1ère  STL  BTK  -­‐  24/09/2015  

TP  n°3  :  Découverte  de  la  coloration  de  GRAM  et  étude  de  la  flore  d’un  lait  cru  
 
 
Ce   TP   doit   vous   permettre   d’acquérir   des   gestes   de   base   de   microbiologie   concernant   l’observation  
microscopique  et  l’identification  de  structures  cellulaires.    
 
À  quoi  sert  la  coloration  de  Gram  ?  D’où  vient  le  nom  de  Gram  ?  Pourquoi  parle-­‐t-­‐on  de  bactéries  à  Gram  
positif  ou  négatif  ?  Peut-­‐on  utiliser  cette  coloration  pour  observer  la  flore  d’un  lait  pasteurisé  ?  
 
Contexte  :   en   1884,   Hans   Christian   Gram,   un   médecin   d’origine   danoise   travaillant   à   Berlin,   a   trouvé  
accidentellement  une  méthode  qui  est  encore  aujourd’hui  à  la  base  de  l’identification  bactérienne.  Au  cours  
de   ses   études   sur   les   tissus   de   poumons   de   patients   morts   de   pneumonie,   il   découvre   que   les   colorants  
permettent   de   mieux   observer   les   cellules   bactériennes   transparentes.   Il   s’aperçoit   aussi   que   certaines  
bactéries  sont  colorées  par  les  colorant  qu’il  emploie,  tandis  que  d’autres  ne  le  sont  pas.  Quelques  années  
plus   tard,   Hans   Gram   développe   une   procédure   de   coloration   qui   sépare   la   population   bactérienne   en   deux  
grands  groupes  :  les  bactéries  à  Gram  positif  et  les  bactéries  à  Gram  négatif.  Cette  coloration  est  toujours  
utilisée  dans  les  laboratoires  de  microbiologie  du  monde  entier.  Elle  est  l’étape  indispensable  et  préliminaire  
à  toute  identification  bactérienne.  Découvrons  la  coloration  de  Gram.  
 
I. Coloration  de  Gram  sur  un  bouillon  de  composition  inconnue  
 
ü Matériel  et  réactif  
Ø Un  bouillon  impur  de  bactérie  
Ø Réactifs  de  la  coloration  de  Gram.  
 
ü Mode  opératoire  
Ø Réaliser  un  état  frais  sur  le  bouillon.  
Ø Réaliser  un  frottis  sur  le  bouillon.  
Ø Procéder  à  la  coloration  de  Gram  du  frottis.  
Ø Observer  le  frottis  ainsi  colorés  à  l’immersion.  
 
ü Compte  rendu  
1) Décrire   les   résultats   des   observations   (type,   taille,   forme,   mode   de   groupement,   mobilité  
(uniquement  visible  à  l’état  frais),  Gram  +  ou  -­‐).  
2) Conclure  à  l’issue  de  la  coloration,  sur  la  couleur  des  bactéries  à  Gram  -­‐  et  des  bactéries  à  
Gram  +    
 
II. Étude  séquentielle  du  Gram  
 
ü Mode  opératoire  
Ø Réaliser  un  nouveau  frottis  à  partir  du  mélange.  
Ø La   coloration   de   Gram   va   être   réalisée   de   manière   séquentielle   pour   découvrir   le   rôle   des  
réactifs  et  l’intérêt  des  différentes  étapes.  Répartition  les  activités  en  5  groupes  de  travail  :  

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Étapes  de  la  coloration  de  Gram  à  effectuer   Groupes  d’élèves   Consignes  communes  
Violet  de  gentiane  +  rinçage  eau   1  
Jusqu’à  l’ajout  de  lugol  +  rinçage  eau   2   Sécher  le  frottis.  
Jusqu’à  l’ajout  d’éthanol  +  rinçage  eau   3   Observer  au  microscope  à  
Coloration  intégrale  classique   4   l’immersion  (x100).  
Coloration  témoin  à  la  fuchsine   5  
 
 
ü Compte  rendu  
1) Recopier   le   tableau   ci-­‐dessous   en   faisant   une   mise   en   commun   des   observations   de   tous   les  
groupes  :  
 
Faire  un  schéma  
Réactifs  employés  
Coque  à  Gram  +     Bacille  à  Gram  -­‐    
Violet  de  gentiane      
Violet  de  gentiane  +  lugol      
Violet  de  gentiane  +  lugol  +  
   
éthanol  
Violet  de  gentiane  +  lugol  +  
   
éthanol  +  fuchsine  
Fuchsine  seule      
 
2) Déduire  des  observations  le  rôle  visible  de  chaque  réactif.  
3) Justifier   le   nom   de   chaque   étape   de   la   coloration   de   Gram   présenté   dans   le   tableau   ci-­‐
dessous  :  
 
Réactifs  ajoutés   Nom  des  étapes  
Violet  de  gentiane   Coloration  primaire  
Lugol   Mordançage  (accentuation  de  la  coloration)  
Éthanol   Décoloration  différentielle  
Fuchsine   Contre-­‐coloration  
 
III. Coloration  de  Gram  de  la  flore  du  lait  cru  
 
ü Matériel  et  réactif  
Ø Culot  de  centrifugation  d’un  échantillon  de  lait  cru.  
Ø Réactifs  de  la  coloration  de  Gram.  
ü Mode  opératoire  
Ø Réaliser  un  frottis  à  partir  du  culot  de  centrifugation  du  lait  cru.  
Ø Procéder  à  la  coloration  de  Gram.  
Ø Observer  à  l’immersion.  
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ü Compte  rendu  
1) Qu’est-­‐ce  qu’un  lait  cru  ?  
2) Quels  sont  les  autres  laits  que  vous  connaissez  ?  
3) Décrire  les  résultats  de  l’observation  microscopique.  
4) Conclure  sur  la  composition  microbiologique  de  la  flore  du  lait  cru.  
 

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