Challenge Test - Adria PDF

CHALLENGE-TEST MICROBIOLOGIEPRVISIONNELLE CHALLENGE-TEST, MICROBIOLOGIEPRVISIONNELLE,
DTERMINATION DELA DLC

Nouvellenormetechniquepourleschallengetests:
NF V 01009 (mai 2014) points cls dans la NFV01009(mai2014),pointsclsdansla
ralisation,casconcretsurunmodlepathogne,
interprtationsetoutildaide
Veronique.huchet@adria.tm.fr
ARCHITECTUREDESTEXTES
COMMUNAUTAIRES
Ensure Food safety and Quality
COMMUNAUTAIRES
n
e
EC 178/2002
Ensure Food safety and Quality
u
r
o
p
e
n
n
EC 178/2002
n
t
a
t
i
o
n

e
u
EC 852/2004
& EC 853/2004
R
g
l
e
m
e
n
EC 2073/2005
R
EC 2073/2005
S i d t l
Services de contrle : Produit avec une
autorisation de mise
sur le marche (DLC)
COMMUNAUTAIRES
Ne pas confondre les critres prsents dans le rglement
COMMUNAUTAIRES
p p g
(CE) n 2073/2005 Critres microbiologiques avec la
liste des dangers dfinir dans le cadre du plan de
matrise sanitaire :
E
C

2
E
C

2
matrise sanitaire :
L'absence de critres au sein de la rglementation ne signifie
pas qu'il n'y a pas de de risques prendre en compte
0
7
3
/
2
0
0
7
3
/
2
0
pas quil ny a pas de de risques prendre en compte
APPROCHE PRVENTIVE
0
0
5
0
0
5
-mthodes danalyse des diffrentes flores,
-utilisation de donnes bibliographiques, g p q ,
-de tests de vieillissement,
-de tests de croissance (challenge-tests),
-ou encore de la microbiologie prvisionnelle
COMMUNAUTAIRES COMMUNAUTAIRES
E
C

2
E
C

2
0
7
3
/
2
0
0
7
3
/
2
0
NF V01-009 mai 2014
Lignes directrices pour la ralisation des tests de
croissance microbiologique
0
0
5
0
0
5
-utilisation de donnes bibliographiques,
A working group ISO TC34/SC9 (WG 19) has been created,
Liste des laboratoires reconnus pour la ralisation des tests
de croissance Listeria monocytogenes ( DGAL)
g p q ,
gathered 7 countries and aimsat setting up "Guidelines for
conducting challenge tests".
RMT dure de vie , QUALIMA en lien avec DGAL :

rseau de rfrence et dexpertise en scurit microbiologique
des aliments
COMMUNAUTAIRES COMMUNAUTAIRES
-utilisation de donnes bibliographiques,
E
C

2
E
C

2
0
7
3
/
2
0
0
7
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/
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0
NF V01-009 mai 2014
Lignes directrices pour la ralisation des tests de
0
0
5
0
0
5
Liste des laboratoires reconnus pour la ralisation des tests
de croissance Listeria monocytogenes ( DGAL)
gathered 7 countries and aimsat setting up "Guidelines for
conducting challenge tests".
RMT dure de vie , QUALIMA en lien avec DGAL :

rseau de rfrence et dexpertise en scurit microbiologique
des aliments
Lignes directrices pour la ralisation des
tests de croissance microbiologiques tests de croissance microbiologiques
NF V01-009 ( mai 2014)
NF V01-009 : Principe
Principe:Elledcritleslignesdirectricespourla
ralisationdetroistypesdetests decroissance:
OEstimationdu potentieldecroissance
5
6
7
)
=log(ufc/g)J
DLC
log(ufc/g)J
0
2
3
4
5
L
o
g
(
u
f
c
/
g
)
0
1
0 5 10 15
Temps (jours)
Amplitude de la croissance
J
0
J
DLC
OEstimationdutempsdelatence
Tempsdelatence(h)
OEstimationdu tauxdecroissance
Tauxdecroissance
(max)(h1)
Tempsdegnration
(Tg) =Ln(2)/max
Vitessedemultiplication
(Tg)=Ln(2)/max
o Nombredelots,deportions
o Lematrielbiologique g q
o Ltatphysiologique
o Lelieuetmthodedinoculation
o Letauxdinoculation
o Lednombrement
o Lexpressiondesrsultats
NF V01-009 : Echantillonnage
Echantillonnage : nombre de lots Echantillonnage:nombredelots
V i bilit d t h i hi i ( H t id ) Variabilitdesparamtresphysicochimiques(pH,awetacides)
Variabilitdesparamtresmicrobiologiques
Variabilitinterlots
Faible:1lot Importante:3lots
(recommand)
Echantillonnage:nombredelots
Variabilitinterlotsdesparamtresphysicochimiques p p y q
AnnexeB(titreinformatif):Calculstatistique(exempleavecdesdonnes
decroissancedeListeriamonocytogenes)
MthodeatprogrammeparlANSESdansunoutil Hetrogeneity
Calculator Calculator
Echantillonnage : nombre de lots Echantillonnage:nombredelots
Pour1soucheteste
Variabilitinterlots
Caractristiques
physicochimiques
+ +
p y q
Caractristiques
microbiologiques
+ +
g q
Nombredelots 1 3 3 3
E h ill b d i Echantillonnage:nombredeportions
Variabilitintralots
Paramtresphysicochimiques
P t i bi l i Paramtresmicrobiologiques
Contaminationartificielle
i d l i Incertitudeanalytique
Nombrededatesdednombrement
Nombredanalyses/date
Nombredetmoins
Echantillonnage : nombre de portions Echantillonnage:nombredeportions
Pour1soucheet1lot
Variabilitintralots 1 2 3 4 5
Caractristiquesphysico
+
chimiques
+
Caractristiquesmicrobiologiques +
Contaminationartificielle
(Inoculation,structureetnature
aliment)
+
Incertitude analytique Incertitudeanalytique

(techniquedeprised'essaiet
d'analyse)
+
Nombre de portions
Nombredeportions
1 3 3 3 3
Pourune1soucheet1lot
Exemple test de croissance (temps de latence* + taux de croissance*) Exempletestdecroissance(tempsdelatence*+tauxdecroissance*)
Variabilitintralots 1 2345
Dnombrementportions
inocules
(10dates*) 1x10=10 3x10=30
Dnombrementportions
flore annexe floreannexe
(J0etJDLC) 1x2=2 3x2=6
Dnombrementportions
physicochimie
(J0J1/2JDLC) 1x3=3 3x3=9
Recherchecontaminant
(J0JDLC)
1x2=2 3x2=6
Totalportions 17 51
Concentrationengaz(J0
JDLC) 1x2 = 2 1x2 = 2
JDLC) 1x2=2 1x2=2
E l t ti l d i
Pourune1soucheet1lot
Exemplepotentieldecroissance
Variabilitintralots 1 2345
Dnombrement portions inocules Dnombrementportionsinocules
(2dates*)
1x2=2 3x2=6
Dnombrementportionsfloreannexe
(J0etJDLC)
1x2=2 3x2=6
D b i h i Dnombrementportionsphysico
chimie
(J0J1/2JDLC) 1x3=3 3x3=9
Recherchecontaminant
(J0JDLC) 1x2=2 3x2=6
Totalportions 9 27
Concentrationengaz(J0JDLC)
1x2=2 1x2=2
NF V01-009 : Choix des souches
Choix des souches Choixdessouches
Identification(analysesbiochimiqueset/ousrologiques
et/oumolculaires)
Souchesterrains,cliniques,environnementales,..mais
ll d ll l l l ellesdoiventappartenirunecollectionlocale,nationale,
Sipossiblecaractrisesparleursvaleurscardinales
(T,pH,aw)sinonverifier lacapacitdemultiplicationT test
Mlange de souches uniquement pour lestimation Mlangedesouchesuniquementpourl estimation
dupotentieldecroissance(concentrationquivalente)
NF V01-009 : Prparation
inoculum inoculum
Mode opratoire Modeopratoire
OPrparationdelinoculum(cellulesvgtatives)
inoculum inoculum
OPrparationdelinoculum(suspensionsdespores)
Etapes Protocole
1 Dconglationsouche
(Subculture1) (dbutdephasestationnaire)
2 Repiquage souche 1% 2 Repiquagesouche1%
(subculture2) dbutdephasestationnaire)
3 Dnombrementdela
solution
Milieuslectifetnonslectif
4 Vrificationdelapuret Isolement,ColorationdeGram
Inoculation (bouillon)
Striesouinondation(glose)
5 Inoculationbouillonou
glosedesporulation
Tempratureettempsdtermins
80<tauxdesporulation(%)<90
Observationmicroscopique(tatfrais)
inoculum inoculum
OPrparationdelinoculum(suspensionsdespores)
Etapes Protocole Etapes Protocole
6 Rcoltedesspores Raclagegloseaveceaudistillestrileoucentrifugation(bouillon)
7 Centrifugation
3lavageseneaudistilleoueauultrapure
Dernierculotreprisparxmld'eau
7 Dnombrementdesspores
Traitementthermiquenonsporicide delasuspensiondilueau1/10
e
(liminationdescellulesvgtatives)
Dnombrement (ex Bacillus PCA + amidon 0 2%) Dnombrement(exBacillus PCA+amidon0.2%)
8 Conservationsuspension
de spores
Tempraturede4Coutempraturengative
Eneauoudanssolutionthanol90%(v/v)
Vrifier rgulirement la stabilit de la solution (spores cultivables et
despores Vrifierrgulirementlastabilitdelasolution(sporescultivableset
absencecellulesvgtatives)
NF V01-009 : Inoculation
OInoculation
Ratio volume dinoculum/masse (ou volume) chantillon 1/100
Chaque portion inocule par volume identique inoculum
Concentration inoculum >5 fois le seuil de dnombrement de la mthode
Concentration initiale <10
4
ufc/g
Concentration inoculum faible : adaptation dilution solution mre
et facteurs de dilution (NF EN ISO 6887)
g
Aucune modification physico-chimique
Les portions doivent tre quilibres la temprature initiale du test
Conditions atmosphriques identiques au conditionnement habituel
Les portions doivent tre quilibres la temprature initiale du test
Dans le cas daliments htrognes, inoculer linterface ou sur aliments pertinents
NF V01-009 : Conservation
OConservation
Et h t i t l Etuveavecousanshygromtriecontrle
Exigence+/ 1C
S i i d l t t t t l d l ti Suividelatempraturetoutaulongdelaconservation
NF V01-009 : Conservation
OConservation
Estimation temps de latence et/ou taux de croissance :
Temprature constante Temprature constante
Estimation potentiel de croissance : p
Temprature raisonnablement prvisible :
-Variable : 1/3 4C et 2/3 8C
C l i -Constante : temprature rglementaire
ou dfinie par fabricant
NF V01-009 : Dnombrements
ODnombrements
Selon NF EN ISO 6887, NF ISO 7218
Selon mthodes normalises adaptes au microorganisme p g
-Taux de croissance (5 dnombrements)
-Temps de latence (3 mais 5 dnombrements recommands) Temps de latence (3 mais 5 dnombrements recommands)
-Potentiel de croissance (2 dnombrements)
La confirmation des colonies caractristiques
nest pas obligatoire
NF V01-009 : Expression des
rsultats
Expressions des rsultats
rsultats
Expressionsdesrsultats
OEstimationdupotentieldecroissance:alimenthomogne
et htrogne
5
6
7
)
ethtrogne
2
3
4
5
L
o
g
(
u
f
c
/
g
0
1
0 5 10 15
Temps (jours)
J
0
J
DLC
NF V01-009 : Estimation du
potentiel de croissance potentiel de croissance
Expressions des rsultats Expressionsdesrsultats
OEstimationdupotentieldecroissance:alimenthomogne
et htrogne ethtrogne
= logf-logi
L
f = concentration finale
i = concentration initiale
Listeria monocytogenes
DocumentLCR(2008),TGDLmshelflifestudies(juin,2014):
l ( f / ) l >0,5log(ufc/g):permetlacroissance
NationalAdvisoryCommiteeOnMicrobiologicalCriteriafor
food (2009) : > 1,0 log(ufc/g) : permet la croissance food(2009): >1,0log(ufc/g):permetlacroissance
Pas Pas dextrapolation dextrapolationpossible possible dans dans
dautres dautresconditions conditions
d autres d autresconditions conditions
NF V01-009 : Estimation du taux de
croissance et du temps de latence
Expressions des rsultats
croissance et du temps de latence
Expressionsdesrsultats
OEstimationdutauxdecroissance(max)etdelalatence
P i li i
Sur chaque lot individuellement
Par rgression linaire
max (heure
-1
) = vmax (pente de la droite) x ln(10)
Tg (heure)= ln(2) Tg (heure)= ln(2)
max
Intersection entre la droite dcrivant la phase exponentielle
t l d it h i t l d t l h d l t
En utilisant un modle de croissance reconnu
Logiciel tel SymPrevius
et la droite horizontale correspondant la phase de latence
Logiciel tel Sym Previus
NF V01-009 : Estimation du taux de
croissance et du temps de latence croissance et du temps de latence
pH=7 T=8C Aw = 0 97 :max=0 19h
-1
et Lag =21h
Le Le taux taux de de croissance croissance et le temps de et le temps de latence latence sont sontlis lis
des conditions des conditions environnementales environnementalesconnues connues
pH=7, T =8 C, Aw = 0.97 :max=0.19h et Lag =21h
des conditions des conditions environnementales environnementalesconnues connues
Du laboratoire lentreprise p
Comment aller plus loin dans linterprtation des rsultats?
Comment lutiliser dans son entreprise?
Comment lassocier aux autres rsultats
(autocontrles microbiologiques, analyses physico-
chimiques, enregistrement T.)
Microbiologie prvisionnelle
La microbiologie prvisionnelle
Mmo
La croissance du contaminant au sein de laliment
Mmo
La croissance du contaminant au sein de l aliment

2
max min
H H H H H H
pH pH pH pH
pH

T
o
pH aw acid

2
opt max min
pH pH pH pH pH pH
T
min
T
opt
T
max
pH
min
pH
opt
pH
max
aw
min
aw
opt
aw
max
alpha MIC
Dtermination des paramtres de croissance du
microorganismes
microorganismes
Mmo
Problmatique: en pratique, difficult jouer sur un seul facteur pour
Mmo
limiter la croissance microbienne (poudres, conglation,)
Pour amliorer les qualits organoleptiques,
ibilit d i l i f t possibilit dassocier plusieurs facteurs
dose modre
AH CO
2
F
t
NEP pH
Pris individuellement, chaque facteur ninhibe pas le
dveloppement bactrien.
Cest leffet combin des facteurs qui va assurer la scurit
Mmo
Quest Questce ce que que la la microbiologie microbiologie previsionnelle previsionnelle??
Mmo
E
C

2
E
C

2
Taux de croissance
optimal
pH
i
pH
t
pH alpha MIC
0
7
3
/
2
0
0
7
3
/
2
0
p
pH
min
pH
opt
pH
max
alpha MIC
max = opt (T) (pH) (aw) (inhibitor) (interaction)
0
0
5
0
0
5
T
min
T
opt
T
max
aw
min
aw
opt
aw
max
Loutil probabiliste de
SymPrevius SymPrevius
Quest Questce ce que que la la microbiologie microbiologie previsionnelle previsionnelle?? Quest Questce ce que que la la microbiologie microbiologie previsionnelle previsionnelle??
E
C

2
E
C

2
Optimal
growth rate
pH
i
pH
t
pH alpha MIC
0
7
3
/
2
0
0
7
3
/
2
0
g
pH
min
pH
opt
pH
max
alpha MIC
0
0
5
0
0
5
2 aliments avec des caractristiques T, pH, a , 2 aliments avec des caractristiques T , pH, a
w
,
[inhibiteurs ] identiques peuvent ne pas induire
la mme croissance : substrats, accessibilit
aux nutriments
opt opt 11 opt opt 22
opt opt 11 opt opt 22
Loutil probabiliste de
SymPrevius
SymPrevius
E
C

2
E
C

2
Optimal
growth rate
pH
i
pH
t
pH alpha MIC
0
7
3
/
2
0
0
7
3
/
2
0
g
pH
min
pH
opt
pH
max
alpha MIC
0
0
5
0
0
5
Valeur cardinales
++
Valeur cardinales
de lespce
microbienne
Les autresfacteursqui ne sont pas modellissspecifiquement
sont nanmoinsprisen compte via le opt.
Les outils daide la dcision
Beaucoup dquations!
Outils daide Outils d aide
la dcision
Application pratique
Donnesncessaires
Mi i Mi i P d it P d it C t i ti C t i ti Si l ti Si l ti
Donnesncessaires
1- Microorganisme
Microorganisme Microorganisme Produit Produit Contamination Contamination Simulation Simulation
1 Microorganisme
Microorganismes
pathognes
Microorganismes
Daltration
L. monocytogenes
B. cereus
Salmonella
B. amyloliquefaciens
B. weihenstephanensis
B. licheniformis
E. coli
S. aureus
C. botulinum
C perfringens
C. freundii
E. faecium
L. casei
L sakei C. perfringens L. sakei
Le. mesenteroides
P. fluorescens
P. putida
Q l
S. marescens
Quelques
levures
Vos propres souches caractrises
Donnesncessaires
Donnesncessaires
2- Produit
2 Produit
+ 4 possibilites
Ch ll l Challengetestresult(dnombrement bactrien)
oOnegrowthrateinstudiedfood
oTheoptimalgrowthrateinstudiedfood
Challenge-test at 8C
time in h log CFU/g
0 1.58
o p g
oLaboratorymedia
72 1.76
168 2.53
240 2.82
336 4.6
430 4.9
Challenge test conditions
-T=8C
-pH=5.1
520 6.8
590 6.5
700 6.7
p
-aw= 0.97
Donnesncessaires
Donnesncessaires
3- Contamination
3 Contamination
+ 3 possibilites
oUn taux de contamination(in log) oUntaux decontamination(inlog)
Donnes dautocontroles (Nbre dchantillons positifs /nbre tests)
oDonnes dautocontroles (dnombrement bactrien)
6 positives samples
among247 tested (25g)
Donnesncessaires Donnesncessaires
4- Simulation
4 Simulation
oInformationgnrale (contaminationmaximale autorise,dure devie,poids de
l it d t ) lunit devente)
oTemperature(statique,dynamique ou profil prslectionn)
opH (statique,donnes dautocontroles,dynamique,conditionoptimale)
oaw (statique,donnes dautocontroles,dynamique,conditionoptimale)
oAcidlactic (statique,donnes dautocontroles,dynamique,conditionoptimale)
Donnesncessaires
Donnesncessaires
4- Simulation
4 Simulation
Informationgnrale (contaminationmaximale autorise,dure devie,poids
delunit devente)
oTemperature
opH opH
oaw
oAcidlactic
2 l 2 log
21jours
200g +/- 2
Donnesncessaires
Donnesncessaires
4- Simulation
4 Simulation
oInformationgnrale
Temperature(statique,dynamique ou profil prslectionn)
opH
oaw oaw
oAcidlactic
Pr-slectionn :
1/3 DLC 4C et 2/3 8C
1/3 DLC 4 C et 2/3 8 C
4- Simulation
4 Simulation
oInformationgnrale
oT t oTemperature
pH (statique,donnes dautocontroles,dynamique,conditionoptimale)
ooaw
oAcidlactic
Statique: 5.1 +/-0.01
Statique: 5.1 / 0.01
4- Simulation
4 Simulation
oInformationgnrale
oT t oTemperature
opH
aw ( t ti d d t t l d i diti ti l ) aw (statique,donnes dautocontroles,dynamique,conditionoptimale)
oAcidlactic
Statique: 0.97 +/-0.005
Statique: 0.97 / 0.005
4- Simulation
4 Simulation
oInformationgnrale
oTemperature
opH
oaw oaw
Acidlactic (statique,donnes dautocontroles,dynamique,conditionoptimale)
Absence dacide lactique
Absence d acide lactique
SymPrevius :
de la formulation la dure de vie de la formulation la dure de vie
Une approche sur mesure utilisant VOS donnes
D R lt t d P id d l it P t
pp
Donnes
dautocontrle
Rsultats de
challenge test
Poids de lunit
de vente
Paramtres
dynamiques
Eff t d l ti
Conditions relles
200 g 2
6/247
(25g)
Effet de la matrice
alimentaire
Conditions relles
de conservation
(25g)
Prvalence du
danger microbien
Probabilit de
contamination de
lunit de vente
SymPrevius :
Donnes dautocontrles (6/247) 31% des units de vente contamines!
Simulation de croissance
T= 1/3 4C et 2/3 8C
pH=5.10.1
aw=0 970 005 aw=0.970.005
SymPrevius :
Donnes dautocontrles (6/247) 31% des units de vente contamines!
Dans4% des produits contamins,
L. monocytogenesva dpasser le
seuil critique de 2 log impos par
la rglementation
0.04 x 31%
Soit une
probabilit 13% probabilit 1.3%
SymPrevius :
Est ce possible dAugmenter la dure de vie 23J ? Est-ce possible d Augmenter la dure de vie 23J ?
CTestsdevieillissement:
Evaluerlvolutionorganoleptiqueduproduit
Evaluerlvolutiondeflorenaturelleduproduit
i i d l Reprsentativitdeslots
SymPrevius :
Dans10.3% des produits
CProblmatique Listeria monocytogenes

contamins, L. monocytogenesva
dpasser le seuil critique de 2 log
impos par la rglementation
Soit une
probabilit 32% probabilit 3.2%
SymPrevius :
et si je matrise mon aw ?
Soit une
probabilit 32%
, et si je matrise mon aw ?
probabilit 3.2%
SymPrevius :
de la formulation la dure de vie
Une formulation revue :
( matrise de law)
probabilit
0.8%
UneDLCmodifiepourunrisque<ouquivalent
SymPrevius :
CProblmatique Listeria monocytogenes

et si j ajoute de lacide lactique?
Soit une
probabilit 32%
, et si j ajoute de l acide lactique?
probabilit 3.2%
SymPrevius :
( acide lactique)
probabilit
0.7%
Une DLC modifie pour un risque Listeria monocytogenes
UneDLCmodifiepourunrisqueListeriamonocytogenes
<ouquivalent
Conclusion
Unchallengetestestunecourbederfrencedelabactrietest
danslamatrice:
oIntrtavoirdesrsultatsrobustes(vigilancesurtousles
pointsdelanormenotammentlenombredelots,depointset
lamtrologie)
oNcessit dutiliser des outils complmentaires (logiciel de oNcessitd utiliserdesoutilscomplmentaires(logicielde
microbiologieprvisionnelle)pouruneinterprtation optimale
etfairelelienaveclesdonnesentreprise
oLechallengetestestsouventladonnemanquantepour
estimerlaprobabilitdedpasser100L.monocytogenes enfin
p p y g
deDLC
Conclusion:
Symprevius une pice du puzzle Symprevius, une pice du puzzle
Veronique.huchet@adria.tm.fr 57
Supported by the French
Food Safety Authorities
Conclusion
Unensembledoutilsquipermettent
demieuxapprhenderlescritresde
scuritmicrobiologiquespendant
Autocontroles
microbiologiques
HACCP
touteladuredevieduproduit
Challenge test
Outils daide
Analyses physico-
chimiques
Outils d aide
la dcision
Qualit
microbiologique

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CProblmatique Listeria monocytogenes

CProblmatique Listeria monocytogenes

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