Iso 16140-4 - 2020 (F) PDF

Date livraison : mercredi 19 mai 2021 11:06:14
Client : SEAAL
NORME ISO
INTERNATIONALE 16140-4
Première édition
2020-07
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 4:
Protocole pour la validation de
méthodes dans un seul laboratoire
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 4: Protocol for method validation in a single laboratory
Numéro de référence
ISO 16140-4:2020(F)
© ISO 2020
Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT

© ISO 2020
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2020 – Tous droits réservés

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Sommaire Page
Avant-propos.................................................................................................................................................................................................................................v
Introduction................................................................................................................................................................................................................................. vi
1 Domaine d’application.................................................................................................................................................................................... 1
2 Références normatives.................................................................................................................................................................................... 2
3 Termes et définitions........................................................................................................................................................................................ 2
4 Principes généraux de la validation dans un seul laboratoire de méthodes de
détection et de quantification................................................................................................................................................................. 4
4.1 Généralités................................................................................................................................................................................................... 4
4.2 Principes de l’approche factorielle......................................................................................................................................... 5
4.3 Principes de l’approche conventionnelle.......................................................................................................................... 6
5 Protocole technique de validation — Approche factorielle...................................................................................... 8
5.1 Méthodes qualitatives........................................................................................................................................................................ 8
5.1.1 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire par rapport à
une méthode de référence........................................................................................................................................ 8
5.1.2 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire sans méthode
de référence........................................................................................................................................................................ 15
5.2 Méthodes quantitatives................................................................................................................................................................. 18
une méthode de référence..................................................................................................................................... 18
de référence........................................................................................................................................................................ 21
6 Protocole technique de validation — Approche conventionnelle...................................................................22
6.1 Méthodes qualitatives..................................................................................................................................................................... 22
de référence........................................................................................................................................................................ 23
6.2 Méthodes quantitatives................................................................................................................................................................. 24
de référence........................................................................................................................................................................ 26
7 Résumé des limites d’acceptabilité.................................................................................................................................................28
Annexe A (informative) Liste des facteurs et niveaux de facteurs relatifs à la validation de la
méthode factorielle.........................................................................................................................................................................................30
Annexe B (informative) Calcul de la reproductibilité interne applicable aux méthodes
qualitatives d’après l’étude LOD50 décrite en 6.1.2.3...................................................................................................32
Annexe C (informative) Exemple d’étude factorielle de validation de méthodes dans un seul
laboratoire pour une méthode quantitative par rapport à une méthode de référence...........33
Annexe D (informative) Exemple d’étude factorielle de validation de méthodes dans un
seul laboratoire pour une méthode qualitative par rapport à une méthode de référence..39
Annexe E (informative) Exemple d’étude factorielle de validation de méthodes dans seul un
laboratoire pour la variabilité du LOD50 d’une méthode qualitative sans méthode
de référence.............................................................................................................................................................................................................43
Annexe F (informative) Détermination de la fidélité en cas d’échantillons artificiellement
contaminés instables.....................................................................................................................................................................................46
Annexe G (informative) Protocole pour la validation dans un seul laboratoire de méthodes
alternatives pour la confirmation microbiologique et le typage.....................................................................48
© ISO 2020 – Tous droits réservés iii

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Bibliographie............................................................................................................................................................................................................................ 49
iv © ISO 2020 – Tous droits réservés

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso.org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la
chaîne alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération
technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Une liste de toutes les parties de la série ISO 16140 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/f r/members.html.
© ISO 2020 – Tous droits réservés v

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Introduction
0.1 Série ISO 16140
La série ISO 16140 a été étendue en réponse à la nécessité de disposer de différents protocoles pour la
validation ou la vérification des méthodes d’essai. Elle succède à l’ISO 16140:2003. La série ISO 16140
comprend six parties ayant le titre général, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des
méthodes:
— Partie 1: Vocabulaire;
— Partie 2: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par rapport à une
méthode de référence;
— Partie 3: Protocole pour la vérification de méthodes de référence et de méthodes alternatives validées
dans un seul laboratoire;
— Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes dans un seul laboratoire;
— Partie 5: Protocole pour la validation interlaboratoires de méthodes non commerciales par plan
factoriel;
— Partie 6: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) pour la confirmation
microbiologique et le typage.
L’ISO 17468 est une Norme internationale étroitement liée, qui établit les règles techniques pour le
développement et la validation de méthodes normalisées.
En général, deux étapes sont nécessaires avant de pouvoir utiliser une méthode en laboratoire.
— La première étape est la validation de la méthode. Celle-ci est effectuée à l’aide d’une étude dans
un seul laboratoire suivie d’une étude interlaboratoires (voir l’ISO 16140-2, l’ISO 16140-5 et
l’ISO 16140-6). Dans le cas où une méthode est validée dans un seul laboratoire (comme décrit dans
le présent document), aucune étude interlaboratoires n’est effectuée.
— La deuxième étape est la vérification des méthodes, au cours de laquelle un laboratoire prouve qu’il
peut effectuer une méthode validée de manière satisfaisante. Celle-ci est décrite dans l’ISO 16140-3.
La vérification est uniquement applicable aux méthodes qui ont été validées à l’aide d’une étude
interlaboratoires.
On distingue en général deux types de méthodes: les méthodes de référence et les méthodes alternatives.
Une méthode de référence est définie dans l’ISO 16140-1:2016, 2.59, comme étant une «méthode
reconnue internationalement et largement acceptée». La note à l’article clarifie que «ces normes sont
des normes ISO et des normes publiées conjointement par l’ISO et le CEN ou d’autres normes régionales/
nationales de niveau équivalent».
Dans la série ISO 16140, les méthodes de référence comprennent les méthodes de référence normalisées
(ISO et CEN) telles que définies dans l’ISO 17468:2016, 3.5, en tant que «méthode de référence décrite
dans une norme».
Une méthode alternative (méthode soumise à validation) est définie dans l’ISO 16140-1:2016, 2.4, en
tant que «méthode d’analyse permettant de détecter ou de quantifier, pour une catégorie de produits
donnée, le même analyte que celui détecté ou quantifié avec la méthode de référence correspondante».
La note à l’article clarifie que: «La méthode peut être commerciale. L’adjectif ‘alternatif’ se réfère à la
totalité du «mode opératoire d’analyse et du système réactionnel». Ce terme recouvre tous les éléments
nécessaires à la mise en œuvre de la méthode, qu’ils soient matériels ou autres.»
Le présent document, l’ISO 16140-4, traite de la validation dans un seul laboratoire. Par conséquent, les
résultats sont uniquement valides pour le laboratoire effectuant l’étude. Dans ce cas, aucune vérification
(comme décrit dans l’ISO 16140-3) n’est applicable. L’ISO 16140-5 décrit les protocoles applicables aux
vi © ISO 2020 – Tous droits réservés

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

méthodes non commerciales dans lesquelles une validation plus rapide est nécessaire ou dans lesquelles
la méthode à valider est hautement spécialisée, et le nombre de laboratoires participants requis par
l’ISO 16140-2 ne peut pas être atteint. Le présent document et l’ISO 16140-5 peuvent être utilisés pour
la validation avec méthode de référence. Le présent document (pour les méthodes qualitatives et
quantitatives) et l’ISO 16140-5 (pour les méthodes quantitatives uniquement) peuvent également être
utilisés pour la validation sans méthode de référence.
Le logigramme de la Figure 1 donne une vue d’ensemble des relations entre les différentes parties
susmentionnées. Il aide également l’utilisateur à choisir la partie appropriée de la série ISO 16140, en
tenant compte de l’objectif de l’étude et des remarques énoncées ci-dessus.
Figure 1 — Logigramme relatif à l’application de la série ISO 16140
NOTE Dans le présent document, les termes «catégorie», «type» et/ou «élément» sont parfois associés au
terme «(aliment)» pour une meilleure compréhension. Cependant, le terme «(aliment)» peut être remplacé par
«(aliment pour animaux)» et par les autres secteurs de la chaîne alimentaire tels que mentionnés à l’Article 1.
L’ISO 16140-6 est quelque peu différente des autres parties de la série ISO 16140 car elle concerne une
situation très spécifique dans laquelle seul le mode opératoire de confirmation d’une méthode doit
être validé [par exemple, la confirmation biochimique des Enterobacteriaceae (voir l’ISO 21528-2)].
Le mode opératoire de confirmation modifie un résultat suspecté (présomptif) en un résultat positif
confirmé. La validation des méthodes alternatives de typage (par exemple, sérotypage de Salmonella)
est également couverte par l’ISO 16140-6. L’étude de validation de l’ISO 16140-6 définit clairement la ou
les gélose(s) sélective(s) à partir de laquelle/desquelles les souches peuvent être confirmées en utilisant
la méthode alternative de confirmation. Lorsque la méthode alternative de confirmation est validée,
elle ne peut être appliquée que si les souches sont cultivées sur une gélose utilisée et jugée acceptable
lors de l’étude de validation. La Figure 2 illustre les situations dans lesquelles une méthode alternative
de confirmation validée conformément à l’ISO 16140-6 peut être appliquée (voir le texte dans les cases).
© ISO 2020 – Tous droits réservés vii

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Figure 2 — Utilisation de méthodes alternatives de confirmation (voir l’ISO 16140-6)
EXEMPLE Un exemple d’application d’une méthode alternative de confirmation validée est donné ci-après.
Une méthode alternative de confirmation fondée sur un ELISA a été validée (conformément à
l’ISO 16140-6) pour remplacer la confirmation biochimique de Salmonella tel qu’il est décrit dans
l’ISO 6579-1. Lors de l’étude de validation, la gélose XLD (gélose obligatoire conformément à l’ISO 6579-1)
ainsi que la gélose BGA et une gélose chromogène spécifiée (deux géloses facultatives pour le deuxième
ensemencement conformément à l’ISO 6579-1) ont été utilisées pour commencer la confirmation. La
méthode de confirmation validée peut être utilisée pour remplacer la confirmation biochimique dans
les conditions suivantes:
— par des laboratoires utilisant l’ISO 6579-1; ou
— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée de l’ISO 16140-2 faisant référence à
l’ISO 6579-1 pour la confirmation; ou
— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée de l’ISO 16140-2 qui commence la
confirmation avec la gélose XLD et/ou la gélose BGA et/ou la gélose chromogène spécifiée.
La méthode de confirmation validée ne peut pas être utilisée dans les conditions suivantes:
— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 faisant uniquement
référence à des géloses autres que celles incluses dans la validation pour commencer la confirmation
(par exemple, la gélose Hektoen et la gélose SS uniquement); ou
— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée de l’ISO 16140-2 faisant uniquement
référence à un mode opératoire de confirmation ne nécessitant pas d’isolement sur gélose.
0.2 Protocoles de validation dans la série ISO 16140
Une étude de validation interlaboratoires, conformément à l’ISO 16140-2, requiert au moins
huit laboratoires pour les méthodes quantitatives et dix laboratoires pour les méthodes qualitatives.
L’ISO 16140-5 est destinée à être utilisée lors d’études interlaboratoires comprenant quatre à
sept laboratoires pour les méthodes quantitatives et quatre à neuf laboratoires pour les méthodes
qualitatives. L’ISO 16140-5 ne peut être utilisée que pour des méthodes non commerciales. Le Tableau 1
donne une vue d’ensemble des différents protocoles.
viii © ISO 2020 – Tous droits réservés

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Tableau 1 — Vue d’ensemble des différents protocoles de validation décrits dans la série
ISO 16140
Nombre de laboratoires
Avec méthode de référence Sans méthode de référence
participants
Le présent document: Le présent document:
— factorielle (voir en 5.1.1 et 5.2.1), — factorielle (voir en 5.1.2 et 5.2.2)
1 ou ou
— conventionnelle (voir en 6.1.1 et — conventionnelle (voir en 6.1.2 et
6.2.1) 6.2.2)
ISO 16140-5: pour les méthodes
4 à 7 (méthode quantitative)/ ISO 16140-5: pour les méthodes non
quantitatives non commerciales
4 à 9 (méthode qualitative) commerciales uniquement
uniquement
≥ 8 (méthode quantitative)/ ISO 16140-2: pour la partie de l’étude
Non applicable
≥ 10 (méthode qualitative) interlaboratoires
L’objectif du présent document est d’évaluer la performance des méthodes de détection ou de

quantification dans un seul laboratoire, généralement dans plusieurs catégories (d’aliments) et types
(d’aliments). La validation dans un seul laboratoire des méthodes alternatives pour la confirmation
microbiologique et le typage peut également être effectuée dans certaines conditions: les principes
généraux sont les mêmes que ceux décrits dans l’ISO 16140-6 pour la validation des méthodes
alternatives (commerciales) pour la confirmation microbiologique et le typage (excepté qu’il n’y a pas
d’étude interlaboratoires). Des informations plus détaillées sont données à l’Annexe G.
Les protocoles du présent document valident la méthode uniquement pour le laboratoire concerné. Ces
protocoles ne permettent pas sa généralisation à d’autres laboratoires. Cependant, il est possible de
l’étendre à d’autres laboratoires si le présent document est utilisé comme première phase de validation
d’une méthode de référence, qui doit être suivie d’une étude interlaboratoires telle que décrite dans
l’ISO 17468.
Si une méthode de référence est disponible, la validation d’une méthode est effectuée en comparant la
méthode alternative avec la méthode de référence. Cela permet d’inclure dans le processus de validation
les échantillons naturellement contaminés et donne ainsi une image plus réaliste de la performance
de la méthode. Si aucune méthode de référence n’est disponible, le processus de validation repose
uniquement sur des échantillons dont les niveaux de contamination sont connus. Le présent document
décrit les protocoles applicables dans les deux cas.
Les principes généraux applicables aux validations dans un seul laboratoire des méthodes de détection
et de quantification sont les mêmes que ceux décrits dans l’ISO 16140-2 pour la validation de méthodes
alternatives (commerciales) par rapport à une méthode de référence. Le présent document ne peut
pas être utilisé sans l’ISO 16140-1 ou l’ISO 16140-2, car de nombreuses définitions et de nombreux
modes opératoires sont donnés dans ces Normes internationales. Outre les paramètres de validation
décrits dans l’ISO 16140-2, le présent document spécifie le calcul de la répétabilité interne et de la
reproductibilité interne. Il est inutile de calculer ces paramètres si une étude interlaboratoires doit
être effectuée après la validation dans un seul laboratoire (c’est-à-dire, si la validation dans un seul
laboratoire n’est que la première phase de la validation). La fiabilité des paramètres de performance
obtenus avec le présent document est comparable à l’ISO 16140-2. Cela signifie également que la charge
de travail associée aux protocoles techniques du laboratoire est comparable à l’étude comparative des
méthodes de l’ISO 16140-2.
Le présent document fournit deux stratégies de validation dans un seul laboratoire des méthodes de
détection et de quantification. La première stratégie repose sur une approche factorielle alors que la
seconde stratégie utilise l’approche conventionnelle extraite des protocoles de l’ISO 16140-2. En outre,
les protocoles de détermination de la reproductibilité interne pour les méthodes quantitatives sont
décrits.
Les avantages de l’utilisation d’une approche factorielle par rapport à l’approche conventionnelle sont
qu’elle tient compte des conditions spécifiques que le laboratoire rencontre pendant les essais de routine
et qu’elle fournit plus d’informations sur les facteurs (techniciens, milieux de culture, etc.) variant dans
le laboratoire pour des matrices (d’aliments) appropriées, tout en utilisant moins d’échantillons pour
© ISO 2020 – Tous droits réservés ix

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

évaluer la performance de la méthode. L’approche factorielle permet d’évaluer la fidélité des méthodes
quantitatives. Elle permet d’obtenir des paramètres de validation des méthodes dans un seul laboratoire
fiables et représentatifs, notamment l’écart-type de reproductibilité interne, les valeurs LOD50 ou
RLOD, car elle fournit des informations sur la variabilité de ces valeurs dans différentes conditions de
mesure. L’approche factorielle requiert moins de résultats d’essai pour obtenir des niveaux de fiabilité
similaires ou supérieurs à ceux obtenus avec l’approche conventionnelle.
x © ISO 2020 – Tous droits réservés

Client : SEAAL
NORME INTERNATIONALE ISO 16140-4:2020(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des

méthodes —
Partie 4:
Protocole pour la validation de méthodes dans un seul
laboratoire
1 Domaine d’application
Le présent document établit les principes généraux ainsi que les protocoles techniques pour la validation
dans un seul laboratoire des méthodes applicables à la microbiologie de la chaîne alimentaire. Les
protocoles du présent document valident la méthode uniquement pour le laboratoire effectuant l’étude.
Le présent document est applicable à la validation dans un seul laboratoire de:
— méthodes utilisées pour l’analyse (détection ou quantification) de micro-organismes présents dans:
— les produits destinés à la consommation humaine;
— les produits destinés à l’alimentation animale;
— les échantillons environnementaux dans les domaines de la production et de la manutention de
produits alimentaires;
— les échantillons au stade de la production primaire;
— méthodes de confirmation ou de typage de micro-organismes. Cette validation remplacera
uniquement le mode opératoire de confirmation ou de typage d’une méthode spécifiée (voir
l’Annexe G).
Le présent document est notamment applicable aux bactéries et aux champignons. Certains articles
peuvent être applicables à d’autres (micro-)organismes ou à leurs métabolites, qui doivent être
déterminés au cas par cas.
La validation dans un seul laboratoire est requise si une validation interlaboratoires conformément à
l’ISO 16140-2 n’est pas appropriée. Les applications possibles sont les suivantes:
— validation d’une méthode interne;
— étude d’évaluation de méthode lors du processus de validation d’une méthode de référence
conformément à l’ISO 17468;
— extension du domaine d’application d’une méthode validée de l’ISO 16140-2, par exemple extension
de catégorie ou taille de la prise d’essai;
— modifications de méthodes existantes.
La validation dans un seul laboratoire est la deuxième étape de la normalisation d’une méthode de
référence (voir l’ISO 17468). Elle est uniquement applicable aux méthodes qui sont intégralement
spécifiées par rapport à tous les paramètres pertinents (notamment les tolérances sur les températures
et les spécifications sur les milieux de culture) et qui ont déjà été optimisées.
© ISO 2020 – Tous droits réservés 1

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 16140-1:2016, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 1:
Vocabulaire
ISO 16140-2:2016, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 2: Protocole
pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par rapport à une méthode de référence
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 16140-1 ainsi que les
suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https://w ww.iso.org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http://w ww.electropedia.org/
3.1
bloc
groupe de configurations (3.12) qui doivent être effectuées en parallèle ou dans un court laps de temps,
et qui sont utilisées pour les mêmes échantillons
EXEMPLE Bloc = configurations effectuées en parallèle =
technicien «a» + milieu de culture «b» + température «a» + condition d’incubation «a»
et
technicien «b» + milieu de culture «a» + température «b» + condition d’incubation «b».
Note 1 à l'article: à l’article Cette définition repose sur la façon dont l’ISO 3534-3:2013, 3.1.25, définit le«bloc».
Dans l’ISO 3534-3:2013, 3.1.25, la définition est plus générale car elle définit un bloc comme un groupement
d’unités expérimentales qui sont homogènes dans un certain sens. La signification statistique est la même.
3.2
facteur
paramètre qualitatif ou quantitatif de la méthode, qui peut être modifié à deux niveaux ou plus, dans les
limites de la méthode spécifiée
EXEMPLE Technicien.
Note 1 à l'article: à l’article Dans le présent document, seuls les facteurs conformes au protocole de la méthode
sont pris en compte.
3.3
niveau de facteur
valeur des facteurs (3.2) du plan d’expérience
EXEMPLE Technicien «a», technicien «b», etc.
2 © ISO 2020 – Tous droits réservés

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Note 1 à l'article: à l’article Dans le présent document, chaque facteur est modifié à deux niveaux de facteurs:
«a» et «b».
Note 2 à l'article: à l’article Cette définition repose sur la façon dont l’ISO 3534-3:2013, 3.1.12, définit le «niveau de
facteur». Dans l’ISO 3534-3:2013, 3.1.12, la définition est plus générale, mais la signification statistique est la même.
3.4
répétabilité interne
fidélité de mesure dans un ensemble de conditions de répétabilité interne dans un laboratoire spécifique
Note 1 à l'article: à l’article Les conditions de répétabilité interne comprennent le même mode opératoire de
mesure, les mêmes techniciens, le même système de mesure, les mêmes conditions de fonctionnement, le même
lieu, et des mesurages répétés sur des objets identiques ou similaires sur une courte période de temps dans un
laboratoire particulier.
3.5
reproductibilité interne
fidélité de mesure dans un ensemble de conditions de reproductibilité interne dans un laboratoire
spécifique
Note 1 à l'article: à l’article Les conditions de reproductibilité interne comprennent différents techniciens,
différentes conditions de fonctionnement et des mesurages répétés sur des objets identiques ou similaires sur
une plus longue période de temps dans un laboratoire particulier.
3.6
niveau de détection
LODx
<méthodes qualitatives> concentration en analyte mesurée, obtenue par un mode opératoire de mesure
donné, dont la probabilité de détection (3.9) est x
EXEMPLE LOD50 est le niveau de détection auquel 50 % des essais donnent un résultat positif.
Note 1 à l'article: à l’article Le terme «niveau de détection» est utilisé pour les méthodes qualitatives en
microbiologie sur la base d’analyses de réplicats avec trois différents niveaux de contamination de l’analyte cible
dans une matrice soumise à essai. Les réplicats sont analysés et le nombre de résultats positifs est consigné (par
exemple, 20 %, 70 % et 100 %) respectivement à chaque niveau de contamination. Ces données sont ensuite
utilisées pour déterminer le nombre de cellules qui donnerait 50 % de résultats positifs avec un modèle linéaire
généralisé (voir l’ISO 16140-2). Cela diffère du mode opératoire utilisé pour les méthodes chimiques et physiques
pour lesquelles une «limite de détection» est définie comme la quantité minimale d’un analyte qui peut être
distinguée de l’absence de cet analyte avec un niveau de confiance déclaré.
[SOURCE: ISO 16140‑1:2016, 2.35, modifiée — La Note 1 à l’article a été légèrement modifiée.]

3.7
limite de quantification
LOQ
limite de détermination
<méthodes quantitatives> plus faible concentration en analyte pouvant être quantifiée avec un niveau
acceptable de fidélité et de justesse dans les conditions de l’essai
[SOURCE: ISO 16140‑1:2016, 2.36]
3.8
plan orthogonal
plan factoriel, dans lequel pour chaque paire de facteurs (3.2), chaque combinaison de niveaux de facteur
(3.3) apparaît autant de fois parmi les niveaux de facteur possibles
Note 1 à l'article: à l’article Cette définition repose sur la façon dont l’ISO 3534-3:2013, 3.1.31, définit
l’«arrangement orthogonal», mais pour le «plan orthogonal», une définition plus générale et plus théorique est
utilisée.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

3.9
probabilité de détection
POD
proportion de résultats analytiques positifs pour une méthode qualitative sur une matrice donnée à
une concentration en analyte ou à un niveau d’analyte donné
Note 1 à l'article: à l’article Pour les méthodes qualitatives, la POD représente la probabilité de détection.
[SOURCE: ISO 16140‑1:2016, 2.53, modifiée — La Note 1 à l’article a été ajoutée.]

3.10
niveau de détection relatif
RLOD
niveau de détection (3.6) à P = 0,50 (LOD50) de la méthode alternative (commerciale) divisé par le niveau
de détection à P = 0,50 (LOD50) de la méthode de référence
Note 1 à l'article: à l’article Pour les besoins de l’acceptation de la méthode alternative, le RLOD obtenu est
comparé avec la limite d’acceptabilité pour vérifier sa conformité.
[SOURCE: ISO 16140‑1:2016, 2.61]

3.11
validation de méthodes dans un seul laboratoire
validation de méthodes internes
établissement des caractéristiques de performance d’une méthode pour un laboratoire particulier dans
lequel la validation est effectuée
3.12
configuration
combinaison de niveaux de facteurs (3.3)
EXEMPLE Technicien «a» + milieu de culture «b» + température «a» + etc.
Note 1 à l'article: à l’article Ces conditions peuvent être décrites par la combinaison des niveaux de facteurs
modifiés lors de l’étude.
4 Principes généraux de la validation dans un seul laboratoire de méthodes de

détection et de quantification
4.1 Généralités
Une étude de validation dans un seul laboratoire de méthodes de détection ou de quantification est
la première étape dans le cadre d’une validation générale de méthodes et est nécessaire pour évaluer
la performance de la méthode sur plusieurs types (d’aliments) et éléments (d’aliments). Dans le cadre
d’une validation générale de méthodes, la seconde étape est une étude interlaboratoires visant à évaluer
la performance de la méthode dans les laboratoires.
Une étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire sert à démontrer la performance de
la méthode dans le laboratoire qui a réalisé l’étude. Les résultats sont valides uniquement pour ce
laboratoire particulier.
NOTE L’Annexe G énonce les principes généraux applicables à la validation dans un seul laboratoire de
méthodes alternatives pour la confirmation microbiologique et le typage.
Le présent document décrit deux approches applicables à la validation de méthodes dans un seul
laboratoire:
— une approche factorielle, avec:
— caractéristiques de performance extraites de l’ISO 16140-2;

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

— plan d’étude factoriel orthogonal (voir l’ISO 3534-3);

— davantage de configurations de routine couvertes et moins d’essais que l’approche
conventionnelle;
— approche conventionnelle, avec:
— caractéristiques de la performance extraites de l’ISO 16140-2;
— mode opératoire par étapes;
— plan d’étude extrait de l’ISO 16140-2.
Les protocoles de validation dépendent de la nature qualitative ou quantitative de la méthode, et du fait
qu’une approche factorielle ou conventionnelle est choisie. L’approche de validation par plan factoriel
dans un seul laboratoire ne peut être utilisée que pour une méthode intégralement développée et
optimisée. Une approche conventionnelle étudie la méthode au niveau d’une configuration spécifique
(c’est-à-dire un groupe de conditions spécifiques sous lesquelles la méthode est effectuée). Les
principales différences applicables à l’approche de validation dans un seul laboratoire abordée par le
présent document sont le nombre d’éléments (d’aliments) différents et le nombre d’essais requis pour
prouver que la méthode fonctionne correctement. Il est possible de valider des méthodes, avec et sans
méthode de référence, à l’aide des protocoles décrits.
Le domaine d’application du protocole de validation doit être déterminé au début du processus, par
exemple: validation de méthodes internes, deuxième étape du processus de validation conformément à
l’ISO 17468, extension du domaine d’application d’une méthode validée de l’ISO 16140-2, modification
de méthodes existantes.
Pour les méthodes comprenant une étape de détection par PCR, une évaluation des caractéristiques de
performance pour l’étape de détection par PCR est décrite dans l’ISO 22118. Il convient de commencer
par une évaluation des paramètres de performance pertinents de l’étape de PCR (selon l’ISO 22118),
puis de poursuivre par une validation du mode opératoire d’analyse complet (par exemple, selon le
présent document) pour s’assurer que l’organisme cible présent dans les échantillons soumis à essai est
détecté avec fiabilité.
Le choix des catégories (d’aliments) et des types (d’aliments) utilisés dans l’étude de validation doit
être effectué conformément à l’ISO 16140-2:2016, 5.1.3.1. Lors de l’étude de validation de méthodes
dans un seul laboratoire, il est recommandé de tenir compte également de chaque catégorie (d’aliment)
correspondant à la méthode d’essai. Des recommandations sur le choix des catégories (d’aliments) et
des types (d’aliments) sont données dans l’ISO 16140-2:2016, Annexe A.
Le domaine d’application de l’étude de validation, les résultats (tableaux et calculs) des différentes
parties et l’interprétation des résultats, y compris des résultats divergents, doivent être inclus dans un
rapport d’étude de validation.
4.2 Principes de l’approche factorielle

Dans une approche factorielle, une variation systématique des facteurs est utilisée pour étudier la
performance de la méthode dans une gamme définie de conditions généralement rencontrées lors de
l’application de routine de la méthode. Les facteurs types sont le technicien ou la conservation des
échantillons, qui peuvent même varier dans un seul et même laboratoire utilisant un mode opératoire
particulier. En étudiant la méthode sous différentes conditions en même temps, l’approche factorielle
permet de généraliser la validation à des conditions généralement rencontrées en laboratoire et n’est
pas simplement limitée à une seule condition.
Il est nécessaire de choisir quatre facteurs principaux supposés refléter la variation type des conditions
rencontrées lors de l’application de routine de la méthode. Il est recommandé d’effectuer une analyse de
risque du flux analytique pour choisir les facteurs. Des exemples de facteurs sont donnés à l’Annexe A.
La variation systématique des facteurs assure que leur impact combiné sur les paramètres de
performance généraux, notamment la fidélité et la sensibilité, peut être déduit. Cela est l’inverse

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

d’une étude factorielle de robustesse, dans laquelle l’objectif principal est de détecter les principaux
paramètres spécifiques des méthodes, et ainsi d’optimiser la performance de la méthode. La
compatibilité entre différents niveaux de facteurs et l’impact sur la fidélité des effets non significatifs
ne sont pas pris en compte dans ce type d’étude.
Comparée à l’approche conventionnelle décrite dans l’ISO 16140-2, l’approche factorielle exige moins
d’éléments (d’aliments) et moins d’essais mais permet de déterminer les paramètres de validation avec
fiabilité.
4.3 Principes de l’approche conventionnelle

L’approche conventionnelle suit principalement l’ISO 16140-2. Elle s’effectue en plusieurs étapes
et ne fait pas varier les facteurs (voir le Tableau 2). L’approche conventionnelle exige d’analyser plus
d’éléments (d’aliments) et de prises d’essai que l’approche factorielle.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Tableau 2 — Nombre d’essais requis pour une validation de méthodes par catégorie (d’aliment)
par l’approche factorielle et l’approche conventionnelle
Approche factorielle Approche conventionnelle
Méthode
qualitative par
A R A R
rapport à une
méthode de Étude factorielle 78 78 Étude de sensibilité 60 60
référence (sensibilité + RLOD)
Étude d’inclusivité/ 80 0 Étude RLOD 30 30
exclusivitéa
Étude d’inclusivité/ 80 0
exclusivitéa
Nombre total d’essais 236 Nombre total d’essais 260
(voir en 5.1.1) (voir en 6.1.1)
Méthode
qualitative
Étude factorielle 256 Spécificité 20
sans méthode
(sensibilité + LOD50)
de référence
Étude d’inclusivité/ 80 Étude LOD50 (LOD50 + 360
exclusivitéa sensibilité)
Nombre total d’essais 336 Étude d’inclusivité/ 80
exclusivitéa
Nombre total d’essais 460
(voir en 5.1.2) (voir en 6.1.2)
Méthode
quantitative
A R A R
par rapport à
une méthode Étude factorielle 48 48 Étude de justesse relative 15 15
de référence (justesse relative +
profil d’exactitude +
fidélité interne)
Étude d’inclusivité/ 80 0 Étude du profil d’exactitude 30 30
exclusivitéa
Nombre total d’essais 176 Étude de fidélité interne 40 5
Étude d’inclusivité/ 80 0
exclusivitéa
(voir en 5.2.1) (sans étude LOQ) (voir en 6.2.1)
Méthode
quantitative
Étude factorielle 48 Étude de justesse relative 15
sans méthode
(justesse relative +
de référence
profil d’exactitude +
fidélité interne)
Étude d’inclusivité/ 80 Étude du profil d’exactitude 30
exclusivitéa
Nombre total d’essais 128 Étude de fidélité interne 40
(voir en 5.2.2) Étude d’inclusivité/ 80
exclusivitéa
(sans étude LOQ) (voir en 6.2.2)
Légende
A: nombre d’essais de la méthode alternative
R: nombre d’essais de la méthode de référence
a L’étude d’inclusivité/exclusivité exige 80 souches de culture (130 pour Salmonella) et est effectuée une seule fois pour
toutes les approches, quel que soit le nombre de catégories (d’aliments).

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

5 Protocole technique de validation — Approche factorielle
5.1 Méthodes qualitatives
5.1.1 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire par rapport à une méthode de
référence
5.1.1.1 Considérations générales
La validation par plan factoriel dans un seul laboratoire ne peut être utilisée que pour une méthode
intégralement développée et optimisée. L’étude de validation comprend deux parties:
— une étude comparative orthogonale factorielle (sensibilité et RLOD);
— une étude d’inclusivité/d’exclusivité de la méthode alternative.
Voir l’Annexe D pour un exemple détaillé.
5.1.1.2 Étude comparative orthogonale factorielle des méthodes
5.1.1.2.1 Sélection des échantillons
L’étude comparative des méthodes compare les résultats obtenus par la méthode de référence avec
ceux de la méthode alternative. L’étude est effectuée en utilisant des échantillons naturellement et/ou
artificiellement contaminés: en général, seuls des échantillons artificiellement contaminés sont utilisés.
Les exigences sont les suivantes:
— douze éléments (d’aliments) par catégorie (d’aliment) doivent être choisis: trois types (d’aliments)
par catégorie (d’aliment) doivent être choisis et quatre éléments (d’aliments) par type (d’élément)
doivent être choisis. Il convient que les éléments (d’aliments) soient représentatifs du type (d’aliment)
correspondant;
— la sélection des éléments (d’aliments) doit tenir compte: du microbiote annexe et des facteurs de
production alimentaire tels que la chaleur, le pH, la congélation, la fumaison, le séchage (faible
aw); des conditions de la matrice telles que la valeur de pH, la valeur aw, les conditions aérobies/
anaérobies; des exigences spéciales de préparation des échantillons, telles que la forte teneur en
matières grasses ou la présence d’inhibiteurs, conformément à la série ISO 6887;
— chaque élément (d’aliment) doit être contaminé à au moins deux niveaux, à savoir au moins les
suivants:
— un niveau faible L1: il convient que le niveau faible permette d’obtenir des résultats positifs
partiels pour la méthode de référence (il convient que les résultats positifs partiels au niveau
faible soient compris entre 25 % et 75 % du nombre de prises d’essai soumises à essai).
Idéalement, il convient que le niveau faible soit proche du niveau de détection théorique
de 0,7 ufc/prise d’essai (par exemple, 0,5 ufc/prise d’essai à 0,9 ufc/prise d’essai);
— un niveau élevé L2: au niveau élevé (par exemple, 5 ufc/prise d’essai à 10 ufc/prise d’essai), 100 %
de résultats positifs sont attendus;
— les quatre éléments (d’aliments) de chaque type (d’aliment) sont attribués dans un ordre aléatoire à
quatre blocs différents. Chaque bloc doit contenir trois éléments (d’aliments), chacun à deux niveaux
de contamination, provenant de trois types (d’aliments);
— utiliser une souche différente par bloc et/ou la même souche soumise à différents facteurs de stress
[par exemple, températures excessives, traitement à l’acide ou chloration, selon la pertinence du
type (d’aliment)]. S’il n’est pas possible d’utiliser différentes souches pour chaque bloc, le laboratoire
doit fournir une explication;

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

— les éléments à prendre en compte lors de la sélection des souches sont indiqués dans l’ISO 16140-2:2016,
Annexe E;
— six éléments (d’aliments) sur les douze éléments (d’aliments) différents doivent être soumis à essai
au niveau zéro L0 (blanc, c’est-à-dire pas d’organisme cible dans les prises d’essai);
— la taille de la prise d’essai doit être standardisée pour chaque étude et il convient qu’elle soit
identique pour les deux méthodes, si possible. Si la taille de la prise d’essai permise par la méthode
alternative est différente de celle de la méthode de référence, les niveaux de contamination des micro-
organismes cibles doivent être ajustés en conséquence de façon que le niveau de contamination final
(ufc/prise d’essai) soit identique pour les deux;
— les protocoles généraux de contamination artificielle des échantillons sont donnés dans
l’ISO 16140-2:2016, Annexe C;
— la contamination artificielle des échantillons doit être finalisée avant de commencer les analyses.
5.1.1.2.2 Sélection des facteurs de la méthode
Il convient de prendre l’avis des experts avant de choisir les facteurs appropriés à l’étude en
particulier. Par exemple, les conditions optimales sont spécifiées dans chaque méthode (par exemple,
la température et la durée d’incubation à 37 °C et 24 h), et celles-ci donneront les meilleurs résultats.
Toutefois, les gammes situées autour de ces valeurs, mais qui donnent encore des conditions acceptables
(par exemple, pendant 24 h ± 1 h), sont autorisées et il convient que le plan d’étude soumette à essai les
extrêmes de ces gammes (par exemple, incuber les échantillons pendant 23 h ou 25 h). Les conditions
de fonctionnement acceptables pour le matériel sont décrites dans l’ISO 7218.
Des facteurs de la méthode pertinents, plus difficiles à contrôler (par exemple les techniciens, les
milieux et la température d’incubation) doivent être choisis et modifiés systématiquement pour
pouvoir évaluer l’exactitude dans des conditions de routine du laboratoire spécifique. Du choix de ces
facteurs et des niveaux de facteurs dépend la fiabilité du résultat de validation. Ils doivent refléter la
variation en laboratoire dans des conditions de routine et il convient qu’ils couvrent les principaux
aspects de la méthode, notamment la préparation des échantillons, le stockage des échantillons, le
technicien de laboratoire, le matériel de laboratoire ou le microbiote annexe. D’autres influences telles
que l’atmosphère et le stress peuvent également être prises en compte.
Quatre facteurs pertinents doivent être modifiés simultanément, chacun sur deux niveaux.
Pour les méthodes applicables aux micro-organismes cultivables, les facteurs et les niveaux de facteurs
indiqués ci-dessous doivent être pris en compte. Les «techniciens» et les «milieux de culture» ont le
plus grand impact et doivent être inclus dans toutes les études, comme suit:
— techniciens: les essais doivent être effectués dans le laboratoire par deux techniciens de façon
indépendante;
— milieux de culture: utiliser des milieux de culture provenant de deux fabricants différents, ou deux
lots différents de milieux de culture, ou des milieux préalablement préparés contre des milieux
préparés à partir de milieux déshydratés. Les choix dépendent des conditions normales d’utilisation
des milieux dans le laboratoire. Par exemple, deux lots différents peuvent être utilisés si un seul
produit est employé dans le laboratoire, même si le produit est disponible auprès de fabricants
différents.
Deux autres facteurs doivent être pris en compte. Une liste non exhaustive de facteurs potentiels est
fournie à l’Annexe A. Si possible, un facteur de deux des principaux groupes doit être choisi.
Les facteurs sont étudiés simultanément à l’aide du plan d’étude décrit en 5.1.1.2.3.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

5.1.1.2.3 Plan d’expérience
Les douze éléments (d’aliments) de trois types (d’aliments) doivent être attribués à quatre blocs: ainsi,
chaque bloc doit inclure un élément (d’aliment) de chaque type (d’aliment). Chaque élément (d’aliment),
contaminé au niveau fractionnel et au niveau élevé, est analysé sous deux configurations différentes
(combinaisons de niveaux de facteurs). Chaque configuration est une combinaison de niveaux de quatre
facteurs, par exemple les éléments (d’aliments) 1 à 3 sont analysés sous la configuration 1: technicien
«a», microbiote annexe «b», milieu de culture «a», condition d’incubation «a» (voir le Tableau 3). De
plus, six éléments (d’aliments) choisis doivent être soumis à essai au niveau zéro L0 (blanc).
Les essais doivent être effectués comme suit:
— le niveau zéro L0 (blanc) doit être soumis à essai en utilisant 1 réplicat de chacun des 6 éléments
(d’aliments) choisis représentant les 3 types (d’aliments) (6 essais);
NOTE 1 Les échantillons du niveau zéro L0 sont soumis à essai pour prouver qu’il n’y a pas de faux positifs
[réactivité croisée par exemple avec la matrice (d’aliment)]. Par conséquent, le choix des configurations
utilisées pour soumettre à essai les échantillons L0 n’est pas important, ce qui signifie que n’importe quelle
configuration peut être utilisée. Tous les éléments d’aliments utilisés (les 12 et pas seulement les 6 utilisés
pour le niveau zéro) sont examinés afin qu’ils ne contiennent pas l’organisme cible.
— le niveau fractionnel L1 doit être soumis à essai en utilisant 2 configurations × 2 réplicats pour
chacun des 12 éléments (d’aliments) conformément au plan factoriel présenté dans le Tableau 3
(48 essais);
— le niveau élevé L2 doit être soumis à essai en utilisant 2 configurations × 1 réplicat pour chacun
des 12 éléments (d’aliments) conformément au plan factoriel présenté dans le Tableau 3 (24 essais).
Ainsi, 78 essais individuels doivent être effectués au total par catégorie (d’aliment) étudiée et par
méthode d’essai. 156 essais individuels doivent donc être effectués pour les deux méthodes (de
référence et alternative).
NOTE 2 La deuxième configuration de chaque bloc correspond à la première configuration avec tous les
niveaux de facteurs permutés. La deuxième configuration reflète donc la déviation maximale par rapport à la
première configuration.
NOTE 3 Le plan factoriel avec blocs permet non seulement de détecter les différents effets de facteurs, mais
également les interactions entre les facteurs.
NOTE 4 À titre d’illustration, prendre le cas où tous les résultats se situaient dans la gamme prévue, sauf les
résultats de la configuration 3 avec la combinaison des niveaux de facteurs a-a-a-b et de la configuration 8 avec
la combinaison des niveaux de facteurs b-a-a-a. Cela signifie que le microbiote annexe «a» provoque un effet
indésirable pour le milieu de culture «a» car c’est ce que les deux configurations ont en commun. Dans ce cas, le
laboratoire effectuerait une analyse des causes pour fournir une explication à propos des résultats observés.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Tableau 3 — Plan d’étude orthogonal factoriel pour les méthodes qualitatives avec méthode de
référence; par catégorie (d’aliment)
12 éléments (d’aliments) 6 sur les 12 éléments (d’aliments) au 6 sur les 12 éléments (d’aliments) sous
de 3 types (d’aliments) niveau zéro n’importe quelle configuration
dans un ordre aléa- Les 12 éléments (d’aliments) au niveau
toire, chaque élément 1à3 4à6 7à9 10 à 12
fractionnel
(d’aliment) ayant des
niveaux de contamina- Les 12 éléments (d’aliments) au niveau
1à3 4à6 7à9 10 à 12
tion connus élevé
Bloc 1 Bloc 2 Bloc 3 Bloc 4

Configuration 1 2 3 4 5 6 7 8
Facteur 1 technicien a b a b a b a b
Facteur 2 milieu de culture b a a b a b b a
Facteur 3 par exemple microbiote annexe (stockage) a b a b b a b a
Facteur 4 par exemple condition d’incubation a b b a a b b a
NOTE 1 Répartition des 12 éléments (d’aliments) dans 4 blocs, chacun avec 2 combinaisons différentes de niveaux de
facteurs (configurations). Les 12 éléments (d’aliments) sont contaminés à 2 niveaux: fractionnel (2 réplicats) et élevé (1
réplicat).
NOTE 2 Nombre d’essais: 12 éléments (d’aliments) × ((2+1) × réplicats) × 2 configurations × 2 méthodes = 144 essais.
NOTE 3 En plus de 144 essais: 6 éléments (d’aliments) × 2 réplicats × 2 méthodes = 12 essais pour le niveau zéro L0 (blanc).
NOTE 4 Nombre total d’essais = 144 + 12 = 156.
La Figure 3 donne une vue d’ensemble du plan relatif au technicien «a».
Figure 3 — Plan relatif au technicien «a»
Il est nécessaire de confirmer le résultat (final) de la méthode alternative conformément à

l’ISO 16140-2:2016, 5.1.3.3 afin d’éviter les faux positifs et de confirmer les vrais positifs.
L’Annexe D donne un exemple d’étude de validation des méthodes dans un seul laboratoire pour une
méthode qualitative en fonction d’une méthode de référence.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

5.1.1.3 Calcul et interprétation de la sensibilité
Les calculs fondés sur les résultats de l’étude comparative factorielle au niveau fractionnel L1 doivent
être effectués conformément à l’ISO 16140-2:2016, 5.1.3.4. Tous les calculs doivent être réalisés:
— séparément, pour chaque catégorie (d’aliment) [tous les types (d’aliments)];
— séparément, pour chaque type (d’aliment).
Les résultats obtenus peuvent être récapitulés comme présenté dans le Tableau 4.
Les résultats et les calculs obtenus pour les catégories (d’aliments) sont utilisés pour l’évaluation en
fonction des critères d’acceptation (voir l’Article 7). Les résultats et les calculs obtenus pour les types
(d’aliments) peuvent uniquement être utilisés comme valeurs indicatives et peuvent également être
utilisés dans une analyse des causes.
Pour visualiser les effets d’interaction factoriels, les calculs peuvent également être effectués pour des
niveaux de facteurs spécifiques, par exemple pour tous les résultats du milieu de culture «a», sur les
types (d’aliments) et dans les catégories (d’aliments).
Pour visualiser les effets factoriels, examiner:
a) si les résultats pour 2 des 8 configurations ne se situent pas dans la gamme prévue;
b) quels niveaux de facteurs ces deux configurations partagent.
Par exemple, les configurations 2 et 5 partagent les niveaux de facteurs du milieu de culture (niveau «a»)
et du microbiote annexe (niveau «b»), ce qui signifie que les résultats imprévus dans les configurations 2
et 5 indiquent qu’il existe un effet d’interaction entre le milieu de culture et le microbiote annexe.
Tableau 4 — Résumé des résultats obtenus avec la méthode de référence et la méthode

alternative au niveau fractionnel L1 pour chaque catégorie (d’aliment) et chaque type
(d’aliment), d’après le plan d’étude décrit dans le Tableau 3
Catégorie PA NA ND PD FP Na SE(alt) SE(ref) RT b FPRc
Types (d’aliments)
(d’aliment) % % % %
Catégorie 1 Tous les types (d’aliments)
Catégorie 1 Type (d’aliment) A
Catégorie 1 Type (d’aliment) B
Catégorie 1 Type (d’aliment) C
Catégorie 1 Technicien «a» [tous les types
(d’aliments)]
Catégorie 1 Technicien «b» [tous les types
(d’aliments)]
Catégorie 1 Milieu de culture «a» [tous les types
(d’aliments)]
Catégorie 1 Milieu de culture «b» [tous les types
(d’aliments)]
Légende
PA: accord positif, NA: accord négatif, ND: déviation négative, PD: déviation positive, FP: faux positif, N: somme, SE(alt):
sensibilité de la méthode alternative, SE(ref): sensibilité de la méthode de référence, RT: justesse relative, FPR: pourcentage
de faux positifs
a N = NA + PA + PD + ND.
b RT = (PA + NA)/N × 100 %.
c FPR = FP/NA × 100 %.
NOTE Les définitions et l’établissement des paramètres sont donnés dans l’ISO 16140-2:2016, 5.1.3.4.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Tableau 4 (suite)
Catégorie PA NA ND PD FP Na SE(alt) SE(ref) RT b FPRc
Types (d’aliments)
(d’aliment) % % % %
Catégorie 1 Microbiote annexe «a» [tous les types
(d’aliments)]
Catégorie 1 Microbiote annexe «b» [tous les types
(d’aliments)]
Catégorie 1 Condition d’incubation «a» [tous les
types (d’aliments)]
Catégorie 1 Condition d’incubation «b» [tous les
types (d’aliments)]
Catégorie 2 Tous les types (d’aliments)
Catégorie 2 Type (d’aliment) A
Catégorie 2 Type (d’aliment) B
Catégorie 2 Type (d’aliment) C
Catégorie 2 ... (séparément pour chaque niveau de
facteur)
Catégorie x Tous les types (d’aliments)
Catégorie x Type (d’aliment) A
Catégorie x Type (d’aliment) B
Catégorie x Type (d’aliment) C
Catégorie x ... (séparément pour chaque niveau de
facteur)
Légende
de faux positifs
b RT = (PA + NA)/N × 100 %.
c FPR = FP/NA × 100 %.
NOTE Les définitions et l’établissement des paramètres sont donnés dans l’ISO 16140-2:2016, 5.1.3.4.
Calculer la différence, (ND – PD), pour des études de méthodes appariées et non appariées, et la somme,
(ND + PD), pour des études de méthodes appariées. L’explication relative aux études de méthodes
appariées et non appariées est donnée dans l’ISO 16140-2:2016, 5.1.2. Vérifier si la différence et/ou
la somme de PD et ND sont conformes à la limite d’acceptabilité (AL) indiquée dans le Tableau 5. Les
conditions ne sont pas acceptables lorsque la valeur observée est supérieure à l’AL. L’interprétation des
résultats doit être effectuée pour chaque catégorie (d’aliment) et pour toutes les catégories (d’aliments)
utilisées lors de l’étude de validation. Voir l’Annexe D pour un exemple détaillé.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Tableau 5 — Paramètres et valeurs de limite d’acceptabilité (AL) pour des études de méthodes
appariées et non appariées en fonction du nombre de catégories utilisé
Étude de méthodes
Nombre de Étude de méthodes appariées
non appariées
catégories
(NDa – PDb) (ND + PD) (ND – PD)
1 3 6 3
2 4 8 4
3 5 10 5
4 5 12 5
5 5 14 5
6 6 16 6
7 6 18 7
8 6 20 7
a ND = nombre d’échantillons ayant des résultats de déviation négative au niveau
fractionnel L1.
b PD = nombre d’échantillons ayant des résultats de déviation positive au niveau
fractionnel L1.
NOTE Les limites d’acceptabilité (AL) reposent sur des données et sur un consensus
d’experts. Les AL ne reposent pas sur l’analyse statistique des données.
5.1.1.4 Calcul et interprétation du niveau RLOD
Les calculs fondés sur tous les résultats de l’étude comparative factorielle par catégorie (d’aliment)
doivent être effectués conformément à l’ISO 16140-2:2016, 5.1.4.2.
Il convient d’analyser les effets des facteurs individuels à partir des valeurs RLOD calculées pour chaque
niveau de facteur.
NOTE Un programme Excel®1) est disponible pour calculer le RLOD à l’adresse https://standards.iso.org/
iso/16140/-4/ed-1/en.
Pour un facteur d’intérêt spécifique, nommer:

— Y(a) la valeur log10 du RLOD à l’aide de tous les résultats d’essai des quatre configurations sous
lesquelles le facteur est défini au niveau «a»;
— Y(b) la valeur log10 du RLOD à l’aide de tous les résultats d’essai des quatre autres configurations
sous lesquelles le facteur est défini au niveau «b».
Calculer la différence entre ces valeurs log10 du RLOD comme indiqué par la Formule (1):
d = Y ( b ) −Y ( a ) = log10 ( RLOD ( niveau "b" ) ) − log10 ( RLOD ( niveau "a" ) ) (1)
Si cette différence d est inférieure à −0,6 ou supérieure à +0,6, le facteur est considéré comme ayant
une influence importante sur le RLOD. Dans ce cas, on peut en conclure que le niveau LOD50 des deux
niveaux de facteurs diffère de plus de 4:1. Cela peut indiquer un problème avec la méthode alternative
ou la méthode de référence. Effectuer une analyse des causes afin de fournir une explication à propos
des résultats hors gamme. Rejeter la méthode alternative s’il est impossible d’exclure qu’il y a un
problème avec cette méthode.
Le Tableau D.4 fournit un exemple détaillé. D’autres techniques d’analyse sont données dans la
Référence [12].
1) Excel® est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Microsoft et constitue un exemple d’un produit
approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

5.1.1.5 Étude d’inclusivité/exclusivité
Dans l’étude d’inclusivité/exclusivité, les souches cibles et les souches non cibles sont soumises à essai
avec la méthode alternative. L’étude, y compris la sélection et le nombre de souches, doit être effectuée
conformément à l’ISO 16140-2:2016, 5.1.5. Si la validation est une extension de matrice [élément, type ou
catégorie (d’aliment)] d’une méthode déjà validée, aucune étude d’inclusivité/exclusivité supplémentaire
n’est requise. Si le mode opératoire d’enrichissement est remplacé par un autre enrichissement sélectif,
une étude d’inclusivité/exclusivité est requise.
5.1.2 Étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire sans méthode de référence
En l’absence de méthode de référence, la validation de la méthode est légèrement différente du

paragraphe 5.1.1. Au lieu d’une étude comparative reposant sur le niveau RLOD, tous les calculs sont
fondés uniquement sur les valeurs LOD50 correspondant à chaque configuration du plan factoriel.
L’étude est réalisée à l’aide d’échantillons contenant des niveaux de contamination connus et il convient
de dénombrer l’inoculum en utilisant un milieu non sélectif. Le dénombrement doit être effectué
conformément à l’ISO 7218.
5.1.2.2 Étude factorielle
Seize éléments (d’aliments), d’au moins trois types (d’aliments), par catégorie (d’aliment) doivent être
choisis. Les éléments (d’aliments) doivent être choisis conformément aux critères décrits en 5.1.1.2.
Chaque élément (d’aliment) doit être artificiellement contaminé à deux niveaux différents: un niveau
faible (fractionnel) et un niveau élevé de contamination (ISO 16140-2:2016, 5.1.4.1). Un échantillon non
ensemencé (blanc) doit également être préparé pour chaque élément (d’aliment). Les essais doivent être
effectués en réplicats, avec deux réplicats pour le niveau blanc et le niveau élevé, et quatre réplicats
pour le niveau fractionnel.
Chaque élément (d’aliment) est analysé sous deux configurations différentes (= combinaison de niveaux
de quatre facteurs). Ainsi, chacun des seize éléments (d’aliments) est analysé sous deux configurations
avec deux réplicats, à un niveau zéro et un niveau élevé, et avec quatre réplicats, à un niveau faible
(fractionnel). Au total, 256 [16 éléments (d’aliments) × (2 + 4 + 2) réplicats × 2 configurations] essais
sont effectués.
Le plan d’expérience du paragraphe 5.1.1.2 est respecté pour la sélection des facteurs. Le Tableau 6
illustre le plan d’étude orthogonal factoriel pour les méthodes qualitatives sans méthode de référence
applicables à une catégorie (d’aliment).

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Tableau 6 — Plan d’étude orthogonal factoriel pour les méthodes qualitatives sans méthode de
référence; par catégorie (d’aliment)
16 éléments (d’aliments) d’au Les 16 éléments (d’aliments) au
1à4 5à8 9 à 12 13 à 16
moins 3 types (d’aliments) de niveau zéro
1 catégorie (d’aliment), dans un Les 16 éléments (d’aliments) au
ordre aléatoire, chaque élément 1à4 5à8 9 à 12 13 à 16
niveau fractionnel
(d’aliment) ayant des niveaux
de contamination connus: zéro, Les 16 éléments (d’aliments) au
1à4 5à8 9 à 12 13 à 16
fractionnel et élevé niveau élevé
Facteur 3 par exemple microbiote annexe (stockage) a b a b b a b a
Facteur 4 par exemple condition d’incubation a b b a a b b a
NOTE 1 Répartition des 16 éléments (d’aliments) dans 4 blocs, chacun avec 2 combinaisons différentes de niveaux de
facteurs (configurations). Les 16 éléments (d’aliments) ont des niveaux de contamination connus: zéro (2 réplicats),
fractionnel (4 réplicats) et élevé (2 réplicats).
NOTE 2 Nombre d’essais: 16 éléments (d’aliments) × (2 + 4 + 2) réplicats × 2 configurations = 256 essais.
Il convient d’effectuer l’étude de validation avec quatre souches par catégorie (d’aliment). Utiliser une
souche différente par bloc et/ou la même souche soumise à différents facteurs de stress [par exemple,
températures excessives, traitement à l’acide ou chloration, selon la pertinence du type (d’aliment)].
Lorsque différentes catégories sont soumises à essai, il convient idéalement d’utiliser également
différentes souches par catégorie. Cependant, ceci dépendra de la disponibilité des souches.
S’il est impossible d’utiliser différentes souches, pour chaque bloc ou l’ensemble de l’étude, il convient
que le laboratoire fournisse une explication.
Les éléments à prendre en compte lors de la sélection des souches sont indiqués dans l’ISO 16140-2:2016,
Annexe E.
Le calcul des résultats de l’étude factorielle au niveau zéro et au niveau élevé doit reposer sur les
principes énoncés dans l’ISO 16140-2:2016, 5.1.3.4, pour une étude de méthodes non appariées. Les
résultats d’essai au niveau faible (fractionnel) ne sont pas utilisés. Tous les résultats de référence au
niveau zéro sont considérés comme étant des résultats négatifs. Au niveau élevé, ils sont considérés
comme étant des résultats positifs.
NA représente le nombre de résultats d’essai négatifs et PD le nombre de résultats d’essai positifs de
la méthode au niveau zéro. ND représente le nombre de résultats d’essai négatifs et PA le nombre de
résultats d’essai positifs de la méthode au niveau élevé.
Les limites d’acceptabilité (AL) par catégorie (d’aliment) sont les suivantes: ND = 3, PD = 1. Si ND est
supérieur à 3 ou si PD est supérieur à 1, la méthode ne peut pas être validée.
5.1.2.4 Calcul et interprétation du niveau LOD50
Le niveau LOD50 peut être calculé pour chaque configuration en utilisant l’approche log-log
complémentaire (LLC) pour la probabilité de détection (POD) adaptée de l’ISO 16140-2. Le niveau
LOD50 dans les configurations peut être obtenu sous la forme 10k , où k désigne la moyenne des valeurs
log10 du LOD50 dans les configurations (c’est-à-dire, sous forme de moyenne géométrique des valeurs

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

LOD50). L’Annexe E fournit un exemple. Une approche plus complète applicable au calcul du niveau
LOD50, incluant le calcul de l’écart-type de reproductibilité interne, est disponible dans la Référence[12].
NOTE 1 Le LOD50 peut être calculé à l’aide de «R». «R» est un langage de programmation et un environnement
logiciel gratuit destiné aux calculs et représentations statistiques des données, soutenu par la R Foundation
for Statistical Computing. Le langage R est couramment utilisé chez les statisticiens. Il peut être téléchargé à
l’adresse https://cran.r-project.org. Le code R pour le calcul du LOD50 est le suivant:
fit=glm(Result~1+offset(log(Concentration))+Item,
family=binomial(link="cloglog"), data=TEST.RESULTS.DATAFRAME)
Item1 = summary(fit)$coefficients[1]
Item2 = summary(fit)$coefficients[1]+summary(fit)$coefficients[2]
(…)
ItemN = summary(fit)$coefficients[1]+summary(fit)$coefficients[N]
MeanAcrossItems = mean(c(Item1, Item2,…, ItemN))
LOD50 = -log(0,5)/exp(MeanAcrossItems)
NOTE 2 Un programme Excel®2) est disponible pour calculer le LOD50 à l’adresse https://standards.iso.org/
iso/16140/-4/ed-1/en.
De plus, les effets des facteurs individuels (par exemple, technicien) et des interactions entre les
facteurs (par exemple, milieu de culture ou conditions d’incubation) peuvent être calculés d’après le
plan factoriel à partir des valeurs LOD50 calculées pour chaque configuration. Pour un facteur d’intérêt
spécifique, nommer:
— Y(a) la valeur log10 de la valeur LOD50 à l’aide de tous les résultats d’essai des quatre configurations
sous lesquelles le facteur est défini au niveau «a»;
— Y(b) la valeur log10 de la valeur LOD50 à l’aide de tous les résultats d’essai des quatre autres
configurations sous lesquelles le facteur est défini au niveau «b».
Calculer la différence entre ces valeurs log10 du LOD50 comme indiqué par la Formule (2):
d = Y ( b ) −Y ( a ) (2)
Si cette différence d est inférieure à −0,6 ou supérieure à +0,6, le facteur est considéré comme ayant
une influence importante sur le LOD50. Dans ce cas, on peut en conclure que le niveau LOD50 des deux
niveaux de facteurs diffère de plus de 4:1. Cela peut indiquer un effet indésirable avec la méthode
alternative. Effectuer une analyse des causes afin de fournir une explication à propos des résultats
très divergents. Examiner si l’effet indésirable est lié à certaines combinaisons des niveaux de facteurs.
Rejeter la méthode alternative s’il est impossible d’exclure qu’il y a un problème avec cette méthode.
Les essais d’inclusivité/exclusivité doivent être effectués conformément à 5.1.1.5.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

5.2 Méthodes quantitatives
référence
La validation par plan factoriel dans un seul laboratoire ne peut être utilisée que pour une méthode
intégralement développée et optimisée. L’étude de validation comprend deux parties:
— une étude comparative orthogonale factorielle (justesse relative, profil d’exactitude et fidélité
interne);
— une étude d’inclusivité/d’exclusivité de la méthode alternative.
Voir l’Annexe C pour un exemple détaillé.
5.2.1.2 Sélection des échantillons
L’étude comparative des méthodes compare les résultats obtenus par la méthode de référence avec
ceux de la méthode alternative. L’étude est effectuée en utilisant des échantillons naturellement et/ou
artificiellement contaminés, choisis de la façon suivante:
— pour chaque catégorie (d’aliment) soumise à essai, douze éléments (d’aliments) doivent être choisis
parmi trois ou quatre types (d’aliments). Pour chaque type (d’aliment), au moins trois éléments
(d’aliments) doivent être choisis. Par exemple, s’il y a trois types (d’aliments), quatre éléments
(d’aliments) peuvent être choisis pour chaque type (d’aliment), mais il est également possible de
choisir six éléments (d’aliments) pour le premier type (d’aliment) et trois éléments (d’aliments) pour
chacun des deux types (d’aliments) restants;
— la sélection doit tenir compte du microbiote annexe et des facteurs de production alimentaire tels
que la chaleur, le pH, la congélation, la fumaison, le séchage (aw) et des conditions de la matrice telles
que la valeur de pH, la valeur aw, les conditions aérobies/anaérobies et les modes opératoires de
revivification;
— la taille de la prise d’essai doit être standardisée pour chaque étude;
— les éléments (d’aliments) peuvent être naturellement ou artificiellement contaminés. En cas de
contamination artificielle, pour chaque élément (d’aliment), si possible, utiliser une souche et/
ou un microbiote annexe différent(e) et différents facteurs de stress, par exemple, températures
excessives, traitement à l’acide ou chloration, selon la pertinence du type (d’aliment) respectif. S’il
est impossible d’utiliser différentes souches par élément (d’aliment), le laboratoire doit fournir une
explication;
— les éléments à prendre en compte lors de la sélection des souches sont indiqués dans l’ISO 16140-2:2016,
Annexe E;
— les douze éléments (d’aliments) doivent être (artificiellement ou naturellement) contaminés à trois
niveaux: quatre éléments (d’aliments) doivent être choisis au niveau de contamination faible L1
(désigné par les chiffres 1, 4, 7, 10), quatre au niveau de contamination intermédiaire L2 (2, 5, 8, 11)
et quatre au niveau de contamination élevé L3 (3, 6, 9, 12), voir le Tableau 7;
— les protocoles généraux de contamination artificielle des échantillons sont donnés dans
l’ISO 16140-2:2016, Annexe C.
5.2.1.3 Sélection des facteurs de la méthode
La sélection des facteurs de la méthode doit être effectuée conformément au paragraphe 5.1.1.2.2. Les
facteurs sont étudiés simultanément à l’aide du plan d’étude décrit en 5.2.1.4.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

5.2.1.4 Plan d’expérience
— Pour chaque méthode et catégorie (d’aliment): douze éléments (d’aliments) (quatre au niveau de
contamination faible, quatre au niveau de contamination intermédiaire et quatre au niveau de
contamination élevé) doivent être analysés sous deux configurations. Deux réplicats, c’est-à-dire deux
dilutions indépendantes de l’élément (d’aliment), doivent être effectués sous chaque configuration.
Ainsi, 12 éléments (d’aliments) × 2 configurations × 2 réplicats = 48 essais individuels doivent être
réalisés. Au total, 96 (48 pour la méthode de référence et 48 pour la méthode alternative) essais
individuels par catégorie (d’aliment) sont effectués.
— Chaque configuration est une combinaison de niveaux de quatre facteurs de la méthode. Huit
configurations différentes (1 à 8) doivent être prises en compte.
Le Tableau 7 illustre l’attribution d’échantillons aux différentes configurations.
Tableau 7 — Plan de l’étude de validation orthogonale factorielle pour une méthode

quantitative avec méthode de référence; par catégorie (d’aliment)
12 éléments (d’aliments) d’au 4 éléments (d’aliments) au niveau
1 4 7 10
moins 3 faible
types (d’aliments) par catégorie 4 éléments (d’aliments) au niveau
2 5 8 11
(d’aliment), moyen
dans l’ordre aléatoire 4 éléments (d’aliments) au niveau
3 6 9 12
élevé

Facteur 3 par exemple durée d’incubation a b a b b a b a
Facteur 4 par exemple temps de lecture a b b a a b b a
NOTE Nombre d’essais par méthode: 12 éléments (d’aliments) × 2 configurations × 2 réplicats = 48 essais.
5.2.1.5 Justesse relative
Calculer la moyenne des quatre (2 configurations × 2 réplicats) résultats d’essai pour chaque élément
(d’aliment) et utiliser ces moyennes pour calculer la justesse relative dans toutes les configurations. Le
calcul et l’interprétation de la justesse relative doivent être effectués conformément à l’ISO 16140-2:2016,
6.1.2.3.
Déterminer également la justesse relative séparément pour chaque niveau de quatre facteurs
conformément à l’attribution des configurations indiquées dans le Tableau 7: par exemple technicien «a»
(configurations 1, 3, 5, 7), technicien «b» (configurations 2, 4, 6, 8), milieu de culture «a» (configurations
2, 3, 5, 8), milieu de culture «b» (configurations 1, 4, 6, 7), durée d’incubation «a» (configurations
1, 3, 6, 8), durée d’incubation «b» (configurations 2, 4, 5, 7), temps de lecture «a» (configurations
1, 4, 5, 8), temps de lecture «b» (configurations 2, 3, 6, 7).
Calculer les différences de biais:
a) entre les deux techniciens;
b) entre les deux milieux de culture;
c) entre les deux durées d’incubation;
d) entre les deux temps de lecture différents.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

NOTE D’autres essais peuvent être effectués si certaines combinaisons de facteurs donnent des résultats
inattendus. Le plan factoriel permet d’étudier plus en détails les paramètres de performance, en cas de résultat
particulièrement significatif pour une combinaison spécifique de facteurs, par exemple un milieu de culture en
combinaison avec une configuration d’incubation spécifique.
5.2.1.6 Profil d’exactitude
Le calcul et l’interprétation du profil d’exactitude doivent être effectués conformément à

l’ISO 16140-2:2016, 6.1.3.3. Considérer les quatre résultats d’essai (2 configurations × 2 réplicats) de
chaque méthode pour chaque élément (d’aliment) comme quatre réplicats.
NOTE 1 D’autres évaluations du profil d’exactitude peuvent être effectuées en analysant les effets factoriels.
NOTE 2 Un programme Excel®3) est disponible pour calculer le profil d’exactitude à l’adresse https://
standards.iso.org/iso/16140/-4/ed-1/en.
5.2.1.7 Fidélité interne (répétabilité interne et reproductibilité interne)
La notation suivante est utilisée: i désigne le niveau (1 ≤ i ≤ 3); j désigne la configuration (1 ≤ j ≤ 8); k
désigne le réplicat (1 ≤ k ≤ 2). Noter les données comme suit:
— yijk est le résultat d’essai log-transformé sur le niveau i pour la configuration j du réplicat k à l’aide
de la méthode alternative;
— yp1 et yp2 sont les deux moyennes des valeurs appariées y, p désignant l’échantillon respectif p
(1 ≤ p ≤ 12) des deux configurations correspondantes.
L’écart-type de répétabilité interne des types (d’aliments) est calculé comme indiqué par la Formule (3):
3 8
∑∑ ( yij 1 − yij 2 )
1 2
sr ,interne = (3)
48
i =1 j=1
L’écart-type de reproductibilité interne des types (d’aliments) est calculé comme indiqué par la
Formule (4):
sR ,interne = sL2 ,interne + sr2,interne (4)
où
12
∑ ( yp 1 − yp 2 )
1 2 1
sL ,interne = − sr2,interne
24 2
p=1
Si les formules entraînent le calcul de la racine carrée d’un nombre négatif, le résultat est égal à 0.
L’écart-type de répétabilité interne et l’écart-type de reproductibilité interne sont utilisés pour décrire
la fidélité de la méthode alternative dans des conditions de répétabilité interne et dans des conditions
de reproductibilité interne.
NOTE 1 Un calcul plus efficace d’un point de vue statistique et plus précis peut être obtenu en utilisant les
estimations par maximum de vraisemblance restreinte (REML)[13].
NOTE 2 L’évaluation de l’écart-type de reproductibilité interne calculé peut être effectuée en utilisant le
critère proposé dans la Référence [11]: valeur cible ±0,25 log10 ufc/g. Étant donné que l’exactitude comprend la
fidélité, aucune autre évaluation de la fidélité n’est requise dans le présent document.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Les essais d’inclusivité/exclusivité sont requis pour les méthodes de dénombrement conçues pour les
micro-organismes spécifiques. Ils ne sont pas requis pour les méthodes générales de dénombrement
telles que la méthode de comptage total et les méthodes applicables aux levures et moisissures.
Dans l’étude d’inclusivité/exclusivité, les souches cibles et les souches non cibles sont soumises à essai
avec la méthode alternative. L’étude, y compris la sélection et le nombre de souches, doit être effectuée
conformément à l’ISO 16140-2:2016, 6.1.5. Si la validation est une extension de matrice [élément,
type ou catégorie (d’aliment)] d’une méthode déjà validée, aucune étude d’inclusivité/exclusivité
supplémentaire n’est requise.
Les considérations générales de 5.2.1.1 s’appliquent. Toutefois, en l’absence de méthode de référence,

les résultats de la méthode alternative doivent être comparés avec des niveaux de contamination
connus des échantillons, et il convient de dénombrer l’inoculum à l’aide d’un milieu non sélectif. Le
dénombrement doit être effectué conformément à l’ISO 7218.
Si les niveaux de contamination ne sont pas connus, les niveaux relatifs de dilution de l’inoculum
peuvent être utilisés pour évaluer la proportionnalité de dilution de la méthode. Il s’agit d’une exigence
minimale de chaque méthode quantitative: il convient que les résultats de différents niveaux de dilution
soient inversement proportionnels au niveau de dilution. La proportionnalité de dilution et la fidélité de
la répétabilité interne peuvent être évaluées en utilisant le protocole du paragraphe 5.2.1, dans lequel
la méthode de référence est remplacée par la méthode alternative avec des étapes supplémentaires de
dilution (par exemple, dilution de tous les échantillons à 1:10).
5.2.2.2 Sélection des échantillons
Les échantillons doivent être choisis conformément à 5.2.1.2.
5.2.2.3 Sélection des facteurs de la méthode
Les facteurs de la méthode doivent être choisis conformément à 5.2.1.3.
5.2.2.4 Plan d’expérience
Les éléments (d’aliments) doivent avoir un niveau de contamination connu à trois niveaux: un niveau
faible L1, un niveau moyen L2 et un niveau élevé L3. Les niveaux de contamination relatifs doivent être
atteints en utilisant différentes dilutions de l’inoculum (par exemple 1:10:100). Le plan d’expérience
du paragraphe 5.2.1.4 est utilisé: quatre éléments (d’aliments) par niveau de contamination sont
analysés sous deux configurations avec deux réplicats. Les attributions des douze éléments (d’aliments)
différents aux huit configurations dans quatre blocs sont données dans le Tableau 7. Au total, huit
configurations avec trois niveaux et deux réplicats sont soumises à essai, soit 48 essais individuels.
NOTE Pour certaines méthodes, il peut être plus approprié d’utiliser le même bloc d’éléments (d’aliments)
pour tous les niveaux de contamination de la même configuration. Pour cela, utiliser quatre blocs d’échantillons
et attribuer les blocs aux configurations conformément au Tableau 6.
5.2.2.5 Justesse relative
Le calcul et l’interprétation de la justesse relative reposent sur le protocole du paragraphe 5.2.1.5,

notamment le calcul de la justesse relative pour les huit sous-ensembles de données décrits. Ce
protocole est modifié en utilisant les niveaux de contamination artificielle connus au lieu des résultats
d’essai de la méthode de référence.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

5.2.2.6 Profil d’exactitude
Une version modifiée du profil d’exactitude doit être calculée conformément à l’ISO 16140-2:2016, 6.1.3,
et en remplaçant les résultats d’essai de la méthode de référence par le niveau de contamination connu
de l’échantillon. De plus, les adaptations suivantes doivent être effectuées.
— Le calcul de l’écart-type de la méthode de référence de l’étape 5 de l’ISO 16140-2:2016, 6.1.3.3, peut
être omis, et la valeur remplacée par 0 car les niveaux de contamination sont connus et, de ce fait, il
n’y a pas de variabilité.
— L’étape 9 de l’ISO 16140-2:2016, 6.1.3.3, ne s’applique pas car l’écart-type des valeurs de référence ne
peut pas dépasser le seuil de 0,125.
5.2.2.7 Fidélité interne (répétabilité interne et reproductibilité interne)
L’écart-type de répétabilité interne et l’écart-type de reproductibilité interne sont utilisés pour décrire
la fidélité de la méthode alternative dans des conditions de répétabilité interne et dans des conditions
de reproductibilité interne. Ils sont calculés conformément à 5.2.1.7.
6 Protocole technique de validation — Approche conventionnelle
6.1 Méthodes qualitatives
référence
6.1.1.1 Généralités
L’approche conventionnelle de validation dans un seul laboratoire repose sur le plan d’étude comparative
des méthodes de l’ISO 16140-2:2016, 5.1.
6.1.1.2 Étude de sensibilité
L’étude de sensibilité compare les résultats obtenus par la méthode de référence avec ceux de la
méthode alternative. Elle doit être réalisée et interprétée conformément à l’ISO 16140-2:2016, 5.1.3.
Pour chaque catégorie (d’aliment) étudiée, au moins 60 échantillons doivent être soumis à essai. Au
moins 20 échantillons représentatifs de chacun des trois types (d’aliments) doivent être soumis à
essai par catégorie (d’aliment). Des résultats positifs partiels doivent être obtenus pour chaque type
(d’aliment) soumis à essai, avec la méthode de référence ou alternative (c’est-à-dire qu’il convient
que les échantillons ne soient pas tous positifs ou tous négatifs). Idéalement, il est recommandé que
10 échantillons (50 %) soumis à essai par type (d’aliment) soient positifs. Pour chaque catégorie
(d’aliment), au moins 30 échantillons doivent avoir un résultat positif par la méthode de référence et/ou
alternative.
6.1.1.3 Étude RLOD
L’étude RLOD est une étude comparative entre le LOD50 obtenu par la méthode de référence et celui de
la méthode alternative. Elle doit être réalisée et interprétée conformément à l’ISO 16140-2:2016, 5.1.4.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Si aucune méthode de référence n’est disponible, la validation de la méthode alternative s’effectue en

deux temps. Dans un premier temps, la spécificité de la méthode est établie avant d’étudier le LOD50, la
sensibilité et la performance de l’étude d’inclusivité/exclusivité dans un deuxième temps.
Pour la sélection des catégories (d’aliments) et des éléments (d’aliments), voir ISO 16140-2:2016, 5.1.3.1.
6.1.2.2 Spécificité
Vingt éléments (d’aliments) non contaminés (avec le micro-organisme cible) par catégorie (d’aliment)
doivent être utilisés comme blancs d’analyse. Si plusieurs échantillons donnent un résultat positif, la
méthode ne peut pas être validée.
6.1.2.3 Étude LOD50
Pour chaque catégorie (d’aliment), douze éléments (d’aliments) de trois types (d’aliments) doivent être
choisis. Chaque élément (d’aliment) doit être analysé un jour différent. Pour chaque élément (d’aliment)
et pour chaque jour, 30 prises d’essai sont artificiellement contaminées à différents niveaux:
— 5 prises d’essai sans contamination (non ensemencées), de sorte qu’aucun résultat positif n’est
attendu;
— 20 prises d’essai à un niveau fractionnel, de sorte qu’environ 50 % de résultats positifs sont
attendus; et
— 5 prises d’essai à un niveau élevé, de sorte que 100 % de résultats positifs sont attendus.
Utiliser une souche différente par élément (d’aliment) et/ou la même souche soumise à différents
facteurs de stress [par exemple, températures excessives, traitement à l’acide ou chloration, selon
la pertinence du type (d’aliment)]. S’il n’est pas possible d’utiliser différentes souches pour chaque
élément (d’aliment), le laboratoire doit fournir une explication. Les éléments à prendre en compte lors
de la sélection des souches sont indiqués dans l’ISO 16140-2:2016, Annexe E. Les protocoles généraux de
contamination artificielle des échantillons sont donnés dans l’ISO 16140-2:2016, Annexe C. Il convient
de dénombrer chaque inoculum à l’aide d’un milieu non sélectif. Le dénombrement doit être effectué
conformément à l’ISO 7218.
Au total, 360 essais sont réalisés par catégorie (d’aliment).
Pour chaque élément (d’aliment), le LOD50 doit être calculé en utilisant l’approche log-log complémentaire
(LLC) pour la probabilité de détection (POD) adaptée de l’ISO 16140-2.
NOTE 1 Le LOD50 peut être calculé à l’aide de «R». «R» est un langage de programmation et un environnement
logiciel gratuit destiné aux calculs et représentations statistiques des données, soutenu par la R Foundation
for Statistical Computing. Le langage R est couramment utilisé chez les statisticiens. Il peut être téléchargé à
l’adresse https://cran.r-project.org. Le code R pour le calcul du LOD50 est le suivant:
fit=glm(Result~1+offset(log(Concentration))+Item,
family=binomial(link="cloglog"), data=TEST.RESULTS.DATAFRAME)
Item1 = summary(fit)$coefficients[1]
Item2 = summary(fit)$coefficients[1]+summary(fit)$coefficients[2]
(…)
ItemN = summary(fit)$coefficients[1]+summary(fit)$coefficients[N]
MeanAcrossItems = mean(c(Item1, Item2,…, ItemN))

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

LOD50 = -log(0,5)/exp(MeanAcrossItems)
NOTE 2 Un programme Excel®4) est disponible pour calculer le LOD50 à l’adresse https://standards.iso.org/
iso/16140/-4/ed-1/en.
L’Annexe B fournit des informations supplémentaires sur l’étude LOD50 qui permet de calculer la
reproductibilité interne.
Le calcul de la sensibilité doit être effectué conformément à l’ISO 16140-2:2016, 5.1.3.4. Utiliser les
résultats d’essai de l’étude LOD50 au niveau zéro et au niveau élevé. Les résultats d’essai au niveau faible
(fractionnel) ne sont pas utilisés. Tous les résultats de référence au niveau zéro sont considérés comme
étant des résultats négatifs. Au niveau élevé, ils sont considérés comme étant des résultats positifs.
NA représente le nombre de résultats d’essai négatifs de la méthode au niveau zéro et PD le nombre
de résultats d’essai positifs au niveau zéro. ND représente le nombre de résultats d’essai négatifs de la
méthode au niveau élevé et PA le nombre de résultats d’essai positifs au niveau élevé.
Les limites d’acceptabilité (AL) par catégorie (d’aliment) sont les suivantes: ND = 3, PD = 1. Si ND est
supérieur à 3 ou si PD est supérieur à 1, la méthode ne peut pas être validée.
6.2 Méthodes quantitatives
référence
des méthodes de l’ISO 16140-2:2016, 6.1.
6.2.1.2 Étude de justesse relative
L’étude de justesse relative est une étude comparative entre les résultats obtenus par la
méthode de référence et ceux de la méthode alternative. Elle doit être effectuée conformément à
l’ISO 16140-2:2016, 6.1.2.
6.2.1.3 Étude du profil d’exactitude
L’étude du profil d’exactitude compare les résultats obtenus par la méthode de référence avec ceux de la
méthode alternative. Elle doit être effectuée conformément à l’ISO 16140-2:2016, 6.1.3.
6.2.1.4 Étude de la limite de quantification
Pour certaines méthodes alternatives, il est approprié de déterminer la limite de quantification (LOQ).
La limite LOQ n’est pertinente que lorsque le principe de mesure de la méthode alternative n’est pas
fondé sur l’observation visuelle du micro-organisme cible et, dans ce cas, elle doit être déterminée.
L’étude de la LOQ, le cas échéant, doit être effectuée conformément à l’ISO 16140-2:2016, 6.1.4.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

6.2.1.5 Étude de la fidélité interne
L’écart-type de répétabilité interne et l’écart-type de reproductibilité interne sont des caractéristiques

de performance importantes de toute méthode de mesure. Ils décrivent la fidélité de la méthode
alternative sous des conditions de répétabilité interne et sous des conditions de reproductibilité interne.
Un élément (d’aliment) par catégorie (d’aliment) est choisi pour déterminer l’écart-type de répétabilité
interne et l’écart-type de reproductibilité interne.
Si l’élément (d’aliment) artificiellement contaminé est suffisamment stable d’un point de vue
microbiologique, les essais sont effectués sur huit jours différents par trois techniciens ou plus. Aucun
des techniciens ne doit réaliser les essais sur plus de trois jours. Toutefois, si seulement deux techniciens
sont disponibles, chacun d’eux doit effectuer les essais sur quatre jours. Si un seul technicien est
disponible, celui-ci doit effectuer tous les essais, mais la méthode est alors validée uniquement pour ce
technicien.
Chaque jour, l’un des techniciens effectue les essais sur cinq réplicats en utilisant la méthode alternative,
soit un total de 8 × 5 = 40 essais. De plus, le 1er jour, cinq essais en réplicats sont effectués en utilisant la
méthode de référence comme témoin.
L’écart-type de répétabilité interne est calculé comme indiqué par la Formule (5):
∑ j=1 ∑ i=1 ( yij − y j )

1 8 5 2
sr ,interne = (5)
32
où
y ij est la mesure log10 du ième réplicat le jour j;
5
∑ yij
1
yj = est la moyenne sur les cinq mesures log10 le jour j.
5
i =1
L’écart-type de reproductibilité interne est calculé comme indiqué par la Formule (6):
sI ,interne = s2A + sr,interne

2 (6)
où
8
∑( y j − y)
1 2 1
s2A = − sr2,interne
7 5
j=1
et
∑ i=1 ∑ j=1 yij

1 5 8
y=
40
est la moyenne sur les 40 mesures log10. Si s2A < 0 , définir s2A = 0 .
Si l’élément (d’aliment) artificiellement contaminé n’est pas suffisamment stable d’un point de vue
microbiologique, les options suivantes s’appliquent:
— effectuer l’étude de fidélité d’après le plan décrit ci-dessus. L’écart-type de reproductibilité interne
calculé sera très vraisemblablement supérieur à l’écart-type de reproductibilité interne inconnu
réel. Par conséquent, il peut uniquement être utilisé comme limite supérieure de la variation réelle.
Cependant, l’écart-type de répétabilité interne calculé n’est pas (très) affecté par l’instabilité de
l’échantillon, et peut être utilisé sans restriction;

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

— effectuer l’étude de fidélité d’après le plan décrit ci-dessus, mais adapter les résultats à la tendance
sous-jacente, voir F.2;
— effectuer l’étude de fidélité d’après le plan décrit ci-dessus, mais remplacer les huit jours par huit
moments différents. Ces huit moments différents doivent comprendre au moins trois jours différents,
et chaque jour, différents matériels ou différents lots/fournisseurs de milieux doivent être utilises;
— effectuer l’étude de fidélité et corriger les résultats de la méthode alternative par les résultats de la
méthode de référence, voir F.3.
Le plan de l’étude de fidélité doit être décrit dans le rapport d’étude de validation.
NOTE 1 Les composantes de la variance peuvent être calculées plus efficacement, avec une plus grande
fidélité, en utilisant l’approche du maximum de vraisemblance restreinte (REML)[13].
Les essais d’inclusivité/exclusivité doivent être effectués conformément au paragraphe 5.2.1.8.
des méthodes de l’ISO 16140-2:2016, 6.1. En cas de validation sans méthode de référence, l’étude repose
sur des niveaux de contamination connus d’échantillons artificiellement contaminés.
6.2.2.2 Étude de justesse relative
La justesse relative est mesurée par rapport aux niveaux de contamination connus des échantillons.
Elle doit être effectuée conformément à l’ISO 16140-2:2016, 6.1.2, dans laquelle chaque résultat
d’essai de la méthode de référence est remplacé par le niveau de contamination connu de l’échantillon
artificiellement contaminé.
6.2.2.3 Étude du profil d’exactitude
L’étude du profil d’exactitude doit être effectuée conformément à l’ISO 16140-2:2016, 6.1.3, dans laquelle
chaque résultat d’essai de la méthode de référence est remplacé par le niveau de contamination connu
de l’échantillon artificiellement contaminé. De plus, les adaptations suivantes doivent être effectuées:
a) le calcul de l’écart-type de la méthode de référence de l’étape 5 de l’ISO 16140-2:2016, 6.1.3.3, peut
être omis, et la valeur remplacée par 0 car les niveaux de contamination sont connus et, de ce fait, il
n’y a pas de variabilité;
b) l’étape 9 de l’ISO 16140-2:2016, 6.1.3.3, ne s’applique pas car l’écart-type des valeurs de référence
ne peut pas dépasser le seuil de 0,125.
6.2.2.4 Étude de la limite de quantification
L’étude de la LOQ, le cas échéant, doit être effectuée conformément à l’ISO 16140-2:2016, 6.1.4.
6.2.2.5 Étude de la fidélité interne
Un élément (d’aliment) par catégorie (d’aliment) est choisi pour déterminer l’écart-type de répétabilité
interne et l’écart-type de reproductibilité interne.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Si l’élément (d’aliment) artificiellement contaminé est suffisamment stable d’un point de vue
microbiologique, les essais sont effectués sur huit jours différents par trois techniciens ou plus. Aucun
des techniciens ne doit réaliser les essais sur plus de trois jours. Toutefois, si seulement deux techniciens
sont disponibles, chacun d’eux doit effectuer les essais sur quatre jours. Si un seul technicien est
disponible, celui-ci doit effectuer tous les essais, mais la méthode est alors validée uniquement pour ce
technicien.
Chaque jour, le technicien effectue les essais sur cinq réplicats, soit un total de 8 × 5 = 40 essais sur les
huit jours.
L’écart-type de répétabilité interne est calculé comme indiqué par la Formule (7):
8 5
∑∑ ( yij − y j )
1 2
sr ,interne = (7)
32
j=1 i =1
où
y ij est la valeur log10 du résultats d’essai du ième réplicat le jour j;

5
∑ yij
1
yj = est la moyenne sur les cinq résultats d’essai le jour j.
5
i =1
L’écart-type de reproductibilité interne est calculé comme indiqué par la Formule (8):
sI ,interne = s2A + sr2,interne (8)
où
8
∑( y j − y)
1 2 1
s2A = − sr2,interne
7 5
j=1
et
∑ i=1 ∑ j=1 yij

1 5 8
y=
40
est la moyenne sur les 40 mesures log10. Si s2A < 0 , définir s2A = 0 .
Si l’élément (d’aliment) artificiellement contaminé n’est pas suffisamment stable d’un point de vue
microbiologique, les options suivantes s’appliquent:
— effectuer l’étude de fidélité d’après le plan décrit ci-dessus. L’écart-type de reproductibilité interne
calculé sera très vraisemblablement supérieur à l’écart-type de reproductibilité interne inconnu
réel. Par conséquent, il peut uniquement être utilisé comme limite supérieure de la variation réelle.
Cependant, l’écart-type de répétabilité interne calculé n’est pas (très) affecté par l’instabilité de
l’échantillon, et peut être utilisé sans restriction;
— effectuer l’étude de fidélité d’après le plan décrit ci-dessus, mais adapter les résultats à la tendance
sous-jacente, voir F.2;
— effectuer l’étude de fidélité d’après le plan décrit ci-dessus, mais remplacer les huit jours par huit
moments différents. Ces huit moments différents doivent comprendre au moins trois jours différents.
Chaque jour, différents matériels ou différents lots/fournisseurs de milieux doivent être utilisés.
Le plan de l’étude de fidélité doit être décrit dans le rapport d’étude de validation.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Les écarts-type de répétabilité interne et de reproductibilité interne sont utilisés pour décrire la fidélité
de la méthode alternative. Si l’écart-type de reproductibilité interne est supérieur à 0,5, la méthode ne
peut pas être considérée comme étant validée.
NOTE 1 Les composantes de la variance peuvent être calculées plus efficacement, avec une plus grande
fidélité, en utilisant l’approche du maximum de vraisemblance restreinte (REML).
Les essais d’inclusivité/exclusivité doivent être effectués conformément au paragraphe 5.2.1.8.
7 Résumé des limites d’acceptabilité

Le Tableau 8 donne une vue d’ensemble des limites d’acceptabilité (AL). Les critères appliqués
lors de l’étude d’inclusivité/exclusivité ne sont pas inclus. L’organisation du tableau repose sur les
caractéristiques de méthode et d’étude suivantes:
— méthode qualitative ou quantitative;
— plan d’étude factoriel ou conventionnel;
— avec ou sans méthode de référence;
— étude de méthodes appariées ou non appariées.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Tableau 8 — Vue d’ensemble des limites d’acceptabilité

Méthode
Méthode
appariée/
Étude Méthode de réfé- Limite d’acceptabilité (AL)
non
rence
appariée
(ND–PD) ≤ AL conformément au Tableau 5
Non
RLOD ≤ 2,5
appariée
Différence factorielle de RLOD: |d| < 0,6
Oui (ND–PD) et (ND+PD) ≤ AL conformément au Tableau 5
Qualitative Appariée RLOD ≤ 1,5
Factorielle Différence factorielle de RLOD: |d| < 0,6
ND ≤ 3
Non
Non PD ≤ 1
applicable
Différence factorielle de LOD: |d| < 0,6
Appariée/
Profil d’exactitude conformément à
Oui Non
l’ISO 16140-2:2016, 6.1.3.3
Quantitative appariée
Non Profil d’exactitude conformément à
Non
applicable l’ISO 16140-2:2016, 6.1.3.3
(ND–PD) ≤ AL conformément à
Non l’ISO 16140-2:2016, 5.1.3.4
appariée
RLOD ≤ 2,5
Oui (ND–PD) et (ND+PD) ≤ AL conformément à
Qualitative
l’ISO 16140-2:2016, 5.1.3.4
Appariée
Convention-
RLOD ≤ 1,5
nelle
Non Non ND ≤ 3
applicable PD ≤ 1
Appariée/
Profil d’exactitude conformément à
Oui Non
l’ISO 16140-2:2016, 6.1.3.3
Quantitative appariée
Non Profil d’exactitude conformément à
Non
applicable l’ISO 16140-2:2016, 6.1.3.3

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Annexe A
(informative)
Liste des facteurs et niveaux de facteurs relatifs à la validation de

la méthode factorielle
La liste suivante peut être utilisée pour choisir les facteurs et niveaux de facteurs applicables aux plans
d’étude factoriels fournis dans le présent document. Il convient de choisir, dans la liste suivante, les
facteurs et niveaux de facteurs censés avoir un effet notable sur le résultat final:
— milieux de culture et incubation:
— fournisseur de bouillon non sélectif/primaire;
— bouillon préparé contre bouillon non sélectif/primaire prêt à l’emploi;
— fournisseur de bouillon sélectif/secondaire;
— bouillon préparé contre bouillon sélectif/secondaire prêt à l’emploi;
— fournisseur de boîte de gélose;
— boîte de gélose coulée contre boîte de gélose prête à l’emploi;
— durée de stockage des bouillons ou boîtes après incubation avant un repiquage ou un comptage
ultérieur (conformément aux spécifications du mode opératoire de la méthode);
— âge du milieu (conforme à la date de péremption du milieu);
— lots de milieux (par exemple, milieux pour Enterobacteriaceae contenant des sels biliaires);
— durée d’incubation des différentes étapes (par exemple, 20 h contre 28 h lorsqu’une durée
de 24 h ± 4 h est autorisée);
— microbiote annexe [au moins deux niveaux de microbiote annexe par élément (d’aliment), par
exemple date de fraîcheur et date limite de consommation]:
— microbiote annexe associé à la conservation (conservation/non conservation au réfrigérateur/à
température ambiante);
— niveaux de contamination (ajout artificiel de différents niveaux);
— organismes interférents;
— lots d’éléments (d’aliments), dans lesquels le microbiote annexe est connu pour varier;
— préparation et conservation des échantillons:
— mélangeur ou vortex;
— mode opératoire de revivification [par exemple, décongélation d’échantillons congelés («a») à
température ambiante ou («b») à 4 °C];
— utilisation immédiate ou congélation/décongélation d’échantillons;

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

— conditions de transport: conservation ou transport des échantillons;

— matériel et techniciens:
— technicien (utiliser des techniciens ayant différents niveaux d’expérience, si possible);
— différents systèmes de pipettage;
— différentes conditions d’incubation [utiliser deux types d’incubateurs différents, par exemple
différents incubateurs à air à 37 °C, incubateur contre bain d’eau; si un seul type d’incubateur
est disponible, faire varier les conditions d’incubation à deux niveaux, par exemple niveau
«a» = durée minimale autorisée par la tolérance de la méthode et position la plus basse dans
l’incubateur (= température minimale), et niveau «b» = durée maximale autorisée par la
tolérance de la méthode et position la plus haute dans l’incubateur (= température maximale)];
— ensemencement en surface contre ensemencement en profondeur, le cas échéant;
— facteurs de stress (le cas échéant):
— température basse/normale;
— température élevée/normale;
— stress chimique (par exemple, fumaison et salaison);
— stress dû au pH;
— stress dû à une pression élevée;
— rayonnement à faible dose/pas de rayonnement (faisceau électronique);
— sécheresse/humidité, par exemple aw faible (≤0,60)/aw élevée (≥0,95).
NOTE Une configuration est une combinaison spécifique de niveaux de tous les facteurs. Deux exemples de
configuration des facteurs du Tableau A.1 sont:
— configuration 1 (a,a,b,b): technicien «a»; boîtes de gélose coulées; conservation au réfrigérateur; condition
d’incubation «b»;
— configuration 2 (b,b,a,a): technicien «b»; boîtes de gélose prêtes à l’emploi; pas de conservation; condition
d’incubation «a».
Tableau A.1 — Exemples de facteurs et niveaux correspondants

Facteur Niveau «a» Niveau «b»
Technicien Technicien «a» Technicien «b»
Préparation des boîtes de gélose Préparées en interne Achetées prêtes à l’emploi
Conservation des échantillons Aucune Conservés au réfrigérateur
ensemencés (augmente les bruits pendant 2 jours
de fond)
Condition d’incubation Condition d’incubation «a» Condition d’incubation «b»

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Annexe B
(informative)
Calcul de la reproductibilité interne applicable aux méthodes

qualitatives d’après l’étude LOD50 décrite en 6.1.2.3
Le paramètre de reproductibilité interne capture d’importantes informations au sujet de la performance

des méthodes microbiologiques et il convient de le déterminer lors des études de validation. Le risque
lié à la non-considération de la reproductibilité interne est que la fiabilité réelle d’une méthode n’est
pas connue et qu’on se fie à des déterminations de routine inexactes en laboratoire. Cela peut avoir de
graves conséquences pratiques.
Par exemple, si l’étude de validation se déroule un «bon» jour, dans le sens où le LOD50 de la méthode
alternative est de 3 ufc/prise d’essai, la non-fiabilité réelle de la méthode risque de ne pas être détectée.
Lorsqu’un résultat négatif est obtenu pendant une détermination de routine en laboratoire, on peut en
conclure que le niveau de contamination est inférieur à 3 ufc/prise d’essai. Toutefois, un «mauvais» jour,
le niveau réel peut être de 30 ufc/prise d’essai. Cependant, si l’étude de validation a lieu un «mauvais»
jour, et si le LOD50 de la méthode alternative est de 30 ufc/ml, la méthode n’est pas validée, même si les
deux méthodes peuvent être considérées, en moyenne, comme étant équivalentes.
L’écart-type de reproductibilité interne des éléments (d’aliments) peut être estimé comme mesure de la
fidélité de la méthode alternative sous différentes conditions et dans le même laboratoire par le mode
opératoire suivant:
a) calculer, pour chaque élément (d’aliment)/jour i = 1, 2,…12, le LOD50 relatif à la méthode alternative
à l’aide d’un modèle LLC pour la POD. Désigner la valeur log10 du LOD50 pour le jour i par Yi;
b) calculer l’écart-type de la valeur log10 du LOD50, comme indiqué par la Formule (B.1):
12
∑(Yi −Y )2 (B.1)
1
sY =
11
i =1
12
∑Yi désigne la moyenne de la valeur log10 du LOD50;
1
où Y =
12
i =1
c) soustraire l’erreur-type du LOD50 pour l’élément (d’aliment)/le jour i, (si). Cette valeur est calculée
automatiquement par le logiciel standard d’ajustement du modèle LLC;
d) calculer l’erreur-type moyenne, comme indiqué par la Formule (B.2):
12
∑si2 (B.2)
1
s0 =
12
i =1
e) calculer l’écart-type de reproductibilité interne des éléments (d’aliments), comme indiqué par la
Formule (B.3):
sinterne = sY2 − s02 (B.3)
La fidélité interne est définie sur 0 lorsque la différence dans l’étape e) est négative.
Si l’écart-type de reproductibilité interne sinterne est supérieur à 0,5, cela signifie que la variation du
LOD50 entre différents éléments (d’aliments) ou jours est considérable.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Annexe C
(informative)
Exemple d’étude factorielle de validation de méthodes dans un

seul laboratoire pour une méthode quantitative par rapport à une
méthode de référence
C.1 Généralités
Cette annexe fournit un exemple illustrant le mode opératoire d’exécution de la validation d’une
méthode quantitative par rapport à une méthode de référence telle que décrite en 5.2.
C.2 Plan d’étude

Douze éléments d’aliments provenant de trois types d’aliments de la catégorie d’aliment «lait cru et
produits laitiers» ont été choisis. Les échantillons ont été artificiellement contaminés à trois niveaux
de contamination: un niveau faible L1, un niveau moyen L2 et un niveau élevé L3, conformément au
Tableau C.1.
Tableau C.1 — Éléments d’aliments et niveaux de contamination

Niveau Élément d’aliment
Faible 1, 4, 7, 10
Moyen 2, 5, 8, 11
Élevé 3, 6, 9, 12
Deux techniciens ont effectué la méthode de référence (voir ISO 4833-1) et la méthode alternative pour
le dénombrement en boîtes en aérobiose des produits laitiers. Les durées d’incubation, pour la méthode
de référence et la méthode alternative, étaient de 48 h ± 3 h et 72 h ± 3 h, respectivement.
Chaque élément d’aliment a été analysé sous deux configurations, et dans chaque configuration, deux
réplicats ont été effectués. Ainsi, 48 (12 éléments (d’aliments) × 2 configurations × 2 réplicats) essais
individuels par méthode ont été réalisés au total. Au total, 96 (48 pour la méthode de référence et 48
pour la méthode alternative) essais individuels ont été réalisés, chaque technicien effectuant 48 essais.
Le Tableau C.2 décrit l’attribution d’échantillons aux configurations des combinaisons de niveaux de
facteurs.
Quatre facteurs d’influence ont été évalués lors de l’étude:
— technicien;
— milieu de culture;
— condition d’incubation;
— durée d’incubation.
Les douze éléments d’aliments ont tous été évalués lors d’un plan d’étude de méthodes appariées:
les mêmes réplicats ont été utilisés pour la méthode alternative et la méthode de référence. Les
variations au niveau des techniciens, milieux de culture, conditions d’incubation et durées d’incubation
conformément au plan d’expérience résumé dans le Tableau C.2 ont été appliquées à la méthode
alternative et à la méthode de référence.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Des instructions détaillées ont été fournies pour l’analyse, notamment un logigramme pour chacun des
deux techniciens (voir Figures C.1 et C.2).
Tableau C.2 — Plan d’expérience
Facteur 3 Facteur 4
Élément Facteur 1 Facteur 2 Durée d’incubation
Configuration Condition
d’aliment Technicien Milieu de culture
d’incubation Alternative Référence
Tampon de dilution Condition d’incu-
1 1, 2, 3 a 45 h 69 h
prêt à l’emploi bation A
2 1, 2, 3 b 51 h 75 h
déshydraté bation B
3 4, 5, 6 a 51 h 75 h
déshydraté bation A
4 4, 5, 6 b 45 h 69 h
prêt à l’emploi bation B
5 7, 8, 9 a 45 h 69 h
déshydraté bation B
6 7, 8, 9 b 51 h 75 h
prêt à l’emploi bation A
7 10, 11, 12 a 51 h 75 h
prêt à l’emploi bation B
8 10, 11, 12 b 45 h 69 h
déshydraté bation A
Figure C.1 — Instructions pour le technicien «a»

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Figure C.2 — Instructions pour le technicien «b»
C.3 Calculs et résumé des données

C.3.1 Résumé des résultats
Dès réception des données, il a été vérifié que les deux techniciens avaient effectué les analyses
conformément aux méthodes indiquées dans la procédure opérationnelle normalisée. Aucun essai
aberrant n’a été réalisé sur les données et aucun point de données n’a été exclu.
Les calculs des résultats d’essai individuels ont tous été log-transformés. Les résultats sont présentés
dans le Tableau C.3.
C.3.2 Justesse relative

Le calcul de la justesse relative a été effectué conformément aux étapes décrites en 5.2.1.5. Un résumé
des résultats est donné dans le Tableau C.4.
C.3.3 Profil d’exactitude

Le calcul du profil d’exactitude a été effectué conformément aux étapes décrites en 5.2.1.6, d’après
les résultats d’essai individuels récapitulés dans le Tableau C.5. La Figure C.3 est la représentation
graphique du profil d’exactitude.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Tableau C.3 — Résultats de l’étude de validation de méthodes dans un seul laboratoire

log10 ufc/g ou ml – Résultats d’essai individuels
Référence Alternative
Niveau de
contamination Élément
Configuration d’aliment Réplicat 1 Réplicat 2 Réplicat 1 Réplicat 2
1 1 2,08 2,11 2,65 2,93
2 2,52 2,41 2,41 2,38
3 4 2,69 2,36 2,73 2,84
Faible 4 2,62 2,40 2,62 2,40
5 7 2,15 2,45 2,76 2,54
6 2,45 2,32 2,30 2,49
7 10 2,53 2,62 2,82 2,74
8 2,54 2,78 2,51 2,72
1 2 3,28 3,26 3,20 3,20
2 2,97 2,91 2,94 2,91
3 5 2,83 2,93 2,91 3,11
Moyen 4 2,93 2,98 2,96 2,97
5 8 3,36 3,18 3,08 3,15
6 2,91 2,93 2,99 2,90
7 11 2,89 2,88 2,81 2,66
8 2,94 2,86 3,04 3,08
1 3 3,94 3,79 4,11 4,12
2 4,34 4,20 4,15 4,08
3 6 4,26 4,23 4,56 4,51
Élevé 4 4,11 3,89 4,12 4,11
5 9 4,15 3,72 3,98 3,74
6 4,34 4,11 4,30 4,08
7 12 4,08 3,80 4,62 4,36
8 4,18 4,00 4,26 4,08

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Tableau C.4 — Résumé de la justesse relative

log10 ufc/g ou ml
Niveau de Élément
Résultats d’essai moyens
contamination d’aliment
Référence Alternative Moyenne Différence
1 2,280 2,593 2,436 0,313
Faible 4 2,518 2,648 2,583 0,130
7 2,343 2,523 2,433 0,180
10 2,618 2,698 2,658 0,080
2 3,105 3,063 3,084 −0,043
Moyen 5 2,918 2,988 2,953 0,070
8 3,095 3,030 3,063 −0,065
11 2,893 2,898 2,895 0,005
3 4,068 4,115 4,091 0,048
Élevé 6 4,123 4,325 4,224 0,203
9 4,080 4,025 4,053 −0,055
12 4,015 4,330 4,173 0,315
Différences moyennes: Total 0,098
Écart-type des différences: Total 0,133
Différences moyennes: Technicien «a» 0,190
Différences moyennes: Technicien «b» 0,007
Différences moyennes: Tampon de dilution prêt à l’emploi 0,134
Différences moyennes: Tampon de dilution déshydraté 0,063
Différences moyennes: Condition d’incubation A 0,146
Différences moyennes: Condition d’incubation B 0,051
Différences moyennes: Durée d’incubation courte 0,110
Différences moyennes: Durée d’incubation longue 0,087
Tableau C.5 — Résultats récapitulés pour le profil d’exactitude
Niveau de Élément log10 ufc/g ou ml – Résultats d’essai individuels

Configuration
contamination d’aliment Référence Alternative
1 1, 2 2,08 2,11 2,52 2,41 2,65 2,93 2,41 2,38
Faible 4 3, 4 2,69 2,36 2,62 2,40 2,73 2,84 2,62 2,40
7 5, 6 2,15 2,45 2,45 2,32 2,76 2,54 2,30 2,49
10 7, 8 2,53 2,62 2,54 2,78 2,82 2,74 2,51 2,72
2 1, 2 3,28 3,26 2,97 2,91 3,20 3,20 2,94 2,91
Moyen 5 3, 4 2,83 2,93 2,93 2,98 2,91 3,11 2,96 2,97
8 5, 6 3,36 3,18 2,91 2,93 3,08 3,15 2,99 2,90
11 7, 8 2,89 2,88 2,94 2,86 2,81 2,66 3,04 3,08
3 1, 2 3,94 3,79 4,34 4,20 4,11 4,12 4,15 4,08
Élevé 6 3, 4 4,26 4,23 4,11 3,89 4,56 4,51 4,12 4,11
9 5, 6 4,15 3,72 4,34 4,11 3,98 3,74 4,30 4,08
12 7, 8 4,08 3,80 4,18 4,00 4,62 4,36 4,26 4,08

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Légende
X niveaux log10 ufc
Y exactitude (différence logarithmique)
biais absolu
β-ETI supérieur et inférieur
ligne du biais zéro
limites d’acceptabilité supérieure et inférieure
Figure C.3 — Profil d’exactitude
C.3.4 Données de fidélité

Le calcul des données de fidélité a été effectué conformément aux étapes décrites en 5.2.1.7. Le
Tableau C.6 présente les résultats récapitulés pour les données de fidélité. La fidélité de la méthode
alternative était relativement proche de la fidélité de la méthode de référence.
Tableau C.6 — Résultats récapitulés pour les données de fidélité

Référence Alternative
sr,interne 0,132 0,109
sL,interne 0,146 0,181
sR,interne 0,197 0,211
C.3.5 Interprétation
Le critère d’acceptabilité du profil d’exactitude est satisfait. Aucun effet factoriel important n’a été
détecté et la fidélité de la méthode alternative est similaire à la fidélité de la méthode de référence.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Annexe D
(informative)
Exemple d’étude factorielle de validation de méthodes dans un

seul laboratoire pour une méthode qualitative par rapport à une
méthode de référence
Cette annexe fournit un exemple illustrant le mode opératoire de calcul des paramètres de validation
conformément au paragraphe 5.1. L’étude est une étude de méthodes non appariées. Le plan d’expérience
indiqué dans le Tableau 3 est mis en œuvre. Les essais ont été effectués avec douze éléments (d’aliments)
attribués à quatre blocs, chaque bloc comprenant deux configurations, à deux niveaux de contamination.
Dans cet exemple, la catégorie d’aliment «Lait et produits laitiers traités à chaud» est validée, en
choisissant par exemple les trois types d’aliments «Produits laitiers pasteurisés», «Produits laitiers
stérilisés ou UHT» et «Produits secs».
Le plan d’étude est présenté dans le Tableau D.1. Les résultats d’essai pour les méthodes alternative et
de référence sont indiqués dans le Tableau D.2. Noter que, dans cet exemple, les résultats de la méthode
alternative et ceux de la méthode alternative confirmée sont identiques. Par conséquent, par souci de
simplicité, aucune distinction n’est faite entre les résultats de la méthode alternative et les résultats de
la méthode alternative confirmée. De plus, six éléments (d’aliments) au niveau zéro L0 se sont avérés
négatifs avec la méthode de référence et la méthode alternative.
Tableau D.1 — Plan pour les méthodes alternatives et de référence (niveaux de contamination

fractionnel et élevé)
Bloc 1: Bloc 2: Bloc 3: Bloc 4:
Éléments d’aliments 1 à 12
1à3 4à6 7à9 10 à 12
Facteur 3 microbiote annexe a b a b b a b a
Facteur 4 condition
a b b a a b b a
d’incubation

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Tableau D.2 — Résultats d’essai

Résultats d’essai individuels
Niveau de contamination fractionnel Niveau de contamination élevé

(0,8 ufc/prise d’essai) (10 ufc/prise d’essai)
Méthode Méthode de Méthode Méthode de

alternative référence alternative référence
Élé- Type
Confi-
ment d’ali-
gura- R1 R2 R1 R2 R1 R1
d’aliment
tion
ment
1 1 0 1 1 1 1
1 A
2 0 0 1 0 1 1
3 1 0 0 0 1 1
4 A
4 1 0 1 0 1 1
5 0 0 0 0 1 1
7 A
6 0 0 1 1 1 1
7 1 0 0 0 1 1
10 A
8 1 1 0 0 1 1
1 1 1 1 1 1 1
2 B
2 0 0 1 1 1 1
3 0 0 0 0 1 1
5 B
4 1 1 1 0 1 1
5 1 1 1 0 1 1
8 B
6 1 0 1 1 1 1
7 0 0 1 1 1 1
11 B
8 1 0 0 0 1 1
1 1 0 1 1 1 1
3 C
2 0 0 1 0 1 1
3 1 1 0 0 1 1
6 C
4 1 0 1 1 1 1
5 0 0 1 0 1 1
9 C
6 1 0 1 1 1 1
7 1 0 1 1 1 1
12 C
8 1 0 0 0 1 1
Légende
1: positif, 0: négatif, R1: réplicat 1, R2: réplicat 2
NOTE De plus, six éléments (d’aliments) au niveau zéro L0 se sont avérés négatifs avec les deux méthodes (pas de réplicats).
Les résultats de l’étude de sensibilité au niveau fractionnel L1 (voir le Tableau 4) sont fournis dans le
Tableau D.3 (pour les calculs, voir l’ISO 16140-2:2016, 5.1.3). La limite d’acceptabilité (ND – PD) pour
une étude de méthodes non appariées du Tableau 5 (AL = 3) n’est pas atteinte. Il convient de faire des
recherches (par exemple, une analyse des causes) pour fournir une explication à propos des résultats
observés.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Table D.3 — Étude de sensibilité (niveau fractionnel L1)

Niveaux de ND − SE(alt) SE(ref) RT b FPRc
Configurations PA NA ND PD FP Na AL
facteurs PD % % % %
Toutes les confi-
gurations et 1à8 11 12 15 10 0 48 5 3 58,3 72,2 47,9 0
types d’aliments
Type d’aliment A 1à8 2 6 4 4 0 16 0 — 60,0 60,0 50,0 0
Type d’aliment B 1à8 5 3 5 3 0 16 2 — 61,5 76,9 50,0 0
Type d’aliment C 1à8 4 3 6 3 0 16 3 — 53,8 76,9 43,8 0
Technicien «a» 1,3,5,7 6 7 6 5 0 24 1 — 64,7 70,6 54,2 0
Technicien «b» 2,4,6,8 5 5 9 5 0 24 4 — 52,6 73,7 41,7 0
Milieu de —
2,3,5,8 1 10 5 8 0 24 −3 64,3 42,9 45,8 0
culture «a»
Milieu de —
1,4,6,7 10 2 10 2 0 24 8 54,5 90,9 50,0 0
culture «b»
Microbiote —
1,3,6,8 6 5 6 7 0 24 −1 68,4 63,2 45,8 0
annexe «a»
Microbiote —
2,4,5,7 5 7 9 3 0 24 6 47,1 82,4 50,0 0
annexe «b»
Condition —
1,4,5,8 8 6 4 6 0 24 −2 77,8 66,7 58,3 0
d’incubation «a»
Condition —
2,3,6,7 3 6 11 4 0 24 7 38,9 77,8 37,5 0
d’incubation «b»
Légende
de faux positifs
b RT = (PA + NA)/N × 100 %.
c FPR = FP/NA × 100 %.
NOTE 1 Les calculs sont effectués d’après les formules de l’ISO 16140-2:2016, 5.1.3. Par exemple, la sensibilité
de la méthode alternative avec la condition d’incubation «b» est calculée comme indiqué par la Formule (D.1):
PA+PD 3+ 4
SE(alt) = ×100 % = ×100 % = 38 , 9 % (D.1)
PA+ND+PD 3 + 11 + 4
NOTE 2 Dans cet exemple, les résultats de la méthode alternative et ceux de la méthode alternative confirmée
sont identiques. Pour cette raison, le nombre de faux positifs est toujours égal à 0 et le taux de faux positifs est
toujours égal à 0 %. Le facteur «milieu de culture» a une influence considérable sur la sensibilité de la méthode
de référence, qui augmente de 42,9 % à 90,9 % entre le niveau «a» et le niveau «b» de ce facteur.
La performance globale de la méthode alternative (par rapport à la méthode de référence) est évaluée
en termes de valeur RLOD globale. Dans cet exemple, une valeur RLOD de 1,35 a été calculée pour
la catégorie d’aliment «Lait et produits laitiers traités à la chaleur» en utilisant le mode opératoire
en 5.1.1.4.
NOTE 3 D’après le modèle mixte décrit dans la Référence [12], une valeur RLOD plus précise d’un point de vue
statistique de 1,53 est obtenue.
Étant donné que l’étude est une étude de méthodes non appariées, l’AL est égale à 2,5 et le RLOD obtenu
dans cet exemple satisfait au critère.
Les calculs reposaient sur le fait que les niveaux de contamination sont connus (voir le Tableau D.2). Si
les niveaux de contamination ne sont pas connus, seule une estimation directe du RLOD est possible.
Cela est décrite dans 5.1.1.4. Dans ce cas, aucune information sur le LOD50 ne peut être obtenue.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Les résultats de l’étude factorielle (voir en 5.1.1.4) pour les deux méthodes applicables au RLOD sont
indiqués dans le Tableau D.4.
Tableau D.4 — Étude factorielle pour les deux méthodes applicables au RLOD

Différence logarith-
Facteur Niveau de facteur LODalt LODref log10 RLOD mique de RLOD
(niveau b – niveau a)
Technicien a 0,90 0,80 0,05 0,15
b 1,02 0,63 0,21
Milieu de culture a 1,16 1,69 −0,17 0,58
b 0,80 0,31 0,41
Microbiote annexe a 0,71 0,80 −0,05 0,37
b 1,31 0,63 0,32
Condition
a 0,47
d’incubation 0,63 0,80 −0,10
b 1,49 0,63 0,37
NOTE 1 Les valeurs log10 du RLOD relatives aux deux différents niveaux de chaque facteur sont indiquées avec les
différences correspondantes.
NOTE 2 La déviation des derniers chiffres est due à l’erreur d’arrondissement.
Comme il est expliqué en 5.1.1.4, un facteur est considéré comme ayant un effet important sur le RLOD
si la valeur absolue de la différence correspondante est supérieure à 0,6 (ce qui signifie que la valeur
RLOD à l’un des niveaux de facteurs est le quadruple de la valeur à l’autre niveau de facteur). Le critère
est satisfait pour les quatre facteurs.
Les différences indiquées dans le Tableau D.4 donnent une indication de l’effet du facteur associé. Par
exemple, pour le facteur «milieu de culture», la valeur de 0,58 signifie que ce facteur a un effet important
sur le RLOD, même si le critère est (tout juste) satisfait. En effet, une augmentation log10 du RLOD de
0,58 signifie que le rapport RLODNiveau b/RLODNiveau a est 100 ,58 ≅ 3 , 80 , donc le RLOD au niveau «b» du
facteur «condition d’incubation» est plus de trois fois supérieur à celui au niveau «a». Cela correspondrait,
par exemple, à une augmentation d’environ trois fois de la valeur LOD50 de la méthode alternative alors
que celle de la méthode de référence est restée constante. En d’autres termes, la méthode alternative
est nettement moins sensible au niveau «b» qu’au niveau «a» que la méthode de référence. Cela corrobore
les résultats de l’étude de sensibilité indiqués dans le Tableau D.3.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Annexe E
(informative)
Exemple d’étude factorielle de validation de méthodes dans

seul un laboratoire pour la variabilité du LOD50 d’une méthode
qualitative sans méthode de référence
Cette annexe fournit un exemple d’illustration du mode opératoire de calcul des paramètres de
validation conformément à 5.1.2.4 pour une méthode de recherche de Listeria monocytogenes avec le
bouillon Fraser 1/2 et la gélose Listeria selon Ottaviani et Agosti conformément à l’ISO 11290-1.
— Facteur 1 – Technicien: a = Peter et b = Jane.
— Facteur 2 – Milieu de culture: fournisseur a et fournisseur b.
— Facteur 3 – Température de conservation: a = 8 jours à 2 °C et b = 8 jours à 8 °C.
— Facteur 4 – Durée d’incubation: a = 22 h et b = 28 h.
Le plan d’expérience indiqué dans le Tableau 6 est mis en œuvre. Les essais ont été effectués avec
seize éléments d’aliments attribués à quatre blocs, chaque bloc comprenant deux configurations, à
trois niveaux de contamination. Les seize éléments d’aliments ont été extraits de la catégorie d’aliment
combinée «Produits laitiers» comprenant «Lait et produits laitiers traités à chaud» et «Lait cru et
produits laitiers», et proviennent d'au moins trois types d'aliments:
a) lait pasteurisé;
b) Gouda pasteurisé;
c) fromage de chèvre pasteurisé;
d) crème pasteurisée;
e) camembert au lait cru;
f) lait de chèvre cru;
g) lait de vache cru;
h) bleu au lait cru;
i) lait infantile;
j) lait en poudre;
k) poudre de lactosérum;
l) beurre;
m) crème Chantilly;
n) panna cotta;
o) crème glacée à la vanille;
p) crème anglaise.
Les données sont indiquées dans le Tableau E.1.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Tableau E.1 — Plan et résultats d’essai

Résultats d’essai individuels
Élevé
Fractionnel
Blanc (10 ufc/prise
(0,8 ufc/prise d’essai)
d’essai)
Configuration Élément R1 R2 R1 R2 R3 R4 R1 R2
1 0 0 0 1 1 0 1 1
1
2 0 0 1 0 0 0 1 1
3 0 0 0 0 0 0 1 1
5
4 0 0 1 1 0 0 1 1
5 0 0 1 1 1 0 1 1
9
6 0 0 0 0 1 0 1 1
7 0 0 0 1 0 0 1 1
13
8 0 0 0 0 0 0 1 1
1 0 0 0 0 1 0 1 1
2
2 0 0 0 1 0 0 1 1
3 0 0 0 0 0 0 1 1
6
4 0 0 1 0 1 0 1 1
5 0 0 0 0 0 0 1 1
10
6 0 0 0 0 1 0 1 1
7 0 0 0 1 0 1 1 1
14
8 0 0 1 0 0 1 1 1
1 0 0 1 0 1 0 1 1
3
2 0 0 0 1 0 0 1 1
3 0 0 0 0 0 0 1 1
7
4 0 0 0 0 0 0 1 1
5 0 0 1 0 0 1 1 1
11
6 0 0 0 1 0 0 1 1
7 0 0 0 0 0 0 1 1
15
8 0 0 0 1 0 0 1 1
1 0 0 1 0 0 1 1 1
4
2 0 0 1 0 0 0 1 1
3 0 0 1 0 0 1 1 1
8
4 0 0 1 1 1 1 1 1
5 0 0 1 0 1 1 1 1
12
6 0 0 0 0 0 1 1 1
7 0 0 0 1 0 1 1 1
16
8 0 0 1 0 1 0 1 1
Légende
1: positif, 0: négatif
Les valeurs LOD50 sont calculées séparément pour chaque configuration (voir 5.1.2.4). Les résultats
sont indiqués dans le Tableau E.2.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Tableau E.2 — Valeurs LOD50 pour chaque configuration

Configuration LOD50 log10 LOD50
1 0,96 −0,02
2 1,69 0,23
3 2,44 0,39
4 0.80 −0.10
5 0.80 −0,10
6 1,69 0,23
7 1,40 0,15
8 1,40 0,15
En prenant la moyenne (0,012) des valeurs log10 LOD50 des configurations, une valeur LOD50 globale
de 1,12 ufc/prise d’essai (= 100,012) est obtenue.
Les résultats de l’analyse des effets factoriels sont indiqués dans le Tableau E.3.
Tableau E.3 — Résultats de l’analyse des effets factoriels

Différence logarith-
Niveau de
Facteur Configurations LOD50 log10 LOD50 mique de LOD50
facteur
(niveau b – niveau a)
a = Peter 1,3,5,7 1,27 0,10
Technicien 0,02
b = Jane 2,4,6,8 1,33 0,13
Fournisseur a 2,3,5,8 1,47 0,17
Milieu de culture −0,10
Fournisseur b 1,4,6,7 1,16 0,06
Température de a = 2 °C 1,3,6,8 1,54 0,19
conservation 1,10 0,04 −0,14
(8 jours) b = 8 °C 2,4,5,7
a = 22 h 1,4,5,8 0,96 −0,02
Durée d’incubation 0,27
b = 28 h 2,3,6,7 1,77 0,25
NOTE 1 Les valeurs log10 du LOD relatives aux deux différents niveaux de chaque facteur sont indiquées avec les différences
correspondantes.
NOTE 2 La déviation des derniers chiffres est due à l’erreur d’arrondissement.
Comme le montre le Tableau E.3, aucune des différences des valeurs log10 du LOD50 pour un facteur
particulier n’est inférieur à −0,6 ou supérieur à 0,6. Aucun des facteurs n’est considéré comme ayant un
effet significatif sur le LOD50.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Annexe F
(informative)
Détermination de la fidélité en cas d’échantillons artificiellement

contaminés instables
F.1 Généralités
Pour déterminer les écarts-types de répétabilité et de reproductibilité internes selon l’approche
conventionnelle, des essais sont effectués sur huit jours différents. Si l’inoculum dans les éléments
(d’aliments) est instable, l’écart-type de reproductibilité interne reflètera non seulement la variation
entre les résultats d’essai pour le même élément (d’aliment), mais également la variation due à
l’instabilité de l’inoculum dans l’élément (d’aliment). Cela est lié à des échantillons contaminés
artificiellement.
L’écart-type de reproductibilité interne calculé sera très vraisemblablement supérieur à l’écart-type de
reproductibilité interne inconnu réel. Il est possible de continuer à utiliser la reproductibilité interne
calculée comme limite supérieure de la variation réelle.
Deux possibilités d’ajustement de l’instabilité de l’échantillon sont décrites dans la présente annexe.
F.2 Ajustement des valeurs de mesure à l’aide d’une tendance linéaire

Très souvent, les mesures log10 sont linéaires en fonction du temps, ce qui signifie que l’instabilité est
causée par la croissance ou par la diminution continue de la viabilité. Dans ce cas, il est recommandé
de calculer la tendance linéaire et d’ajuster les valeurs de mesure en conséquence. Le calcul nécessite
plusieurs éléments:
— le nombre de jours d1 ,… , d8 des jours de mesure 1,…,8;
— la mesure log10 yij du ième réplicat le jour j;
∑ i=1 yij
1 5
— la moyenne y j = sur les 5 mesures log10 le jour j;
5
8
∑d j ;
1
— le nombre moyen de jours d =
8
j=1
8
∑d2j ;
1
— la moyenne du nombre de jours élevé au carré d2 =
8
j=1
∑ i=1 ∑ j=1 yij

1 5 8
— la moyenne y = sur les 40 mesures log10;
40
8
∑ y j2 ;
1
— la moyenne des valeurs de mesure élevées au carré y2 =
8
j=1
8
∑d j y j .
1
— la moyenne du produit entre le jour et la mesure, dy =
8
j=1

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Ajuster ensuite les valeurs de mesure comme suit:
dy − d ⋅ y
a) calculer la pente b = ;
2
d2 − d
b) calculer les moyennes ajustées y j = y j − b d j − d . ( )
L’écart-type de répétabilité interne est calculé à l’aide des valeurs de mesure non ajustées, comme
indiqué par la Formule (F.1):
8 5
∑∑ ( yij − y j )
1 2
sr ,interne = (F.1)
32
j=1 i =1
L’écart-type de reproductibilité interne est calculé comme indiqué par la Formule (F.2):
sI ,interne = s2A + sr2,interne (F.2)
8
∑ ( y j − y )
1 2 1
où s2A = − sr2,interne désigne la variance entre les jours ajustée selon la tendance.
6 5
j=1
F.3 Ajustement des valeurs de mesure à l’aide d’une méthode de référence

Si une méthode de référence est disponible, il est possible d’effectuer des essais en utilisant la méthode
de référence et la méthode alternative en parallèle. Il convient de réaliser ces essais indépendamment
sous des conditions de répétabilité lors d’un plan d’étude de méthodes non appariées.
Chaque jour, les échantillons sont soumis à essai sous des conditions de répétabilité pour la méthode de
référence et la méthode alternative. Le calcul nécessite plusieurs éléments:
a) pour la méthode alternative: la mesure log10 yij du ième réplicat le jour j, la moyenne
∑ ∑ i=1 ∑ j=1 yij

1 5 1 5 8
yj = yij sur les 5 mesures log10 le jour j et la moyenne y = sur les
5 i =1 40
40 mesures log10;
b) pour la méthode de référence: la mesure log10 xij du ième réplicat le jour j, la moyenne
∑ ∑ i=1 ∑ j=1 xij

1 5 1 5 8
xj = xij sur les 5 mesures log10 le jour j et la moyenne x = sur les
5 i =1 40
40 mesures log10.
Calculer ensuite la corrélation entre x j et y j . Si la corrélation est supérieure à 50 %, calculer les
moyennes ajustées comme indiqué par la Formule (F.3):
( )
y j = y j − x j − x (F.3)
Avec ces moyennes ajustées, calculer les écarts-types conformément à F.2.

Si la corrélation entre x j , y j ne dépasse pas 50 %, il n’est pas recommandé d’effectuer l’ajustement
d’après la méthode de référence comme décrit dans ce paragraphe.
NOTE Les composantes de la variance peuvent être calculées plus efficacement, avec une plus grande
fidélité, en utilisant l’approche du maximum de vraisemblance restreinte (REML).

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Annexe G
(informative)
Protocole pour la validation dans un seul laboratoire de méthodes

alternatives pour la confirmation microbiologique et le typage
Cette annexe est spécifiquement applicable à la validation dans un seul laboratoire de méthodes
alternatives pour la confirmation microbiologique et le typage. Cette validation se limite à la partie
confirmation ou typage d’une méthode spécifiée.
La validation dans un seul laboratoire de méthodes alternatives pour la confirmation microbiologique
et le typage doit être effectuée conformément à l’étude comparative des méthodes indiquée dans
l’ISO 16140-6:2019, Article 6. La méthode alternative de confirmation doit reposer sur un principe de
mesure différent (par exemple, analyse de l’ADN, des protéines, immunologique, biochimique) de celui
utilisé dans la méthode de détection ou de quantification, ou doit utiliser des marqueurs différents (par
exemple, différents anticorps, différentes amorces). Une étude de validation de méthodes dans un seul
laboratoire sert à démontrer la performance de la méthode dans le laboratoire qui a réalisé l’étude. Les
résultats sont valides uniquement pour ce laboratoire particulier.

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

Bibliographie
[1] ISO 3534-3:2013, Statistique — Vocabulaire et symboles — Partie 3: Plans d’expériences

[2] ISO 4833-1, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour le dénombrement
des micro-organismes — Partie 1: Comptage des colonies à 30 °C par la technique d’ensemencement
en profondeur
[3] ISO 6579-1, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche, le
dénombrement et le sérotypage des Salmonella — Partie 1: Recherche des Salmonella spp.
[4] ISO 11290-1, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le
dénombrement de Listeria monocytogenes et de Listeria spp. — Partie 1: Méthode de recherche
[5] ISO 16140-3, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 3: Protocole
pour la vérification de méthodes de référence et de méthodes alternatives validées dans un seul
laboratoire
[6] ISO 16140-5, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 5: Protocole
pour la validation interlaboratoires de méthodes non commerciales par plan factoriel
[7] ISO 16140-6, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 6:
Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) pour la confirmation
microbiologique et le typage
[8] ISO 17468:2016, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et recommandations
techniques pour le développement ou la révision d’une méthode de référence normalisée
[9] ISO 21528-2, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le
dénombrement des Enterobacteriaceae — Partie 2: Technique par comptage des colonies
[10] ISO 22118, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la
détection et la quantification des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Caractéristiques
de performance
[11] Heisterkamp S.H., Hoekstra J.A., van Strijp-Lockefeer N.G.W.M., Havelaar A.H., Mooijman
K.A., in ’t Veld P.H. Statistical analysis of certification trials for microbiological reference materials.
(Report EUR 15008 EN). Commission of the European Communities, Luxembourg, 1993, 41 p
[12] Uhlig S., Gowik P. Efficient estimation of reproducibility of LOD and RLOD by means of GLMM.
Journal of Consumer Protection and Food Safety. 2018, 13(79). Disponible à l’adresse: https://doi
.org/10.1007/s00003-017-1130-0
[13] Uhlig S., Gowik P. Efficient estimation of in-house reproducibility and reproducibility standard
deviation in factorial validation studies. Journal of Consumer Protection and Food Safety. 2018,
13(315). Disponible à l’adresse: https://doi.org/10.1007/s00003-018-1157-x

Client : SEAAL
ISO 16140-4:2020(F)

ICS 07.100.30
Prix basé sur 46 pages
© ISO 2020 – Tous droits réservés

Iso 16140-4 - 2020 (F) PDF

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Iso 16140-4 - 2020 (F) PDF

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Date livraison : mercredi 19 mai 2021 11:06:14

DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT

ii ﻿ © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés ﻿ iii

iv ﻿ © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés ﻿ v

vi ﻿ © ISO 2020 – Tous droits réservés

Figure 1 — Logigramme relatif à l’application de la série ISO 16140

© ISO 2020 – Tous droits réservés ﻿ vii

Figure 2 — Utilisation de méthodes alternatives de confirmation (voir l’ISO 16140-6)

viii ﻿ © ISO 2020 – Tous droits réservés

L’objectif du présent document est d’évaluer la performance des méthodes de détection ou de

© ISO 2020 – Tous droits réservés ﻿ ix

x ﻿ © ISO 2020 – Tous droits réservés

NORME INTERNATIONALE ISO 16140-4:2020(F)

Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des

© ISO 2020 – Tous droits réservés ﻿ 1

2 ﻿ © ISO 2020 – Tous droits réservés

[SOURCE: ISO 16140‑1:2016, 2.35, modifiée — La Note 1 à l’article a été légèrement modifiée.]

© ISO 2020 – Tous droits réservés ﻿ 3

[SOURCE: ISO 16140‑1:2016, 2.53, modifiée — La Note 1 à l’article a été ajoutée.]

[SOURCE: ISO 16140‑1:2016, 2.61]

4 Principes généraux de la validation dans un seul laboratoire de méthodes de

4 ﻿ © ISO 2020 – Tous droits réservés

— plan d’étude factoriel orthogonal (voir l’ISO 3534-3);

4.2 Principes de l’approche factorielle

© ISO 2020 – Tous droits réservés ﻿ 5

4.3 Principes de l’approche conventionnelle

6 ﻿ © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés ﻿ 7

5 Protocole technique de validation — Approche factorielle

5.1 Méthodes qualitatives

5.1.1.1 Considérations générales

5.1.1.2 Étude comparative orthogonale factorielle des méthodes

5.1.1.2.1 Sélection des échantillons

8 ﻿ © ISO 2020 – Tous droits réservés

5.1.1.2.2 Sélection des facteurs de la méthode

© ISO 2020 – Tous droits réservés ﻿ 9

5.1.1.2.3 Plan d’expérience

10 ﻿ © ISO 2020 – Tous droits réservés

La Figure 3 donne une vue d’ensemble du plan relatif au technicien «a».

Figure 3 — Plan relatif au technicien «a»

Il est nécessaire de confirmer le résultat (final) de la méthode alternative conformément à

© ISO 2020 – Tous droits réservés ﻿ 11

5.1.1.3 Calcul et interprétation de la sensibilité

Tableau 4 — Résumé des résultats obtenus avec la méthode de référence et la méthode

12 ﻿ © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés ﻿ 13

5.1.1.4 Calcul et interprétation du niveau RLOD

Pour un facteur d’intérêt spécifique, nommer:

d = Y ( b ) −Y ( a ) = log10 ( RLOD ( niveau "b" ) ) − log10 ( RLOD ( niveau "a" ) ) (1)

14 ﻿ © ISO 2020 – Tous droits réservés

5.1.1.5 Étude d’inclusivité/exclusivité

5.1.2.1 Considérations générales

En l’absence de méthode de référence, la validation de la méthode est légèrement différente du

5.1.2.2 Étude factorielle

© ISO 2020 – Tous droits réservés ﻿ 15

5.1.2.3 Calcul et interprétation de la sensibilité

5.1.2.4 Calcul et interprétation du niveau LOD50

16 ﻿ © ISO 2020 – Tous droits réservés

MeanAcrossItems = mean(c(Item1, Item2,…, ItemN))

5.1.2.5 Étude d’inclusivité/exclusivité

Les essais d’inclusivité/exclusivité doivent être effectués conformément à 5.1.1.5.

ii © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés iii

iv © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés v

vi © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés vii

viii © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés ix

x © ISO 2020 – Tous droits réservés

NORME INTERNATIONALE ISO 16140-4:2020(F)

© ISO 2020 – Tous droits réservés 1

2 © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés 3

4 © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés 5

6 © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés 7

8 © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés 9

10 © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés 11

12 © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés 13

14 © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés 15

16 © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés 17

18 © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés 19

20 © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés 21

22 © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés 23

24 © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés 25

26 © ISO 2020 – Tous droits réservés

© ISO 2020 – Tous droits réservés 27