FT4 : Blue Genes – la sélection des bactéries recombinées.

(question modifiée issue de l’examen de fin d’études secondaires GSN, 2019)

Une version mutée d‘Escherichia coli a été développée. Ce type de mutante, nommée E.coli K12, est aussi bien
incapable de coloniser les intestins humains que de survivre en-dehors des conditions offertes par un laboratoire. Ceci
a comme avantage que des expériences avec E.coli K12 sont permises dans les écoles.

Comme, contrairement au type sauvage, E. coli K12 ne dispose pas du gène lacZ, des expériences de clonage peuvent
par exemple être réalisées à l’école en transférant le gène lacZ dans des bactéries K12.

Le gène lacZ code pour une enzyme, la β-galactosidase, capable de scinder le lactose en glucose et en galactose. Or, si
le milieu de culture contient du X-gal au lieu de lactose, non seulement du galactose est produit mais également un
colorant bleu.

Une classe a réalisé une expérience de clonage à l’aide de plasmides comme celui représenté par l’illustration 1.

L’illustration 2 résume les résultats de l’expérience.

ill. 1: plasmide servant au clonage du gène lacZ. Ampr= gène de résistance à l‘ampicilline; Nhe I = site de
restriction

source : Linder Biologie Arbeitsbuch

milieu nutritionnel milieu nutritionnel

• sans ampicilline • avec ampicilline

• sans X-gal • avec X-gal

expérience E. coli K12 transformées à uniquement des 175 colonies blanches

clonage l’aide du plasmide recombiné colonies blanches 7 colonies bleues

ill.2 : colonies de E. coli après 24h d’incubation à 37°C sur différents milieux de culture.
1. Expliquez en vos propres mots, étape par étape, le déroulement de l’expérience. Dans quels cas peut-on s’attendre
à des colonies bleues respectivement des colonies blanches ?
• Le but : transférer le gène lacZ dans des bactéries E.coli K12 et évaluer le taux de transformation,
• lacZ est inséré dans des plasmides contenant une résistance à l’ampicilline et un site de restriction NheI,
• transfert des plasmides dans des bactéries,
• mise en culture sur deux milieu différents : un milieu sans ampicilline et sans x-gal, un milieu avec
ampicilline et x-gal,
• évaluation du taux de transformation à l’aide des rapports colonies bleues/blanches
• les colonies bleues témoignent de la présence de plasmides pBR322 contenant lacZ, les colonies blanches
contiennent le plasmide pBR322 mais sans lacZ

2. Décrivez, de façon détaillée, les diverses étapes moléculaires nécessaires pour obtenir des bactéries E. coli
contenant le gène lacZ.

• l’enzyme de restriction (NheI) coupe au niveau du site de restriction NHeI du plasmide,

• décalage -> sticky-ends/bouts collants,
• le gène lacZ est découpé avec la même enzyme de l’ADN d‘origine,
• le gène lacZ est inséré dans le plasmide, ligué par une ligase (formation de liaisons covalentes),
• insertion dans E. coli (=transformation, voir tranfert de gènes)

3. Exploitez les résultats (ill.2) de l’expérience et expliquez comment ce résultat a pu se produire. Pour quelle raison
est-ce qu’on cultive également des bactéries sur un milieu sans ampicilline et sans X-gal ?

sur milieu avec ampicilline et avec x-gal :

• les cellules bactériennes qui n’ont pas incorporées de plasmides meurent car elles ne disposent pas
de résistance à l’ampicilline qui se trouve dans le milieu de culture,
• des colonies blanches se développent à partir de bactéries qui ont incorporé un plasmide sans gène
lacZ,
→ ni la b-galactosidase ni le colorant bleu ne peuvent être formés
• des colonies bleues se forment si la transformation avec le plasmide contenant le le gène lacZ a réussi
→ formation de b-galactosidase et du colorant bleu
• comme sur 182 colonies 7 sont bleues, on peut conclure que la transformation a fonctionné dans 4%
des cas

culture sur milieu sans ampicilline et sans x-gal = témoin :

• des colonies blanches se forment parce que le milieu de culture dispose d’assez de nutriments mais
pas d’ampicilline qui pourrait décimer la population bactérienne,
• but : pour vérifier la viabilité des bactéries, vérifier si le travail a été réalisé proprement (présence de
lacZ hors du plasmide)
4. Quels sont les avantages pratiques de l’utilisation du marqueur lacZ ? Comparez celle-ci avec l’utilisation de deux
gènes de résistance à des antibiotiques, comme vu en cours.
• les bactéries recherchées peuvent optiquement être directement identifiées,
• dans le cas d’une utilisation de deux gènes de résistance, les bactéries doivent, après une première
phase de croissance, être transférées et recultivées sur un deuxième milieu,
• l’utilisation de deux résistances comme gènes marqueurs demande donc plus de travail,
• et plus de temps.