj ] dvi d [ Ei ] = + e [v iS j ] = 0 vi [ Ei ] [ Sj ]
ou
[10.22] [10.23]
d[ Sj ] d [ Ei ] = e [v iS j ] [ Ei ] [ Sj ]
Une quation correspondante peut tre crite pour chaque valeur de i, de sorte que nous pouvons facilement calculer les petites variations qui doivent tre apportes la concentration de chaque enzyme pour produire une variation donne de la concentration d'un des mtabolites, en conservant les concentrations des autres mtabolites, et les vitesses (et donc les flux) inchanges. S'il n'y a aucune variation du flux pour une srie donne de perturbations de l'enzyme, l'quation [10.18] peut s'crire de la manire suivante :
0 = C1J
d [ E1 ] J d [ E2 ] J d [ E3 ] + C2 + C3 + [ E1 ] [ E2 ] [ E3 ]
[10.24]
En substituant l'quation [10.23] pour chacune des valeurs de i dans cette dernire et en liminant les facteurs communs d [ S j ] [ S j ] de tous les termes, nous obtenons : J J C1J e [v1S j ] + C 2 e [v 2 j ] + C3 e [v 3 j ] + = 0 [10.25] S S Cette dernire quation exprime maintenant la proprit de connectivit entre les coefficients de contrle de flux et les lasticits, qui a t dcouverte par KACSER et BURNS (1973). Dans une voie mtabolique relle, certaines valeurs d'lasticit sont normalement gales zro, puisqu'il est trs improbable que chaque mtabolite ait un effet significatif sur chaque enzyme. En consquence, certains des termes des sommes, telle que celle de l'quation [10.25], seront gnralement manquants, mais dans ce , nous inclurons tous les termes qui doivent en principe s'y trouver. Puisqu'aucune concentration de mtabolite, l'exception de [ S j ] , n'a t modifie, une quation similaire l'quation [10.24] s'applique pour tout mtabolite Sk pour lequel k j : d [ E3 ] d [ E2 ] d [ E1 ] [ [ 0 = C1[ S k ] + C2 S k ] + C3 S k ] + [10.26] [ E1 ] [ E2 ] [ E3 ] Si k = j , il y a une variation d [ S j ] [ S j ] et donc :
d[ Sj ] [ S ] d [ E1 ] [ S ] d [ E2 ] [ S ] d [ E3 ] = C1 j + C2 j + C3 j + SJ [ E1 ] [ E2 ] [ E3 ]
[10.27]
346
En substituant l'quation [10.23] comme ci-dessus, nous obtenons les proprits de connectivit entre les coefficients de contrle des concentrations et les lasticits (WESTERHOFF et CHEN, 1985) :
1 si k = j [ [ C1[ S k ] e [v1S j ] + C 2 S k ] e [v 2 j ] + C3 S k ] e [v 3 j ] + = S S 0 si k j
[10.28]
Pour une voie non-branche de n enzymes, il y a (n 1) quations similaires l'quation [10.25], une pour chaque mtabolite, et (n 1)2 quations similaires l'quation [10.28], une pour chaque combinaison de deux mtabolites, ce qui au total donne n (n 1) quations supplmentaires qui doivent tre combines avec les n relations d'addition pour donner les n2 quations ncessaires pour calculer tous les coefficients de contrle partir des lasticits.
10.6.2. Les coefficients de contrle dans une voie trois tapes

Bien que des complications soient amenes par l'existence de voies branches, celles-ci n'altrent en rien le point essentiel qui est qu'un nombre suffisant de relations indpendantes entre les coefficients de contrle et les lasticits doit exister pour qu'il soit possible, en principe, de calculer tous les coefficients de contrle. Ces considrations non seulement tablissent que les proprits d'tat stationnaire (les coefficients de contrle) d'un systme complet dcoulent des proprits de ses composants (lasticits), mais elles montrent galement comment le calcul peut tre ralis. La solution relle de n2 quations simultanes est complique si n n'est pas trivialement petit, et dans la pratique courante, le problme est trait par l'algbre linaire (FELL et SAURO, 1985 ; FELL, 1992). Nous n'entrerons pas ici dans ces dtails, mais nous examinerons uniquement les rsultats d'un tel calcul pour un exemple simple : E1 E2 E3 X0 S1 S2 X3 [10.29] Pour la voie trois tapes prsente dans l'quation [10.29] les trois coefficients de contrle du flux peuvent tre exprims de la manire suivante en fonction des lasticits : e [v 2 1 ] e [v 3 2 ] S S J [10.30] C1 = v v3 2 e [ S 1 ] e [ S 2 ] e [v1S 1 ] e [v 3 2 ] + e [v1S 1 ] e [v 2 2 ] e [v 2 1 ] e [v1S 2 ] S S S
J C2
e [v1S 1 ] e [v 3 2 ] S e [v 2 1 ] e [v 3 2 ] e [v1S 1 ] e [v 3 2 ] + e [v1S 1 ] e [v 2 2 ] e [v 2 1 ] e [v1S 2 ] S S S S S e [v1S 1 ] e [v 2 2 ] e [v 2 1 ] e [v1S 2 ] S S e [v 2 1 ] e [v 3 2 ] e [v1S 1 ] e [v 3 2 ] + e [v1S 1 ] e [v 2 2 ] e [v 2 1 ] e [v1S 2 ] S S S S S
[10.31]
J C3
[10.32]
347
Les termes du numrateur sont placs au-dessus des termes correspondants du dnominateur afin de mettre en vidence que non seulement le dnominateur est identique dans les trois expressions mais qu'il correspond galement la somme des numrateurs en accord avec la relation d'addition de l'quation [10.15]. Chaque terme du dnominateur consiste dans un produit d'lasticits, une pour chaque mtabolite interne du systme ; pour une voie linaire, il y a une seule valeur d'lasticit par enzyme except pour celui qui est modul, c'est--dire celui dont le coefficient de contrle est en train d'tre exprim. Les signes ngatifs dans les quations [10.30] [10.32] proviennent naturellement de l'algbre. Nous ne devrions pas nous laisser abuser par ceux-ci en pensant que l'un de ces termes est ngatif dans les quations. Dans des conditions normales (dfinies dans le 10.3.2 comme des conditions o il n'y a ni inhibition par le substrat, ni activation par le produit) la combinaison des lasticits positives du substrat avec les lasticits ngatives des produits rend positifs tous les termes de ces trois quations. Il existe des relations correspondantes pour chaque concentration de mtabolite, par exemple pour S1 : e [v 3 2 ] e [v 2 2 ] S S [10.33] C1[ S 1 ] = v v3 v1 v3 v1 2 e [ S 1 ] e [ S 2 ] e [ S 1 ]? [ S 2 ] + e [ S 1 ] e [v 2 2 ] e [v 2 1 ] e [v1S 2 ] S S
[ C2 S 1 ] =
e [v1S 2 ] e [v 3 2 ] S e [v 2 1 ] e [v 3 2 ] e [v1S 1 ] e [v 3 2 ] + e [v1S 1 ] e [v 2 2 ] e [v 2 1 ] e [v1S 2 ] S S S S S e [v 2 2 ] e [v1S 2 ] S e [v 2 1 ] e [v 3 2 ] e [v1S 1 ] e [v 3 2 ] + e [v1S 1 ] e [v 2 2 ] e [v 2 1 ] e [v1S 2 ] S S S S S
[10.34]
[ C3 S 1 ] =
[10.35]
Ces quations ont le mme dnominateur que celles pour les coefficients de contrle de flux, quations [10.30] [10.32], mais maintenant chaque terme du numrateur contient une lasticit de moins que les termes du dnominateur, puisque la concentration [S1] qui apparat comme un indice dans la partie gauche de l'quation n'apparat pas parmi les lasticits au numrateur. Comme prcdemment, l'enzyme modul est manquant de tous les produits, et un enzyme supplmentaire est manquant dans chaque produit. Chaque terme du numrateur apparat deux fois dans les trois expressions, avec des signes opposs ; par exemple, le terme e [v 3 2 ] dans l'quation [10.33] est balanc par le terme e [v 3 2 ] dans l'S S quation [10.34]. Cette balance entre les termes du numrateur assure que la relation d'addition de l'quation [10.16] est vrifie.
348
10.6.3. Expression des relations d'addition et de connectivit sous une forme matricielle
Bien que nous vitions l'algbre linaire autant que possible dans ce manuel, les lecteurs familiers avec celui-ci trouveront peut tre utile d'analyser les rsultats du paragraphe prcdent sous une forme permettant leur comparaison avec les articles de revues qui utilisent la formulation matricielle. Celle-ci devient presque indispensable pour appliquer l'analyse du contrle mtabolique un niveau autre que le niveau lmentaire. Considrons, par exemple, l'quation suivante dans laquelle nous ferons rfrence la premire matrice comme la matrice C, la seconde comme la matrice et la partie droite comme la matrice unit :
C1J [ S1 ] C1 [S2] C1
J C2 [ C2 S 1 ] [ C2 S 2 ]
1 e [v1S ] 1 [ S1 ] v2 C3 1 e [ S 1 ] [ C3 S 2 ] 1 0
J C3
1 0 0 e [v1S 2 ] e [v 2 2 ] = 0 1 0 S 0 0 1 e [v 3 2 ] S
[10.36]
Notons premirement que la premire ligne de la matrice C contient les trois coefficients de contrle de flux, alors que les lignes deux et trois contiennent respectivement les coefficients de contrle des concentrations pour les deux intermdiaires S1 et S2. La matrice contient un vecteur unit dans la premire colonne alors que les autres entres contiennent toutes les lasticits, parmi lesquelles e [v 3 1 ] S est remplace par 0 puisque S1 est suppos dans l'quation [10.29] n'avoir aucun effet sur E3. Le produit de la premire ligne de C et de la premire colonne de donne la premire entre dans le coin suprieur gauche de la matrice unit, c'est-dire 1, et donc exprime la relation d'addition pour les coefficients de contrle de flux (voir quations [10.15] et [10.20]). D'une manire similaire, les relations d'addition des coefficients de contrle des concentrations sont exprimes par les produits des autres lignes de C et de la premire colonne de . La relation de connectivit pour les coefficients de contrle de flux est exprime par le produit de la ligne suprieure de C et des lignes de , autres que la premire. Les relations de connectivit pour les coefficients de contrle des concentrations sont exprimes par tous les autres produits possibles qui n'ont pas t mentionns ici explicitement.
10.6.4. Relation de connectivit pour un mtabolite non-impliqu dans une boucle de contrle rtroactif
Chaque mtabolite a au moins deux lasticits de valeur non-nulle, puisque chaque mtabolite affecte la vitesse de l'enzyme pour lequel il est le substrat et celle de l'enzyme pour lequel il est le produit. Nanmoins, les mtabolites qui ne sont pas impliqus dans des effets de contrle rtroactif ou de contrle par un prcurseur et
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qui ne sont pas des substrats ou des produits de plusieurs enzymes la fois, auront uniquement ces deux lasticits non-nulles, et la relation de connectivit prendra alors une forme simple. Par exemple, pour S1 dans l'quation [10.29], nous obtenons : J C1J e [v1S 1 ] = C 2 e [v 2 1 ] [10.37] S qui montre que le rapport des coefficients de contrle de flux de deux enzymes conscutifs est gal moins la rciproque du rapport des lasticits du mtabolite qui les connecte (d'o le nom de relation de connectivit) :
e [v 2 ] C1J S = v 1 J 1 C2 e[ S 1 ]
[10.38]
Cette relation permet de se dplacer le long d'une voie en reliant les coefficients de contrle par paires et puisque les coefficients de contrle sont en principe beaucoup plus difficiles mesurer directement que les lasticits, cette relation constitue un avantage important.
10.6.5. Le coefficient de contrle de flux d'un enzyme pour le flux au travers de sa propre raction
La complication des expressions algbriques utilises dans l'analyse du contrle mtabolique, et en particulier l'utilisation croissante de l'algbre linaire, peut occulter des proprits qui sont videntes, si nous ne prenons pas soin de garder l'esprit la chimie sous-jacente. Un exemple est fourni par le degr de contrle exerc par un enzyme Ei sur le flux travers la raction qu'il catalyse. Si nous ignorons la complication de l'existence possible dans le systme de plusieurs enzymes qui catalysent la mme raction (c'est--dire la possibilit de l'existence d'isoenzymes), alors il est vident que la vitesse vi dpend uniquement de l'activit de l'enzyme lui-mme, qui est dtermine par sa propre concentration, par les concentrations de son substrat S et de son produit P comme pressenti par leur valeur nonnulle d'lasticit et par la concentration de tout autre mtabolite pour lequel l'lasticit est non-nulle, que nous pouvons ici reprsenter par un mtabolite arbitraire M. Ainsi, par le mme type d'exprience thorique que celle qui nous a conduit l'quation [10.17], nous obtenons l'expression suivante :
dJ i =
vi vi vi vi d[ M ] d[ P ] + d[ S ] + d [ Ei ] + [ M ] [ P ] [ S ] [ Ei ]
[10.39]
Nous pouvons crire le flux l'tat stationnaire Ji travers l'tape catalyse par Ei dans la moiti gauche de cette expression plutt que vi parce que, l'tat stationnaire, les valeurs de ces deux variables sont identiques. En divisant tous les termes par vi d [ Ei ] [ Ei ] (ou par Ji d [ Ei ] [ Ei ] ) et en substituant les dfinitions des coefficients de contrle et des lasticits, nous obtenons :
i i CiJ = 1 + e [v iS ] Ci[ S ] + e [vP ] Ci[ P ] + e [vM ] Ci[ M ]
[10.40]
350
Dans cette quation, le premier terme du ct droit de l'quation est 1 puisqu'un enzyme a normalement une lasticit de 1 vis--vis de sa propre vitesse. Cette quation exprime l'ide importante que le coefficient de contrle de flux de n'importe quel enzyme pour le flux travers sa propre raction est entirement dtermin par la somme des produits des lasticits non-nulles avec les coefficients de contrle des concentrations correspondants. Bien que seuls trois mtabolites apparaissent du ct droit de l'quation [10.40], reprsentant les trois classes de mtabolites qui ont communment des valeurs nonnulles d'lasticit, dans un cas donn ce nombre peut tre infrieur ou suprieur trois. Il ne sera normalement pas infrieur deux, puisque les substrats et les produits ont toujours des lasticits non-nulles : algbriquement ceci doit tre vrai et, mme numriquement, il est inhabituel que l'lasticit d'un substrat ou d'un produit soit ngligeable.
10.7. LES COEFFICIENTS DE RPONSE : LA RPONSE PARTAGE

Bien qu'il soit parfois commode pour l'algbre de traiter les changements de l'activit d'un enzyme comme s'ils rsultaient de changements de la concentration de l'enzyme, en ralit, les effets sur le systme sont exactement les mmes, quelle que soit la manire dont ils sont provoqus. La justification de cette affirmation provient du traitement de l'effet d'effecteurs externes sur les enzymes. Comme un analogue du coefficient de contrle, qui exprime la dpendance d'une variable du systme telle que le flux, vis--vis d'un paramtre interne tel que l'activit de l'enzyme, nous pouvons dfinir un coefficient de rponse, R[JZ ] , pour exprimer la dpendance d'une variable du systme vis--vis d'un paramtre externe, tel que la concentration [ Z ] d'un effecteur externe Z :
R[JZ ] =
ln J ln [ Z ]
[10.41]
Un effecteur externe tel que Z peut uniquement produire un effet systmique en agissant sur un ou plusieurs enzymes du systme. Donc, il doit avoir au moins une i lasticit de valeur non-nulle e [vZ ] , dfinie exactement de la mme manire que les autres lasticits : ln vi i e [vZ ] = [10.42] ln [ Z ] Nous considrons maintenant comment ces deux quantits sont relies l'une l'autre et comment elles sont relies au coefficient de contrle de flux de l'enzyme sur lequel Z agit. Tout effet de Z sur le systme peut tre contrebalanc par un changement de la concentration d'enzyme d'une quantit juste suffisante pour que l'effet net soit nul.
351
Ainsi, nous pouvons crire qu'un changement nul de la vitesse est gal la somme de deux effets non-nuls : dvi d [ Z ] d [ Ei ] i = e [vZ ] + = 0 [10.43] vi [Z] [ Ei ] et le changement nul dans le flux est aussi gal la somme de deux termes :
dJ = RJ d [ Z ] + C J d [ Ei ] = 0 [Z ] i J [Z] [ Ei ]
[10.44]
En divisant une quation par l'autre, nous obtenons une relation importante, appele la rponse partage, qui exprime le fait que le coefficient de rponse est le produit de l'lasticit de l'effecteur pour l'enzyme sur lequel il agit et du coefficient de contrle de cet enzyme : i R[JZ ] = CiJ e [vZ ] (10.45) Bien que nous ayons considr ici les effets sur les flux, la mme relation s'applique toute variable du systme, ainsi J dans l'quation [10.45] peut reprsenter non seulement un flux quelconque mais aussi une concentration. La rponse partage explique pourquoi les effets sur l'activit de l'enzyme peuvent tre traits comme s'ils correspondaient des changements de la concentration de l'enzyme ; elle explique galement la diffrence entre les dfinitions d'un coefficient de contrle donnes dans les quations [10.12] et [10.13] : celles-ci ne sont apparemment quivalentes que parce que l'quation [10.7] est suppose vraie ; il existe une lasticit implicite de valeur unit qui relie le coefficient de rponse, tel qu'il est dfini par l'quation [10.13], au coefficient de contrle, tel qu'il est dfini par l'quation [10.12]. En gnral, tout coefficient de rponse peut tre crit comme le produit d'un coefficient de contrle et d'une lasticit. Une brve rflexion montre qu'une relation de ce type doit manifestement s'appliquer : tout effecteur peut seulement agir sur une variable du systme en altrant l'activit d'un enzyme, et la transmission de cet effet primaire est module en accord avec le coefficient de contrle de l'enzyme en question.
10.8. CONTRLE ET RGULATION

Bien que les ides essentielles qui prsident l'analyse du contrle mtabolique datent des annes 1973-1974 et que leurs racines sont chercher dans le travail d'HIGGINS (1965) une dcennie plus tt, elles se sont intgres trs lentement dans le courant principal de pense de la rgulation mtabolique. En effet, il a fallu attendre presque une dizaine d'annes avant qu'elles ne soient tendues de nouveaux systmes mtaboliques comme la respiration (GROEN et al., 1982a) et la noglucogense (GROEN et al., 1982b, 1983). Cette lente acceptation de l'analyse
352
du contrle mtabolique par la communaut biochimique s'explique partiellement par le fait qu'elle est souvent perue comme ddaigneuse des travaux classiques sur la rgulation (par exemple, voir ATKINSON (1990)), qu'elle fait peu d'usage de concepts centraux tels que l'inhibition rtroactive par des produits terminaux (YATES et PARDEE, 1956 ; UMBARGER, 1956), ou tels que les interactions coopratives et allostriques (MONOD, CHANGEUX et JACOB, 1963 ; MONOD, WYMAN et CHANGEUX, 1965 ; KOSHLAND, NMETHY et FILMER, 1966). La confusion rsulte en partie d'un manque d'accord entre les dfinitions de certains termes cruciaux. La dfinition du contrle donne par KACSER et BURNS (1973) est maintenant largement accepte, mais celle de rgulation continue poser des problmes. Pour certains, la rgulation n'est pas trs diffrente du contrle et SAURO (1990) par exemple lui donne la signification suivante : une sorte de rponse du mtabolisme vis--vis de la modification d'une influence externe 4 ; pour d'autres elle a une toute autre signification en relation avec les proprits des enzymes qui sont rguls, mme lorsqu'ils sont pris isolment. HOFMEYR et CORNISH-BOWDEN (1991) ont propos que son utilisation en biochimie soit aussi proche que possible de celle qu'elle a dans la vie courante. Ainsi par exemple, quand nous disons d'un rfrigrateur qu'il est bien rgul, nous voulons dire qu'il est capable de maintenir constante une temprature interne prdtermine, quelles que soient les variations de flux de chaleur dues aux ouvertures de la porte ou aux variations de la temprature extrieure. Le mtabolisme reprsente une analogie presque parfaite si nous considrons qu'un systme bien rgul est un systme dans lequel les concentrations de mtabolites internes (la temprature ) sont maintenues stationnaires face aux variations du flux mtabolique. En termes d'conomie, nous considrons qu'une conomie est bien rgule si la vitesse laquelle les biens sont produits est dtermine en grande partie par la vitesse laquelle ils sont utiliss. Encore une fois, il existe une forte analogie avec le mtabolisme et nous nous attendons ce que, dans un organisme bien rgul, l'apport de prcurseurs pour la synthse des protines soit dtermin par le besoin de synthtiser des protines, et pas uniquement par l'apport de nourriture. Un autre terme important, qui semble avoir une signification mais en a en ralit une autre, est le produit terminal . Il semble vident que le produit terminal dans un systme mtabolique doit reprsenter un drain dans lequel le flux s'coule. Mais dans la littrature concernant la rgulation mtabolique, l'usage commun de produit terminal (par exemple, voir STADTMAN, 1970) fait toujours rfrence un mtabolite, tel que la thronine, qui n'est pas excrt mais qui est reconnu explicitement comme le point de dpart d'autres voies mtaboliques. Dans la presque totalit de la littrature exprimentale sur la rgulation mtabolique, un produit terminal est compris de cette manire ; il ne reprsente jamais un authentique produit terminal du mtabolisme comme l'eau ou le dioxyde de carbone.
4. Some sort of response of metabolism to a change in an external influence .
353
Il s'ensuit donc que nous ne pouvons pas esprer comprendre le rle de l'inhibition par un produit terminal dans la rgulation mtabolique sauf si nous reprsentons les voies mtaboliques comme des composants de systmes qui font apparatre explicitement qu'il existe des tapes aprs la libration des produits terminaux . Ainsi dans leur discussion de l'inhibition rtroactive, KACSER et BURNS (1973) ont inclu une tape aprs la formation du produit terminal, bien qu'ils n'expliquent pas leur raison d'agir de la sorte. Pour intgrer les concepts classiques de rgulation dans l'analyse du contrle mtabolique (HOFMEYER et CORNISH-BOWDEN, 1991, 2000), nous pouvons reprsenter une voie mtabolique avec une inhibition rtroactive sous la forme d'une voie deux tapes, compose d'un bloc de fourniture, constitu de toutes les ractions qui conduisent au produit terminal et d'un bloc de demande, constitu de toutes les ractions qui consomment ce produit terminal (figure 10.3). Si le bloc de fourniture composait l'entiret de la voie, le produit terminal serait un paramtre externe et tous les effets qu'il aurait sur le flux devraient tre traits sous la forme d'un s coefficient de rponse R[J S 3 ] , mais ce coefficient de rponse est conceptuellement identique l'lasticit du bloc e [v1233 ] qui dfinit son effet sur le flux de fourniture S considr comme la vitesse locale.
"Produit final" Bloc de demande
Bloc de fourniture Inhibition E1 E2 E3
X0
S1
S2
S3
E4
10.3 - Structure rgule d'une voie mtabolique La rgulation d'une voie typique de biosynthse peut tre le plus facilement rationalise en considrant qu'elle est constitue d'un bloc de fourniture, qui produit un produit terminal une vitesse qui satisfait le besoin d'un bloc de demande, qui est reprsent ici sous la forme d'une seule raction. Dans la majorit des discussions de la rgulation mtabolique le bloc de demande est omis et le produit terminal reprsente la fin du processus. Cependant cette sorte de reprsentation perd sa capacit exprimer la rgulation sous la forme d'une communication entre les blocs de fourniture et de demande par l'intermdiaire du produit final.
Il dcoule de ce type de discussion que les limites d'un systme et les distinctions entre paramtres externes et internes ou entre les proprits locales et systmiques ne peuvent pas tre considres comme absolues. Pour comprendre comment un produit terminal comme S3 dans la figure 10.3 peut remplir son rle de rgulation, il n'est pas suffisant de le considrer uniquement comme un mtabolite interne ; nous devons aussi tudier les sous-systmes dans lesquels il agit en tant que
354
paramtre externe, de sorte que nous pouvons nous poser la question : si le bloc de fourniture (figure 10.3) reprsentait le systme complet, quel serait l'effet de S3 sur le flux de fourniture ? En utilisant ce type d'analyse, nous pouvons tudier comment une voie telle que celle dcrite dans la figure 10.3 peut tre efficacement rgule par la demande, par quoi nous entendons non seulement que le flux rponde de manire sensible aux changements dans la demande, mais galement que la concentration de produit terminal varie peu lorsque le flux varie. Il apparat que le point essentiel est que l'lasticit de fourniture e [v1233 ] dans le systme complet, qui est identique au coeffiS
s cient de rponse R[J S 3 ] dans le bloc de fourniture quand celui-ci est considr isol-
ment, doit tre aussi grand que possible en grandeur absolue. Puisqu'il s'agit d'une lasticit d'inhibition, elle est ngative, de sorte que aussi grande que possible signifie infrieure 2 . L'lasticit de demande e [v 4 3 ] est moins importante, S puisqu'une rgulation efficace peut tre ralise sur une large gamme de valeurs. Les rsultats d'une tude de l'importance de la cooprativit de la rgulation (HOFMEYR et CORNISH-BOWDEN, 1991) sont apparus surprenants puisque, premire vue, ils suggraient que celle-ci est beaucoup moins importante qu'on ne l'avait imagin depuis les annes 1960. Nanmoins, il faut mettre en vidence qu'il ne s'agissait l que d'une illusion : la cooprativit est certainement ncessaire pour une rgulation efficace comme cela avait t propos, mais son rle est quelque peu diffrent de celui que l'on peut navement imaginer. Modifier le degr de cooprativit dans l'inhibition rtroactive de E1 par S3 dans la figure 10.3, dans la gamme des coefficients de HILL allant de 1 (non coopratif) 4 (approximativement la cooprativit maximale observe pour une interaction unique effecteur-enzyme), n'a presque aucun effet sur le contrle du flux par la demande : les courbes montrant le flux en fonction de la demande (exprime comme la vitesse limite V4 du bloc de demande) indiquent une proportionnalit quasi parfaite entre le flux et la demande sur une gamme de 25 fois, quelle que soit la valeur du coefficient de HILL. Ceci peut surprendre celui qui pense que la cooprativit est essentielle pour la rgulation du flux. Cependant, comme nous l'avons dj mentionn, la rgulation du flux reprsente seulement une partie de la rgulation, et elle est de peu d'importance sans la rgulation de la concentration : nous ne serions pas heureux de disposer d'un rfrigrateur qui tolre une large gamme de flux de chaleur mais qui n'a aucun contrle sur la temprature interne ! Quand la concentration du produit terminal est considre de la mme manire que le flux, l'effet du coefficient de HILL devient trs important : sur la mme gamme d'une variation de 25 fois de la demande considre auparavant, un coefficient de HILL de 4 maintient la variation de [ S3 ] dans une gamme de variation de trois fois, alors qu'un coefficient de 1 le maintient dans une gamme de variation de dix fois pour une variation de la demande de seulement trois fois.
355
En rsum, la cooprativit des interactions rtroactives est, en effet, essentielle pour une rgulation efficace, mais il n'est pas suffisant de dire qu'elle permet une rgulation efficace du flux par la demande ; nous devons dire qu'elle permet une rgulation efficace du flux par la demande tout en maintenant l'homostasie.
10.9. MCANISMES DE RGULATION

Dans une large mesure, l'analyse du contrle mtabolique prend en compte les proprits des enzymes individuels telles qu'elles sont, considrant une explication mcanique de ces proprits comme en dehors de son domaine. De plus, nous avons dj discut les mcanismes principaux de rgulation dans le chapitre 9 de ce manuel et il n'est pas ncessaire de revenir sur ce sujet. Nanmoins, en plus de ceux discuts auparavant, il existe trois mcanismes de rgulation qui impliquent plusieurs enzymes et qui ncessitent une discussion plus complte : il s'agit de la canalisation 5 d'intermdiaires entre plusieurs enzymes, des cascades d'enzymes convertibles impliquant des modifications covalentes et de l'amplification des effets de petites variations de la concentration d'ATP par l'adnylate kinase.
10.9.1. Canalisation de mtabolites

La canalisation implique l'ide que le mtabolite partag par deux enzymes conscutifs dans une voie peut tre transfr directement d'un enzyme vers l'autre sans tre libr sous forme libre dans la solution ou au moins sans atteindre un quilibre avec le mtabolite prsent dans la solution. Il existe plusieurs variations sur ce thme (voir le schma 1 de OVDI, 1991), mais les points essentiels sont prsents dans la figure 10.4a, qui est base sur le mcanisme propos par GUTFREUND (1965). Ceci peut tre considr comme une combinaison entre une canalisation pure (figure 10.4b) et un mcanisme ordinaire de libre diffusion (figure 10.4c). Bien qu'il existe au moins un cas, celui de l'enzyme multifonctionnel dnomm tryptophane synthtase, pour lequel les preuves d'une canalisation (de l'indole) sont abondantes et gnralement acceptes (voir YANOFSKY, 1989), la canalisation reste controverse en gnral, du moins pour les enzymes qui forment des complexes dynamiques , c'est--dire des complexes qui existent seulement transitoirement pendant le transfert du mtabolite. Les enzymes malate dshydrognase et citrate synthtase illustrent le type de difficults qui surviennent lorsque l'on essaye de prouver le phnomne de canalisation. LINDBLADH et al. (1994) ont construit une protine fusion avec ces deux enzymes issus de la levure, c'est--dire qu'ils ont utilis les techniques de gnie
5. En anglais, channeling.
356
gntique pour produire une seule protine prsentant les deux activits et SHATALIN et al. (1999) ont ralis la mme construction pour la mme paire d'enzymes issus du porc.
S1
Premier substrat
E1
S2
Intermdiaire libre en solution
E2
S3
Second produit
E1S1
E1S2
E2S2
E2S3
E1E2S2
Intermdiaire canalis
E2
E1
a - Canalisation dynamique S1
Premier substrat
E1
Aucune libre diffusion
E2
S3
Second produit
E1S1
E1S2
E2S2
E2S3
E1E2S2
Intermdiaire canalis
E2
E1
b - Canalisation parfaite S1
Premier substrat
E1
S2
Intermdiaire libre en solution
E2
S3
Second produit
E1S1
E1S2
Aucun intermdiaire canalis
E2S2
E2S3
c - Aucun transfert direct

10.4 - Canalisation mtabolique Si un mtabolite S2 est la fois le produit de l'enzyme E1 et le substrat de l'enzyme E2, nous pouvons envisager qu'au lieu d'tre libr dans la solution, il peut tre transfr directement d'un enzyme l'autre l'occasion d'une rencontre entre le premier complexe enzyme substrat E1S2 et le second enzyme E2. La canalisation dynamique (a) peut tre considre comme une combinaison entre la canalisation parfaite (b), dans laquelle aucun intermdiaire n'est form et un mcanisme de libre diffusion (c), dans lequel il n'y a pas de transfert direct.
357
Dans les deux cas, le dlai transitoire dans la formation du produit est plus court avec la protine fusion qu'il ne l'est avec les enzymes libres, suggrant que l'intermdiaire oxaloactate est canalis entre les sites actifs. Pour tablir cette conclusion, il est ncessaire de supposer que les enzymes ont exactement les mmes proprits cintiques quand ils sont fusionns l'un l'autre que quand ils sont spars. Quand cette proprit a t soigneusement vrifie pour la protine fusion des enzymes de levure, les paramtres cintiques obtenu diffraient de ceux des enzymes libres, suffisamment pour expliquer la diminution du dlai (PETTERSON et al., 2000), sans avoir recours l'existence d'une canalisation. La controverse au sujet de savoir si la canalisation existe rellement dans les systmes o elle a t propose, est certainement importante en relation avec le contrle mtabolique, puisque si elle ne s'effectue pas, elle ne peut pas avoir d'influence sur le contrle. Nanmoins, il ne s'agit l que d'une partie de la question, puisque mme si elle existe, il n'est pas ncessaire qu'elle joue un rle significatif sur le mtabolisme. Ce point a t beaucoup moins discut, probablement parce que les avantages de la canalisation semblent vidents, en raison de la confusion entre les proprits de la canalisation parfaite et celles du mcanisme de canalisation dynamique qui est le sujet de la controverse. Il peut sembler intuitif que mme dans un mcanisme tel que celui de la figure 10.4a, une augmentation de la vitesse des tapes de canalisation au dpend des tapes de libre diffusion devrait augmenter la concentration l'tat stationnaire de l'intermdiaire libre, mais il s'agit ici d'une illusion. Bien qu'une telle augmentation puisse diminuer la vitesse laquelle S2 est libr du complexe E1S2, elle diminuera galement la vitesse laquelle S2 est fix par E2 et le rsultat net peut pencher d'un ct ou de l'autre. Qu'il y ait un petit effet ou non est purement une question de dfinition, puisqu'il n'est pas facile de distinguer les effets authentiques d'une canalisation des effets qui pourraient provenir de changements de l'activit catalytique de l'enzyme qui ne sont pas lis la canalisation ; nanmoins, il n'y a aucun doute que, mme si la canalisation a un effet sur les concentrations d'intermdiaires l'tat stationnaire, il est trop faible pour jouer un rle rgulateur utile (CORNISH-BOWDEN et CRDENAS, 1993). Pour cette raison, il n'est pas ncessaire de considrer d'avantage cet effet dans notre discussion.
10.9.2. Cascades d'enzymes convertibles

La cooprativit des interactions pour des enzymes individuels est une manire trs importante de rendre une inhibition rtroactive plus efficace en tant que mcanisme de rgulation. Elle a cependant un srieux inconvnient qui l'empche de fournir un moyen universel d'augmenter les lasticits : le degr de cooprativit est svrement limit en pratique par le fait que les enzymes ayant un coefficient de HILL suprieur 4 sont trs rares ; puisque l'lasticit pour une interaction ne peut pas excder le coefficient de HILL correspondant, cela signifie que les interactions
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individuelles enzyme-mtabolite ont des lasticits qui ne sont pas suprieures 4. Cette valeur est trop faible pour un mcanisme destin oprer comme un interrupteur : cela implique que pour obtenir une variation de 3 fois de la concentration d'un mtabolite il est ncessaire d'avoir une variation de 10% 90% de l'activit maximale (voir 9.1.2). Des lasticits beaucoup plus leves sont possibles si nous considrons des systmes multi-enzymatiques du type de celui qui est illustr dans la figure 10.5, et qui sont parfois dnomms cascades .
Effecteur
Effecteur
Enzyme allostrique Activation
E1
Inactif
Eb
Inactif en absence de G Activation
E1
Inhibition
E2
Cycle de modification (unidirectionnel)
E1G
EG X
Raction cible
Inactif en absence de G fix
E2G
Ea
Raction cible
a - Activation allostrique
b - Activation par un systme cyclique
10.5 - Cascade d'enzymes convertibles Dans une activation allostrique ordinaire (a), l'activateur G se fixe directement sur un enzyme pour augmenter son activit, mais dans un systme convertible (b), il agit sur les enzymes qui catalysent des conversions irrversibles entre les formes actives et inactives de l'enzyme cible. Des substrats supplmentaires (qui ne sont pas reprsents ici), comme l'ATP et l'eau, sont ncessaires pour rendre les conversions irrversibles.
Les systmes d'enzymes convertibles sont connus depuis plus d'un quart de sicle et de nombreux exemples sont connus, incluant de nombreuses kinases et phosphatases de protines (KREBS et BEAVO, 1979). La glutamine synthtase d'E. coli, qui est inactive par adnylation et ractive par dadnylation (CHOCK, RHEE et STADTMAN, 1980, 1990), a t tudie en dtails et a servi de base pour un travail thorique extensif (CHOCK et STADTMAN, 1977 ; STADTMAN et CHOCK, 1977, 1978). Dans le contexte de ce chapitre, le point essentiel est que les systmes d'enzymes convertibles peuvent gnrer des sensibilits trs leves aux signaux, beaucoup plus leves que ce qui n'est possible pour les enzymes seuls (GOLBETER et KOSHLAND, 1981, 1984). Il est tentant de supposer que cette sensibilit leve est inhrente la structure du cycle, mais en ralit, si des valeurs arbitraires sont donnes aux paramtres cintiques de la raction cyclique, le rsultat typique est un systme qui gnre une sensibilit plus faible qu'un enzyme non-coopratif isol.
359
Une trs grande sensibilit est obtenue uniquement si plusieurs conditions sont remplies (CRDENAS et CORNISH-BOWDEN, 1989) : les interactions de l'effecteur avec les enzymes modifiants devraient tre catalytiques plutt que spcifiques (anti-comptitives plutt que comptitives dans la terminologie de l'inhibition) ; la raction d'inactivation devrait cesser d'oprer des concentrations d'effecteur beaucoup plus faibles que celles qui sont ncessaires pour stimuler la raction d'activation ; les deux enzymes modifiants devraient fonctionner dans des conditions proches de la saturation, une caractristique particulirement mise en vidence par GOLDBETER et KOSHLAND (1981, 1982, 1984) sous le nom d' ultra-sensibilit d'ordre zro . Si toutes ces conditions sont satisfaites, la sensibilit accessible avec le mcanisme de la figure 10.5 est considrablement plus grande qu'avec un enzyme isol ; mme avec des contraintes svres imposes aux paramtres cintiques des enzymes modifiants, nous pouvons facilement obtenir l'quivalent d'un coefficient de HILL de 30 ou de 800 si nous relchons les contraintes, tout en restant dans la gamme de comportements communment observs avec les enzymes rels (CRDENAS et CORNISH-BOWDEN, 1989). Les deux premires de ces conditions impliquent que les exprimentateurs devraient prendre un soin particulier noter ce qui pourrait apparatre comme des proprits cintiques insignifiantes des enzymes modifiants. Mme si la composante anti-comptitive de l'inhibition d'un enzyme modifiant est un ordre de grandeur plus faible que la composante comptitive, elle peut encore tre essentielle pour un travail efficace du systme. De la mme manire, si nous observons que la phosphatase implique dans un cycle est active uniquement des concentrations apparemment non-physiologiques d'un effecteur, dix fois plus leves que celles qui sont efficaces pour inhiber la kinase, cela ne signifie pas que l'effecteur est sans intrt pour l'action de la phosphatase ; cela signifie que l'ensemble du systme est bien mis au point pour gnrer une sensibilit trs leve. Puisque les systmes d'enzymes convertibles peuvent gnrer une bien meilleure sensibilit que des enzymes coopratifs, nous pouvons nous demander pourquoi ils ne sont pas universellement utiliss dans la rgulation mtabolique. Contrairement aux enzymes coopratifs, les systmes d'enzymes convertibles consomment de l'nergie, parce que les deux ractions de modification sont supposes tre irrversibles ; ceci n'est uniquement possible que si elles impliquent des co-substrats diffrents, par exemple l'activation peut tre la phosphorylation par l'ATP, alors que l'inactivation peut tre l'hydrolyse par l'eau.
10.9.3. Le rle mtabolique de l'adnylate kinase

Le troisime mcanisme que nous considrerons ici est celui qui est le moins discut dans l'analyse du contrle mtabolique, probablement parce que son existence est
360
connue depuis si longtemps (il a t suggr pour la premire fois par KREBS (1964)) qu'il a t oubli en tant que mcanisme multi-enzymatique de rgulation. Il concerne l'adnylate kinase (souvent appel myokinase) qui catalyse la conversion entre trois nuclotides adnyliques : ATP + AMP 2 ADP [10.46] L'adnylate kinase est prsente avec une activit catalytique trs leve dans certains tissus (tel que le muscle), o premire vue sa raction apparat n'avoir aucune fonction mtabolique ; certainement dans de nombreuses cellules o l'enzyme est trouv, le flux long terme travers la raction est ngligemment faible. Pourquoi alors, est-il prsent et pourquoi avec une activit si leve ? Il n'est pas suffisant d'affirmer simplement que son rle est de maintenir la raction l'quilibre, parce que les concentrations d'ATP et d'ADP changent normalement si peu que la raction pourrait difficilement se trouver loigne de sa position d'quilibre, mme si la concentration d'enzyme tait beaucoup plus faible. La rponse semble tre que si les nuclotides d'adnine existent de manire prdominante sous la forme d'ATP, et que si l'quation [10.46] est toujours l'quilibre, pas juste de manire approximative mais exactement, alors les petites variations dans la balance entre l'ATP et l'ADP se traduisent par de larges variations relatives de la concentration d'AMP, de sorte que les enzymes qui sont spcifiquement affects par l'AMP peuvent rpondre avec une grande sensibilit aux petites variations originales. Cette ide est illustre dans la figure 10.6, dont la partie suprieure montre que, si les trois nuclotides d'adnine sont maintenus une concentration totale [ ATP ] + [ ADP ] + [ AMP ] = 5 mM avec une constante d'quilibre
[ ATP ] + [ AMP ] = 0 ,5 , les concentrations d'ATP [ ADP ] 2 autour de 4 mM correspondent de si faibles concentrations d'AMP que, quelle que soit la variation de la concentration d'ATP, celle-ci se traduit par une variation oppose et presque gale de la concentration d'ADP. A premire vue cela ne semble pas nettement diffrent de ce que nous aurions si l'AMP tait absent. Cependant, bien que sa concentration dans ces conditions est faible, ces variations fractionnelles sont trs importantes en comparaison de celles de l'ATP et de l'ADP. Tous les enzymes qui fixent l'AMP trs fortement (de sorte qu'ils peuvent le dtecter mme si sa concentration est trs faible par rapport celles de l'ATP et de l'ADP) peuvent rpondre avec une sensibilit importante comme l'illustre la figure 10.6b. La prsence d'une activit leve de l'adnylate kinase dans la cellule permet donc l'AMP d'agir comme un amplificateur de signaux de faibles amplitudes : dans l'exemple de la figure 10.6, une variation de 5% de la concentration d'ATP produit seulement une variation de 2,8% de la vitesse si l'enzyme n'est pas sensible l'AMP, mais provoque une variation de 20% si l'enzyme est sensible ; en effet, le mcanisme a augment l'lasticit efficace vis--vis de l'AMP par un facteur suprieur 7, partir d'une valeur d'environ 0,56 (2,8/5) jusqu' une valeur de 4 (20/5).
361
[AMP] ou [ADP] (mM)
5 4 3 2 1 0 0
[AMP] 25 [AMP] a [ADP]

1 2 3 4 5
[ATP] (mM)
15 2,8% 10 20% 5 Inhibition par l'AMP 0

0,5 0 0,5 0 0,1 0,2
Aucun effet de l'AMP
b
5%
[ATP] (mM)
10.6 - Effet de l'adnylate kinase (a) Si les trois nuclotides d'adnine sont toujours l'quilibre, les faibles variations de la concentration d'ATP autour de 4 mM rsultent dans des variations relatives importantes de la concentration d'AMP. (b) Ceci permet un enzyme qui fixe fermement l'AMP pour prsenter une plus importante rponse l'ATP que s'il n'y avait pas de variation dans la concentration d'AMP. Les courbes dans la figure (b) ont t calcules en supposant des cintiques de MICHAELIS et MENTEN vis--vis de l'ATP et de l'ADP, et une simple inhibition comptitive par l'AMP. Si les rponses individuelles taient coopratives, les effets nets pourraient tre beaucoup plus grands que ceux qui sont prsents. Les faibles vitesses ngatives aux faibles concentrations d'ATP (rgion agrandie dans l'insert) sont dues la raction inverse, qui a lieu (quoiqu' un faible taux) quand le rapport [ ATP ] /[ ADP ] est suffisamment petit.
Par lui-mme cet effet ne permet pas d'expliquer entirement, par exemple, l'augmentation d'un facteur 100 du flux glycolytique dans les muscles de vol des insectes quand la concentration d'ATP diminue de 10% et que la concentration d'AMP augmentate simultanment de 2,5 fois (SACKTOR et WORMSER-SHAVIT, 1966 ; SACKTOR et HURLBUT, 1966), mais il contribue certainement de manire prpondrante cette rponse. D'autant que les enzymes qui sont sensibles l'AMP
362
rpondent aux variations de concentrations de celui-ci de manire cooprative, alors que dans la figure 10.6 nous avons suppos uniquement une simple inhibition comptitive, pour viter de compliquer la discussion en examinant simultanment deux types d'effet.
PROBLMES
10.1 - Considrons un enzyme avec une vitesse donne par l'quation de HILL (quation [9.3]), c'est--dire v =
V [ A ]h , dans des conditions o h ( K0 ,5 + [ A ]h )
la raction est hors quilibre et l'inhibition par le produit est ngliv geable. Quelle est la valeur de l'lasticit e [ A ] quand l'enzyme est moiti satur, c'est--dire quand [ A ] = K0 ,5 ? Quelles valeurs limites prend-elle lorsque [ A ] devient trs petit ou trs grand ? 10.2 - Pour la voie trois tapes de l'quation [10.29], calculer les coefficients de contrle du flux dans des conditions o les lasticits vis--vis des deux intermdiaires sont les suivantes : e [v1S 1 ] = 0, 2, e [v 2 1 ] = 0, 3, e [v 2 2 ] = 0,1, e [v 3 1 ] = 0, 2. S S S (Supposer que S1 n'a aucun effet sur E3 et que S2 n'a aucun effet sur E1, v v c'est--dire e [ 3 1 ] = e [ 1S 2 ] = 0 ). S 10.3 - La manipulation de l'activit de l'enzyme Ei dans une voie mtabolique rvle que celui-ci a un coefficient de contrle du flux de 0,15 dans des conditions physiologiques. Son lasticit vis--vis du produit Si de la raction est de 0,25 dans les mmes conditions. L'enzyme suivant dans la voie, Ej, ne peut tre directement manipul et son coefficient de contrle ne peut donc pas tre mesur directement. Cependant, des tudes avec l'enzyme purifi indiquent qu'il a une lasticit de 0,2 vis-vis du substrat Si dans des conditions physiologiques. En supposant que S i n'a pas d'interaction particulire avec l'un des autres enzymes de la voie, estimer la valeur du coefficient de contrle du flux de Ej. 10.4 - L'approche de bas en haut dcrite par BROWN, HA F N E R et BRAND (1990), implique de varier les activits de plusieurs enzymes dans une proportion constante et d'utiliser les variations rsultantes dans le flux et dans les concentrations de mtabolites pour estimer les coefficients de contrle pour le bloc complet d'enzymes plutt que pour les enzymes individuels. Imaginer une exprience thorique permettant de dduire la relation entre l'un des coefficients de contrle d'un bloc d'enzymes et les coefficients de contrle correspondants des enzymes composants le bloc.
363
10.5 - Une grande partie de la biotechnologie moderne est base sur le principe que l'identification des enzymes qui catalysent les tapes limitant la vitesse dans une voie qui conduit au produit recherch, le clonage de ces enzymes et leur sur-expression dans des organismes adapts permettront d'obtenir des rendements levs des produits dsirs. Quelles implications l'analyse du prsent chapitre a-t-elle sur une telle stratgie ?
11 LES RACTIONS RAPIDES

11.1. LES LIMITATIONS DES MESURES L'TAT STATIONNAIRE
11.1.1. Phases transitoires
Une phase transitoire est reprsente par un terme de la forme A e( t t ) dans une quation qui exprime la variation d'une quantit donne en fonction du temps. Etant donn que t, une constante appele temps de relaxation ou constante de temps, est une grandeur strictement positive, chaque phase transitoire a une valeur finie de A, connue sous le nom d'amplitude, quand t = 0, mais qui diminue en tendant vers zro lorsque t augmente et qui fini ventuellement par devenir ngligeable. Nous avons rencontr plusieurs exemples de phase transitoire notamment dans le chapitre 1 : le second terme de l'quation [1.10], par exemple, est une phase transitoire dont le temps de relaxation vaut 1 k et dont l'amplitude vaut [ A ]0 . Comme l'illustre cet exemple, un temps de relaxation correspond l'inverse d'une constante de vitesse de premier ordre ou de pseudo-premier ordre. Des phases transitoires apparaissent toujours dans les quations cintiques qui dcrivent les ractions catalyses par des enzymes sauf si celles-ci sont drives en utilisant l'hypothse de l'tat stationnaire. Cela signifie qu'il y a toujours une priode avant que l'tat stationnaire ne soit tabli et durant laquelle l'hypothse de l'tat stationnaire n'est pas valable. Cette priode est appele la phase transitoire de la raction. Il semble vident que les mthodes exprimentales ncessaires pour tudier des ractions trs rapides, se droulant sur des temps infrieurs la seconde, doivent tre diffrentes de celles utilises pour tudier les ractions lentes, tout simplement parce que la majorit des mthodes habituelles ncessitent un temps de l'ordre de plusieurs secondes pour mlanger les ractifs. Par contre, il est peut tre moins vident que des quations cintiques diffrentes soient galement ncessaires pour analyser ces phnomnes rapides. Avec la majorit des ractions catalyses par des enzymes, l'tat stationnaire est tabli suffisamment rapidement pour que celui-ci soit considr comme existant pendant toute la dure de la mesure, condition que les premires secondes aprs le mlange ne soient pas incluses dans cette priode (voir 3.3.7). En consquence, la plupart des quations que nous avons discutes dans ce manuel reposent sur l'hypothse de l'tat stationnaire. Inversement, les ractions rapides concernent, presque par dfinition, la phase transitoire existant
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avant l'tablissement de l'tat stationnaire et ne peuvent donc pas tre dcrites par les quations de vitesse l'tat stationnaire. Ce chapitre est consacr aux aspects exprimentaux et thoriques de l'tude des phases transitoires, mais avant d'aborder ces problmes, il est utile de se demander quoi peut servir de s'intresser aux mesures des phases transitoires : que pouvons-nous apprendre de l'tude de ces phases que nous ne puissions apprendre des cintiques l'tat stationnaire ?
11.1.2. Etapes lentes et rapides dans les mcanismes enzymatiques

Les mesures l'tat stationnaire ont t trs utiles pour lucider les mcanismes des ractions enzymatiques, mais elles prsentent le dsavantage que, la vitesse l'tat stationnaire d'une raction impliquant plusieurs tapes concide, dans le meilleur des cas, avec la vitesse de l'tape la plus lente et ne fournit en aucun cas d'information sur les tapes les plus rapides. Pour comprendre le mcanisme d'une raction enzymatique, il est ncessaire d'obtenir des informations sur les tapes rapides autant que sur les tapes lentes. Avant de poursuivre cette discussion, nous devons nous dbarrasser d'une absurdit apparente introduite dans le chapitre prcdent. Pour un processus linaire dans des conditions d'tat stationnaire, toutes les tapes se droulent une mme vitesse, donc il semble injustifi de dsigner l'une de ces tapes comme tant l' tape la plus lente et NORTHROP (2001), par exemple, appelle cela un terme inappropri . Si nous considrons que le plus lent signifie qui se droule la vitesse la plus faible, alors NORTHROP a certainement raison, mais si nous considrons que cela signifie qui compte pour la majeure partie du temps total, alors une vue diffrente est possible. Si nous considrons l'quation [7.20] (ou l'quation [3.99b], qui est quivalente) comme un exemple simple, nous pouvons l'crire dans sa forme rciproque de la manire suivante : 1 = 1 + K1 + K1 K 2 [12.0] kA k1 k 2 k3 o K1 = k 1 k1 et K 2 = k 2 k 2 sont les constantes d'quilibre (crites dans la direction inverse) pour les tapes 1 et 2. En gnralisant cela, nous voyons que la rciproque de la constante de spcificit est la somme des rciproques des constantes de vitesse dans la direction directe o chacune est multiplie par le produit des constantes d'quilibre partir de la premire tape. Cette grandeur, le temps spcifique ( 3.3.4), peut donc tre considr comme la somme d'une srie de temps. Bien que la rversibilit des tapes indique que le temps mis par des molcules individuelles pour passer travers l'ensemble du processus, peut varier fortement, il reste vrai qu'il y a un temps moyen qui peut tre considr comme la somme des quantits moyennes de temps utilises pour passer sparment au travers de chacune des tapes ; en effet, il y a de nombreuses annes, VAN SLYKE et CULLEN (1914) ont
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discut les cintiques de l'urase exactement en ces termes. Il y aura toujours une tape qui contribue autant au temps total que n'importe quelle autre tape, et il ne semble pas que ce soit un abus de langage d'appeler celle-ci l'tape la plus lente et de faire rfrence aux tapes qui contribuent de manire moins significative en utilisant le terme d'tapes plus rapides. Ainsi, bien que toutes les tapes aient la mme vitesse dans des conditions d'tat stationnaire, cela ne signifie pas qu'une mme quantit de temps soit ncessaire pour chaque tape, ainsi lorsque nous dsignons certaines tapes comme les tapes les plus lentes, nous ne considrons pas qu'elles se droulent plus lentement, mais qu'elles comptent pour une plus large proportion du temps consomm. NORTHROP (1981) a galement questionn l'ide globale d'tape limitant la vitesse dans les mcanismes enzymatiques. RAY (1973) a ralis une analyse complte qui est sous certains aspects parallle la discussion des tapes limitant la vitesse dans le mtabolisme, initie par KACSER et BURNS (1973) et prsente dans le 10.5 ; en effet, RAY a dfini l'indice de sensibilit, utiliser dans l'tude des effets isotopiques, qui a des proprits similaires celles des coefficients de contrle de flux. Il est parfaitement possible (bien que pas ncessaire) pour une tape de ncessiter plus de temps que pour toutes les autres prises ensembles, et si ceci est vrai, il est raisonnable d'appeler celle-ci l'tape limitant la vitesse. Mme s'il ne domine pas entirement la somme, le temps requis par l'tape la plus lente sera toujours habituellement similaire en grandeur au temps requis par l'ensemble du processus, et il est trs commun qu'une seule tape limite la vitesse globale. Des exceptions apparatront si le processus complet renferme un grand nombre d'tapes lentes se droulant sur des temps similaires, mais ceci est beaucoup plus improbable dans les mcanismes d'enzymes individuels que dans les systmes mtaboliques : ces derniers peuvent en effet contenir un grand nombre de composants et la slection naturelle peut avoir limin une grande variabilit dans l'efficacit cintique de diffrentes tapes entre elles ; mais dans les systmes chimiques, les constantes de vitesse pour les processus individuels varient typiquement sur plusieurs ordres de grandeur et aucune slection naturelle ne peut tre invoque (en particulier pour les ractions tudies avec des ractifs non-naturels) pour suggrer que les variations devraient tre rduites. Des considrations de ce type expliquent vraisemblablement pourquoi la ncessit d'liminer les tapes limitant la vitesse des discussions de la rgulation mtabolique est devenue vidente une dizaine d'annes avant que la question correspondante ne soit srieusement discute pour les mcanismes enzymatiques.
11.1.3. Ambiguts dans l'analyse l'tat stationnaire de systmes impliquant des isomrisations d'intermdiaires
Comme nous l'avons discut dans le chapitre 6, l'exprimentateur dispose d'une grande libert pour modifier les vitesses relatives des diffrentes tapes d'une raction en variant les concentrations des substrats. Il est donc souvent possible d'tudier
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plus d'une tape de la raction malgr la limitation fondamentale des cintiques l'tat stationnaire. Cependant, les isomrisations d'intermdiaires pendant le processus ractionnel ne peuvent pas tre isoles de cette manire, comme l'illustre l'exemple d'un mcanisme de MICHAELIS et MENTEN trois tapes (quaion [3.82]), dont les paramtres sont dcrits par les quations [3.99] et [3.100], respectivement pour les ractions directe et inverse. Puisque ce mcanisme comporte six constantes lmentaires de vitesse, mais uniquement deux paramtres de MICHAELIS et MENTEN pour chaque direction de la raction, il apparat que la caractrisation du systme dans des conditions d'tat stationnaire, c'est--dire la mesure des paramtres de MICHAELIS et MENTEN, ne fournit pas suffisamment d'information pour dterminer toutes les constantes de vitesse. Comme nous l'avons discut dans le 7.7, la mesure des effets isotopiques primaires permet de pallier ce problme mais uniquement au prix de l'introduction de nouvelles hypothses et uniquement pour les cas les plus simples : si le mcanisme comporte trois tapes au lieu de deux, entre la fixation du substrat et la libration du produit, aucune mthode d'tude l'tat stationnaire ne permet de rvler leur existence, et donc en aucune faon de fournir des informations sur la grandeur des constantes de vitesse. En gnral, comme mentionn dans le 6.3, tous les intermdiaires intervenant dans un mcanisme ractionnel qui consiste en une srie d'isomrisations d'intermdiaires, doivent tre traits comme une seule espce dans les cintiques d'tat stationnaire. Ceci reprsente une limitation svre et fournit la justification principale pour l'tude des cintiques des phases transitoires, qui ne sont pas soumises cette limitation. Les vitesses lentes observes dans les expriences l'tat stationnaire sont gnralement obtenues en travaillant avec des concentrations faibles d'enzyme. Ceci peut constituer un avantage si l'enzyme est coteux ou disponible uniquement en petite quantit, mais cela signifie galement que toute l'information concernant l'enzyme est obtenue indirectement, en observant les effet sur les ractifs et non en observant directement l'enzyme lui-mme. Pour observer directement l'enzyme, il faut l'utiliser dans des quantits comparables celles des ractifs, de sorte qu'il puisse tre dtect par des mthodes spectroscopiques ou autres. Cette pratique conduit l'utilisation de concentrations d'enzyme tellement leves que les mthodes de mesure l'tat stationnaire ne peuvent plus tre utilises. Les avantages des mthodes d'tude des phases transitoires pourraient faire apparatre les mthodes de mesure l'tat stationnaire comme obsoltes, mais rien ne semble indiquer que ces dernires soient dpasses et, pour les raisons que nous allons voquer, nous pouvons nous attendre ce qu'elles continuent prdominer dans les tudes enzymatiques pendant de nombreuses annes. Premirement, la thorie de l'tat stationnaire est la plus simple et les mesures l'tat stationnaire ncessitent un quipement plus simple. Deuximement, les faibles quantits d'enzyme, ncessaires pour les mesures l'tat stationnaire permettent de les appliquer avec de nombreux enzymes pour lesquels des tudes des phases transitoires seraient trop coteuses.
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11.1.4. Mauvais conditionnement

Finalement, en plus de ces considrations pratiques, l'analyse des donnes des phases transitoires pose une difficult numrique importante connue sous le nom de mauvais conditionnement 1 . Cela signifie que, mme en absence d'erreurs exprimentales, il est possible d'obtenir des ajustements convainquant des mmes courbes exprimentales avec une large gamme de constantes et d'quations. Ceci est illustr dans la figure 11.1 qui montre un ensemble de points et une ligne calcule partir de deux quations diffrentes, toutes deux typiques des cintiques des phases transitoires. Bien que le graphique montrant les rsidus, c'est--dire la diffrence entre les points calculs et observs, indique une dviation systmatique (insert dans la figure 11.1), ce graphique est trac avec une chelle tellement largie que mme une petite erreur alatoire dans les donnes masquerait toutes dviations par rapport un ajustement parfait. L'implication pratique de cette observation est qu'il est souvent impossible d'obtenir toutes les informations qui sont thoriquement disponibles dans les mesures des phases transitoires sauf si les diffrents processus sont suffisamment spars dans le temps ou si les amplitudes des termes ayant des constantes de temps similaires sont de signe oppos.
Erreur rsiduelle
y 20
0,1
15
10
0,1 0 10 20
0 0 5 10 15 20
t
14, 2
11.1 - Caractre du mauvais conditionnement des fonctions exponentielles Les points ont t calculs partir de l'quation : y = 5,1e t 1, 3 + 4.7e t 4, 4 + 9,3e t
et la ligne a t calcule partir de l'quation : y = 7,32e t 2,162 + 10,914e t 12, 86 . Bien qu'en principe la mauvaise qualit de l'ajustement puisse tre tablie en portant en graphique en fonction du temps les diffrences entre valeurs observes de y et valeurs calcules (insert), ceci prsuppose une grande prcision exprimentale.
1. ill conditioning
370
11.2. LIBRATION DU PRODUIT

AVANT LA FIN DE CYCLE CATALYTIQUE
11.2.1. Les cintiques avec burst 2
Lorsqu'ils ont tudi l'hydrolyse du carbonate de nitrophnylthyle catalyse par la chymotrypsine, HARTLEY et KILBY (1954) ont observ que, bien que la libration du nitrophnolate au cours du temps est presque linaire, l'extrapolation de la ligne sur l'axe des y donne une ordonne positive (figure 11.2).
Nitrophnol libr (M)
16M
30
Ordonne l'origine (M)
12M
20
20
8M 4M 2M
10
10
12
[Chymotrypsine] (M) Temps (min)
0 0 4 8 12
11.2 - Un burst de libration de produit Les donnes sont celles de HARTLEY et KILBY (1954) pour l'hydrolyse du carbonate de nitrophnylthyle catalyse par la chymotrypsine et la concentration d'enzyme est indique sur chaque courbe. Les ordonnes l'origine obtenues par extrapolation au temps zro de la partie linaire de chaque courbe d'avancement sont proportionnelles et presque gales ces concentrations d'enzyme (insert).
Parce que le substrat n'est pas le substrat spcifique de l'enzyme et qu'il est donc trs mauvais, ils ont d travailler avec des concentrations leves d'enzyme, et ils ont ainsi pu mettre en vidence que la grandeur de l'ordonne, qui est appele le burst de produit, est proportionnelle la concentration d'enzyme. Cette observation suggre un mcanisme dans lequel les produits sont librs en deux tapes, le nitrophnolate tant libr en premier :
2. Certains termes anglais sont difficiles traduire simplement en franais sans perdre une partie de leur signification, si une terminologie complexe veut tre vite. Dans d'autres cas, la terminologie anglaise fait partie du langage scientifique courant. Nous avons choisi dans ces cas de conserver le terme anglais plutt que d'utiliser une traduction imprcise ou lourde. C'est le cas pour les termes burst, stoppedflow et quenched-flow.
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E+A
k1 k1
P EA k2 EQ k3 E+Q
[11.1]
Si l'tape finale limite la vitesse, c'est--dire si k3 est petit vis--vis de k1 [ A ] , k1 et k2, l'enzyme existe presque exclusivement sous la forme EQ l'tat stationnaire. Cependant, le produit P peut tre libr avant que EQ ne soit form, et donc durant la phase transitoire, P peut tre libr beaucoup plus rapidement que pendant l'tat stationnaire. On pourrait alors supposer que la quantit de P libre pendant la phase transitoire de burst correspond exactement la quantit d'enzyme et n'est pas seulement proportionnelle. Nanmoins, cela n'est rigoureusement vrai que si k3 est beaucoup plus petit que les autres constantes de vitesse ; sinon le burst est plus petit que la quantit stchiomtrique, comme nous allons maintenant le montrer, en accord avec une drivation base sur celle de GUTFREUND (1955). Si [ A ] est suffisamment leve pour tre considre comme une constante pendant le temps de l'exprience, et si k1 [ A ] est grand par rapport (k1 + k2 + k3), alors, peu de temps aprs le mlange, le systme se simplifie sous la forme :
P
EA
Q
k2 k3
EQ
[11.2]
EA peut tre considre comme instantane et parce que la raction E + A irrversible, et que la concentration d'enzyme libre devient ngligeable. Il s'agit alors d'une simple raction rversible de premier ordre (voir 1.2.6) qui a les solutions suivantes : [ E ]0 k3 + k 2 e[ ( k 2 +k 3 ) t ] [ EA ] = [11.3] k 2 + k3
[ EQ ] =
k 2 [ E ]0 1 e[ ( k 2 +k 3 ) t ] k 2 + k3
) )
[11.4]
Les expressions pour les vitesses de libration des deux produits sont aisment obtenues en multipliant ces deux quations respectivement par k2 et par k3 :
k 2 [ E ]0 k3 + k 2 e[ ( k 2 +k 3 ) t ] d[ P ] = k 2 [ EA ] = dt k 2 + k3 k 2 k3 [ E ]0 1 e[ ( k 2 +k 3 ) t ] d[ Q ] = k3 [ EQ ] = dt k 2 + k3
[11.5]
[11.6]
A l'tat stationnaire, c'est--dire quand t est grand, le terme exponentiel devient ngligeable et les deux vitesses deviennent quivalentes :
372
d[ Q ] d[ P ] k k [ E ]0 = = 2 3 dt dt k 2 + k3
[11.7]
Pendant la phase transitoire, cependant, d [ P ] dt est initialement plus grand que d [ Q ] dt , de sorte que l'apparition de P se caractrise par un burst, alors que l'apparition de Q se caractrise par un dlai (lag en anglais) quand les parties linaires des courbes d'avancement sont extrapoles au temps zro. La grandeur du burst peut tre calcule en intgrant l'quation [11.5] et en introduisant la condition [ P ] = 0 quand t = 0 : [ ( k 2 +k 3 ) t ] 2 k 2 k3 [ E ]0 t k 2 [ E ]0 1 e [P] = + [11.8] k 2 + k3 ( k 2 + k3 ) 2
La partie de la courbe d'avancement correspondant la phase d'tat stationnaire est obtenue en considrant la mme quation aprs que la phase transitoire a diminu jusqu' zro : k k [ E ]0 t k 2 [ E ]0 + 2 [P] = 2 3 [11.9] k 2 + k3 ( k 2 + k3 ) 2 C'est l'quation d'une droite dont l'intersection avec l'axe des [ P ] donne la valeur p, la grandeur du burst : 2 [ E ]0 k 2 [ E ]0 p = = [11.10] 2 ( k 2 + k3 ) 2 k3 1 + k2 Ainsi le burst n'est pas gal la concentration d'enzyme mais il s'en approche si k2 est beaucoup plus grand que k3. Bien que l'quation implique que la taille du burst ne peut jamais dpasser la concentration d'enzyme, la ralit est parfois plus complexe, parce que la concentration de substrat n'est pas vraiment constante et diminue pendant la phase d'tat stationnaire. En consquence, la partie de la courbe d'avancement correspondant l'tat stationnaire n'est pas exactement une droite. Si la vitesse diminue de manire significative pendant la priode utilise pour la mesure, l'extrapolation sur l'axe peut conduire une surestimation de la taille du burst. Ce type d'erreur peut tre vit en s'assurant qu'il n'y a aucune dviation perceptible par rapport la linarit pendant la phase d'tat stationnaire.
11.2.2. Titrage du site actif

La dcouverte des cintiques prsentant un burst a conduit au dveloppement d'une mthode importante pour titrer le site actif des enzymes. Il est en gnral difficile d'obtenir une mesure prcise de la molarit d'une solution d'enzyme : les mesures de vitesse fournissent des concentrations en units d'activit ou en katals par millilitre, qui sont utiles pour des tudes comparatives, mais qui ne donnent pas accs la concentration relle de l'enzyme sauf si elles sont calibres ; la plupart des autres
373
tests (test de BRADFORD, mesure de l'absorbance dans l'ultraviolet) sont des mesures de concentration des protines et sont ds lors peu spcifiques sauf si l'enzyme est pur et entirement actif. L'quation [11.10] montre que, si nous pouvons disposer d'un substrat pour lequel k3 est petit ou nul, alors la taille du burst, p, est bien dfinie et gale la concentration du site actif. Les substrats de la chymotrypsine utiliss dans les premires tudes de cet enzyme, le carbonate de p-nitrophnylthyle et l'actate de p-nitrophnyle, ont des valeurs de k3 trop leves, mais par la suite, SCHONBAUM, ZERNER et BENDER (1961) ont montr que dans des conditions adquates, le trans-cinnamoylimidazole donne d'excellents rsultats. A pH 5,5 ce compos ragit avec la chymotrypsine pour donner de l'imidazole et la trans-cinnamoyl-chymotrypsine, mais la raction ne se poursuit pas, c'est--dire que k 3 0 . Ainsi la mesure de la quantit d'imidazole libre pour une solution de chymotrypsine donne une mesure prcise de la quantit d'enzyme. Le titrage du site actif par mesure du burst diffre des mesures de vitesse en tant relativement insensible aux modifications des constantes de vitesse : une mesure de vitesse exige des conditions bien dfinies de pH, de temprature, de composition du tampon pour assurer sa reproductibilit. Par opposition, la taille du burst n'est pas affecte par des variations relativement importantes de k2, qui pourraient, par exemple, rsulter de la modification chimique de l'enzyme, sauf si k2 diminue au point d'avoir une valeur comparable celle de k3. Mesure de cette manire, la modification chimique d'un enzyme n'affecte pas la mesure de la molarit de l'enzyme ou la rend gale zro. Pour cette raison, le titrage des enzymes a t appel une mthode de tout ou rien (KOSHLAND, STRUMEYER et RAY, 1962).
11.3. LES TECHNIQUES EXPRIMENTALES

11.3.1. Les classes de mthodes
Les expriences l'tat stationnaire sont habituellement ralises sur une chelle de temps de plusieurs minutes, au minimum. Elles n'ont pas ncessit le dveloppement d'un quipement spcial, parce que, en principe, toute mthode qui permet l'analyse d'un mlange ractionnel l'quilibre peut tre adapte pour permettre l'analyse du droulement d'une raction. Dans l'tude des ractions rapides, cependant, les courtes priodes de temps sur lesquelles les mesures doivent tre ralises ont ncessit le dveloppement d'appareils spciaux, et ne se prsentent donc pas comme une simple extension de celles des ractions l'tat stationnaire. Les chelles de temps typiques des processus importants pour comprendre les ractions catalyses par des enzymes couvrent la gamme allant d'environ 10 ps pour les ractions les plus rapides de transfert de proton ou d'lectron jusqu'aux secondes pour les ractions spcifiques les plus lentes catalyses par des enzymes, ou plus longues minutes ou heures pour les ractions avec des substrats non-spcifiques,
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comme prsent dans la moiti infrieure de la figure 11.3. Cependant, comme le montre la partie suprieure de cette figure, les mthodes courantes de mesure l'tat stationnaire ne peuvent tre appliques sur des chelles de temps infrieures quelques secondes (et cela mme avec certaines difficults). Un groupe important de mthodes de mlange rapide ( 11.3.2 et 11.3.4) permet d'tendre cette gamme jusqu'aux millisecondes, mais cela est toujours trop lent pour tudier certains processus. Pour ces phnomnes trs rapides, il faut avoir recours aux mthodes de relaxation ( 11.3.5).
Mthodes l'tat stationnaire
Mthodes de flux
"Quenched flow" "Stopped flow"
Flux continu
Mthodes de relaxation
Saut de pression Saut de temprature
Mthodes ultrasoniques
1012 1ps
109 1ns
106 1s
103 1ms
1 1s
1min
103 Temps (s) 1h
Ractions de transfert de protons Raction de transfert d'lectrons Changements de conformation des macromolcules Ractions catalyses par des enzymes
11.3 - Domaines de temps des mthodes et des processus observs La partie suprieure de la figure montre les gammes de temps sur lesquelles les diffrentes mthodes discutes dans le texte peuvent tre utilises. La partie infrieure prsente les gammes typiques de temps sur lesquels certains processus se droulent.
D'autres mthodes que celles discutes dans ce manuel (figure 11.3) sont utiles dans certaines circonstances. La photolyse clair ou la radiolyse pulse sont des techniques qui permettent de gnrer trs rapidement un intermdiaire de courte dure de vie et d'observer les ractions ultrieures. Ces techniques ont une utilit limite dans l'tude des ractions biologiques car peu d'intermdiaires peuvent tre gnrs de cette faon. Cependant, quand elles peuvent tre utilises, la gamme accessible de l'chelle de temps est trs tendue et peut aller jusqu' des temps aussi court que 0,1 ps. Mme s'il existe peu de systmes biologiques auxquels elles peuvent tre directement appliques, l'information qu'elles sont susceptibles de fournir sur les ractions chimiques simples contribue notre comprhension des tapes chimiques qui se droulent dans les ractions enzymatiques.
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Les mthodes de rsonance magntique, en particulier la rsonance magntique nuclaire, sont de plus en plus utilises pour tudier la structure des protines et peuvent galement tre appliques la mesure des constantes de vitesse des systmes l'quilibre, en particulier celles des constantes de vitesse de dissociation des ligands, par exemple des complexes enzyme-inhibiteur. L'chelle de temps couverte correspond celle des mthodes de saut de temprature.
11.3.2. Les mthodes de flux continu

Pour les processus qui ont des constantes de temps d'un ordre gal ou suprieur la milliseconde, les techniques principalement utilises sont les mthodes de mlange rapide collectivement dsignes sous le nom de mthodes de flux. Elles sont toutes drives de la mthode de flux continu mise au point par HARTRIDGE et ROUGHTON (1923) pour mesurer la vitesse de la combinaison de l'oxygne avec l'hmoglobine. Dans cette mthode la raction tait initie en forant deux ractifs se mlanger, l'hmoglobine rduite et un tampon oxygn, de sorte que le mlange tait conduit se dplacer rapidement dans un tube d'un mtre de long. Dans une exprience de ce type, pour viter un flux laminaire de composants incompltement mlang dans le tube, il est essentiel d'inclure une chambre de mlange dans le systme et de crer une turbulence pour s'assurer d'un mlange complet et instantan. Tant que la vitesse de flux est constante, le mlange observ un point quelconque du tube a un ge constant, dtermin par la vitesse de flux et la distance qui spare ce point de la chambre de mlange. Ainsi, en ralisant des mesures plusieurs points le long du tube, il est possible d'obtenir une courbe d'avancement pour les premires tapes de la raction. Le principe de l'appareil est prsent dans la figure 11.4, qui n'est pas une reprsentation raliste de l'appareil original, mais qui a t dessine de manire souligner la relation avec la mthode de stopped-flow dont nous discuterons ci-dessous.
Moteur ou pression Hmoglobine dsoxygne Tampon oxygn Source de lumire Systme de dtection
Chambre de mlange
Dchets
11.4 - Mthode de flux continu En positionnant le systme de dtection diffrentes positions le long de la chambre d'observation, il est possible de visualiser des mlanges qui ont des ages diffrents. Cet appareil ncessite de grandes quantits de protines mais ne ncessite pas un systme de dtection avec une rponse rapide.
La mthode de flux continu requiert de grandes quantits de matriel, ce qui a initialement limit son utilisation l'tude de l'hmoglobine. Nanmoins, les expriences d'HARTRIDGE et de ROUGHTON (1923) sont parmi les plus importantes dans
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l'histoire de la biochimie, et devraient tre tudies par tous les exprimentateurs qu'ils s'intressent ou non aux cintiques de raction, parce qu'elles illustrent comment l'ingniosit scientifique permet de surmonter des obstacles apparemment infranchissables. Ces expriences ont t ralises avant le dveloppement commercial de systmes automatiques de mesure de l'intensit lumineuse et l'quipement qui existait l'poque, ncessitait plusieurs secondes d'ajustement manuel pour raliser chaque mesure. Alors qu'il pouvait sembler vident que les processus se droulant sur une chelle de temps de l'ordre de la milliseconde ne pouvaient pas tre tudis avec un tel quipement, HARTRIDGE et ROUGHTON ont dmontr le contraire. Aprs avoir t presque totalement abandonne au profit des mthodes de stoppedflow dont nous allons discuter ci-dessous, et ce en grande partie cause de la consommation importante de matriel, la mthode de flux continu a rcemment connu un regain d'utilisation avec le dveloppement de mthodes de mlange ultra-rapide, qui permettent de descendre sous la barre de la milliseconde. Comme nous l'avons signal, de nombreuses ractions ont des constantes de temps trs courtes, infrieures la milliseconde. Avec le dveloppement des mthodes de mesure spectroscopique qui permettent aujourd'hui de raliser un chantillonnage rapide, les mthodes de flux restaient limites par la capacit mlanger rapidement et entirement les deux solutions. Un premier systme de mlange ultra-rapide, dvelopp en 1985 par REGENFUSS et ses collgues, repose sur la miniaturisation du systme et sur un astucieux systme de mlange (REGENFUSS, 1985). Le dveloppement de ce systme est presque pass inaperu jusqu' ce que ROUSSEAU et ses collaborateurs dveloppent un systme proche pour tudier la fixation de l'O2 sur la cytochrome oxydase (TAKAHASHI, CHING, WANG et ROUSSEAU, 1995). Depuis ce systme a connu de nouveaux dveloppements et des applications diverses (RODER et SHASTRY, 1999).
11.3.3. Les mthodes de stopped-flow

De trs nombreuses amliorations ont t apportes au systme de mlange rapide de HARTRIDGE et ROUGHTON par MILLIKAN (1936), CHANCE (1940, 1951), GIBSON et MILNES (1964) et par d'autres, qui ont conduit au dveloppement de la mthode de stopped-flow, qui est devenue la mthode la plus couramment utilise pour tudier les ractions rapides. Cet appareil reprsent schmatiquement dans la figure 11.5 est constitu : de deux ou plusieurs seringues contenant les solutions de ractif, d'un systme de mlange, d'une chambre d'observation, d'une seringue ou d'une vanne d'arrt, d'un systme de dtection et d'enregistrement capable de rpondre trs rapidement.
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La raction est initie en poussant simultanment les pistons des deux seringues, provoquant ainsi le mlange des deux ractifs et forant le mlange se dplacer travers la chambre d'observation jusque dans la seringue d'arrt. Un court dplacement du piston de cette seringue d'arrt l'amne jusqu' une bute mcanique qui l'empche de se dplacer plus loin, qui empche ainsi le mlange de se poursuivre et qui dclenche simultanment le systme de dtection et d'enregistrement. Le temps qui se passe invitablement entre le mlange des ractifs et son arrive dans la chambre d'observation est de l'ordre de la milliseconde et est appel le temps mort de l'appareil.
Remplissage
Moteur ou pression
Enzyme
Source de lumire
Cellule d'observation Arrt
Substrat
Chambre de mlange Systme de dtection Dchets
Remplissage
Dclencheur
11.5 - Reprsentation d'un appareil de stopped-flow
Dans sa forme courante, la mthode de stopped-flow ncessite l'utilisation d'un spectrophotomtre pour suivre le droulement de la raction. Cette mthode est donc particulirement utile pour tudier les ractions qui engendrent une large variation de l'absorbance une longueur d'onde utilisable, comme par exemple, les ractions catalyses par les dshydrognases dans lesquelles le NADox est rduit en NADred. Cette mthode n'est cependant pas limite de tels cas, puisque d'autres systmes de dtection peuvent tre utiliss. Par exemple, de nombreuses ractions catalyses par des enzymes s'accompagnent de la libration ou de la fixation de protons, qui peuvent tre dtects optiquement en ajoutant un indicateur de p H dans le mlange ractionnel, une approche qui remonte aux mthodes de flux continu (BRINKMAN, MARGARIA et ROUGHTON, 1933). Dans d'autres cas, il est possible d'utiliser des changements de fluorescence (HASTINGS et GIBSON, 1963) ou de tout autre signal spectroscopique mesurable rapidement.
11.3.4. Le quenched flow

Quelques fois la nature chimique des vnements observs par spectroscopie dans la mthode de stopped-flow n'est pas clairement tablie (PORTER, 1967). Ces ambiguts peuvent tre leves en utilisant la mthode de quenched-flow (figure 11.6). Dans cette mthode, la raction est arrte (quenched) brivement aprs le
378
mlange, par exemple par un second mlange avec un agent dnaturant comme l'acide trichloroactique, qui limine rapidement l'activit enzymatique ; une autre mthode consiste refroidir trs rapidement le mlange jusqu' une temprature ou la vitesse de raction est ngligeable ou mme en congelant l'chantillon. En variant le temps entre le mlange initial et l'arrt de la raction, il est possible d'obtenir une srie d'chantillons qui peuvent tre analyss par des mthodes chimiques ou autres et partir desquelles la courbe d'avancement de la raction peut tre construite.
Remplissage
Moteur ou pression
Enzyme Tube de longueur variable Substrat Systme de "quenching"
Chambre de mlange Remplissage
11.6 - Reprsentation d'un appareil de quenched-flow L'age du mlange est vari en modifiant la longueur du tube connectant la chambre de mlange au systme de quenching.
Gnralement, la mthode de quenched-flow ncessite des quantits d'enzyme ou des autres ractifs plus importantes que la mthode de stopped-flow, parce que chaque exprience ne fournit qu'un point sur la courbe d'avancement, alors que par la mthode de stopped-flow chaque exprience fournit une courbe d'avancement complte. Il est donc souhaitable d'utiliser la mthode de quenched-flow aprs avoir ralis des expriences prliminaires avec le stopped-flow pour bien cerner le problme rsoudre. Considrons, par exemple, les donnes prsentes dans la figure 11.7 qui ont t obtenues par EADY, LOWE et THORNELEY (1978) dans des tudes de la dpendance au MgATP2 des ractions catalyses par la nitrognase. Cet enzyme est responsable de la fixation biologique de l'azote, et est form de deux protines, une protine contenant un centre 4Fe-4S et une protine contenant un centre Mo-Fe. Le MgATP2 est ncessaire pour le transfert des lectrons de la protine centre 4Fe-4S vers la protine Mo-Fe et est hydrolys en MgADP au cours de cette raction. L'oxydation de la protine centre 4Fe-4S peut tre observe directement avec un stopped-flow coupl un spectrophotomtre en suivant l'absorbance 420 nm. Quand la raction est initie par un mlange avec du MgATP2, un phnomne unique de relaxation est observ avec une constante de temps de 42 3 ms (figure 11.7a). Cette seule observation ne permet pas d'tablir que l'hydrolyse du MgATP2 est directement couple au transfert d'lectron ; au contraire, MgATP2 pourrait simplement tre un activateur de la protine
379
centre 4Fe-4S. Pour rsoudre cette question, la vitesse d'hydrolyse a du tre mesure directement, et cela a t ralis en mesurant la production du phosphate inorganique par la mthode de quenched-flow. Cette approche a permis de dterminer que la raction d'hydrolyse proprement dite a une constante de vitesse de 44 4 ms (figure 11.7b), qui n'est pas distinguable de la valeur mesure par la mthode de stopped-flow, confirmant que les deux ractions sont synchrones.
E420nm
0,02
a - "Stopped flow" Phosphate libr (nmol)

8
20ms
Temps
b - "Quenched flow"
50
100
150
200
Temps (ms)
11.7 - Comparaison des donnes de stopped-flow et de quenched-flow pour la raction catalyse par la nitrognase de Klebsiella pneumoniae (EADY, LOWE et THORNELEY, 1978) La trace de stopped-flow (a) mesure le transfert d'lectrons entre les deux composants de la nitrognase, alors que les observations de quenched-flow (b) mesurent la vitesse d'apparition du phosphate inorganique, c'est--dire l'hydrolyse de l'ATP. L'galit des constantes de temps montrent que les deux processus sont coupls.
Dans les premires versions de la mthode de quenched-flow, le temps entre le mlange et l'arrt tait modifi en modifiant l'organisation physique de l'appareil, c'est--dire en modifiant la vitesse de flux et la longueur du tube sparant les deux systmes de mlange. En pratique, cela imposait des limitations svres sur les chelles de temps qui pouvaient tre utilises et la mthode n'tait pas pratique pour un usage gnral. De nombreux problmes ont t rsolus par la mthode de quenched-flow puls, qui a t dcrite par FERSHT et JAKES (1975). Dans cet arrangement, la raction est initie exactement comme dans une exprience de stopped-flow, et un deuxime ensemble de seringues est utilis pour l'arrt. Cellesci sont mises en mouvement automatiquement un laps de temps prtabli aprs le premier mlange. La priode entre le mlange et l'arrt est contrl lectroniquement et ne dpend pas des dimensions physiques de l'appareil. Puisqu'il ne ncessite pas l'utilisation de longs tubes, ce systme est plus conomique en terme de ractif que le systme de quenched-flow dvelopp originellement.
380
Une information plus dtaille concernant les mthodes de flux peut tre obtenue dans les ouvrages plus spcialiss, (par exemple, HIROMI (1979)). Des mthodes plus labores comprennent l'utilisation de spectrophotomtres balayage rapide dcrite par HOLLAWAY et WHITE (1975). Ce dernier type d'instrument, maintenant disponible commercialement, offre des avantages considrables sur les types plus simples d'quipement de stopped-flow, puisque des spectres complets peuvent tre enregistrs au cours de la phase transitoire. Ceci a permis, par exemple, une tude dtaille des intermdiaires produits durant la raction de la myloperoxydase avec le peroxide d'hydrogne (MARQUEZ, HUANG et DUNFORD, 1994).
11.3.5. Les mthodes de relaxation

Le mlange de ractifs ne peut pas tre ralis efficacement en moins de 0,2 ms, et l'arrt du flux dans un instrument ncessite environ 0,5 ms. (Bien qu'il soit concevable d'arrter une raction plus abruptement, en pratique, cela provoquerait des ondes de choc qui gnreraient des fluctuations transitoires dans le systme de dtection). Le quenching, soit chimique, soit par refroidissement, prend galement un temps fini. Il existe donc une limite d'environ 0,5 ms pour le temps mort qu'il est possible d'atteindre avec les mthodes de flux et il est peu probable qu'une adaptation des instruments permettra une rduction notable de ce temps. En consquence les processus qui sont termins en moins de 0,5 ms ne peuvent tre observs au moyen de ces mthodes de flux. Ceci constitue une restriction svre pour un enzymologiste car la plupart des ractions catalyses par des enzymes impliquent de tels processus, et ils en existent quelques-uns pour lesquels le cycle catalytique complet se droule en moins de 1 ms. FERSHT (1999), par exemple, a rpertori sept enzymes dont les constantes catalytiques sont de l'ordre de 103 s1 ou suprieures. Des considrations de ce type ont conduit au dveloppement des mthodes de relaxation (EIGEN, 1954) pour l'tude des processus trs rapides. Ces mthodes ne ncessitent pas le mlange de ractifs, mais comme nous le dcrirons ci-dessous, il peut tre utile de les combiner avec une mthode de stopped-flow. Dans une mthode standard de relaxation, un systme l'quilibre est soumis une perturbation qui modifie la constante d'quilibre et nous observons alors l'volution du systme vers un nouvel quilibre, un processus qui est appel relaxation. Plusieurs mthodes de relaxation existent, parmi lesquelles la plus familire est certainement la mthode de saut de temprature (t-jump) dans laquelle la perturbation est une augmentation de temprature ralise par passage d'une dcharge de courant lectrique travers l'chantillon : de cette manire il est possible d'augmenter la temprature de l'chantillon de 10C en environ 1 s. Plus rcemment des techniques de saut de temprature utilisant un pulse de radiation mis par un laser ont t dveloppes. Ces mthodes permettent d'augmenter la temprature en moins d'1 ns. Un autre type de perturbation consiste dans un saut de pression : cette mthode est utilise pour mesurer des variations de volume qui peuvent avoir lieu
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pendant le processus catalytique, mais elle est difficile utiliser car les changements des constantes de vitesse qui ont lieu lors d'un changement de pression sont typiquement beaucoup plus petits que ceux induits par un mme apport d'nergie sous la forme d'un saut de temprature. La perturbation produite par une dcharge lectrique n'est pas instantanment convertie en une variation de temprature uniformment rpartie dans le volume de l'chantillon. En fait cela prend au moins 1 s, et un soin considrable doit tre apporter la construction de l'instrument de manire s'assurer que l'ensemble du volume est chauff uniformment. Ainsi, avec cette mthode, l'augmentation de temprature ne peut tre considre comme instantane que si l'on s'intresse des processus se droulant plus de 1 s aprs le dbut de la perturbation. Il est improbable que des temps plus courts puissent tre atteints avec des perturbations irrversibles, mais des processus beaucoup plus rapides peuvent tre tudis en utilisant des perturbations sinusodales. Des ultrasons, par exemple, dont les frquences sont aussi leves que 1011 s1, produisent des fluctuations locales de la temprature et de la pression lorsqu'elles se propagent travers un milieu. Ces fluctuations produisent des oscillations dans les valeurs des constantes de vitesse du systme, et l'tude de l'absorption de l'nergie ultrasonique par le mlange ractionnel fournit des informations sur ces constantes de vitesse (HAMMES et SCHIMMEL, 1970). Les systmes enzymatiques sont gnralement trop complexes pour qu'une application directe de cette approche puisse tre utilise, mais l'tude de systmes simples a malgr tout fourni des informations utiles pour les enzymologistes : par exemple, le travail de BURKE, HAMMES et LEWIS (1965) sur le poly-L-glutamate a montr qu'un changement important de conformation d'une macromolcule, la transition hlice-pelote statistique, se droule avec une vitesse de 105-107 s1. Apparemment, les changements de conformation des enzymes ne se droulent pas obligatoirement de telles vitesses, mais des vitesses de cet ordre de grandeur sont possibles et la ncessit d'un changement rapide de conformation ne peut constituer une objection l'encontre d'un mcanisme de catalyse enzymatique. Un dsavantage de l'observation des phnomnes de relaxation d'un systme l'quilibre est que les concentrations l'quilibre des espces transitoires importantes pour le processus catalytique peuvent tre trop faibles pour tre dtectes. Cette difficult peut tre contourne en combinant les mthodes de stopped-flow et de saut de temprature, et des instruments de stopped-flow commercialiss comprennent un accessoire de saut de temprature. Les ractifs sont mlangs dans une exprience conventionnelle de stopped-flow et sont soumis ultrieurement un saut de temprature aprs qu'un tat stationnaire a t atteint. La relaxation vers un nouvel tat stationnaire caractristique de la temprature la plus leve est alors observe. Ce type d'exprience permet d'observer des processus dans les phases prcoces de raction qui sont trop rapides pour tre observe par la mthode conventionnelle de stopped-flow, parce que les ractifs sont dj mlangs lorsque le saut de temprature est appliqu.
382
Dans le type standard d'instrument de saut de temprature, dans lequel la variation de temprature est produite par une dcharge lectrique, il n'y a aucune garantie que le systme ne se refroidisse pas progressivement une fois le saut de temprature ralis. Cela impose une limite suprieure au temps d'observation d'environ 1s comme l'illustre la figure 11.3. Cependant, si des prcautions sont prises pour viter ce problme, la priode d'observation peut tre tendue indfiniment. Par exemple, BUC, RICARD et MEUNIER (1977) ont russi utiliser une mthode de saut de temprature pour tudier la relaxation de l'hexokinase de germe de bl sur des temps de l'ordre de 40 min.
11.4. LA CINTIQUE DES PHASES TRANSITOIRES

11.4.1. Les systmes hors d'quilibre
Dans le 3.3.7, nous avons examin la validit de l'hypothse d'tat stationnaire en drivant l'quation pour la cintique d'un mcanisme de MICHAELIS et MENTEN en deux tapes, sans supposer l'atteinte d'un tat stationnaire. Cette drivation est cependant possible, parce que la concentration du substrat est traite comme une constante, ce qui n'est pas exactement correct. Malheureusement, la rsolution des quations diffrentielles est impossible pour presque tous les mcanismes de catalyse enzymatique sauf en faisant certaines hypothses. Dans les mesures des phases transitoires, nous essayons habituellement de choisir des conditions telles que le mcanisme suive approximativement une squence d'tapes de premier ordre, parce que c'est le type le plus gnral de mcanisme qui a une solution exacte. Le mcanisme suivant en deux tapes servira illustrer la manire selon laquelle les squences d'tapes de premier ordre sont analyses : X0 k1 k1 X1 k2 k2 X2 [11.11]
Le systme est dfini par l'quation de conservation et par trois quations de vitesse. L'quation de conservation est donne par :
[ X 0 ] + [ X1 ] + [ X 2 ] = [ XTot ]
[11.12]
et assure que les exigences de la stchiomtrie sont satisfaites en exigeant que la somme des trois concentrations soit une constante, [ XTot ] . Les trois quations de vitesse sont donnes par : d[ X0 ] [11.13] = k1 [ X 0 ] + k 1 [ X1 ] dt d [ X1 ] [11.14] = k1 [ X 0 ] ( k 1 + k 2 )[ X1 ] + k 2 [ X 2 ] dt d[ X2 ] [11.15] = k 2 [ X1 ] k 2 [ X 2 ] dt
383
L'une de ces trois quations est redondante, puisque leur somme est simplement la drive premire de l'quation de conservation (quation [11.12]) :
d [ X 0 ] d [ X1 ] d [ X 2 ] + + = 0 dt dt dt
[11.16]
Pour rsoudre le systme, nous pouvons donc considrer qu'il est dfini par les quations [11.12] [11.14] en ignorant l'quation [11.15]. La solution d'un ensemble de trois quations diffrentielles de trois concentrations inconnues peut tre rsolue simplement en liminant deux des concentrations pour produire une seule quation diffrentielle une inconnue. Premirement, [ X 2 ] peut tre limine en utilisant l'quation [11.12] pour l'exprimer en terme des deux autres concentrations :
[ X 2 ] = [ XTot ] [ X 0 ] [ X1 ]
et en substituant cette quation dans l'quation [11.14], nous obtenons :
[11.17]
d [ X1 ] dt
= k1 [ X 0 ] ( k 1 + k 2 )[ X1 ] + k 2 ([ XTot ] [ X 0 ] [ X1 ]) = ( k1 k 2 )[ X 0 ] ( k 1 + k 2 + k 2 )[ X1 ] + k 2 [ XTot ]
[11.18]
La diffrentiation de l'quation [11.13] fournit :
d 2 [ X0 ] dt 2
d [ X1 ] d[ X0 ] + k 1 dt dt d[ X0 ] = k1 + k 1( k1 k 2 )[ X 0 ] dt k 1( k 1 + k 2 + k 2 )[ X1 ] + k 1k 2 [ XTot ] = k1
[11.19]
Ensuite [ X1 ] est limin en rarrangeant l'quation [11.13] de manire obtenir une expression de k 1 [ X1 ] en terme de [ X 0 ] : d[ X0 ] [11.20] k 1 [ X1 ] = k1 [ X 0 ] + dt qui peut tre substitue dans l'quation [11.19] :
d 2 [ X0 ] dt 2
= k1
d[ X0 ] + k 1( k1 k 2 )[ X 0 ] dt d[ X0 ] ( k 1 + k 2 + k 2 ) k1 [ X 0 ] + + k 1k 2 [ XTot ] dt
[11.21]
Si celle-ci est rorganise de la manire suivante :
d[ X0 ] d 2 [ X0 ] + ( k1 + k 1 + k 2 + k 2 ) dt dt 2 + ( k 1k 2 + k1k 2 + k1k 2 )[ X 0 ] = k 1k 2 [ XTot ]
[11.22]
384
elle prend la forme standard suivante :
d 2 [ X0 ] d[ X0 ] +P + Q[ X 0 ] = R dt dt 2
et donne la solution suivante :
[11.23]
[ X 0 ] = [ X 0 ] + A01 e t
t1
+ A02 e t
t2
[11.24]
dans laquelle [ X 0 ] est la valeur de [ X 0 ] l'quilibre, A01 et A02 sont des constantes d'intgration qui donnent les amplitudes des phases transitoires, et t1 et t2 sont les temps de relaxation correspondants. Comme dans la plupart des discussions lmentaires des cintiques de relaxation, nous nous concentrerons dans cette discussion sur le contenu en information des constantes de temps, qui sont plus simples traiter mathmatiquement que les amplitudes. Nanmoins, les amplitudes constituent une source potentiellement riche d'information additionnelle. Parce que les mthodes de relaxation implique un apport d'nergie, habituellement sous la forme de chaleur, chaque amplitude de relaxation dpend des proprits thermodynamiques du systme, telle que l'enthalpie de la raction, DH. En consquence, les mesures d'amplitude peuvent fournir une information plus prcise sur ces proprits thermodynamiques que celles qui sont obtenues par des mesures ordinaires. THUSIUS (1973) a dcrit comment cela est ralis dans le cas simple de la formation d'un complexe 1:1 et donne des rfrences pour d'autres sources d'information. Les valeurs des temps de relaxation dans l'quation [11.24] sont les suivantes :
1 = 1 P + ( P 2 4Q ) 1 2 t1 2 1 t2
2
[ = 1 [P ( P 2
] 4Q ) ]
1 2
[11.25] [11.26]
Les solutions pour les deux autres concentrations [ X ]1 et [ X ]2 ont la mme forme que l'quation [11.24] avec les mmes temps de relaxation que ceux des quations [11.25] et [11.26] mais avec des amplitudes diffrentes. Si k 1k 2 est petit par rapport ( k 1k 2 + k1k 2 + k1k 2 ) , les expressions pour les rciproques des temps de relaxation se simplifient en ( k1 + k 1 ) et en ( k 2 + k 2 ) , pas ncessairement dans cet ordre, puisque 1 t 1 est toujours le plus grand et que 1 t 2 est toujours le plus petit. Cette simplification n'est pas toujours autorise, mais les expressions pour la somme et le produit des rciproques des temps de relaxation prennent toujours des formes simples :
1 + 1 =k +k +k +k = P 1 2 1 2 t1 t 2 1 = k k +k k +k k = Q 1 2 1 2 1 2 t 1t 2
[11.27] [11.28]
385
Cet exemple illustre plusieurs points qui s'appliquent de manire plus gnrale. Tout mcanisme qui consiste dans une squence de n tapes de premier ordre dans les deux sens de la raction peut tre rsolu exactement. La solution donnant l'volution de la concentration de chacun des ractifs ou des intermdiaires consiste dans une somme de (n + 1) termes, le premier donnant sa valeur l'quilibre et les autres consistant en n phases transitoires dont les temps de relaxation sont les mmes pour toutes les concentrations et dont les amplitudes sont caractristiques d'une concentration particulire. Dans les cas favorables, les temps de relaxation pour certaines ou pour toutes les phases transitoires peuvent tre associs avec des tapes particulires du mcanisme ; dans ces cas, la rciproque du temps de relaxation est gale la somme des constantes de vitesse caractristiques des sens direct et inverse de l'tape concerne. Un second point gnral qui n'est pas illustr par l'analyse ci-dessus, est que les ractifs qui sont spars du reste du mcanisme par des tapes irrversibles ont des caractristiques de relaxation plus simples que celles des autres ractifs, parce que certaines amplitudes sont nulles. Considrons par exemple le mcanisme suivant en cinq tapes, dans lequel deux tapes sont irrversibles : X0 X1 X2 X3 X4 X5 [11.29] En principe, chaque ractif devrait avoir cinq temps de relaxation, et c'est effectivement ce qui devrait tre observ pour X4 et X5 . Mais X2 et X3 sont isols des deux dernires tapes par la quatrime tape qui est irrversible ; chacun a, ds lors une amplitude nulle et donc seulement quatre temps de relaxation observables. X0 et X1 sont isols du reste du mcanisme par la seconde tape qui est irrversible ; l'volution de chacun de ces ractifs a trois amplitudes nulles et seulement deux temps de relaxation observables. Indpendamment du nombre d'tapes irrversibles, le nombre total de phnomnes observs de relaxation pour chaque concentration ne peut tre suprieur au nombre prdit par le mcanisme, mais est souvent infrieur soit parce que des processus ayant des temps de relaxation similaires ne peuvent pas tre rsolus ou parce que certaines amplitudes sont trop petites pour tre dtectes. Tous les mcanismes de catalyse enzymatique comprennent au moins une tape de second ordre. Cependant, chaque tape de ce type peut tre transforme en une cintique de premier ordre en fonction du temps (c'est--dire une cintique de pseudo-premier ordre ; 1.2.3), en s'assurant que l'un des deux ractifs est en large excs par rapport l'autre. En consquence, au moins un des temps de relaxation observs renferme une constante de vitesse de pseudo-premier ordre et donc, son expression comprend une dpendance la concentration. Cela est trs utile, puisqu'il permet d'attribuer les temps de relaxation mesurs des tapes particulires du mcanisme. Considrons, par exemple, le mcanisme suivant qui reprsente la moiti d'un mcanisme enzyme modifi ( 6.2.2) tudi en absence du second substrat :
386
E + A
k1 k1
EA
k2
E' + P
[11.30]
Pour ce mcanisme les quations [11.27] et [11.28] prennent la forme suivante :
1 + 1 = k [ A] + k + k 1 1 2 t1 t 2 1 = k k [ A] 1 2 t 1t 2
[11.31] [11.32]
Ainsi un graphique de la somme des rciproques des temps de relaxation en fonction de [ A ] fournit une droite dont la pente vaut k1 et dont l'ordonne l'origine vaut (k1 + k2), alors qu'un graphique de leur produit en fonction de [ A ] fournit une droite passant par l'origine et dont la pente vaut k1k2. Les trois constantes de vitesse peuvent donc tre calcules partir de la mesure des temps de relaxation.
11.4.2. Simplification de mcanismes complexes

Bien qu'un mcanisme constitu de n tapes unimolculaires puisse en principe tre analys exactement quelle que soit la valeur de n, il est dans la pratique difficile de rsoudre des processus exponentiels sauf s'ils se droulent sur des chelles de temps suffisamment diffrentes. En consquence, le nombre de phases transitoires dtectes peut tre bien infrieur au nombre de phases rellement prsentes. Le degr de sparation ncessaire pour la rsolution dpend de l'amplitude, mais quelques gnralisations utiles sont possibles. Si deux processus ont des amplitudes de signe oppos, elles sont relativement plus faciles rsoudre, mme si les temps de relaxation diffrent par moins d'un facteur 2. La raison de cela est vidente : si un signal apparat et ensuite disparat, il est indniable qu'au moins deux phases transitoires sont impliques. Si deux phases transitoires proches ont des amplitudes de mme signe, elles sont plus difficiles rsoudre, parce que la dcroissance de la courbe est monotone et sauf si le processus rapide possde une amplitude plus grande que le processus lent, son existence peut passer inaperue. Les relaxations lentes sont, en gnral, plus faciles mesurer que les rapides parce qu'elles peuvent tre observes sur une gamme de temps o les phases plus rapides ont disparu. En principe, donc, il est possible d'tudier les processus rapides en soustrayant la contribution des phases lentes. Considrons, par exemple, l'quation suivante : [11.33] [ X ] = [ X ] + A1 e t t 1 + A2 e t t 2 et supposons que t1 soit suprieur t2 par un facteur d'au moins 10. Nous pouvons valuer [ X ] en laissant voluer la raction jusqu' l'quilibre et ensuite dterminer A2 et t2 en ralisant des mesures sur une priode allant d'environ 0,5 t2 jusqu' 5 t2. Ces trois constantes permettent alors de calculer [ X ] + A2 e t t 2 n'importe quel temps. En faisant cela pour la premire partie de la courbe d'avancement de
387
la raction et en soustrayant cette valeur de la valeur observe de [ X ] , nous obtenons des donnes caractristiques d'un simple processus de relaxation : A1 e t t 1 . Dans cette manire de procder, qui est connue sous le nom d'pluchage, les erreurs s'accumulent progressivement ; toute imprcision sur la valeur de [ X ] contribue aux erreurs commises dans l'estimation des valeurs de A2 et de t2, et toute imprcision sur les valeurs de [ X ] , A2 et t2 contribuent aux erreurs commises dans la dtermination des valeurs de A1 et de t1. Ainsi, bien qu'en principe un nombre illimit de relaxations puisse tre rsolu par cette mthode, en pratique les processus les plus rapides sont beaucoup moins bien dfinis que les lents. Pour des raisons pratiques, donc, il est conseill de crer des conditions dans lesquelles le nombre de phnomnes de relaxation est aussi petit que possible. Un exemple simple de cette approche a t prsent dans le 11.2.1 : bien que le mcanisme en trois tapes utilis pour expliquer le burst de libration du produit doive en principe produire deux relaxations, le nombre de phnomnes observables de relaxation est rduit un seul en utilisant une concentration de substrat tellement leve que le premier phnomne de relaxation peut tre considr comme instantan. Considres du point de vue de l'enzyme, les ractions catalyses par les enzymes sont des ractions habituellement cycliques ; c'est--dire que le ractif initial, l'enzyme libre, est aussi le produit final. Cela n'empche pas d'obtenir une solution pour les quations diffrentielles (en supposant, comme prcdemment, que chaque tape soit de premier ordre ou de pseudo-premier ordre), mais conduit des cintiques de phase transitoire plus complexes que celles obtenues avec des ractions non-cycliques, parce que le systme cyclique se relaxe vers un tat stationnaire plutt que vers un quilibre. Il est alors utile de simplifier le problme en liminant le caractre cyclique de la raction. Il y a diffrentes manires de raliser cette condition. La plus simple conceptuellement est de choisir un substrat pour lequel la vitesse l'tat stationnaire est suffisamment faible pour tre ignore. En fait, c'est ce que nous ralisons lorsque nous utilisons un titrant du site actif ( 11.2.2). Cette approche prsente nanmoins, un dsavantage important qui est qu'elle implique d'tudier l'enzyme avec un substrat artificiel. Une approche diffrente consiste raliser une exprience de cycle unique (single turn-over), dans laquelle la vitesse est limite par le substrat et non par l'enzyme, c'est--dire que [ E ]0 >> [ A ]0 . Dans ce cas, le mcanisme de MICHAELIS et MENTEN peut tre crit comme suit : A k1 [ E ] k1 EA k2 k2 [ E ] P [11.34]
Cette quation a la forme de l'quation [11.11] parce que la raction doit s'arrter quand le substrat est consomm et donc aucun recyclage de l'enzyme n'a lieu. Cette approche a t comparativement peu utilise ces dernires annes, mais elle reste potentiellement prcieuse pour la dtermination de la vritable molarit des sites actifs (ou d'autres catalyseurs comme les anticorps catalytiques) sans qu'aucune
388
hypothse ne doive tre faite sur la puret de la prparation, et elle reste valable en prsence de certaines complications telles que la capacit de certains enzymes fixer le substrat sans catalyser la raction (TOPHAM et al., 2000). L'ide essentielle est que les mthodes habituelles d'tat stationnaire fournissent facilement des mesures des paramtres tels que Km V = 1 k A [ E ]0 qui comprend la concentration d'enzyme [ E ]0 , alors que les mthodes pr-stationnaires, par exemple les graphiques dcrits la fin du 11.4.1, fournissent les quantits correspondantes sans le facteur [ E ]0 ; en divisant l'un par l'autre, il est donc possible de calculer la vritable molarit de l'enzyme (BENDER et al., 1966 ; REINER, 1969). Dans les ractions plusieurs substrats (autres que les ractions d'hydrolyse), il est possible d'empcher l'enzyme d'tre recycl en omettant un des substrats du mlange ractionnel. Cela est particulirement utile pour les enzymes qui suivent un mcanisme enzyme modifi, parce qu'une raction se droule et est potentiellement mesurable, mme si la raction est incomplte. Un exemple prcoce de l'application de cette approche a t l'tude de l'aspartate transaminase par HAMMES et FASELLA (1962). En tudiant les ractions partielles de cet enzyme, principalement par la mthode de saut de temprature, ces auteurs ont pu attribuer des valeurs 10 des 12 constantes de vitesse qui caractrisent le mcanisme (figure 11.8). Les transaminases constituent une classe d'enzymes particulirement attractive pour ces tudes en raison de la facilit de mesurer les changements spectraux dus au coenzyme, le phosphate de pyridoxal, qui ont lieu au cours de la raction.
Complexe pyridoxal-enzyme-glutamate 3,3 107 M1 s1 2,8 103 s1 61 s1 30 s1 Complexe pyridoxamine-enzyme-2-oxoglutarate 70 s1
2,1 107 M1 s1
Pyridoxal-enzyme
Pyridoxamine-enzyme 140 s1 80 s1 26 s1
Rapport = 1,8 103 M1 Complexe pyridoxal-enzyme-aspartate
7 107 M1 s1
Complexe pyridoxamine-enzyme-oxaloactate
11.8 - Le mcanisme de la raction catalyse par l'aspartate transaminase, avec les constantes de vitesse attribues par HAMMES et FASELLA (1962)
Le traitement des enzymes qui suivent un mcanisme complexe ternaire est moins direct parce qu'un mlange ractionnel complet est normalement ncessaire avant qu'un changement chimique ne puisse se drouler. Nanmoins, PETTERSSON (1976)
389
a fourni un traitement rigoureux des cintiques des phases transitoires des ractions complexe ternaire, et l'a appliqu pour rsoudre certaines ambiguts dans les ractions catalyses par l'alcool dshydrognase du foie de cheval (KVASSMAN et PETTERSSON, 1976). Des expriences de cycle unique (single turnover) peuvent tre ralises avec des enzymes suivants un mcanisme complexe ternaire, en maintenant un des substrats une concentration plus faible que celle de l'enzyme. Une des caractristiques attractives des cintiques des ractions rapides est que celles-ci peuvent souvent fournir une information simple au sujet du mcanisme tout en vitant la complexit algbrique qui peut tre difficilement vite dans les tudes l'tat stationnaire. Un exemple vident est celui de l'exprience originale de burst de HARTLEY et KILBY (1954), dans laquelle l'ordre de libration des produits a t tabli avec un haut degr de certitude par l'observation qu'un des produits (le premier) est libr au cours du burst ( 11.2.1). Strictement, il est ncessaire de montrer que le second produit n'est pas galement libr dans un burst, parce qu'en principe les deux produits pourraient tre librs dans un burst si la dernire tape de la raction tait une isomrisation de l'enzyme libre limitant la vitesse et permettant la rgnration de sa forme originale. De manire similaire, nous pouvons dduire l'ordre d'addition des substrats dans le mcanisme complexe ternaire en variant les combinaisons de ractifs dans les seringues dans une exprience de stopped-flow. S'il existe un ordre obligatoire de fixation, la trace observe lorsque l'enzyme est pr-mlang avec le substrat qui se fixe en premier est probablement plus simple que celle observe lorsque l'enzyme est pr-mlang avec le substrat qui se fixe en second : dans le premier cas, le premier complexe est dj form quand les seringues sont actionnes, mais dans le second cas le pr-mlange avec le second substrat ne provoque rien, puisque aucune raction ne peut se drouler tant que l'enzyme n'est pas mis en contact avec le premier substrat.
11.4.3. Les systmes proches de l'quilibre

Dans un instrument de saut de temprature, la perturbation de la constante d'quilibre n'est gnralement pas suffisamment importante pour gnrer un tat dans lequel le systme est loign de l'quilibre. En consquence, l'analyse des cintiques de relaxation est simple et il n'y a aucune ncessit transformer des tapes d'ordre lev en tape de pseudo-premier ordre. La raison de cette situation est que ce sont les termes impliquant un produit de concentrations qui empche la rsolution du systme d'quations diffrentielles mais ces termes peuvent tre ngligs dans les systmes proches de l'quilibre. Une simple raction de fixation permet d'illustrer cette situation : k1 E + A EA [11.35] k1 [ E ] + D[ E ] [ A ] + D[ A ] [ X ] + D[ X ]
390
Dans ce schma, [ E ] , [ A ] et [ X ] sont respectivement les concentrations l'quilibre de E, A et EA la temprature la plus leve, c'est--dire qu'elles dfinissent l'quilibre dans le systme aprs la perturbation ; les constantes de vitesse k1 et k1 sont de la mme manire celles qui s'appliquent la temprature la plus leve. La concentration chaque instant t peut tre reprsente respectivement par [ E ] + D[ E ] , [ A ] + D[ A ] et [ X ] + D[ X ] , et la vitesse est donne par l'expression suivante :
d[ X ] = k1([ E ] + D[ E ]) ([ A ] + D[ A ]) k 1([ X ] + D[ X ]) dt
[11.36]
Cependant, dD[ X ] dt est identique d [ X ] dt , et par la stchiomtrie de la raction, D[ E ] = D[ A ] = D[ X ] . Ainsi :
dD [ X ] = k1 [ E ] [ A ] k 1 [ X ] dt k1([ E ] [ A ] ) + k 1 D[ X ] + k1( D[ X ]) 2
[11.37]
Sous cette forme, il s'agit d'une quation diffrentielle non-linaire qui n'a aucune solution analytique. Le terme qui la rend non-linaire est k1( D[ X ]) 2 . Si le systme est proche de l'quilibre comme nous l'avons suppos au dbut, ce terme peut tre nglig. Cependant, la vitesse nette l'quilibre est nulle, comme dans tout systme l'quilibre et ainsi k1 [ E ] [ A ] k 1 [ X ] = 0 , c'est--dire que le premier des deux termes de l'quation [11.37] disparat et que celle-ci se simplifie sous la forme suivante : dD [ X ] [11.38] = k1([ E ] [ A ] ) + k 1 D[ X ] dt
Cette quation est une simple quation diffrentielle linaire qui peut tre rsolue directement en sparant les variables et en intgrant (voir l'quation [1.1] dans le 1.1.1 qui a la mme forme), ce qui donne le rsultat suivant :
D[ X ] = D[ X ]0 e [k 1 ([ E ] +[ A ] ) +k 1 ]t
[11.39]
dans lequel D[ X ]0 est la grandeur de la perturbation quand t = 0. Donc, en supposant que la perturbation initiale est faible, la relaxation d'une raction une seule tape est dcrite par une seule phase transitoire avec un temps de relaxation t donn par : 1 = k ([ E ] + [ A ] ) + k [11.40] 1 1 t Puisque [ E ] , [ A ] et k 1 k1 peuvent normalement tre mesurs indpendamment, une mesure de t permet d'attribuer des valeurs individuelles k1 et k1. Une analyse similaire peut tre applique tout mcanisme proche de l'quilibre, que les tapes individuelles soient ou non de premier ordre, parce que les termes non-linaires du type k1( D[ X ]) 2 peuvent toujours tre ngligs. En gnral, un
391
mcanisme comprenant n tapes a une solution comprenant n phases transitoires, bien que le nombre puisse tre rduit en imposant des contraintes thermodynamiques sur les valeurs permises pour les constantes de vitesse. En plus, le nombre de phases transitoires observ exprimentalement est souvent infrieur au nombre thorique, en raison de difficults rencontres pour dtecter des phases de faible amplitude ou pour rsoudre des phases proches les unes des autres. A la fin du 11.3.4, nous avons vu qu'il est souvent pratique d'observer un systme se relaxant vers un tat stationnaire plutt que vers un quilibre. Bien qu'il ne s'agisse pas rigoureusement d'un systme proche de l'quilibre, il peut tre analys de la mme manire. Considrons, par exemple, le mcanisme de MICHAELIS et MENTEN : k2 k1 E + A EA E + P [11.41] k1 [ E ]ss + D[ E ] [ A ]0 [ X ]ss + D[ X ] Si celui-ci est cart de son tat stationnaire (caractris par les valeurs [ E ]ss et [ X ]ss qui reprsentent respectivement les concentrations d'enzyme libre et de complexe EA l'tat stationnaire) de sorte que les constantes de vitesse ne sont plus celles qui dfinissent l'tat stationnaire original, il se relaxera vers un nouvel tat stationnaire la vitesse suivante : d[ X ] [11.42] = k1([ E ]ss + D[ E ])[ A ]0 ( k 1 + k 2 )([ X ]ss + D[ X ]) dt Si nous introduisons la condition d'tat stationnaire k1 [ E ]ss [ A ]0 = ( k 1 + k 2 )[ X ]ss et la condition impose par la stchiomtrie D[ E ] = D[ X ] , elle se simplifie de la manire suivante :
dD [ X ] = ( k1 [ A ]0 + k 1 + k 2 ) D[ X ] dt
[11.43]
qui est facilement intgrable et donne une solution qui consiste dans une seule phase transitoire : [11.44] D[ X ] = D[ X ]0 e ( k 1 [ A ] 0 +k 1 +k 2 ) t Une prsentation plus avance et plus dtaille des cintiques de relaxation des enzymes est donne par HAMMES et SCHIMMEL (1970).
392
PROBLMES
11.1 - Un enzyme d'une masse molculaire de 50 kDa est tudi dans une exprience de cycle unique une concentration de substrat de 1 M. La mesure de la vitesse d'apparition du produit une concentration d'enzyme de 1 mg mL1 rvle deux phases transitoires, avec des temps de relaxation de 4,5 ms et de 0,1 s. A 5 mg mL1 d'enzyme les valeurs correspondantes sont 2,8 ms et 31 ms. En supposant le mcanisme le plus simple en accord avec ces observations, estimer les valeurs des constantes de vitesse. 11.2 - Les donnes suivantes peuvent tre exprimes par une quation de la forme y = A + B e t t 1 + C e t t 2 . En supposant que t1 est infrieur 5 ms, estimer les valeurs de A, C et t2, et utiliser ces rsultats pour estimer B et t1.
t (ms)
1 2 3 4 5 6
y
78 68 60 53 48 43
t (ms)
7 8 9 10 15 20
y
40 37 34 32 25 22
t (ms)
25 30 35 40 45 50
y
20 19 18 17 17 17
11.3 - Dans des tudes en conditions d'tat stationnaire d'un enzyme, un inhibiteur comptitif est dcouvert qui possde un Ki = 20 M. Cette valeur est interprte comme une vritable constante d'quilibre. La constante de MICHAELIS pour le substrat est gale 0,5 mM. Ensuite, des expriences de stopped-flow sont ralises : dans l'exprience (a), une seringue de l'appareil contient 0,2 mM d'inhibiteur et l'autre contient 50 M d'enzyme, 0,2 mM d'inhibiteur et 10 mM de substrat ; dans l'exprience (b), une seringue de l'appareil contient 0,2 mM d'inhibiteur et 50 M d'enzyme et l'autre contient 0,2 mM d'inhibiteur et 10 mM de substrat. La phase transitoire de la raction a un temps de relaxation de 7,7 ms dans l'exprience (a) et de 15 ms dans l'exprience (b). Estimer les constantes de vitesses on et off pour la fixation de l'inhibiteur sur l'enzyme libre. Les rsultats des expriences de stopped-flow confirment-elles l'interprtation originale que K i est une vritable constante d'quilibre.
12 ESTIMATION DES CONSTANTES CINTIQUES

12.1. L'EFFET DES ERREURS EXPRIMENTALES DANS L'ANALYSE DES DONNES CINTIQUES
Au cours des 60 dernires annes, la majorit des expriences de cintique enzymatique a t analyse au moyen de graphiques linaires dcrits dans le 3.5.2 et parmi ceux-ci, le plus populaire est sans aucun doute le graphique en double inverse dans lequel l'inverse de la vitesse est port en fonction de l'inverse de la concentration de substrat ( 3.5.2.1). Depuis le dbut des annes 1980, l'apparition des micro-ordinateurs dans les laboratoires a conduit l'utilisation de programmes pour l'analyse des donnes. Il peut sembler que tous les graphiques utilisables devraient donner les mmes rsultats, avec uniquement de lgres variations subjectives provenant de la manire de tracer la meilleure courbe, et donc que l'utilisation de l'ordinateur devrait galement fournir les mmes rsultats avec un accord encore plus gnral d l'limination du caractre subjectif. Cela serait le cas si les expriences pouvaient tre ralises avec une prcision parfaite mais, en ralit, l'erreur exprimentale est toujours prsente et les diffrentes mthodes utilises fournissent des valeurs diffrentes des paramtres, parce qu'elles sont diffremment influences par les erreurss. Cette situation est illustre par quelques exemples de calculs prsents dans le tableau 12.1. La premire moiti suprieure du tableau montre l'effet sur 1 v et sur [ A ] v d'une mme incertitude additive de + 0,1 dans chacune des 5 observations s'talant sur la gamme allant de Km 5 5 Km . Il faut noter que si les incertitudes sur les valeurs de v sont toutes identiques, les incertitudes rsultantes sur 1 v varient entre elles d'un facteur suprieur 20, et celles sur [ A ] v d'un facteur presque gal deux (cette diffrence importante explique pourquoi la longueur des barres d'erreur qui sont prsentes dans la figure 3.11 est trs variable alors que celle de la figure 3.12 l'est beaucoup moins). De plus, comme le montre la moiti infrieure du tableau, les rsultats ne sont ni proportionnels, ni mme qualitativement les mmes quand les incertitudes sur v correspondent une proportion constante de leurs vritables valeurs.
394
Par souci de simplicit, toutes les incertitudes prsentes dans le tableau 12.1 ont t calcules comme des valeurs positives, bien qu'en ralit certaines soient positives et d'autres soient ngatives. Si le calcul avait t ralis avec des valeurs ngatives, les rsultats seraient similaires ceux qui sont prsents ( l'exception du signe) mais pas identiques puisque les transformations non-linaires de v en 1 v et en [ A ] v ont des effets asymtriques dans les deux directions : c'est pour cette raison que les barres d'erreur des figures 3.10 3.12 sont asymtriques (toutes sont asymtriques mme si cette caractristique n'est pas visible pour certaines parmi les plus longues).
Tableau 12.1 - Effet de l'incertitude exprimentale sur les valeurs transformes des observations [A] 0,2 0,5 1 2 5 0,2 0,5 1 2 5
vrelle
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
e + 0,1 + 0,1 + 0,1 + 0,1 + 0,1
v
1,1 2,1 3,1 4,1 5,1
1 v relle
1 v
1 1 v vrelle
[A] v relle
[A] v
0,18182 0,23810 0,33333 0,48780 0,98039 0,19048 0,23810 0,31746 0,47619 0,95238
[A] [A] v v relle

0,01818 0,01190 0,01075 0,01220 0,01961 0,00952 0,01190 0,01587 0,02381 0,04762
1,00000 0,90909 0,09091 0,20000 0,50000 0,47619 0,02381 0,25000 0,33333 0,32258 0,01075 0,33333 0,25000 0,24390 0,00610 0,50000 0,20000 0,19608 0,00392 1,00000
+ 5% 1,05 1,00000 0,90909 0,04762 0,20000 + 5% 2,10 0,50000 0,47619 0,02381 0,25000 + 5% 3,15 0,33333 0,32258 0,01587 0,33333 + 5% 4,20 0,25000 0,24390 0,01190 0,50000 + 5% 5,25 0,20000 0,19608 0,00952 1,00000
Mme ces complications pourraient, avec quelques efforts, tre limines, si les vritables erreurs exprimentales taient systmatiques (toutes de la mme taille et dans la mme direction) et de grandeur connue, comme dans le tableau 12.1. Dans la ralit, elles sont de grandeur inconnue et elles varient au hasard, d'une observation l'autre. Ainsi, une transformation non-linaire des observations originales ralises pour faciliter le trac d'un graphique produit des distorsions non-linaires de toute erreur prsente dans les donnes originales, et ces distorsions rendent difficile le traitement correct de ces incertitudes. Cela signifie que l'estimation des paramtres cintiques partir de l'analyse des graphiques n'est pas aussi vidente qu'elle y parat. De nombreux auteurs (et notamment l'un d'entre nous dans un livre prcdent : CORNISH-BOWDEN, 1976b) ont conclu que les graphiques devraient tre vits et qu'une estimation srieuse des paramtres devrait toujours se baser sur une analyse par ordinateur. Cette conclusion est particulirement attirante si nous considrons que la plupart des mthodes dcrites dans ce chapitre sont utilisables pour le dveloppement de logiciels
395
d'analyse et qu'un grand nombre de celles-ci sont trop compliques pour tre abordes d'une autre manire. Elle est toutefois errone parce qu'elle nglige deux points : premirement l'il humain est beaucoup plus performant pour reconnatre un comportement particulier ou inattendu que n'importe quel logiciel existant aujourd'hui ; deuximement, tous les logiciels reposent sur des hypothses concernant les proprits des erreurs exprimentales prsentes dans les donnes et si cellesci ne sont pas appropries, les rsultats fournis par un logiciel ne seront pas meilleurs que ceux qui seraient obtenus partir d'un graphique mal trac. Il est vident que de nombreux utilisateurs de ces logiciels sont gnralement mal informs au sujet de ces hypothses, et de nombreux articles renferment des affirmations inconsistantes. Ainsi, par exemple, dans les cas o des observations auxquelles sont attribues un pourcentage d'incertitude approximativement uniforme, sont traites en leur donnant une pondration gale. Comme nous allons le voir ci-dessous, une pondration gale est approprie pour des observations caractrises par des incertitudes uniformes lorsque celles-ci sont exprimes en valeur absolue et non lorsqu'elles sont exprimes comme des pourcentages. L'utilisation aveugle d'un logiciel crit par quelqu'un d'autre est rarement un procd sr. Il ne peut du moins transformer une exprience mal prpare en une exprience russie et il ne peut extraire une information prcise partir de mauvaises donnes. Nanmoins, il est irraliste de demander aujourd'hui tous les utilisateurs d'ordinateur d'crire leurs propres logiciels et, de plus, de nombreux logiciels d'ajustement des donnes de cintiques enzymatiques sont dj disponibles. A condition d'tre utiliss avec certaines prcautions, ceux-ci peuvent se rvler tre des outils trs utiles. Ce chapitre constitue une introduction de la thorie mais une description plus dtaille peut tre obtenue dans un autre livre (CORNISH-BOWDEN, 1995b) qui inclut un logiciel permettront d'implmenter les mthodes dcrites sur un PC ou sur d'autres ordinateurs compatibles. Avant de terminer cette discussion sur les graphiques, nous devrions noter que leur fonction s'tend au-del de l'analyse des donnes, qui est en effet ralise plus efficacement avec l'aide d'un ordinateur ; ils jouent galement un rle essentiel dans l'illustration des rsultats de l'analyse. Si les lecteurs d'une publication scientifique voient, comme ils le font de plus en plus frquemment, des valeurs de paramtres qui ne sont accompagnes d'aucune indication sur la manire dont celles-ci ont t obtenues, l'exception de l'affirmation que les donnes ont t ajustes sur l'quation de MICHAELIS et MENTEN (PORTARO et al., 2000) ou que les paramtres ont t calculs par ajustement des donnes l'aide du logiciel GRAFIT (STABILE, CURTI et VANONI, 2000), ils n'ont aucun moyen de juger si l'ajustement a t ralis en utilisant une pondration approprie et en vrifiant la prsence d'une erreur systmatique. Ils n'ont aucune raison d'avoir confiance dans les donnes qui sont prsentes. Accompagner les rsultats quantitatifs au moins par un graphique qui illustre la qualit et la quantit de donnes devrait tre considr comme une ncessit. Inversement, la pression des diteurs pour liminer ce qu'ils
396
considrent comme inutile produit une tendance oppose : de plus en plus de publications, non seulement ne prsentent pas de donnes primaires, mais ne prsentent galement aucune donne secondaire.
12.2. AJUSTEMENT SUR UNE QUATION DE MICHAELIS ET MENTEN PAR LA MTHODE DES MOINDRES CARRS
12.2.1. Introduction des erreurs dans l'quation de MICHAELIS et MENTEN
L'quation de MICHAELIS et MENTEN est habibuellement crite sous la forme de l'quation [3.36], c'est--dire de la manire suivante :
v =
V [ A] Km + [ A ]
[12.1]
ou d'une manire quivalente. Sous cette forme, elle est incomplte puisqu'elle nglige l'effet de l'erreur exprimentale. Alors que le point essentiel de l'estimation statistique des paramtres consiste minimiser les effets de l'erreur exprimentale, l'omettre de l'quation est une bonne recette pour chercher dans le noir. Nous pouvons modifier l'quation [12.1] en y faisant figurer l'effet de l'erreur exprimentale de diffrentes manires. Parmi ces manires, deux impliquent des hypothses simples sur les erreurs commises. Si nous supposons que toutes les observations ont le mme coefficient de variation, c'est--dire que les erreurs sont approximativement uniformes quand elles sont exprimes en pourcentage, alors un terme d'incertitude multiplicative ( 1+ ei ) est appropri :
vi =
V [ A ]i ( 1 + ei ) Km + [ A ]i
[12.2]
mais si nous pensons qu'elles ont la mme dviation standard, c'est--dire que les erreurs sont approximativement uniformes quand elles sont exprimes en units de vitesse (mM s1), alors, un terme d'incertitude additive e'i est le plus appropri :
vi =
V [ A ]i + e'i Km + [ A ]i
[12.3]
Dans les deux cas, l'indice i, dans ce chapitre, indique que nous avons affaire, non des observations isoles, mais la iime observation parmi un chantillon de n observations. Les valeurs de e'i dans l'quation [12.3] ne sont pas les mmes que celles de ei dans l'quation [12.2], ce qui explique pourquoi nous avons besoin de deux symboles. Il n'est pas essentiel d'crire les quations de cette manire : nous pouvons utiliser l'quation [12.2] pour tudier le cas d'un coefficient uniforme de variation ou
397
l'quation [12.3] pour tudier le cas d'une dviation standard uniforme, mais cette pratique complique l'analyse sans ncessit. L'avantage d'utiliser l'quation [12.2] dans le cas d'un coefficient uniforme de variation est que nous avons un terme ei qui se comporte simplement sans facteur de correction. Dans ce chapitre, nous utiliserons l'quation [12.2] comme la forme standard puisqu'elle correspond au mieux aux rsultats qui ont t obtenus dans les rares tudes qui ont pris en compte les erreurs exprimentales rencontres en cintique enzymatique (par exemple STORER, DARLISON et CORNISH-BOWDEN, 1975 ; ASKELF, KORSFELDT et MANNERVIK, 1976 ; MANNERVIK, JAKOBSON et WARHOLM, 1986). Nous ne rentrerons pas dans l'algbre qui rsulte de l'utilisation de l'quation [12.3], mais nous donnerons quelques rsultats qui en dcoulent, lorsque cela sera utile. En bonus, nous pouvons noter qu' la fois l'algbre et l'arithmtique sont plus simples si nous supposons un coefficient de variation constant ; cependant, nous soulignons que ceci n'est pas une raison valable pour prfrer cette situation, puisque le choix doit tre dict par les proprits sous-jacentes des incertaintudes et non par la facilit. Exprimer l'quation de MICHAELIS et MENTEN sous la forme de l'quation [12.2] illustre pourquoi les transformations linaires telles que celles dcrites dans le 3.5 peuvent donner des rsultats insatisfaisants. Puisqu'elles sont ralises partir de l'quation [3.36] (identique l'quation [12.1]) par une algbre parfaitement correcte, il est difficile d'admettre premire vue pourquoi elles pourraient tre incorrectes. Le problme disparat une fois que nous avons ralis que l'algbre n'est pas en cause, mais qu'il provient du point de dpart. En effet, une expression plus complte de l'quation de MICHAELIS et MENTEN, comme celle de l'quation [12.2], ne peut tre mise sous la forme de l'quation d'une droite.
12.2.2. Estimations de V et de Km
Le problme d'estimer V et Km aussi prcisment que possible revient trouver les valeurs qui rendent les dviations ei aussi petites que possibles. A l'exception du cas trivial o il y a seulement une ou deux observations, il n'est, en gnral, pas possible d'obtenir des valeurs pour lesquelles toutes les valeurs de ei sont nulles. Par contre, il est possible d'en trouver qui minimisent la moyenne du carr des valeurs de ei , ei2 . Nous utilisons ei2 plutt que ei pour viter les complications provenant de l'existence la fois de valeurs positives et de valeurs ngatives. (En principe, nous pouvons obtenir un effet similaire simplement en ignorant le signe de ei , mais cela conduit un algbre si difficile que cela n'est gnralement pas utilis). Ainsi, nous pouvons dfinir les valeurs de V et de K m qui donnent le meilleur ajustement des donnes exprimentales comme celles qui minimisent la somme des carrs des dviations, SS, dfinie de la manire suivante :
SS =
ei2
i =1
[12.4]
398
La somme est faite sur toutes les observations, comme indiqu, mais puisque les limites d'addition sont normalement videntes dans les calculs statistiques, elles peuvent tre ngliges sans danger d'introduire des ambiguts et dans le reste de ce chapitre, elles ne seront plus prsentes explicitement. Le rarrangement de l'quation [12.2] permet d'exprimer ei en fonction de vi, [ A ]i , Km et V :
ei =
K m vi V [ A ]i
vi V
[12.5]
En substituant cette quation dans l'quation [12.4], nous obtenons :
Nvi SS = + Mvi 1 [ A ]i
[12.6]
dans laquelle N = Km V et M = 1 V sont respectivement l'ordonne l'origine et la pente du graphique de [ A ]i vi en fonction de [ A ]i ( 3.5.2 et figure 3.11). Bien que les valeurs de V et de K m qui minimisent SS puissent tre obtenues en calculant les drives partielles de l'quation [12.6] par rapport V et K m et en galant chacune de ces deux drives zro, la mme conclusion peut tre atteinte de manire plus rapide et plus simple en rsolvant d'abord l'quation pour N et M. Les drivations partielles de l'quation [12.6] vis--vis de N et de M donnent la paire suivante de drives partielles :
SS = N SS = M
[ A i]

2 v Nvi + Mvi 1 i [ A ]i Nv + Mvi 1
[12.7]
i 2 vi [ A ]
[12.8]
Si nous dfinissons N et M comme les valeurs de N et de M qui minimisent SS, les deux expressions peuvent tre considres comme gales zro et rarranges en un systme de deux quations en N et M :
v2 v2 N i 2 + M i = [ A ]i [ A ]i
[ Ai ]
[12.10] [12.11]
v2 N i + M vi2 = [ A ]i
qui donne les solutions suivantes :
vi
N =
i vi2 [ Ai ] [ A ] vi i i
v2
vi2 [ A ] 2 vi2 [ A ] i i vi2
[12.11]

i [ Ai ] 2 vi [ A ] [ Ai ] i i
399
v2
v2
M =
vi2 [ A ] 2 vi2 [ A ] i i vi2
[12.12]
La substitution dans ces quations des dfinitions de K m et de V en termes de N et de M donne alors les expressions suivantes pour les valeurs V et Km du meilleur ajustement :
V = 1 = M
v2 vi2 [ Ai ] 2 vi2 [ A ] i i
v2 vi2 v [ Ai ] 2 vi [ A ] [ Ai ] i i i
i vi2 [ Ai ] [ A ] vi i i
[12.13]
v2
Km = N = M
v [ A ] 2 vi [ A ] [ Ai ] i i i
vi2
vi2
[12.14]
Ce rsultat, qui a, pour la premire fois, t donn par JOHANSEN et LUMRY (1961) est exact ; aucune modification supplmentaire n'est ncessaire pour minimiser SS comme nous l'avons dfini dans l'quation [12.6].
12.2.3. Rsultats correspondants pour une dviation standard uniforme des vitesses
Si nous prenons l'quation [12.3] comme point de dpart la place de l'quation [12.2], en substituant e'i dans l'quation [12.4] la place de ei dans la dfinition de SS, cela revient supposer que les vitesses originales sont caractrises par une dviation standard constante plutt que par un coefficient de variation constant. L'analyse est plus difficile, parce qu'avec cette dfinition il n'y a pas d'expressions analytiques donnant les paramtres de la courbe ajuste. Au contraire, celles-ci doivent tre obtenues par une srie d'approximations (voir CORNISH-BOWDEN, 1995b). La drivation n'est pas prsente ici (voir nanmoins le problme 12.3), mais les rsultats suivants sont obtenus :
vi3 v vi3 v [ A ]i2 vi3 vi [ A ]i i i V = 3 3 vi v vi v v3 [ A ]i2 vi3 [ A ]i [ Ai ] i i i
[12.15]
400
i vi3 vi [ Ai ] [ A ]i vi3 i i
v3
v3v
Km =
vi3 v v3 vi3 v [ A ]i2 vi3 [ A ]i [ Ai ] i i i
[12.16]
Ces quations ne peuvent tre utilises directement puisqu'elles comprennent les vitesses calcules, vi , qui sont inconnues tant que les paramtres n'ont pas t calculs. Pour contourner ce problme, nous commenons par supposer que les vitesses mesures reprsentent des estimations raisonnablement prcises des vitesses calcules, c'est--dire que nous calculons des estimations prliminaires de V et de Km partir des quations [12.15] et [12.16] dans lesquelles vi est remplace par vi . Ces estimations prliminaires des paramtres peuvent tre utilises pour calculer des estimations prliminaires des vitesses calcules, qui peuvent alors tre utilises pour obtenir de meilleures estimations des paramtres, qui peuvent leur tour tre utilises pour calculer de meilleures valeurs pour les vitesses calcules et ainsi de suite jusqu' ce que les rsultats soient auto-consistants. Puisque ces calculs impliquent des approximations, il n'existe pas une manire unique de procder, et une approche diffrente dcrite par WILKINSON (1961) est souvent donne en rfrence dans la littrature. Celle-ci converge exactement vers les mmes rsultats numriques et reprsente un travail tout aussi laborieux par ordinateur : il n'y a donc aucune bonne raison de prfrer l'une ou l'autre mthode. Des formules lgrement diffrentes sont galement rencontres dans la littrature qui donnent des rsultats lgrement diffrents de ceux obtenus par la mthode de WILKINSON, parce qu'ils ne sont pas vraiment corrects : par exemple, dans un livre prcdent de CORNISH-BOWDEN (1976b), cet auteur donne des expressions quivalentes des quations [12.15] et [12.16] o vi3 vi est remplac par vi2 vi2 ; CLELAND (1967) donne des expressions quivalentes aux quations [12.15] et [12.16] o vi3 vi est remplac par vi4 .
12.3. ASPECTS STATISTIQUES DU GRAPHIQUE LINAIRE DIRECT

12.3.1. Comparaison entre les statistiques classiques et les statistiques distribution libre
L'approche par la mthode des moindres carrs pour ajuster les donnes est la mthode gnrale la plus pratique et la plus largement utilise ( l'exception peut tre de celle qui consiste tracer l'il une droite passant par les points), mais elle n'est pas ncessairement la meilleure. Pour dmontrer que la solution de la mthode des moindres carrs est la meilleure solution au problme pos, nous devons non seulement dfinir ce que nous considrons comme la meilleure solution , mais
401
nous devons galement faire diverses hypothses concernant la nature de l'incertitude exprimentale : Les incertitudes alatoires sur les mesures sont distribues selon une courbe normale (gaussienne) d'incertitude. Seulement une variable, la variable dite dpendante, est sujette des incertitudes. Dans les mesures de cintique enzymatique, celle-ci est en gnral assimile la vitesse. Les pondrations appropries sont connues. Dans le contexte de ce chapitre cela correspond connatre quelle quation, parmi les quations [12.2], [12.3] ou toute autre quation, doit tre utilise comme point de dpart pour introduire des incertitudes dans l'quation cintique. Les incertitudes ne sont pas corrles, c'est--dire que la grandeur ou le signe d'une incertitude particulire n'a aucune influence sur la grandeur ou le signe d'une autre incertitude. L'incertitude systmatique peut tre ignore, c'est--dire que la courbe de distribution pour chaque incertitude a une moyenne gale zro. En pratique, nous connaissons peu de chose ou rien au sujet de la vrit ou mme au sujet de ces hypothses. En consquence, l'analyse classique des donnes par la mthode des moindres carrs repose sur des bases thoriques plus fragiles que nous ne le ralisons habituellement, mme si les scientifiques prfrent baser leurs conclusions sur aussi peu d'hypothses non-vrifies que possible. Une branche alternative de la statistique, connue comme la statistique distribution libre ou non-paramtrique, propose une solution puisqu'elle vite les diffrentes hypothses ci-dessus l'exception de la dernire, qui est conserve sous une forme attnue : en absence d'autre information, une incertitude est suppose tre aussi bien positive que ngative. Peut-tre l'ide la plus simple suivre dans cette rduction du nombre d'hypothses est que le meilleur estimateur de la valeur moyenne d'un ensemble de valeurs n'est pas d'en calculer la moyenne simple mais de calculer la mdiane, c'est--dire l a valeur centrale quand toutes les valeurs sont ranges par ordre. La moyenne est l'archtype d'un estimateur de la mthode des moindres carrs, alors que la mdiane est l'archtype d'un estimateur d'une mthode distribution libre. Les avantages d'utiliser une mthode distribution libre peuvent tre trs importants puisque ces mthodes fournissent gnralement des informations plus fiables quand les hypothses reprises ci-dessus sont fausses. D'un autre ct, rien n'est gratuit et dans ce cas, le prix payer est que si toutes les hypothses de la thorie classique sont vrifies, nous obtiendrons de moins bonnes estimations des paramtres avec les mthodes distribution libre qu'avec la mthode des moindres carrs. Nanmoins, en gnral le prix est faible en comparaison des bnfices potentiels. Un bnfice qui n'est pas le moindre, est le fait que la thorie qui supporte l'analyse distribution libre est plus simple comprendre que la thorie statistique classique. Puisqu'aucune distribution n'est suppose, aucune thorie de
402
distribution de probabilit n'est ncessaire et en effet trs peu de thorie est implique en plus de celle ncessaire pour comprendre les expriences de tirage au sort (pile ou face). En effet, l'ide que chaque incertitude a la mme probabilit d'tre positive et ngative est trs similaire l'hypothse qu'une pice de monnaie a la mme probabilit de tomber sur le ct pile ou sur le ct face.
12.3.2. Application au graphique linaire direct

Le graphique linaire direct ( 3.5.2.4) a t conu dans le but d'introduire les notions d'analyse distribution libre dans l'analyse des cintiques enzymatiques et en mme temps de simplifier les procdures et les concepts. Pour toute paire nonrplique d'observations ( [ A ]i , vi ) et ( [ A ]j , v j ), il existe une paire unique de valeurs des paramtres V et K m qui satisfait exactement les deux observations quand elles sont substitues dans l'quation de MICHAELIS et MENTEN :
Vij =
[ A ]i [ A ]j [ A ]i c vi vj
v j vi vj vi [ A ]i [ A ]j
Km ,ij =
Les valeurs de ces paramtres dfinissent les coordonnes du point d'intersection des deux droites reprsentant les deux observations dans le graphique linaire direct. Prises dans leur ensemble, n observations fournissent un maximum de 1 2 n( n 1 ) paires de telles valeurs. (Il s'agit du nombre maximum de valeurs plutt que du nombre rel parce que les paires de valeurs obtenues partir d'observations rpliques o [ A ]i = [ A ]j n'ont pas de significations et ne doivent pas tre considres). La meilleure estimation de Km peut maintenant tre choisie comme la mdiane d'un ensemble de valeurs de Km,ij, et la meilleure estimation de V comme la mdiane d'un ensemble de valeur de Vij. S'il existe un nombre impair de valeurs, la mdiane est la valeur centrale quand les valeurs sont ranges par ordre ; s'il existe un nombre pair de valeurs, la mdiane est donne par la moyenne des deux valeurs centrales. Nous utiliserons les symboles Km* et V* pour reprsenter ces estimations afin de souligner le fait qu'elles ne proviennent pas de l'utilisation de la mthode des moindres carrs. Il existe deux raisons principales dans l'analyse du graphique linaire direct pour prfrer dfinir ces estimations comme la mdiane plutt que comme un estimateur plus courant tel que la moyenne arithmtique : premirement, les estimations de Km,ij et de Vij sont automatiquement classes par ordre lorsque le graphique est trac comme l'illustre la figure 12.1, et donc aucun calcul n'est ncessaire pour dterminer les mdianes ; deuximement, la mdiane, au contraire des
403
V
autres types de moyenne est insensibles aux valeurs extrmes qui sont obtenues de manire invitable dans les graphiques linaires directs, parce que certaines droites sont presque parallles.
V*
v5 v4 v3 v2 v1
[A]5
[A]4
[A]3
[A]2
[A]1
K*m
Km
12.1 - Dtermination des mdianes partir d'un graphique linaire direct Chaque paire de droites se coupe en un point dont les coordonnes donnent une estimation de Km et une estimation de V, comme l'indiquent les projections sur les deux axes. Puisque les intersections sont automatiquement ordonnes lorsque le graphique est trac, la dtermination des mdianes se rsume compter afin de trouver l'estimation centrale dans chaque srie ou calculer la moyenne entre les estimations centrales lorsqu'il y a un nombre pair de points d'intersection (comme dans notre exemple). Si certaines intersections se situent en dehors du premier quadrant, donnant lieu des estimations ngatives des paramtres, celles-ci doivent recevoir une attention spciale (voir figure 12.2). Si de telles intersections sont nombreuses ou si l'arrangement des intersections indique un profil clair et reproductible, il est ncessaire d'tudier la possibilit que les donnes n'obissent pas l'quation de MICHAELIS et MENTEN.
L'avantage principal de cette approche par rapport la mthode des moindres carrs rside certainement dans le fait qu'elle ne ncessite pas de calcul et qu'elle n'implique aucune ide abstraite ou difficile comprendre telle que la distribution normale des incertitudes. Mais elle possde galement certains avantages statistiques (CORNISH-BOWDEN et EISENTHAL, 1974) qui seront mis en vidence dans les suivants.
12.3.3. Absence de la ncessit d'utiliser des pondrations

L'analyse distribution libre du graphique linaire direct est seulement marginalement moins bonne que l'analyse par la mthode des moindres carrs lorsque toutes les hypothses de la mthode des moindres carrs sont vrifies (voir la liste dans le 12.3.1). Dans d'autres circonstances, elle peut se rvler bien meilleure,
404
parce qu'elle repose sur peu d'hypothses et est en consquence insensible aux dviations vis--vis de la distribution attendue des incertitudes. Par exemple, les estimations obtenues par la mthode des moindres carrs des paramtres de MICHAELIS et MENTEN donnes par les quations [12.15] et [12.16] ne sont en aucune manire les mmes que celles donnes par les quations [12.13] et [12.14] ; si nous utilisons les quations [12.15] et [12.16] alors que nous devrions utiliser les quations [12.13] et [12.14] ou vice versa, nous nous cartons des proprits optimales de la mthode des moindres carrs et nous obtenons de mauvaises estimations des paramtres. Ceci signifie qu'en pratique, pour utiliser la mthode des moindres carrs avec confiance, il est ncessaire de connatre la pondration qui doit tre applique aux observations, de savoir si celles-ci sont uniformes dans leur coefficient de variation ou si elles sont uniformes dans leur dviation standard ou dans une combinaison des deux, mais en pratique nous n'avons presque jamais accs cette connaissance. L'approche distribution libre nous dispense de cette ncessit d'appliquer la pondration adquate et bien qu'elle puisse fournir des rsultats marginalement de moins bonne qualit qu'une mthode des moindres carrs correctement pondre, elle donnera gnralement de bien meilleurs rsultats qu'une mthode des moindres carrs mal pondre.
12.3.4. Insensibilit vis--vis d'observations exceptionnelles

Une observation exceptionnelle est une observation prsentant une incertitude plus grande qu'il n'est attendu sur la base de la distribution des incertitudes de la majorit des observations. Si une exprience renferme une telle observation, celle-ci peut avoir un effet dramatique sur l'estimation des paramtres par la mthode des moindres carrs, mais n'en aura presque aucune sur la mthode distribution libre. La raison pour cela est trs simple et drive des proprits ordinaires de la moyenne et de la mdiane : si un octognaire marche dans une chambre remplie d'enfants, l'age moyen de la population de la pice peut facilement tre doubl, mais la mdiane ne variera quasiment pas. L'estimation mdiane des paramtres comme nous l'avons dcrite dans le 12.3.2 n'est pas aussi insensible que cela parce que toute observation aberrante contribue (n 1) droites dans le graphique, mais elle est toujours beaucoup plus rsistante ces observations exceptionnelles que l'estimation par la mthode des moindres carrs. Pour rsumer ce paragraphe et les prcdents, nous pouvons dire que dans des conditions idales, la mthode des moindres carrs est plus performante que toute mthode alternative distribution libre, mais qu'elle est tellement sensible aux dviations par rapport aux conditions idales que dans la pratique, elle peut s'avrer beaucoup moins performante.
405
12.3.5. Traitement des estimations ngatives des paramtres

Dans les expriences caractrises par des incertitudes importantes sur les mesures de vitesse, le graphique linaire direct comme il a t dcrit originellement (c'est-dire comme il est prsent dans les figures 3.13 et 12.1) prsente un lger dsavantage, c'est--dire qu'il conduit des valeurs de Km* et de V* qui ne sont pas distribues aux environs des valeurs relles correspondantes mais aux environs de valeurs qui sont trop faibles (CORNISH-BOWDEN et EISENTHAL, 1978). Ce problme provient de la prsence de points d'intersection dans le troisime quadrant, c'est--dire de points avec des valeurs ngatives de Km,ij et de Vij. Pour comprendre comment corriger ce problme il est utile de considrer pourquoi les intersections se trouvent en dehors du premier quadrant et la figure 12.2 montre des combinaisons typiques de valeurs de [ A ] et de v qui conduisent des intersections situes dans les premier, second et troisime quadrants ; le cas de l'intersection dans le quatrime quadrant n'est pas prsent puisqu'il est impossible sauf si les donnes contiennent des vitesses ngatives. Il est possible de voir que les intersections localises dans le deuxime et dans le troisime quadrant ont des origines totalement diffrentes et en consquence, elles doivent tre traites diffremment. Les intersections du deuxime quadrant (figure 12.2b) peuvent apparatre parce que l'enzyme prsente un phnomne d'inhibition par le substrat et les observations proviennent d'une partie de la courbe o v diminue lorsque [ A ] augmente. Si s'agit de l'explication correcte, elle devrait tre confirme par la prsence dans le second quadrant d'autres intersections qui correspondent des observations ralises dans cette gamme de concentrations de substrat. Cependant, s'il n'y a aucune preuve d'une dviation systmatique vis--vis de l'quation de MICHAELIS et MENTEN, la prsence d'une intersection isole dans le second quadrant est trs vraisemblablement obtenue quand les deux valeurs de [ A ] sont grandes vis--vis de K m et donc que les deux valeurs de v sont suffisamment proches l'une de l'autre pour que l'erreur exprimentale provoque leur inversion dans l'ordre des valeurs. Ceci implique que la vritable valeur de V est similaire aux deux valeurs de v et que la vritable valeur de Km est beaucoup plus petite que les deux valeurs de [ A ] . Puisque la mme conclusion dcoule du traitement des valeurs de Km,ij et de Vij obtenues partir des intersections du second quadrant, il n'y a aucune raison d'appliquer un traitement particulier ces intersections. Le cas des intersections dans le troisime quadrant (figure 12.2c) est trs diffrent. Celles-ci peuvent tre le symptme d'une incertitude systmatique, signifiant dans ce cas que le graphique de v en fonction de [ A ] est une sigmode et non une hyperbole rectangulaire, mais encore une fois, cela doit tre confirm ou infirm par l'examen des autres intersections obtenues partir d'observations ralises pour des valeurs similaires de [ A ] . Si une incertitude systmatique n'est pas confirme, l'origine la plus vraisemblable de ces observations est que les deux valeurs de [ A ]
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sont suffisamment faibles vis--vis du vritable Km pour que l'erreur exprimentale provoque une inversion dans l'ordre des valeurs de v [ A ] .
V a - Premier quadrant Comportement habituel aucun traitement spcial 0 V b - Deuxime quadrant [A]1, [A]2 << Km 0 V c - Troisime quadrant [A]1, [A]2 >> Km 0 Km 0 0 [A] Km 0 v 0 [A] Km 0 v 0 [A] v
12.2 - Interprtation des estimations ngatives des paramtres obtenues partir du graphique linaire direct Dans chaque cas, le graphique de gauche montre une paire d'observations dans les coordonnes (Km, V) et le graphique de droite montre les mme observations dans les coordonnes ([ A ], v), o la courbe est trace en accord avec les valeurs des paramtres indiques par le cercle vide ( ) dans le graphique de gauche. Les graphiques sont schmatiques plutt qu'exacts, c'est--dire qu'ils ne sont pas tracs avec une chelle consistante. (a) Dans le cas normal, l'erreur exprimentale existe mais le point d'intersection correspondant est situ dans le premier quadrant et les estimations des deux paramtres sont positives. (b) Si les deux valeurs de [ A ] sont plus grandes que Km, l'erreur exprimentale peut conduire une intersection dans le second quadrant si les valeurs de v sont incorrectement ordonnes. (c) Si les deux valeurs de [ A ] sont plus petites que Km, l'erreur exprimentale peut conduire des intersections dans le troisime quadrant si les valeurs de v/[A] sont incorrectement ordonnes.
407
Ceci implique que la vritable valeur de K m est grande vis--vis des valeurs de [ A ] et que la vritable valeur de V est grande vis--vis des petites valeurs de v : cette conclusion est l'oppose de celle impliques par les valeurs de K m,ij et de Vij qui sont obtenues en considrant les valeurs brutes de l'intersection, puisque ces deux valeurs sont ngatives dans le troisime quadrant. Ceci explique le petit problme rencontr si les valeurs brutes des intersections du graphique linaire direct sont utilises et celui-ci peut tre corrig en traitant ces intersections comme donnant des valeurs leves la fois de Km,ij et de Vij. Des valeurs numriques relles ne doivent pas tre proposes ; il est juste suffisant de dire qu'elles sont grandes et positives. Ceci s'explique parce que les valeurs numriques des membres extrmes d'un chantillon ne sont pas ncessaires pour dterminer la mdiane. Ce remde traite un nombre ngatif comme tant au-del de l'infini plutt qu'en dessous de zro. Bien que de nombreuses personnes puissent se sentir mal l'aise d'agir de la sorte, elles devraient raliser qu'extrapoler au-del d'une vitesse infinie est ce que chaque utilisateur d'un graphique en double inverse fait lorsqu'il considre l'intersection de sa droite avec l'axe des abscisses pour dterminer la valeur de 1 Km (figure 3.11). Aucune de ces complications n'affecte la forme alternative du graphique linaire direct illustr dans la figure 3.14, parce que, avec ce graphique tous les dplacements modrs des droites, provoqus par des incertitudes de grandeurs raisonnables entranent des dplacements modrs des intersections, c'est--dire que celles-ci se dplacent modrment sur chacun des deux axes et ne passent jamais d'un quadrant l'autre en raison d'un passage par l'infini. A cause de cela, aucune rgle spciale n'est ncessaire pour interprter les intersections situes en dehors du premier quadrant de ce graphique.
12.4. PRCISION DES ESTIMATIONS

DES PARAMTRES CINTIQUES
Nous avons essay de limiter au maximum les complexits mathmatiques dans ce chapitre et nous ne dcrirons pas comment les formules permettant de tester la prcision de l'estimation des paramtres sont drives, mais nous donnerons quelques rsultats qui peuvent tre utiles (bien qu'ils devraient tre utiliss avec prcautions, puisque les calculs faits sans les comprendre sont une source d'interprtations errones). Des explications sur la manire d'obtenir ces rsultats peuvent tre trouves ailleurs (CORNISH-BOWDEN, 1994c). Pour viter de traiter sparment les quations [12.13-14] et [12.15-16], il est pratique de commencer par noter que ces deux paires d'expressions pour les meilleures estimations des paramtres de MICHAELIS et MENTEN sont des cas spciaux
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de la paire suivante d'expressions donnant les meilleures estimations pondres pour le graphique en double inverse :
V =
[ A i] 2 wi [ Ai]
i
w i
w [ A i] 2 i
w w v i [ Ai] i i
w
w [ A ]i v i i
[12.19]
Km
wi w vi [ A ]i i i i = wi wi wi wi [ A ]2 v [ A ] [ A ] v i i i i i
i wi v [ A ]
[12.20]
Dans ces quations, les pondrations wi sont les pondrations appropries qui doivent s'appliquer aux valeurs de 1 vi sur la base de deux hypothses diffrentes au sujet de la pondration approprie pour vi : si les coefficients de variation associs aux vitesses sont supposs uniformes, la pondration appliquer 1 vi est wi = vi2 et les quations [12.19] et [12.20] sont identiques aux quations [12.13] et [12.14] ; si les dviations standards associs aux vitesses sont supposes uniformes, la pondration appliquer est wi = vi3 vi et les quations sont identiques aux quations [12.15] et [12.16]. Diffrents calculs peuvent tre raliss pour tester la qualit de l'ajustement, mais deux questions apparaissent : de quelle manire la courbe calcule s'ajuste-t-elle aux points observs et avec quelles prcisions les valeurs des paramtres sont-elles dfinies ? La somme minimale des carrs fournit un point de dpart pour rpondre la premire question. En termes d'ajustement pondr, elle peut tre dfinie de la manire suivante : 2 1 1 [12.21] SS = wi vi vi qui est quivalente l'quation [12.6] si nous utilisons l'galit wi = vi2 et si nous calculons vi avec les meilleures estimations des paramtres. Dans cette situation, cependant, la somme des carrs n'est pas satisfaisante puisqu'il s'agit d'une somme plutt que d'une moyenne. Le remde vident est de la convertir en une moyenne en divisant par n, le nombre d'observations. Cependant, cette procdure est trop simple, parce qu'elle surestime la prcision si n est petit : la raison peut tre apprhende en considrant le cas extrme de n = 2, o SS sera toujours gal zro, puisqu'il est toujours possible d'ajuster exactement deux observations avec l'quation de MICHAELIS et MENTEN, mme s'il n'y a aucune raison de supposer que les observations sont exactes. Bien que ceci explique de manire vidente la ncessit de raliser la correction, il est moins vident de savoir quelle taille cette correction doit avoir ; ici nous affirmerons simplement sans argumenter qu'une
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estimation non-biaise de l'incertitude exprimentale peut tre obtenue en divisant SS par n 2 :

2 s exp =
SS n 2
[12.22]
Cette quantit est appele la variance exprimentale. Elle fournit un moyen de tester la prcision des estimations de V et de Km, puisque leurs variances peuvent tre exprimes partir de celle-ci :
s 2( V ) =
wi 2 V 4s exp [ A ]i2 w [ A i] 2 i w wi [ Ai] i

2
[12.23]
s 2 ( Km ) =
w wi 2 2 V 2s exp wi + 2 Km i + Km [ A ]i [ A ]i2 w [ A i] 2 i
4
w wi [ Ai] i
[12.24]
s2 V = Km
V 2 s exp wi Km w [ A i] 2 i w wi [ Ai] i
2
[12.25]
Cette dernire expression est donne explicitement parce que, bien que la manire de calculer V Km partir de V et de K m est vidente, la relation entre les trois variances n'est peut tre pas vidente du tout. Une complication mineure est que, lorsque les dviations standards relatives aux vitesses sont uniformes, les valeurs de wi qui sont appropries pour tre introduites dans les quations [12.21] [12.25] ne sont pas les mmes que celles qui sont ncessaires dans les quations [12.19] et [12.20] : pour calculer les meilleurs para mtres, nous devrions utiliser wi = vi3 vi comme nous l'avons dj mentionn, mais une fois qu'ils sont connus, nous remplacerons ces pondrations par wi = vi2 vi2 pour leur utilisation dans les quations [12.21] [12.25]. Les raisons de ce changement sont subtiles (CORNISH-BOWDEN, 1982) et ne sont pas trs importantes, parce que les rsultats sont trs peu affects si nous l'ignorons simplement et si nous utilisons les mmes pondrations pour l'ensemble de la procdure. Les estimations des variances n'ont pas les mmes dimensions que les paramtres auxquelles elles correspondent, mais ont ces dimensions leves au carr. La racine carre de la variance a donc les mmes dimensions que les paramtres correspondant et est souvent appele l'incertitude standard. Sa valeur est prsente de la manire
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suivante : V = 10.7 1,2 mM s1, par exemple, o 10,7 mM s1 est l'estimation de la valeur et 1,2 mM s1 est la racine carre de l'estimation de la variance. Notons qu'il n'y a aucune raison d'enregistrer un rsultat avec une prcision suprieure celle-ci (except dans des exercices o l'intrt rside plus dans l'arithmtique que dans le rsultat), par exemple tel que V = 10,7137 1,2077 mM s1, bien que des expressions de ce type soient couramment rencontres dans la littrature. En rgle gnrale, il y a rarement un intrt exprimer une incertitude standard avec plus de deux chiffres significatifs et la valeur du paramtre correspondant devrait tre exprime avec le mme nombre de dcimales que l'incertitude standard. Une fois que nous avons calcul l'incertitude standard, qu'est-ce que cela signifie ? Cela signifie que : si toutes les hypothses prsentes dans le 12.3.1 sont vrifies, y compris que nous avons bien utilis le modle correct et qu'il n'y a aucune incertitude systmatique, si nous considrons une exprience particulire que nous avons ralise de la mme manire dans les mmes conditions qu'une myriade d'autres expriences, si le nombre d'observations n est infini dans chaque exprience, alors la valeur relle du paramtre se situe dans la gamme allant de plus moins une dviation standard du paramtre calcul dans environ 68% des cas de cette myriade d'expriences. Si ceci semble avoir une signification plutt abstraite dcoulant d'une grande quantit d'hypothses, il s'agit nanmoins d'un fait : souhaiter qu'une dviation standard ait une signification plus utile ne la rendra pas relle ! La troisime supposition est clairement fausse dans les expriences relles, puisque nous n'avons jamais un nombre infini d'observations, mais heureusement, le biais d l'utilisation d'une valeur finie n peut tre corrige, en accord avec un principe dcouvert par W.S. GOSSET, un brasseur qui a publi un travail thorique de statistique sous le nom de STUDENT. Au moyen de cette thorie (STUDENT, 1908) nous pouvons facilement convertir l'incertitude standard en une limite de confiance n'importe quel niveau de confiance, pas uniquement 68%. Comme un guide grossier, nous pouvons considrer deux et trois fois l'incertitude standard comme la limite de confiance respectivement 95% et 99%. Ceci nous laisse toujours avec une dfinition de la limite de confiance qui est plus abstraite que nous le souhaiterions et qui dpend toujours de nombreuses hypothses parmi lesquels certaines sont trs vraisemblablement incorrectes. Peu de choses peuvent tre faites au sujet de cette abstraction, mais les biochimistes qui ne sont pas satisfaits par l'utilisation de tant d'hypothses peuvent toujours diminuer ce nombre en utilisant la mthode distribution libre. La thorie ncessaire pour calculer par la mthode distribution libre les limites de confiance des paramtres de MICHAELIS et MENTEN (CORNISH-BOWDEN, PORTER et TRAGER, 1978) n'est pas particulirement difficile (en ralit elle est plus aise comprendre que celle qui constitue la base du calcul des incertitudes standards)
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mais la dcrire clairement ncessiterait plus de place que nous ne pouvons en consacrer dans un livre d'enzymologie. Nous renvoyons les lecteurs intresss vers l'ouvrage de CORNISH-BOWDEN (1995b) pour plus d'information.
12.5. GRAPHIQUES DES RSIDUS ET LEURS UTILISATIONS

Aprs que des donnes aient t ajustes sur une quation, il est toujours utile de vrifier si les hypothses faites dans l'analyse sont raisonnables. Avons-nous ajust la bonne quation, une autre quation aurait-elle apport une explication plus crdible aux observations, une quation plus simple (avec moins de paramtres) aurait-elle donn les mmes rsultats ? Avons-nous faits des hypothses statistiques raisonnables par exemple, le coefficient de variation est-il constant, comme nous l'avons suppos dans le 12.2.2, ou une dviation standard constante aurait-elle constitu une meilleure approximation ou les incertitudes exprimentales varient-elles d'une manire plus complexe que ces deux hypothses ne l'impliquent ? La manire la plus simple d'aborder ces questions consiste examiner les rsidus aprs l'ajustement, c'est--dire les diffrences entre les vitesses observes v et les vitesses correspondantes v calcules partir de l'quation ajuste. Nous ne chercherons pas traiter cette partie de manire exhaustive, mais nous allons plutt indiquer les types d'usage qui peuvent tre faits des rsidus. Si les valeurs observes de v ont rellement un coefficient de variation uniforme, les diffrences simples ( v v ) devraient avoir tendance augmenter en valeur absolue lorsque la vitesse calcule v augmente, mais les diffrences relatives ( v v ) 1 devraient tre distribues l'intrieur d'une bande parallle autour de zro. D'un autre ct, si les vitesses observes ont rellement une dviation standard constante, les diffrences simples devraient tre distribues l'intrieur d'une bande parallle autour de zro et les diffrences relatives devraient avoir tendance diminuer en valeur absolue lorsque la vitesse calcule v augmente. La figure 12.3 montre des exemples de tels graphiques des rsidus. Ils sont faciles excuter, en dpit de la complexit que peuvent avoir les quations qui ont t ajustes, et ils peuvent fournir une information utile qui n'est pas rellement accessible d'une autre manire. Il est conseill d'avoir autant de points que possible dans un graphique des rsidus, prfrentiellement plus de 30, si celui-ci doit tre utilis pour dcider de la stratgie correcte de pondration. Ceci permet d'viter d'tre influenc indment par le comportement aberrant d'une ou de deux observations, puisque la dispersion est toujours importante. Nanmoins, mme un graphique qui contient aussi peu que cinq ou dix points peut tre utile pour autant que nous considrions l'interprtation comme une suggestion plutt que comme une information prcise.
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v^ v
^ v /v 1
a ^ vv
b ^ v /v 1
12.3 - Graphique des rsidus pour tester l'exactitude du schma de pondration a, b - La paire suprieure de graphiques montre les graphiques des rsidus attendus quand toutes les vitesses observes ont la mme dviation standard : (a) si la diffrence simple (v v) est porte en graphique en fonction de v , les points sont disperss l'intrieur d'une bande parallle autour de l'axe des abscisses, mais (b) si la diffrence relative (v v ) 1 est porte en graphique, la bande a la forme d'une trompette dont l'ouverture est situe gauche. c, d - La paire infrieure de graphiques montre les graphiques des rsidus attendus quand toutes les vitesses observes ont le mme coefficient de variation : (c) maintenant le graphique de (v v) produit une bande en forme de coin dont l'ouverture est droite, alors que (d) le graphique de (v v ) 1 produit une bande parallle.
Les graphiques des rsidus sont toujours trs utiles pour reconnatre si les dviations vis--vis de l'quation ajuste sont dues une incertitude systmatique (utilisation d'une mauvaise quation) plutt qu' une dispersion alatoire. Dans cette utilisation, l'interprtation peut tre claire mme s'il n'y a que quelques points. Par exemple, la tendance systmatique du graphique des rsidus prsent dans l'insert de la figure 11.1 serait immanquable mme s'il n'y avait que 6 ou 7 points plutt que 19. Il s'agit d'un exemple construit artificiellement, mais un exemple rel est prsent dans la figure 12.4 : notons que sans le graphique des rsidus l'ajustement sur le mauvais modle apparat excellent l'il, mais avec le graphique des rsidus la nature systmatique des dviations est vidente.
413
Les auteurs fournissent rarement des graphiques des rsidus dans leurs publications, et donc il est important pour un lecteur critique de savoir quoi ils ressembleraient s'ils taient prsents. Une grande prcision n'est pas essentielle pour cette application et il s'avre souvent suffisant de retracer un graphique publi sous la forme d'un graphique des rsidus en estimant les coordonnes l'il. Plus rapide et plus simple, nous pouvons mettre en vidence les incertitudes rsiduelles dans le graphique publi en observant la courbe trace en plaant l'il proche du papier. Cette mthode fonctionne trs bien si la ligne trace est une droite, mais elle peut aussi tre utilise avec une courbe si la courbure est faible.
Produit form (M) 80 60
40
20
4 Temps (min)
a - Complexe enzyme-enzyme suppos inactif

Produit form (M) 80 60
40
20
4 Temps (min)
b - Complexe enzyme-enzyme trait comme actif

12.4 - Discrimination entre modles avec l'aide des graphiques des rsidus Deux modles utiliss pour reprsenter la courbe d'avancement de la raction catalyse par la phosphoribulokinase (LEBRETON et GONTERO, 1999) ne sont presque pas distinguables quand ils sont compars sous la forme de graphiques ordinaires, mais pour le modle qui traite la phosphoribulokinase complexe comme inactive (a) le graphique des rsidus prsente une vidence claire d'incertitude systmatique, alors que le modle qui traite le complexe comme actif (b) ne le fait pas.
Il peut souvent tre impossible de tirer des conclusions dfinitives partir d'un seul graphique, puisque le nombre d'observations peut tre trop faible, mais si plusieurs courbes sont traces dans un graphique, reprsentant des conditions exprimentales
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diffrentes mais proches, ou si plusieurs graphiques relis sont prsents dans un mme article, nous pouvons les comparer entre eux. Si plusieurs cas de ce genre indiquent une tendance systmatique, mme si chacun de ces graphiques ne contient que quatre ou cinq points, il y a une probabilit leve qu'une incertitude systmatique soit prsente. Une seule courbe comprenant cinq observations et prsentant une distribution des rsidus en forme de U (par exemple, montrant un profil des signes de ces rsidus + + +), ne doivent pas revtir une importance considrable, mais cinq rptitions de ce type de figure ncessite une investigation plus pousse. Des exemples de figures prsentant des incertitudes systmatiques videntes qui sont passes inaperues par les auteurs peuvent tre obtenus en quelques minutes en feuilletant n'importe quelle revue rcente dans laquelle des graphiques cintiques sont prsents. Si un graphique des rsidus indique que l'utilisation d'une quation plus complexe est souhaitable, la question est alors de dcider quelle quation plus complexe nous devons essayer. Une fois encore, les graphiques des rsidus devraient s'avrer utiles. Supposons, par exemple, que des expriences sur l'effet d'un inhibiteur ont t interprtes en termes d'une inhibition comptitive mme si une composante faible mais apprciable d'inhibition anti-comptitive est prsente. Dans ce cas l'quation incorrecte peut donner de bons rsultats des concentrations faibles de substrat mais de trs mauvais rsultats des concentrations leves de substrat, parce que lorsque la concentration de substrat augmente les effets comptitifs deviennent moins importants alors que les effets anti-comptitifs deviennent plus importants. Ainsi, un graphique des rsidus en fonction de la concentration de substrat (avec des points pour toutes les concentrations d'inhibiteur, superposs sur le mme graphique) devrait prsenter une tendance systmatique qui ne serait pas vidente dans un graphique des mmes rsidus tracs en fonction de la vitesse calcule. En rsum, la figure 12.5 est une galerie de diffrents types de graphiques des rsidus qui peut tre utilise pour diagnostiquer diffrents types de problmes rencontrs dans les expriences ou dans l'analyse des rsultats. Le graphique (a) montre un rsultat idal (similaire ceux des figures 12.3a et 12.3d) alors que le graphique (b) rvle un choix inappropri de la pondration (similaire la figure 12.3c et similaire dans l'ide la figure 12.3b, bien qu'il soit diffrent dans les dtails). Le graphique (c) indique une incertitude systmatique vidente, alors que le graphique (d) peut indiquer une incertitude systmatique, mais il est essentiellement symptomatique d'une exprience mal prpare qui n'apporte pas de rponse claire quant au choix de l'quation utiliser. Le graphique (e) indique un arrondissement excessif des donnes numrique un stade trop prcoce de l'analyse (CRDENAS et CORNISH-BOWDEN, 1993), mais dans un cadre plus gnral, il illustre comment l'analyse d'un graphique des rsidus permet d'attirer l'attention sur une anomalie dans la distribution des incertitudes qui passerait compltement inaperue dans un autre type d'analyse des donnes. Le graphique (f) montre qu'une incertitude systmatique peut tre plus complique qu'une simple dviation de la
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linarit et tre nanmoins toujours dtectable dans un graphique des rsidus. Le graphique (g) illustre l'effet de la prsence d'une seule valeur exceptionnelle. Le graphique (h) est plus raliste que les autres puisqu'il illustre que les dviations par rapport au comportement attendu peuvent tre faibles et que plus d'un type de dviation peut apparatre dans le mme graphique. Bien qu'une incertitude systmatique semble prsente, elle n'est pas plus importante en taille que la dispersion alatoire et donc il n'est pas possible de conclure. De la mme manire, ce schma suggre l'existence d'une valeur exceptionnelle, mais elle n'est pas aussi vidente que dans le graphique (g). De plus, l'ombrage dans la figure une interprtation des donnes et non une donne en soi influence fortement l'interprtation du graphique. Dans le graphique (i) exactement les mmes donnes sont prsentes sans ombrage et sans indication supplmentaire, ce qui fournit une vue plus neutre, qui suggre moins nettement l'existence d'une incertitude systmatique ou d'une valeur exceptionnelle.
a f
0,010 0,005 0,000 0,005 0,010
Erreurs rsiduelles pour les donnes pH7,6
^ v (M/s)
12.5 - Slection de graphique des rsidus illustrant diffrents types de comportement (a) Dispersion alatoire aprs ajustement de donnes en utilisant un modle adquat et une pondration correcte ; (b) pondration inapproprie ; (c) incertitude systmatique ; (d) prparation exprimentale inadquate ; (e) effets d'un arrondissement excessif des donnes numriques ; (f) effets plus complexes d'incertitudes systmatiques ; (g) effet d'une seule valeur exceptionnelle ; (h) diffrents effets superposs ; (i) absence d'ombrage et d'autre indication, axes aussi fins que possible tout en restant visible ; (j) annotation excessive o les donnes ne sont pas suffisamment mises en vidence.
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En gnral, donc, bien que l'ombrage soit utile pour prsenter une interprtation au lecteur, l'interprtation initiale devrait idalement tre faite sans ombrage et sans interfrence de toute nature. Si nous comparons les graphiques (h) et (i) avec le graphique (j), qui reprsente encore les mmes donnes mais qui cette fois sont noyes dans les annotations du graphique, une pratique communment rencontre dans les graphiques publis, nous constatons que les points eux-mmes ont presque perdu leur signification et que la tendance non-linaire est devenue presque imperceptible. Idalement, un graphique des rsidus ne devrait contenir aucune annotation (aucune chelle, aucun nombre, aucun titre, aucun nom de variable) : toute cette information, si elle est ncessaire peut facilement tre communique dans la lgende. Les axes restent utiles mais ils devraient tre aussi imperceptibles que possible tout en restant visible, comme dans le graphique (i). Ces dernires remarques s'appliquent en particulier aux graphiques des rsidus. Certaines ne s'appliquent pas aux autres types de graphiques pour lesquels relguer l'information dans la lgende n'est pas une bonne ide. Certains points ne s'appliquent pas galement d'autres graphiques, cependant n'importe quel graphique devrait s'attacher mettre en vidence les donnes analyses et non par exemple une grille utilise pour l'interprtation. TUFTE (1990), par exemple, recommande que si nous traons un graphique la main sur une feuille de papier en utilisant une grille trs prominente, nous devrions tracer le graphique au dos du papier : la grille apparatrait ainsi suffisamment clairement par transparence pour permettre de tracer le graphique, mais suffisamment faiblement pour tre ignore par la suite. Plus gnralement, les trois livres publis par cet auteur (TUFTE, 1983, 1990, 1997) sont recommands tous ceux qui sont srieusement intress par la reprsentation graphique d'une information.
PROBLMES
12.1 - Dterminer par les mthodes des moindres carrs et distribution libre les estimations des paramtres de l'quation de MICHAELIS et MENTEN pour l'ensemble suivant de donnes :
[ A ] (mM)
1 2 3 4 5
v (mM min1)
0,219 0,343 0,411 0,470 0,490
[ A ] (mM)
6 7 8 9 10
v (mM min1)
0,525 0,512 0,535 0,525 0,540
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Pour les deux ensembles d'estimations, tracer le graphique des rsidus en fonction de [ A ] . Une tendance est-elle apparente ? Si oui, quelle exprience doit tre ralise pour dcider si la tendance est relle et n'est pas un artfact d une incertitude alatoire ? Une conclusion peut-elle tre tire au sujet de la pondration qui serait approprie pour l'analyse des moindres carrs ? 12.2 - Quelles seraient les estimations des paramtres obtenues partir des donnes du problme 12.1 si la valeur de v pour [ A ] = 1 mM tait 0,159 mM min1 plutt que 0,219 mM min1 ? 12.3 - Supposons que certaines donnes aient t ajustes par la mthode des moindres carrs en utilisant les deux hypothses de pondration discutes dans le texte, c'est--dire un coefficient de variation constant ( 12.2.2) et une dviation standard constante ( 12.2.3). Si les graphiques des rsidus suggraient non seulement que l'incertitude simple diminue lorsque la vitesse augmente, mais galement que l'incertitude relative augmente dans les mmes conditions, nous pourrions envisager d'utiliser un compromis dans le schma de pondration en utilisant le facteur de pondration wi = v 3 dans les quations [12.19] et [12.20]. Ecrire les expressions des paramtres de MICHAELIS et MENTEN dans lesquelles cette substitution est faite et tester le rsultat pour le respect des dimensions. 12.4 - Intuitivement, nous pouvons penser qu'il est raisonnable que le coefficient de variation d'une quantit mesure peut tre approximativement constant si cette quantit mesure est grande, mais qu'il n'est pas possible de mesurer une valeur de zro exactement, c'est--dire qu'aux faibles valeurs la tendance serait en faveur d'une dviation standard constante. Est-ce cela qui est impliqu dans le compromis du schma de pondration suggr dans le problme 12.3 ?
SOLUTIONS DES PROBLMES ET COMMENTAIRES

1.1 Ordre 1/2 vis--vis de A et ordre 1 vis--vis de B. Un ordre 1/2 peut tre expliqu en supposant que l'espce prdominante dans un mlange lquilibre est le dimre de lespce chimiquement active.
1.2 - a - La pente et lordonne lorigine sont toutes deux incompatibles. b - Compatible. c - Pente compatible, ordonne l'origine incompatible. 1.3 - Pente = e ( k 1 +k 1 ) t ; le point d'intersection = ([ P ] ,[ P ] ) . 2.1 - Les enthalpies d'activation sont typiquement d'environ 50 kJ mol1. 2.2 - 0,0033 K1. 3.1 - a - Km 9 . b - 9Km . c - 81. 3.3 - Au moins 8,2. 3.4 - La constante d'quilibre = 5,1. La seconde exprience donne une valeur de 1,5 pour la mme constante d'quilibre. Un changement de l'enzyme ne peut pas par lui-mme expliquer cette diffrence. Donc soit les valeurs mesures sont sujettes caution, soit les conditions exprimentales taient diffrentes sans que cela ne soit spcifi (par exemple, l'exprience a t ralise une temprature diffrente ou un pH diffrent). 3.5 - Les mthodes les plus prcises devraient donner des valeurs proches de Km = 10,6 mM, V = 1,24 mM min1.
3.6 - b - V app =
k0 [ E ]0 app , Km = KmA K 1 mA KP
1+
[ A ]0 KP ; K 1 mA KP
c - Quand la valeur de KP est infrieure celle de Km .
420
3.7 - Ni les valeurs de k0 ou ni celles de k0 Km ne sont grandes par rapport celles de nombreuses ractions catalyses par un enzyme avec des substrats spcifiques. De plus, les deux substrats utiliss sont des substances nonnaturelles qui n'existent pas dans la nature. Il n'est pas possible que l'un de ces enzymes ait t optimis pour agir sur ces substrats. Les rsultats ne permettent donc pas une comparaison significative entre le pouvoir catalytique des pepzymes et des enzymes naturelles. De plus, comme l'hydrolyse de ces composs n'a aucune utilisation mdicale ou industrielle vidente il n'est pas possible de tirer des conclusions concernant des applications possibles. 3.8 - Le graphique de v en fonction du log [ A ] est le seul mentionn dans le chapitre 3 qui permettrait de distinguer aisment les trois courbes. Dans le graphique de [ A ] v en fonction de [ A ] , par exemple, la droite pour l'isoenzyme avec la valeur de Km la plus grande pourrait seulement tre trace en utilisant une chelle telle que la droite pour l'iosenzyme avec la valeur de Km la plus petite serait confondue avec l'axe horizontal. 4.1 - Au moins 0,21 mM min1. 4.2 - Maintenir la concentration totale d'ATP 5 mM en excs par rapport la concentration totale de MgCl2. 4.3 - Les graphiques de SELWYN des deux dcours de raction ne sont mme pas approximativement superposs, la vitesse initiale de l'augmentation de [ P ]B ne correspondant qu' la moiti de celle pour [ P ]A , alors qu'une valeur double serait attendue la suite du doublement de la concentration d'enzyme. Les rsultats peuvent tre expliqus par la polymrisation de l'enzyme en considrant que la forme la plus associe est la moins active. 5.1 - Si Ki = ( k 1 + k 2 ) k1 et si cette expression est trs diffrente de la constante d'quilibre k 1 k1 , comme l'affirment CHILDS et BARDSLEY (1975), alors k1 doit tre petit par rapport k2. Ainsi k1 est environ 5.103/104 = 50 M1s1. Ceci rendrait k1 infrieur d'un facteur 104 aux valeurs typiquement mesures pour les constantes de fixation observes avec de nombreux enzymes : ceci n'est pas impossible mais est trs improbable et donc cela suggre que l'analyse original de KITZ et WILSON (1962) tait valable. Pour une discussion plus dtaille, voir CORNISH-BOWDEN (1979). 5.2 - 4 mM. 5.3 - Kic = 4,9 mM, Kiu >> 5 mM. Les donnes ne permettent pas une distinction dfinitive entre l'inhibition comptitive pure et l'inhibition mixte parce que la concentration la plus leve est infrieure K m et donc trop petite pour fournir une information probante au sujet de Kiu. En plus, la gamme de concentrations d'inhibiteur n'est pas suffisamment tendue pour permettre une dtermination prcise des constantes d'inhibition.
421
5.4 - a - 1. b - 24/6 = 4. 5.5 - a - Le graphique en double inverse. b - L'ordonne. c - Comme une intersection ngative sur l'axe des abscisses. 5.6 - A-C (parce qu'il donne la valeur la plus leve de V/Km). 5.7 - a - L-Ala-L-Ala-L-Ala (parce qu'il donne la valeur la plus leve de k0 /Km). b - Oui (comparer avec le tableau 5.2). c - Des expriences permettant de tracer un graphique de comptition.
[ I ] [ I ] 5.8 - Si [ A ] < Km , alors Km 1+ est plus grand que [ A ] 1+ quel Kic Kiu
que soit le rapport entre la concentration d'inhibiteur et la constante d'inhibition. Dsormais, dans ces conditions un inhibiteur comptitif augmente la valeur du dnominateur de l'quation de vitesse plus qu'un inhibiteur anticomptitif la mme concentration, c'est--dire qu'il diminue la vitesse d'un facteur plus important. L'inverse s'applique quand [ A ] > Km . Un inhibiteur comptitif exerce ces effets en se fixant sur la forme de l'enzyme qui est prdominante aux faibles concentrations de substrat, alors qu'un inhibiteur anti-comptitif le fait en se fixant la forme qui est prdominante des concentrations leves de substrat. 5.9 - La logique de l'analyse est essentiellement la mme que celle du graphique de DIXON ( 5.3), mais le rsultat est oppos, c'est--dire que les droites se coupent o [ I ] = Kiu et non o [ I ] = Kic . Les rsultats pour l'hexokinase D implique que la N-actylglucosamine et la glucosamine se fixe au mme site et que seulement une seule molcule la fois peut tre fixe, de sorte que la valeur K'j est infinie. Par contre, la valeur de K'j pour la protine rgulatrice est la mme ou est similaire la constante d'inhibition, K'j , impliquant qu'elle se fixe sur un site diffrent de celui sur lequel se fixe la N-glucosamine et qu'aucun inhibiteur n'affecte la fixation de l'autre. 5.10 - a - 17 possibilits pour chaque position donnent 178 7.109 squences. b - 1 mg = 103/1600 = 6.107 moles quelque soit la squence. Donc chacune des 7.109 espces est reprsente en moyenne par 8,5.1017 mol. En multipliant par la constante d'AVAGADRO, 6.1023, donne une moyenne de 5.107 molcules pour chacune, bien qu'une distribution ingale entre les 17 possibilits pour chaque position puisse toujours se traduire par quelques squences mal reprsentes (ou pas reprsentes du tout) dans l'chantillon.
422
c - (8,5.1017 mol)/(300.106 l) = 2,8.1013 M. La valeur extrmement faible de cette concentration vis--vis d'une valeur typique de Km est sans signification puisque la spcificit n'est pas dtermine par Km ; puisque l'exprience implique que les enzymes doivent choisir parmi une large gamme de substrats, tous disponibles simultanment, elle fournit un excellent test pour la spcificit. 6.1 - Les ractions bimolculaire de substitution simple (appeles ractions SN2 dans les livres de chimie organique) procdent communment avec une inversion de configuration de l'atome substitu. La rtention, comme dans le cas de l'-amylase, peut rsulter de deux substitutions successives, comme dans un mcanisme enzyme modifi ou dans un mcanisme de double dplacement. Une inversion nette, comme dans le cas de la b-amylase, suggre un nombre impair d'inversions, comme dans un mcanisme complexe ternaire ou de simple dplacement (Noter, cependant, que les donnes stchiomtriques n'excluent pas un mcanisme triple dplacement, comme nous en avons discut dans le 6.2.3.) 6.2 - Le mcanisme, comme il est dcrit, ne contient aucune tape de premier ordre, donc la vitesse nette peut en principe tre augmente sans limite en augmentant les concentrations de substrat. (Dans la majorit des mcanismes, il existe au moins une tape de premier ordre et la saturation est atteinte parce que le flux travers une telle tape ne peut tre augment indfiniment en augmentant les concentrations de substrat.) 6.3 - v =
V [ A ][ B ] (aucun terme en [ B ] ) ; le graphique de K A KB + K A [ A ] + [ A ][ B ] [ B ] v en fonction de [ B ] donnerait des droites parallles dont la pente est gale 1 V .
6.4 - a - Hyperbolique. b - Droites parallles avec une pente gale 1 V . Cette approche a t peu utilise, mais elle fournit une manire plus rapide et plus simple de distinguer entre les mcanismes complexe ternaire et les mcanismes enzyme modifi que les mthodes mieux connues. Pour une application la kinase des nuclotides diphosphates, voir GARCS et CLELAND (1969) 6.5 - Inhibition comptitive pour toutes les paires substrat-produit. 6.6 - Anti-comptitive vis--vis de A ; comptitive vis--vis de B. 6.7 - f 0 =
[ E ]0 [ E ]0 KmA [ E ]0 KmB [ E ]0 KiA KmB ; f 1= ; f 2= ; f 12 = . v V V V f f ( f 1 0 12 ) f2 f 12 [ S1 ] = , . Les droites se croisent en [ S1 ] = v [ E ]0 f2
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6.8 - a bcd7.1 -
Il n'y a aucun terme en [ B ] . Aucun. [ Q ]. R.
La capacit de catalyser une demi-raction est une caractristique d'un enzyme qui suit un mcanisme enzyme modifi. Dans ce cas, l'enzyme modifi serait vraisemblablement un glycolsylenzyme. L'inhibition comptitive de lchange par le glucose indique lexistence dun complexe distinct non-covalent enzyme-glucose : si celui-ci correspondait au complexe glycosylenzyme lenzyme serait un bon catalyseur de lhydrolyse du glucose 1-phosphate.
7.2 - L'utilisation des effets isotopiques cintiques ncessite de faire l'hypothse que la substitution isotopique n'affecte pas les constantes de vitesse pour l'tape chimique, mais galement qu'elle n'a aucun autre effet. La substitution chimique satisferait la premire mais pas la seconde ncessit. 8.1 - a - pH = pKEA. b - pH = pKE. 8.2 - Une expression telle que log Km reprsente rellement un raccourci pour 0 0 log( Km Km ) , o Km (trs probablement = 1 mM) reprsente un tat standard et log V et log( V Km ) doivent tre interprts de la mme manire. Les dfinitions des tats standards impliqus (c'est--dire le choix des units de mesure) affectent la hauteur des courbes par rapport l'axe des abscisses, mais elles n'ont aucun effet sur leurs formes et en particulier elles n'ont aucun effet sur les valeurs de pH auxquelles il y a des variations de pente. Donc, les tats standards peuvent rester indfinis sans que cela n'affecte les valeurs de pKa. 8.3 - pK1 = 5,99 ; pK2 = 7,21. Si la valeur de 6,10 fait rfrence au pK11, alors, pK12 = 6,64, pK22 = 7,10, pK21 = 6,56 ; si elle fait rfrence pK22, alors, pK11 = 7,10, pK12 = 6,03, pK21 = 7,17. Dans les deux cas, pK1 + pK2 = pK11 + pK22 = pK21 + pK12. 8.4 - Il faut premirement noter que les constantes de vitesse pour la fixation et la libration du substrat et du produit peuvent seulement tre indpendantes de l'tat de protonation si H2E, H2EA et H2EP ont la mme paire de constantes de dissociation, K1 et K 2 . Il n'est donc pas ncessaire de dfinir f ([ H + ]) sparment pour H2E, H2EA et H2EP. Alors, Km =
k 2 ( k3 k 1 ) f ([ H + ]) k 1 . Cette quation peut tre ind+ k1 ( k 2 + k 2 ) f ([ H + ]) + k3 k1
pendante du pH si k2 est trs petit ou si k3 = k1. Dans chacun des cas, elle se simplifie en Km = k 1 k1 .
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8.5 - Non : un graphique d'ARRHENIUS avec ces donnes montre une courbure prononce, caractristique des effets combins de deux ou de plusieurs constantes de vitesse plutt qu'une droite qui est attendue pour la dpendance la temprature d'une constante de vitesse lmentaire. 9.1 - La pente = [ H + ] 1. Ce graphique exprime la cooprativit de manire plus directe que le graphique de HILL parce que sa pente a toujours le mme signe que celui de la cooprativit. 9.2 - v =
V1 [ A ] V2 [ A ] + . Km 1 + [ A ] Km 2 + [ A ]
Km 1V1 Km 2V2 dv = + . 2 d[ A] ( Km 1 + [ A ]) ( Km 2 + [ A ]) 2 2 Km 1V1 2 Km 2V2 d 2v = . 2 3 ( Km 1 + [ A ]) ( Km 2 + [ A ])3 d[ A]

Puisque les paramtres cintiques et la concentration de substrat doivent obligatoirement tre des grandeurs positives, cette expression peut uniquement tre de signe ngatif. Un graphique de v en fonction de [ A ] ne peut donc pas tre une sigmode. 9.3 - [ H + ] = 1 +
[ A] [ A] . La valeur extrme de K 2 + [ A ] K1 + [ A ]
2 1+ K2 K1
est
obtenue quand [ A ] =
K1 K 2 .
9.4 - K1= K4. Pour dmontrer cette galit, il faut driver une expression pour Y ( 1 Y ) partir de l'quation [9.14] et alors trouver la condition pour l'identit des deux expressions quand [ A ] est ngligeable et quand [ A ] est trs grand. 9.5 - A faibles concentrations, il y a de nombreux sites de fixation disponibles pour le substrat et l'inhibiteur, et la comptition entre les deux est minimale ; ainsi l'effet prdominant de l'inhibiteur est de promouvoir le changement de conformation qui favorise la fixation du substrat, et donc il apparat comme un activateur. A concentrations leves, la comptition ordinaire prdomine et entrane l'inhibition attendue. 10.1 -
[H+] demi-saturation, [ H + ] trs faible valeur de [ A ] et 0 des 2 valeurs leves de [ A ] .
J J 10.2 - C1J = 0 ,5 , C 2 = 0 , 333 , C3 = 0 ,167 ( partir des quations [10.30]-[10.32]).
10.3 - C J = j
( 0 ,15 )( 0 , 25 ) = 0 ,1875 ( partir de l'quation [10.38]). 2
425
10.5 - Une mthode base sur la surexpression d'enzymes limitant la vitesse peut uniquement fonctionner si les enzymes limitant la vitesse existent et continuent limiter la vitesse quand leurs activits augmentent. L'analyse du contrle mtabolique suggre non seulement que les enzymes limitant la vitesse n'existent pas mais aussi que les coefficients de contrle du flux d'un enzyme tendent diminuer quand l'activit dans le systme est augmente. Donc, la stratgie propose ne peut pas fonctionner. Pour une discussion plus approfondie de ce point, voir CORNISH-BOWDEN (1995c) et pour une application voir NIEDERBERGER (1992). 11.1 - Le mcanisme le plus simple en accord avec les rsultats est un mcanisme de MICHAELIS-MENTEN irrversible, c'est--dire un mcanisme dans lequel k2 = 0. Dans ce cas, les quations [11.27]-[11.28] sont simplifies et fournissent : k1 2.106 M1 s1, k2 60 s1, k1 130 s1. 11.2 - Les donnes ont t calcules partir de y = 16 , 37 + 46 , 3 e 3.72 + 29 ,7 e11,41 , mais les valeurs suivantes sont typiques de celles qui pourraient tre obtenues en utilisant la mthode d'pluchage dcrite dans le 11.4.2 : A = 17, B = 42,5, C = 33,4, 1 = 3,4 ms, 2 = 10,3 ms. 11.3 - Il faut noter que les concentrations finales aprs mlange taient les mmes dans les deux expriences, et la concentration de substrat tait suffisamment leve pour entrer en comptition effective avec l'inhibiteur. Les diffrentes constantes de temps indiquent que le processus le plus lent ( = 15 ms) correspond approximativement la libration de l'inhibteur partir du complexe enzyme-inhibiteur, c'est--dire que 1 koff 15 ms, koff 67 s1. Ds lors, kon = 3,3 106 M1s1. L'observation selon laquelle la libration de l'inhibiteur est l'tape qui limite la vitesse dans l'exprience (b) n'a aucun effet sur l'interprtation de Ki comme constante d'quilibre. Ceci dcoule du fait qu'il fait rfrence une raction en cul-de-sac (voir 6.3.6.3). 12.1 - Les moindres carrs : K = 1,925 mM, V = 0,666 mM min1. Distribution libre : Km* = 1,718 mM, V* = 0,636 mM min1. La tendance des rsidus suggre que l'enzyme est sujet une inhibition par le substrat, de sorte qu'il serait incorrect de tirer des conclusions au sujet des poids statistiques appropris tant que les donnes n'ont pas t ajustes sur une quation plus adquate que l'quation de MICHAELIS-MENTEN. Il serait galement souhaitable de disposer de bien plus que 10 observations.
m
t t
12.2 - Km = 2,747 mM, V = 0,737 mM min1 ; Km* = 1,718 mM, V* = 0,638 mM min1 (si vous obtenez Km* = 1,677 mM, V* = 0,632 mM min1, vous devriez consulter la discussion dans le 12.3.5). Les rsultats, quand ils sont compars avec ceux du problme 12.1, illustrent le point gnral selon lequel les estimations par la mthode des moindres
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carrs sont beaucoup plus sensibles que les estimations par la mthode des distributions libres pour la prsence des mauvaises observations exceptionnelles.
v3 v3 v2 v3 vi3 i 2 i i i vi2 [ Ai ] [ Ai ] [ Ai ] [ Ai ] 12.3 - Km = ,V= . 3 2 3 3 vi vi vi vi3 vi2 vi 2 2 vi vi [ Ai ] [ Ai ] [ Ai ] [ Ai ] [ Ai ] 2 [ Ai ] 2
vi3
Dans le numrateur de l'expression pour Km , les deux termes ont les dimensions de v 5 [ A ] , alors que dans le dnominateur ils ont les dimensions de v 5 [ A ] 2 , de sorte que l'expression dans son ensemble a les dimensions de [ A ] , ce qui est correct. L'analyse de l'expression de V est similaire.
12.4 - Non, cela implique l'oppos. Il faut noter que les poids statistiques v 3 pour 1 v correspondent approximativement aux poids statistiques de 1 v pour v, c'est--dire qu'ils supposent une variance de v pour v ou une dviation standard de v1/2 : loin d'tre approximativement constante pour les petites valeurs et fortement croissante pour les grandes, elle augmente rapidement partir de l'origine et stagne lorsque v augmente.
RFRENCES
Les paragraphes ou les problmes dans lesquels les publications sont cites en rfrences sont indiqus entre crochets aprs chaque rfrence.
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INDEX
A
actate kinase 186 actylcholinestrase 140 acide 5-inosinique 175 acide 259 dfinition de BRNSTED 259 acide-base proprits des protines 265 action de masses loi 11,57 rapport 35,333 activateur allostrique voir effet htrotrope activation 159,163 hyperbolique 163 mcanisme gnral de modification 163 mixte (mcanisme) 162 spcifique 143,160 zymognes 160 activit enzymatique 119 mesure 119 mthodes continues et discontinues de mesure 119 spcifique 81 units (katal) 81 ADAIR (quation) 303-309 ADAIR-KOSHLAND (modle) 323 addition (relations) 342 adnylate kinase 359-362 AINSLIE 325 ajustement induit 67,182,309 ajustement paramtrique 22,119,396 linaire 119 non linaire 22,119 ALBERTY 205 ALBERY 248,254 alcool dshydrognase 186,389 ALTMAN voir KING-ALTMAN aminoacyl-ARNt synthtase 230 aminotripeptidase 176 AMP 359-362 amylase 233 analyse aux dimensions 16 arginase 144 arginine (proprits acide-base) 265 ARMSTRONG 66 ARRHENIUS 46-47,260 quation 46 graphique 47,284 asparagine synthtase 242 aspartate (proprits acide-base) 265 aspartate transaminase 183,243,388 asymptotes des hyperboles rectangulaires83 ATASSI 116 ATKINSON 103,339 ATP 135 autoprotolyse 260 AVOGADRO 31
B
-galactosidase BARDSLEY BARKER BARTH base (dfinition de BRNSTED) BENDER BERZELIUS BLANGY bloc de demande de fourniture 253 131 183 60 214,259 285,373 59 318 353 353
444 BODENSTEIN 42,73 BOEKER (graphique) 113-114 BOLTZMANN 31,47 BOYER 205,239 BRANDT 152 BRIDGMAN 285 BRIGGS 45,73 BRIGGS et HALDANE (quation de vitesse) 45,73,79 BRITTON 243,249 BRODE 111 BRNSTED 259 BROWN 60-64 BUC 318,326 BUCHNER 56 BUNTING 147 BURK voir LINEWEAVER-BURK BURNS 329-355,367 burst (cintique avec) 370,389
CINTIQUE ENZYMATIQUE coefficient de contrle 340 de contrle de flux 344 de rponse 342,350 de sensibilit 341 de variation 396 collision lmentaire (thorie) 47 compartimentation 294 comptition avec un substrat 154 complexe activ 49 en cul-de-sac 142,201 enzyme-substrat 60 conditionnement (mauvais) 369 connectivit (proprits) 344 constante catalytique (dfinition) 75,210 dacidit 261 de dissociation 261 de dissociation molculaire 269-270 dinhibition (spcifique) 142 de MICHAELIS (dfinition) 75,210 de PLANCK 50 de spcificit (dfinition) 77,211 de temps (dfinition) 365 de vitesse (dfinition) 11 intrinsque 305 contrle mtabolique 294 dfinition de KACSER et BURNS 352 analyse 330 contrle boucle de rtroactif 348 coefficients 340 de flux 344 force du 341 cooprativit 294-328,357 cintique 325 coefficient de HILL 299-301 dfinition 297 dfinitions mcaniques et oprationnelles 307 index de TAKETA et POGELL 301,306 modles 311 coordonnes de raction 46 CORNISH-BOWDEN 89-91,120,125,149, 308,352,400-403
C
canalisation (de mtabolites) 355 capacit de chaleur 28 cascade denzymes 355-357 catalyseur 59 CAVENDISH 260 CECH 56 CHA (mthode) 197-199,292 chaleur (dfinition) 28 CHANCE 376 CHANGEUX 298,311-318 channeling voir canalisation CHENG 152 chymotrypsine 166,168,183,370 effet de la pression 287 effet de la temprature 285 citrate synthtase 355 classification chimique et cintique 184 classification des mcanismes plusieurs substrats 180 CLAUSIUS 30 cl-serrure (modle) 60 CLELAND 184,187-189,205,225,400 nomenclature 184
INDEX courbe en cloche 271 cratine kinase 224 cul-de-sac (tapes en) 142,201-202 CULLEN 72,366 cycle catalytique dfinition 75 unique 387 cycle futile 293 cystine (proprits acide-base) 265
445
E
EADIE et HOFSTEE (graphique) 45-46,87 EASTERBY 126 eau (produit de dissociation) 261 changes disotopes 237-250 lquilibre 241-242 hors quilibre 243-260 comparaison avec les effets isotopiques 237-238 principes 238-240 mcanisme enzyme substitu 242-243 effet de la pression 285 effet de la temprature 281 effet du pH 257 effet htrotrope 317 effecteur ngatif 317 effecteur positif 317 effet homotrope 317 effet isotopique 237-238, 251-256 cintique 251-256 du solvant 289 hexokinase D 291 primaire 251-253, 254-256 secondaire 253 lequilibre 253-254 effet tampon 263 comparaison avec les changes isotopiques 237-238 EIGEN (relaxation) ,380 EISENTHAL 89-91,149,402-403 lasticit 332-340 coefficient 334 dfinition 332 relations 344 lectrostriction 287 nergie dactivation 46-47 nergie de GIBBS critre de spontanit 33 dactivation 46,283 dfinition 32 profil 25,104 relation avec l'quilibre 35 relation avec les constantes de vitesse 40 nergie libre voir nergie de GIBBS
D
DALZIEL 205 coefficient 234-235 DAVIDSOHN 128-129 dcours de raction 22,108-115,120-123 dfinition oprationnelle 143 dgnrescence 31 dlai 372 demi-inhibition (concentration) 151 dnaturation thermique 281 drivation des quations de vitesse 189-204 assiste par ordinateur 202-204 dshydrognases dpendant du NAD 182,186 deutron 289 dviation standard 396,399-400 dialyse lquilibre 159 diastase 55 diisopropyl-fluoro-phosphate (DFP) 171 dissociation de leau 260 molculaire (constantes) 269-270 distribution libre (mthodes) 401 DIXON 150-151,272,277 graphique 151,153 profils de pH 278 double dplacement (raction ) 185 DOUDOROFF 183 DOWD 86 drain 330 DUCLAUX 60 DUGGLEBY 115,297
446 enthalpie dfinition 29 dactivation 52, 252 de raction 282-283 entropie 30 critre de spontanit 30 dfinition 30 dfinition statistique 31 dactivation 52 de raction 282-283 environnement 26 enzyme dcouverte 55 nomenclature 157-158179 allostrique 298 mmoire 173, 274-275 unidirectionnel 53-55,104 pluchage 387 quation de vitesse 10,63 rgles pour lcriture 68 drivation 189 quilibre 37 dfinition 38 dionisation 135,259 "dynamique" 42 relation avec l'nergie de GIBBS 34 relation avec les constantes de vitesse 40 erreur alatoire 133 exprimentale 84-91,393-396 pure 133 dtection des algbriques 16-18 tape limitante (dfinition) 14,366-367 tat de transition 46 thorie de l' 49 tat standard 34 tat stationnaire 37,41,72 approximation 41 BODENSTEIN 42 BRIGGS et HALDANE 73 principe 73 validit et limites 79 VAN SLYKE et CULLEN 72 limitations 365-366 EVANS 49 EYRING quation thorie
CINTIQUE ENZYMATIQUE 49-54 284 voir tat de transition
F
FARADAY 34 FASELLA 388 FERDINAND 325-326 fermentation 55 ferment 55 FERSHT 291,379-380 FILMER (modle squentiel) 318-324 FISCHER 56,60,67,310 fixation non-productive de substrat 166-169 analyse des expriences 91-96 et voir SCATCHARD flux chimique 243 force de contrle 341 fraction de saturation 304,313 FRIEDEN 231 fructose biphosphatase 293 fumarase 38-39,115,155,288
G
158,199 25,32-41 et voir nergie de GIBBS GIBSON 376 gluconogense 293-294 glucosamine 177 glucose 6-phosphate 153 glucose 6-phosphate dshydrognase 123-126,137,229 glutamate (proprits acide-base) 265 glutamate dshydrognase 325 glutamine synthtase 358 glutamyl-ARN synthtase 128 glycraldhyde 3-phosphate dshydrognase 325 glycolyse 293-294 glyphosate 340 GOLDBETER 359 galactokinase GIBBS
INDEX GOLDSTEIN 194 GOSSET (STUDENT) 410 graphique dARRHENIUS 46-48 de DIXON 148-151 dEADIE-HOFSTEE 87-88 de GUGGENHEIM 20-21 de HANES 86-87 de HILL 299-301,307-309 de KZDY-SWINBOURNE 21 de KLOTZ 94 de LINEWEAVER-BURK 84-86 de SCATCHARD 91-96,316 de TSOU 173 de WOOLF 88 de comptition 157 dinhibition 148-151 des rsidus 411-416 quation de MICHAELIS-MENTEN 82-91 en double inverse voir LINEWEAVER-BURK linaire direct 89-91,148-149,400-407 raction deux substrats 213-216 primaire 213-214 secondaire 214-216 GROSS-BUTLER (quation) 290 GUGGENHEIM 20-21 graphique 21 GULDBERG 11,57 GUNTER 285 GUTFREUND 355,371
447 hmoglobine 299,309 HENDERSON-HASSELBALCH (quation) 262 HENRI 59-70,108,110,115 quation de vitesse 67-71,76 travaux 59-64 hexokinase 123,125,158,180,229,246,310 A 137 D 153,160,177,186,325 HIGGINS 351 HILL 131,155,299-309 coefficient 299,357-359 quation 299 graphique 300 histidine (proprits acide-base) 265 HITCHCOCK 73 HOFMEYR 352 HOLLAWAY 380 homostasie 355 HOFSTEE voir EADIE et HOFSTEE HUDSON 129 hydron (dfinition) 289 hyperboles rectangulaires 82-84
I
[I]0.5 151-153 inactivation d'un enzyme dtection 127 mcanisme voir KITZ-WILSON protection par le substrat 158 incertitude exprimentales 393 multiplicative 396 standard 409 INGLES 168 inhibiteur 139 inhibiteur allostrique voir effet htrotrope inhibition anti-comptitive 141,146 catalytique voir anti-comptitive comptitive 107,141 complte voir linaire concentration de demi 151-153 constante 140-148 hyperbolique 141,163
H
HALDANE relation HAMMES HANES formalisme graphique HARCOURT HARTLEY HARTRIDGE HASSID HEINRICH 45,53,73,100-102,129,181 100,105,333 381,388,391 86-89 voir WONG et HANES 86-87 46 370,389 375-376 183 329-355
448 linaire 140-148 mcanisme gnral de modification 163 mixte 144 non-comptitive 143 par le produit 107-109,221-223 par le substrat 154-159, 169-171,217-220 partielle voir hyperbolique rversible et irrversible 139 spcifique voir comptitive uncompetitive 146 et voir anti-comptitive interaction allostrique 298 cooprative 293 inventaire de protons 291 invertase 55,57,59,62,107,128,144 ion hydrogne (concentration) 257-259, voir aussi pH ion hydronium 260 ionisation du substrat 280 isoenzyme 82-85,295 ISOGAI 327 isomrase 247-249 isotopes 237 change 238-250 effets 251-256 IUB 147 IUBMB 8,143,179,205,334 IUPAC 143,244,289
CINTIQUE ENZYMATIQUE mthode des moindres carrs 396-400 dpendance au pH 274-276 kcat /Km voir aussi V/Km = constante de spcificit 76-77 caractre fondamental 76-77 raction deux substrats 205,212-213 mthode des moindres carrs 396-400 dpendance au pH 274-276 Km 76-79 apparent 132 constante de dissociation 73-78 ractions deux susbtrats 205,212-213 dpendance au pH 277-279 mthode des moindres carrs 396-400 distribution libre 400-403 prcision 407-410 KACHMAR 205 KACSER et BURNS 329-355,367 katal 81 katsuobushi 175 KENDREW 56 KZDY 285 KZDY-SWINBOURNE (graphique) 21 KILBY 370,389 kinase 160,177,186,295 KING et ALTMAN principe 189-193 description 189-193 drivation des quations 184-204 tapes lquilibre 197-199 tapes en cul-de-sac 201-202 inspection visuelle 199-200 modifications 194-197 programme dordinateur 202-204 voies alternatives 200 KITZ-WILSON (mcanisme d'inactivation) 139-140,158-159,174 KLOTZ (graphique) 94 KNF (modle) 318-324 KNOOP 239 KNOWLES 168,248,254,280 KOSHLAND 67,182,308,359 ajustement induit 67,182,309-311 modle squentiel 318-324 ractions double dplacement 184 KREBS 360 KUHNE 55
J
JACOB JAKES JENCKS JENNINGS JOHANSEN 298,311 379 105-106 111 399
K
kA 76-79, voir aussi kcat /Km kcat k0 75-76, voir aussi V raction deux substrats 205,212-213
INDEX
449 quenched-flow 377-379 stopped-flow 376 mmoire (d'un enzyme) 326-327 MENTEN 70-71,258 mtabolites internes et externes 330 mthionine adnosyltransfrase 105 MEUNIER 325-326 MICHAELIS 70-71,108,128-129, 144,257-258,267-271 constante 75,210 fonctions pH 267-271 vitesse initiale 70-71 modle daction des enzymes 70-71 dpendance au pH 257-259,267-277 v en fonction de log [A] 82-85 MICHAELIS et MENTEN 70-71,75-81,108 quation 70-81 quation intgre 119 raction rversible 96-98 inhibition par le produit 108-110 paramtres apparents 212 MILLIKAN 376 MILNES 376 mise au point des expriences dinhibition 164-166 concentration de MgATP2 135-137 choix du pH 131-132 rplication dobservations 132-135 graphique des rsidus 411-416 concentration de substrat 129-131 raction deux substrats 223-224 mnmonique (cooprativit) 326-327 modle allostrique 311-327 association-dissociation 324 mnmonique 326-327 squentiel voir KNF symtrique 311-318 modification chimique 171-174 moindres carrs (mthode des) 396 molcularit 11-12 MONOD 298,311-318 monophosphatase du myo-inositol 147 mutagense dirige 171 mutase 250 MWC (modle) voir modle symtrique
L
laccase 234 lactate dshydrognase 126,228 LAIDLER 81,147 LANGMUIR 72 LAUX 152 LE CHATELIER (principe) 286 Li+ 147 LIEBIG 55 LINDBLADH 355 LINEWEAVER-BURK (graphique) 73,84-86,226 lipase 55 lois de la thermodynamique 28-30 deuxime loi 30 premire loi (conservation de l'nergie) 28 LUMRY 399 lysine (proprits acide-base) 265 lysozyme 166
M
malate dshydrognase 355 MANSHOURI 116 MCKAY 239 mcanisme complexe ternaire 180,213 complexe ternaire alatoire 181,206 complexe ternaire ordonn182,205,218 enzyme modifi 183,208 ordre prfrentiel 326 plusieurs substrats (classification) 180 d'activation spcifique 161 de raction dfinition 11 de rgulation 294 gnral de modification 163 ping pong (voir enzyme modifi) 184 squentiel (voir complexe ternaire) 184 meilleur ajustement 397 mlange rapide 375 flux continu 375
450
CINTIQUE ENZYMATIQUE phase transitoire 365 phosphatase 295 phosphatase alcaline 258 phosphate de pyridoxal 183,388 phosphocratine 224 phosphofructokinase 246,293,298,326 phosphoglucomutase 179 phosphoribosyl-ATP-pyrophosphorylase311 phosphoribulokinase 413 phosphorylase 160 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransfrase 340 photolyse clair 374 pKa 262 pKa cintique 281 PLANCK 50 POGELL voir TAKETA et POGELL POLYANI 49 polylectrolyte 266 pondration 403 potentiel chimique dfinition 33 relation avec les constantes de vitesse 40 potentiel lectrique 34 potentiel lectrochimique 34 micro-rversibilit (principe) 41 pression hydrostatique 285-288 quilibre et vitesse 285-286 interaction covalente 287 raction enzymatique 287-288 processus irrversible 27 rversible 27 produit (dfinition) 8 profil central 190 ractionnel 45 proline racmase 250 protection par le substrat 158 proton activit 260 inventaire 291 PRUSOFF 152 pyruvate dcarboxylase 180 pyruvate kinase 126,228
N
N-actylglucosamine 177 NADox 119,228 NADred 119,228 NEET 325 ngentropie 32 NMETHY (modle squentiel) 318 NIEMANN 111 nitrognase 378 non-productive voir fixation NORTHROP 254
O
OSULLIVAN optimum de temprature ordre cintique global partiel pseudo-premier ordre OSTWALD oxydase des acides amins D oxydation des acides gras 59-64,129 283 11,15,334 11-15 11-15 14 59 285 239
P
PASTEUR 55 PAULING 53,309 PAULING-KOSHLAND (modle) 323 PAYEN 55 PECHSTEIN 108 PELZER 49 pepsine 55,149,160,166,172,258 PERRIN 136 PERSOZ 55 perturbation 380 "perturb" (groupe) 266-267 PETTERSSON 388 pH choix 131 dfinition 257 chelle 260 optimum 132 pH-stat 120
INDEX
451 SCATCHARD (graphique) 91-96,316 SCHIMMEL 391 SCHONBAUM 373 SCHNHEYDER 113 SCHWANN 55 SEGAL 64,205 SELWYN (test d'inactivation) 127 sensibilit (coefficient de) 341 SHATALIN 356 SHILL 325 site actif dfinition 66 titrage 372 site allostrique 298 solution idale 34 solvatation dun ion 287 somme des carrs des dviations 397 SRENSEN 63,257 source 330 SPALLANZANI 55 Spcificit 154 SPECTOR 186-187 statistique classique 400 distribution libre 400 stchiomtrique (coefficient) 9,10 STORER 125 STUDENT 410 substrat (dfinition) 8 subtilisine 111 succinate dshydrognase 141 SUMNER 56 SWINBOURNE 21 systme biochimique (thorie) 334 coupl 120,123,228 K 318 systme thermodynamique 26 ferm 26 isol 26,30 ouvert 26 cyclique 30 quilibre 27 non-quilibre non-stationnaire 27 non-quilibre stationnaire 27 hors dquilibre 382
R
RABIN 325-326 radiolyse pulse 374 RAPOPORT 329-355 RAY 367 raction 11 bimolculaire 11 conventions d'criture 7 dtermination de l'ordre 15 lmentaire 11 molcularit 11 ordre 11 rversible 19 trimolculaire 11 unimolculaire 11 RAUMUR 55-57 REDER 343 REGENFUSS 376 rgulation du mtabolisme 355-362 relaxation mthodes 380 temps de 365 rplication des mesures 132 rponse coefficient 342,350 partage 351 rsidus (graphique) 411-416 rsonance magntique nuclaire 375 rversibilit microscopique 41,199 ribonuclase 166 RICARD 303,326-327 RIGGS 86 RONA 108 ROSENTHAL (mthode) 96 ROUGHTON 375-376 Roundup 340 ROUSSEAU 376
S
saccharose glucosyltransfrase SAURO saut de temprature (mthode) SAVAGEAU SAYCE 183,256 352 380 334 136
452
T
TAKETA et POGELL (index) 301-306 TAMMANN 59 tampon 263 pouvoir molaire 264 temprature choix 131-132 effet sur les ractions catalyses par des enzymes 281-285 effet sur les constantes de vitesse 45-53 optimum 281-285 mthode de saut 380-382 temps mort 377 temps spcifique voir constante de spcificit thronyl-ARNt synthtase 231 THUSIUS 384 TOMPSON 59-64,129 topologique (raisonnement) 200 traceur (perturbation) 249-250 transaminase 183,186,211 transformation linaire EADIE et HOFSTEE 87 graphique linaire direct 89 HANES 86 LINEWEAVER et BURK 84 transitoire (phase) 365 proche de lquilibre 389-391 hors-quilibre 382-389 triose-phosphate isomrase 250,254 trypsine 55 tryptophane synthtase 355 TSOU 171-174 graphique 173 TUFTE 416 tyrosine (proprits acide-base) 265 tyrosine kinase 177
V
voir aussi pKcat dfinition 75-76 mthode distribution libre 400-403 mthode des moindres carrs 396-400 effets du pH 274-276 ractions deux substrats 205,212-213 V/Km voir aussi kca t /Km dfinition 75-76 mthode distribution libre 400-403 mthode des moindres carrs 396-400 effets du pH 274-276 ractions deux substrats 205,212-213 VAN SLYKE 72,366 tampon 264 VAN SLYKE et CULLEN (quation) 72,366 VANT HOFF 36,46-47,57,282 variable d'tat 27 variance exprimentale 409 variation (coefficient de) 396 vitesse dfinition 10 nette (dfinition) 37 limite (dfinition) 75 absolue (thorie) 49 dinactivation 139 maximale Vmax voir vitesse limite vitesse initiale dfinition 37 estimation 120 en absence de produit 210 mesures prcises 110 VOLKENSTEIN 194 volume d'activation 285-288 V
W
WAAGE WAIGHT WATARI WESTLEY WHITE WHITEHEAD WIGNER 11,57 131 327 212 380 307,326 49
U
ultra-sensibilit d'ordre zro unit denzyme urase 359 82 175
INDEX WILKINSON 400 WILSON 139-140,158-159,174 WONG et HANES formalisme 180,232 mthode de 193 WONG 81 raisonnement topologique 200 WOOLF 88,181 WURTZ 61 WYMAN 311-318
453
Y
YANOFSKY YATES 355 152
Z
ZERNER zymase zymogne 373 56 160
TABLE DES MATIRES

PRFACE .............................................................................................................................................5 1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE ....................................................................7
1.1. Introduction........................................................................................................................7 Les conventions d'criture des ractions chimiques....................................................................7 1.2. Les principes de base de la cintique chimique.............................................................10 1.2.1. Vitesse de raction et quation de vitesse.....................................................................10 1.2.2. Mcanisme de raction et ractions lmentaires ........................................................11 1.2.3. Ordre et molcularit d'une raction.............................................................................11 1.2.4. Dtermination de l'ordre d'une raction........................................................................15 1.2.5. Dimensions des constantes de vitesse...........................................................................16 1.2.6. Les ractions rversibles ...............................................................................................19 1.2.7. Dtermination des constantes de vitesse du premier ordre..........................................20 Problmes ...................................................................................................................................23
2 LA THERMODYNAMIQUE ET LA
2.1.
THORIE DES VITESSES .....................................................25
La thermodynamique et ses limites...............................................................................25
2.2. Concepts gnraux de la thermodynamique..................................................................26 2.2.1. tats du systme ............................................................................................................26 2.2.2. Un processus est un vnement au cours duquel une proprit du systme change ..................................................................................27 2.3. Les lois de la thermodynamique .....................................................................................28 2.3.1. Loi de conservation de lnergie...................................................................................28 2.3.2. La dfinition de lentropie et du critre de spontanit................................................30 2.3.3. La dfinition statistique de lentropie ...........................................................................31 2.3.4. Lentropie dans les systmes vivants et les ractions couples ...................................32 2.3.5. Lnergie de GIBBS ........................................................................................................32 2.3.6. Le potentiel chimique : Lnergie de GIBBS dun solut dpend de sa concentration.......................................33 2.3.7. Relation entre la constante dquilibre et la variation dnergie de GIBBS .................34 2.4. Relations entre la thermodynamique et la cintique : les notions dquilibre et dtat stationnaire ...............................................................37 2.4.1. Distinction entre vitesse initiale et vitesse nette...........................................................37 2.4.2. Ltat dquilibre ...........................................................................................................38 2.4.3. Ltat stationnaire ..........................................................................................................41
456
2.5. Linfluence de la temprature sur les constantes de vitesse.....................................45 2.5.1. Le profil ractionnel ......................................................................................................45 2.5.2. Lquation dARRHENIUS ..............................................................................................46 2.5.3. Thorie de collision lmentaire...................................................................................47 2.5.4. Thorie de ltat de transition - Thorie de la vitesse absolue.....................................49 2.5.5. Les enzymes stabilisent ltat de transition de la raction ...........................................53 Problmes ...................................................................................................................................54
3 INTRODUCTION LA CINTIQUE ENZYMATIQUE RACTIONS UN SUBSTRAT ET UN PRODUIT......................................................................55

3.1. Historique .........................................................................................................................55 3.1.1. La dcouverte des enzymes...........................................................................................55 3.1.2. Les premires tudes de la cintique enzymatique et le dveloppement du concept du complexe enzyme-substrat ..................................57 3.1.3. Les travaux de Victor HENRI.........................................................................................59 3.1.4. Les problmes rencontrs par HENRI ............................................................................63 3.1.5. La notion de site actif et le mcanisme daction des enzymes ....................................66 3.2. Description cintique des ractions enzymatiques dans des conditions dquilibre ......................................................................................67 3.2.1. La premire quation cintique : lquation de HENRI ................................................67 3.2.2. Le traitement de MICHAELIS et MENTEN ......................................................................70 3.3. Description cintique des ractions enzymatiques dans des conditions dtat stationnaire ......................................................................72 3.3.1. Les premires utilisations de la notion dtat stationnaire...........................................72 3.3.2. Le traitement de BRIGGS et HALDANE ..........................................................................73 3.3.3. Lquation de MICHAELIS et MENTEN ..........................................................................75 3.3.4. Analyse de la courbe dfinie par lquation de MICHAELIS et MENTEN .....................76 3.3.5. Autres formes de lquation de MICHAELIS et MENTEN ..............................................78 3.3.6. Lquilibre comme un cas particulier de ltat stationnaire.........................................79 3.3.7. Validit et limites de lhypothse de ltat stationnaire ...............................................79 3.4. Units de lactivit enzymatique.....................................................................................81 3.5. Mthodes danalyse des donnes cintiques................................................................82 3.5.1. Le graphique de v en fonction de [A] ...........................................................................82 3.5.2. Diffrentes mthodes de transformation linaire .........................................................84 3.6. Les ractions rversibles.................................................................................................96 3.6.1. Lquation de vitesse du mcanisme rversible simple ...............................................96 3.6.2. Lquation de vitesse du mcanisme en trois tapes : traitement lquilibre ...........98 3.6.3. La relation de HALDANE..............................................................................................100 3.6.4. Lquation de vitesse du mcanisme en trois tapes : cas ltat stationnaire.........102 3.6.5. Utilisation du profil dnergie de GIBBS.....................................................................104 3.6.6. Les enzymes unidirectionnels .....................................................................................104 3.7. Inhibition par le produit .................................................................................................107 3.8. Intgration des quations de vitesse pour les ractions enzymatiques ................108 3.8.1. quation de MICHAELIS et MENTEN sans inhibition par le produit ...........................108 3.8.2. Inhibition par le produit...............................................................................................109
TABLE DES MATIRES
457
3.8.3. Mesures prcises des vitesses initiales........................................................................110 3.8.4. Les dcours complets dans dautres cas .....................................................................114 Problmes .................................................................................................................................115
4 ASPECTS PRATIQUES DES TUDES CINTIQUES ................................................................119

4.1. Mesure de lactivit enzymatique .................................................................................119 4.1.1. Mthodes continues et discontinues de mesure..........................................................119 4.1.2. Estimation de la vitesse initiale...................................................................................120 4.1.3. Amlioration de la linarit dun dcours de raction ...............................................121 4.1.4. Les systmes coupls...................................................................................................123 4.2. Dtection de linactivation dun enzyme.......................................................................127 4.3. Choix des conditions exprimentales ...........................................................................129 4.3.1. Choix des concentrations de substrat..........................................................................129 4.3.2. Choix du pH, de la temprature et des autres conditions...........................................131 4.3.3. Rplication des mesures ..............................................................................................132 4.4. Traitement des quilibres ioniques ..............................................................................135 Problmes .................................................................................................................................137
5 INHIBITION ET ACTIVATION DES ENZYMES...........................................................................139

5.1. Inhibition rversible et irrversible ................................................................................139 5.1.1. Les poisons de la raction catalytique ........................................................................139 5.1.2. Analyse de la vitesse dinactivation............................................................................139 5.1.3. Types dinhibition rversible ......................................................................................140 5.2. Inhibitions linaires ........................................................................................................141 5.2.1. Inhibition comptitive (ou inhibition spcifique).......................................................141 5.2.2. Inhibition mixte ...........................................................................................................143 5.2.3. Linhibition anti-comptitive (inhibition catalytique) ..............................................146 5.2.4. Rsum des types dinhibition linaire.......................................................................147 5.3. Prsentations graphiques des rsultats des inhibitions.........................................148 5.4. Relation entre les constantes dinhibition et la concentration de demi-inhibition.........................................................................151 5.5. Inhibition par comptition avec un substrat...............................................................154 5.5.1. Spcificit de lenzyme ...............................................................................................154 5.5.2. Test du droulement simultan de deux ractions......................................................156 5.5.3. Protection par le substrat .............................................................................................158 5.6. Activation des enzymes.................................................................................................159 5.6.1. Diverses utilisations du terme activation................................................................159 5.6.2. Activation spcifique...................................................................................................160 5.6.3. Activation et inhibition hyperboliques .......................................................................163 5.7. Prparation des expriences dinhibition .....................................................................164 5.8. Effets inhibiteurs des substrats .................................................................................166 5.8.1. Fixation non-productive ..............................................................................................166 5.8.2. Inhibition par le substrat..............................................................................................169
458
5.9. La modification dun groupe de lenzyme comme un moyen didentifier les groupes essentiels.................................................171 Problmes .................................................................................................................................174
6 RACTIONS PLUSIEURS SUBSTRATS ...............................................................................179

6.1. Introduction....................................................................................................................179 6.2. Classification des mcanismes ....................................................................................180 6.2.1. Les mcanismes complexe ternaire..........................................................................180 6.2.2. Mcanismes enzyme modifi ...................................................................................183 6.2.3. Comparaison entre la classification chimique et la classification cintique ............184 6.2.4. Reprsentation schmatique des mcanismes ............................................................187 6.3. Drivation des quations de vitesse l'tat stationnaire.....................................189 6.3.1. Introduction..................................................................................................................189 6.3.2. La mthode de KING et ALTMAN ................................................................................189 6.3.3. La mthode de WONG et HANES .................................................................................193 6.3.4. Modifications de la mthode de KING et ALTMAN ....................................................194 6.3.5. Ractions renfermant des tapes l'quilibre.............................................................197 6.3.6. Analyse des mcanismes par inspection.....................................................................199 6.3.7. Drivation des quations de vitesse par ordinateur....................................................202 6.4. Les quations de vitesse...............................................................................................205 6.4.1. Mcanisme de type ordonn complexe ternaire ......................................................205 6.4.2. Mcanisme de type alatoire complexe ternaire......................................................206 6.4.3. Mcanisme enzyme modifi.....................................................................................208 6.4.4. Calcul des constantes de vitesse partir des paramtres cintiques..........................208 6.5. Les mesures de vitesse initiale en absence de produit.............................................210 6.5.1. Signification des paramtres .......................................................................................210 6.5.2. Paramtres apparents de MICHAELIS et MENTEN .......................................................212 6.5.3. Les graphiques primaires pour les mcanismes complexe ternaire........................213 6.5.4. Les graphiques secondaires.........................................................................................214 6.5.5. Graphiques pour les mcanismes enzyme modifi .................................................216 6.6. Inhibition par le substrat ..............................................................................................217 6.6.1. Pourquoi y a-t-il une inhibition par le substrat ? ........................................................217 6.6.2. Mcanisme de type ordonn complexe ternaire ......................................................218 6.6.3. Mcanisme de type alatoire complexe ternaire......................................................219 6.6.4. Mcanisme enzyme modifi.....................................................................................219 6.6.5. Valeur diagnostique de l'inhibition par le substrat .....................................................220 6.7. Inhibition par le produit .................................................................................................221 6.8. Prparation des expriences .........................................................................................223 6.9. Un exemple simple d'tude d'un enzyme deux substrats et deux produits : la cratine kinase ...........................................................................................................224 6.9.1. Application pratique de la mesure des paramtres pour la cratine kinase...............228 6.10. Ractions trois substrats et plus ...............................................................................229 Problmes .................................................................................................................................233
TABLE DES MATIRES
459
DES MCANISMES ENZYMATIQUES ...............237
7 UTILISATION D'ISOTOPES POUR L'TUDE

7.1.
Echange isotopique et effets isotopiques ..................................................................237
7.2. Principes de l'change d'isotope ...................................................................................238 7.3. Echange d'isotopes l'quilibre....................................................................................241 7.4. Echange d'isotopes dans des mcanismes enzyme modifi ..................................242 7.5. Echange d'isotopes hors quilibre................................................................................243 7.5.1. Rapports de flux chimiques.........................................................................................243 7.5.2. Cintiques d'isomrisation ..........................................................................................247 7.5.3. Perturbation par un traceur..........................................................................................249 7.6. La thorie des effets isotopiques cintiques .............................................................251 7.6.1. Effets isotopiques primaires........................................................................................251 7.6.2. Effets isotopiques secondaires ....................................................................................253 7.6.3. Effets isotopiques sur les quilibres............................................................................253 7.7. Effets isotopiques primaires sur les cintiques enzymatiques...............................254 Problmes .................................................................................................................................256
8 EFFETS DE LENVIRONNEMENT
SUR LES ENZYMES .........................................................257
8.1. Effet du pH sur les cintiques enzymatiques .............................................................257 8.2. Les proprits acide-base .............................................................................................259 8.2.1. Les quilibres dionisation ..........................................................................................259 8.2.2. Les tampons .................................................................................................................263 8.2.3. Les proprits acide-base des protines......................................................................265 8.2.4. Analyse sur la base des constantes de dissociation des groupes................................267 8.2.5. Analyse sur la base des constantes de dissociation molculaires ..............................269 8.2.6. Les fonctions pH de MICHAELIS .................................................................................270 8.2.7. Les courbes en cloche..................................................................................................271 8.3. Leffet du pH sur les constantes cintiques enzymatiques .....................................273 8.3.1. Hypothses sous-jacentes............................................................................................273 8.3.2. La dpendance au pH des paramtres V et V/Km ........................................................274 8.3.3. Les paramtres indpendants du pH et leur relation avec les paramtres apparents ..................................................................................................................276 8.3.4. La dpendance au pH de Km ........................................................................................277 8.3.5. Prparation des expriences ........................................................................................279 8.4. Ionisation du substrat ..................................................................................................280 8.5. Effets complexes du pH.................................................................................................280 8.6. Effets de la temprature sur les ractions catalyses par des enzymes ...............281 8.6.1. Dnaturation thermique...............................................................................................281 8.6.2. Loptimum de temprature......................................................................................283 8.6.3. Application de lquation dEYRING aux enzymes ....................................................284 8.7. Effets de la pression sur les ractions catalyses par des enzymes .....................285 8.7.1. Effets de la pression sur les quilibres et les vitesses de raction .............................285 8.7.2. Effet de la pression sur les interactions non-covalentes.............................................287 8.7.3. Effets de la pression sur les ractions enzymatiques..................................................287
460
8.8. Effets isotopiques du solvant ......................................................................................289 Problmes .................................................................................................................................291
9 CONTRLE DE LACTIVIT ENZYMATIQUE .............................................................................293

9.1. Fonction des interactions coopratives et allostriques.........................................293 9.1.1. Cycles futiles ...............................................................................................................293 9.1.2. Mcanismes de rgulations de lactivit enzymatique...............................................294 9.1.3. Inadquation de lquation de MICHAELIS et MENTEN pour dcrire les mcanismes de rgulation.................................................................296 9.1.4. La cooprativit ...........................................................................................................297 9.1.5. Interactions allostriques.............................................................................................298 9.2. Le dveloppement de modle expliquant la cooprativit .........................................299 9.2.1. Lquation de HILL ......................................................................................................299 9.2.2. Un autre index de cooprativit ..................................................................................301 9.2.3. Hypothse dun quilibre de fixation dans les cintiques coopratives ...................301 9.2.4. Lquation dADAIR ....................................................................................................303 9.2.5. Dfinitions mcaniques et oprationnelles de la cooprativit..................................307 9.3. Ajustement induit ..........................................................................................................309 9.4. Modles modernes de cooprativit ............................................................................311 9.4.1. Le modle symtrique de MONOD, WYMAN et CHANGEUX ......................................311 9.4.2. Le modle squentiel de KOSHLAND, NMETHY et FILMER ......................................318 9.4.3. Modles association-dissociation................................................................................324 9.5. Cooprativit cintique..................................................................................................325 Problmes .................................................................................................................................327
10 CINTIQUES DES SYSTMES
MULTI-ENZYMATIQUES .....................................................329
10.1. Les enzymes dans leur contexte biologique.................................................................329 10.2. Analyse du contrle mtabolique .................................................................................330 10.3. Elasticits.......................................................................................................................332 10.3.1. Dfinition de l'lasticit...............................................................................................332 10.3.2. Proprits communes des lasticits...........................................................................335 10.3.3. Les cintiques enzymatiques vues travers l'analyse du contrle ............................336 10.3.4. Considration des vitesses et des concentrations comme des effets et non comme des causes...............................................................337 10.4. Les coefficients de contrle..........................................................................................340 10.5. Relations d'addition.......................................................................................................342 10.6. Relations entre les lasticits et les coefficients de contrle de flux ....................344 10.6.1. Proprits de connectivit ...........................................................................................344 10.6.2. Les coefficients de contrle dans une voie trois tapes...........................................346 10.6.3. Expression des relations d'addition et de connectivit sous une forme matricielle ..........................................................................................348 10.6.4. Relation de connectivit pour un mtabolite non-impliqu dans une boucle de contrle rtroactif ........................................................................348
TABLE DES MATIRES
461
10.6.5. Le coefficient de contrle de flux d'un enzyme pour le flux au travers de sa propre raction ..............................................................349 10.7. Les coefficients de rponse : la rponse partage .....................................................350 10.8. Contrle et rgulation....................................................................................................351 10.9. Mcanismes de rgulation ............................................................................................355 10.9.1. Canalisation de mtabolites.........................................................................................355 10.9.2. Cascades d'enzymes convertibles ...............................................................................357 10.9.3. Le rle mtabolique de l'adnylate kinase..................................................................359 Problmes .................................................................................................................................362
11 LES RACTIONS RAPIDES .....................................................................................................365

11.1. Les limitations des mesures l'tat stationnaire.....................................................365 11.1.1. Phases transitoires .......................................................................................................365 11.1.2. Etapes lentes et rapides dans les mcanismes enzymatiques............................366 11.1.3. Ambiguts dans l'analyse l'tat stationnaire de systmes impliquant des isomrisations d'intermdiaires..........................................................367 11.1.4. Mauvais conditionnement ...........................................................................................369 11.2. Libration du produit avant la fin de cycle catalytique .............................................370 11.2.1. Les cintiques avec burst ............................................................................................370 11.2.2. Titrage du site actif......................................................................................................372 11.3. Les techniques exprimentales.....................................................................................373 11.3.1. Les classes de mthodes..............................................................................................373 11.3.2. Les mthodes de flux continu .....................................................................................375 11.3.3. Les mthodes de stopped-flow....................................................................................376 11.3.4. Le quenched flow ........................................................................................................377 11.3.5. Les mthodes de relaxation.........................................................................................380 11.4. La cintique des phases transitoires ..........................................................................382 11.4.1. Les systmes hors d'quilibre......................................................................................382 11.4.2. Simplification de mcanismes complexes..................................................................386 11.4.3. Les systmes proches de l'quilibre ............................................................................389 Problmes .................................................................................................................................392
12 ESTIMATION DES CONSTANTES CINTIQUES ....................................................................393

12.1. L'effet des erreurs exprimentales dans l'analyse des donnes cintiques ............393 12.2. Ajustement sur une quation de MICHAELIS et MENTEN par la mthode des moindres carrs ...........................................................................396 12.2.1. Introduction d'erreurs dans l'quation de MICHAELIS et MENTEN .............................396 12.2.2. Estimations de V et de Km............................................................................................397 12.2.3. Rsultats correspondants pour une dviation standard uniforme des vitesses .........399 12.3. Aspects statistiques du graphique linaire direct ....................................................400 12.3.1. Comparaison entre les statistiques classiques et les statistiques distribution libre...........................................................................400 12.3.2. Application au graphique linaire direct.....................................................................402 12.3.3. Absence de la ncessit d'utiliser des pondrations ...................................................403
462
12.3.4. Insensibilit vis--vis d'observations exceptionnelles................................................404 12.3.5. Traitement des estimations ngatives des paramtres................................................405 12.4. Prcision des estimations des paramtres cintiques ............................................407 12.5. Graphiques des rsidus et leurs utilisations .............................................................411 Problmes .................................................................................................................................416
SOLUTIONS DES PROBLMES ET COMMENTAIRES ....................................................................419 RFRENCES ..................................................................................................................................427 INDEX ...............................................................................................................................................443 TABLE DES MATIRES ...................................................................................................................455

Cinétique Enzymatique

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C

DIRIGE PAR JEAN BORNAREL

Comit de lecture pour Cintique enzymatique

Ouvrages Grenoble Sciences dits par EDP Sciences

Collection Grenoble Sciences

Grenoble Sciences - Rencontres Scientifiques

1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE

Les conventions d'criture des ractions chimiques

Coefficient stchiomtrique Sens de la raction inverse

Produit Constante de vitesse de la raction inverse

1.1 - Reprsentation schmatique d'une raction chimique et conventions d'criture

1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE

1.2. LES PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE

1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE

1.2.2. Mcanisme de raction et ractions lmentaires

1.2.3. Ordre et molcularit d'une raction

1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE

En prenant l'exponentielle des deux cts de l'quation, nous obtenons l'quation

1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE

1.2.4. Dtermination de l'ordre d'une raction

1.2.5. Dimensions des constantes de vitesse

1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE

Ordre 0 Equation de vitesse

Graphique v en fonction de [A]

1,5.104 1.104 5.105 0.10 0

Tableau 1.1 - Caractristiques de ractions d'ordre 0, 1 et 2

1,5.103 1.103 5.104 0,00006

1.103 5.10 0,00006

Dtermination de l'ordre de la raction

log v0 = 1.log [A] + log k

log v0 = 2.log [A] + log k

Graphique log v en fonction de log [A]

Dtermination de la constante de vitesse

[A]t = [A]0 k.t

ln [A]t = ln [A]0 k.t

1/[A]t = 1/[A]0 + k.t

Linarisation du graphique [A] en fonction du temps

1.100 2.100 2.10 3

Unit de la constante de vitesse

1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE

La pente = Dy/Dx a les dimensions de y/x

L'intersection avec l'axe des x a les dimensions de x

L'ordonne l'origine a les dimensions de y

1.2.6. Les ractions rversibles

Si nous posons que [ P ] = 0 quand t = 0, nous obtenons que a = et l'quation suivante :

qui peut tre rarrange pour donner :

1.2.7. Dtermination des constantes de vitesse du premier ordre

[1.28] [1.29] [1.30] [1.31]

1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE

[1.33] [1.34] [1.35] [1.36]

log ([ P ]i ' [ P ]i ) = constante

Pente = (k1 + k1)/2,303

1 PRINCIPES DE BASE DE LA CINTIQUE CHIMIQUE

100 10 1,9 100 50 9,8

10 20 1,3 10 100 6,3

20 20 2,0 20 100 8,9

50 20 2,9 50 100 14,4

100 20 3,9 100 100 20,3

1.3 - KZDY, JAZ et BRUYLANTS (1958) et S WINBOURNE (1960) suggrrent

2.2. CONCEPTS GNRAUX DE LA THERMODYNAMIQUE

2.1 - Description thermodynamique de lunivers

2 LA THERMODYNAMIQUE ET LA THORIE DES VITESSES ABSOLUES

2.3. LES LOIS DE LA THERMODYNAMIQUE