Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
danalyse quantitative
par le profil dexactitude
1
Collectif
Sommaire
Introduction p. 03
Conclusion p. 135
https://intranet.inra.fr/cahier_des_techniques
1
Le Cahier des Techniques de lInra est une publication destine changer des mthodes et
des savoir-faire. Ce n'est pas une revue Comit de lecture. Les auteurs sont seuls
responsables de leurs textes.
2
UR1204 Met@risk - Mthodologie danalyse de risque alimentaire)- INRA F- 75231 Paris cedex 05.
01 44 08 16 52 max.feinberg@paris.inra.fr
3
Unit de Pharmacocintique-Pharmacodynamie - AFSSA F-35302 Fougres cedex, m.laurentie@afssa.fr
4
US0010 LAS, INRA F- 62000 Arras www.lille.inra.fr/las
5
UAR1185- Dlgation au partenariat avec les entreprises DV/DPE - INRA - F-75338 Paris Cedex 07
01 42 75 91 65 marie.huyez@paris.inra.fr
Le Cahier des Techniques de lInra
2
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude
Introduction
Max Feinberg
Pour celle ou celui qui a entre les mains ce numro spcial du Cahier des
Techniques de lInra, deux questions peuvent se poser :
Notre but est de vous convaincre que cest beaucoup plus simple quon ne veut
le faire croire . Merci de nous aider atteindre cet objectif.
Max Feinberg1
En outre, il nous a sembl intressant dillustrer, de faon moins aride quun ta-
bleau chiffr2, ce que jai appel le taux de satisfaction des participants et les
bnfices quils ont pu retirer de ces deux coles. Vous trouverez donc ci-aprs
une compilation de tmoignages classs selon le numro dunit, manant des
1. UR1204 Met@risk - Mthodologie danalyse de risque alimentaire INRA - F-75231 Paris cedex 05.
01 44 08 16 52 max.feinberg@paris.inra.fr
2 Cependant, le lecteur intress peut retrouver ces statistiques pour lcole de 2008 en tlchargeant le fichier
https://intranet.inra.fr/mission_qualite/content/download/3881/36715/version/1/file/Synth%E8se+%E9val
uation+ETVM+physicochimiques+2008.pdf
Rappelons que lensemble des prsentations et fichiers modles Excel sont sur
le site :
https://intranet.inra.fr/mission_qualite/acces_thematiques/formations_et_ecoles/ecole_des_tec
hniques_validation_methodes_2008/recueil_presentations_edt_validation_methodes_2008
L'Inra dispose d'un unique rseau d'units exprimentales, lieux prennes d'observations de
multi donnes dans leurs contextes. En faire l'acquisition avec les mthodes adaptes, les va-
lider, les enregistrer, les conserver, les rendre accessibles durablement est un des socles de ce
que l'on construit pour demain. Ceux qui nous succderont dans ces units utiliseront certai-
nes de ces donnes pour des objets de recherche non connus ce jour. Nous avons pour eux
aussi un devoir de rigueur. La validation des mthodes est un pralable
L'unit exprimentale de Pech Rouge collecte les donnes disponibles depuis la cration du
domaine, en 1956, ce jour en termes de relevs mto, d'cophysiologie de la vigne, de qua-
lit du raisin et du vin. C'est un exercice difficile au niveau de l'accs aux donnes anciennes,
pour les saisir ds lors que les mthodes sont valides.
UR1119 URGSE - Gochimie des sols et des eaux- INRA -F-13545 Aix-en-Provence
Fabienne Trolard, Directrice de lunit
Dans le domaine de la gochimie des sols et des eaux, nous sommes absolument convaincus
et depuis longtemps de la ncessit de mettre en place des mthodes robustes de validation de
mthodes analytiques. En effet, la difficult principale que nous rencontrons, en particulier
pour les analyses des eaux, est que nous ignorons les niveaux de concentrations des anions et
cations qui peuvent tre trs variables avec la saison. Seules des mesures justes et fidles
constituent des acquis analytiques fiables dans le temps et permettent de dvelopper des mo-
dles gochimiques. Grce ces deux de formation coles nous avons pu initier dans l'unit et
mener jusqu'au bout, la validation des mesures des anions dans les eaux par chromatographie
ionique. Ceci a conduit la rdaction d'un article par Monique Mayor et Guilhem Bourri.
Lunit de Recherches sur les Herbivores, constitue le 1er janvier 1999, regroupe en 2009
174 agents dont 62 chercheurs et ingnieurs. Elle est organise en 8 quipes de recherche, une
quipe logistique, une installation exprimentale et dispose dun abattoir exprimental. De
plus, elle accueille chaque anne de 80 100 tudiants (dont 15 20 thsards et post-doc). La
mission de l'URH est de contribuer au dveloppement des systmes durables d'levage des
herbivores en accord avec les attentes socitales, c'est--dire conomique et dveloppement
rural, respect de l'environnement, qualit des produits et bien-tre animal. Dans ce contexte,
les activits de lURH sont majoritairement orientes vers la mesure des caractres qui dter-
minent les phnotypes des animaux, principalement les herbivores.
Afin d'atteindre les deux objectives prioritaires fiabilit des rsultats mesurables et tra-
abilit des travaux de recherche , le groupe qualit a identifi diffrentes actions mettre en
place qui ont permis en particulier de :
- Fiabiliser les rsultats grce la gestion des instruments de mesures et la mise en place
d'actions de mtrologie sur diffrents quipements tels que les balances, les pipettes, les
spectrophotomtres, les pH-mtres et le suivi des tempratures dans les enceintes climati-
ques.
- Harmoniser les pratiques lors de la mise en place des exprimentations animales par la
mise disposition de procdure et de trame-type de protocole exprimentaux.
- Prenniser les savoir-faire par la rdaction d'environ 400 modes opratoires dcrivant les
diffrentes mthodes d'analyses utilises.
Ce travail a permis l'unit d'atteindre environ 90% du niveau 1 du Rfrentiel INRA en
2008 (Auto-valuation 2008). Cependant, il nous est apparu important de complter ces ac-
tions par la validation de nos mthodes de laboratoires les plus stratgiques . En effet,
l'Unit dispose dune large gamme de mthodes analytiques (quantitatives, semi-quantitatives
et qualitatives) relevant de la chimie, de la biochimie, de la physiologie et de la biologie cellu-
laire et molculaire, ces mthodes originales n'tant pour la plupart que partiellement, voire
pas du tout, valides au sens qualit du terme (domaine de validit, linarit, spcificit,
fidlit). Cette tape devrait permettre d'apporter une aide au scientifique comme l'optimi-
sation des protocoles exprimentaux (nombre d'animaux utiliser, nombre de prlvement
raliser, mthodes utiliser en fonction des niveaux attendus). Cela participera consolider
l'obtention de rsultats fiables et interprtables en vue de leur valorisation lors des nombreu-
ses communications orales et publications scientifiques de lunit (environ 330 publications
annuelles dans le cas de lURH).
De plus, la mise en place de cette approche de validation de mthode devrait renforcer le dia-
logue entre le chercheur et l'analyste, notamment au moment de la validation d'une mthode
d'analyse pour s'assurer que les variables mesures correspondront bien l'utilisation faite
ultrieurement des rsultats obtenus. Plus gnralement, la validation des mthodes est un
levier daction important parmi dautres pour mieux prciser les caractres mesurs et ainsi
les dfinir. A ce titre, la dmarche engage va contribuer au projet ATO pour Animal Trait
Ontology (ou Ontologie des caractres des animaux) dont lobjectif majeur est la dfinition
des caractres phnotypiques des animaux. Les dfinitions et les mesures de ces caractres
doivent tre standardises pour tre comparables partout dans le monde et dune espce
Chapitre I
Max Feinberg1
Rsum : La validation des mthodes est un problme rcurrent dans les laboratoires. Cet
article a pour but dexpliquer les objectifs et principes fondamentaux de la validation en
prsentant les principes de lassurance qualit dans les laboratoires.
1. UR1204 Met@risk - Mthodologie danalyse de risque alimentaire - INRA F- 75231 Paris cedex 05.
01 44 08 16 52 max.feinberg@paris.inra.fr
de la spcificit par la mthode des ajouts doss et talonnage linaire par les moindres
carrs.
Mais rien nest dit sur le niveau de garantie atteindre pour lestimation de ces critres, par
exemple en termes de nombre de mesures, ni ce quon doit en faire par la suite pour
effectivement valider. En particulier, comment doit-on faire pour vrifier quils permettent
datteindre un niveau de qualit donn ? Le principe du traitement statistique des donnes
dvelopp dans ces guides de validation consiste raliser un certain nombre de tests dit de
signification de lhypothse nulle. Ils ont le gros inconvnient de favoriser les mthodes les
plus dispersives, cest--dire dont la fidlit est mauvaise. La dmonstration de cet
inconvnient des guides classiques requiert des dveloppements importants qui alourdiraient
ce texte. Le lecteur intress pourra trouver dans Feinberg M. (2009), Boulanger et al. (2003)
et Feinberg M. et al., (2004), tous les lments qui appuient cette affirmation. Cest pourquoi,
nous avons dvelopp une approche mieux adapte qui dbouche sur un autre outil statistique
appel le profil dexactitude.
Il est alors possible de dfinir un certain nombre de types de dossiers de validation qui se
solderont par des documents prsentables un organisme de contrle. Le dossier de
validation, une fois constitu, permettra aussi dtablir des valeurs seuils de qualification du
matriel de mesure quil faudra vrifier, par exemple, avant chaque utilisation. Ces tests de
qualification font lobjet de fiches de qualification spcifiques de chaque instrument
employ. Une vrification daptitude doit aussi avoir lieu si la mthode est transfre sur un
autre matriel. Il ne faut donc pas confondre la validation de la mthode avec un test de
qualification de linstrumentation.
2. Vocabulaire et dfinitions
Le vocabulaire relatif la validation est trs abondant, souvent foisonnant et souvent confus.
Nous avons dcid de choisir les dfinitions proposes en 2007 dans la dernire version du
Vocabulaire International de Mtrologie (VIM) (Guide ISO/CEI 99:2007) car elles
reprsentent leffort le plus rcent de normalisation dans ce domaine.
Exactitude de VIM 2.13 a) troitesse de l'accord entre une valeur mesure et une
mesure, et 2.14 valeur vraie du mesurande.
exactitude b) troitesse de l'accord entre les valeurs mesures qui sont
attribues au mesurande.
Incertitude de VIM 2.27 Paramtre qui caractrise la dispersion des valeurs attribues
mesure, un mesurande, partir des informations utilises.
incertitude L'incertitude de mesure comprend des composantes
provenant d'effets systmatiques, telles que les composantes
associes aux corrections et aux valeurs assignes des
talons, ainsi que l'incertitude dfinitionnelle. Parfois, les
effets systmatiques connus ne sont pas corrigs mais traits
comme des composantes de l'incertitude.
Le paramtre qui sert exprimer lincertitude peut tre, par
exemple, un cart-type appel incertitude-type (ou un de ses
multiples) ou la demi tendue d'un Intervalle ayant un
niveau de confiance dtermin.
Limite de VIM 4.18 Valeur mesure, obtenue par une procdure opratoire
dtection donne, pour laquelle la probabilit de dclarer faussement
l'absence d'un constituant dans un matriau est , tant
donne la probabilit de dclarer faussement sa prsence.
La notation utilise dans cette dfinition reprsente un
risque derreur (dit de seconde espce) et ne doit pas tre
confondue avec la proportion de la dfinition de
lintervalle de tolrance.
Aptitude d'un systme de mesure, utilisant une procdure
Slectivit VIM 4.13
opratoire spcifie, fournir des rsultats de mesure pour
un ou plusieurs mesurandes, qui ne dpendent pas les uns
des autres ou de toute autre grandeur existant dans le
systme en cours de mesurage.
Spcificit UIPAC Stade ultime de la slectivit.
VIM 5.18 Valeur d'une grandeur, dont l'incertitude de mesure associe
Valeur de
est considre communment comme suffisamment petite
rfrence
pour que la valeur puisse servir de base de comparaison
pour les valeurs de grandeurs de mme nature.
VIM 2.45 Vrification que des exigences spcifies sont adquates
Validation
pour un usage dtermin. Le terme caractrisation
sapplique la mthode, alors que le terme vrification
sapplique au rsultat rendu. La validation de la mthode
consiste donc vrifier si les rsultats sont adquats en vue
dun usage dfini.
VIM 2.44 Fourniture de preuves tangibles qu'une entit donne
Vrification
satisfait des exigences spcifies, en prenant en compte
toute incertitude de mesure.
Ensemble des types de matrice auquel sapplique la
Domaine
mthode, en tenant compte de la gamme de concentrations
d'application
sur laquelle doit porter la validation.
<de la mthode>
Le profil dexactitude est bas sur une application directe des principes dcrits dans les
normes de la srie ISO 5725 (1, 2, 3, 4 ; 1994)]. On y propose un modle statistique pour
estimer lexactitude (justesse et fidlit) dune mthode ou de rsultats. Ce modle dcrit un
mesurage z dun mesurande Z sous la forme :
z=m+B+e
O m est la moyenne gnrale de lchantillon homogne, B la composante du biais du
laboratoire sous condition de rptabilit et e lerreur alatoire survenant dans chaque
mesurage, sous condition de rptabilit. Dans le cas dune tude inter-laboratoires, la
composante du biais B provient des laboratoires, mais elle peut aussi provenir de toute autre
source dincertitude, comme le jour, loprateur, linstrument... dans le cas dune tude intra-
laboratoire. Dans le vocabulaire statistique, un tel modle est dit modle danalyse de la
variance un seul facteur effets alatoires ou aussi modle des composantes de la
variance (en anglais, One-Way ANOVA Random Effect Model). Il est trs rpandu dans la
recherche agronomique.
Outre les mthodes statistiques pour calculer les critres dexactitude, les normes ISO 5725
prcisent aussi en dtail lorganisation de la collecte et les prcautions respecter.
Daprs sa dfinition, la fidlit peut tre estime sous plusieurs conditions, comme la
rptabilit, la fidlit intermdiaire ou la reproductibilit. Dans tous les cas, la fidlit est
quantifie par un cart-type, quil soit de rptabilit et not sr, de fidlit intermdiaire sFI ou
de reproductibilit sR. On peut tablir une chelle de complexit entre ces diffrents carts-
sR = sr2 + sL2
sr
Sources de variation
0 1 2 n Plusieurs
Jour ou Jour et Sources laboratoires
Oprateur Oprateur
Figure 1 : les diffrentes estimations de la fidlit dune mthode en fonction des sources de
variation impliques
Dune faon gnrale, le choix des sources de variation pour organiser les sries de mesure
doit reflter au mieux les composantes de lincertitude qui risquent dapparatre lors de
lapplication en routine de la mthode valider.
Dans la mthode du profil dexactitude, il est indispensable de collecter les donnes en
plusieurs sries et en contrlant les sources de variation. Sinon, il est impossible de construire
un profil dexactitude.
120%
Recouvrement (%)
110%
100%
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
90%
Domaine de validit
70%
Domaine de validation
60%
Concentration connue (mg/L)
Tous les calculs sont effectus sparment pour chaque niveau de concentration k, permettant
dobtenir k carts-types de fidlit puis k intervalles de tolrance qui une fois runis servent
construire le profil. La figure 2 illustre un exemple de profil dexactitude construit
avec 3 niveaux de concentration 0,4 ; 2,0 et 4,0 mg/l qui dlimitent le domaine de
validation (ou dapplication) de la mthode valider.
Les lments graphiques entrant dans le profil dexactitude sont les suivants :
sur laxe horizontal, la concentration thorique des niveaux (soit les valeurs de rfrence
assignes aux niveaux) ;
sur laxe vertical, simultanment :
les limites des intervalles de tolrance desprance calculs sur les concentrations
retrouves et exprimes en pourcentages (sous la forme dun taux de recouvrement ou
dune exactitude relative) ;
les intervalles dacceptabilit, dfinis en fonction de lobjectif de la mthode,
exprims de la mme faon que les intervalles de tolrance.
La stratgie dinterprtation de ce graphique est dcrite en dtail par Max Feinberg (2010 c).
Cependant, dune part, les limites dacceptabilit, dautre part, la proportion qui sert
calculer les intervalles de tolrance dpendent strictement du contexte dutilisation de la
mthode et doivent tre adapts chaque cas. Sur la figure 2, dans le domaine de validit,
dlimit par les traits verticaux discontinus, la mthode est capable de produire une
ISO 13843 (NF T90-460) Qualit de l'eau, Lignes directrices pour la validation des mthodes
microbiologiques (2001) ISO, Genve
ISO 16140 Microbiologie des aliments, Protocole pour la validation des mthodes
alternatives (2003) ISO, Genve
ISO 17994 Qualit de l'eau, Critres pour tablir l'quivalence entre les mthodes
microbiologiques (2004) ISO, Genve
Bibliographie
Boulanger B., Chiap P., Dew W., Crommen J., Hubert Ph. (2003) An analysis of the SFSTP
guide on validation of chromatographic bioanalytical methods: progresses and limitations.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 32, 753-765
Commission SFSTP, Hubert P Nguyen-Huu JJ, Boulanger B, Chapuzet E, Cohen N,
Compagnon PA, Dew W, Feinberg M, Laurentie M, Mercier N, Muzard G, Valat L,
(2003) Validation des procdures analytiques quantitatives, Harmonisation des dmarches :
Partie I STP Pharma Pratiques 13(3) 101-138
Commission SFSTP, Hubert P Nguyen-Huu JJ, Boulanger B, Chapuzet E, Cohen N,
Compagnon PA, Dew W, Feinberg M, Laurentie M, Mercier N, Muzard G, Valat L,
(2006) Validation des procdures analytiques quantitatives, Harmonisation des dmarches :
Partie II Statistiques STP Pharma Pratiques 16(1) 30-60
Commission SFSTP, Hubert P Nguyen-Huu JJ, Boulanger B, Chapuzet E, Cohen N,
Compagnon PA, Dew W, Feinberg M, Laurentie M, Mercier N, Muzard G, Valat L,
(2006) Validation des procdures analytiques quantitatives, Harmonisation des dmarches :
Partie III Exemples d'application STP Pharma Pratiques 16(2) 87-121
Feinberg M., Boulanger B., Dew W., Hubert P. (2004) New advances in method validation
and measurement uncertainty aimed at improving the quality of chemical data. Analytical
Bioanalytical Chemistry 380: 502-514
Feinberg M., (2009) Labo-Stat : Guide de validation des mthodes danalyse Lavoisier
Tec&Doc, Paris
Feinberg M. (2010b) Mise en uvre du profil dexactitude. In Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 27-44
Feinberg M. (2010c) Interprtation du profil dexactitude. In Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 45-59
ISO (2007) Guide ISO/CEI 99 Vocabulaire international de mtrologie Concepts
fondamentaux et gnraux et termes associs (VIM), ISO, Genve
1
Max Feinberg
Introduction
Le profil dexactitude ne sapplique quaux mthodes compltement dveloppes et mises au
point. En particulier, la slectivit/spcificit doit avoir t tudie ainsi que le domaine
dapplication de la mthode valider, en termes de types de matrice et de niveaux de
concentrations. Le domaine dapplication du profil dexactitude sinspire directement de la
norme ISO 17025:2005 qui propose que
Bien sr, de nombreux dveloppements statistiques ne sont pas prsents mais sont
disponibles la rfrence (Feinberg M., 2009).
1 UR1204 Met@risk - Mthodologie danalyse de risque alimentaire- INRA F-75231 Paris cedex 05
01 44 08 16 52 max.feinberg@paris.inra.fr
Les limites dacceptabilit sont notes , lorsquelles sont exprimes de faon absolue dans
la mme unit que le mesurande, ou (1 ) 100 de faon relative. Dans la mesure du
possible, on va dfinir les limites dacceptabilit, en se rfrant un document, une pratique
de la profession ou une exigence scientifique. La liste des approches possibles qui sont
prsentes ci-dessous nest pas exhaustive et na quune valeur dexemple. Cependant, il
nentre pas dans le champ dapplication de ce texte de fixer des valeurs pour .
Lgislation. Plusieurs textes rglementaires fournissent des valeurs qui peuvent servir
de base pour fixer . Par exemple, la Dcision de la commission 2002/657 indique dans
son tableau 2 la justesse minimale des mthodes quantitatives pour les mdicaments et
rsidus de mdicaments vtrinaires dans les produits dorigine animale (Dcision de la
commission 2002/657 (CE) du 12 aot 2002). Dautres documents publis par la
Commission du Codex Alimentarius dfinissent une approche critre pour diffrents
analytes et matrices (FAO, 1997 ; CX/MAS 09/30/7) qui devrait clarifier la situation au
niveau international.
Pratiques de la profession. Certaines professions ont dfini des limites dacceptabilit
sous la forme dcart maximum acceptable (EMA), comme cela se pratique pour le
contrle de qualit ou la mtrologie lgale. Cest une approche classique en biologie
mdicale pour les paramtres du sang ou dans lindustrie pharmaceutique pour le
contrle des spcialits pharmaceutiques.
Modle empirique. Il existe des modles mathmatiques qui relient des performances
analytiques la concentration. Le plus connu est celui dvelopp par Horwitz vers
1980 ; il est repris dans de nombreux textes et permet de prdire la valeur attendue de
lcart-type de reproductibilit sR en fonction dun niveau de concentration X (en
particulier : dcision de la commission 2002/657 (CE) du 12 aot 2002 ; CX/MAS
09/30/7). Pour une concentration infrieure 10-7 kg.kg-1, il sexprime sous la forme,
sR = 0,02 X0.85 (1)
partir de performances connues. Par ailleurs, si on considre que la
reproductibilit limite reprsente un cart maximal acceptable (EMA) entre 2 mesures
faites en condition de reproductibilit, pour un niveau de confiance de 95%, celui-ci
vaut EMA 2,83sR et il vaudra EMA 4,24sR pour un niveau de 99%. En combinant
cette dfinition lquation (1) on peut dfinir la limite dacceptabilit partir de
lEMA et du modle Horwitz :
EMA 0, 057 X 0,85 ou EMA 0, 085 X 0,85
ou exprim en %.
0, 057 X 0,85 0, 085 X 0,85
EMA% 100 ou EMA% 100
X X
Dans le cas o on dispose dune estimation exprimentale de lcart-type de
reproductibilit par exemple si la mthode a t soumise une tude inter-
laboratoires on peut affiner les limites dacceptabilit en utilisant la valeur observe
de sR.
partir de la limite de quantification. Lorsque lobjectif de la mthode est
lapplication dune norme sanitaire, il est possible de dduire des limites
dacceptabilit, partir de la limite de quantification calcule avec le profil
dexactitude (Feinberg M., 2010c). La dcision de validation se fera alors en fonction
du risque encouru, obtenu a posteriori.
Il est souvent plus commode que les limites dacceptabilit soient exprimes sous la forme
dun pourcentage mais ce nest pas une obligation. De mme, pour simplifier, on choisit une
valeur constante pour tout le domaine dapplication. Mais, si le domaine dapplication est
large, on peut utiliser des valeurs variant en fonction du niveau de concentration.
Dans le cas o les valeurs de rfrence sont connues avec une incertitude leve, le choix des
limites dacceptabilit devra tre compatible avec cette incertitude.
2
Sous linfluence de la littrature anglo-saxonne, de nombreux analystes franais utilisent le terme
calibration la place dtalonnage.
Construire le tableau 2 qui rsume lensemble des essais et mesurages effectuer. Dans ce
tableau les concentrations des talons sont exprimes en quantits absolues (mg, g,) ou
relatives (mg/kg, g/kg, mg/l,). Aprs ralisation, les rponses sont notes dans les units
de la mthode instrumentale (surface du pic, hauteur de pic, absorbance,).
Le nombre de rptitions J pour chaque talon dans chaque srie est laiss au choix.
Cependant, il est recommand de prendre J 2. Lors de lutilisation en routine, on pourra
modifier le mode opratoire normalis de la mthode en fonction des conditions dmontres
comme tant capables de fournir des rsultats acceptables.
Si la mthode ncessite un talonnage, il faut veiller ce quaucune des rponses y obtenues
sur les chantillons de validation ne dpasse la rponse la plus leve ou la plus petite,
recueillie dans le tableau 1. En dautres termes, il ne faut pas extrapoler le modle en-dehors
des concentrations o il a t construit.
Il est impratif de raliser les mesures pour le plan de validation en appliquant la mthode
telle quelle sera utilise en routine. En particulier, appliquer au mieux les conditions
dtalonnage mme si celles-ci pourront tre modifies au vu des rsultats obtenus par le
profil dexactitude. Par contre, le nombre de rptitions utilises pour exprimer un rsultat
final doit tre fidlement respect. Par exemple, si chaque rsultat final est exprim comme la
moyenne de 2 rptitions, chaque essai doit tre fait selon cette mthode.
Dans le cas o des effets de matrice ont t mis en vidence lors du dveloppement de la
mthode, on peut tre amen raliser plusieurs plans de validation pour calculer un facteur
de correction qui sera appliqu en routine (sauf interdiction rglementaire). Il faut alors
effectuer deux plans de validation sur deux chantillons indpendants et utiliser les rsultats
du premier pour calculer le facteur de correction qui sera appliqu au second plan
(Feinberg M., 2010c)
Le rle du profil dexactitude est destimer, partir des rsultats obtenus lors de la validation,
quelle garantie aura lutilisateur que la mthode utilise en routine fournira des rsultats
acceptables. Cest pourquoi, la ralisation des plans doit respecter les conditions suivantes :
Exigence dtre en condition de fidlit intermdiaire ou de reproductibilit. Les
mesurages doivent tre raliss en condition de fidlit intermdiaire ou de
reproductibilit, avec pour objectif de prendre en compte le plus de sources
dincertitude possible. Comme ces sources dincertitude dpendent de la mthode et des
matrices analyses, il est impossible de dfinir une stratgie unique. Il est recommand
de construire un diagramme causes/effets pour choisir les conditions les plus globales.
Dans la plupart des cas, on pourra dcider de faire les mesurages sur plusieurs jours
dans la mesure o on prend ainsi en compte les incertitudes dues lappareillage
(rglages, et prparation des ractifs), ltalonnage, au personnel, la conservation de
lchantillon Mais pour des chantillons trs instables, on pourra raliser les
mesurages sur un seul jour avec plusieurs oprateurs ou instruments.
Exigence de couvrir le domaine dapplication. Une tude de validation doit couvrir
lensemble du domaine dapplication de la mthode. Pour satisfaire ces deux
contraintes, plusieurs choix sont possibles et, dans tous les cas, avant de commencer il
faut disposer de quantits suffisantes dchantillons pour faire tous les mesurages :
utiliser un seul chantillon dont on sait faire varier le niveau de concentration, par
exemple au moyen dajouts doss (approche de choix pour une mthode indirecte) ;
utiliser plusieurs chantillons (ou mme plusieurs matrices proches) prsentant des
niveaux de concentration varis (gnralement le cas pour une mthode directe) ;
prparer des matrices synthtiques (matires premires ou produits chimiques) ;
utiliser des matriaux de rfrence externes ou certifis
Exigence de synchroniser les plans. Dans le cas, o deux plans sont ncessaires
talonnage et validation il est indispensable de raliser les essais dans les mmes
conditions de fidlit intermdiaire. Par exemple, si le jour est la source de variation
choisie, il faut raliser des mesurages dtalonnage et de validation pour un mme jour
donn. Les donnes dtalonnage de ce jour serviront prdire les concentrations
partir des donnes de validation faites le mme jour.
Avant tout traitement numrique, il est recommand de procder une illustration graphique
pralable et un examen visuel des donnes afin de dtecter une erreur flagrante, comme une
donne mal enregistre. Ces graphiques peuvent tre mis en annexe du dossier dvaluation.
La prsence dune donne anormale amne suspecter une mauvaise mise au point de la
mthode et peut invalider la procdure de validation.
La mthode la plus accessible est celle des moindres carrs, car elle est disponible sur les
tableurs. La rgression pondre sapplique dans les cas o les variances des rponses ne sont
pas homognes entre niveaux. Les estimations des paramtres du modle pour chaque srie
sont regroupes dans le tableau 4.
Si le type de modle dtalonnage a t clairement tabli lors du dveloppement de la
mthode, on pourra choisir le nombre minimum pour K. Cependant, on aura intrt prendre
le nombre souhaitable ou plus afin de tester si dautres modles plus complexes ne sont pas
mieux adapts. En effet, partir des donnes du plan dtalonnage, il est possible destimer
plusieurs modles dtalonnage puis de construire ainsi plusieurs profils dexactitude. On
pourra alors retenir le modle qui fournit le profil le plus favorable. Il conviendra alors de
modifier le mode opratoire en fonction du modle choisi, sans pour autant modifier les
limites dacceptabilit .
a1 + a12 4a2 ( a0 Y )
Fonction quadratique z=
2a2
a2
z= 1
Logistique 4 paramtres a3 a0 a1
1
Y a0
Utiliser les donnes du plan de validation et les paramtres des modles dtalonnage estims
partir du plan dtalonnage pour calculer les concentrations retrouves dans les chantillons
de validation. Effectuer ces calculs par srie, avec le modle de la srie correspondante. Ce
mode de calcul souligne le fait quil est indispensable que les essais des plans dtalonnage et
de validation soient synchroniss cest--dire raliss le mme jour et/ou par le mme
oprateur et/ou par le mme laboratoire.
Tableau 6 : concentrations retrouves par prdiction inverse obtenues partir des donnes
du plan de validation
Niveau Srie Rptition Concentration Concentratio Biais Biais
thorique X n retrouve Z absolu relatif
1 1 1 x111 z111 bijk bijk%
1 1 2
1
J
1 I 1
1 I 2
1 I
1 I J
Rassembler avec les critres de justesse, calculs pour un niveau et non plus pour un
mesurage individuel, sous la forme dun tableau, comme le tableau 7.
Dans les cas trs particuliers o la justesse nest pas exige, la valeur de rfrence moyenne
peut tre fixe comme tant gale la concentration retrouve moyenne. Il est alors inutile de
calculer un biais moyen ou un taux de recouvrement moyen.
skr
cart-type de rptabilit
skB
cart-type inter-sries
zk xk
Biais moyen relatif 100
xk
zk
Taux de recouvrement moyen 100
xk
La mthode de calcul propose par Mee (1984) est celle qui a t choisie pour cette
procdure. Elle a aussi t adopte par une commission de la Socit des sciences et
techniques pharmaceutiques (SFSTP - 2003, 2006). Le calcul se fait partir des donnes du
tableau 7, indpendamment pour chaque niveau de concentration k. Pour des raisons de
simplification des formules, lindice k est omis dans les formules suivantes.
Exprimer lintervalle de tolrance comme un intervalle symtrique autour de la concentration
retrouve moyenne z du niveau :
z ktol sIT (7)
Calculer lcart-type de lintervalle de tolrance sIT selon la formule (8) ; il servira aussi
lestimation de lincertitude de mesure. Il est obtenu grce aux formules suivantes :
1
sIT = sFI 1 + (8)
I J B2
R +1
B= (9)
J R +1
sB2
R= (10)
sr2
v= (12)
2
1 1
R+ J 1
+ J
I 1 IJ
Pour chaque niveau k, calculer lcart-type de lintervalle de tolrance sIT, le facteur de
couverture ktol et les limites basse et haute de lintervalle de tolrance. La valeur choisie pour
doit tre au moins de 80%. Lensemble des calculs est rassembl dans un tableau de la
forme du tableau 8.
Tableau 8 : rsum des diffrents lments qui serviront au profil dexactitude, incluant les
limites des intervalles de tolrance par niveau
Symbole Niveaux
Critres
1 K
Valeur de rfrence moyenne x
Limite de tolrance basse z ktol sIT
Limite de tolrance haute z + ktol sIT
z ktol sIT
Limite de tolrance basse relative x 100
z + ktol sIT
Limite de tolrance haute relative x 100
Limite dacceptabilit basse relative (1 ) 100
Limite dacceptabilit haute relative (1 + ) 100
Le nombre (Eq.(12)) est rarement un nombre entier et il convient dutiliser des tables de la
loi de Student qui acceptent des nombres de degrs de libert non entiers. Cependant, il est
possible dapprocher la valeur du quantile par interpolation linaire entre les 2 nombres de
degr de libert entiers qui encadrent . Ce calcul approch est illustr dans la feuille de calcul
(dans les cellules B30 B32) prsente par Max Feinberg (2010c).
sB2
Le rapport R = entre la variance inter-sries et la variance de rptabilit intervient dans
sr2
plusieurs formules. Il traduit limportance relative de leffet de la srie. Par exemple, dans le
cas o leffet jour est leffet srie, si la mthode est trs stable dun jour lautre et est
capable de fournir des rsultats trs proches pour un mme chantillon, R est proche de 1 et ne
jouera quun rle secondaire. Par contre, si ce rapport augmente le nombre de degrs de
libert est diminu et, plus le nombre de degrs de libert est petit, plus le quantile de la
distribution t de Student est lev et largit lintervalle de tolrance.
Le profil dexactitude peut tre construit de diffrentes faons, en fonction du type de donnes
trait. La mthode la plus classique, lorsquon a faire des concentrations relatives, est celle
prsente la figure 1 o les performances sont exprimes de faon relative, par un taux de
recouvrement. Mais si les donnes sont des comptages exprims en logarithmes, il vaut mieux
exprimer les performances, comme des diffrences entre 2 logarithmes, ce qui est quivalent
un rapport.
Pour construire le profil dexactitude, slectionner dans le tableau 8, les lignes suivantes :
130%
120%
110%
Recouvrement (%)
100%
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
90%
80%
70%
60%
Concentration thorique
Pour utiliser le profil dexactitude en vue de valider une mthode, il faut avoir fix les deux
critres de dcision suivants :
les limites dacceptabilit . Elles servent traduire les objectifs pratiques des
utilisateurs. Elles dlimitent un intervalle autour de la valeur de rfrence. Le plus
souvent, ces limites sont rglementaires ou issues de la rglementation. Mais dans le cas
o il nexiste pas de rfrence tablie, il convient de prendre en compte les attentes des
utilisateurs finaux, comme une LQ donne (voir 1.2) ;
la proportion . Elle reprsente la proportion de futurs rsultats qui seront en moyenne
compris dans les intervalles de tolrance. La valeur choisie pour dpend largement du
champ dapplication (contrle sanitaire, contrle de fabrication, etc.). Il est vident que
plus est petit, par exemple 70 %, plus la mthode risque de produire des rsultats qui
ne correspondent pas aux spcifications annonces. Cest pourquoi, dans la mthode du
profil dexactitude cette proportion a t fixe 80 %, au moins.
140%
130%
120%
Recouvrement (%)
110%
100%
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
90%
80%
70%
60%
Concentration thorique (mg/kg)
Figure 2 : exemple dune mthode valide sur une zone rduite du domaine de validation
Rgles de dcision
Reporter les limites dacceptabilit sur le graphique du profil dexactitude pour permettre une
interprtation visuelle directe des rsultats. La figure 2 illustre une situation classique o la
majeure partie des intervalles de tolrance est comprise dans lintervalle dacceptabilit. Ds
que lintervalle de tolrance sort de lintervalle dacceptabilit, on peut conclure que la
mthode nest plus capable de fournir suffisamment de rsultats acceptables, en fonction des
choix faits au dpart de ltude. Par exemple, pour = 80 % et une limite dacceptabilit de
25 %, on peut conclure que la mthode est valide entre environ 0,2 mg/kg et 4,0 mg/kg. En
outre, ce graphique fournit dautres indications. En particulier, sur la figure 2, il apparat que
la justesse varie avec la concentration. Le taux de recouvrement qui traduit la justesse est
denviron 108 % aux basses concentrations pour tre proche de 100 % aux concentrations
leves. laide des rsultats statistiques regroups dans le tableau construit sur le modle du
tableau 7, on peut trouver diffrents lments qui expliquent le comportement de ce biais de la
mthode.
Dans le cas illustr par la figure 3, la mthode prsente un biais systmatique lev : le taux
de recouvrement est seulement denviron 70 % ; d par exemple un effet de matrice non
contrl. Il faut alors conclure que la mthode nest pas valide dans le domaine tudi. Si les
pratiques de la profession ou la rglementation le permettent, il est alors possible dappliquer
un facteur de correction qui viendra corriger ce biais. La procdure appliquer pour calculer
et valider ce facteur de correction est dcrite par Max Feinberg (2010c).
130%
120%
110%
100%
Recouvrement (%)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
90%
80%
70%
60%
50%
40%
Concentration thorique (mg/kg)
Figure 3 : exemple dun profil dexactitude pour une mthode prsentant un biais
systmatique important, caractris par un taux de recouvrement denviron 70 %
Bibliographie
AFNOR (1994) Norme NF ISO 5725-2, Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure Partie 2 : Mthode de base pour la dtermination de la rptabilit
et de la reproductibilit d'une mthode de mesure normalise.
AFNOR (1996) Norme NF ISO 11095 talonnage linaire utilisant des matriaux de
rfrence, Afnor, Paris
Azas J.M., Bardet J.M.; (2006) Le modle linaire par l'exemple, Rgression, analyse de la
variance et plans d'exprience illustrs avec R, SAS et Splus, Dunod, Paris
Commission europenne (2002) Dcision de la commission 2002/657 du 12 aot 2002 portant
modalits dapplication de la directive 96/23/CE du Conseil en ce qui concerne les
performances des mthodes danalyse et linterprtation des rsultats
Commission SFSTP, P. Hubert, J.J. Nguyen-Huu, B. Boulanger, E. Chapuzet, P. Chiap, N.
Cohen, P.A. Compagnon, W. Dew, M. Feinberg, M. Lallier, M. Laurentie, N. Mercier, G.
Muzard, C. Nivet, L. Valat ; Validation des procdures analytiques quantitatives :
harmonisation des dmarches.
Partie I. : STP Pharma Pratiques (2003) 13:3, 101-138
Partie II. : Statistiques, STP Pharma Pratiques (2006) 16:1, 30-60
Partie III : Exemples d'application, STP Pharma Pratiques (2006) 16:2, 87-121
FAO (1997) Manuel sur le contrle de la qualit des produits alimentaires. 14 : Assurance de
la qualit dans le laboratoire d'analyse chimique des aliments, Rome,
http://www.fao.org/docrep/T0845F/t0845f00.HTM
Feinberg M., (2009) Labo-Stat : Guide de validation des mthodes danalyse Lavoisier
tec&Doc, Paris
Feinberg M. (2010c) Interprtation du profil dexactitude in Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 45-59
Huet S., Bouvier A., Poursat M.A., Jolivet E. (2004) Statistical Tools for Nonlinear
Regression Springer Verlag, New-York, ISBN 0-387-40081-8
Mee R.W. (1984) -Expectation and -Content Tolerance Limits for Balanced One-Way
ANOVA Random Model Technometrics 26:3, 251-254
Commission du Codex Alimentarius (2005) Manuel de procdure de la 15me dition,
http://www.codexalimentarius.net/web/procedural_manual.jsp)
CX/MAS 09/30/7, Directives pour tablir des critres pour lidentification des mthodes
danalyse adquates (Conversion des mthodes pour les lments traces en critres)
ftp://ftp.fao.org/codex/ )
Max Feinberg1
Rsum : partir des donnes collectes pour construire le profil dexactitude, il est possible de
calculer divers critres complmentaires souvent exiges pour les dossiers de validation, comme la
limite de quantification ou lincertitude. Sappuyant sur les concepts dcrits dans dautres articles
consacrs la validation des mthodes : principe et mise en uvre du profil dexactitude cet article
prsente diffrents complments et, en particulier, le mode de calcul de la rptabilit et de la fidlit.
Notations et symboles
Une srie de mesurages i, (i variant de 1 I) contient des niveaux de concentration k (k variant
de 1 K) pour lesquels des rptitions ont t faites j (j variant de 1 J) les indices seront
repris dans lordre i, j, k. Les variables alatoires sont notes en majuscules et les valeurs
quelles prennent en minuscules.
Symbole Description
xijk Valeur de rfrence assigne un talon pour la srie i (1 i I), la rptition j
(1 j J) et le niveau k (1 k K)
ou
Valeur de rfrence assigne un chantillon de validation pour la srie i, la
rptition j et le niveau k.
yijk Mesure de la rponse instrumentale ou exprimentale observe pour un talon ou
un tmoin de validation pour la srie i, la rptition j et le niveau k.
zijk Valeur retrouve dans lchantillon de validation de la srie i, pour la rptition j
et le niveau k, obtenue soit par prdiction inverse laide dun modle
dtalonnage, soit par une mesure directe.
bijk Biais exprimant lerreur de justesse pour un tmoin de validation entre sa valeur
retrouve et sa valeur de rfrence bijk = zijk xijk
1 UR1204 Met@risk - Mthodologie danalyse de risque alimentaire INRA F-75231 Paris cedex 05
01 44 08 16 52 max.feinberg@paris.inra.fr
zi =1 j =1
ij
( z
i =1 j =1
Z )2 = ( zij Zi )2 + J ( Zi Z )2
ij
i =1 j =1 i =1
(2)
SCEt SCEr SCEB
Cette quation est traditionnellement crite sous une forme abrge, faisant appel trois
sommes de carrs dcarts (SCE).
SCEt = SCEB + SCEr quation gnrale de lanalyse de variance
O chacune des sommes est dfinie comme suit pour faciliter linterprtation :
SCEt Somme totale des carts la moyenne gnrale du niveau
SCEB Somme des carts inter-sries
SCEr Somme des carts intra-srie
Comme le propose la norme ISO 5725, il nest pas ncessaire de dvelopper les trois sommes
de carrs pour effectuer les calculs ; le calcul de SCEB se fait par diffrence. Cette mthode
peut poser des problmes si le rsultat est ngatif : forcer alors la valeur de SCEB 0.
SCEB = SCEt SCEr si SCEB > 0
SCEB = 0 si SCEB 0
n 2
i
N* = N i =1
I
Avec N et N = ni
i =1
Diffrents exemples de calcul sont disponibles dans la littrature (Feinberg M., 2009 -
Commission SFSTP 2003, 2006). Lexemple prsent porte sur une mthode de dosage du
nicotinamide (vitamine B3) dans le lait par HPLC avec une dtection fluorimtrique. Cest
une mthode indirecte qui ncessite un talonnage pour raliser la quantification. Les 10
tapes de la procdure se droulent ainsi.
4. Plan dtalonnage (tableau 2). Le plan dtalonnage comporte I = 3 sries (jours) pour K
= 2 niveaux de concentration et J = 2 rptitions par jour et par niveau, soit un total de 12
essais. Les deux niveaux sont cods Bas et Haut.
6. Calcul des concentrations prdites inverses et calcul de la justesse (tableau 4). partir des
coefficients du tableau 3 et des mesures des surfaces de pic des chantillons de validation
rassembles au tableau 1, calculer les concentrations prdites inverses de chaque rptition
en prenant soin dutiliser les modles obtenus pour chaque srie.
Tableau 4. Concentrations retrouves par prdiction inverse partir des donnes du plan de
validation (exprimes en mg/l)
Srie Niveau Concentration X Rponse Y Retrouve Z Biais absolu Biais relatif
Jour 1 A 0.40 22.6 0.40 -0.004 -1.06%
Jour 1 A 0.40 22.1 0.39 -0.011 -2.82%
Jour 1 A 0.40 22.4 0.39 -0.007 -1.76%
Jour 2 A 0.40 23.3 0.40 0.004 0.89%
Jour 2 A 0.40 24.1 0.42 0.015 3.75%
Jour 2 A 0.40 23.9 0.41 0.012 3.04%
Jour 3 A 0.40 23.8 0.43 0.026 6.47%
Jour 3 A 0.40 23.6 0.42 0.023 5.75%
Jour 3 A 0.40 23.5 0.42 0.022 5.39%
Jour 1 B 2.00 135.0 1.98 -0.021 -1.04%
Jour 1 B 2.00 135.1 1.98 -0.019 -0.97%
Jour 1 B 2.00 129.9 1.91 -0.093 -4.63%
Jour 2 B 2.00 137.6 2.04 0.037 1.85%
Jour 2 B 2.00 135.2 2.00 0.003 0.14%
Jour 2 B 2.00 138.8 2.05 0.054 2.71%
Jour 3 B 2.00 136.3 2.04 0.043 2.13%
Jour 3 B 2.00 135.1 2.03 0.025 1.27%
Jour 3 B 2.00 134.4 2.02 0.015 0.77%
Jour 1 C 4.00 275.2 3.95 -0.046 -1.14%
Jour 1 C 4.00 276.9 3.98 -0.022 -0.55%
Jour 1 C 4.00 261.3 3.76 -0.242 -6.04%
Jour 2 C 4.00 268.1 3.90 -0.098 -2.45%
Jour 2 C 4.00 269.7 3.92 -0.075 -1.88%
Jour 2 C 4.00 276.9 4.03 0.028 0.70%
Jour 3 C 4.00 271.6 3.99 -0.013 -0.32%
Jour 3 C 4.00 273.3 4.01 0.011 0.29%
Jour 3 C 4.00 275.0 4.04 0.036 0.90%
7. Calculer les biais individuels. On observe que les biais individuels varient entre -6.04% et
6.47% et permettent didentifier les mesures ventuellement atypiques. Aucune donne
atypique na t identifie.
8. Calcul des donnes de fidlit et des intervalles de tolrance. Calculer les critres de
fidlit, comme dcrit dans le 1et les limites des intervalles de tolrance selon la mthode
dcrite dans Feinberg M. (2010b). Rassembler les valeurs trouves dans un tableau
rcapitulatif organis comme le tableau 5.
Tableau 5 : tableau rcapitulatif des critres de validation et des lments du profil dexactitude
Probabilit tolrance () 80%
Limite d'acceptabilit () 10%
Niveaux Niveau A Niveau B Niveau C
Concentration moyenne thorique 0.4 2.0 4.0
Concentration moyenne retrouve 0.409 2.005 3.953
Fidlit
cart-type de rptabilit (sr) 0.004 0.030 0.081
cart-type inter-sries (sB) 0.015 0.039 0.033
cart-type de fidlit (sFI) 0.016 0.049 0.087
Coefficient de variation de fidlit 3.90% 2.45% 2.21%
Justesse
Biais (%) 2.18% 0.25% -1.17%
Intervalle de tolrance
Nombre de degrs libert 2.197 3.374 6.826
Facteur de couverture (kIT) 1.837 1.599 1.419
cart-type de tolrance (sIT) 0.018 0.055 0.093
Limite intervalle tolrance basse 0.375 1.917 3.821
Limite intervalle tolrance haute 0.442 2.093 4.086
Limite d'acceptabilit basse 0.3600 1.8000 3.6000
Limite d'acceptabilit haute 0.4400 2.2000 4.4000
Profil d'exactitude
Recouvrement % 102.2% 100.2% 98.8%
Limite intervalle tolrance basse en % 93.8% 95.9% 95.5%
Limite intervalle tolrance haute en % 110.6% 104.6% 102.2%
Limite d'acceptabilit basse en % 90.0% 90.0% 90.0%
Limite d'acceptabilit haute en % 110.0% 110.0% 110.0%
110%
105%
Recouvrement (%)
100%
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
95%
90%
85% Concentration
Figure 1 : profil dexactitude pour le dosage de la vitamine B3 dans le lait par HPLC
A B C D E F G
1 Niveau A
2 Concentration moyenne thorique 0.4000
3 Sries Rptition 1 Rptition 2 Rptition 3 ni SCEi
4 Jour (Srie) 1 0.396 0.389 0.393 3 0.00003
5 Jour (Srie) 2 0.404 0.415 0.412 3 0.00007
6 Jour (Srie) 3 0.426 0.423 0.422 3 0.00001
7
8 Nombre de sries (I) 3.0000 =NB(B4:B6)
9 Nombre de mesures (IJ) 9.0000 =NB(B4:D6)
10 Nombre de rptitions (J) 3.0000 =SI(F4*B8<>B9;"Calcul impossible";F4)
11 SCE rsiduelle 0.00011 =SOMME(G4:G8)
12 SCE totale 0.00156 =SOMME.CARRES.ECARTS(B4:D6)
13 SCE inter-sries 0.00145 =B12-B11
14 Calcul intermdiaire de sB 0.00024 =((B13/(B8-1))-B15)/B10
15 Variance de rptabilit (sr) 0.00002 =B11/(B9-B8)
16 Variance inter-sries (sB) 0.00024 =SI(B14<0;0;B14)
17 Variance de fidlit (sFI) 0.00025 =SOMME(B15:B16)
18 Fidlit
19 Concentration moyenne retrouve 0.40873 =MOYENNE(B4:D6)
20 Ecart-type de rptabilit (sr) 0.00419 =RACINE(B15)
21 Ecart-type inter-sries (sB) 0.01536 =RACINE(B16)
22 Ecart-type de fidlit (sFI) 0.01592 =RACINE(B17)
23 Justesse
24 Biais (%) 2.18% =B19/B2-1
25 Facteur de couverture de l'intervalle de tolrance
26 Rapport des variances (R) 13.40469 =B16/B15
27 Coefficient B 0.34951 =(B26+1)/(B10*B26+1)
28 Nombre de degrs libert 2.19709 =(B26+1)^2/((B26+1/B10)^2/(B8-1)+(1-1/B10)/B9)
29 Probabilit tolrance (bta) 80%
30 t Student bas 1.88562 =LOI.STUDENT.INVERSE(1-B29;ARRONDI.INF(B28;0))
31 t Student haut 1.63774 =LOI.STUDENT.INVERSE(1-B29;ARRONDI.SUP(B28;0))
32 Facteur de couverture (kIT) 1.83676 =B30-(B30-B31)*(B28-ARRONDI.INF(B28;0))
33 Ecart-type de tolrance (sIT) 0.01828 =B22*RACINE(1+1/(B9*B27))
34 Intervalle de tolrance
35 Limite intervalle tolrance basse 0.37516 =B19-B33*B32
36 Limite intervalle tolrance haute 0.44230 =B19+B33*B32
Afin de faciliter la mise en uvre, les principales formules, telles que saisies, sont indiques
dans la colonne C et se rfrent au contenu de la colonne B.
En ce qui concerne ltalonnage et le calcul des modles, il suffit dutiliser la fonction de
rgression DROITEREG pour trouver les paramtres. Lorganisation de la feuille doit tenir
compte du fait quon calcule un modle par srie.
Principe
Sur la figure 1 on note quil existe une concentration partir de laquelle au moins une des
bornes de lintervalle de tolrance coupe une des limites dacceptabilit. Au-dessus de ce
seuil, lanalyste peut garantir que la mthode produira une proportion de rsultats au moins
gale . Selon les rgles de dcision proposes, la mthode est donc valide puisquelle
permet de garantir les objectifs fixs. En revanche, en dessous de ce seuil, il nest plus
Les formules utilises sont indiques dans les colonnes D et E. Finalement, la LQ vaut 0,434 mg/l.
Bien sr, la limite de quantification dpend des valeurs choisies des limites dacceptabilit et
de la proportion . Si ces deux critres nont pas pu tre fixs lavance par manque de
consignes ou de rglementation, mais si une LQ limite est attendue, par exemple pour un
contrle rglementaire, il est possible de les calculer en retour en se fixant une LQ prtablie.
Ce mode de calcul inverse se dduit directement des formules fournies.
Niveau B Niveau A
Z% Niveau B
Z
Niveau A
2.0 110%
109%
1.5
108%
1.0
107%
0.5
106%
LQ X LQ X
0.0 105%
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
4.5
4.0
Concentration retrouve Z (mg/L)
3.5
3.0
2.5
Z = 0.52X + 0.02
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
Valeur de rfrence X (mg/L)
Figure 3 : reprsentation des concentrations retrouves en fonction des valeurs de rfrence permettant
de mettre en vidence un effet de matrice et de calculer une droite moyenne de recouvrement
Une mthode plus exacte consiste reporter sur un graphique les concentrations retrouves en
fonction des valeurs de rfrence. La figure 3 montre comment mettre en vidence un effet de
matrice. On peut alors calculer, sous la forme dune droite de rgression au moindres carrs,
lquation dune droite dont la pente reprsente un taux moyen de recouvrement et lordonne
lorigine un biais systmatique. Elle permet ainsi de dfinir deux facteurs de correction
possibles :
linverse de la pente permet de corriger un taux de recouvrement non satisfaisant. Dans
lexemple on prendra 1/0,52 2.0 ;
lordonne lorigine permet de corriger un biais systmatique, par exemple gnr par
lintgration dun pic mal rsolu en chromatographie. Dans lexemple ce type de biais
nest pas important et ne sera pas pris en compte.
Le facteur de correction choisi sera alors inclus dans le mode opratoire de la mthode, par
exemple, dans la partie relative lexpression du rsultat. Afin de vrifier la pertinence du
facteur de correction choisi, il suffit de recalculer le profil dexactitude avec les donnes
corriges. Cependant, pour assurer lindpendance des mesures, il est prfrable dutiliser
deux chantillons de validation et de raliser lensemble des plans dexprience en parallle.
La figure 4 illustre leffet du facteur de correction 2,0. Lchantillon A dont les mesures nont
pas t corriges produit un profil dexactitude qui mne conclure que la mthode nest pas
valide. En revanche, les mesures faites sur un deuxime chantillon B puis corriges par 2,0,
conduisent la conclusion que la mthode est valide si les rsultats sont corrigs.
140%
chantillon B corrig
130%
120%
110%
100%
Recouvrement %
80%
60%
50%
40%
30%
Concentration thorique (mg/L)
Cette approche est volontairement empirique et ne fait pas appel des tests de signification de
la pente ou de lordonne lorigine.
2 1
sFI 1 sr2
u ( D) = I
J
Bibliographie
AFNOR Norme NF ISO 5725-2:1994, Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure Partie 2 : Mthode de base pour la dtermination de la rptabilit
et de la reproductibilit d'une mthode de mesure normalise. Afnor, Paris
AFNOR Norme NF X 06-041, Application de la statistique Fidlit des mthodes d'essai
Dtermination de la rptabilit et de la reproductibilit d'une mthode d'essai
normalise par essais inter-laboratoires. Afnor, Paris
AFNOR Norme FD X07-021:1999 Normes fondamentales - Mtrologie et applications de la
statistique - Aide la dmarche pour l'estimation et l'utilisation de l'incertitude des mesures
et des rsultats d'essais, Afnor, Paris
AFNOR Norme FD V03-116:2001 Analyse des produits agricoles et alimentaires - Guide
d'application des donnes mtrologiques, Afnor, Paris
FD ISO/TS 21748 :2004. Lignes directrices relatives l'utilisation d'estimations de la
rptabilit, de la reproductibilit et de la justesse dans l'valuation de l'incertitude de
mesure, ISO, Genve
Feinberg M., (2009) Labo-Stat : Guide de validation des mthodes danalyse Lavoisier
Tec&Doc, Paris
Feinberg M. (2010a) Principes et vocabulaire in Validation des mthodes danalyse
quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra, numro
spcial : 13-26
Michel Laurentie1
Problmatique
1
Unit de pharmacocintique-pharmacodynamie - AFSSA F-35302 Fougres cedex- m.laurentie@afssa.fr
Variance maximale
Variance de la rponse
Variance minimale
Concentration
Concentration
Figure 2 : volution des rponses en fonction du niveau des concentrations, reprsente par
rapport une courbe dtalonnage
Une autre possibilit pour valuer limpact de la variance sur le modle dtalonnage est
lutilisation du graphique des rsidus. Le rsidu est la diffrence entre la valeur observe et la
valeur prdite (quation 1)
quation 1
Avec Yobs la valeur observe, la valeur calcule par le modle dtalonnage e.g.un
modle linaire.
Si la rpartition des rsidus est homogne dans lintervalle des concentrations, il est conclu
la validit du modle et lhomognit des variances par niveau des concentrations. Si au
contraire les rsidus paraissent structurs, i.e. que distribution suit une courbe particulire
(droite par exemple) ou si la distribution des rsidus montre une variabilit importante ou une
forme particulire, par exemple, en trompette, il y a htrognit des variances et par
consquent il est conclut la non validit du modle. Ceci est illustr sur les figures 3A et 3B.
A
Rsidu
Concentration
B
Rsidu
Concentration
Figure 3 : (A) rpartition des rsidus pour un modle dtalonnage pour lequel la variance
des rponses est homogne.
(B) rpartition des rsidus pour un modle dtalonnage pour lequel les variances
des rponses sont non homognes (forme dite en trompette).
convient de prciser que ces tests sont des drapeaux pour indiquer lhtrognit des
variances et non des tests pour liminer des niveaux de concentration qui seraient dits
aberrants.
La transformation des donnes permet de stabiliser la variance. Les plus utilises sont les
logarithmes ou les racines carres.
Dans le cas de lutilisation de la transformation, logarithmique le modle utilis scrit :
quation 2
Ou le logY est le logarithme nprien de la rponse Y et logC le logarithme nprien de la
concentration.
Les techniques de rgression sont alors utilises comme pour une rgression classique, en
particulier lutilisation des moindres carrs. Lobservation des rsidus doit montrer une
stabilisation des variances. Dans ce cas le modle de fonction de rponse utilise en routine
implique de transformer les rponses avant de calculer les concentrations en retour.
La deuxime approche est lutilisation de la pondration.
2.2 La pondration
Le principe de la pondration est simple. Pour chaque niveau de concentration d'un intervalle
de dosage, la variance n'est pas proportionnelle la concentration. Ceci implique de donner
un poids chaque niveau de concentration pour corriger le manque de proportionnalit.
Prenons le cas d'une rgression linaire de type (Tomassone R., Lesquoy E., Miller C., 1983) :
quation 3
Avec Y la rponse, a et b les coefficients de la droite de rgression.
Lors d'une estimation des paramtres a et b nous cherchons minimiser la diffrence entre les
valeurs calcules et les valeurs estimes ce qui se traduit par l'quation
quation 4
Avec SCE : somme des carres des carts entre la nime observation Yi et lestimation par
la droite de rgression.
La prise en compte du poids (wi) se fera par l'introduction d'un facteur dans lquation 4.
quation 5
La slection de la valeur du poids peut se faire graphiquement. Sur la figure 4, les diffrentes
relations entre la variance des rponses et les niveaux de concentration sont reprsentes.
Plusieurs types de relation existent entre la variance et la concentration [4]. A chaque type de
structure il est possible de dfinir un poids (wi pour weighting factor) qui permettra de prendre
en compte linfluence de la variance. Quatre cas sont gnralement observs :
1 - Il ny a pas de relation entre la concentration et la variance (le cas idal) : le
poids wi = 1. En dautres il ny a pas de ncessit de pondrer
2 - la variance varie avec une relation de type 1/X i.e. inversement proportionnelle la
concentration, le poids qui doit tre pris en compte est de la forme wi = 1/C.
3 - la variance varie selon une relation de type 1/X2 i.e. inversement proportionnelle au
carr de la concentration, le poids utiliser est de la forme wi = 1/C2
4 - la relation n'est pas une relation simple entre la concentration et la variance, chaque
variance variant indpendamment du niveau de concentration, le poids wi = 1/S2
avec S2 la variance observe chaque niveau de concentration.
Les cas 2 et 3 sont les plus frquemment rencontrs mais le cas 4, cas le plus difficile, peut
galement s'observer.
Wi=1/C2
Wi=1/C
Rponse
Wi=1
Wi=1/S2
Concentration
Ce type de graphique peut tre facilement ralis sur une feuille Excel, partir des donnes
obtenues lors de l'tude de validation ou de pr-validation. Il devrait tre un pralable avant
toute analyse statistique car ce graphique permet de visualiser sil faut appliquer une
pondration.
La pondration est applicable quel que soit le modle choisi et l'utilisation dun facteur permet
de minimiser la SCE et donc d'avoir des meilleurs estimateurs pour les coefficients de la
droite de rgression.
3. Exemple
La forme de la courbe montre que la variance nest pas homogne sur lintervalle de dosage,
avec une trs forte augmentation pour le niveau de concentration de 5000 ng/ml. Pour
stabiliser cette variance il est possible de pondrer soit par 1/C ou par un 1/C2 ou tester la
transformation logarithmique des donnes.
La figure 6 montre la distribution des rsidus obtenue par un modle de rgression linaire
pondre ou non ou appliqu sur des donnes logarithmiques.
Figure 6 : volution des rsidus en fonction des concentrations (A) modle linaire ; (B)
modle linaire pondr (1/C) ; (C) modle linaire pondr (1/C2) ; (D) modle
linaire appliqu aprs transformation logarithmique des donnes
Lobservation des rsidus montre que le modle linaire simple (figure 6A) conduit une
distribution des rsidus en forme de trompette. Ceci implique que le modle ne sera pas trs
performant. La pondration 1/C (figure 6B) diminue cet effet trompette. En revanche la
pondration de type 1/C2 ne modifie pas la distribution des rsidus (figure 6C). Lapplication
du modle linaire sur les donnes transformes (figure 6D) montre une stabilisation de la
variance. Ce modle pourrait tre retenu pour dcrire les donnes.
La figure 7 montre limpact de la pondration et de la transformation sur le profil
dexactitude. En utilisant une fonction de rponse linaire sans pondration ou transformation,
les faibles concentrations prsentent un biais de plus de 40 % (figure 7A). Les profils obtenus
aprs pondration par 1/C ou par 1/C2 ou aprs transformation des donnes sont acceptables.
La pondration 1/C prsente une variabilit moins grande et aprs transformation
logarithmique un moindre biais est observ. Le choix se fera sur lobjectif assign de la
mthode, c'est--dire privilgier le biais ou la fidlit.
Figure 7 : profil dexactitude obtenu avec (A) modle linaire, (B) modle linaire avec
pondration (1/C), (C) modle linaire avec pondration (1C2), (D) modle linaire aprs
transformation logarithmique des donnes
Conclusion
La pondration et / ou la transformation des donnes sont des outils qui permettent de
stabiliser la variance. Elle nest pas systmatiquement ncessaire mais elle est un pralable
lutilisation de modle linaire ou non linaire, si la variance des rponses nest pas
homogne sur le domaine des concentrations tudies. Le choix de la pondration ou de la
transformation repose sur des aspects graphiques (rsidus) ou sur la ralisation de tests
statistiques appropris. Dans certains cas difficiles, il faut avoir recours la fois la
pondration et la transformation des donnes. Lutilisation des ces outils optimise le modle
et ainsi dobtenir les meilleurs paramtres descriptifs de la relation rponse / concentration.
Bibliographie
Hubert Ph., Chiap P., Crommena J., Boulanger B., Chapuzet E., Mercier N., Bervoas-Martin S.,
Chevalier P., Grandjean D., Lagorce P., Lallier M., Laparra M.C., Laurentie M., Nivet J.C.
(1999) The SFSTP guide on the validation of chromatographic methods for drug
bioanalysis: from the Washington Conference to the laboratory. Analytica Chimica Acta,
391, 135 -148
Mac Taggart D.L., Farwell S.O. (1992) analysis use of linear regression. Part 1: regression
procedures or calibration and quantitation. J. of the AOAC 75, 594-614
Tomassone R., Lesquoy E., Miller C. (1983) La rgression, nouveaux regards sur une
ancienne mthode statistique. Inra, Actualits scientifiques et agronomiques, p. 180
Chapitre II
Rsum : Parmi les programmes de recherche conduits par l'Unit de recherche sur les
herbivores, la mesure des flux de nutriments nergtiques travers le foie ncessite de
dterminer avec exactitude les concentrations sanguines de glucose au niveau des vaisseaux
affrents (veine porte) et effrents (veine hpatique). Les faibles diffrences de concentrations
attendues entre vaisseaux, rendent la mesure de ces concentrations dterminante. Par
ailleurs, la lourdeur en cot et en temps, des exprimentations ralises sur des animaux
cathtriss ne permet pas denvisager plusieurs rptitions de la mme exprimentation.
Aussi, nous avons souhait dterminer les performances de notre mthode de dosage du
glucose (selon la norme V03-110) avant d'tablir le plan exprimental. Nous avons ainsi
montr que selon les exigences que lon se fixe (niveau de probabilit de 0,05 ou 0,01 ;
dosages effectus dans la mme journe ou sur plusieurs jours), le nombre d'animaux
ncessaire pour mettre en vidence dventuelles diffrences significatives entre traitements
variait de 4 10. Cet article reprendra d'aprs cet exemple spcifique, les tapes de
caractrisation d'une mthode de dosage ainsi que l'intrt de l'utilisation des performances
de la mthode pour l'tablissement du plan exprimental.
1. Introduction
L'unit de recherche sur les herbivores (URH) du centre Inra de Theix, regroupe 172 agents
permanents rpartis dans 8 quipes de recherche, un abattoir exprimental, une quipe de
ressources techniques et administratives et une installation exprimentale. La mission de
l'URH est de contribuer au dveloppement des systmes durables d'levage des herbivores
en accord avec les attentes socitales, c'est--dire conciliant viabilit socio-conomique et
dveloppement rural, respect de l'environnement, qualit des produits et bien-tre
animal. Pour rpondre ces missions, l'URH met en place des projets de recherche faisant
intervenir de plus en plus de partenaires extrieurs (publics, privs ...). Les rsultats obtenus
lissue de ces projets sont valoriss principalement au travers de publications (environ 300 par
an) et d'enseignements (320 heures/an).
Outre le fait que dans le cadre du rfrentiel "Qualit" INRA, les exigences concernant
la fiabilit des rsultats peut ncessiter que nos mthodes soient valides, une autre contrainte
propre notre secteur d'activit nous a conduits rflchir une approche complmentaire de
la "validation de mthode" qu'est la "caractrisation de mthode". Cette approche peut
compltement sintgrer dans les dispositions dj prises dans notre Unit pour rpondre aux
exigences du rfrentiel Inra de niveau 1 (Thomas A. et Durand D., 2009).
1
UR1213 URH - Unit de recherche sur les herbivores - NEM (quipe Nutriments et Mtabolismes) - INRA
F-63122 Saint-Gens-Champanelle 04 73 62 45 43 agnes.thomas@clermont.inra.fr
Une grande partie des exprimentations sont conduites sur des animaux (bovins, ovins,
caprins, rongeurs) ce qui implique une approbation de nos protocoles par le comit
d'thique. La charte du comit d'thique nonce en 9 articles (Verschuere B., 2008), prcise
que le scientifique doit avoir employ toutes les stratgies dbouchant sur une utilisation dun
nombre rduit et adquat d'animaux pour obtenir des donnes suffisantes permettant de
rpondre une question de recherche.
Nous allons montrer, travers un exemple extrait d'une exprimentation conduite sur des
moutons ce qu'apporte la caractrisation de mthodes par rapport aux exigences relatives la
dmarche qualit et celles relatives lthique animale. Nous aborderons successivement les
diffrentes tapes de caractrisation dune mthode en prenant lexemple du dosage du
glucose sanguin ; puis nous montrerons comment nous avons utilis les rsultats de cette
caractrisation dans llaboration du plan exprimental.
2. Contexte exprimental
Les finalits de lquipe Nutriments et Mtabolismes sont damliorer les qualits
nutritionnelles et sensorielles de la viande de ruminant, tout en prservant les performances de
croissance des animaux. Afin datteindre ces objectifs scientifiques, il est ncessaire d'valuer
la rpartition des nutriments entre les tissus et les organes de manire dterminer les tapes
limitantes de l'utilisation mtabolique des nutriments.
Pour valuer la rpartition des nutriments entre organes, il est impratif de mesurer au mieux
la quantit de nutriments qui entre (flux affrent) et qui sort (flux effrent) des organes
d'intrt (Majdoub L. et al., 2003). Pour rpondre cette problmatique, l'quipe a mis en
place une approche chirurgicale permettant de prlever du sang l'entre et la sortie des
organes d'intrt (pose de cathters implants en chronique), et de mesurer les dbits sanguins
des vaisseaux cathtriss (pose de sondes dbimtriques ou dilution de marqueur). Ainsi il
est possible de mesurer des flux de nutriments entre organes et d'en calculer les flux nets au
travers des organes (de production ou captation) au cours de la journe en fonction de
diffrents facteurs de variation (composition de la ration, niveau de production, tat
physiologique de l'animal). Parmi les diffrents nutriments d'intrt, le glucose est lun des
principaux nutriments nergtiques tudi (Ortigues I. et Visseiche A.-L., 1995), cest
pourquoi nous dvelopperons dans cet exemple la caractrisation de cette mthode.
Le glucose est phosphoryl par l'adnosine triphosphate (ATP) au cours d'une raction
enzymatique catalyse par l'hexokinase, pour produire du glucose-6-phosphate (G-6-P) selon
lquation :
D - Glucose + ATP G - 6 - P
Hexokinase
+ ADP
+ +
G - 6 - P + NAD 6 Phosphogloconate +
G-6-PDH
NADPH + H
3. 2 Principe de la caractrisation
2 - Dveloppement
1 - Slection
4 Utilisation
en Revalidation
routine
3 - Validation
intra-laboratoire
La caractrisation d'une mthode d'analyse s'effectue selon une procdure bien dfinie
(protocole de caractrisation) tablie daprs la norme AFNOR V03-110 et les
recommandations de Max Feinberg (Feinberg M., 2001).
Les performances dune mthode sont values selon plusieurs critres. Les critres les plus
frquents sont la linarit, la spcificit, la rptabilit, la fidlit intermdiaire, la justesse, la
limite de dtection et la limite de quantification (Feinberg M., 2010a).
Lorsque cette procdure de caractrisation est acheve, l'analyste doit confronter les rsultats
obtenus pour chacun des critres aux exigences dfinies par le chercheur de manire vrifier
que la mthode sera en mesure d'y rpondre. C'est seulement aprs cette tape que la mthode
d'analyse pourra tre utilise en routine.
3. 3 Caractrisation de la mthode
Nous avons choisi, dans le cas du dosage du glucose, de dterminer les performances de la
mthode au travers des critres suivants : linarit, limite de dtection et de quantification et
fidlit.
Les diffrents calculs ont t effectus l'aide d'une application dveloppe sous Excel (A.
Thomas, M. Feinberg, Y. Anglaret et D. Durand - Mars 2000), les tableaux de rsultats tant
pour la plupart issus directement de l'application Excel.
Objectif
Dans la mthode que nous avons dveloppe, la quantit de glucose sanguin est obtenue
partir d'une mthode indirecte qui ncessite la mise en place d'un talonnage. La linarit
d'une mthode est sa capacit, l'intrieur d'un certain domaine, fournir des rsultats
directement proportionnels la concentration en analyte doser. Le test de linarit va
permettre de vrifier la validit du modle de rgression et de vrifier le domaine d'talonnage
pour en dduire les caractristiques d'talonnage. Il faut donc choisir a priori le domaine
d'talonnage. Nous avons choisi celui-ci partir des exigences inhrentes
l'exprimentation elle-mme, savoir une plage de concentration variant 0,40 et 0,80g/l.
Organisation
Les exigences de la norme V03-110 prconisent pour mettre en vidence une non-linarit au
risque de 1% de prparer, un minimum de 5 solutions talons et de faire 5 rptitions de
chacune delle. Nous avons choisi de tester 9 niveaux de concentrations analyss
sur 9 journes. Les niveaux de concentrations ont t rpartis rgulirement entre 0 1,6 g/l,
donc encadrant largement la plage de concentration souhaite au dpart (0,40 et 0,80 g/l)
de faon pouvoir utiliser cette mthode dans d'autres situations physiologiques plus
"extrmes" (comme lors d'un stress intense, lors des phases peripartum ).
Les niveaux de concentration ont t prpars par dilutions indpendantes les unes des autres
partir d'une solution mre de glucose 2 g/l (Sigma). L'analyse des 9 niveaux de
concentration a t rpte sur 9 jours partir de solution frachement prpare de manire
viter tout biais systmatique (tableau 1). Les essais ont t organiss en suivant le tableau ci-
dessous :
y = a1 x + a 0
o :
y : la concentration
a1 : la pente
x : la rponse instrumentale (densit optique (DO))
a0 : l'ordonne l'origine
La mthode utilise pour raliser le test de linarit met en uvre un test d'erreur d'adquation
du modle bas sur l'analyse de variance. Ce test consiste dcomposer la somme des carrs
des carts des rponses, en diffrentes SCE, selon l'quation ci-dessous :
o :
SCEreg somme des carrs des carts due la rgression
SCEem somme des carrs des carts due une erreur de modle
SCEe somme des carrs des carts rsiduels
Rsultats
Au vu des rsultats statistiques (tableau 2) entre les concentrations 0 et 1,6 g/l, le modle de
rgression choisi est acceptable (F calcul > F limite dtermin partir de la table de Fisher)
et le modle est linaire dans tout le domaine choisi (F calcul < F critique dtermin partir
de la table de Fisher).
A partir de ces donnes ayant permis d'tablir la fonction rponse il est possible de dterminer
les limites de dtection et de quantification.
Objectif
Il est important pour le chercheur de connatre ces limites qui pourront lui permettre de savoir
partir de quelle concentration il pourra mettre en vidence avec certitude la prsence de
l'analyte recherch (ici le glucose) (limite de dtection) et partir de quelle concentration il
pourra garantir la fiabilit de son rsultat et donc en tirer une interprtation mcanistique
(limite de quantification).
Organisation
Les mesures collectes sont utilises pour calculer la sensibilit ou pente (a1) et son cart-type
(sa1), ainsi que le blanc ou ordonne l'origine (a0) et son cart-type (sa0).
Les limites de dtection et de quantification sont dtermines de la faon suivante :
a 0 + 3 Sa 0
Limite de dtection (LD) =
a1
a 0 + 10 Sa 0
Limite de quantification (LQ) =
a1
Rsultats
Comme nous pouvons le lire dans le tableau 3, la limite de dtection est de 0,089 g/l, la
valeur partir de laquelle nous pouvons garantir la fiabilit de notre mesure (P<0,01) est de
0,133 g/l.
3.3.3 Fidlit
Objectif
Organisation
Afin de rpondre aux besoins de ltude, ce test a t ralis sur la matrice d'intrt, savoir
un chantillon sanguin d'ovin situ dans des conditions physiologiques de base. Cet
chantillon a t trait comme les chantillons exprimentaux c'est--dire qu'aprs
prlvement au niveau de la veine jugulaire, le sang a t dprotinis, aliquot puis conserv
-20C.
Ensuite, un aliquote dchantillon dprotinis a t analys en triple (conditions de
rptabilit) et rpt sur 9 jours (conditions de fidlit intermdiaire). Le nombre de
rptitions intra et inter journe (ou srie) a t dfini en fonction des exigences de la norme
franaise (NF ISO 5725-1, 1994) qui recommande de faire au moins 8 sries dau moins 2
rptitions de lchantillon.
Ce test utilise comme modle statistique, une analyse de variance un seul facteur effet
alatoire. Cette analyse permet de dterminer lcart-type de rptabilit, de fidlit
intermdiaire ainsi que les limites de rptabilit et de fidlit intermdiaire pour un risque
d'erreur de 5%.
Rsultats
Tableau 4 : estimation des critres de fidlit
La mthode enzymatique que nous avons utilise pour doser le glucose sanguin est
caractrise par des coefficients de variation (CV) de rptabilit de 1,55% et de fidlit
intermdiaire de 2,75%.
3.3.4 Conclusion
Par ailleurs, il apparat important que l'on puisse associer les performances ainsi dtermines
aux besoins spcifiques de certaines exprimentations en particulier dans le cas
d'exprimentation exigeant une trs bonne limite de quantification. Nous allons dans la suite
de cet article illustrer par un exemple d'exprimentation conduite dans notre quipe cette
exploitation des performances d'une mthode.
4.1 Objectifs
Lors de la mise en place d'une exprimentation, le chercheur formule une hypothse tester,
pour rpondre une question scientifique labore partir des connaissances disponibles. Il
doit ensuite laborer le protocole exprimental et faire des choix oprationnels les plus
appropris pour tester l'hypothse mise. Pour cela, le chercheur doit slectionner les
variables qu'il voudra mesurer mais galement la mthode de dosage de ces variables. Le
choix des mthodes associes aux variables dpend de leur facilit de mise en uvre, de
l'quipement disponible dans l'quipe, du cot mais peut galement dpendre des
performances exiges. C'est sur ce dernier point que nous allons particulirement insister.
Nous avons dans un premier temps ralis des pr-essais sur des animaux recevant diffrentes
rations alimentaires. Nous avons ainsi mesur les concentrations en glucose dans plusieurs
vaisseaux d'intrt comme laorte, la veine porte, la veine sus-hpatique et la veine iliaque
pour tudier les flux nets de glucose travers le foie, le tube digestif et le train arrire. Nous
avons dtermin les variations de concentrations en glucose au cours de la journe et ceci
pour chacun des vaisseaux et en fonction des diffrents traitements exprimentaux appliqus
aux animaux (niveaux d'nergie variables entre lots). Il est apparu clairement que la diffrence
minimale en glucose entre vaisseaux releve parmi ces traitements exprimentaux tait
voisine de 0,050 g/l soit seulement 8 % des concentrations moyennes habituellement
enregistres chez des ovins. Compte tenu de ces diffrences attendues et des performances de
notre mthode nous avons pu apporter des lments objectifs de choix pour l'laboration du
plan exprimental. C'est ce que nous allons prsenter dans la suite de ce paragraphe.
Equation 1
2 t
n
O :
= diffrence
t = variable de Student (probabilit 0,05 ou 0,01)
= cart-type de rptabilit ou cart-type de fidlit
n = nombre d'animaux
Tableau 5 : nombre d'animaux utiliser selon les conditions de dosage et prcision recherches
Diffrences Diffrences
Rptabilit Fidlit intermdiaire
(0,013 g/l (0,023 g/l)
P 0,05 0,01 0,05 0,01
n
2 0,413 2,071 0,234 1,170
3 0,114 0,264 0,065 0,149
4 0,073 0,134 0,041 0,076
5 0,057 0,095 0,032 0,054
6 0,048 0,076 0,027 0,043
7 0,043 0,064 0,024 0,036
8 0,038 0,057 0,022 0,032
9 0,035 0,051 0,020 0,029
10 0,033 0,047 0,019 0,027
11 0,031 0,044 0,017 0,025
12 0,029 0,041 0,017 0,023
Le tableau 5 rassemble les rsultats de ces simulations et montre clairement que pour mettre
en vidence une diffrence de concentration en glucose entre vaisseaux avec la probabilit la
plus exigeante (P<0,01) il serait ncessaire de conduire 10 ou 6 animaux selon que le
laboratoire ralise tous les dosages dans une mme srie avec le mme oprateur (conditions
de rptabilit) ou dans des sries diffrentes (conditions de fidlit intermdiaire). Le nombre
d'animaux se rduit 6 (condition de rptabilit) ou 4 (condition de fidlit intermdiaire) si
l'exprimentateur n'exige qu'une probabilit de 5 %. Ainsi, il apparait clairement que le
nombre danimaux mettre en exprimentation est variable selon les possibilits analytiques
du laboratoire et les exigences du chercheur en termes de niveau statistique souhait.
Conclusion
La caractrisation d'une mthode permet donc de connatre les performances de cette mthode
et den dduire des indications prcieuses pour llaboration du plan exprimental mettre en
uvre. Elle garantit que le dosage effectu est compatible avec les possibilits qu'offre la
mthode (mesure ralise au dessus de la limite de quantification, dans le domaine de
linarit, avec une incertitude lie aux critres de fidlit). En revanche, elle ne permet pas
d'accompagner la valeur rendue au commanditaire avec des incertitudes connues.
Il apparat clairement que la validation de mthode, telle quelle sera aborde dans les
chapitres suivants, permet l'analyste de garantir que chaque mesure ralise avec cette
mthode sera accompagne d'une limite d'acceptabilit et dun intervalle de tolrance qui
dfinissent des incertitudes sur la valeur transmise au commanditaire. Ces deux paramtres,
limite d'acceptabilit et intervalle de tolrance, sont fixs par le futur utilisateur (le plus
souvent le chercheur) et/ou par l'analyste en fonction de ses besoins (Feinberg M., 2010b).
Bibliographie
Bergmeyer H.U., Bernt, Schmit F. and Stork H. (1974) Determination with hexokinase and
glucose-6-phosphate dehydrogenase. In "Methods of enzymatic analysis" volume 3rd ed.
H.U. Bergmeyer Verlag Chemie Academic Press, Inc. 1196-1227
Feinberg M. (2001) Validation interne des mthodes d'analyse. Techniques de l'ingnieur.
Mesures Analyse Qualit et scurit au laboratoire. P224, 1-23
Feinberg M. (2010a) Principes et vocabulaire in Validation des mthodes danalyse
quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra, numro
spcial : 13-25
Feinberg M. (2010b) Mise en uvre du profil d'exactitude in Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 27-44
Kunst A. et al., (1984) D-glucose. UV-methods withhexokinase and glucose-6-phosphate
dehydrogenase. In Methods of Enzymatic Analysis. 3rd edition. H. U. Bergemeyer, editor.
Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 163-172
Majdoub L. et al., (2003) Intraruminal propionate supplementation modifies hindlimb energy
metabolism without changing the splancnic release of glucose in growing lambs. British
Journal of Nutrition 89, 39-50
Ortigues I. et Visseiche A.-L. (1995) Whole-body fuel selection in ruminants : nutrient supply
and utilization by major tissues. Proceedings of the Nutrition Society 54, 235-251
Thomas A. et Durand D. (2009) Dmarche qualit de l'unit de recherche sur les herbivores,
Inra. In La dmarche qualit dans la recherche publique et l'enseignement suprieur.
Editions QUAE. Granier C., Mas L.-Y., Finot L., Arnoux B., Pasqualini N., Doll V.
coordinateurs. 13, 121-131
Verschuere B. (2008) Exprimentation animale : les comits d'thique en 2008. Bull. Acad.
Vt. France. Tome 161 N5 http://www.academie-veterinaire-defrance.org/ (Consult le
5/2/2010)
NF ISO 5725-1, (Dcembre 1994) Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et mthodes de
mesure. Partie 1 : Principes gnraux et dfinitions.
NF V03-110, (Dcembre 1998) Procdure de validation intralaboratoire d'une mthode
alternative par rapport une mthode de rfrence. AFNOR
NF ISO/CEI 17025, (Mai 2000) Prescriptions gnrales concernant la comptence des
laboratoires d'talonnages et d'essais. AFNOR
Marjolaine Bourdat-Deschamps1
Introduction
Les HAP sont des molcules apolaires, issues de la combustion incomplte des matires
organiques dont certaines sont cancrignes, mutagnes et toxiques pour la reproduction. Les
flux de HAP provenant des dpositions atmosphriques totales (retombes sches et humides)
sont de lordre de 150 g/m2/an (zone urbaine et pri-urbaine, Azimi et al., 2005). Disposant
dun pluviomtre permettant de rcolter les retombes humides (pluie) et suivant par ailleurs
les teneurs en HAP dans les sols dans le cadre dun suivi exprimental de longue dure, nous
avons souhait connatre le flux des HAP via leau de pluie en regard du stock en HAP du sol.
Une mthode danalyse a t optimise (Bourdat-Deschamps et al., 2007) qui permet de
concentrer les HAP par absorption sur barreau magntique (SBSE : Stir Bar Sorptive
Extraction), de les dsorber dans un trs faible volume dactonitrile et de les analyser par
chromatographie liquide haute performance avec un dtecteur de fluorescence. La mthode a
t caractrise (linarit, rptabilit deux niveaux de concentration, fidlit intermdiaire,
limite de quantification). La mthode du profil dexactitude a t employe pour valider
lanalyse des HAP contenus dans les eaux de pluie. Dans une premire partie, chaque tape de
la mthode de validation est dtaille (cf. Feinberg M, 2010b). Dans une deuxime partie,
diffrents profils dexactitude du pyrne et du benzo(k)fluoranthne sont prsents et
comments.
1
UMR1091 EGC- Environnement et Grandes Cultures, INRA-F-78850 Thiverval-Grignon
01 30 81 53 12 marjolaine.deschamps@grignon.inra.fr
Objectif de la mthode
Quantifier 15 HAP (naphtalne, acnaphtne, fluorne, phnantrne, anthracne,
fluoranthne, pyrne, benzo(a)anthracne, chrysne, benzo(b)fluoranthne,
benzo(k)fluoranthne, benzo(a)pyrne, dibenzo(ah)anthracne, benzo(ghi)prylne,
indno(1,2,3-cd)pyrne) contenus dans des eaux de pluie. La mthode doit tre juste (nous
avons besoin des concentrations en ng/l pour calculer les flux de HAP via leau de pluie et les
comparer au stock du sol, qui est dtermin par une autre mthode analytique). La mthode
doit tre fidle (les analyses sont ralises une fois par an, il ny a pas de rptition par
chantillon). Les rsultats sont destins aux scientifiques utilisant le dispositif exprimental.
Mthode analytique optimise et mode opratoire rdig sous trame qualit du laboratoire
Voici quelques informations concernant le mode opratoire (Bourdat-Deschamps et al., 2007).
Les eaux de pluies sont collectes de faon hebdomadaire et sont congeles. Aprs
dconglation, un chantillon moyen mensuel est ralis. Dans un volume de 10 ml deau de
cet chantillon, additionn de 200 l dactonitrile, on place un Twister (barreau aimant
recouvert dun film polymrique), pralablement conditionn. Lextraction est ralise dans
un bain marie 25C, avec une agitation de 800 tr/mn pendant 140 mn. Le barreau est ensuite
plac dans un flacon HPLC avec insert. Un volume de 100 l dactonitrile est rajout.
Ltape de dsorption ralise labri de la lumire dure 25 mn dans un bain marie 50C.
Le barreau est ensuite sorti du flacon. Le flacon est rebouch, stock labri de la lumire
avant analyse par HPLC-fluorescence (colonne polarit de phases inverse spciale HAP,
gradient actonitrile-eau). La quantification est ralise par talonnage externe : dopage deau
milli-Q 4 ou 5 niveaux de concentrations de HAP, extraction des HAP selon la procdure
dtaille ci-dessus, quantification des HAP contenus dans leau de pluie avec la droite
dtalonnage ralise dans leau milli-Q dope.
Initialement, la mthode prvoyait deux dsorptions successives dans lactonitrile afin de
maximiser le rendement de dsorption. Cependant la ralisation de deux dsorptions
successives limitait 8 le nombre dexpriences qui pouvaient tre ralises dans une journe.
Afin daugmenter 12 le nombre dexpriences ralisables par jour, le protocole a t modifi
et dsormais une seule dsorption est ralise.
En gnral, 12 chantillons deau de pluie sont extraits par jour. Le lendemain, ce sont les
chantillons dtalonnage (eau Milli-Q dope) qui sont extraits. Puis, lanalyse HPLC est
ralise pour lensemble des chantillons deau de pluie et dtalonnage.
Teneurs approximatives des chantillons analyser : nous avons analys des chantillons
deau de pluie laide de la mthode dcrite ci-dessus. Les teneurs sont variables selon les
HAP et selon les saisons (de quelques ng/l quelques dizaines de ng/l).
Que mesure-t-on ? Chacun des 15 HAP contenu dans de leau de pluie (chantillon moyen
mensuel)
Comment exprime-t-on le rsultat final ? Un seul chantillon deau par mois est analys
(pas de rptition). La teneur (ng/l) est dtermine par talonnage externe (eau milli-Q dope).
Limites dacceptabilit () : 20%, ce qui signifie que pour une teneur de 1ng/L le rsultat
sera compris au maximum entre 0,8 et 1,2 ng/L et pour une teneur de 30 ng/L, il sera compris
au maximum entre 24 et 36 ng/L.
Quelle est la valeur de rfrence pour chaque chantillon ? Des ajouts doss diffrentes
concentrations ont t raliss sur la matrice ainsi prpare, avec une solution talon
commerciale contenant les 15 HAP, chacun la mme concentration.
Quatre niveaux de concentration (1,9 ; 4,7 ; 9,5 ; 28,5 ng/l) ont t choisis. Selon les
saisons et les HAP, certaines teneurs risquent dtre proches des limites de quantification.
Lors de la caractrisation de la mthode, ces limites avaient t values (rapport signal sur
bruit de lordre de 10) autour de 1 5 ng/l selon les HAP, ce qui explique notre choix pour les
deux niveaux bas de concentration.
La matrice que nous avons dope contient probablement des HAP (cest de leau de pluie
naturelle). Un chantillon non dop a galement t analys.
Deux rptitions par niveau de concentration ont t ralises car nous pouvons effectuer
au maximum 12 extractions par jour. Or (4 niveaux de concentration + 1 chantillon non
dop) 2 rptitions = 10 extractions.
Trois sries de mesures ont t ralises, sur trois jours.
Nous avons choisi dappliquer le protocole dextraction SBSE aux chantillons dtalonnage
qui sont constitus deau Milli-Q dope avec les HAP.
Comme indiqu dans le mode opratoire ltape 0, les extractions des chantillons de terrain
sont ralises un jour et les extractions des chantillons deau milli-Q dope sont ralises un
autre jour. Nous avons donc procd de mme pour la validation de la mthode. Pour chaque
srie, les extractions SBSE des chantillons dtalonnage ont t ralises le lendemain des
extractions dchantillons de validation. Ensuite, les injections HPLC de tous ces chantillons
de la mme srie ont t ralises sur une nuit.
Cinq niveaux de concentration (de 0,9 27,6 ng/l) ont t choisis. Le point le plus lev de
la gamme dtalonnage est lgrement infrieur celui de la gamme de validation. Comme le
rendement dextraction SBSE est infrieur 83 %, cela ne posera pas de problme car les
aires obtenues pour les chantillons de validations seront comprises dans la gamme des aires
des chantillons dtalonnage.
Une analyse par niveau a t ralise. Ce choix a t fait car dans lorganisation de la
semaine de travail, il ntait pas possible de raliser deux rptitions (le conditionnement des
barreaux demandant beaucoup de temps). Par ailleurs, le coefficient de variation caractrisant
la rptabilit de la mthode pour chaque HAP, dtermin notamment pour de leau Milli-Q
dope 5ng/l, est infrieur 10% (except pour le benzo(ghi)prylne : 12,8 %), ce qui a
confort ce choix.
Trois sries de mesures ont t ralises cest--dire trois jours, comme pour les chantillons
de validation.
Pour les tapes 6 9, seuls les rsultats concernant le pyrne seront prsents, la
mthodologie tant la mme pour les 14 autres HAP.
Essais de validation
valeur ref
niveaux sries (ng/L) Mesurages pyrne (aires)
1 43083
1 2 0,9 24719
3 35684
1 117767
2 2 4,6 112319
3 115840
1 238120
3 2 9,2 202957
3 249807
1 450132
4 2 18,4 398342
3 440029
1 682393
5 2 27,6 611523
3 633748
partir des donnes du tableau 2, pour chaque srie dtalonnage, les coefficients du modle
dtalonnage sont dtermins (tableau 3), sachant que dans notre cas, le modle dtalonnage
est une droite. Ensuite, partir des mesurages raliss sur les chantillons de validation
(tableau 1), ces coefficients permettent de calculer les concentrations retrouves des
chantillons de validation (tableau 4).
Pyrne
800000
y = 24031x + 14563
700000 R2 = 0,9994
talonnage 1
y = 21757x + 5845,6
600000 talonnage 2
R2 = 0,9994
y = 22431x + 22707 talonnage 3
500000
R2 = 0,9972
aire
validation 1- rep1
400000
validation 1 - rep 2
300000 validation 2 - rep 1
validation 2 - rep 2
200000
validation 3 - rep 1
100000 validation 3 - rep 2
0
0 5 10 15 20 25 30
concentration (ng/L)
Figure 1 : reprsentation graphique des aires mesures lors des essais dtalonnage et de
validation, en fonction de la concentration
2. Rsultats et interprtations
2.1 Rsultats pour le pyrne
140%
Le trac du profil dexactitude
130%
pour le pyrne est prsent sur
120%
la figure 2.
110%
recouvrement (%)
100%
0 5 10 15 20 25 30
90%
80%
70%
Niveaux
60% Recouvrement (justesse)
Limite basse tolrance (%)
Limite haute tolrance (%)
50%
Limite d'acceptabilit basse
Limite d'acceptabilit haute
40%
Figure 2 : profil dexactitude pour le pyrne (daprs tableau 4), pour =20% et =80%
La mthode prsente un biais systmatique (la ligne de recouvrements moyens nest pas
100%) qui est explicable par un effet matrice. Or cela invalide la mthode puisque nous avons
besoin quelle soit juste. En traant les concentrations retrouves (donnes du tableau 4) en
fonction des concentrations thoriques pour les chantillons de validation (figure 3), il est
possible de dterminer la pente moyenne des taux de recouvrement. Linverse de cette pente
moyenne donne le facteur de correction (1,20) que lon peut appliquer chacune des
concentrations retrouves afin de retracer un profil dexactitude corrig (figure 4).
Pyrne
30
y = 0,79x + 0,40 y = 0,89x - 0,84
concentration retrouve
25
y = 0,83x + 0,33
y = 0,87x - 0,74 serie1 rep 1
20 serie 1 rep 2
(ng/L)
15
y = 0,81x + 0,10 serie 2 rep 1
y = 0,80x + 0,76 serie 2 rep 2
10 serie 3 rep 1
5 serie 3 rep 2
0
0 5 10 15 20 25 30
concentration thorique (ng/L)
160%
140%
Recouvrement (%)
120%
100%
0 5 10 15 20 25 30
80%
Niveaux
Recouvrement (justesse)
En corrigeant les valeurs retrouves avec le facteur de correction, la mthode devient juste
(biais infrieur 3% pour des concentrations entre 5 et 28 ng/l).
Afin de valider le facteur de correction, une nouvelle srie de mesures a t ralise
(chantillons de validation : 4 niveaux et 2 rptitions par niveau ; chantillons dtalonnage :
5 niveaux sans rptition). Le facteur de correction dtermin auparavant a t appliqu aux
concentrations retrouves. Les teneurs corriges se situent dans le profil dexactitude prsent
figure 4.
Le profil dexactitude peut tre employ pour choisir les teneurs des contrles qualits
(CQ) qui seront employs lors des analyses en routine. En effet, on pourra choisir un CQ
proche de 10 ng/l. Le CQ se comportant comme les chantillons, sil ne passe pas, il faudra
refaire la srie danalyse. Si on choisit dutiliser 3 CQ de niveaux de concentrations diffrents,
on peut choisir un CQ 5 ng/l (proche de la limite de quantification basse), un CQ 10 ng/l
(concentration critique du profil) et un CQ 25 ng/l (proche de la limite haute).
Les rsultats prsents la figure 1 ont t obtenus en prenant une droite (a1 X + a0) comme
modle dtalonnage. Dautres modles dtalonnage ont t tests (droite passant par zro,
modle quadratique), ainsi que des pondrations (1/X) de ces modles. Ces modles
dtalonnage, pondrs ou non, ont t dtermins partir des donnes du tableau 2, en
utilisant le logiciel Statgraphics Plus 4.1. Les coefficients de ces modles ont t appliqus
aux donnes du tableau 1 afin de dterminer les concentrations de pyrne retrouves dans
chaque chantillon de validation. Les profils dexactitude (avec application dun facteur de
correction aux donnes de validation) correspondant chaque modle ont t tracs (figure 5).
160% 160%
140% a 140% b
R ecou v rem en t (% )
120%
R e couv re m en t (% )
120%
100% 100%
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
80% 80%
Niveaux Niveaux
60% 60%
40% 40%
160%
160%
140%
c 140%
d
120% 120%
R ecou v rem en t (% )
100% 100%
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
80% 80%
Niveaux Niveaux
60% 60%
40% 40%
120%
100%
0 5 10 15 20 25 30
80%
Niveaux
60%
40%
Pour le benzo(k)fluoranthne (figure 7a), la mthode prsente un biais (effet matrice) qui est
plus important que dans le cas du pyrne (car celui-ci est plus apolaire que le pyrne et
prsente de plus fortes interactions avec la matire organique dissoute de leau de pluie).
Aprs application dun facteur de correction (figure 7b), le biais est corrig pour les teneurs
entre 8 et 18 ng/L, mais il subsiste un biais qui saccentue quand la concentration diminue.
La mthode non corrige est assez fidle (figure 7a), mais aprs application du facteur de
correction (figure 7b), les intervalles de tolrance slargissent considrablement. Ce qui
normal puisque le facteur de correction est suprieur 1 et a pour effet daugmenter les
carts-types.
Aprs application du facteur de correction, la limite haute de tolrance dpasse la limite haute
dacceptabilit 17,5 ng/l, ce qui correspond la limite basse de quantification. Sachant que
les teneurs en benzo(k)fluoranthne dans les chantillons deau de pluie sont gnralement
infrieures cette valeur, la mthode nest donc pas valide pour raliser les analyses de ce
compos.
100%
Recouvrement (%)
0 5 10 15 20 25 30
90%
80%
70%
60%
Niveaux
50%
40%
30%
130% b
120%
110%
100%
0 5 10 15 20 25 30
90%
80%
70%
60%
Niveaux
50% Recouvrement (justesse)
Limite basse tolrance (%)
Limite haute tolrance (%)
40%
Limite d'acceptabilit basse
Limite d'acceptabilit haute
30%
Pour que la mthode soit valide, le facteur pourrait tre diminu (70 % par exemple,
figure 8) ; dans ce cas, le risque moyen davoir un rsultat qui ne sera plus acceptable serait
augment et il est peu raisonnable daugmenter ce risque (on choisit en gnral un dau
minimum 80 %).
140%
130%
120%
110%
Recouvrement (%)
100%
0 5 10 15 20 25 30
90%
80%
70%
Recouvrement (justesse) Niveaux
60% Limite basse tolrance (%)
Limite haute tolrance (%)
50%
Limite d'acceptabilit basse
40% Limite d'acceptabilit haute
140%
130%
120%
110%
Recouvrement (%)
100%
0 5 10 15 20 25 30
90%
80%
70%
Recouvrement (justesse) Niveaux
60% Limite basse tolrance (%)
Limite haute tolrance (%)
50%
Limite d'acceptabilit basse
40% Limite d'acceptabilit haute
Dautres profils dexactitude ont t tracs avec diffrents modles dtalonnages (pondrs
ou non). Il savre que le modle linaire donne le profil (figure 9) le plus adapt aux
objectifs de la mthode (intervalle de tolrance le plus troit, meilleure justesse, limite de
quantification la plus basse).
Comme dans le cas du pyrne, nous avons trac le profil dexactitude en utilisant des
chantillons dtalonnage dans lactonitrile (ne subissant pas le protocole dextraction)
(figure 10), et aprs application dun facteur de correction (2,45). La figure 10 est comparer
avec la figure 7b, o les chantillons dtalonnage ont subi lintgralit du protocole
extraction-analyse.
140%
130%
120%
110%
Recouvrement (%)
100%
0 5 10 15 20 25 30
90%
80%
70%
Niveaux
60%
50%
40%
La mthode est juste entre 8 et 28 ng/l (biais infrieur 5 %), comme ctait le cas figure 7b.
En revanche, figure 10, lintervalle de tolrance se situe lintrieur des limites
dacceptabilit entre 8,8 et 28 ng/l. Le domaine de validit de la mthode ainsi dfini, avec
= 20 % et = 80 %, est plus tendu que celui du profil dexactitude figure 7b. Pour valider
la mthode en utilisant des talons qui subissent le protocole dextraction, nous avions t
contraints daugmenter 25 % (figure 9), mais le domaine de validit tait plus tendu
(entre 6 et 28 ng/l). Dans le cas du benzo(k)fluoranthne, le choix de la mthode dtalonnage
est orienter en fonction des besoins scientifiques : domaine de validit tendu et = 25 %
(ce que nous avons choisi) ou domaine de validit plus restreint (limite basse de quantification
plus leve) et = 20 %.
Conclusion
Nous avons ralis un total de 47 essais pour essayer de valider la mthode danalyse
de 15 HAP contenus dans de leau de pluie selon la mthode du profil dexactitude. Les
expriences ont t ralises avec le mlange des 15 HAP (mthode multi-analytes), mais les
rsultats ont t traits individuellement pour chaque HAP.
Ltendue du domaine de validation varie selon les HAP. Pour la plupart des HAP, il est
ncessaire dappliquer un facteur de correction afin de corriger le biais (effet matrice) et de
valider la mthode. Pour certains HAP, nous avons choisi daugmenter la limite
dacceptabilit 25 % (au lieu de 20 %) afin de valider la mthode sur un domaine de
concentration plus large (mais toujours compris entre les niveaux bas et haut des chantillons
de validation, lextrapolation hors du domaine test tant proscrite).
Outre lintrt pour la validation de la mthode, le profil dexactitude est galement un outil
diagnostic pour dterminer les points faibles de la mthode et galement pour choisir
judicieusement les contrles qualit qui seront employs en routine. Le trac des profils
dexactitude pour des modles dtalonnages varis, pondrs ou non, permet de dterminer le
modle dtalonnage qui donnera le profil le plus en adquation avec les objectifs
scientifiques. De mme, le trac des profils dexactitude en prenant des chantillons
dtalonnage qui subissent ou non le protocole dextraction permet de dterminer la procdure
dtalonnage qui valide la mthode.
Bibliographie
Azimi S., Rocher V., Muller M., Moilleron R., Thevenot D. (2005) Source, distribution and
variability of hydrocarbons and metals in atmospheric deposition in an urban area (Paris,
France). Sci. Total Environ. 337:223-239
Bourdat-Deschamps M., Daudin J.-J., Barriuso E. (2007) An experimental design approach to
optimize the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons from rainfall water using
stir bar sortpive extraction and high performance liquid chromatography fluorescence. J.
Chromatogr. A. 1167 :143-153
Feinberg M. (2010b) Mise en uvre du profil dexactitude in Validation des mthodes
danalyse quantitatives physicochimiques par le profil dexactitude. Le Cahier des
Techniques de lInra, numro spcial : 27-44
Rsum : La chlorophylle a est un pigment vert prsent dans tous les vgtaux, dont les algues.
Lunit mixte de recherche CARRTEL de lInra de Thonon-les-Bains, mesure la concentration de ce
pigment dans des lacs alpins afin dtudier ces cosystmes. Ce pigment est dos dans leau par
HPLC-DAD aprs une tape de filtration / extraction. Cette mthode qui fait lobjet dun protocole
dfini, est utilise depuis plusieurs annes au laboratoire de lunit. Afin de mieux rpondre aux
besoins des chercheurs et de se conformer la dmarche qualit de lInra, cette mthode a t valide
par un profil dexactitude. Cette validation a t effectue en deux tapes afin dvaluer la mthode
dans son ensemble : une tape avec un matriau de rfrence puis partir de cultures dalgues. Cet
article dcrit le plan dexprience et la validation de cette mthode avec un profil dexactitude dans ce
contexte.
Introduction
Lunit mixte de recherche CARRTEL de lInra de Thonon-les-Bains tudie les cosystmes
lacustres ; son laboratoire de chimie ralise les analyses des eaux et des sdiments lors
dtudes limnologiques. Depuis plusieurs annes, le laboratoire de chimie est engag dans une
dmarche qualit selon le Rfrentiel Inra. Un des objectifs du plateau technique est que toute
mthode utilise en routine soit valide.
Afin dtudier les cosystmes lacustres, la biomasse algale des lacs doit tre value. Cette
biomasse peut tre value soit par une dtermination taxonomique soit par une estimation en
quantifiant les pigments prsents.
Nous traiterons ici de la validation de la mthode danalyse de la chlorophylle a par
chromatographie liquide avec dtections sur barrette de diodes (HPLC-DAD) aprs extraction
liquide-solide avec la mthode du profil dexactitude (Max Feinberg, 2010b).
1
UMR0042 CARRTEL Centre alpin de recherche sur les rseaux trophiques des cosystmes mimniques
INRA - F-74200 Thonon-les-bains 04 50 26 78 21 lazzarotto@thonon.inra.fr
2. Matriel et mthode
Leau est filtre pour mesurer sa teneur en chlorophylle a. Lanalyse de la chlorophylle a est
ralise par extraction liquide-solide partir du filtre puis HPLC-DAD.
Cette mthode est tablie et fixe par un mode opratoire, inspir de la norme NF T90 116.
Les pigments sont photosensibles et thermosensibles, les chantillons sont donc conservs au
froid et lobscurit jusqu lanalyse.
Leau brute est filtre sur un filtre GFC. Le volume filtr est choisi entre 50 ml et 5 l selon la
transparence de lchantillon. Les algues contenant les pigments sont retenues sur ce filtre.
Les filtres sont dposs dans un tube centrifuger avec
le solvant dextraction (mthanol/actate dammonium 0.5 M (98/2 ; v/v)). Ils sont soumis
des ultra-sons afin de briser les cellules algales et de librer les pigments. Les tubes sont
ensuite centrifugs.
Le surnageant est rcupr et filtr travers un filtre seringue pour le sparer des dbris
2.2 HPLC-DAD
Lextrait est ensuite analys par HPLC-DAD, sur une chaine Waters avec un passeur
dchantillons. 100 l sont injects et lus selon un gradient dlution base de 3 luants
(mthanol / 0,5 M actate dammonium (80/20) ; actonitrile/eau (90/10) ; thyle actate)
de 30 mn.
La chlorophylle a est identifie par son temps de rtention ainsi que par son spectre
dabsorption spcifique (Jeffrey et al., 1997).
analyses sur plusieurs jours, il dtermine les paramtres pris en compte pour la validation de
mthode tels que la justesse, la fidlit intermdiaire et les incertitudes.
Pour cette dmarche, nous avons choisi de diffrencier les deux tapes de la mthode :
lextraction puis la quantification. Dans un premier temps, nous tablissons le profil
dexactitude pour la quantification seule via HPLC-DAD, avec des matriaux de rfrence
certifis (MRC) et diffrents de ceux utiliss pour effectuer ltalonnage. Nous validons ainsi la
justesse de la mthode et nous estimerons la variabilit de cette tape.
Dans un second temps, nous tablissons le profil dexactitude pour la mthode entire, soit
lextraction puis la quantification. Pour ce faire, nous utilisons plusieurs cultures dalgues.
Ltape dextraction peut apporter un biais quil faut considrer. Les pigments prsents dans
lchantillon initial peuvent ne pas tre extraits en totalit. Nous ne pouvons pas dterminer le
recouvrement rel de la mthode. Nous avons estim en tude prliminaire le rendement
maximum de la mthode. Nous avons effectu des mesures en modifiant la mthode et en
utilisant une mthode dextraction considre comme optimale, avec une tape
supplmentaire de broyage du filtre. Le recouvrement observ par rapport la mthode
considre comme optimale est de 78 % pour des quantits entre 0.1 g Chl a et 6 g Chl a
extraites. Ce recouvrement nest pas un recouvrement absolu mais relatif et correspond au
recouvrement maximum possible de la mthode.
Daprs ces connaissances de la mthode que nous utilisons en routine, nous suivons la
dmarche de validation dcrite par Max Feinberg (2010b)
Les rsultats habituels observs varient entre 0,2 et 100 g Chl a/L, avec des volumes filtrs
entre 50 ml et 5 l. La quantit extraite varie donc entre 1 et 5 g Chl a.
Le domaine de validation est exprim en quantit extraite. Il est choisi plus large
quentre 1 et 5 g Chl a extraite afin de pouvoir mesurer le pigment si le volume filtr nest
pas optimal et de ne pas avoir refaire une filtration. Le domaine de validation choisi est
de 0,4 8,0 g Chl a extrait.
Les exigences des demandeurs danalyses sont fixes selon les frquences dobservation et les
distinctions entre stades deutrophisation explicites en 1. Il est souhait que au
moins 3 analyses sur 4 donnent un rsultat +/- 25 % de la valeur vraie de lchantillon, soit
que 75 % des rsultats obtenus aient un recouvrement de 25 %.
Ainsi les limites dacceptabilit ( ) sont de 25 % et lintervalle de tolrance ( ) est de 75 %.
Il existe des talons certifis dextrait de chlorophylle a mthanolique. Mais il nexiste pas de
solution dalgue avec une concentration connue en chlorophylle a, du fait des problmes lis
lvolution des algues. Il est impossible aussi de doper une matrice puisque le pigment mesur
est lintrieur des cellules de plancton.
Pour cette validation, nous avons choisi de diffrencier les deux tapes de la mthode :
lextraction puis la quantification.
Dans un premier temps, nous tablirons un profil dexactitude pour la quantification seule via
HPLC-DAD, avec des talons dextrait de chlorophylle a mthanolique certifis. Nous validons
ainsi la justesse de la mthode et la variabilit lie cette tape.
Dans un second temps, nous tablirons deux profils dexactitude pour la mthode entire, soit
lextraction puis la quantification. Pour ce faire, nous utilisons deux cultures dalgues, afin de
contrler les espces dalgues en prsence et lvolution de la biomasse. Nous ne connaissons
pas la valeur vraie de la concentration en chlorophylle a de ces cultures. Ces profils
dexactitude nous renseignerons sur la variabilit globale de la mthode.
Ces profils sont effectus pour deux algues cultives spcifiques : diatomes et
cyanobactries. Ces cultures seront filtres dans les mmes conditions que les chantillons.
Nous avons choisi 4 niveaux de quantit de chlorophylle a : 0,4 ; 0,8 ; 2,0 ; 8,0 g Chl a. Afin
dvaluer la rptabilit et la fidlit intermdiaire de cette tape, nous avons ralis pour
chacune de ces quantits 3 rplicats et cela pendant 3 jours. Soit 9 mesures par niveau, soit 36
mesures au total.
Nous avons filtr diffrentes quantits des cultures dalgues afin dapprocher les quantits
values lors de la premire tape : 1 ml ; 3 ml ; 10 ml ; 90 ml. Afin dvaluer la rptabilit
de cette tape, nous avons ralis pour chacune de ces filtrations 3 rplicats. Etant donn que
la culture dalgues volue dans le temps, la fidlit intermdiaire ne peut tre dtermine en
effectuant plusieurs mesures sur diffrents jours, nous avons donc effectu 3 sries de
filtration dans la mme journe avec deux oprateurs. Soit 9 mesures par niveau, 36 mesures
par culture dalgues et 72 mesures au total.
3.5 Ltalonnage
Ltalonnage est effectu avec des solutions talons mthanoliques injectes 3 niveaux :
0,28 g Chl a ; 4,60 g Chl a ; 9,20 g Chl a. Ltalonnage est effectu avec une analyse par
niveau.
Ltalonnage devant tre effectu chaque srie du plan de validation, il sera effectu lors
des 3 sries de mesures pour les talons certifis ainsi que pour les algues.
4. Rsultats
La fonction dtalonnage est linaire. Les quantits extraites lors de chaque srie sont
calcules partir des fonctions linaires dtermines chaque talonnage.
Tableau 1 : Rsultats des talonnages obtenus lors de chaque srie du plan (Aire = a x [Chl a] + b
Les rsultats des essais de validation sont insrs dans le fichier Excel
(https://intranet.inra.fr/mission_qualite/acces_thematiques/formations_et_ecoles/ecole_des_te
chniques_validation_methodes/profil_d_exactitude). Le fichier gnre automatiquement les
tableaux de calcul
Le profil dexactitude de cette tape analytique (figure 1) nous indique que la mthode est
juste et rptable dans le domaine de 0,4 8,0 g Chl a. Les incertitudes relatives sont de
lordre de 10 % et les limites de tolrance sont comprises dans les limites dacceptabilit
jusqu la valeur basse de 0,4 g Chl a.
Les profils dexactitude partir des cultures dalgues ne renseignent pas sur la justesse de la
mthode. La valeur cible correspond la moyenne des mesures. Ces profils indiquent la
variabilit de la mthode dans son ensemble : lextraction et lanalyse HPLC-DAD.
Les figures 2 et 3 reprsentent ces profils.
Ces profils sont diffrents selon la culture dalgues. Lhomognit des pigments dans les
algues et les solutions ne sont donc pas les mmes selon les cultures dalgues. La variabilit
est acceptable de 1,8 g Chl a 12 g Chl a pour la culture de diatomes et de 0,5 g Chl a
4,1 g Chl a pour la culture de cyanobactries.
Conclusion
Ltape danalyse HPLC-DAD est valide selon les exigences spcifies : la justesse de la
mthode est valide dans le domaine de 0,4 8,0 gChl a.
Les rsultats des essais de la mthode globale extraction HPLC-DAD indique une
variabilit diffrente selon les algues en prsence.
En prenant en considration ces rsultats, la mthode est valide selon les exigences
spcifies dans le domaine de 4,1 g Chl a 8 g Chl a, soit avec des volumes filtrs
de 50 ml 5 l de 0,8 160 g Chl a/l. Le domaine valid correspond aux besoins
usuels. 75 % des rsultats indiqueront des valeurs autours de 25 % de la valeur vraie.
tant donn limportance de la variabilit due au prlvement et aux classes dalgues en
prsence, il est conseill dapporter un soin particulier lchantillonnage sur le terrain, en
effectuant par exemple plusieurs chantillons pooler.
Une carte de contrle partir de solutions de chlorophylle a certifies, est effectue afin de
garantir la stabilit de la mthode valide.
Loutil profil dexactitude a facilit cette validation et a permis de confronter les exigences
des demandeurs danalyses avec les possibilits du laboratoire.
Bibliographie
Barroin G. (2004) Phosphore, azote, carbone Du facteur limitant au facteur de matrise.
Courrier Env. INRA, 52, 23-30.
DCE, Directive Cadre Eau (2000) Directive 2000/60/CE JO CE L 327/1 du 22.12.2000, p. 72
Feinberg Max (2010b) Mise en uvre du profil dexactitude in Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 27-44
Lazzarotto J., Rapin F. (2008) volution physico-chimique des eaux du Lman. Rapports sur
les tudes et recherches entreprises dans le bassin lmanique. Programme quinquennal
2006-2010. Campagne 2007, p. 31-55
SEQ-Eau (1999) Systme d'valuation de la qualit des cours d'eau, rapport de prsentation
SEQ-Eau. Agences de l'eau, les tudes des agences de l'eau n 64 - 59p.
Vollenweider, R.A., and Kerekes, J. (1982) Eutrophication of waters. Monitoring, assessment
and control. OECD Cooperative programme on monitoring of inland waters
(Eutrophication control), Environment Directorate, OECD, Paris. P. 154
Jrme Lazzarotto1
Rsum : Le titre alcalimtrique complet (TAC) dune eau est la mesure du pouvoir alcalin
de la solution. Le TAC est principalement expliqu par le pH et la concentration en ions
carbonate. Cette titration est effectue de manire automatise lunit mixte de recherche
CARRTEL de lInra de Thonon-les-Bains
Cette mthode a t valide avec un profil dexactitude afin de comparer les besoins des
tudes utilisant cette mesure avec ses caractristiques.
Cet article dcrit le plan dexprience choisi pour cette validation ainsi que les rsultats.
Introduction
1
UMR0042 CARRTEL Centre alpin de recherche sur les rseaux trophiques des cosystmes mimniques
INRA - F-74200 Thonon-les-bains 04 50 26 78 21 lazzarotto@thonon.inra.fr
2. Matriel et mthode
La mesure de lalcalinit complte est une titration acide-base. Au laboratoire de lunit
CARRTEL, la mthode utilise est une titration automatique avec mesure du point final
dtermin laide de la drive seconde du pH en fonction du volume dacide. Cette mthode
est inspire de la norme NF T90-036 qui utilise une titration manuelle avec indicateur color.
Le pH est mesur avec une lectrode de verre connecte au titrateur. Le titrateur utilis est un
Metrohm Basic Titrino 794 avec un passeur dchantillons 730.
La prise dessai est de 100 ml. La burette a un volume de 20 ml de HCl 0.1 mol/l. Le TAC
est calcul par quivalence de la quantit dacide ayant ragi avec lensemble des espces
alcalines de la solution.
La quantit mesure est la quantit despces alcalines prsentes dans leau analyser. Cette
quantit est ramene au volume de la prise dessai. Le rsultat est exprim en mq/l.
Le domaine de validation
Les eaux douces des cosystmes que nous tudions ont un TAC qui varie entre 1 et 5 mq/l.
Le volume de la burette permet datteindre des valeurs de 20 mq/l.
Afin que le domaine dutilisation soit compris dans le domaine de validation, nous
choisissons un domaine de 0,5 10,0 mq/l.
tant donn que le volume de la prise dessai est important (100 ml) et quun plan
dexprience minimal ncessitera au minimum 27 mesures (avec 3 rplicats 3 niveaux
pendant 3 jours), le volume minimal dtalon utilis serait de 2,7 l. Le cot de cette validation
serait donc trop lev si nous utilisons des solutions de rfrence certifies, par rapport
lutilisation de la mesure.
Nous choisissons donc de raliser des solutions talons base de carbonate de sodium et
dhydrognocarbonate de sodium.
Les chantillons de validation seront donc prpars partir de poudres sches puis peses sur
des balances vrifies, ensuite dissoutes dans des fioles de classe A vrifies.
tant donn que la mthode est automatise et que le domaine est grand, nous choisissons 5
niveaux de TAC dans le domaine de validation. Les 5 niveaux choisis sont : 0,5 ; 1,0 ; .5 ; 5.0
et 10,0 mq/l. Afin dvaluer la rptabilit et la fidlit intermdiaire de cette tape, nous
avons ralis pour chacun de ces niveaux 3 rplicats et cela pendant 5 jours, soit 15 mesures
par niveaux, soit 75 mesures au total.
3.5 Ltalonnage
La dtermination du TAC est une mthode directe qui ne ncessite pas dtalonnage.
4. Rsultats
Les rsultats des essais de validation sont insrs dans le fichier Excel
(https://intranet.inra.fr/mission_qualite/acces_thematiques/formations_et_ecoles/ecole_des_te
chniques_validation_methodes/profil_d_exactitude ). Le fichier gnre automatiquement les
tableaux de calcul et le profil dexactitude (figure 1).
120%
110%
Biais (%)
100%
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0
90%
80%
70% Niveaux
Le profil dexactitude de cette mthode indique que la mthode est valide par rapport aux
exigences pour lensemble du domaine de validation, de 0,5 10,0 mq/l. Le fichier du profil
dexactitude calcule lincertitude de la mthode pour chaque niveau en fonction de la fidlit
mesure. Lincertitude relative de cette mthode varie entre 4 et 2 %.
Conclusion
La mthode de dtermination du TAC a t valide dans le domaine de 0,5 10,0 mq/l avec
une limite dacceptabilit de 25 % et un intervalle de tolrance de 80 %.
Bibliographie
AFNOR (1996) Norme NF T90-036 / NF EN ISO 9963-1 : Dtermination de lalcalinit. Qualit
de leau, T2 :115-125
Feinberg Max (2010b) Mise en uvre du profil dexactitude in Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 27-44
Feinberg M. (2010c) Interprtation du profil dexactitude in Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 45-59
Lazzarotto J., Rapin F. (2008) volution physico-chimique des eaux du Lman. Rapports sur
les tudes et recherches entreprises dans le bassin lmanique. Programme quinquennal
2006-2010. Campagne 2007, 31-55
SEQ-Eau (2003) Systme d'valuation de la qualit des cours d'eau, rapport de prsentation
SEQ-Eau. Agences de l'eau, les tudes des agences de l'eau n 64, p. 59
Rsum : Afin de rpondre aux besoins des chercheurs ainsi quaux exigences de la norme
ISO 17025, lInra, le LAS, unit de service accrdite par le COFRAC (comit franais
daccrditation), a dvelopp une mthode originale destimation des incertitudes de
mesures. Cette mthode, base sur le traitement des donnes issues de cartes de contrle et de
rsultats dessais sur des sols dun circuit dessais daptitude, permet dtablir une relation
simple entre un rsultat (concentration en un lment) et lincertitude associe, pour
lensemble des analyses proposes.
Introduction
Le laboratoire danalyses des sols dArras (LAS) est une unit de services de lInra, accrdite
par le COFRAC. Au LAS, les critres de validation dune mthode danalyse sont choisis en
fonction des objectifs de la mthode, des besoins exprims par nos partenaires et des
exigences rglementaires auxquelles nous devons nous conformer. Parmi ces critres,
lincertitude des mesures occupe une place particulire non seulement pour son intrt
scientifique mais aussi pour la difficult lestimer de faon rapide, conomique et
compatible avec le nombre dchantillons et de donnes traiter.
Lincertitude des mesures est le reflet de leur variabilit. Les sources de variabilit sont
diverses (Feinberg et Laurentie, 2006) et notamment : la prparation des chantillons
(conditions ambiantes, ractifs), la mthode de mesure (talonnage, instrument) et
lexprience de loprateur ainsi que la nature mme de lchantillon et de lanalyte considr.
Lincertitude totale (It) est donc propre un laboratoire, une matrice et un niveau de
concentration. Son calcul repose sur la rptition des analyses au sein dune mme srie mais
aussi sur la rptition des sries.
Le LAS traite plus de 25 000 chantillons de sols par an, correspondant
environ 200 000 analyses par an. Dans ces conditions, on comprendra aisment quil nest pas
envisageable destimer exprimentalement les incertitudes de mesure par des rptitions
systmatiques ncessitant du temps, une quantit dchantillons importante et pour un cot
non ngligeable. Lidal serait de disposer dun modle mathmatique simple reliant
lincertitude la mesure. Mais ce modle nexiste pas dans la littrature. Cest pourquoi nous
avons dvelopp une stratgie dvaluation des incertitudes de mesure avec pour objectif de
dfinir une relation entre la concentration en analyte et lincertitude associe. Afin dillustrer
cette dmarche, nous exposons les rsultats obtenus pour le dosage du Cadmium total dans les
sols, dos aprs minralisation totale par de lacide fluorhydrique (suivant la norme NF X 31-147).
1
US0010 LAS - Laboratoire danalyses des sols, INRA -F- 62000 ARRAS www.lille.inra.fr/las
03 21 21 86 38 Annie.Guerin@arras.inra.fr
1. Principe et mthode
Ainsi, daprs les relations (1) et (2), pour estimer lincertitude totale il nous faut valuer les
carts types intra et inter sries correspondants.
Lapproche originale dveloppe au LAS consiste estimer dune part sintra en fonction de la
concentration de lanalyste et dautre part sinter en fonction de sintra. Elle est base sur les
rsultats dessais de rptitions sur une population de sols dun circuit dessais daptitude
judicieusement choisis ainsi que sur ltude de nos cartes de contrle.
Trois hypothses sont avances pour justifier cette dmarche. Dune part, on considre que la
meilleure estimation disponible des influences respectives des facteurs de rptabilit et de
fidlit intermdiaire exprime par r = sinter / sintra est issue des cartes de contrle du LAS.
Dautre part, ayant observ sur nos cartes de contrle que le rapport r est stable pour des
analyses de mme nature (ensemble des teneurs totales en lments en traces dans les sols par
exemple), on considre quil peut tre gnralis lensemble des chantillons et divers
niveaux de concentration.
Enfin, les ventuels carts en justesse ne sont pas quantifis et sont considrs comme non
significatifs, dans la mesure o les rsultats fournis pour des essais daptitude sinscrivent
dans les fourchettes de tolrance des circuits correspondants.
puis des relations linaires de type sintra = a C + b (3) ont t recherches pour chaque
paramtre dtermin (a et b tant respectivement la pente et lordonne lorigine de la droite
de rgression linaire).
2. Rsultats
Afin dallger la prsentation des rsultats, seuls quelques exemples reprsentatifs sont
exposs ci-aprs et plus particulirement celui du dosage de la teneur en cadmium total dans
les sols. La figure 1 montre la bonne relation obtenue entre les carts types intra-srie sintra et
les teneurs en Cd des 20 sols de circuit dessais daptitude tudis. Ainsi, pour Cd,
sintra=0.026C-0.001. Le coefficient a (pente de la droite) est troitement li au coefficient de
variation des mesures (CV) : une relation satisfaisante entre C et sintra est le reflet dun CV
relativement constant sur lensemble de la gamme de concentration tudie. De fait, lorsque la
relation obtenue nest pas satisfaisante, a est calcul partir du CV moyen obtenu pour
lensemble des 17 sols (a = CVm/100) et b (ordonne lorigine) est fix comme tant gal au
plus faible sintra de la srie. Il est galement possible davoir a = 0; dans ce cas lincertitude est
indpendante de la concentration, comme constat pour le pHeau (figure 2). La valeur de b
est alors fixe comme tant gale au sintra de lchantillon de contrle interne du LAS.
La figure 3 reprsente la relation entre les sinter et les sintra de lchantillon de contrle interne
du LAS issus des cartes de contrle de Cd, Cr, Cu, Co, Mo, Ni, Pb, Tl et Zn (doss aprs
minralisation totale suivant la norme Afnor NF X 31-147). Pour lensemble de ces lments,
nous considrons donc que sinter = 0.95 sintra, do K 1.
Au final, si nous reprenons comme exemple le cas de Cd total, quen est-il de lestimation de
lincertitude des mesures ?
Nous avons dfini que :
sintra = 0.026 C - 0.001 (figure 1)
sinter = 1 sintra (figure 3)
avec a = 0.026, b = -0.001 et K = 1
do, si lon reprend les relations (5) et (6) :
a = k 0.026 21/2 = k 0.037
b = k (-0.001) 21/2 = k (-0.001)
Avec k = 3, nous obtenons :
It = 0.11 C + 0.004
Ainsi, partir de cette formule, il nous est possible destimer lincertitude de mesure de la
concentration C en cadmium total dans les sols.
Figure 1 : relation entre la concentration en Cd total dans les sols et lcart type intra srie
Figure 2 : relation entre le pHeau des sols et lcart type intra srie.
Figure 3 : relation entre sintra et sinter de lments en traces (Cd, Cr, Co, Cu, Mo, Ni, Pb, Tl et
Zn) dans les minralisats HF de lchantillon de contrle interne du LAS.
3. Conclusion
A partir de ltude de 20 sols de nature varie, issus dun circuit dessais daptitude et en
exploitant les donnes de ses cartes de contrle internes, le LAS a dfini une mthode propre
destimation des incertitudes de mesure dune partie des dterminations quil propose. Afin de
couvrir lensemble des dterminations du catalogue du LAS, des tudes similaires ont t
ralises avec dautres sols de circuits inter-laboratoires ainsi quavec des boues. De fait, les
coefficients a et b utiliss pour estimer lincertitude des mesures sont disponibles et fournis
sur demande auprs du LAS.
Bibliographie
Rsum : La validation dune mthode danalyse passe par diffrentes tapes qui visent :
(i) tester la normalit de la distribution des mesures ; (ii) estimer les composantes de
lincertitude de mesure, fidlit, justesse, spcificit ; (iii) dfinir des tests de contrle de la
non dgradation des performances de la mthode. Aprs un rappel des dfinitions et des
concepts mtrologiques, cet article prsente les diffrentes tapes qui permettent de valider
une mthode d'analyse. La mthode consiste en la construction dun modle statistique, dun
plan dexprience et lutilisation dun matriau de rfrence certifi (MRC), utilis (i) pour
valuer le biais (ou erreur systmatique ), (ii) pour calculer lincertitude compose ,
somme de lincertitude sur la moyenne ( erreur alatoire ) et de lincertitude sur la valeur
exacte du MRC et (iii) pour construire les cartes de contrle. Cette mthode est applique au
dosage des anions contenus en solution aqueuse par chromatographie ionique, et le modle
choisi est linaire. Les rsultats montrent : (i) que les distributions ne sont pas
significativement diffrentes de la loi normale ; (ii) quil existe gnralement un biais
significativement diffrent de zro et quil faut corriger ; (iii) quil n'existe aucune liaison
entre le biais et la concentration de lanalyte ; (iv) que lintervalle de confiance peut tre
calcul par application de la loi de Student avec lincertitude compose. La reprsentation
graphique suivant la mthode du profil dexactitude aide visualiser les performances de
la mthode pour chacun des analytes. La mthode des ajouts doss permet de vrifier la
spcificit de la mthode et dtablir le pourcentage de recouvrement. Les droites de
rgression obtenues permettent de corriger les concentrations brutes de lerreur
systmatique. Les cartes de contrle permettent de dceler la dgradation des performances
dans le temps et la stabilit des talonnages.
1
UR1119, Gochimie des sols et des eaux - INRA F-13545 Aix-en-Provence
04 42 90 85 42 monique.mayor@aix.inra.fr.
Introduction
Toute analyse chimique ncessite des procdures de mise au point de mthodes de dosage,
dtalonnage et de validation des rsultats. La dmarche Qualit a pour objectif d'assurer la
fiabilit et la traabilit des rsultats. Nous prsentons ici le protocole exprimental et les
mthodes statistiques utilises pour valider une mthode danalyse. La dmarche est
applique ici au dosage danions en solution par chromatographie ionique et peut tre tendue
sans difficults d'autres mthodes. Plus prcisment, lobjectif de cet article est dvaluer
statistiquement la validit de cette mthode de dosage dans le domaine de concentration de
10-5 10-3 M, et de dcrire les procdures dtalonnage multiparamtrique, de correction de
biais, de calcul d'incertitude par lutilisation dtalons certifis et la mthode d'ajouts doss.
Figure 1 : lchange ionique : (1) lanion dplace lluant ; (2) lluant dplace lanion
La chromatographie est une technique de sparation despces dans un mlange par partage
entre une phase mobile (gaz ou liquide) et une phase stationnaire (liquide ou solide). Chaque
solut inject dans la colonne est soumis deux effets antagonistes : lentranement par la
phase mobile dans laquelle il est soluble et la rtention par la phase stationnaire avec laquelle
il interagit. La sparation est possible grce aux diffrences daffinits de ces composs pour
les phases mobile et stationnaire. La phase stationnaire, la colonne, est un changeur dions
constitu de particules de rsine (figure 1).
Lappareil utilis est un chromatographe ionique Dionex hautes performances monocanal
modle DX 100 muni dun passeur diluteur Dionex modle AS50, le tout pilot par le logiciel
de gestion Chromlon CM-CHM-1-IC version 6.5.
Il est ncessaire avant de valider une mthode doptimiser les conditions danalyse, en faisant
varier le dbit, la temprature, en modifiant la nature ainsi que la concentration de lluant, en
optimisant le choix de la colonne. On peut ainsi minimiser le temps de lanalyse, fix par le
temps du dernier compos lu, tout en prservant une bonne rsolution pour que la mthode
reste spcifique, cest--dire quelle produise une rponse uniquement pour lanalyte dintrt.
La rsolution de la mthode est le pouvoir de sparation des composs, elle est quantifiable
par exemple par le rapport R = d/m, o d est la distance sparant les sommets des 2 pics, et m
la moyenne des largeurs la base des pics. Si on considre des pics rapprochs, par exemple
les pics du phosphate et du sulfate, il apparat quune rsolution R = 1,12 nest pas suffisante,
mais quavec une rsolution suprieure 2, les pics sont bien rsolus. La figure 3 montre la
diffrence entre une bonne rsolution et une rsolution incorrecte due la dgradation des
performances de la colonne avec le temps.
2.2 Mthodes
2.2.a Normalit
La normalit est teste en construisant la droite de Henry : si les points sont aligns sur la
droite, on ne peut pas infirmer lhypothse de normalit de la distribution.
partir dune mesure faite sur un blanc analytique, on calcule lcart type du signal. La limite
de dtection LOD correspond la concentration qui conduit un signal dont lintensit est
gale 3 fois celle de lcart type du blanc yd = yb +3 sb. La limite de quantification LOQ est
calcule en prenant comme valeur du signal 10 fois la valeur de lcart type du blanc yq = yb
+10 sb. (ACS, 1980).
Lincertitude de la mesure, qui caractrise la dispersion, est exprime sous la forme dun
cart-type s qui est la racine carre de la somme de lensemble des variances associes aux
sources derreur :
- le biais du rsultat ou erreur systmatique est la diffrence entre lesprance des rsultats
dessais et la valeur de rfrence accepte, et dpend de la mthode, de loprateur et de
linstrument. Lestimation de lerreur systmatique, cest--dire lincertitude systmatique,
est value en utilisant un talon certifi. On obtient alors un facteur de correction, quon
applique au rsultat de mesure. Mais comme ltalon certifi (MRC) nest connu quavec
une certaine incertitude, soit umrc, celle-ci doit tre compte dans lincertitude de mesure.
Cette incertitude est donne par lorganisme certificateur, sous la forme de lincertitude
largie, Umrc, telle que : U mrc = kmrcumrc . Sauf indication contraire, dment documente,
kmrc = 2 pour un niveau de confiance de 95 % (Taylor et Kuyatt, 1994) ;
Lintervalle de confiance au seuil (niveau de confiance 1-) dlimite la zone dans laquelle
se trouve probablement la moyenne de la population do est extrait lchantillon. On fixe le
risque acceptable pour cette affirmation. Lintervalle de confiance 95 % signifie que lon
accepte un risque de 5 % de se tromper en affirmant que la moyenne de la population est
comprise entre [moyenne - IC et moyenne + IC].
Si x est la grandeur recherche (exemple la concentration) et y la grandeur mesure (exemple
la hauteur du pic) et si ltalonnage linaire est donn par la droite de rgression de x par
rapport y, alors x = C1 y + C2, et lintervalle de confiance de la moyenne de n mesures est :
x k ( , v )uc , (3)
O x est la moyenne corrige de toutes les erreurs systmatiques identifies, k suit une loi de
Student degrs de libert, = n 1, est le niveau de confiance, gnralement = 0,05
pour P = 0,95, n est la taille de l'chantillon, et uc est lincertitude compose dfinie ci-dessus.
Le produit Uc = kuc est lincertitude largie.
2.2.f Spcificit
3. Protocole exprimental
Le protocole exprimental est prsent dans le tableau 1, et lensemble des tapes dans le
tableau 2.
Tableau 1 : protocole exprimental
- Pour apprcier la fidlit, nous utilisons le plan dtalonnage en faisant 9 rptitions des
solutions multilments prpares sans la matrice, 4 niveaux de concentrations, (0,1
mmol/l; 0,25 mmol/l ; 0,5 mmol/l et 1 mmol/l) ; les dosages sont raliss sur 3 jours avec
le mme oprateur. Lquation de la droite dtalonnage journalire est utilise pour
calculer les concentrations qui serviront pour le calcul de justesse. Le coefficient de
variation CV des aires est calcul pour les 7 analytes, ceci pour les diffrents niveaux de
concentration.
- que les CV dans des conditions de fidlit intermdiaire soient infrieurs une valeur de
tolrance, par exemple 10 % ;
- que la diffrence entre le rsultat obtenu et la valeur vraie inconnue de lchantillon soit
petite ou du moins infrieure une limite dacceptation : pour cela, les estimateurs de biais
et de variance obtenus grce des expriences effectues sur des chantillons connus nous
renseignent si la procdure va pouvoir quantifier avec une exactitude suffisante.
4. Rsultats et discussion
Les rsultats (histogramme et droite de Henry) montrent que lhypothse de normalit de la
distribution ne peut pas tre rejete.
4.1 La fidlit
Les rsultats complets pour la fidlit sont reports dans le tableau 3. Toutes les valeurs des
coefficients de variation sont infrieures 4 %. La valeur admise dans notre protocole est de 10 %.
Tableau 3 : rsultats du test de fidlit, aux quatre niveaux de concentration des solutions multilments.
Valeurs en aires de pics (S min)
F- Cl - NO2- Br - NO3- P-PO43- SO42
Solution multilment 0,10 mmol/l
Moyenne 0,547 0,688 0,526 0,655 0,658 0,502 1,324
cart type 0,015 0,017 0,018 0,013 0,021 0,019 0,034
Variance 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,001
CV 2,74 % 2,44 % 3,40 % 1,98 % 3,25 % 3,79 % 2,59 %
Solution multilment 0,25 mmol/l
Moyenne 1,439 1,883 1,416 1,730 1,661 1,324 3,463
cart type 0,032 0,038 0,027 0,032 0,028 0,026 0,066
Variance 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,004
CV 2,24% 2,02% 1,88% 1,83% 1,66% 1,99% 1,90%
Solution multilment 0,5 mmol/l
Moyenne 2,974 3,750 2,900 3,514 3,409 2,747 7,104
cart type 0,094 0,122 0,089 0,104 0,103 0,065 0,210
Variance 0,009 0,015 0,008 0,011 0,011 0,004 0,044
CV 3,17% 3,25% 3,09% 2,97% 3,03% 2,38% 2,95%
Solution multilment 1 mmol/l
Moyenne 6,167 8,184 6,168 7,682 7,369 5,815 15,358
cart type 0,155 0,165 0,105 0,147 0,140 0,126 0,338
Variance 0,024 0,027 0,011 0,022 0,020 0,016 0,114
CV 2,51% 2,02% 1,70% 1,91% 1,90% 2,17% 2,20%
4.2 La justesse
Les rsultats du test de justesse montrent (non prsents ici, donnes disponibles sur demande) que
le biais (estimation de lerreur systmatique) est significativement diffrent de zro, en gnral
positif, ce qui correspond une surestimation ; il est ngatif pour le chlorure et pour le fluorure et
pour ce dernier, le biais maximum est observ la concentration 0,1 et atteint - 6,2 %, ce qui est
considrable. On nobserve pas de variation ordonne du biais avec la concentration. Il faut donc
corriger les valeurs mesures de ce biais estim.
Une fois corriges de ce biais, les valeurs sont accompagnes dune incertitude compose obtenue
selon lquation ci-dessus (q. 2), qui permet de calculer lintervalle de confiance du rsultat. Ici, le
nombre de mesures effectues pour estimer la moyenne de la concentration dun chantillon
inconnu est de 5. Lintervalle de confiance est donc obtenu par application de lquation (3) avec n
= 5, k (0,95 ; 4) = 2,78 et uc lincertitude compose. Les rsultats obtenus montrent que les
moyennes journalires sont comprises dans les intervalles de confiance de la moyenne ainsi
calculs. Elles peuvent donc tre considres comme des estimations indpendantes de la mme
grandeur. Ceci veut dire que les performances instrumentales et que ltalonnage sont rests stables
pendant les 3 jours conscutifs des mesures. On peut en dduire galement le nombre de mesures
ncessaires pour obtenir un intervalle de confiance sur la moyenne donne, puisquon est dans les
conditions de validit de la loi normale.
a)
b)
Figure 4 : profil dexactitude du sulfate
a) avant correction du biais ; b) aprs correction du biais
Les valeurs obtenues par les pentes des droites de rgression sont diffrentes des valeurs
obtenues par la mthode du profil dexactitude, et plus loignes de 100 %. Ceci peut tre
attribu au fait que la mthode du profil dexactitude a t applique des solutions
multilments en solution pure, tandis que la mthode des ajouts doss intgre leffet de
matrice sur un chantillon naturel reprsentatif du milieu gochimique tudi. On peut
considrer que la mthode du profil dexactitude (figures 4 10) permet de visualiser lordre
de grandeur des biais des mthodes, mais quil vaut mieux utiliser les droites de rgression
obtenues (figure 11) pour corriger les concentrations brutes, car ces droites tiennent compte
de leffet de matrice.
Dans ces conditions, le rsultat danalyse est simultanment corrig des effets de matrice et
du biais suivant la relation :
x = (C1 y + C2 ) / C3 k ( , v)uc , (4)
LOD < y < LOQ : lanalyte est dtect, mais non quantifiable ;
Les LOD sont toutes de lordre de 15 20 mol/l, sauf celle du sulfate, qui est deux fois plus
faible. Ceci est d la pente plus grande de la droite dtalonnage, qui traduit une sensibilit
plus grande, du fait que le sulfate est un ion bivalent. La chromatographie ionique semble
donc plus performante pour le dosage des sulfates, qui pose problme avec les mthodes
traditionnelles comme la nphlomtrie aprs prcipitation du sulfate de baryum.
5. Tests de conformit
Les tests de conformit sont des tests permettant de vrifier que, pendant lanalyse, les
performances du systme restent compatibles avec le cahier des charges de la mthode.
La vrification permet de sassurer que les carts entre les valeurs indiques par un appareil
de mesure et les valeurs connues correspondantes dune grandeur mesure sont tous infrieurs
aux erreurs maximales tolres.
La carte de contrle est un enregistrement utilis pour contrler la stabilit dune mthode
dans le temps. On utilise comme talon de surveillance le Matriau de Rfrence Certifi
(MRC) qui a servi au contrle de la justesse. On ralise un nombre assez important de
mesures groupes en sries, les rsultats sont reports sur un graphique. Il est prfrable de
faire une moyenne sur une trentaine de rptitions au moins et dans ces conditions, les valeurs
du t de Student peuvent tre prises gales 2 et 3 respectivement.
5.2 Surveillance
La surveillance complte les oprations de vrification et dtalonnage afin de dtecter les
drives ventuelles de lquipement entre ces mesures.
Il sagit denregistrer les carts entre les valeurs dindication de lquipement de mesure et les
valeurs vraies du contrle certifi. Ces oprations de surveillance sont consignes sur des
enregistrements tels que la carte de contrle. A chaque nouvelle analyse, le rsultat du
contrle est ajout, ce qui permet de vrifier sil est bien lintrieur des limites admises, et
ainsi dentreprendre des actions correctives si ncessaire. Cela permet galement de contrler
au cours du temps que les valeurs exprimentales sont rparties dune faon alatoire par
rapport la moyenne et de nous alerter sur une ventuelle drive de lappareil (Tableau 7).
On fait correspondre sur cet enregistrement un point chacune des valeurs dune statistique
calcule sur des chantillons successifs ; chacun de ces points a pour abscisse le numro de
lchantillon et pour ordonne la valeur de la statistique calcule sur cet chantillon.
Le but de ces tests de surveillance est de nous alerter en cas danomalie. Reste dfinir quels
seront les critres utiliss pour considrer ce qui sera anormal. Nous dcidons dans notre cas
dtre vigilants lorsquune mesure sort des limites de contrle, ce qui dclenchera la rptition
du contrle pour confirmer ou infirmer la drive et nous alertera lorsque la rpartition des
mesures fait suspecter un comportement non alatoire. Un exemple de test de surveillance
donn par le logiciel Chromlon est report sur la figure 12. On peut constater que le
contrle ne sort pas des limites autorises.
brutes donnes par la courbe de rponse. Lincertitude compose est galement utilise pour
calculer les limites de lintervalle de confiance acceptables, par une mesure rgulire du
MRC, qui sert ainsi effectuer les tests de surveillance et alerter en cas de dgradation des
performances de la chane de mesure. Lchantillon doit bien sr dabord se situer au dessus
de la limite de quantification LOQ.
Matriel supplmentaire :
Lensemble des donnes et des tableaux peuvent tre fournis sur demande.
Bibliographie
ACS (1980) Guidelines for Data Acquisition and Data Quality Evaluation in Environmental
Chemistry, Analytical chemistry, 52, 14, 2242-2249
AFNOR (1994a) Norme franaise NF X 07-001 -Vocabulaire International des termes
fondamentaux et gnraux de mtrologie
AFNOR (1994b) Norme NF ISO 5725-1 : Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure. Partie 1 : Principes gnraux et dfinitions.
AFNOR (1994c) Norme NF ISO 5725-2 : Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure. Partie 2 : Mthodes de base pour la dtermination de la
rptabilit et de la reproductibilit dune mthode de mesure normalise.
AFNOR (1994d) Norme NF ISO 5725-4 : Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure. Partie 4 : Mthodes de base pour la dtermination de la justesse
dune mthode de mesure normalise.
AFNOR (1996) Mtrologie dans lentreprise : outil de la qualit.
AFNOR (1998) Norme NF ISO 5725-5 : Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure. Partie 5 : Mthodes alternatives pour la dtermination de la
fidlit dune mthode de mesure normalise.
AFNOR (1999) Norme XP T90-210 : Protocole dvaluation dune mthode alternative
danalyse physico-chimique quantitative par rapport une mthode de rfrence.
Feinberg M. (2000) La validation des mthodes danalyse. Le cahier des Techniques de
lInra, 44, 19-49.
Feinberg M. (2003) Lincertitude des mesures analytiques. Le cahier des Techniques de
lInra, 50, 3-10
Feinberg, M. (2006) Approche globale et harmonise de la validation. Spectra Analyse, 249,
avril-mai 2006, 16-23.
Feinberg M. (2010a) Principes et vocabulaire in Validation des mthodes danalyse
quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra, numro
spcial, 13-25
Feinberg M. (2010b) Mise en uvre du profil dexactitude in Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial, 27-44
Conclusion
Franois Jacquet1
1
Dlgu la qualit de lINRA - F- 75338 Paris cedex 03 francois.jacquet@paris.inra.fr
Pour la mise en uvre, vous pourrez aussi faire appel, via la liste de diffusion
validation-analytique-et-maitrise :
http://listes.inra.fr/wws/info/validation-analytique-et-maitrise 2
et, aux experts et praticiens de la validation des mthodes, que je remercie de
poursuivre ainsi leur implication dans la diffusion de ces mthodes, et de
contribuer lamlioration de la garantie de la fiabilit des rsultats sur lesquels
nombre de publications se fondent.
2
Pour sy abonner, contacter Christophe.Garin@paris.inra.fr
Bourdat-Deschamps Marjolaine 85
Bourri Guilhem 117,
Ciesielki Henri 111
Durand Denys 73
Feinberg Max 5, 13, 27, 45
Guerin Annie 111
Laurentie Michel 61
Lazzarotto Jrme 99, 107
Maherou Jennifer 99
Mayor Monique 117
Ortigues-Marty Isabelle 73
page
3
Introduction
5 Tmoignages de directeurs dunit sur les coles techniques
Conclusion
Anne 2010
Sommaire
Introduction p. 03
Conclusion p. 135
Participation de la Dlgation la qualit et des dpartement s : AlimH, Cpia, EA, Phase , SA et SPE Responsables scientifiques :
Max Feinberg et Michel Laurentie Comit ditorial : Christophe Garin, Annie Gurin, Marie Huyez-Levrat, Franois Jacquet,
Directeur de la Publication : Jean-Franois Quillien , Responsable du Cahier des Techniques de lInra : Marie Huyez-Levrat
Photos Inra - Impression : Jouve 18, rue saint Denis 75001 Paris - N ISSN 0762 7939
https://intranet.inra.fr/cahier_des_techniques