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Validation des mthodes

danalyse quantitative
par le profil dexactitude

Dlgation au Partenariat avec les Entreprises


Institut national de la recherche agronomique - 147 rue de lUniversit - F-75338 Paris Cedex 07
Validation des mthodes danalyse quantitative
par le profil dexactitude

Numro spcial 2010

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Collectif

Responsables scientifiques : Max Feinberg2 et Michel Laurentie3


Annimatrice : Annie Guerin4 - Coordonnatrice : Marie Huyez-Levrat5

Sommaire

Introduction p. 03

Tmoignages sur les coles techniques p. 05

Chapitre I : Validation des mthodes p. 11

Chapitre II : Application dans les laboratoires lInra p. 71

Conclusion p. 135

Index des auteurs p. 137

Index des articles p. 139

Cet ouvrage est tlchargeable partir du site de lInra

https://intranet.inra.fr/cahier_des_techniques

1
Le Cahier des Techniques de lInra est une publication destine changer des mthodes et
des savoir-faire. Ce n'est pas une revue Comit de lecture. Les auteurs sont seuls
responsables de leurs textes.
2
UR1204 Met@risk - Mthodologie danalyse de risque alimentaire)- INRA F- 75231 Paris cedex 05.
01 44 08 16 52 max.feinberg@paris.inra.fr
3
Unit de Pharmacocintique-Pharmacodynamie - AFSSA F-35302 Fougres cedex, m.laurentie@afssa.fr
4
US0010 LAS, INRA F- 62000 Arras www.lille.inra.fr/las
5
UAR1185- Dlgation au partenariat avec les entreprises DV/DPE - INRA - F-75338 Paris Cedex 07
01 42 75 91 65 marie.huyez@paris.inra.fr
Le Cahier des Techniques de lInra
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Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Introduction

Max Feinberg

Pour celle ou celui qui a entre les mains ce numro spcial du Cahier des
Techniques de lInra, deux questions peuvent se poser :

- Pourquoi devrais-je valider les mthodes danalyse que jutilise ?


- Si je me dcide, comment dois-je my prendre ?

Rponse la question : Pourquoi valider ?

Depuis toujours les analystes valident leurs mthodes en effectuant des


sries de mesures plus ou moins bien organises pour essayer de dmontrer
quelles conviennent leurs objectifs. Bien sr, celles et ceux qui sont dans des
laboratoires accrdits savent que cest insuffisant et quune validation doit tre
conduite selon une procdure exprimentale plus stricte o on parle de justesse,
de reproductibilit, etc. La validation est devenue un lment majeur pour la
dmonstration de la comptence de ces laboratoires accrdits.

Numro spcial 2010


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Cela signifie-t-il que lorsquon nest pas accrdit, on na pas se plier cette
dmarche ? Si la rponse pouvait tre un oui timide il y a encore deux ou
trois ans, ce nest plus le cas aujourdhui. Dune part, la notion de qualit a
gagn tous les niveaux de lactivit technique et scientifique. Ainsi, les
industriels avec lesquels les units INRA peuvent tre amenes collaborer ont
des systmes dassurance qualit qui, par ricochet, les obligent ne travailler
quavec des contractants qui ont eux-mmes un systme qualit. Dautre part,
les divers exemples prsents dans ce numro illustrent bien les raisons pour
lesquelles nombre de nos collgues ont t amens valider de faon formalise
leurs mthodes.
Lapproche propose sappelle le profil dexactitude . Cest une approche
relativement nouvelle qui, cependant, est dj standardise dans la norme
Afnor NF V03-110 qui vient dtre publie. Elle a lavantage de proposer une
mthode dinterprtation graphique trs simple et visuelle qui ne sembarrasse
pas de tests statistiques toujours dlicats dcrypter. Son objectif est de servir
les analystes plutt que de les transformer en statisticiens Elle est universelle
et sapplique toutes les mthodes de mesure, comme le prouve une littrature
maintenant abondante.

Rponse la question : Comment dmarrer ?

Pour dmarrer, vous avez toute une srie de possibilits :


tlcharger et lire les documents disponibles sur lIntranet de la Dlgation
la qualit :
https://intranet.inra.fr/mission_qualite/acces_thematiques/formations_et_ecol
es/ecole_des_techniques_validation_methodes_2008 sous le lien Le recueil
des prsentations de l'cole 2008 (vous devez avoir un login LDAP pour y
accder) ;
pour faire les calculs, tlcharger des fichiers modles Excel (qui marchent
aussi sous Open Office) partir de :
http://www.paris.inra.fr/metarisk/downloads/software_programs/excel_templ
ates ;
vous renseigner auprs de nos collgues qui ont dj utilis les profils
dexactitude et dont vous avez les adresses lectroniques ;
interroger la Dlgation la qualit, comme lindique dans son article
Franois Jacquet, le dlgu la qualit de lInra.

Notre but est de vous convaincre que cest beaucoup plus simple quon ne veut
le faire croire . Merci de nous aider atteindre cet objectif.

Le Cahier des Techniques de lInra


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Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Tmoignages sur les coles techniques

de validation des mthodes danalyse

Max Feinberg1

deux reprises, le service de la Formation permanente nationale (FPN) de


lInra, sous limpulsion de Marie-Andre Pidallu, a organis une cole des
techniques sur la validation des mthodes danalyses quantitatives. La premi-
re a eu lieu du 3 au 5 dcembre 2007 prs de Strasbourg et la seconde
du 10 au 13 Juin 2008 Batz-sur-Mer. En ces deux occasions, lassistance a t
nombreuse, jusqu 60 participants, et assidue. De plus, le taux de satisfac-
tion des participants a t trs satisfaisant pour les confrenciers ! Ce qui les
a amens prparer ce numro spcial du Cahier des techniques de lInra pour
que celles et ceux qui nont pas pu participer puissent se faire une opinion sur
cette question fondamentale pour lInra quest la validation des mthodes
danalyse.

En outre, il nous a sembl intressant dillustrer, de faon moins aride quun ta-
bleau chiffr2, ce que jai appel le taux de satisfaction des participants et les
bnfices quils ont pu retirer de ces deux coles. Vous trouverez donc ci-aprs
une compilation de tmoignages classs selon le numro dunit, manant des

1. UR1204 Met@risk - Mthodologie danalyse de risque alimentaire INRA - F-75231 Paris cedex 05.
01 44 08 16 52 max.feinberg@paris.inra.fr

2 Cependant, le lecteur intress peut retrouver ces statistiques pour lcole de 2008 en tlchargeant le fichier
https://intranet.inra.fr/mission_qualite/content/download/3881/36715/version/1/file/Synth%E8se+%E9val
uation+ETVM+physicochimiques+2008.pdf

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personnes qui ont accept de faire part de leurs impressions. Je voudrais les en
remercier car il est toujours un peu difficile de savoir si une formation a servi
quelque chose. De plus, elles mvitent davoir dcliner une liste darguments
en faveur de la validation des mthodes ; tout y est, travers la diversit des
exemples pratiques qui y sont dcrits et des commentaires effectus.
De fait, sil fallait trouver une autre preuve de satisfaction, plusieurs tudes de
validation ont t ralises (et russies) lissue de ces deux coles. Certaines
font lobjet darticles dans ce numro spcial, dautres ont t soumises des
revues internationales en vue dune publication, enfin quelques-unes dont jai pu
tre inform ne sont pas publies mais rendent dj des services dans les units.

Rappelons que lensemble des prsentations et fichiers modles Excel sont sur
le site :

https://intranet.inra.fr/mission_qualite/acces_thematiques/formations_et_ecoles/ecole_des_tec
hniques_validation_methodes_2008/recueil_presentations_edt_validation_methodes_2008

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Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

UR 50 - LBE - Laboratoire de biotechnologie de l'environnement INRA


F-11100 Narbonne
Voici la rponse groupe que nous souhaitons faire au nom du LBE Narbonne... Sans affi-
cher de nom prcis car la dmarche qualit telle que nous l'entendons s'inscrit dans notre col-
lectif. Nous partageons cette vision et nous aimerions la renforcer l'avenir (d'o la demande
ci dessous) sans pour autant pnaliser nos forces vives lies la recherche, l'innovation et le
fourmillement d'ides et de concepts qui ne sont pas forcement formaliss dans des proc-
dures tablies et valides... Courant 2008, une personne du laboratoire a suivi cette formation,
son avis est le suivant :
Cette formation est de bon niveau et donne de faon simple et
claire les outils et la mthodologie mettre en place pour conduire
la validation de mthodes .
Cela la motive mettre en place ces outils et cette mthodologie sur les instruments de me-
sure dont elle a la charge, faire partager les connaissances acquises au cours dune prsenta-
tion synthtique et sensibiliser ses collgues cette pratique ncessaire pour la fiabilisation
des rsultats de recherche. Cette pratique est dailleurs applique dans lunit mais sans rel-
lement mettre derrire le vocabulaire adquat, le formalisme qualit et la systmatisation de
ces activits. Une demande a t formule quant la systmatisation de ces formations sur
site en local car tout comme la formation ddie aux incertitudes de mesure, nous devrions
tous et, tous corps confondus, nous sentir concerns et investis par la validation des mthodes
et la gestion des incertitudes de mesure, garantie de la fiabilit des rsultats de recherche.

UR 251 - PESSAC - Physico-chimie et cotoxicologie des sols d'agrosystmes


contamins INRA F-78000 Versailles
Christian Mougin, Directeur de lunit

Les activits de recherche sappuient sur linterprtation de rsultats exprimentaux. Il est


indispensable que les scientifiques bnficient de rsultats dignes de confiance, issus de me-
sures et danalyses qui doivent tre justes et fiables. Lexercice de validation des mthodes
physicochimiques danalyse quantitative relve donc des mmes proccupations que la mise
en place de lAQR (assurance qualit en recherche) dans les units. Il vise pour un collectif
sapproprier des concepts, des bases thoriques et des outils et mettre en place des modes de
pense et de fonctionnement communs et partags. Si la validation des mthodes me parat
profondment ancre dans certaines disciplines comme par exemple la chimie analytique et
concerne, mon sens, une population encore trop rduite, elle doit tre tendue toutes les
disciplines, mettant en uvre des mesures, dune unit de recherche. Ainsi, dans des units
fonctionnant sur la base de plateaux techniques disciplinaires, la validation est un moyen
dinteraction fort entre les agents, et de mise en place dune homognit de fonctionnement.
Par exemple, la communaut des biologistes devrait rapidement intgrer les bases thoriques
de la validation des mthodes, et effectuer la transition de mthodes optimises des mtho-
des valides, de lempirique au raisonn. La validation doit aussi permettre de dfinir le cadre
et les limites dutilisation des mthodes.
En conclusion, la matrise des mthodes relve de la valorisation des curs de mtiers des
ITA, avec des retombes pour lensemble des agents : en effet, les donnes une fois valides
sont ensuite destines rpondre aux questions scientifiques souleves par les chercheurs. Par
rapport nos activits, cest une indispensable source dchange et de partage, un outil
dorganisation des activits et une valorisation des mtiers

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UE 999 Unit exprimentale de Pech-Rouge- INRA- F-11430 Gruissan
Jean-Louis Escudier, Directeur de lunit

L'Inra dispose d'un unique rseau d'units exprimentales, lieux prennes d'observations de
multi donnes dans leurs contextes. En faire l'acquisition avec les mthodes adaptes, les va-
lider, les enregistrer, les conserver, les rendre accessibles durablement est un des socles de ce
que l'on construit pour demain. Ceux qui nous succderont dans ces units utiliseront certai-
nes de ces donnes pour des objets de recherche non connus ce jour. Nous avons pour eux
aussi un devoir de rigueur. La validation des mthodes est un pralable
L'unit exprimentale de Pech Rouge collecte les donnes disponibles depuis la cration du
domaine, en 1956, ce jour en termes de relevs mto, d'cophysiologie de la vigne, de qua-
lit du raisin et du vin. C'est un exercice difficile au niveau de l'accs aux donnes anciennes,
pour les saisir ds lors que les mthodes sont valides.

UMR 1091 EGC - Environnement et grandes cultures - INRA-


F-8850 Thiverval-Grignon
Enrique Barriuso, Directeur de lunit

Les moyens analytiques pour la quantification des contaminants organiques de l'environne-


ment (sols, eaux, air) sont de plus en plus performants. Leur automatisation et la simplifica-
tion des interfaces de contrle et de traitement permettent de concevoir l'acquisition de don-
nes des flux trs importants et avec des prcisions de plus en plus leves. C'est le cas, par
exemple, pour l'analyse chromatographique de pesticides au niveau des traces et d'ultra-traces.
Face cette ralit, des angoisses perptuelles des scientifiques se manifestent : Que valent
ces donnes ? Refltent-elles une ralit ? Pour des conditions exprimentales donnes, al-
lons-nous trouver les mmes rsultats ? Quelle est la contribution analytique la variabilit de
nos rptitions ? Comment allons-nous certifier la qualit de donnes ? C'est dans ce contexte
que la validation des mthodes vient rduire nos angoisses, introduisant de la rigueur dans
nos activits analytiques et apportant une dmarche permettant de prciser et de faire valoir
vis--vis de nos partenaires la pertinence de nos mthodes analytiques, mthodes dveloppes
ou adaptes de mthodes existantes, la qualit de nos donnes, leur justesse, leur reproductibi-
lit, etc.

UR1119 URGSE - Gochimie des sols et des eaux- INRA -F-13545 Aix-en-Provence
Fabienne Trolard, Directrice de lunit

Dans le domaine de la gochimie des sols et des eaux, nous sommes absolument convaincus
et depuis longtemps de la ncessit de mettre en place des mthodes robustes de validation de
mthodes analytiques. En effet, la difficult principale que nous rencontrons, en particulier
pour les analyses des eaux, est que nous ignorons les niveaux de concentrations des anions et
cations qui peuvent tre trs variables avec la saison. Seules des mesures justes et fidles
constituent des acquis analytiques fiables dans le temps et permettent de dvelopper des mo-
dles gochimiques. Grce ces deux de formation coles nous avons pu initier dans l'unit et
mener jusqu'au bout, la validation des mesures des anions dans les eaux par chromatographie
ionique. Ceci a conduit la rdaction d'un article par Monique Mayor et Guilhem Bourri.

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Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

UR 1213 -URH - Unit de recherche sur les Herbivores INRA-


F-63122 Saint-Gens-Champanelle
Jean-Franois Hocquette, Directeur de lunit

Lunit de Recherches sur les Herbivores, constitue le 1er janvier 1999, regroupe en 2009
174 agents dont 62 chercheurs et ingnieurs. Elle est organise en 8 quipes de recherche, une
quipe logistique, une installation exprimentale et dispose dun abattoir exprimental. De
plus, elle accueille chaque anne de 80 100 tudiants (dont 15 20 thsards et post-doc). La
mission de l'URH est de contribuer au dveloppement des systmes durables d'levage des
herbivores en accord avec les attentes socitales, c'est--dire conomique et dveloppement
rural, respect de l'environnement, qualit des produits et bien-tre animal. Dans ce contexte,
les activits de lURH sont majoritairement orientes vers la mesure des caractres qui dter-
minent les phnotypes des animaux, principalement les herbivores.
Afin d'atteindre les deux objectives prioritaires fiabilit des rsultats mesurables et tra-
abilit des travaux de recherche , le groupe qualit a identifi diffrentes actions mettre en
place qui ont permis en particulier de :
- Fiabiliser les rsultats grce la gestion des instruments de mesures et la mise en place
d'actions de mtrologie sur diffrents quipements tels que les balances, les pipettes, les
spectrophotomtres, les pH-mtres et le suivi des tempratures dans les enceintes climati-
ques.
- Harmoniser les pratiques lors de la mise en place des exprimentations animales par la
mise disposition de procdure et de trame-type de protocole exprimentaux.
- Prenniser les savoir-faire par la rdaction d'environ 400 modes opratoires dcrivant les
diffrentes mthodes d'analyses utilises.
Ce travail a permis l'unit d'atteindre environ 90% du niveau 1 du Rfrentiel INRA en
2008 (Auto-valuation 2008). Cependant, il nous est apparu important de complter ces ac-
tions par la validation de nos mthodes de laboratoires les plus stratgiques . En effet,
l'Unit dispose dune large gamme de mthodes analytiques (quantitatives, semi-quantitatives
et qualitatives) relevant de la chimie, de la biochimie, de la physiologie et de la biologie cellu-
laire et molculaire, ces mthodes originales n'tant pour la plupart que partiellement, voire
pas du tout, valides au sens qualit du terme (domaine de validit, linarit, spcificit,
fidlit). Cette tape devrait permettre d'apporter une aide au scientifique comme l'optimi-
sation des protocoles exprimentaux (nombre d'animaux utiliser, nombre de prlvement
raliser, mthodes utiliser en fonction des niveaux attendus). Cela participera consolider
l'obtention de rsultats fiables et interprtables en vue de leur valorisation lors des nombreu-
ses communications orales et publications scientifiques de lunit (environ 330 publications
annuelles dans le cas de lURH).
De plus, la mise en place de cette approche de validation de mthode devrait renforcer le dia-
logue entre le chercheur et l'analyste, notamment au moment de la validation d'une mthode
d'analyse pour s'assurer que les variables mesures correspondront bien l'utilisation faite
ultrieurement des rsultats obtenus. Plus gnralement, la validation des mthodes est un
levier daction important parmi dautres pour mieux prciser les caractres mesurs et ainsi
les dfinir. A ce titre, la dmarche engage va contribuer au projet ATO pour Animal Trait
Ontology (ou Ontologie des caractres des animaux) dont lobjectif majeur est la dfinition
des caractres phnotypiques des animaux. Les dfinitions et les mesures de ces caractres
doivent tre standardises pour tre comparables partout dans le monde et dune espce

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lautre. Le projet ATO a t lanc en 2009 par le dpartement Phase (Responsable : Pierre-
Yves Le Bail), en troite collaboration avec James Reecy de l'universit de l'Iowa.
Enfin, les caractristiques obtenues lors de la validation de nos mthodes d'analyse permet-
tront de renforcer la lisibilit de notre savoir faire et des prestations proposes auprs de nos
diffrents partenaires clients (environ 50 contrats en cours chaque anne) dans nos 4
grands secteurs d'activits : la Recherche et Dveloppement (ANR (14 projets ANR en cours
pour 2009) contrat Europen (9 Projets Europens en cours en 2009), industrie, instituts tech-
niques, centre de recherche franais ou tranger, ...), la formation (cole doctorale des Scien-
ces de la Vie et de la Sant de l'Universit d'Auvergne, l'ENITA de Clermont-Ferrand, ...) et
l'expertise (Agence Franaise de Scurit Sanitaire des Aliments, ...).

UR 1268 BIA - Biopolymres, interactions assemblages- INRA


F-44316 Nantes
Estelle Bonnin, ingnieur de recherche, quipe PVPP, Responsable Qualit de lunit
Cette formation s'applique en particulier aux mthodes utilises en routine et par diffrents
oprateurs (par exemple, chez nous la CPG ou les dosages d'activits enzymatiques). Cela ne
peut pas tre spar du niveau 1 de la Qualit INRA puisque cela fait partie intgrante de la
fiabilit des rsultats. Cela signifie que maintenant que ce type de formation est mis notre
disposition, l'tape de validation devrait tre systmatique lors de la mise en place d'une nou-
velle mthode, entre son dveloppement et son utilisation courante. Cela ncessite donc qu'un
nombre suffisant de personnes ait suivi cette formation.
Jean-Charles Gaudin, charg de recherche, quipe ALL
L'cole de validation des mthodes s'adresse surtout des gens dveloppant ou utilisant une
mthode de dosage. L'tape de validation est indispensable pour des gens ralisant des dosa-
ges de manire trs rptitive, devant en particulier garantir la validit du rsultat un tiers
(prestation de service). Elle est aussi particulirement intressante pour tout dveloppement
de mthode car elle va permettre de dterminer si la mthode choisie est apte donner un rsul-
tat avec lincertitude ncessaire ou demande (elle permet en outre de mettre l'accent sur les
tapes amliorer). A mon sens, cette formation devrait tre largement suivie par toute per-
sonne ralisant des dosages, particulirement si ces dosages son frquemment rpts. Je n'ai
pas encore eu l'opportunit de mettre en application ce que j'ai appris lors de la formation,
cependant elle m'a convaincu de la ncessit de mettre en place une procdure de validation
pour toute nouvelle mthode utilise ou dveloppe des fins de quantification.
Lucie Ribourg, technicien de la recherche, quipe ISD
Effectivement, j'ai suivi cette formation en juin l'anne dernire. Je suis contente d'y avoir
particip ; j'y ai appris ou revu beaucoup de choses. En tout cas, a met l'accent sur des erreurs
que l'on commet souvent et a rappelle l'importance de la dmarche qualit de l'INRA. Cette
formation concerne un large public, du technicien au chercheur. C'est parfois un peu pouss
pour un technicien mais ceci dit trs intressant. J'ai fait une prsentation l'quipe en rentrant
sous forme de PowerPoint et j'ai appliqu la validation une mthode au laboratoire bien
que a ne soit pas aussi simple que sur le papier.

Le Cahier des Techniques de lInra 10


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Chapitre I

Validation des mthodes

La validation des mthodes est un problme rcurrent dans les laboratoires. Ce


chapitre, compos de quatre articles complmentaires, a pour but de fournir un
guide dtaill permettant de conduire la validation dune mthode quantitative
danalyse.

Larticle 1 explique les objectifs et principes fondamentaux de la validation en


prsentant les principes de lassurance qualit dans les laboratoires.
Larticle 2 dcrit en dtail une procdure innovante appele le profil
dexactitude.
Larticle 3 fournit quelques complments, comme lapplication numrique ou le
calcul de la limite de quantification.
Larticle 4 traite de la pondration et de la transformation des donnes qui sont
des outils ncessaires leur exploitation statistique.

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Validation des mthodes

Le Cahier des Techniques de lInra 12


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Principes et vocabulaire pour la validation des mthodes

Max Feinberg1

Rsum : La validation des mthodes est un problme rcurrent dans les laboratoires. Cet
article a pour but dexpliquer les objectifs et principes fondamentaux de la validation en
prsentant les principes de lassurance qualit dans les laboratoires.

Mots-cls : Validation, profil dexactitude, justesse, fidlit, incertitude, mthodes danalyse


quantitative

1. Place de la validation dans la qualit


1.1. Assurance qualit au laboratoire
Parmi les diverses proccupations des analystes, la place prise par la validation des mthodes,
doit tre mise en relation avec le dveloppement de lassurance qualit dans les laboratoires.
Les principes de lassurance qualit sont lobjet dune srie de normes publies par
lInternational Standardisation Organisation (ISO), comme la srie des normes ISO 9000. Sy
trouvent dfinies la qualit et toutes les oprations qui y concourent. Mme si ces normes ne
sont pas, en gnral, applicables en ltat aux activits des laboratoires, leur lecture nest pas
inutile. Elles insistent sur le fait que la qualit des produits ou des services doit tre conue en
vue de satisfaire les besoins dun client. Souvent on rsume les objectifs de la qualit dun
produit ou dun service sous la forme dune liste comme celle-ci :
rpondre un besoin, un usage ou un objectif bien dfini ;
satisfaire les attentes des consommateurs ;
tre conforme aux normes, spcifications, exigences rglementaires et autres ;
avoir un prix comptitif ;
tre fourni un cot qui gnre un profit.
Par ailleurs, pour remplir son rle, un systme dassurance de la qualit doit prsenter trois
caractristiques :
tre conu pour le but quon lui assigne ;
tre correctement mis en uvre ;
tre effectivement contrl.
Tous ces principes peuvent sembler bien abstraits mais en les appliquant lactivit dun
laboratoire danalyse, lassurance de la qualit est tout ce qui peut individuellement ou
collectivement influencer le rsultat dune analyse.
Afin de prendre en compte la spcificit des activits de laboratoire et la diversit de leurs
domaines dapplication, il existe au moins quatre rfrentiels principaux qui expliquent
comment organiser lassurance de la qualit au laboratoire :
les Bonnes pratiques de laboratoire (BPL) sappliquent ltude et au dveloppement

1. UR1204 Met@risk - Mthodologie danalyse de risque alimentaire - INRA F- 75231 Paris cedex 05.
01 44 08 16 52 max.feinberg@paris.inra.fr

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Validation des mthodes

de molcules chimiques, mdicaments, des pesticides et, en gnral, ltude de toute


substance nouvelle ;
le Guide de bonne excution des analyses (GBEA) prcise comment doit fonctionner
le systme dassurance de la qualit dun laboratoire danalyse de biologie mdicale ;
laccrditation, qui suit les principes de la norme ISO 17025 et permet dassurer la
comptence dun laboratoire qui applique un ensemble de recommandations
NF EN ISO/CEI 17025:2005, (NF X 50-061) ;
la certification de service sappuie sur les normes ISO 9000 et sapplique une
entreprise dans son ensemble et, ventuellement, au laboratoire qui sy rattache.
Dans les annes 1970, mettre en place lassurance qualit dans un laboratoire, ctait surtout
mieux prvoir son organisation afin damliorer la transparence de son fonctionnement. La
validation se concevait alors surtout pour les mthodes normalises qui servaient aux
changes commerciaux : ctait le rle de la norme ISO 5725 de fixer ces critres dinter-
comparaison. Ensuite, les normes sur lassurance qualit se sont diversifies mais nont pas
chang beaucoup dans leurs principes. Les textes qui dfinissaient des procdures de
validation interne ne sont apparus que vers la fin des annes 1990. La question de savoir
comment seront interprts les rsultats danalyse par les demandeurs ne sest vraiment pose
que vers 2005. Lintroduction de lincertitude et le dveloppement de lapproche critres sont
lis cet objectif. On peut considrer quil sagit de mieux prendre en compte les besoins des
utilisateurs ; ce qui semble logique si on se rfre la dfinition de la qualit.
De nombreux guides, recommandations et guidances plus ou moins officiels ont t publis
par des structures rglementaires, des organismes de normalisation ou des groupes dexperts.
On trouvera en section 4 une liste de rfrences pour ces normes et guides. Ces documents
sont souvent disponibles sur Internet et peuvent tre tlchargs. On peut ainsi constater quils
se recopient largement les uns les autres. En outre, ils contiennent de nombreuses dfinitions
dont certaines sont reprises la section 2.
Ces guides permettent cependant de comprendre la philosophie gnrale qui a t adopte
jusqu prsent pour conduire une validation. Dans la plupart des cas, cela consiste en une
suite dtudes exprimentales qui permettent de calculer des critres de validation. Par
exemple, le document 1133 du Comit franais daccrditation (Cofrac) sur la Validation
interne des mthodes d'essais indique que les critres de performance tablir, lors de la
validation d'une mthode d'essai, dpendent des caractristiques mesures, qualitatives ou
quantitatives, des principes physiques, chimiques, mcaniques ou biologiques sur lesquels
portent l'essai ou l'analyse et du type d'quipement utilis . Vient ensuite la liste de ces
critres, cite titre dexemple : la justesse (obtenue par comparaison avec une mthode
de rfrence, par l'emploi de matriaux de rfrence ou de matriaux dont les proprits sont
connues ou par essai inter-laboratoires) ; la fidlit (exprime en terme de rptabilit, de
reproductibilit et ventuellement d'hystrsis) ; la limite de dtection et la limite de
quantification ; la sensibilit ; la slectivit ou la spcificit ; le pouvoir de rsolution ou de
sparation ou de discrimination ; et la robustesse.
De mme, la norme NF V03-110:1994, propose de faire des tests pour vrifier la conformit
dune mthode alternative par rapport une mthode de rfrence en comparant les carts-
types de rptabilit, les moyennes et les limites de dtection de deux mthodes. Divers autres
tests viennent complter ce qui est alors appel tude de validation : vrification de
lhomognit de la variance dans le domaine dapplication ; adquation du modle linaire
au cas dtalonnage linaire avec une variance constante ; calcul de la sensibilit ; contrle

Le Cahier des Techniques de lInra 14


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

de la spcificit par la mthode des ajouts doss et talonnage linaire par les moindres
carrs.
Mais rien nest dit sur le niveau de garantie atteindre pour lestimation de ces critres, par
exemple en termes de nombre de mesures, ni ce quon doit en faire par la suite pour
effectivement valider. En particulier, comment doit-on faire pour vrifier quils permettent
datteindre un niveau de qualit donn ? Le principe du traitement statistique des donnes
dvelopp dans ces guides de validation consiste raliser un certain nombre de tests dit de
signification de lhypothse nulle. Ils ont le gros inconvnient de favoriser les mthodes les
plus dispersives, cest--dire dont la fidlit est mauvaise. La dmonstration de cet
inconvnient des guides classiques requiert des dveloppements importants qui alourdiraient
ce texte. Le lecteur intress pourra trouver dans Feinberg M. (2009), Boulanger et al. (2003)
et Feinberg M. et al., (2004), tous les lments qui appuient cette affirmation. Cest pourquoi,
nous avons dvelopp une approche mieux adapte qui dbouche sur un autre outil statistique
appel le profil dexactitude.

1.2. Organiser la validation dune mthode


Pour organiser la validation dune mthode danalyse, il faut dabord lavoir correctement
mise au point. Bien souvent les analystes sont trop impatients et vont essayer de valider une
mthode dont le domaine dapplication nest encore bien dfini et pour laquelle il existe des
effets de matrice inconnus. Cest une perte de temps et dargent. Une tude de validation doit
dmarrer lorsquon dispose dun mode opratoire compltement rdig.
Bien sr lorganisation pratique des essais dpend ensuite du guide de validation choisi. Dans
Feinberg (2010b) nous proposons une squence de dix oprations qui dbouchent sur la
construction dun profil dexactitude. On peut dj en dfinir des principes gnraux :
dfinir les objectifs atteindre ;
prvoir les plans dexprience raliser ;
prvoir les quantits et la qualit des matriaux qui seront utiliss ;
organiser le calendrier des tudes et celui du personnel qui en sera charg.
En fin dtude, il ne faut pas sous-estimer le temps ncessaire pour interprter les rsultats.
Cest pourquoi, il importe de prvoir ds le dbut le mode denregistrement des mesures, en
fonction des outils de calcul dont dispose le laboratoire.
De toute faon, si le laboratoire fonctionne avec un systme qualit, il se doit de rdiger une
procdure et tous les documents annexes qui prcisent comment ltude sera conduite. On
peut proposer cette srie dtapes qui constituera le squelette de cette procdure :
nommer un responsable qui coordonnera ltude de validation ;
rdiger la version prliminaire du mode opratoire de la mthode en suivant une
procdure de prsentation dun mode opratoire normalis.
ouvrir une fiche de validation ;
runir un groupe de travail qui dfinira le domaine dapplication et les spcifications, en
particulier lobjectif attendu de la mthode.
rdiger les plans dexprience qui devront tre effectus. Prvoir la logistique, en termes
de volumes dchantillon de validation, de ractifs et de disponibilit du personnel.
raliser les tudes prvues.
interprter les rsultats et calculer les divers critres de performance requis.
rdiger la version finale du mode opratoire de la mthode avec ses critres de performance.

Numro spcial 2010


15
Validation des mthodes

Il est alors possible de dfinir un certain nombre de types de dossiers de validation qui se
solderont par des documents prsentables un organisme de contrle. Le dossier de
validation, une fois constitu, permettra aussi dtablir des valeurs seuils de qualification du
matriel de mesure quil faudra vrifier, par exemple, avant chaque utilisation. Ces tests de
qualification font lobjet de fiches de qualification spcifiques de chaque instrument
employ. Une vrification daptitude doit aussi avoir lieu si la mthode est transfre sur un
autre matriel. Il ne faut donc pas confondre la validation de la mthode avec un test de
qualification de linstrumentation.

2. Vocabulaire et dfinitions
Le vocabulaire relatif la validation est trs abondant, souvent foisonnant et souvent confus.
Nous avons dcid de choisir les dfinitions proposes en 2007 dans la dernire version du
Vocabulaire International de Mtrologie (VIM) (Guide ISO/CEI 99:2007) car elles
reprsentent leffort le plus rcent de normalisation dans ce domaine.

Terme Rfrence Dfinition


Mesurage, VIM 2.1 Processus consistant obtenir exprimentalement une ou
mesure plusieurs valeurs que l'on peut raisonnablement attribuer
une grandeur.
Mesurande VIM 2.3 Grandeur que l'on veut mesurer. Analyte, employ en
chimie, est un synonyme de mesurande, dusage plus
gnral.
Justesse de VIM 2.15 troitesse de l'accord entre la moyenne d'un nombre infini
mesure, justesse de valeurs mesures rptes et une valeur de rfrence.
Fidlit de VIM 2.16 troitesse de l'accord entre les valeurs mesures obtenues
mesure, fidlit par des mesurages rpts du mme objet ou d'objets
similaires dans des conditions spcifies.
Condition de VIM 2.21 Condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui
rptabilit comprennent la mme procdure opratoire, les mmes
oprateurs, le mme systme de mesure, les mmes
conditions de fonctionnement et le mme lieu, ainsi que des
mesurages rpts sur le mme objet ou des objets similaires
pendant une courte priode de temps.
Rptabilit de VIM 2.22 Fidlit de mesure selon un ensemble de conditions de
mesure, rptabilit.
rptabilit
Condition de VIM 2.23 Condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui
fidlit comprennent la mme procdure opratoire, le mme lieu et
intermdiaire des mesurages rpts sur le mme objet ou des objets
similaires pendant une priode de temps tendue, mais
peuvent comprendre dautres conditions que lon fait varier.
Fidlit VIM 2.24 Fidlit de mesure selon un ensemble de conditions de
intermdiaire de fidlit intermdiaire.
mesure, fidlit
intermdiaire

Le Cahier des Techniques de lInra 16


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Exactitude de VIM 2.13 a) troitesse de l'accord entre une valeur mesure et une
mesure, et 2.14 valeur vraie du mesurande.
exactitude b) troitesse de l'accord entre les valeurs mesures qui sont
attribues au mesurande.
Incertitude de VIM 2.27 Paramtre qui caractrise la dispersion des valeurs attribues
mesure, un mesurande, partir des informations utilises.
incertitude L'incertitude de mesure comprend des composantes
provenant d'effets systmatiques, telles que les composantes
associes aux corrections et aux valeurs assignes des
talons, ainsi que l'incertitude dfinitionnelle. Parfois, les
effets systmatiques connus ne sont pas corrigs mais traits
comme des composantes de l'incertitude.
Le paramtre qui sert exprimer lincertitude peut tre, par
exemple, un cart-type appel incertitude-type (ou un de ses
multiples) ou la demi tendue d'un Intervalle ayant un
niveau de confiance dtermin.
Limite de VIM 4.18 Valeur mesure, obtenue par une procdure opratoire
dtection donne, pour laquelle la probabilit de dclarer faussement
l'absence d'un constituant dans un matriau est , tant
donne la probabilit de dclarer faussement sa prsence.
La notation utilise dans cette dfinition reprsente un
risque derreur (dit de seconde espce) et ne doit pas tre
confondue avec la proportion de la dfinition de
lintervalle de tolrance.
Aptitude d'un systme de mesure, utilisant une procdure
Slectivit VIM 4.13
opratoire spcifie, fournir des rsultats de mesure pour
un ou plusieurs mesurandes, qui ne dpendent pas les uns
des autres ou de toute autre grandeur existant dans le
systme en cours de mesurage.
Spcificit UIPAC Stade ultime de la slectivit.
VIM 5.18 Valeur d'une grandeur, dont l'incertitude de mesure associe
Valeur de
est considre communment comme suffisamment petite
rfrence
pour que la valeur puisse servir de base de comparaison
pour les valeurs de grandeurs de mme nature.
VIM 2.45 Vrification que des exigences spcifies sont adquates
Validation
pour un usage dtermin. Le terme caractrisation
sapplique la mthode, alors que le terme vrification
sapplique au rsultat rendu. La validation de la mthode
consiste donc vrifier si les rsultats sont adquats en vue
dun usage dfini.
VIM 2.44 Fourniture de preuves tangibles qu'une entit donne
Vrification
satisfait des exigences spcifies, en prenant en compte
toute incertitude de mesure.
Ensemble des types de matrice auquel sapplique la
Domaine
mthode, en tenant compte de la gamme de concentrations
d'application
sur laquelle doit porter la validation.
<de la mthode>

Numro spcial 2010


17
Validation des mthodes

Ensemble des types de matrice auquel sapplique la mthode


Domaine de
et gamme de concentrations sur laquelle a port la
validation
validation.
Ensemble des types de matrice auquel sapplique la mthode
Domaine de
et gamme de concentrations sur laquelle a port la validation
validit
et pour lequel les futurs rsultats fournis par la mthode sont
jugs valides.
Mthode d'analyse qui dtermine la quantit ou la fraction
Mthode
pondrale d'un analyte de manire pouvoir l'exprimer sous
quantitative
forme de valeur numrique dans les units appropries.
Mthode d'analyse reconnue par des experts ou prise comme
Mthode de
rfrence par accord entre les parties, qui donne ou est
rfrence
suppose donner la valeur de rfrence accepte du
mesurande.
Ensemble des proprits de l'chantillon et de ses
Matrice
constituants autres que l'analyte.
L'effet de matrice traduit l'influence possible que ces
proprits ou constituants peuvent avoir sur la rponse
instrumentale. Comme l'effet de matrice peut varier aux
diffrents stades de l'analyse (par exemple avant ou aprs
minralisation), pratiquement un type de matrice sera dfini
comme un groupe de matriaux ou de produits reconnus par
l'analyste comme ayant un comportement homogne vis--
vis de la mthode d'analyse utilise.
Ensemble de mesurages raliss sur un mme chantillon
Srie
selon des conditions de connues. Par exemple, une srie
runira des mesurages effectus un mme jour et/ou par un
mme oprateur et/ou un mme appareil
Combinaison, sous une forme graphique, dun ou plusieurs
Profil
dexactitude intervalles de tolrance desprance calculs diffrents
niveaux de concentration et dune ou plusieurs intervalles
dacceptabilit.
Intervalle de Intervalle qui contient en moyenne une proportion %
tolrance dfinie de futurs mesurages obtenus selon un mode
opratoire donn et pour une concentration donne.
desprance
NOTE. Lintervalle de tolrance, revt une grande
(Intervalle de
importance dans la suite du texte. Ses limites sont obtenues
tolrance)
par le calcul, partir de mesurages rpts. La valeur de
est, gnralement, choisie entre 80 % et 95 %. En fait, elle
nintervient que pour situer la limite de quantification de la
mthode comme on le verra la partie 3.
Spcification de la performance exige pour la mthode,
Intervalle
exprime comme un cart acceptable autour de la valeur de
dacceptabilit
rfrence. Les limites de lintervalle sont fixes par le client
ou par une obligation rglementaire, parfois en fonction du
niveau de concentration. Elles sont notes en valeurs
absolues et dans lunit du mesurande ou (1 ) 100 en
valeurs relatives.

Le Cahier des Techniques de lInra 18


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Matriau dont la valeur de rfrence peut tre assigne, soit


chantillon de
parce quil sagit dun matriau de rfrence (certifi ou
validation
non), soit parce quon a procd un ajout dos ou un
(chantillon
marquage de la molcule doser.
tmoin)
Plus petite et/ou plus grande concentration de l'analyte
Limite de
pouvant tre quantifie, dans les conditions exprimentales
quantification (1)
dcrites de la mthode.
SFSTP Plus petite et/ou plus grande quantit de lanalyte dans un
Limite de
chantillon pouvant tre dose dans les conditions
quantification (2)
exprimentales dcrites avec une exactitude dfinie. Elle
correspond la concentration la plus petite et/ou la plus
grande du domaine de validit.
tablissement quil existe une relation linaire entre les
Linarit <de la
quantits retrouves (ou quantifies) dans des chantillons et
mthode>
leurs valeurs de rfrence. La linarit de la mthode ne doit
pas tre confondue avec la linarit de la fonction de
rponse de lappareillage de mesure qui caractrise la seule
rponse instrumentale lors de ltalonnage et qui nest pas
indispensable pour obtenir une quantification exacte.

3. Principes la base du profil dexactitude


3.1. Rappel sur les normes de la srie ISO 5725

Le profil dexactitude est bas sur une application directe des principes dcrits dans les
normes de la srie ISO 5725 (1, 2, 3, 4 ; 1994)]. On y propose un modle statistique pour
estimer lexactitude (justesse et fidlit) dune mthode ou de rsultats. Ce modle dcrit un
mesurage z dun mesurande Z sous la forme :
z=m+B+e
O m est la moyenne gnrale de lchantillon homogne, B la composante du biais du
laboratoire sous condition de rptabilit et e lerreur alatoire survenant dans chaque
mesurage, sous condition de rptabilit. Dans le cas dune tude inter-laboratoires, la
composante du biais B provient des laboratoires, mais elle peut aussi provenir de toute autre
source dincertitude, comme le jour, loprateur, linstrument... dans le cas dune tude intra-
laboratoire. Dans le vocabulaire statistique, un tel modle est dit modle danalyse de la
variance un seul facteur effets alatoires ou aussi modle des composantes de la
variance (en anglais, One-Way ANOVA Random Effect Model). Il est trs rpandu dans la
recherche agronomique.
Outre les mthodes statistiques pour calculer les critres dexactitude, les normes ISO 5725
prcisent aussi en dtail lorganisation de la collecte et les prcautions respecter.

3.2. Diverses conditions destimation de la fidlit

Daprs sa dfinition, la fidlit peut tre estime sous plusieurs conditions, comme la
rptabilit, la fidlit intermdiaire ou la reproductibilit. Dans tous les cas, la fidlit est
quantifie par un cart-type, quil soit de rptabilit et not sr, de fidlit intermdiaire sFI ou
de reproductibilit sR. On peut tablir une chelle de complexit entre ces diffrents carts-

Numro spcial 2010


19
Validation des mthodes

types, en fonction du nombre de sources dincertitude. La Figure 1 illustre cette graduation


depuis les conditions de rptabilit o il nexiste aucun facteur de variation identifi et/ou
contrl pour calculer lcart entre des rptitions, jusquaux conditions de reproductibilit o
le nombre de sources est inconnu. Ceci, en passant par les diffrentes possibilits destimation
de la fidlit intermdiaire. La norme ISO 5725-3 dcrit ces divers contextes dapplication,
dits de fidlit intermdiaire, et les modles utiliser lorsque dautres facteurs peuvent varier,
comme le jour, loprateur, linstrument...

sR = sr2 + sL2

sFI = sr2 + sO2 sFI = sr2 + sO2 + sJ2

sr
Sources de variation

0 1 2 n Plusieurs
Jour ou Jour et Sources laboratoires
Oprateur Oprateur

Rptabilit Fidlit intermdiaire Reproductibilit

Figure 1 : les diffrentes estimations de la fidlit dune mthode en fonction des sources de
variation impliques

Lapplication la plus classique de la norme ISO 5725-2 est le calcul de la rptabilit et de la


reproductibilit, dans le cadre dune tude inter-laboratoires qui dbouche sur deux carts-
types. Mais elle dcrit aussi les calculs sous des conditions intermdiaires de fidlit. Dans le
cadre de la mthode du profil dexactitude, on peut se situer aussi bien en condition de fidlit
intermdiaire et la validation est alors intra-laboratoire, que de reproductibilit et la validation
est inter-laboratoires.
Pour simplifier la prsentation, la notion de srie sert dsigner un ensemble de rptitions
effectues sous des conditions de rptabilit : une srie regroupe tous les mesurages effectus
sur un mme chantillon sous les mmes conditions, par exemple le mme jour, le mme
oprateur, un dlai court. Les plans dexpriences dcrits dans la Partie 2 consistent raliser
des essais en les rpartissant en plusieurs sries (par exemple, au moins 3 jours). Pour
certaines mthodes qui sappliquent des chantillons trs instables dans le temps il faudra
choisir un effet srie qui ne soit pas le jour mais plutt les oprateurs : une srie regroupe
alors les rptitions faites par un mme oprateur. Par exemple, la dtermination de lextrait
sec dun fromage peut exiger dutiliser diffrents oprateurs travaillant un mme jour, si la
mthode est destine, en routine, rendre un rsultat en moins de 24 heures.
Des schmas plus compliqus peuvent tre utiliss, comme dans lexemple suivant o se
combinent diffrents jours, oprateurs et instruments pour crer 4 sries sous la forme dun
plan factoriel fractionn 3 facteurs.

Le Cahier des Techniques de lInra 20


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Sries Jours Oprateurs Instruments


1 Jour 1 () Oprateur 1 () Instrument 1 (+)
2 Jour 2 (+) Oprateur 1 () Instrument 2 ()
3 Jour 1 () Oprateur 2 (+) Instrument 2 ()
4 Jour 2 (+) Oprateur 2 (+) Instrument 1 (+)

Dune faon gnrale, le choix des sources de variation pour organiser les sries de mesure
doit reflter au mieux les composantes de lincertitude qui risquent dapparatre lors de
lapplication en routine de la mthode valider.
Dans la mthode du profil dexactitude, il est indispensable de collecter les donnes en
plusieurs sries et en contrlant les sources de variation. Sinon, il est impossible de construire
un profil dexactitude.

3.3. Profil dexactitude

partir de lcart-type de fidlit intermdiaire ou de reproductibilit, calcul selon les


recommandations de la norme ISO 5725-2 (voir Partie 3), on construit un intervalle de
tolrance desprance qui contient une proportion % de futurs rsultats. Cette procdure a
t tablie par un groupe de travail de la Socit franaise des sciences et techniques
pharmaceutiques (Commission SFSTP 2003, 2006).
Lintervalle de tolrance desprance est diffrent de lintervalle de confiance. Lintervalle
de confiance caractrise un paramtre statistique. Par exemple lintervalle de confiance de la
moyenne permet dtablir avec un niveau de confiance donn un intervalle autour de la
moyenne observe dans lequel la moyenne vraie a de grandes chances de se trouver. Il
sexprime sous la forme Moyenne kIC(cart-type de la moyenne), o kIC est le facteur de
couverture de lintervalle de confiance. Lintervalle de tolrance caractrise, dun ct, la
dispersion des rsultats dj obtenus mais permet aussi de prvoir ceux qui seront obtenus lors
de futurs mesurages. Il sexprime aussi sous la forme Moyenne kIT(cart-type de fidlit)
mais o kIT est un autre facteur de couverture, calcul de faon compltement
diffrente de kIC.

Numro spcial 2010


21
Validation des mthodes

Recouvrement moyen (%) Limite de tolrance basse


140%
Limite de tolrance haute Limite acceptabilit basse
Limite acceptabilit haute
130%

120%
Recouvrement (%)

110%

100%
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
90%

80% Limite de quantification

Domaine de validit
70%
Domaine de validation
60%
Concentration connue (mg/L)

Figure 2 : profil dexactitude tabli avec 3 niveaux de concentration.


Chaque cercle gris reprsente la concentration moyenne retrouve pour le niveau et quantifie
la justesse. Les lignes pointilles dlimitent lintervalle dacceptabilit et les lignes continues
lintervalle de tolrance calcul partir des carts-types de fidlit intermdiaire pour
chaque niveau. Les traits verticaux dlimitent le domaine de validit, dans lequel la mthode
est capable de produire une proportion leve et connue de rsultats acceptables

Tous les calculs sont effectus sparment pour chaque niveau de concentration k, permettant
dobtenir k carts-types de fidlit puis k intervalles de tolrance qui une fois runis servent
construire le profil. La figure 2 illustre un exemple de profil dexactitude construit
avec 3 niveaux de concentration 0,4 ; 2,0 et 4,0 mg/l qui dlimitent le domaine de
validation (ou dapplication) de la mthode valider.
Les lments graphiques entrant dans le profil dexactitude sont les suivants :
sur laxe horizontal, la concentration thorique des niveaux (soit les valeurs de rfrence
assignes aux niveaux) ;
sur laxe vertical, simultanment :
les limites des intervalles de tolrance desprance calculs sur les concentrations
retrouves et exprimes en pourcentages (sous la forme dun taux de recouvrement ou
dune exactitude relative) ;
les intervalles dacceptabilit, dfinis en fonction de lobjectif de la mthode,
exprims de la mme faon que les intervalles de tolrance.
La stratgie dinterprtation de ce graphique est dcrite en dtail par Max Feinberg (2010 c).
Cependant, dune part, les limites dacceptabilit, dautre part, la proportion qui sert
calculer les intervalles de tolrance dpendent strictement du contexte dutilisation de la
mthode et doivent tre adapts chaque cas. Sur la figure 2, dans le domaine de validit,
dlimit par les traits verticaux discontinus, la mthode est capable de produire une

Le Cahier des Techniques de lInra 22


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

proportion moyenne attendue de rsultats gale comprise entre les limites


dacceptabilit : la mthode est dite valide dans ce domaine. Le domaine dapplication
reprsente le domaine initialement choisi pour conduire la validation.
Dune faon gnrale, pour tre en cohrence avec les modles statistiques utiliss, il faut
disposer de rptitions effectues sous condition de fidlit intermdiaire ou de
reproductibilit sur des chantillons homognes.
Max Feinberg prsente de faon dtaille les 10 tapes de la mthode du profil dexactitude
(2010 b) et des exemples, des complments et des feuilles de calcul (2010 c).

4. Guides et normes de validation


4.1. Textes rglementaires

Commission des Communauts Europennes, Dcision 2002/658/EC : modalits


d'application de la directive 96/23/CE du Conseil en ce qui concerne les performances des
mthodes d'analyse et l'interprtation des rsultats (2002) Off J. Eur. Commun. L221/8
Food and Drug Administration, Guidance for Industry: Analytical Procedures and Methods
Validation, Draft guidance (2000) US Department of Health and Human Services, Center for
Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research
(CBER)
Food and Drug Administration, Guidance for Industry: Bioanalytical Methods Validation for
Human Studies, Draft guidance (1998) US Department of Health and Human Services, Center
for Drug Evaluation and Research (CDER)
Food and Drug Administration, International Conference on Harmonization: Guideline on
validation of analytical procedures: definitions and terminology (1995) Federal Register 60,
11260-11262
Food and Drug Administration, International Conference on Harmonization: Guideline on
validation of analytical procedures: methodology (1997) Federal Register 62, 27463-27467
GBEA Arrt du 2 novembre relatif la bonne excution des analyses de biologie mdicale
(1995) Revue Franaise des Laboratoires 272, 55-65
Health and Welfare Canada, Drugs Directorate Guidelines, Acceptable Methods, published by
Authority of the Minister of National Health and Welfare (1992) Health Protection Branch
United States Pharmacopeia, Current concepts for the validation of compendia assays,
Pharmacopeia Forum (1986) The United States Pharmacopeia Inc., Rockville, MD, USA,
1241-1252
United States Pharmacopeia, XXVI, general information <1225>, Validation of compendia
methods (2003) The United States Pharmacopeia Inc., Rockville, MD, USA, p. 2439-2442
4.2. Normes et textes de consensus
EURACHEM, The Fitness for Purpose of Analytical Methods, A Laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics (1998) 1st Edition
EURACHEM/CITAC Guide, Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement (2000)
Second Edition, Final draft, April

Numro spcial 2010


23
Validation des mthodes

International Conference on Harmonization (ICH) Q2(R1) Validation of Analytical


Procedures: Text and Methodology (2005) http://www.ich.org/cache/compo/276-254-1.html
International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) Harmonized guidelines for
single-laboratory validation of methods of analysis (2002) Pure Appl. Chem. 74(5) 835-855
NF V03-110:2010 Analyse des produits agricoles et alimentaires - Protocole de
caractrisation en vue de la validation d'une mthode d'analyse quantitative par construction
du profil d'exactitude (2010) Afnor, Paris
NF V03-111 Protocole dvaluation intralaboratoire dune mthode alternative qualitative
par rapport une mthode de rfrence (1995) Afnor Paris
Nordic Committee on Food Analysis (NMKL) Validation (Proc. 4) http://www.nmkl.org
Organisation internationale de la vigne et vin (OIV) OENO 10-2005 Guide pratique pour la
validation, le contrle qualit, et lestimation de lincertitude dune mthode danalyse
nologique alternative (2005) OIV, Paris http://www.oiv.int
Vassault A., alt. Protocole de Validation des Techniques. Commission SFBC (1986) Annales
de Biologie Clinique 44, 679-745

4.3. Mthodes microbiologiques

ISO 13843 (NF T90-460) Qualit de l'eau, Lignes directrices pour la validation des mthodes
microbiologiques (2001) ISO, Genve
ISO 16140 Microbiologie des aliments, Protocole pour la validation des mthodes
alternatives (2003) ISO, Genve
ISO 17994 Qualit de l'eau, Critres pour tablir l'quivalence entre les mthodes
microbiologiques (2004) ISO, Genve

Bibliographie

AFNOR (2005) Norme NF EN ISO/CEI 17025 (NF X 50-061) Exigences gnrales


concernant la comptence des laboratoires d'talonnages et d'essais. Afnor, Paris
AFNOR (1994) Norme NF V03-110 Protocole dvaluation dune mthode alternative
quantitative par rapport une mthode de rfrence Afnor, Paris
AFNOR (1994a) Norme NF ISO 5725-1 : Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure Partie 1 : Principes gnraux et dfinitions. ISO, Genve
AFNOR (1994b) Norme NF ISO 5725-2 : Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure Partie 2 : Mthode de base pour la dtermination de la rptabilit
et de la reproductibilit d'une mthode de mesure normalise. ISO, Genve
AFNOR (1994c) Norme NF ISO 5725-3 : Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure Partie 3 : Mesures intermdiaires de la fidlit d'une mthode de
mesure normalise. ISO, Genve
AFNOR (1994d) Norme NF ISO 5725-4 : Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure Partie 4 : Mthodes de base pour la dtermination de la justesse
d'une mthode de mesure normalise. ISO, Genve

Le Cahier des Techniques de lInra 24


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Boulanger B., Chiap P., Dew W., Crommen J., Hubert Ph. (2003) An analysis of the SFSTP
guide on validation of chromatographic bioanalytical methods: progresses and limitations.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 32, 753-765
Commission SFSTP, Hubert P Nguyen-Huu JJ, Boulanger B, Chapuzet E, Cohen N,
Compagnon PA, Dew W, Feinberg M, Laurentie M, Mercier N, Muzard G, Valat L,
(2003) Validation des procdures analytiques quantitatives, Harmonisation des dmarches :
Partie I STP Pharma Pratiques 13(3) 101-138
Commission SFSTP, Hubert P Nguyen-Huu JJ, Boulanger B, Chapuzet E, Cohen N,
Compagnon PA, Dew W, Feinberg M, Laurentie M, Mercier N, Muzard G, Valat L,
(2006) Validation des procdures analytiques quantitatives, Harmonisation des dmarches :
Partie II Statistiques STP Pharma Pratiques 16(1) 30-60
Commission SFSTP, Hubert P Nguyen-Huu JJ, Boulanger B, Chapuzet E, Cohen N,
Compagnon PA, Dew W, Feinberg M, Laurentie M, Mercier N, Muzard G, Valat L,
(2006) Validation des procdures analytiques quantitatives, Harmonisation des dmarches :
Partie III Exemples d'application STP Pharma Pratiques 16(2) 87-121
Feinberg M., Boulanger B., Dew W., Hubert P. (2004) New advances in method validation
and measurement uncertainty aimed at improving the quality of chemical data. Analytical
Bioanalytical Chemistry 380: 502-514
Feinberg M., (2009) Labo-Stat : Guide de validation des mthodes danalyse Lavoisier
Tec&Doc, Paris
Feinberg M. (2010b) Mise en uvre du profil dexactitude. In Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 27-44
Feinberg M. (2010c) Interprtation du profil dexactitude. In Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 45-59
ISO (2007) Guide ISO/CEI 99 Vocabulaire international de mtrologie Concepts
fondamentaux et gnraux et termes associs (VIM), ISO, Genve

Numro spcial 2010


25
Validation des mthodes

Le Cahier des Techniques de lInra 26


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Mise en uvre du profil dexactitude

1
Max Feinberg

Rsum : Cet article a pour objet dexpliquer comment la procdure de construction du


profil dexactitude peut tre utilise pour valider une mthode d'analyse quantitative. Le
profil dexactitude est applicable aussi bien la validation interne dans un laboratoire
d'essais qu linterprtation de donnes collectes dans le cadre dune tude inter-
laboratoires conue selon les recommandations de la norme ISO 5725-2. Elle peut aussi
sappliquer aux essais bass sur des numrations, comme les mthodes microbiologiques, au
prix dun certain nombre de modifications qui ne seront pas prsentes ici. Lapproche
propose doit permettre une validation interne des mthodes dans les domaines suivants :
les mthodes non normalises ;
les mthodes conues/dveloppes par le laboratoire ;
les mthodes normalises employes en dehors de leur domaine d'application prvu ;
les amplifications ou modifications de mthodes normalises ;
et aussi une mthode alternative par rapport une mthode de rfrence.

Mots-cls : Validation, profil dexactitude, justesse, fidlit, incertitude, mthodes


danalyse quantitatives

Introduction
Le profil dexactitude ne sapplique quaux mthodes compltement dveloppes et mises au
point. En particulier, la slectivit/spcificit doit avoir t tudie ainsi que le domaine
dapplication de la mthode valider, en termes de types de matrice et de niveaux de
concentrations. Le domaine dapplication du profil dexactitude sinspire directement de la
norme ISO 17025:2005 qui propose que

Le laboratoire doit valider les mthodes non normalises, les


mthodes conues/dveloppes par le laboratoire, les mthodes
normalises employes en dehors de leur domaine d'application
prvu, ainsi que les amplifications ou les modifications de
mthodes normalises, afin de confirmer que les mthodes sont
aptes l'emploi prvu. La validation doit tre aussi tendue que
l'impose la rponse aux besoins pour l'application ou le domaine
d'application donn .

Bien sr, de nombreux dveloppements statistiques ne sont pas prsents mais sont
disponibles la rfrence (Feinberg M., 2009).

1 UR1204 Met@risk - Mthodologie danalyse de risque alimentaire- INRA F-75231 Paris cedex 05
01 44 08 16 52 max.feinberg@paris.inra.fr

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27
Validation des mthodes

1. Profil dexactitude en 10 tapes

1.1 Dfinir la quantit mesure

partir du mode opratoire de la mthode, on dfinit la quantit mesure en prcisant les


formules dexpression du rsultat final et la procdure pour tablir ce rsultat. En particulier,
il faut faire la distinction entre deux types de mthodes.
Les mthodes indirectes ou rationnelles qui exigent un talonnage pralable pour
calculer la concentration des chantillons inconnus. Pour ces mthodes, on procde en
deux tapes : dabord construire la courbe dtalonnage en utilisant le mme principe
physico-chimique que celui qui sert pour les chantillons ; ensuite faire des mesures sur
les chantillons inconnus et calculer leurs concentrations laide dun modle
dtalonnage ;
Les mthodes directes ou empiriques dont lanalyte est dfini par la mthode elle-
mme. On mesure alors la concentration des chantillons inconnus laide dune autre
mthode de mesure, comme une pese ou une titrimtrie. Parmi ces mthodes, dites
critres ou de type I dans le Codex Alimentarius, on trouve lazote organique total de
Kjeldahl, lextrait sec, les lipides totaux, etc.
Il est fondamental que la quantit mesure lors de la validation soit bien la mme que celle
qui sera mesure en routine. En particulier, si le mode opratoire prvoit dexprimer le
rsultat final partir dun seul mesurage, il ne faut pas exprimer le rsultat dun essai de
validation comme la moyenne de plusieurs rptitions.

1.2 Prciser des objectifs de la validation

Choisir le domaine de validation

Dfinir le domaine de validation de la mthode, sous la forme dune gamme de concentrations


absolues ou relatives, par exemple, entre 1 g et 60 g ou entre 1 et 500 g/l. Pratiquement, cest
travers les choix effectus pour construire les plans dexpriences, en termes de gamme de
concentrations pour un ou plusieurs types de matrice, quon dmontre dans quel domaine la
mthode est effectivement valide, et si elle est capable de fournir des rsultats acceptables. Le
domaine o cette dmonstration est faite est appel domaine de validit et peut tre plus petit
que le domaine dapplication dfini a priori.
Le choix du domaine dapplication peut correspondre une obligation lgale. Par exemple,
dans le domaine pharmaceutique, il faut prendre en compte les domaines minimums suivants :
pour les substances pures ou les spcialits pharmaceutiques, le domaine doit au moins
couvrir entre 80 et 120 % de leurs valeur nominales ;
pour une vrification de concentration continue, le domaine doit stendre entre 70 et
130 % de la concentration attendue.
Si, lors de lutilisation en routine de la mthode on rencontre des chantillons dont la
concentration nest pas incluse dans le domaine de validit, il est interdit dextrapoler. Il faut
alors procder une tude complmentaire pour tendre ce domaine ou procder une
dilution dans la mesure o on a dmontr quelle nentrane pas deffet. Une mauvaise
dfinition du domaine dapplication peut avoir des consquences importantes sur la validit,
surtout en termes de spcificit, dinterfrences ou de ractions croises

Le Cahier des Techniques de lInra


28
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Les limites dacceptabilit sont notes , lorsquelles sont exprimes de faon absolue dans
la mme unit que le mesurande, ou (1 ) 100 de faon relative. Dans la mesure du
possible, on va dfinir les limites dacceptabilit, en se rfrant un document, une pratique
de la profession ou une exigence scientifique. La liste des approches possibles qui sont
prsentes ci-dessous nest pas exhaustive et na quune valeur dexemple. Cependant, il
nentre pas dans le champ dapplication de ce texte de fixer des valeurs pour .
Lgislation. Plusieurs textes rglementaires fournissent des valeurs qui peuvent servir
de base pour fixer . Par exemple, la Dcision de la commission 2002/657 indique dans
son tableau 2 la justesse minimale des mthodes quantitatives pour les mdicaments et
rsidus de mdicaments vtrinaires dans les produits dorigine animale (Dcision de la
commission 2002/657 (CE) du 12 aot 2002). Dautres documents publis par la
Commission du Codex Alimentarius dfinissent une approche critre pour diffrents
analytes et matrices (FAO, 1997 ; CX/MAS 09/30/7) qui devrait clarifier la situation au
niveau international.
Pratiques de la profession. Certaines professions ont dfini des limites dacceptabilit
sous la forme dcart maximum acceptable (EMA), comme cela se pratique pour le
contrle de qualit ou la mtrologie lgale. Cest une approche classique en biologie
mdicale pour les paramtres du sang ou dans lindustrie pharmaceutique pour le
contrle des spcialits pharmaceutiques.
Modle empirique. Il existe des modles mathmatiques qui relient des performances
analytiques la concentration. Le plus connu est celui dvelopp par Horwitz vers
1980 ; il est repris dans de nombreux textes et permet de prdire la valeur attendue de
lcart-type de reproductibilit sR en fonction dun niveau de concentration X (en
particulier : dcision de la commission 2002/657 (CE) du 12 aot 2002 ; CX/MAS
09/30/7). Pour une concentration infrieure 10-7 kg.kg-1, il sexprime sous la forme,
sR = 0,02 X0.85 (1)
partir de performances connues. Par ailleurs, si on considre que la
reproductibilit limite reprsente un cart maximal acceptable (EMA) entre 2 mesures
faites en condition de reproductibilit, pour un niveau de confiance de 95%, celui-ci
vaut EMA 2,83sR et il vaudra EMA 4,24sR pour un niveau de 99%. En combinant
cette dfinition lquation (1) on peut dfinir la limite dacceptabilit partir de
lEMA et du modle Horwitz :
EMA 0, 057 X 0,85 ou EMA 0, 085 X 0,85
ou exprim en %.
0, 057 X 0,85 0, 085 X 0,85
EMA% 100 ou EMA% 100
X X
Dans le cas o on dispose dune estimation exprimentale de lcart-type de
reproductibilit par exemple si la mthode a t soumise une tude inter-
laboratoires on peut affiner les limites dacceptabilit en utilisant la valeur observe
de sR.
partir de la limite de quantification. Lorsque lobjectif de la mthode est
lapplication dune norme sanitaire, il est possible de dduire des limites
dacceptabilit, partir de la limite de quantification calcule avec le profil
dexactitude (Feinberg M., 2010c). La dcision de validation se fera alors en fonction
du risque encouru, obtenu a posteriori.

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29
Validation des mthodes

Il est souvent plus commode que les limites dacceptabilit soient exprimes sous la forme
dun pourcentage mais ce nest pas une obligation. De mme, pour simplifier, on choisit une
valeur constante pour tout le domaine dapplication. Mais, si le domaine dapplication est
large, on peut utiliser des valeurs variant en fonction du niveau de concentration.
Dans le cas o les valeurs de rfrence sont connues avec une incertitude leve, le choix des
limites dacceptabilit devra tre compatible avec cette incertitude.

1.3 Slectionner les chantillons de validation

Choisir la ou les matrices


Les essais qui servent calculer les lments du profil dexactitude doivent tre raliss sur
des chantillons clairement identifis, appels chantillons de validation. Ce sont des
matriaux qui doivent tre le plus reprsentatif possible du domaine dapplication de la
mthode. Ils peuvent ainsi inclure diffrentes matrices pour les mthodes multi-matrices.
Mais surtout on doit tre capable de leur attribuer une valeur de rfrence qui reprsente la
teneur attendue. Penser choisir des matriaux stables et homognes en quantit suffisante
pour raliser lensemble des essais dfinis par le plan dexprience de validation.

tablir les valeurs de rfrence des chantillons de validation


Pour estimer la justesse de la mthode, il faut disposer dchantillons de validation dont la
concentration est connue le plus exactement possible avec une incertitude connue. Cette
concentration correspond la valeur de rfrence assigne lchantillon de validation et
doit tre fixe indpendamment de la mthode valider, on la note X. Il existe plusieurs
approches possibles pour tablir la valeur de rfrence assigne un chantillon de validation,
parmi lesquelles :
utiliser des matriaux de rfrence certifis (MRC), externes (MRE) ou internes (MRI) ;
la traabilit de ces matriaux dcrot en fonction de leur nature ;
raliser des ajouts doss partir dune molcule talon de puret connue ;
prparer des chantillons dops ou synthtiques avec la matrice choisie ;
utiliser une mthode de rfrence, applique en interne ou en externe par un laboratoire
pair. Si la valeur de rfrence est estime par des rptitions de la mthode de rfrence,
il conviendra de slectionner la valeur la plus reprsentative, comme la moyenne ou la
mdiane. Cette approche doit tre prfrentiellement applique dans le cas de la
validation dune mthode alternative par rapport une mthode de rfrence ;
utiliser de la dilution isotopique lorsquon dispose de lanalyte sous une forme marque.
Pour la prparation dchantillons de validation par la mthode des ajouts doss de niveaux
varis, veiller rduire le plus possible la dpendance entre les diffrentes prparations. Les
ajouts doss peuvent tre effectus sous une forme liquide (par ajout dune solution talon) ou
solide (par pese). Si on procde par des dilutions successives (1/2, 1/4, 1/8) partir dune
mme solution mre, on cre une corrlation entre les mesures et on augmente les
consquences dune erreur de justesse ; il est donc dconseill de procder de cette faon.
Cette remarque sapplique aussi la prparation des solutions talons.
Le choix raisonn des valeurs de rfrence revt un aspect fondamental pour lapplication du
profil dexactitude car il conditionne la justesse de la mthode. En fonction de la technique
analytique choisie, toute approche visant cet objectif est acceptable, aussi longtemps quune
justification scientifique fonde est apporte.

Le Cahier des Techniques de lInra


30
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Lorsquon est dans lincapacit dassigner une valeur de rfrence un chantillon de


validation, il est possible de la remplacer par la moyenne ou la mdiane des concentrations
obtenues directement sur cet chantillon. La valeur de rfrence ainsi obtenue nest plus
indpendante de la mthode en cours de validation et interdit lvaluation du biais de justesse.
Cette approche trs restrictive doit tre clairement justifie dans le dossier de validation.

1.4 Planifier les essais de validation

Organiser les essais de validation


Le plan dexprience de validation sert estimer, dans les conditions o le mode opratoire
sera appliqu en routine, quelles seront les performances en routine de la mthode. Dans ce
contexte, un essai consiste faire un mesurage sur un chantillon de validation, de prfrence
dont la valeur de rfrence a t tablie avec une incertitude connue. Les notations sont
rappeles la Partie 3.
Pour raliser ce plan, prvoir :
I sries de mesures (1 i I) ;
pour chaque srie, effectuer J rptitions (1 j J) ;
K niveaux de concentration (1 k K) couvrant le domaine dapplication de la
mthode. Dans ce contexte, on entend par un niveau une valeur de rfrence.
Construire un tableau qui rassemblera les donnes brutes selon le modle du tableau 1. Les
valeurs de rfrence Xk des chantillons de validation sont exprimes en quantits absolues
(mg, g, log,) ou relatives (mg/kg, g/kg, mg/l,). Pour les mthodes indirectes, la rponse
Y est note dans une unit correspondant celle de la mthode instrumentale (surface du pic,
hauteur de pic, absorbance,). Pour les mthodes directes, elle est directement exprime dans
la mme unit que celle des valeurs de rfrence.

Tableau 1 : organisation des mesures du plan de validation

Niveaux Sries Concentrations des Mesurages (Rponses


(Jours) chantillons de instrumentales) Y
validation (valeurs de
rfrence) X
1 2 J
1 1 x11 y111 y121 y1J1
... ...
I ...
2 1

I

K 1
...
I xIK yIJK

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31
Validation des mthodes

Choisir le nombre de sries, de rptitions et de niveaux de validation


L'influence du nombre de sries I est discute au 6.3.2 de la norme ISO 5725-1 propos du
choix du nombre de laboratoires pour une tude inter-laboratoires (NF ISO 5725-2:1994).
Dailleurs, partir de ces donnes, lInternational Union for Pure and Applied Chemistry
(IUPAC) a dcid que I doit tre suprieur ou gal 8 pour quune tude inter-laboratoires
soit reconnue comme recevable au plan scientifique. Dans le cas dune validation interne, il
semble irraliste pour des raisons conomiques de maintenir une telle exigence. Cest
pourquoi, on peut choisir les exigences minimales suivantes :
le nombre de sries I gal ou suprieur 3. Une srie peut tre reprsente par un jour
mais aussi par une combinaison de diverses sources dincertitude, comme plusieurs
appareils, plusieurs oprateurs et plusieurs jours.
le nombre constant de rptitions par srie et par niveau J gal ou suprieur 2.
le nombre de niveaux de concentration K gal ou suprieur 3. Il est indispensable
davoir K 3 car on pourra alors vrifier la linarit entre les concentrations des valeurs
de rfrence et les concentrations retrouves : on a besoin de 3 niveaux pour conduire
cette vrification. Mais, lorsquil est ncessaire de valider la mthode proximit de sa
limite de quantification LQ, il est conseill de choisir K gal ou suprieur 4
(Feinberg M., 2010c).
Si on a choisi I = 3, J = 2 et K = 3, le plan de validation comporte 18 essais. part ces limites
minimales, une grande flexibilit est laisse dans le choix du nombre dessais.
Mais il faut se rappeler que plus le nombre dessais est lev, meilleures sont les estimations
des critres de validation, les intervalles de tolrance resserrs et la confiance quon peut avoir
dans la validation augmente. Cependant, pour amliorer les choses, il est gnralement
prfrable daugmenter le nombre de sries plutt que le nombre de rptitions ou de niveaux.

1.5 Planifier ltalonnage (pour les mthodes indirectes)

Organiser les essais dtalonnage


Le plan dtalonnage a pour objectif de permettre lestimation des coefficients du modle de
2
la courbe dtalonnage . Il nest obligatoire que pour les mthodes indirectes qui requirent un
talonnage pour raliser la quantification. Dans le cas des mthodes directes (comme la
cellulose brute) la quantification se fait sans talonnage, souvent par une pese, lanalyte tant
dfini par la mthode. Le dispositif exprimental utilis (nombre de niveaux dtalonnage, de
rptitions par niveau et ltendue du domaine dtalonnage) doit reflter le plus exactement
possible ce qui sera fait en routine. Ltendue de la gamme dtalonnage nest pas
obligatoirement confondue avec le domaine dapplication de la mthode. Pour raliser ce
plan, on va choisir les paramtres minimums suivants :
prvoir I sries (1 i I). Ce nombre doit absolument tre le mme que pour le plan de
validation. Par exemple, si le jour se confond avec la srie, les mesurages dtalonnage
doivent tre effectus les mmes jours que les mesurages de validation. On calculera
ainsi un modle dtalonnage pour chaque jour et non pas un modle global ;
pour chaque niveau, effectuer J mesurages rpts (1 j J). Le nombre de
rptitions J peut tre diffrent du nombre J choisi pour le plan de validation ;

2
Sous linfluence de la littrature anglo-saxonne, de nombreux analystes franais utilisent le terme
calibration la place dtalonnage.

Le Cahier des Techniques de lInra


32
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

pour chaque srie prvoir K niveaux (1 k K) talons de concentrations connues,


couvrant la gamme dtalonnage. Le nombre de niveaux K peut tre diffrent du
nombre K choisi choisies pour le plan de validation. Par exemple, on peut choisir K = 1
si on est sr que la courbe dtalonnage est une droite qui passe par le 0.

Construire le tableau 2 qui rsume lensemble des essais et mesurages effectuer. Dans ce
tableau les concentrations des talons sont exprimes en quantits absolues (mg, g,) ou
relatives (mg/kg, g/kg, mg/l,). Aprs ralisation, les rponses sont notes dans les units
de la mthode instrumentale (surface du pic, hauteur de pic, absorbance,).

Choisir le nombre de sries, de rptitions et de niveaux dtalonnage

La valeur souhaitable pour K dpend du type de fonction de rponse instrumentale attendue,


comme lindique le tableau 3. La rgle prconise consiste prendre au moins un niveau de
plus quil ny a de coefficients dans le modle dtalonnage. Cette contrainte est lie
lutilisation dune mthode de rgression aux moindres carrs pour estimer les coefficients du
modle (Azas J.M., Bardet J.M., 2006 - Huet S. et al., 2004). Cependant, on peut aussi
utiliser la valeur minimale qui figure dans le mme tableau. Les K talons doivent permettre
une bonne estimation statistique des paramtres de la fonction de rponse. La mthode des
moindres carrs, qui sert aux calculs, est trs sensible au dispositif exprimental et il faut
veiller ce point.
Tableau 2 : organisation des essais du plan dtalonnage
Niveaux Sries Concentrations des Mesurages (Rponses
des talons (Jours) chantillons de instrumentales) Y
validation (valeurs de
rfrence) X
1 2 J
1 1 x11 y111 y121 y1J1
... ...
I ...
2 1

I

K 1
...
I xIK yIJK

Le nombre de rptitions J pour chaque talon dans chaque srie est laiss au choix.
Cependant, il est recommand de prendre J 2. Lors de lutilisation en routine, on pourra
modifier le mode opratoire normalis de la mthode en fonction des conditions dmontres
comme tant capables de fournir des rsultats acceptables.
Si la mthode ncessite un talonnage, il faut veiller ce quaucune des rponses y obtenues
sur les chantillons de validation ne dpasse la rponse la plus leve ou la plus petite,
recueillie dans le tableau 1. En dautres termes, il ne faut pas extrapoler le modle en-dehors
des concentrations o il a t construit.

Numro spcial 2010


33
Validation des mthodes

1.6 Raliser les essais

Il est impratif de raliser les mesures pour le plan de validation en appliquant la mthode
telle quelle sera utilise en routine. En particulier, appliquer au mieux les conditions
dtalonnage mme si celles-ci pourront tre modifies au vu des rsultats obtenus par le
profil dexactitude. Par contre, le nombre de rptitions utilises pour exprimer un rsultat
final doit tre fidlement respect. Par exemple, si chaque rsultat final est exprim comme la
moyenne de 2 rptitions, chaque essai doit tre fait selon cette mthode.
Dans le cas o des effets de matrice ont t mis en vidence lors du dveloppement de la
mthode, on peut tre amen raliser plusieurs plans de validation pour calculer un facteur
de correction qui sera appliqu en routine (sauf interdiction rglementaire). Il faut alors
effectuer deux plans de validation sur deux chantillons indpendants et utiliser les rsultats
du premier pour calculer le facteur de correction qui sera appliqu au second plan
(Feinberg M., 2010c)
Le rle du profil dexactitude est destimer, partir des rsultats obtenus lors de la validation,
quelle garantie aura lutilisateur que la mthode utilise en routine fournira des rsultats
acceptables. Cest pourquoi, la ralisation des plans doit respecter les conditions suivantes :
Exigence dtre en condition de fidlit intermdiaire ou de reproductibilit. Les
mesurages doivent tre raliss en condition de fidlit intermdiaire ou de
reproductibilit, avec pour objectif de prendre en compte le plus de sources
dincertitude possible. Comme ces sources dincertitude dpendent de la mthode et des
matrices analyses, il est impossible de dfinir une stratgie unique. Il est recommand
de construire un diagramme causes/effets pour choisir les conditions les plus globales.
Dans la plupart des cas, on pourra dcider de faire les mesurages sur plusieurs jours
dans la mesure o on prend ainsi en compte les incertitudes dues lappareillage
(rglages, et prparation des ractifs), ltalonnage, au personnel, la conservation de
lchantillon Mais pour des chantillons trs instables, on pourra raliser les
mesurages sur un seul jour avec plusieurs oprateurs ou instruments.
Exigence de couvrir le domaine dapplication. Une tude de validation doit couvrir
lensemble du domaine dapplication de la mthode. Pour satisfaire ces deux
contraintes, plusieurs choix sont possibles et, dans tous les cas, avant de commencer il
faut disposer de quantits suffisantes dchantillons pour faire tous les mesurages :
utiliser un seul chantillon dont on sait faire varier le niveau de concentration, par
exemple au moyen dajouts doss (approche de choix pour une mthode indirecte) ;
utiliser plusieurs chantillons (ou mme plusieurs matrices proches) prsentant des
niveaux de concentration varis (gnralement le cas pour une mthode directe) ;
prparer des matrices synthtiques (matires premires ou produits chimiques) ;
utiliser des matriaux de rfrence externes ou certifis

Exigence de synchroniser les plans. Dans le cas, o deux plans sont ncessaires
talonnage et validation il est indispensable de raliser les essais dans les mmes
conditions de fidlit intermdiaire. Par exemple, si le jour est la source de variation
choisie, il faut raliser des mesurages dtalonnage et de validation pour un mme jour
donn. Les donnes dtalonnage de ce jour serviront prdire les concentrations
partir des donnes de validation faites le mme jour.

Le Cahier des Techniques de lInra


34
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

1.7 Calculer les concentrations prdites inverses [mthodes indirectes]

Avant tout traitement numrique, il est recommand de procder une illustration graphique
pralable et un examen visuel des donnes afin de dtecter une erreur flagrante, comme une
donne mal enregistre. Ces graphiques peuvent tre mis en annexe du dossier dvaluation.
La prsence dune donne anormale amne suspecter une mauvaise mise au point de la
mthode et peut invalider la procdure de validation.

Calculer les modles dtalonnage


Pour les mthodes directes, cette tape de calcul nexiste pas.
Pour les mthodes indirectes, il est ncessaire dexprimer la rponse instrumentale Y en
fonction des concentrations x des talons, laide dun modle mathmatique f de la forme :
Y = f (x) (2)
Les fonctions f classiquement utilises sont regroupes au tableau 3 mais cette liste nest pas
limitative. Les paramtres a1, a2, sont appels les paramtres du modle.
Calculer les paramtres du modle dtalonnage partir des donnes recueillies pour chaque
srie k, de faon obtenir k ensembles de valeurs des paramtres. Le mme type de modle
doit tre utilis pour lensemble des donnes, quelle que soit la srie, mais les valeurs des
paramtres peuvent tre diffrentes dune srie lautre. Cette approche permet de prendre en
compte les variations inter-sries (inter-jours) observes.
Le calcul des estimations des coefficients du modle dtalonnage peut faire appel aux
diverses techniques statistiques classiques dtailles dans la littrature :
1. Rgression par la mthode des moindres carrs (AFNOR, 1996)
2. Rgression pondre (Azas J.M., Bardet J.M., 2006)
3. Rgression non linaire (Huet S., et al., 2004)

Tableau 3 : principales fonctions de rponse utilisables pour un talonnage


quation Souhaitable pour Minimum pour
Type
K K
Droite passant par lorigine Y = a1x 2 1
Droite Y = a0 + a1x 3 2
Fonction quadratique Y = a0 + a1x + a2x2 4 3
a a0
Y = a0 + 3 a1
Fonction logistique 4 a
1+ 2 5 5
paramtres x

La mthode la plus accessible est celle des moindres carrs, car elle est disponible sur les
tableurs. La rgression pondre sapplique dans les cas o les variances des rponses ne sont
pas homognes entre niveaux. Les estimations des paramtres du modle pour chaque srie
sont regroupes dans le tableau 4.
Si le type de modle dtalonnage a t clairement tabli lors du dveloppement de la
mthode, on pourra choisir le nombre minimum pour K. Cependant, on aura intrt prendre
le nombre souhaitable ou plus afin de tester si dautres modles plus complexes ne sont pas

Numro spcial 2010


35
Validation des mthodes

mieux adapts. En effet, partir des donnes du plan dtalonnage, il est possible destimer
plusieurs modles dtalonnage puis de construire ainsi plusieurs profils dexactitude. On
pourra alors retenir le modle qui fournit le profil le plus favorable. Il conviendra alors de
modifier le mode opratoire en fonction du modle choisi, sans pour autant modifier les
limites dacceptabilit .

Tableau 4 : estimations des paramtres du modle en fonction de la srie


Srie 1 I
a0
a1

Calculer les concentrations retrouves par prdiction inverse


Pour les mthodes indirectes, les modles dtalonnage servent calculer les concentrations
retrouves, partir des donnes au plan de validation (Tableau 2), en utilisant la fonction
inverse du modle dtalonnage, selon le modle mathmatique suivant :
x = z = f 1 (Y ) (3)
La fonction inverse est appele quation de prdiction inverse et les valeurs z ainsi obtenues
sont appeles concentrations retrouves. Le tableau 5 fournit ces quations selon la fonction
de rponse choisie au tableau 3.

Tableau 5 : quations de prdiction inverse selon le type de la fonction de rponse


Fonction de rponse Fonction inverse de calcul de la concentration retrouve
Y
Droite passant par lorigine z=
a1
Y a0
Droite z=
a1

a1 + a12 4a2 ( a0 Y )
Fonction quadratique z=
2a2
a2
z= 1
Logistique 4 paramtres a3 a0 a1
1
Y a0

Utiliser les donnes du plan de validation et les paramtres des modles dtalonnage estims
partir du plan dtalonnage pour calculer les concentrations retrouves dans les chantillons
de validation. Effectuer ces calculs par srie, avec le modle de la srie correspondante. Ce
mode de calcul souligne le fait quil est indispensable que les essais des plans dtalonnage et
de validation soient synchroniss cest--dire raliss le mme jour et/ou par le mme
oprateur et/ou par le mme laboratoire.

Le Cahier des Techniques de lInra


36
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

1.8 Calculer les critres de validation

Calculer la justesse par srie


Rassembler lensemble des donnes dans un tableau selon le modle du Tableau 6. Au cas o
diffrents modles dtalonnage sont tests, construire autant de tableaux quil y a de
modles. Utiliser les valeurs de z pour calculer les carts-types de rptabilit, inter-sries et
de fidlit intermdiaire (ou de reproductibilit). Ce calcul seffectue indpendamment pour
chaque niveau de concentration k (avec 1 k K) selon le principe de la norme ISO 5725-2,
comme il est dcrit dans Feinberg M. (2010c). Pour certaines mesures exprimes en
logarithmes, comme les comptages microbiologiques ou unit formant colonie (ufc), exprims
en log10 (ufc), il nest pas utile de calculer les valeurs relatives.

Tableau 6 : concentrations retrouves par prdiction inverse obtenues partir des donnes
du plan de validation
Niveau Srie Rptition Concentration Concentratio Biais Biais
thorique X n retrouve Z absolu relatif
1 1 1 x111 z111 bijk bijk%
1 1 2
1
J
1 I 1
1 I 2
1 I
1 I J

K I J xIJK zIJK bIJK

Dans le tableau 6, il est possible de calculer un ou plusieurs critres exprimant la justesse


(sous la forme dun biais). Ces critres sont les suivants :
bijk = zijk xijk
Biais absolu : (4)
zijk xijk
bijk % = 100
xijk
Biais relatif : (5)
zijk
100
Recouvrement = xk (6)

Calculer la justesse et la fidlit par niveau

Rassembler avec les critres de justesse, calculs pour un niveau et non plus pour un
mesurage individuel, sous la forme dun tableau, comme le tableau 7.
Dans les cas trs particuliers o la justesse nest pas exige, la valeur de rfrence moyenne
peut tre fixe comme tant gale la concentration retrouve moyenne. Il est alors inutile de
calculer un biais moyen ou un taux de recouvrement moyen.

Numro spcial 2010


37
Validation des mthodes

Tableau 7 : critres de fidlit et de justesse par niveau


Niveaux
Critres Symbole 1 K

Valeur de rfrence moyenne xk

Concentration retrouve moyenne zk

skr
cart-type de rptabilit
skB
cart-type inter-sries

cart-type de fidlit intermdiaire skFI = skr2 + skB


2

Coefficient de variation de la fidlit skFI


100
intermdiaire xk
Biais moyen absolu zk xk

zk xk
Biais moyen relatif 100
xk
zk
Taux de recouvrement moyen 100
xk

Calculer les intervalles de tolrance

La mthode de calcul propose par Mee (1984) est celle qui a t choisie pour cette
procdure. Elle a aussi t adopte par une commission de la Socit des sciences et
techniques pharmaceutiques (SFSTP - 2003, 2006). Le calcul se fait partir des donnes du
tableau 7, indpendamment pour chaque niveau de concentration k. Pour des raisons de
simplification des formules, lindice k est omis dans les formules suivantes.
Exprimer lintervalle de tolrance comme un intervalle symtrique autour de la concentration
retrouve moyenne z du niveau :
z ktol sIT (7)
Calculer lcart-type de lintervalle de tolrance sIT selon la formule (8) ; il servira aussi
lestimation de lincertitude de mesure. Il est obtenu grce aux formules suivantes :
1
sIT = sFI 1 + (8)
I J B2

R +1
B= (9)
J R +1

sB2
R= (10)
sr2

Le Cahier des Techniques de lInra


38
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

La quantit ktol est appel facteur de couverture de lintervalle de tolrance et vaut :


ktol = t 1+ (11)
v,
2

t 1+ est le quantile de la distribution t de Student pour degrs de libert et la probabilit


v;
2
du contenu de lintervalle de tolrance. Le nombre de degrs de libert est calcul selon
mthode dapproximation et donne :
( R +1)
2

v= (12)
2
1 1
R+ J 1
+ J
I 1 IJ
Pour chaque niveau k, calculer lcart-type de lintervalle de tolrance sIT, le facteur de
couverture ktol et les limites basse et haute de lintervalle de tolrance. La valeur choisie pour
doit tre au moins de 80%. Lensemble des calculs est rassembl dans un tableau de la
forme du tableau 8.

Tableau 8 : rsum des diffrents lments qui serviront au profil dexactitude, incluant les
limites des intervalles de tolrance par niveau
Symbole Niveaux
Critres
1 K
Valeur de rfrence moyenne x
Limite de tolrance basse z ktol sIT
Limite de tolrance haute z + ktol sIT
z ktol sIT
Limite de tolrance basse relative x 100

z + ktol sIT
Limite de tolrance haute relative x 100

Limite dacceptabilit basse relative (1 ) 100
Limite dacceptabilit haute relative (1 + ) 100

Le nombre (Eq.(12)) est rarement un nombre entier et il convient dutiliser des tables de la
loi de Student qui acceptent des nombres de degrs de libert non entiers. Cependant, il est
possible dapprocher la valeur du quantile par interpolation linaire entre les 2 nombres de
degr de libert entiers qui encadrent . Ce calcul approch est illustr dans la feuille de calcul
(dans les cellules B30 B32) prsente par Max Feinberg (2010c).
sB2
Le rapport R = entre la variance inter-sries et la variance de rptabilit intervient dans
sr2
plusieurs formules. Il traduit limportance relative de leffet de la srie. Par exemple, dans le
cas o leffet jour est leffet srie, si la mthode est trs stable dun jour lautre et est
capable de fournir des rsultats trs proches pour un mme chantillon, R est proche de 1 et ne
jouera quun rle secondaire. Par contre, si ce rapport augmente le nombre de degrs de

Numro spcial 2010


39
Validation des mthodes

libert est diminu et, plus le nombre de degrs de libert est petit, plus le quantile de la
distribution t de Student est lev et largit lintervalle de tolrance.

1.9 Construire le profil dexactitude

Le profil dexactitude peut tre construit de diffrentes faons, en fonction du type de donnes
trait. La mthode la plus classique, lorsquon a faire des concentrations relatives, est celle
prsente la figure 1 o les performances sont exprimes de faon relative, par un taux de
recouvrement. Mais si les donnes sont des comptages exprims en logarithmes, il vaut mieux
exprimer les performances, comme des diffrences entre 2 logarithmes, ce qui est quivalent
un rapport.
Pour construire le profil dexactitude, slectionner dans le tableau 8, les lignes suivantes :

reporter sur laxe horizontal


1) Les valeurs de rfrence moyennes.
reporter sur laxe vertical
2) Les limites de tolrance basses relatives ;
3) Les limites de tolrance hautes relatives ;
4) Les taux de recouvrement moyens ;
5) Les limites dacceptabilit basses relatives ;
6) Les limites dacceptabilit hautes relatives.
Reporter ces donnes sur un graphique en utilisant les valeurs de rfrence moyennes pour
dessiner laxe des abscisses, comme lillustre la figure 1.

130%

120%

110%
Recouvrement (%)

100%
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
90%

80%

70%

60%
Concentration thorique

Figure 1 : profil dexactitude exprim par le taux de recouvrement

Le Cahier des Techniques de lInra


40
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

1.10 Interprter le profil dexactitude pour la validation

Pour utiliser le profil dexactitude en vue de valider une mthode, il faut avoir fix les deux
critres de dcision suivants :
les limites dacceptabilit . Elles servent traduire les objectifs pratiques des
utilisateurs. Elles dlimitent un intervalle autour de la valeur de rfrence. Le plus
souvent, ces limites sont rglementaires ou issues de la rglementation. Mais dans le cas
o il nexiste pas de rfrence tablie, il convient de prendre en compte les attentes des
utilisateurs finaux, comme une LQ donne (voir 1.2) ;
la proportion . Elle reprsente la proportion de futurs rsultats qui seront en moyenne
compris dans les intervalles de tolrance. La valeur choisie pour dpend largement du
champ dapplication (contrle sanitaire, contrle de fabrication, etc.). Il est vident que
plus est petit, par exemple 70 %, plus la mthode risque de produire des rsultats qui
ne correspondent pas aux spcifications annonces. Cest pourquoi, dans la mthode du
profil dexactitude cette proportion a t fixe 80 %, au moins.

140%

130%

120%
Recouvrement (%)

110%

100%
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
90%

80%

70%

60%
Concentration thorique (mg/kg)

Figure 2 : exemple dune mthode valide sur une zone rduite du domaine de validation

Rgles de dcision
Reporter les limites dacceptabilit sur le graphique du profil dexactitude pour permettre une
interprtation visuelle directe des rsultats. La figure 2 illustre une situation classique o la
majeure partie des intervalles de tolrance est comprise dans lintervalle dacceptabilit. Ds
que lintervalle de tolrance sort de lintervalle dacceptabilit, on peut conclure que la
mthode nest plus capable de fournir suffisamment de rsultats acceptables, en fonction des
choix faits au dpart de ltude. Par exemple, pour = 80 % et une limite dacceptabilit de
25 %, on peut conclure que la mthode est valide entre environ 0,2 mg/kg et 4,0 mg/kg. En
outre, ce graphique fournit dautres indications. En particulier, sur la figure 2, il apparat que

Numro spcial 2010


41
Validation des mthodes

la justesse varie avec la concentration. Le taux de recouvrement qui traduit la justesse est
denviron 108 % aux basses concentrations pour tre proche de 100 % aux concentrations
leves. laide des rsultats statistiques regroups dans le tableau construit sur le modle du
tableau 7, on peut trouver diffrents lments qui expliquent le comportement de ce biais de la
mthode.
Dans le cas illustr par la figure 3, la mthode prsente un biais systmatique lev : le taux
de recouvrement est seulement denviron 70 % ; d par exemple un effet de matrice non
contrl. Il faut alors conclure que la mthode nest pas valide dans le domaine tudi. Si les
pratiques de la profession ou la rglementation le permettent, il est alors possible dappliquer
un facteur de correction qui viendra corriger ce biais. La procdure appliquer pour calculer
et valider ce facteur de correction est dcrite par Max Feinberg (2010c).
130%

120%

110%

100%
Recouvrement (%)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
90%

80%

70%

60%

50%

40%
Concentration thorique (mg/kg)

Figure 3 : exemple dun profil dexactitude pour une mthode prsentant un biais
systmatique important, caractris par un taux de recouvrement denviron 70 %

Dfinir du domaine de validit


Le domaine de validit est dtermin par la zone du domaine de validation dans laquelle la
mthode fournit une proportion de rsultats acceptables au moins gale . Il est limit par
une borne suprieure qui quivaut la limite de quantification infrieure et une limite
suprieure qui correspond la limite de quantification suprieure.
Choisir la procdure dtalonnage pour la routine
Dans la mesure o avec les mthodes indirectes on dispose de donnes dtalonnage, il est
possible de construire plusieurs profils dexactitude avec le mme jeu de donnes mais en
utilisant diffrents modles dtalonnage, par exemple un modle passant par le zro et
construit avec une seule solution talon qui est compar un modle linaire complet calcul
partir de 3 solutions talons. On peut alors slectionner le profil le plus favorable ou la
procdure dtalonnage la plus simple qui, malgr tout, permet datteindre lobjectif fix.

Le Cahier des Techniques de lInra


42
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Identifier les points atypiques


La mthode de calcul propose dans la mthode du profil dexactitude exige que le plan
dexprience de validation soit quilibr, cest--dire que le nombre de rptitions I par srie
soit constant. Cest pourquoi, elle ne prvoit pas de mthodes de dtection et/ou de rejet de
donnes atypiques (aberrantes).
Toutefois, si le responsable de la validation juge que le rejet de donnes atypiques est
ncessaire aprs un examen visuel dune reprsentation graphique, il a toute latitude pour
mettre en uvre la procdure qui lui semblera la mieux adapte, par exemple, en sappuyant
sur les recommandations de la norme ISO 5725-2. De plus, il est toujours possible de
recommencer les mesures pour un niveau de concentration et une srie donns.
Un trop grand nombre de points aberrants souligne la mise en uvre mdiocre de la mthode
danalyse et met en doute le bien-fond de sa validation.

2. Transfrer la mthode en routine


Finalement, lors de lapplication en routine de la mthode ainsi valide, il convient de vrifier
de faon rgulire si les rsultats obtenus restent acceptables, par exemple au moyen dune
carte de contrle, en particulier, si on utilise un facteur de correction (Feinberg M., 2010c).
Des actions correctives inefficaces peuvent ainsi conduire la revalidation de la mthode. La
revalidation peut alors tre complte ou partielle. Une revalidation partielle consistant faire
un plan dexprience un seul niveau de concentration pour vrifier si lintervalle de
tolrance obtenu reste bien entre les limites dacceptabilit.

Bibliographie

AFNOR (1994) Norme NF ISO 5725-2, Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure Partie 2 : Mthode de base pour la dtermination de la rptabilit
et de la reproductibilit d'une mthode de mesure normalise.
AFNOR (1996) Norme NF ISO 11095 talonnage linaire utilisant des matriaux de
rfrence, Afnor, Paris
Azas J.M., Bardet J.M.; (2006) Le modle linaire par l'exemple, Rgression, analyse de la
variance et plans d'exprience illustrs avec R, SAS et Splus, Dunod, Paris
Commission europenne (2002) Dcision de la commission 2002/657 du 12 aot 2002 portant
modalits dapplication de la directive 96/23/CE du Conseil en ce qui concerne les
performances des mthodes danalyse et linterprtation des rsultats
Commission SFSTP, P. Hubert, J.J. Nguyen-Huu, B. Boulanger, E. Chapuzet, P. Chiap, N.
Cohen, P.A. Compagnon, W. Dew, M. Feinberg, M. Lallier, M. Laurentie, N. Mercier, G.
Muzard, C. Nivet, L. Valat ; Validation des procdures analytiques quantitatives :
harmonisation des dmarches.
Partie I. : STP Pharma Pratiques (2003) 13:3, 101-138
Partie II. : Statistiques, STP Pharma Pratiques (2006) 16:1, 30-60
Partie III : Exemples d'application, STP Pharma Pratiques (2006) 16:2, 87-121
FAO (1997) Manuel sur le contrle de la qualit des produits alimentaires. 14 : Assurance de
la qualit dans le laboratoire d'analyse chimique des aliments, Rome,
http://www.fao.org/docrep/T0845F/t0845f00.HTM

Numro spcial 2010


43
Validation des mthodes

Feinberg M., (2009) Labo-Stat : Guide de validation des mthodes danalyse Lavoisier
tec&Doc, Paris
Feinberg M. (2010c) Interprtation du profil dexactitude in Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 45-59
Huet S., Bouvier A., Poursat M.A., Jolivet E. (2004) Statistical Tools for Nonlinear
Regression Springer Verlag, New-York, ISBN 0-387-40081-8
Mee R.W. (1984) -Expectation and -Content Tolerance Limits for Balanced One-Way
ANOVA Random Model Technometrics 26:3, 251-254
Commission du Codex Alimentarius (2005) Manuel de procdure de la 15me dition,
http://www.codexalimentarius.net/web/procedural_manual.jsp)
CX/MAS 09/30/7, Directives pour tablir des critres pour lidentification des mthodes
danalyse adquates (Conversion des mthodes pour les lments traces en critres)
ftp://ftp.fao.org/codex/ )

Le Cahier des Techniques de lInra


44
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Interprtation du profil dexactitude

Max Feinberg1

Rsum : partir des donnes collectes pour construire le profil dexactitude, il est possible de
calculer divers critres complmentaires souvent exiges pour les dossiers de validation, comme la
limite de quantification ou lincertitude. Sappuyant sur les concepts dcrits dans dautres articles
consacrs la validation des mthodes : principe et mise en uvre du profil dexactitude cet article
prsente diffrents complments et, en particulier, le mode de calcul de la rptabilit et de la fidlit.

Mots-cls : Validation, profil dexactitude, justesse, fidlit, incertitude, mthodes danalyse


quantitatives

Notations et symboles
Une srie de mesurages i, (i variant de 1 I) contient des niveaux de concentration k (k variant
de 1 K) pour lesquels des rptitions ont t faites j (j variant de 1 J) les indices seront
repris dans lordre i, j, k. Les variables alatoires sont notes en majuscules et les valeurs
quelles prennent en minuscules.

Symbole Description
xijk Valeur de rfrence assigne un talon pour la srie i (1 i I), la rptition j
(1 j J) et le niveau k (1 k K)
ou
Valeur de rfrence assigne un chantillon de validation pour la srie i, la
rptition j et le niveau k.
yijk Mesure de la rponse instrumentale ou exprimentale observe pour un talon ou
un tmoin de validation pour la srie i, la rptition j et le niveau k.
zijk Valeur retrouve dans lchantillon de validation de la srie i, pour la rptition j
et le niveau k, obtenue soit par prdiction inverse laide dun modle
dtalonnage, soit par une mesure directe.
bijk Biais exprimant lerreur de justesse pour un tmoin de validation entre sa valeur
retrouve et sa valeur de rfrence bijk = zijk xijk

1. Calcul des carts-types de rptabilit, fidlit intermdiaire et


reproductibilit
Les calculs sont conduits selon le principe dcrit dans la norme ISO 5725-2 ou de sa version
Afnor NF X 06-041. Ils doivent tre effectus indpendamment niveau par niveau k, sur les
concentrations retrouves par prdiction inverse dans le cas des mthodes indirectes ou sur les
concentrations retrouves dans le cas des mthodes directes. Dans les deux cas, les

1 UR1204 Met@risk - Mthodologie danalyse de risque alimentaire INRA F-75231 Paris cedex 05
01 44 08 16 52 max.feinberg@paris.inra.fr

Numro spcial 2010


45
Validation des mthodes

concentrations retrouves sont notes zijk. Par convention, lindice i (1 i I) reprsente le


numro de la srie et j (1 j J) celui de la rptition dans la srie. Toutes les sries doivent
avoir le mme nombre de rptitions, cest--dire que J est le mme quelque soit i : on dit
alors que le plan dexprience est quilibr. Pour simplifier les notations, lindice k (1 k
K) du niveau est supprim dans les formules qui suivent.
Calculer pour chaque niveau k :
lcart-type de rptabilit, not sr ;
lcart-type inter-sries, not sB ;
lcart-type de fidlit intermdiaire sFI = sr2 + sB2 .

1.1 Cas dun plan quilibr


La norme ISO 5725 ne prend en compte que les plans dexprience o le nombre de
rptitions I par srie est le mme pour toutes les sries. Le nombre total de rptitions doit
tre gal IJ. Par contre, ce total peut tre diffrent pour chaque niveau.
Calculer la moyenne gnrale dun niveau :
I J

zi =1 j =1
ij

Z= Concentration moyenne du niveau (1)


IJ
Calculer les carts-types de rptabilit, inter-sries et de fidlit intermdiaire en effectuant
lanalyse de la variance (ANOVA) dun modle effet alatoire, selon les principes dcrits de
la norme ISO 5725, savoir une dcomposition de la somme des carrs des carts totale en
deux sommes des carrs dcarts :
I J I J I

( z
i =1 j =1
Z )2 = ( zij Zi )2 + J ( Zi Z )2
ij
i =1 j =1 i =1
(2)

SCEt SCEr SCEB

Cette quation est traditionnellement crite sous une forme abrge, faisant appel trois
sommes de carrs dcarts (SCE).
SCEt = SCEB + SCEr quation gnrale de lanalyse de variance
O chacune des sommes est dfinie comme suit pour faciliter linterprtation :
SCEt Somme totale des carts la moyenne gnrale du niveau
SCEB Somme des carts inter-sries
SCEr Somme des carts intra-srie
Comme le propose la norme ISO 5725, il nest pas ncessaire de dvelopper les trois sommes
de carrs pour effectuer les calculs ; le calcul de SCEB se fait par diffrence. Cette mthode
peut poser des problmes si le rsultat est ngatif : forcer alors la valeur de SCEB 0.
SCEB = SCEt SCEr si SCEB > 0
SCEB = 0 si SCEB 0

Le Cahier des Techniques de lInra


46
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Calculer la variance de rptabilit du niveau, partir des rptitions zij :


SCEr
sr2 = Variance intra-srie (3)
I ( J 1)
Calculer la variance inter-sries note sB, comme suit :
SCEB 2
sr
2
sB = I 1 Variance inter-sries (4)
J
Finalement, calculer lcart-type de fidlit intermdiaire du niveau :

sFI = sB2 + sr2 cart-type de fidlit intermdiaire (5)


Voir le 2.2 Utilisation dun logiciel pour un exemple de calcul sous Excel.

1.2 Cas dun plan dsquilibr


Dans la mesure o on ne prvoit pas de tests de rejet des valeurs atypiques mais quon laisse
lutilisateur la libert de supprimer des valeurs juges atypiques, il est possible de dboucher
sur un plan dexprience dsquilibr. Cette situation ne correspond plus aux
recommandations de la norme ISO 5725. Cependant, un algorithme alternatif est prsent
pour viter des pertes de donnes.
Si le nombre ni de rptitions nest pas le mme pour toutes les sries dun mme niveau,
utiliser la formule (6) au lieu de la (4) pour le calcul la variance inter-sries :
SCEB
( I 1) sr2
sB2 = I 1 (6)
N*
I

n 2
i
N* = N i =1
I
Avec N et N = ni
i =1

Utiliser les formules classiques pour les autres critres de fidlit.


Une autre alternative cette mthode de calcul consiste utiliser un algorithme destimation
des variances utilisant la mthode du maximum de vraisemblance restreint (REML) ; elle
disponible dans la plupart des logiciels statistiques spcialiss, comme R.

2. Conduite des calculs


2.1 Exemple de construction dun profil dexactitude

Diffrents exemples de calcul sont disponibles dans la littrature (Feinberg M., 2009 -
Commission SFSTP 2003, 2006). Lexemple prsent porte sur une mthode de dosage du
nicotinamide (vitamine B3) dans le lait par HPLC avec une dtection fluorimtrique. Cest
une mthode indirecte qui ncessite un talonnage pour raliser la quantification. Les 10
tapes de la procdure se droulent ainsi.

Numro spcial 2010


47
Validation des mthodes

1. Choix du domaine et des limites dacceptabilit. Le domaine de validation va


de 0,4 4 mg/l. Les limites dacceptabilit sont fixes 10 % autour de la valeur cible et
choisies aprs discussion avec lutilisateur. La proportion est gale 80 % et choisie de
la mme faon.
2. Matriau de validation et fixation des valeurs cible. Le matriau de validation choisi est un
lait UHT qui ne contient pas la vitamine recherche afin de pouvoir fixer les valeurs cible
par dopage avec des ajouts doss.
3. Plan de validation (tableau 1). Le plan de validation est form de I = 3 sries (jours) avec
K = 3 niveaux de concentration et J = 3 rptitions par jour et par niveau, ce qui fait un
total de 3 3 3 = 27 essais. Les concentrations des valeurs de rfrence sont exprimes
en mg/L et les rponses en surfaces de pic. Les niveaux varient de 1 K et sont cods A, B
et C et les sries de 1 I et sont codes, Jour1, Jour 2 et Jour 3.

Tableau 1 : plan de validation (mesures exprimes en units de surface de pic)


Niveau Valeur de Srie Rptition Rptition Rptition
rfrence 1 2 3
Jour 1 22.6 22.1 22.4
A 0.40 Jour 2 23.3 24.1 23.9
Jour 3 23.8 23.6 23.5
Jour 1 135.0 135.1 129.9
B 2.0 Jour 2 137.6 135.2 138.8
Jour 3 136.3 135.1 134.4
Jour 1 275.2 276.9 261.3
C 4.0 Jour 2 268.1 269.7 276.9
Jour 3 271.6 273.3 275.0

4. Plan dtalonnage (tableau 2). Le plan dtalonnage comporte I = 3 sries (jours) pour K
= 2 niveaux de concentration et J = 2 rptitions par jour et par niveau, soit un total de 12
essais. Les deux niveaux sont cods Bas et Haut.

Tableau 2 : plan dtalonnage (mesures exprimes en units de surface de pic)


Niveau Srie Concentration Rptition 1 Rptition 2
Bas Jour 1 0.4 22.7 23.1
Jour 2 0.4 22.9 23.2
Jour 3 0.4 21.9 22.1
Haut Jour 1 4.0 281.6 275.3
Jour 2 4.0 275.3 274.6
Jour 3 4.0 272.0 273.0
5. Estimation des coefficients des modles dtalonnage (tableau 3). Le modle choisi est une
droite du type Y = a0 + a1X + e, o a0est le blanc, a1 la sensibilit et e une erreur alatoire.
La mthode de calcul est la mthode de rgression aux moindres carrs. Un modle est
calcul pour chaque jour.

Le Cahier des Techniques de lInra


48
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Tableau 3 : estimations des paramtres des modles en fonction des sries


Srie Sensibilit a1 Blanc a0
Jour 1 70.986 -5.494
Jour 2 69.972 -4.939
Jour 3 69.583 -5.833

6. Calcul des concentrations prdites inverses et calcul de la justesse (tableau 4). partir des
coefficients du tableau 3 et des mesures des surfaces de pic des chantillons de validation
rassembles au tableau 1, calculer les concentrations prdites inverses de chaque rptition
en prenant soin dutiliser les modles obtenus pour chaque srie.

Tableau 4. Concentrations retrouves par prdiction inverse partir des donnes du plan de
validation (exprimes en mg/l)
Srie Niveau Concentration X Rponse Y Retrouve Z Biais absolu Biais relatif
Jour 1 A 0.40 22.6 0.40 -0.004 -1.06%
Jour 1 A 0.40 22.1 0.39 -0.011 -2.82%
Jour 1 A 0.40 22.4 0.39 -0.007 -1.76%
Jour 2 A 0.40 23.3 0.40 0.004 0.89%
Jour 2 A 0.40 24.1 0.42 0.015 3.75%
Jour 2 A 0.40 23.9 0.41 0.012 3.04%
Jour 3 A 0.40 23.8 0.43 0.026 6.47%
Jour 3 A 0.40 23.6 0.42 0.023 5.75%
Jour 3 A 0.40 23.5 0.42 0.022 5.39%
Jour 1 B 2.00 135.0 1.98 -0.021 -1.04%
Jour 1 B 2.00 135.1 1.98 -0.019 -0.97%
Jour 1 B 2.00 129.9 1.91 -0.093 -4.63%
Jour 2 B 2.00 137.6 2.04 0.037 1.85%
Jour 2 B 2.00 135.2 2.00 0.003 0.14%
Jour 2 B 2.00 138.8 2.05 0.054 2.71%
Jour 3 B 2.00 136.3 2.04 0.043 2.13%
Jour 3 B 2.00 135.1 2.03 0.025 1.27%
Jour 3 B 2.00 134.4 2.02 0.015 0.77%
Jour 1 C 4.00 275.2 3.95 -0.046 -1.14%
Jour 1 C 4.00 276.9 3.98 -0.022 -0.55%
Jour 1 C 4.00 261.3 3.76 -0.242 -6.04%
Jour 2 C 4.00 268.1 3.90 -0.098 -2.45%
Jour 2 C 4.00 269.7 3.92 -0.075 -1.88%
Jour 2 C 4.00 276.9 4.03 0.028 0.70%
Jour 3 C 4.00 271.6 3.99 -0.013 -0.32%
Jour 3 C 4.00 273.3 4.01 0.011 0.29%
Jour 3 C 4.00 275.0 4.04 0.036 0.90%

7. Calculer les biais individuels. On observe que les biais individuels varient entre -6.04% et
6.47% et permettent didentifier les mesures ventuellement atypiques. Aucune donne
atypique na t identifie.

Numro spcial 2010


49
Validation des mthodes

8. Calcul des donnes de fidlit et des intervalles de tolrance. Calculer les critres de
fidlit, comme dcrit dans le 1et les limites des intervalles de tolrance selon la mthode
dcrite dans Feinberg M. (2010b). Rassembler les valeurs trouves dans un tableau
rcapitulatif organis comme le tableau 5.

Tableau 5 : tableau rcapitulatif des critres de validation et des lments du profil dexactitude
Probabilit tolrance () 80%
Limite d'acceptabilit () 10%
Niveaux Niveau A Niveau B Niveau C
Concentration moyenne thorique 0.4 2.0 4.0
Concentration moyenne retrouve 0.409 2.005 3.953
Fidlit
cart-type de rptabilit (sr) 0.004 0.030 0.081
cart-type inter-sries (sB) 0.015 0.039 0.033
cart-type de fidlit (sFI) 0.016 0.049 0.087
Coefficient de variation de fidlit 3.90% 2.45% 2.21%
Justesse
Biais (%) 2.18% 0.25% -1.17%
Intervalle de tolrance
Nombre de degrs libert 2.197 3.374 6.826
Facteur de couverture (kIT) 1.837 1.599 1.419
cart-type de tolrance (sIT) 0.018 0.055 0.093
Limite intervalle tolrance basse 0.375 1.917 3.821
Limite intervalle tolrance haute 0.442 2.093 4.086
Limite d'acceptabilit basse 0.3600 1.8000 3.6000
Limite d'acceptabilit haute 0.4400 2.2000 4.4000
Profil d'exactitude
Recouvrement % 102.2% 100.2% 98.8%
Limite intervalle tolrance basse en % 93.8% 95.9% 95.5%
Limite intervalle tolrance haute en % 110.6% 104.6% 102.2%
Limite d'acceptabilit basse en % 90.0% 90.0% 90.0%
Limite d'acceptabilit haute en % 110.0% 110.0% 110.0%

9. Construction du profil dexactitude. Construire le graphique correspondant au profil en


slectionnant les valeurs de la ligne Concentration moyenne thorique en abscisse et les
valeurs des 5 lignes sous le titre Profil d'exactitude en ordonnes. On obtient ainsi la
figure 1.
10. Interprtation. On observe que les limites de tolrance 80 % sont comprises entre les
limites dacceptabilit dans un domaine de validit stend de 0,5 mg/l environ 4,0 mg/,.
la mthode est valide dans ce domaine. La limite infrieure (limite de quantification) sera
calcule, si ncessaire, de faon plus exacte comme dcrit dans la section 3. Par ailleurs, on
constate que, dune part la fidlit varie en fonction de la concentration puisque son
coefficient de variation passe de 3,9 2,2 %, dautre part, la justesse varie aussi puisque le
biais de justesse varie de + 2,2 1,2 %. Cette remarque souligne lintrt de procder aux
calculs niveau par niveau. Cependant, ce biais na pas dinfluence importante sur la
validit de la mthode.

Le Cahier des Techniques de lInra


50
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

115% Recouvrement % Limite intervalle tolrance basse en %


Limite intervalle tolrance haute en % Limite d'acceptabilit basse en %
Limite d'acceptabilit haute en %

110%

105%
Recouvrement (%)

100%
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

95%

90%

85% Concentration

Figure 1 : profil dexactitude pour le dosage de la vitamine B3 dans le lait par HPLC

11. Conclusion. On peut donc conclure la capacit de la mthode quantifier exactement le


nicotinamide dans le lait sur le domaine de validit ainsi dfini.

2.2 Utilisation dun logiciel


Les calculs peuvent tre raliss en utilisant diffrents logiciels, comme Excel, OpenOffice ou
R. Excel est une marque commerciale de Microsoft. OpenOffice.org est un projet Open
Source qui dveloppe une suite bureautique libre de droits, compatible avec les autres
standards du march et qui est tlchargeable partir de http://www.openoffice.org/. R est un
environnement de calcul statistique disponible sous la forme dun logiciel libre tlchargeable
partir de http://cran.cict.fr/index.html.
La feuille de calcul suivante permet de calculer les critres de fidlit, de justesse et les
limites de tolrance pour un niveau dans un tableur. Elle est extraite dun fichier modle qui
peut tre tlcharg partir :
http://www.paris.inra.fr/metarisk/downloads/software_programs/excel_templates.
Elle est utilisable sous Excel ou OpenOffice. Les donnes utilises sont celles du niveau A de
lexemple.

Numro spcial 2010


51
Validation des mthodes

A B C D E F G
1 Niveau A
2 Concentration moyenne thorique 0.4000
3 Sries Rptition 1 Rptition 2 Rptition 3 ni SCEi
4 Jour (Srie) 1 0.396 0.389 0.393 3 0.00003
5 Jour (Srie) 2 0.404 0.415 0.412 3 0.00007
6 Jour (Srie) 3 0.426 0.423 0.422 3 0.00001
7
8 Nombre de sries (I) 3.0000 =NB(B4:B6)
9 Nombre de mesures (IJ) 9.0000 =NB(B4:D6)
10 Nombre de rptitions (J) 3.0000 =SI(F4*B8<>B9;"Calcul impossible";F4)
11 SCE rsiduelle 0.00011 =SOMME(G4:G8)
12 SCE totale 0.00156 =SOMME.CARRES.ECARTS(B4:D6)
13 SCE inter-sries 0.00145 =B12-B11
14 Calcul intermdiaire de sB 0.00024 =((B13/(B8-1))-B15)/B10
15 Variance de rptabilit (sr) 0.00002 =B11/(B9-B8)
16 Variance inter-sries (sB) 0.00024 =SI(B14<0;0;B14)
17 Variance de fidlit (sFI) 0.00025 =SOMME(B15:B16)
18 Fidlit
19 Concentration moyenne retrouve 0.40873 =MOYENNE(B4:D6)
20 Ecart-type de rptabilit (sr) 0.00419 =RACINE(B15)
21 Ecart-type inter-sries (sB) 0.01536 =RACINE(B16)
22 Ecart-type de fidlit (sFI) 0.01592 =RACINE(B17)
23 Justesse
24 Biais (%) 2.18% =B19/B2-1
25 Facteur de couverture de l'intervalle de tolrance
26 Rapport des variances (R) 13.40469 =B16/B15
27 Coefficient B 0.34951 =(B26+1)/(B10*B26+1)
28 Nombre de degrs libert 2.19709 =(B26+1)^2/((B26+1/B10)^2/(B8-1)+(1-1/B10)/B9)
29 Probabilit tolrance (bta) 80%
30 t Student bas 1.88562 =LOI.STUDENT.INVERSE(1-B29;ARRONDI.INF(B28;0))
31 t Student haut 1.63774 =LOI.STUDENT.INVERSE(1-B29;ARRONDI.SUP(B28;0))
32 Facteur de couverture (kIT) 1.83676 =B30-(B30-B31)*(B28-ARRONDI.INF(B28;0))
33 Ecart-type de tolrance (sIT) 0.01828 =B22*RACINE(1+1/(B9*B27))
34 Intervalle de tolrance
35 Limite intervalle tolrance basse 0.37516 =B19-B33*B32
36 Limite intervalle tolrance haute 0.44230 =B19+B33*B32

Afin de faciliter la mise en uvre, les principales formules, telles que saisies, sont indiques
dans la colonne C et se rfrent au contenu de la colonne B.
En ce qui concerne ltalonnage et le calcul des modles, il suffit dutiliser la fonction de
rgression DROITEREG pour trouver les paramtres. Lorganisation de la feuille doit tenir
compte du fait quon calcule un modle par srie.

3. Critres de validation complmentaires

3.1 Limite de quantification

Principe
Sur la figure 1 on note quil existe une concentration partir de laquelle au moins une des
bornes de lintervalle de tolrance coupe une des limites dacceptabilit. Au-dessus de ce
seuil, lanalyste peut garantir que la mthode produira une proportion de rsultats au moins
gale . Selon les rgles de dcision proposes, la mthode est donc valide puisquelle
permet de garantir les objectifs fixs. En revanche, en dessous de ce seuil, il nest plus

Le Cahier des Techniques de lInra


52
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

possible de conclure la validit. Tout naturellement, on peut proposer de dfinir ce seuil


comme la limite de quantification (LQ) de la mthode. Si on se rfre lexemple de la
figure 1, la LQ se situerait entre les niveaux A et B.
Lorsquil est ncessaire davoir une trs bonne estimation de la limite de quantification, il est
judicieux dutiliser un plan de validation avec au minimum K = 4 niveaux. Les deux niveaux
les plus bas (nots ici A et B) doivent alors tre choisis de faon encadrer au plus prs la LQ
suppose. Linterpolation sera alors dautant plus exacte que cet encadrement sera troit.
La LQ peut tre obtenue exactement en calculant labscisse du point dintersection. Mais les
calculs doivent tre raliss sur les valeurs absolues des limites dacceptabilit et de tolrance
car le fait de passer aux valeurs relatives, utilises en pratique pour la reprsentation
graphique du profil, introduit une interpolation hyperbolique. En effet, le calcul des
coordonnes du point dintersection de deux droites est un problme dalgbre bien connu.
Pour calculer la LQ entre deux niveaux nots A et B, les notations suivantes sont utilises :
Z les valeurs absolues lues sur laxe des ordonnes ;
X les valeurs de rfrence fournies par laxe des abscisses ;
xA et xB les abscisses des deux niveaux A et B ;
xAt et xBt les ordonnes sur la limite suprieure (ou infrieure) de lintervalle de tolrance
;
xAa et xBa les ordonnes sur la limite suprieure (ou infrieure) dacceptabilit ;
xLQ labscisse du point dintersection, avec LQ = xLQ.
Les deux droites peuvent tre reprsentes laide dun systme de deux quations, dont la
premire traduit la limite de lintervalle de tolrance (paramtres t0 lordonne lorigine et t1
la pente) et la seconde la limite dacceptabilit (paramtres a0 et a1) :
Z = t0 + t1 X
(7)
Z = a0 + a1 X
On peut noter que :
a0 doit tre gal 0 puisque la limite de lintervalle dacceptabilit passe toujours par le
zro.
Si on cherche lintersection avec la limite suprieure dacceptabilit z At = x A (1 + ) ; il
faudra prendre 1 si on recherche lintersection avec la limite infrieure.
Pour obtenir la pente t1, on utilise une rgle de trois :
z Bt z At
t1 = Pente (8)
xB x A
Pour lordonne lorigine t0, on lobtient partir de la premire quation du systme (7) :
t0 = z At x A t1 Origine (9)
De faon symtrique :
z Ba z Aa
a1 =
xB x A
a0 = z Aa xA a1

Numro spcial 2010


53
Validation des mthodes

Pour rsoudre ce systme dquations, poser :


t0 + t1 X = a0 + a1 X
X (t1 a1 ) = a0 t0
On obtenir ainsi la valeur de xLQ :
a0 t0
xLQ = (10)
t1 a1
Exemple de calcul avec un tableur
Pour illustrer la mthode, on va prendre en compte les rsultats de lexemple obtenus pour les
niveaux A (0,4 mg/l) et B (2,0 mg/l), puisque cest entre ces niveaux que la borne suprieure
de lIT coupe la limite suprieure dacceptabilit. Ce sont les valeurs absolues qui vont servir.
La figure 2 dcrit le mode de calcul sur les valeurs absolues et comment cette opration
correspond une interpolation hyperbolique sur les donnes relatives. Pour illustrer le calcul
dans un tableur, les lignes utiles ont t slectionnes dans le tableau 5.

Ligne Niveau A Niveau B


Concentration moyenne thorique 0,40 2,00
Limite intervalle tolrance haute 0,442 2,093
Limite d'acceptabilit haute 0,440 2,200

La feuille de calcul suivante donne les formules de calcul dans un tableur.


A B C D E
2 Niveau A Niveau B
3 Concentration moyenne thorique 0.40 2.00
4 Limite intervalle tolrance haute 0.442 2.093
5 Limite d'acceptabilit haute 0.440 2.200
6 Formules
7 Droite Pente Origine Pente Origine
8 Intervalle tolrance (U) 1.032 0.030 =(C4-B4)/(C3-B3) =B4-B8*B3
9 Limite d'acceptabilit haute 1.100 0.000 =(C5-B5)/(C3-B3) =B5-B9*B3
10
11 Limite de quantification 0.4337 =(C9-C8)/(B8-B9)

Les formules utilises sont indiques dans les colonnes D et E. Finalement, la LQ vaut 0,434 mg/l.
Bien sr, la limite de quantification dpend des valeurs choisies des limites dacceptabilit et
de la proportion . Si ces deux critres nont pas pu tre fixs lavance par manque de
consignes ou de rglementation, mais si une LQ limite est attendue, par exemple pour un
contrle rglementaire, il est possible de les calculer en retour en se fixant une LQ prtablie.
Ce mode de calcul inverse se dduit directement des formules fournies.

Le Cahier des Techniques de lInra


54
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Niveau B Niveau A
Z% Niveau B
Z
Niveau A
2.0 110%

109%
1.5
108%
1.0
107%
0.5
106%
LQ X LQ X
0.0 105%
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

chelle absolue chelle relative


Figure 2 : illustration du mode de calcul de la limite de quantification

3.2 Limite de dtection


La mthode du profil dexactitude ne propose pas dapproche spcifique pour le calcul de la
LD, par contre on peut sappuyer sur les donnes recueillies pour construire le profil
dexactitude en se rfrant diverses approches, dont la liste suivante nest pas exhaustive :
le guide EURACHEM (disponible sur le site www.lne.fr)
la srie des normes ISO 11843
les approches proposes dans lInternational conference on harmonisation (ICH),
savoir :
1 - examen visuel. Applicable aux mthodes non instrumentales ou instrumentales.
2 - rapport signal sur bruit. Cette approche nest possible que lorsquon peut
observer la ligne de base de la mthode. La dtermination du rapport signal sur
bruit est effectue en comparant les signaux obtenus sur des chantillons de faibles
concentrations avec ceux dchantillons blancs. On estime quun rapport entre 3/1
et 2/1 est gnralement satisfaisant pour estimer la limite de dtection.
3.3 Calcul dun facteur de correction
Le calcul dun facteur de correction nest possible que sous deux conditions :
il nexiste pas de contrainte rglementaire qui interdise de corriger les rsultats avant de
les renvoyer au demandeur danalyse. Le demandeur danalyse est alors inform du fait
que le rsultat final est corrig.
lanalyste procde un examen dtaill des mesures collectes lors de ltude de
validation afin de dterminer la nature du biais systmatique afin de choisir un facteur
de correction appropri.
Si on observe un biais systmatique important d un taux de recouvrement moyen infrieur
ou suprieur 100 %, on peut alors proposer dappliquer un facteur de correction sur les
rponses instrumentales, pour corriger ce biais systmatique. Par exemple, si on considre que
le taux de recouvrement moyen dans tout le domaine est 70 %, on peut prendre un facteur
1/0,7 1,4 et lappliquer tous les rsultats.

Numro spcial 2010


55
Validation des mthodes

4.5

4.0
Concentration retrouve Z (mg/L)

3.5

3.0

2.5
Z = 0.52X + 0.02
2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
Valeur de rfrence X (mg/L)

Figure 3 : reprsentation des concentrations retrouves en fonction des valeurs de rfrence permettant
de mettre en vidence un effet de matrice et de calculer une droite moyenne de recouvrement

Une mthode plus exacte consiste reporter sur un graphique les concentrations retrouves en
fonction des valeurs de rfrence. La figure 3 montre comment mettre en vidence un effet de
matrice. On peut alors calculer, sous la forme dune droite de rgression au moindres carrs,
lquation dune droite dont la pente reprsente un taux moyen de recouvrement et lordonne
lorigine un biais systmatique. Elle permet ainsi de dfinir deux facteurs de correction
possibles :
linverse de la pente permet de corriger un taux de recouvrement non satisfaisant. Dans
lexemple on prendra 1/0,52 2.0 ;
lordonne lorigine permet de corriger un biais systmatique, par exemple gnr par
lintgration dun pic mal rsolu en chromatographie. Dans lexemple ce type de biais
nest pas important et ne sera pas pris en compte.
Le facteur de correction choisi sera alors inclus dans le mode opratoire de la mthode, par
exemple, dans la partie relative lexpression du rsultat. Afin de vrifier la pertinence du
facteur de correction choisi, il suffit de recalculer le profil dexactitude avec les donnes
corriges. Cependant, pour assurer lindpendance des mesures, il est prfrable dutiliser
deux chantillons de validation et de raliser lensemble des plans dexprience en parallle.
La figure 4 illustre leffet du facteur de correction 2,0. Lchantillon A dont les mesures nont
pas t corriges produit un profil dexactitude qui mne conclure que la mthode nest pas
valide. En revanche, les mesures faites sur un deuxime chantillon B puis corriges par 2,0,
conduisent la conclusion que la mthode est valide si les rsultats sont corrigs.

Le Cahier des Techniques de lInra


56
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

140%
chantillon B corrig
130%

120%

110%

100%
Recouvrement %

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0


90%

80%

70% chantillon A non corrig

60%

50%

40%

30%
Concentration thorique (mg/L)

Figure 4 : illustration de lintrt du facteur de correction pour valider une mthode

Cette approche est volontairement empirique et ne fait pas appel des tests de signification de
la pente ou de lordonne lorigine.

3.4 Contribution au calcul de lincertitude


Cette section propose une faon destimer une part, souvent importante, de lincertitude-type
compose. Elle est obtenue partir des donnes de validation mais ne remplace pas
lapplication dune procdure exhaustive destimation de lincertitude, telle que dcrite dans
diffrents fascicules de documentation (Afnor, FD X07-021:1999 et FD V03-116:2001). En
particulier, il reste indispensable dtablir la liste des principales sources dincertitude et de
lorganiser sous la forme dun diagramme causes/effets. Le principe de lapproche propose
consiste sappuyer sur le modle dcrit dans le fascicule de documentation ISO/TS 21748.
Ainsi, pour un niveau de concentration donn on va crire que lincertitude-type leve au
carr vaut :
u 2 ( Z ) = u 2 ( D) + sFI2
Avec Z la valeur du mesurande et D le biais absolu moyen. Si on nglige les incertitudes sur
la valeur de rfrence et dautres sources dincertitude ventuelles, on dmontre que (pour
plus de dtails, voir (Feinberg M., 2009) :

2 1
sFI 1 sr2
u ( D) = I
J

Numro spcial 2010


57
Validation des mthodes

En rorganisant les calculs, on trouve :


1
u (Z ) = sFI 1 + (11)
IJB
Avec
R +1
B=
J R +1 sB2
et R =
sr2
On remarquera alors que la formule (11) est identique celle de lcart-type de lintervalle de
tolrance fourni dans Feinberg (2010b). On peut ainsi conclure que lcart-type de lintervalle
de tolrance sIT permet destimer les composantes de lincertitude lies, par exemple :
au modle dtalonnage ;
lenvironnement du laboratoire ;
aux oprateurs ;
la manipulation et au stockage des chantillons lors de leur sjour dans le laboratoire, etc.
Cette liste nest pas exhaustive et dpend beaucoup des conditions de fidlit intermdiaire
choisies pour raliser les essais. Cependant, elle ne prend pas en compte lincertitude sur les
valeurs de rfrence qui correspond ce quon appelle la traabilit des mesurages.

Bibliographie
AFNOR Norme NF ISO 5725-2:1994, Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure Partie 2 : Mthode de base pour la dtermination de la rptabilit
et de la reproductibilit d'une mthode de mesure normalise. Afnor, Paris
AFNOR Norme NF X 06-041, Application de la statistique Fidlit des mthodes d'essai
Dtermination de la rptabilit et de la reproductibilit d'une mthode d'essai
normalise par essais inter-laboratoires. Afnor, Paris
AFNOR Norme FD X07-021:1999 Normes fondamentales - Mtrologie et applications de la
statistique - Aide la dmarche pour l'estimation et l'utilisation de l'incertitude des mesures
et des rsultats d'essais, Afnor, Paris
AFNOR Norme FD V03-116:2001 Analyse des produits agricoles et alimentaires - Guide
d'application des donnes mtrologiques, Afnor, Paris
FD ISO/TS 21748 :2004. Lignes directrices relatives l'utilisation d'estimations de la
rptabilit, de la reproductibilit et de la justesse dans l'valuation de l'incertitude de
mesure, ISO, Genve
Feinberg M., (2009) Labo-Stat : Guide de validation des mthodes danalyse Lavoisier
Tec&Doc, Paris
Feinberg M. (2010a) Principes et vocabulaire in Validation des mthodes danalyse
quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra, numro
spcial : 13-26

Le Cahier des Techniques de lInra


58
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Feinberg M. (2010b) Mise en uvre du profil dexactitude in Validation des mthodes


danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 27-44
Commission SFSTP, P. Hubert, J.J. Nguyen-Huu, B. Boulanger, E. Chapuzet, P. Chiap,
N. Cohen, P.A. Compagnon, W. Dew, M. Feinberg, M. Lallier, M. Laurentie, N. Mercier,
G. Muzard, C. Nivet, L. Valat ; Validation des procdures analytiques quantitatives :
Harmonisation des dmarches.
Partie I. : STP Pharma Pratiques (2003) 13:3, 101-138
Partie II. : Statistiques, STP Pharma Pratiques (2006) 16:1, 30-60
Partie III : Exemples d'application, STP Pharma Pratiques (2006) 16:2, 87-121
ISO 11843-2 :2004 Capabilit de dtection. Cas du modle dtalonnage linaire, ISO Genve

Numro spcial 2010


59
Validation des mthodes

Le Cahier des Techniques de lInra


60
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Complments sur la quantification des rsultats


pondration et transformation

Michel Laurentie1

Rsum : La pondration ou la transformation des donnes sont des outils ncessaires


leur exploitation statistique. Pondrer ou transformer des donnes repose sur la ncessit de
stabiliser la variance. En effet, un principe thorique pour lutilisation de la rgression selon
le critre des moindres carrs impose que les variances soient homognes, cest dire quelles
soient indpendantes du niveau des concentrations. Cet article dcrit ces outils et montre au
travers un exemple leur impact sur la validation des mthodes.

Mots-Cls : pondration, transformation, validation, profil dexactitude, mthodes


danalyse quantitatives

Problmatique

De nombreux logiciels de chromatographie permettent de calculer les critres de performance


d'une mthode analytique. En particulier, ils proposent des modles dtalonnage (fonction de
rponse) permettant de lier la rponse aux diffrents niveaux de concentration. Bien souvent
ces logiciels proposent systmatiquement un facteur de pondration.
La pondration est un des moyens de respecter une rgle fondamentale dans l'analyse
statistique de donnes : l'homognit des variances.
Une autre approche pour respecter cette rgle est celle de la transformation des donnes qui
est plus rarement utilise par les analystes car elle est souvent assimile une modification
des donnes qui ne semble pas justifie. l'inverse dans dautres disciplines telles que la
microbiologie cette approche est systmatique (transformation logarithmique pour analyser
les comptages bactriens).
La question est alors la suivante : quand faut-il pondrer ou utiliser des donnes
transformes ?

1. Quand faut-il agir ?


Dans une gamme de concentration, la variance des rponses peut varier en fonction de la
concentration, d'autant plus que l'intervalle de gamme est important (Mac Taggart D.L. et
Farwell S.O., 1992). On dit alors que la variance nest pas homogne.
Gnralement la variance est plus large aux extrmits du domaine qu'en son milieu. La
Figure 1 illustre cette observation.

1
Unit de pharmacocintique-pharmacodynamie - AFSSA F-35302 Fougres cedex- m.laurentie@afssa.fr

Numro spcial 2010


61
Validation des mthodes

Variance maximale
Variance de la rponse

Variance minimale

Concentration

Figure 1 : reprsentation de lvolution de la variance des rponses


en fonction du niveau de concentration

La reprsentation graphique de la variance de la rponse en fonction de la concentration nest


pas fournie dans les logiciels de chromatographie, mais cette observation peut tre galement
visualise sur une droite dtalonnage (figure 2).
Rponse

Concentration

Figure 2 : volution des rponses en fonction du niveau des concentrations, reprsente par
rapport une courbe dtalonnage

Une autre possibilit pour valuer limpact de la variance sur le modle dtalonnage est
lutilisation du graphique des rsidus. Le rsidu est la diffrence entre la valeur observe et la
valeur prdite (quation 1)
quation 1
Avec Yobs la valeur observe, la valeur calcule par le modle dtalonnage e.g.un
modle linaire.
Si la rpartition des rsidus est homogne dans lintervalle des concentrations, il est conclu
la validit du modle et lhomognit des variances par niveau des concentrations. Si au

Le Cahier des Techniques de lInra 62


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

contraire les rsidus paraissent structurs, i.e. que distribution suit une courbe particulire
(droite par exemple) ou si la distribution des rsidus montre une variabilit importante ou une
forme particulire, par exemple, en trompette, il y a htrognit des variances et par
consquent il est conclut la non validit du modle. Ceci est illustr sur les figures 3A et 3B.

A
Rsidu

Concentration

B
Rsidu

Concentration

Figure 3 : (A) rpartition des rsidus pour un modle dtalonnage pour lequel la variance
des rponses est homogne.
(B) rpartition des rsidus pour un modle dtalonnage pour lequel les variances
des rponses sont non homognes (forme dite en trompette).

La connaissance de la variance, chaque niveau de concentration, est donc primordiale pour


tablir correctement le modle dtalonnage ; ceci implique que le schma exprimental doit
tre rigoureux, avec en particulier, un nombre suffisant de rptition pour valuer la variance
aux extrmits du domaine de dosage.
Cette analyse graphique peut-tre complte par une analyse statistique base sur lutilisation
de tests tel que les tests de Cochran ou de Levne (Hubert Ph. et al., 1999). Ces test sont
largement dcrits dans la littrature et ne seront pas dcrits dans cet article. Toutefois il

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Validation des mthodes

convient de prciser que ces tests sont des drapeaux pour indiquer lhtrognit des
variances et non des tests pour liminer des niveaux de concentration qui seraient dits
aberrants.

2. La stabilisation des variances


Si une htrognit des variances est observe, il convient de la prendre en compte. Deux
approches sont possibles : la pondration ou la transformation des donnes.

2.1 La transformation des donnes

La transformation des donnes permet de stabiliser la variance. Les plus utilises sont les
logarithmes ou les racines carres.
Dans le cas de lutilisation de la transformation, logarithmique le modle utilis scrit :
quation 2
Ou le logY est le logarithme nprien de la rponse Y et logC le logarithme nprien de la
concentration.
Les techniques de rgression sont alors utilises comme pour une rgression classique, en
particulier lutilisation des moindres carrs. Lobservation des rsidus doit montrer une
stabilisation des variances. Dans ce cas le modle de fonction de rponse utilise en routine
implique de transformer les rponses avant de calculer les concentrations en retour.
La deuxime approche est lutilisation de la pondration.

2.2 La pondration

Le principe de la pondration est simple. Pour chaque niveau de concentration d'un intervalle
de dosage, la variance n'est pas proportionnelle la concentration. Ceci implique de donner
un poids chaque niveau de concentration pour corriger le manque de proportionnalit.
Prenons le cas d'une rgression linaire de type (Tomassone R., Lesquoy E., Miller C., 1983) :
quation 3
Avec Y la rponse, a et b les coefficients de la droite de rgression.
Lors d'une estimation des paramtres a et b nous cherchons minimiser la diffrence entre les
valeurs calcules et les valeurs estimes ce qui se traduit par l'quation

quation 4
Avec SCE : somme des carres des carts entre la nime observation Yi et lestimation par
la droite de rgression.
La prise en compte du poids (wi) se fera par l'introduction d'un facteur dans lquation 4.

quation 5
La slection de la valeur du poids peut se faire graphiquement. Sur la figure 4, les diffrentes
relations entre la variance des rponses et les niveaux de concentration sont reprsentes.

Le Cahier des Techniques de lInra 64


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Plusieurs types de relation existent entre la variance et la concentration [4]. A chaque type de
structure il est possible de dfinir un poids (wi pour weighting factor) qui permettra de prendre
en compte linfluence de la variance. Quatre cas sont gnralement observs :
1 - Il ny a pas de relation entre la concentration et la variance (le cas idal) : le
poids wi = 1. En dautres il ny a pas de ncessit de pondrer
2 - la variance varie avec une relation de type 1/X i.e. inversement proportionnelle la
concentration, le poids qui doit tre pris en compte est de la forme wi = 1/C.
3 - la variance varie selon une relation de type 1/X2 i.e. inversement proportionnelle au
carr de la concentration, le poids utiliser est de la forme wi = 1/C2
4 - la relation n'est pas une relation simple entre la concentration et la variance, chaque
variance variant indpendamment du niveau de concentration, le poids wi = 1/S2
avec S2 la variance observe chaque niveau de concentration.
Les cas 2 et 3 sont les plus frquemment rencontrs mais le cas 4, cas le plus difficile, peut
galement s'observer.

Wi=1/C2
Wi=1/C
Rponse

Wi=1

Wi=1/S2

Concentration

Figure 4 : types de relation frquemment observes entre la variance de la rponse et les


niveaux de concentration. Les quatre courbes prsentes correspondent aux quatre cas
dcrits dans le texte

Ce type de graphique peut tre facilement ralis sur une feuille Excel, partir des donnes
obtenues lors de l'tude de validation ou de pr-validation. Il devrait tre un pralable avant
toute analyse statistique car ce graphique permet de visualiser sil faut appliquer une
pondration.
La pondration est applicable quel que soit le modle choisi et l'utilisation dun facteur permet
de minimiser la SCE et donc d'avoir des meilleurs estimateurs pour les coefficients de la
droite de rgression.

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65
Validation des mthodes

3. Exemple

Un exemple dutilisation de la pondration ou de la transformation des donnes est montr


dans lexemple du dosage de lacrylamide.
Lacrylamide est un produit neo-form lors de la cuisson de certains aliments. Il est issu dune
raction de Maillard par combinaison de sucre (i.e. glucose) et de certains acides amins
comme lasparagine. Si de nombreuses tudes documentent la teneur en acrylamide dans les
aliments peu dtudes ont permis den quantifier labsorption aprs ingestion. Une tude de
pharmacocintique, ralise chez le porc doit permettre de dterminer la biodisponibilit de
lacrylamide. Au pralable une mthode analytique est ncessaire pour quantifier dans le
plasma de porc les concentrations en acrylamide. La mthode retenue pour effectuer ce
dosage est une mthode HPLC associe une dtection par spectromtrie de masse (MS). La
gamme tudie varie de 10 5000 ng/ml, compte tenu que nous navons pas dinformation
sur les taux plasmatiques circulants aprs ingestion daliment contenant de lacrylamide.
Deux gammes sont prpares : une gamme standard dtalonnage et une gamme dans du
plasma de porc (standard de validation). 200 l de plasma est ajout 100 l de solution
sature de ZnSO4 puis 1000 l dactonitrile et 100 l de standard interne (acrylamide D5).
Aprs agitation et centrifugation le surnageant est vapor. Llut est repris
avec 200 l dactate dammonium 0,01M pH 6. Le volume dinjection est de 50 l. Les
conditions analytiques utilises sont un dbit chromatographique de 0,2ml/mn travers une
colonne Hypercarb (5 50-2 mm) et une dtection par spectromtrie de masse sur lion
molculaire 72 de lacrylamide. La gamme standard dtalonnage en acrylamide varie de 10
5000 ng/ml et est ralise dans une solution dactate dammonium 0,01M ramene pH 6
avec de lacide formique.
Le plan d'exprience utilis consiste en 5 jours, 6 niveaux et 2 rptitions (5 6 2)
soit 60 essais pour les standards dtalonnage et de validation.
La figure 5 montre lvolution de la variance des rponses en fonction des niveaux de
concentration.

Figure 5 : volution de la variance des rponses en fonction des niveaux de concentrations

La forme de la courbe montre que la variance nest pas homogne sur lintervalle de dosage,
avec une trs forte augmentation pour le niveau de concentration de 5000 ng/ml. Pour

Le Cahier des Techniques de lInra 66


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

stabiliser cette variance il est possible de pondrer soit par 1/C ou par un 1/C2 ou tester la
transformation logarithmique des donnes.
La figure 6 montre la distribution des rsidus obtenue par un modle de rgression linaire
pondre ou non ou appliqu sur des donnes logarithmiques.

Figure 6 : volution des rsidus en fonction des concentrations (A) modle linaire ; (B)
modle linaire pondr (1/C) ; (C) modle linaire pondr (1/C2) ; (D) modle
linaire appliqu aprs transformation logarithmique des donnes

Lobservation des rsidus montre que le modle linaire simple (figure 6A) conduit une
distribution des rsidus en forme de trompette. Ceci implique que le modle ne sera pas trs
performant. La pondration 1/C (figure 6B) diminue cet effet trompette. En revanche la
pondration de type 1/C2 ne modifie pas la distribution des rsidus (figure 6C). Lapplication
du modle linaire sur les donnes transformes (figure 6D) montre une stabilisation de la
variance. Ce modle pourrait tre retenu pour dcrire les donnes.
La figure 7 montre limpact de la pondration et de la transformation sur le profil
dexactitude. En utilisant une fonction de rponse linaire sans pondration ou transformation,
les faibles concentrations prsentent un biais de plus de 40 % (figure 7A). Les profils obtenus
aprs pondration par 1/C ou par 1/C2 ou aprs transformation des donnes sont acceptables.
La pondration 1/C prsente une variabilit moins grande et aprs transformation
logarithmique un moindre biais est observ. Le choix se fera sur lobjectif assign de la
mthode, c'est--dire privilgier le biais ou la fidlit.

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Validation des mthodes

Le Cahier des Techniques de lInra 68


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Figure 7 : profil dexactitude obtenu avec (A) modle linaire, (B) modle linaire avec
pondration (1/C), (C) modle linaire avec pondration (1C2), (D) modle linaire aprs
transformation logarithmique des donnes

Conclusion
La pondration et / ou la transformation des donnes sont des outils qui permettent de
stabiliser la variance. Elle nest pas systmatiquement ncessaire mais elle est un pralable
lutilisation de modle linaire ou non linaire, si la variance des rponses nest pas
homogne sur le domaine des concentrations tudies. Le choix de la pondration ou de la
transformation repose sur des aspects graphiques (rsidus) ou sur la ralisation de tests
statistiques appropris. Dans certains cas difficiles, il faut avoir recours la fois la
pondration et la transformation des donnes. Lutilisation des ces outils optimise le modle
et ainsi dobtenir les meilleurs paramtres descriptifs de la relation rponse / concentration.

Bibliographie

Hubert Ph., Chiap P., Crommena J., Boulanger B., Chapuzet E., Mercier N., Bervoas-Martin S.,
Chevalier P., Grandjean D., Lagorce P., Lallier M., Laparra M.C., Laurentie M., Nivet J.C.
(1999) The SFSTP guide on the validation of chromatographic methods for drug
bioanalysis: from the Washington Conference to the laboratory. Analytica Chimica Acta,
391, 135 -148
Mac Taggart D.L., Farwell S.O. (1992) analysis use of linear regression. Part 1: regression
procedures or calibration and quantitation. J. of the AOAC 75, 594-614
Tomassone R., Lesquoy E., Miller C. (1983) La rgression, nouveaux regards sur une
ancienne mthode statistique. Inra, Actualits scientifiques et agronomiques, p. 180

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Validation des mthodes

Le Cahier des Techniques de lInra 70


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Chapitre II

Application dans les laboratoires lInra

Photo Christophe Maitre/Inra

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Application dans les laboratoires lInra

Le Cahier des Techniques de lInra 72


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

En quoi la connaissance des performances d'une mthode permet-elle


d'optimiser la mise en place d'une exprimentation animale ?

Agns Thomas, Denys Durand et Isabelle Ortigues-Marty1

Rsum : Parmi les programmes de recherche conduits par l'Unit de recherche sur les
herbivores, la mesure des flux de nutriments nergtiques travers le foie ncessite de
dterminer avec exactitude les concentrations sanguines de glucose au niveau des vaisseaux
affrents (veine porte) et effrents (veine hpatique). Les faibles diffrences de concentrations
attendues entre vaisseaux, rendent la mesure de ces concentrations dterminante. Par
ailleurs, la lourdeur en cot et en temps, des exprimentations ralises sur des animaux
cathtriss ne permet pas denvisager plusieurs rptitions de la mme exprimentation.
Aussi, nous avons souhait dterminer les performances de notre mthode de dosage du
glucose (selon la norme V03-110) avant d'tablir le plan exprimental. Nous avons ainsi
montr que selon les exigences que lon se fixe (niveau de probabilit de 0,05 ou 0,01 ;
dosages effectus dans la mme journe ou sur plusieurs jours), le nombre d'animaux
ncessaire pour mettre en vidence dventuelles diffrences significatives entre traitements
variait de 4 10. Cet article reprendra d'aprs cet exemple spcifique, les tapes de
caractrisation d'une mthode de dosage ainsi que l'intrt de l'utilisation des performances
de la mthode pour l'tablissement du plan exprimental.

Mots clefs : caractrisation de mthode, plan exprimental, bilan hpatique, glucose,

1. Introduction
L'unit de recherche sur les herbivores (URH) du centre Inra de Theix, regroupe 172 agents
permanents rpartis dans 8 quipes de recherche, un abattoir exprimental, une quipe de
ressources techniques et administratives et une installation exprimentale. La mission de
l'URH est de contribuer au dveloppement des systmes durables d'levage des herbivores
en accord avec les attentes socitales, c'est--dire conciliant viabilit socio-conomique et
dveloppement rural, respect de l'environnement, qualit des produits et bien-tre
animal. Pour rpondre ces missions, l'URH met en place des projets de recherche faisant
intervenir de plus en plus de partenaires extrieurs (publics, privs ...). Les rsultats obtenus
lissue de ces projets sont valoriss principalement au travers de publications (environ 300 par
an) et d'enseignements (320 heures/an).
Outre le fait que dans le cadre du rfrentiel "Qualit" INRA, les exigences concernant
la fiabilit des rsultats peut ncessiter que nos mthodes soient valides, une autre contrainte
propre notre secteur d'activit nous a conduits rflchir une approche complmentaire de
la "validation de mthode" qu'est la "caractrisation de mthode". Cette approche peut
compltement sintgrer dans les dispositions dj prises dans notre Unit pour rpondre aux
exigences du rfrentiel Inra de niveau 1 (Thomas A. et Durand D., 2009).

1
UR1213 URH - Unit de recherche sur les herbivores - NEM (quipe Nutriments et Mtabolismes) - INRA
F-63122 Saint-Gens-Champanelle 04 73 62 45 43 agnes.thomas@clermont.inra.fr

73 Numro spcial 2010


Application dans les laboratoires lInra

Une grande partie des exprimentations sont conduites sur des animaux (bovins, ovins,
caprins, rongeurs) ce qui implique une approbation de nos protocoles par le comit
d'thique. La charte du comit d'thique nonce en 9 articles (Verschuere B., 2008), prcise
que le scientifique doit avoir employ toutes les stratgies dbouchant sur une utilisation dun
nombre rduit et adquat d'animaux pour obtenir des donnes suffisantes permettant de
rpondre une question de recherche.
Nous allons montrer, travers un exemple extrait d'une exprimentation conduite sur des
moutons ce qu'apporte la caractrisation de mthodes par rapport aux exigences relatives la
dmarche qualit et celles relatives lthique animale. Nous aborderons successivement les
diffrentes tapes de caractrisation dune mthode en prenant lexemple du dosage du
glucose sanguin ; puis nous montrerons comment nous avons utilis les rsultats de cette
caractrisation dans llaboration du plan exprimental.

2. Contexte exprimental
Les finalits de lquipe Nutriments et Mtabolismes sont damliorer les qualits
nutritionnelles et sensorielles de la viande de ruminant, tout en prservant les performances de
croissance des animaux. Afin datteindre ces objectifs scientifiques, il est ncessaire d'valuer
la rpartition des nutriments entre les tissus et les organes de manire dterminer les tapes
limitantes de l'utilisation mtabolique des nutriments.
Pour valuer la rpartition des nutriments entre organes, il est impratif de mesurer au mieux
la quantit de nutriments qui entre (flux affrent) et qui sort (flux effrent) des organes
d'intrt (Majdoub L. et al., 2003). Pour rpondre cette problmatique, l'quipe a mis en
place une approche chirurgicale permettant de prlever du sang l'entre et la sortie des
organes d'intrt (pose de cathters implants en chronique), et de mesurer les dbits sanguins
des vaisseaux cathtriss (pose de sondes dbimtriques ou dilution de marqueur). Ainsi il
est possible de mesurer des flux de nutriments entre organes et d'en calculer les flux nets au
travers des organes (de production ou captation) au cours de la journe en fonction de
diffrents facteurs de variation (composition de la ration, niveau de production, tat
physiologique de l'animal). Parmi les diffrents nutriments d'intrt, le glucose est lun des
principaux nutriments nergtiques tudi (Ortigues I. et Visseiche A.-L., 1995), cest
pourquoi nous dvelopperons dans cet exemple la caractrisation de cette mthode.

3. Mthode de dosage du glucose

3.1 Principe du dosage

La concentration en glucose est dtermine sur un chantillon sanguin prlev sur


anticoagulant (EDTA ou Hparine de lithium). L'chantillon sanguin est dprotinis
immdiatement pour minimiser la glycolyse qui peut conduire une sous estimation de la
concentration de glucose d'environ 10 20 % (Kunst et al., 1984).
La dprotinisation est ralise en ajoutant 2 volumes d'acide perchlorique 0.6 mol/l dans un
volume de sang frachement prlev. Le surnageant obtenu aprs une centrifugation de 20 mn
4500 tours / mn est rcupr puis conserv -20C jusqu' l'analyse.
La dtermination du glucose sanguin est ensuite ralise sur le surnageant en prsence de
deux enzymes l'hexokinase et la glucose-6-phosphate deshydrognase (G-6-PDH) selon la
mthode dcrite par Bergmeyer et al., (1974).

Le Cahier des Techniques de lInra 74


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Le glucose est phosphoryl par l'adnosine triphosphate (ATP) au cours d'une raction
enzymatique catalyse par l'hexokinase, pour produire du glucose-6-phosphate (G-6-P) selon
lquation :

D - Glucose + ATP G - 6 - P
Hexokinase
+ ADP

Le glucose-6-phosphate est ensuite oxyd en 6-phosphogluconate avec la rduction du NAD+


en NADPH par l'action de la G-6-PDH.

+ +
G - 6 - P + NAD 6 Phosphogloconate +
G-6-PDH
NADPH + H

La quantit de NADPH form est proportionnelle la concentration du glucose prsent dans


l'chantillon et son absorbance est mesure 340 nm.
La quantit de glucose prsent dans les chantillons sanguins, exprim en g/l, est prdite
partir dune quation dtalonnage de type y = ax + b, tablie partir d'une gamme talon.

3. 2 Principe de la caractrisation

Rappel des principes de la caractrisation de mthode


De manire gnrale, la caractrisation d'une mthode sert dmontrer, partir de donnes
exprimentales, que les performances de la mthode permettent de rpondre aux exigences de
l'usage auquel elle est destine (NF ISO 17025, mai 2000). La caractrisation est l'tape
ultime du dveloppement d'une nouvelle mthode analytique avant son application en routine
ce qui suit la logique du cycle de vie d'une mthode d'analyse (figure 1). Elle doit donc tre
ralise lorsque les tapes de mise au point et/ou d'optimisation ont t finalises et que le
mode opratoire ait t rdig (Feinberg M., Septembre 2001).

2 - Dveloppement
1 - Slection

4 Utilisation
en Revalidation
routine
3 - Validation
intra-laboratoire

Figure 1 : cycle de vie d'une mthode d'analyse

La caractrisation d'une mthode d'analyse s'effectue selon une procdure bien dfinie
(protocole de caractrisation) tablie daprs la norme AFNOR V03-110 et les
recommandations de Max Feinberg (Feinberg M., 2001).

75 Numro spcial 2010


Application dans les laboratoires lInra

Les performances dune mthode sont values selon plusieurs critres. Les critres les plus
frquents sont la linarit, la spcificit, la rptabilit, la fidlit intermdiaire, la justesse, la
limite de dtection et la limite de quantification (Feinberg M., 2010a).
Lorsque cette procdure de caractrisation est acheve, l'analyste doit confronter les rsultats
obtenus pour chacun des critres aux exigences dfinies par le chercheur de manire vrifier
que la mthode sera en mesure d'y rpondre. C'est seulement aprs cette tape que la mthode
d'analyse pourra tre utilise en routine.

3. 3 Caractrisation de la mthode

Nous avons choisi, dans le cas du dosage du glucose, de dterminer les performances de la
mthode au travers des critres suivants : linarit, limite de dtection et de quantification et
fidlit.
Les diffrents calculs ont t effectus l'aide d'une application dveloppe sous Excel (A.
Thomas, M. Feinberg, Y. Anglaret et D. Durand - Mars 2000), les tableaux de rsultats tant
pour la plupart issus directement de l'application Excel.

3.3.1 Linarit de la fonction de rponse

Objectif

Dans la mthode que nous avons dveloppe, la quantit de glucose sanguin est obtenue
partir d'une mthode indirecte qui ncessite la mise en place d'un talonnage. La linarit
d'une mthode est sa capacit, l'intrieur d'un certain domaine, fournir des rsultats
directement proportionnels la concentration en analyte doser. Le test de linarit va
permettre de vrifier la validit du modle de rgression et de vrifier le domaine d'talonnage
pour en dduire les caractristiques d'talonnage. Il faut donc choisir a priori le domaine
d'talonnage. Nous avons choisi celui-ci partir des exigences inhrentes
l'exprimentation elle-mme, savoir une plage de concentration variant 0,40 et 0,80g/l.

Organisation

Les exigences de la norme V03-110 prconisent pour mettre en vidence une non-linarit au
risque de 1% de prparer, un minimum de 5 solutions talons et de faire 5 rptitions de
chacune delle. Nous avons choisi de tester 9 niveaux de concentrations analyss
sur 9 journes. Les niveaux de concentrations ont t rpartis rgulirement entre 0 1,6 g/l,
donc encadrant largement la plage de concentration souhaite au dpart (0,40 et 0,80 g/l)
de faon pouvoir utiliser cette mthode dans d'autres situations physiologiques plus
"extrmes" (comme lors d'un stress intense, lors des phases peripartum ).
Les niveaux de concentration ont t prpars par dilutions indpendantes les unes des autres
partir d'une solution mre de glucose 2 g/l (Sigma). L'analyse des 9 niveaux de
concentration a t rpte sur 9 jours partir de solution frachement prpare de manire
viter tout biais systmatique (tableau 1). Les essais ont t organiss en suivant le tableau ci-
dessous :

Le Cahier des Techniques de lInra 76


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Tableau 1 : tableau rcapitulatif de l'organisation des essais conduits en vue de la


dtermination des performances dtalonnage du glucose

Niveaux Sries Concentrations des Rponses instrumentales


(Jours) points de gamme (y) (x)
1 1 0 Y11
... 0 ...
9 0 Y19
2 1 0.2 Y12
... ... ...
9 0.2 Y29
... ... ... ...
9 1 1.6 Y91
... ... ...
9 1.6 Y99

valuation des caractristiques

Aprs ralisation du plan exprimental complet, la premire tape consiste tablir la


fonction de rponse la plus approprie nos donnes. Dans notre exemple, nous avons
dlibrment test le modle linaire, la grande majorit de nos mthodes utilises dans
lunit obissant ce modle. Le modle de rgression que nous avons test tait donc le
suivant :

y = a1 x + a 0
o :
y : la concentration
a1 : la pente
x : la rponse instrumentale (densit optique (DO))
a0 : l'ordonne l'origine

La mthode utilise pour raliser le test de linarit met en uvre un test d'erreur d'adquation
du modle bas sur l'analyse de variance. Ce test consiste dcomposer la somme des carrs
des carts des rponses, en diffrentes SCE, selon l'quation ci-dessous :

SCE y = SCE e + SCE em + SCE reg

o :
SCEreg somme des carrs des carts due la rgression
SCEem somme des carrs des carts due une erreur de modle
SCEe somme des carrs des carts rsiduels

Le test de linarit va permettre de vrifier 2 hypothses :


- le modle choisi est-il acceptable ?
- le domaine d'talonnage est-il jug acceptable, cest dire n'existe-t-il pas une courbure
significative dans le domaine choisi ?

77 Numro spcial 2010


Application dans les laboratoires lInra

Rsultats

Tableau 2 : rsultats du test de linarit du modle dtalonnage

Source de variation Somme Degrs de Variance F calcul F de table de Conclusion


des carrs libert fisher P 0,01
Linarit (SCEl) 15,9516 1 15,95163 21670 7,001 acceptable
Non linarit (SCEnl) 0,0014 7 0,00020 0,269 2,898 acceptable
Rsiduelle (SCr) 0,0530 72 0,00074
Totale (somme) 16,0060 80

Au vu des rsultats statistiques (tableau 2) entre les concentrations 0 et 1,6 g/l, le modle de
rgression choisi est acceptable (F calcul > F limite dtermin partir de la table de Fisher)
et le modle est linaire dans tout le domaine choisi (F calcul < F critique dtermin partir
de la table de Fisher).
A partir de ces donnes ayant permis d'tablir la fonction rponse il est possible de dterminer
les limites de dtection et de quantification.

3.3.2 Limite de dtection et de quantification

Objectif

Il est important pour le chercheur de connatre ces limites qui pourront lui permettre de savoir
partir de quelle concentration il pourra mettre en vidence avec certitude la prsence de
l'analyte recherch (ici le glucose) (limite de dtection) et partir de quelle concentration il
pourra garantir la fiabilit de son rsultat et donc en tirer une interprtation mcanistique
(limite de quantification).

Organisation

Lestimation des limites de dtection et de quantification a t ralise partir des paramtres


obtenus partir du modle linaire de la fonction de rponse.

valuation des limites de dtermination

Les mesures collectes sont utilises pour calculer la sensibilit ou pente (a1) et son cart-type
(sa1), ainsi que le blanc ou ordonne l'origine (a0) et son cart-type (sa0).
Les limites de dtection et de quantification sont dtermines de la faon suivante :

a 0 + 3 Sa 0
Limite de dtection (LD) =
a1

a 0 + 10 Sa 0
Limite de quantification (LQ) =
a1

Le Cahier des Techniques de lInra 78


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Rsultats

Tableau 3 : estimation des limites de quantification et de dtection

Limite de dtection, de quantification


Variance exprimentale X g/l 0,00069
Ecart-type exprimental X g/l 0,02624
Limite de dtection XLD X g/l 0,089
Limite de quantification XLQ X g/l 0,133

Comme nous pouvons le lire dans le tableau 3, la limite de dtection est de 0,089 g/l, la
valeur partir de laquelle nous pouvons garantir la fiabilit de notre mesure (P<0,01) est de
0,133 g/l.

3.3.3 Fidlit

Objectif

Ce test va permettre l'analyste destimer la dispersion associe la mesure (erreur alatoire).


Elle peut tre value dans plusieurs conditions, de rptabilit (intra-srie ou intra-jour), de
fidlit intermdiaire (inter-jours) et de reproductibilit (inter-laboratoires). Dans cette
approche, nous navons trait que les conditions de rptabilit et de fidlit intermdiaire.

Organisation

Afin de rpondre aux besoins de ltude, ce test a t ralis sur la matrice d'intrt, savoir
un chantillon sanguin d'ovin situ dans des conditions physiologiques de base. Cet
chantillon a t trait comme les chantillons exprimentaux c'est--dire qu'aprs
prlvement au niveau de la veine jugulaire, le sang a t dprotinis, aliquot puis conserv
-20C.
Ensuite, un aliquote dchantillon dprotinis a t analys en triple (conditions de
rptabilit) et rpt sur 9 jours (conditions de fidlit intermdiaire). Le nombre de
rptitions intra et inter journe (ou srie) a t dfini en fonction des exigences de la norme
franaise (NF ISO 5725-1, 1994) qui recommande de faire au moins 8 sries dau moins 2
rptitions de lchantillon.

valuation des caractristiques

Ce test utilise comme modle statistique, une analyse de variance un seul facteur effet
alatoire. Cette analyse permet de dterminer lcart-type de rptabilit, de fidlit
intermdiaire ainsi que les limites de rptabilit et de fidlit intermdiaire pour un risque
d'erreur de 5%.

79 Numro spcial 2010


Application dans les laboratoires lInra

Rsultats
Tableau 4 : estimation des critres de fidlit

Tableau 4 : Calculs de la rptabilit et de la Fidlit intermdiaire


Moy gnrale = 0,82
2
Sr = 0,00016
S2 L = 0,00035
2
SR = 0,00051
Sr = 0,013
SR = 0,023
Rptabilit et fidlit intermdiaire CV de rptabilit et de fidlit intermdiaire
r95% = 0,04 CVr = 1,55%
R95% = 0,06 CVR = 2,75%

La mthode enzymatique que nous avons utilise pour doser le glucose sanguin est
caractrise par des coefficients de variation (CV) de rptabilit de 1,55% et de fidlit
intermdiaire de 2,75%.

3.3.4 Conclusion

La mthode slectionne et dveloppe sur du sang ovin permet de dterminer des


concentrations de glucose comprises entre 0,13 g/l et 1,6 g/l avec des performances qui nous
apparaissent comme trs satisfaisantes par rapport aux variations attendues pour la majorit
des tudes conduites dans notre quipe.

Par ailleurs, il apparat important que l'on puisse associer les performances ainsi dtermines
aux besoins spcifiques de certaines exprimentations en particulier dans le cas
d'exprimentation exigeant une trs bonne limite de quantification. Nous allons dans la suite
de cet article illustrer par un exemple d'exprimentation conduite dans notre quipe cette
exploitation des performances d'une mthode.

4. Exemple d'utilisation des caractristiques d'une mthode


ltablissement du plan exprimental

4.1 Objectifs
Lors de la mise en place d'une exprimentation, le chercheur formule une hypothse tester,
pour rpondre une question scientifique labore partir des connaissances disponibles. Il
doit ensuite laborer le protocole exprimental et faire des choix oprationnels les plus
appropris pour tester l'hypothse mise. Pour cela, le chercheur doit slectionner les
variables qu'il voudra mesurer mais galement la mthode de dosage de ces variables. Le
choix des mthodes associes aux variables dpend de leur facilit de mise en uvre, de
l'quipement disponible dans l'quipe, du cot mais peut galement dpendre des
performances exiges. C'est sur ce dernier point que nous allons particulirement insister.

Le Cahier des Techniques de lInra 80


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

4.2 Contraintes lies l'exprimentation

Nous avons dans un premier temps ralis des pr-essais sur des animaux recevant diffrentes
rations alimentaires. Nous avons ainsi mesur les concentrations en glucose dans plusieurs
vaisseaux d'intrt comme laorte, la veine porte, la veine sus-hpatique et la veine iliaque
pour tudier les flux nets de glucose travers le foie, le tube digestif et le train arrire. Nous
avons dtermin les variations de concentrations en glucose au cours de la journe et ceci
pour chacun des vaisseaux et en fonction des diffrents traitements exprimentaux appliqus
aux animaux (niveaux d'nergie variables entre lots). Il est apparu clairement que la diffrence
minimale en glucose entre vaisseaux releve parmi ces traitements exprimentaux tait
voisine de 0,050 g/l soit seulement 8 % des concentrations moyennes habituellement
enregistres chez des ovins. Compte tenu de ces diffrences attendues et des performances de
notre mthode nous avons pu apporter des lments objectifs de choix pour l'laboration du
plan exprimental. C'est ce que nous allons prsenter dans la suite de ce paragraphe.

4.3 Quel plan exprimental mettre en place ?

D'aprs le principe de l'intervalle de confiance, il est possible de calculer le nombre d'animaux


thorique mettre en exprimentation par lot (par traitement alimentaire) pour mesurer avec
une incertitude contrle les diffrences entre vaisseaux. Le calcul (quation 1) fait intervenir
la diffrence () entre traitements (ici entre vaisseaux), les carts-types de rptabilit ou de
fidlit intermdiaire de la mthode () et le nombre de rptitions de la mesure (n) qui
correspond ici au nombre d'animaux par traitement.

Equation 1

2 t
n
O :
= diffrence
t = variable de Student (probabilit 0,05 ou 0,01)
= cart-type de rptabilit ou cart-type de fidlit
n = nombre d'animaux

Nous avons simul plusieurs situations :


- soit les analyses de glucose peuvent-tre ralises lors dune mme srie de dosage (donc
le mme jour), et dans ce cas nous avons utilis l'cart type de rptabilit, soit elles sont
ralises sur plusieurs jours et dans ce cas nous avons utilis l'cart-type de fidlit
intermdiaire. Ces deux situations peuvent tre rencontres dans les tudes mises en
uvre par l'quipe de recherche.
- nous avons fix 2 niveaux de confiance habituellement utiliss en biologie et qui sont
0,01 et 0,05.

81 Numro spcial 2010


Application dans les laboratoires lInra

Tableau 5 : nombre d'animaux utiliser selon les conditions de dosage et prcision recherches

Diffrences Diffrences
Rptabilit Fidlit intermdiaire
(0,013 g/l (0,023 g/l)
P 0,05 0,01 0,05 0,01
n
2 0,413 2,071 0,234 1,170
3 0,114 0,264 0,065 0,149
4 0,073 0,134 0,041 0,076
5 0,057 0,095 0,032 0,054
6 0,048 0,076 0,027 0,043
7 0,043 0,064 0,024 0,036
8 0,038 0,057 0,022 0,032
9 0,035 0,051 0,020 0,029
10 0,033 0,047 0,019 0,027
11 0,031 0,044 0,017 0,025
12 0,029 0,041 0,017 0,023

Le tableau 5 rassemble les rsultats de ces simulations et montre clairement que pour mettre
en vidence une diffrence de concentration en glucose entre vaisseaux avec la probabilit la
plus exigeante (P<0,01) il serait ncessaire de conduire 10 ou 6 animaux selon que le
laboratoire ralise tous les dosages dans une mme srie avec le mme oprateur (conditions
de rptabilit) ou dans des sries diffrentes (conditions de fidlit intermdiaire). Le nombre
d'animaux se rduit 6 (condition de rptabilit) ou 4 (condition de fidlit intermdiaire) si
l'exprimentateur n'exige qu'une probabilit de 5 %. Ainsi, il apparait clairement que le
nombre danimaux mettre en exprimentation est variable selon les possibilits analytiques
du laboratoire et les exigences du chercheur en termes de niveau statistique souhait.

Conclusion

La caractrisation d'une mthode permet donc de connatre les performances de cette mthode
et den dduire des indications prcieuses pour llaboration du plan exprimental mettre en
uvre. Elle garantit que le dosage effectu est compatible avec les possibilits qu'offre la
mthode (mesure ralise au dessus de la limite de quantification, dans le domaine de
linarit, avec une incertitude lie aux critres de fidlit). En revanche, elle ne permet pas
d'accompagner la valeur rendue au commanditaire avec des incertitudes connues.
Il apparat clairement que la validation de mthode, telle quelle sera aborde dans les
chapitres suivants, permet l'analyste de garantir que chaque mesure ralise avec cette
mthode sera accompagne d'une limite d'acceptabilit et dun intervalle de tolrance qui
dfinissent des incertitudes sur la valeur transmise au commanditaire. Ces deux paramtres,
limite d'acceptabilit et intervalle de tolrance, sont fixs par le futur utilisateur (le plus
souvent le chercheur) et/ou par l'analyste en fonction de ses besoins (Feinberg M., 2010b).

Le Cahier des Techniques de lInra 82


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Bibliographie

Bergmeyer H.U., Bernt, Schmit F. and Stork H. (1974) Determination with hexokinase and
glucose-6-phosphate dehydrogenase. In "Methods of enzymatic analysis" volume 3rd ed.
H.U. Bergmeyer Verlag Chemie Academic Press, Inc. 1196-1227
Feinberg M. (2001) Validation interne des mthodes d'analyse. Techniques de l'ingnieur.
Mesures Analyse Qualit et scurit au laboratoire. P224, 1-23
Feinberg M. (2010a) Principes et vocabulaire in Validation des mthodes danalyse
quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra, numro
spcial : 13-25
Feinberg M. (2010b) Mise en uvre du profil d'exactitude in Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 27-44
Kunst A. et al., (1984) D-glucose. UV-methods withhexokinase and glucose-6-phosphate
dehydrogenase. In Methods of Enzymatic Analysis. 3rd edition. H. U. Bergemeyer, editor.
Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 163-172
Majdoub L. et al., (2003) Intraruminal propionate supplementation modifies hindlimb energy
metabolism without changing the splancnic release of glucose in growing lambs. British
Journal of Nutrition 89, 39-50
Ortigues I. et Visseiche A.-L. (1995) Whole-body fuel selection in ruminants : nutrient supply
and utilization by major tissues. Proceedings of the Nutrition Society 54, 235-251
Thomas A. et Durand D. (2009) Dmarche qualit de l'unit de recherche sur les herbivores,
Inra. In La dmarche qualit dans la recherche publique et l'enseignement suprieur.
Editions QUAE. Granier C., Mas L.-Y., Finot L., Arnoux B., Pasqualini N., Doll V.
coordinateurs. 13, 121-131
Verschuere B. (2008) Exprimentation animale : les comits d'thique en 2008. Bull. Acad.
Vt. France. Tome 161 N5 http://www.academie-veterinaire-defrance.org/ (Consult le
5/2/2010)
NF ISO 5725-1, (Dcembre 1994) Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et mthodes de
mesure. Partie 1 : Principes gnraux et dfinitions.
NF V03-110, (Dcembre 1998) Procdure de validation intralaboratoire d'une mthode
alternative par rapport une mthode de rfrence. AFNOR
NF ISO/CEI 17025, (Mai 2000) Prescriptions gnrales concernant la comptence des
laboratoires d'talonnages et d'essais. AFNOR

83 Numro spcial 2010


Application dans les laboratoires lInra

Le Cahier des Techniques de lInra 84


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Validation de lanalyse des hydrocarbures aromatiques polycycliques


dans les eaux de pluie par la mthode du profil dexactitude

Marjolaine Bourdat-Deschamps1

Rsum : Une mthode danalyse des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)


contenus dans leau de pluie a t optimise au laboratoire par la mthodologie des plans
dexpriences. La mthode danalyse (absorption sur barreau magntique SBSE analyse en
chromatographie liquide haute performance avec dtection de fluorescence) prsente les deux
caractristiques suivantes : ltape dextraction ne permet pas danalyser plus de 12
chantillons par jour et cest une mthode multi-analytes (15 HAP). Cet article dcrit sa
validation par la mthode du profil dexactitude ; les rsultats pour le pyrne et le
benzo(k)fluoranthne sont prsents titre dexemple.

Mots cls : hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), eau de pluie, validation,


profil dexactitude

Introduction
Les HAP sont des molcules apolaires, issues de la combustion incomplte des matires
organiques dont certaines sont cancrignes, mutagnes et toxiques pour la reproduction. Les
flux de HAP provenant des dpositions atmosphriques totales (retombes sches et humides)
sont de lordre de 150 g/m2/an (zone urbaine et pri-urbaine, Azimi et al., 2005). Disposant
dun pluviomtre permettant de rcolter les retombes humides (pluie) et suivant par ailleurs
les teneurs en HAP dans les sols dans le cadre dun suivi exprimental de longue dure, nous
avons souhait connatre le flux des HAP via leau de pluie en regard du stock en HAP du sol.
Une mthode danalyse a t optimise (Bourdat-Deschamps et al., 2007) qui permet de
concentrer les HAP par absorption sur barreau magntique (SBSE : Stir Bar Sorptive
Extraction), de les dsorber dans un trs faible volume dactonitrile et de les analyser par
chromatographie liquide haute performance avec un dtecteur de fluorescence. La mthode a
t caractrise (linarit, rptabilit deux niveaux de concentration, fidlit intermdiaire,
limite de quantification). La mthode du profil dexactitude a t employe pour valider
lanalyse des HAP contenus dans les eaux de pluie. Dans une premire partie, chaque tape de
la mthode de validation est dtaille (cf. Feinberg M, 2010b). Dans une deuxime partie,
diffrents profils dexactitude du pyrne et du benzo(k)fluoranthne sont prsents et
comments.

1
UMR1091 EGC- Environnement et Grandes Cultures, INRA-F-78850 Thiverval-Grignon
01 30 81 53 12 marjolaine.deschamps@grignon.inra.fr

Numro spcial 2010


85
Application dans les laboratoires de lInra

1. tapes pour la validation (Max Feinberg, 2010b)

1.1. tape 0 : description du mode opratoire

Objectif de la mthode
Quantifier 15 HAP (naphtalne, acnaphtne, fluorne, phnantrne, anthracne,
fluoranthne, pyrne, benzo(a)anthracne, chrysne, benzo(b)fluoranthne,
benzo(k)fluoranthne, benzo(a)pyrne, dibenzo(ah)anthracne, benzo(ghi)prylne,
indno(1,2,3-cd)pyrne) contenus dans des eaux de pluie. La mthode doit tre juste (nous
avons besoin des concentrations en ng/l pour calculer les flux de HAP via leau de pluie et les
comparer au stock du sol, qui est dtermin par une autre mthode analytique). La mthode
doit tre fidle (les analyses sont ralises une fois par an, il ny a pas de rptition par
chantillon). Les rsultats sont destins aux scientifiques utilisant le dispositif exprimental.

Mthode analytique optimise et mode opratoire rdig sous trame qualit du laboratoire
Voici quelques informations concernant le mode opratoire (Bourdat-Deschamps et al., 2007).
Les eaux de pluies sont collectes de faon hebdomadaire et sont congeles. Aprs
dconglation, un chantillon moyen mensuel est ralis. Dans un volume de 10 ml deau de
cet chantillon, additionn de 200 l dactonitrile, on place un Twister (barreau aimant
recouvert dun film polymrique), pralablement conditionn. Lextraction est ralise dans
un bain marie 25C, avec une agitation de 800 tr/mn pendant 140 mn. Le barreau est ensuite
plac dans un flacon HPLC avec insert. Un volume de 100 l dactonitrile est rajout.
Ltape de dsorption ralise labri de la lumire dure 25 mn dans un bain marie 50C.
Le barreau est ensuite sorti du flacon. Le flacon est rebouch, stock labri de la lumire
avant analyse par HPLC-fluorescence (colonne polarit de phases inverse spciale HAP,
gradient actonitrile-eau). La quantification est ralise par talonnage externe : dopage deau
milli-Q 4 ou 5 niveaux de concentrations de HAP, extraction des HAP selon la procdure
dtaille ci-dessus, quantification des HAP contenus dans leau de pluie avec la droite
dtalonnage ralise dans leau milli-Q dope.
Initialement, la mthode prvoyait deux dsorptions successives dans lactonitrile afin de
maximiser le rendement de dsorption. Cependant la ralisation de deux dsorptions
successives limitait 8 le nombre dexpriences qui pouvaient tre ralises dans une journe.
Afin daugmenter 12 le nombre dexpriences ralisables par jour, le protocole a t modifi
et dsormais une seule dsorption est ralise.
En gnral, 12 chantillons deau de pluie sont extraits par jour. Le lendemain, ce sont les
chantillons dtalonnage (eau Milli-Q dope) qui sont extraits. Puis, lanalyse HPLC est
ralise pour lensemble des chantillons deau de pluie et dtalonnage.

Caractrisation ralise : linarit, rptabilit deux niveaux de concentration, fidlit


intermdiaire, limite de quantification (pour eau milli-Q) (Cf. Bourdat-Deschamps et al., 2007).

Teneurs approximatives des chantillons analyser : nous avons analys des chantillons
deau de pluie laide de la mthode dcrite ci-dessus. Les teneurs sont variables selon les
HAP et selon les saisons (de quelques ng/l quelques dizaines de ng/l).

Le Cahier des Techniques de lInra


86
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

1.2 tape 1 : Dfinition du mesurande

Que mesure-t-on ? Chacun des 15 HAP contenu dans de leau de pluie (chantillon moyen
mensuel)
Comment exprime-t-on le rsultat final ? Un seul chantillon deau par mois est analys
(pas de rptition). La teneur (ng/l) est dtermine par talonnage externe (eau milli-Q dope).

1.3 tape 2 : paramtres de la validation

Domaine dapplication (a priori) : daprs ltude de linarit (caractrisation de la


mthode) : de 1 50 ng/l (voire jusqu 100 ou 200 ng/l pour certains HAP). Les analyses
pralables dchantillons deau de pluie ont montr que les teneurs maximales de chaque
HAP nexcdaient pas 30 ng/l. Le domaine dapplication choisi a donc t de 1 30 ng/l.

Limites dacceptabilit () : 20%, ce qui signifie que pour une teneur de 1ng/L le rsultat
sera compris au maximum entre 0,8 et 1,2 ng/L et pour une teneur de 30 ng/L, il sera compris
au maximum entre 24 et 36 ng/L.

Intervalle de tolrance () : 80 % (pas de rglementation pour cette application, en gnral,


on choisit 80%).
1.4 tape 3 : chantillons de validation et dfinition des valeurs de rfrence

Quels chantillons pour ltape de validation ? Afin de reprsenter au mieux la matrice


eau de pluie , un chantillon moyen a t ralis en rassemblant des eaux de pluies
rcoltes tous les mois dune anne. Cet chantillon a t homognis et a t stock labri
de la lumire 4C pour la dure des expriences de validation. Afin de minimiser la
modification de la matrice au cours du temps (dveloppements microbiens), lensemble des
expriences pour la validation a t ralis sur 1,5 semaine.

Quelle est la valeur de rfrence pour chaque chantillon ? Des ajouts doss diffrentes
concentrations ont t raliss sur la matrice ainsi prpare, avec une solution talon
commerciale contenant les 15 HAP, chacun la mme concentration.

1.5 tape 4 : essais de validation

Quatre niveaux de concentration (1,9 ; 4,7 ; 9,5 ; 28,5 ng/l) ont t choisis. Selon les
saisons et les HAP, certaines teneurs risquent dtre proches des limites de quantification.
Lors de la caractrisation de la mthode, ces limites avaient t values (rapport signal sur
bruit de lordre de 10) autour de 1 5 ng/l selon les HAP, ce qui explique notre choix pour les
deux niveaux bas de concentration.
La matrice que nous avons dope contient probablement des HAP (cest de leau de pluie
naturelle). Un chantillon non dop a galement t analys.
Deux rptitions par niveau de concentration ont t ralises car nous pouvons effectuer
au maximum 12 extractions par jour. Or (4 niveaux de concentration + 1 chantillon non
dop) 2 rptitions = 10 extractions.
Trois sries de mesures ont t ralises, sur trois jours.

Numro spcial 2010


87
Application dans les laboratoires de lInra

1.6 tape 5 : essais dtalonnage

Nous avons choisi dappliquer le protocole dextraction SBSE aux chantillons dtalonnage
qui sont constitus deau Milli-Q dope avec les HAP.
Comme indiqu dans le mode opratoire ltape 0, les extractions des chantillons de terrain
sont ralises un jour et les extractions des chantillons deau milli-Q dope sont ralises un
autre jour. Nous avons donc procd de mme pour la validation de la mthode. Pour chaque
srie, les extractions SBSE des chantillons dtalonnage ont t ralises le lendemain des
extractions dchantillons de validation. Ensuite, les injections HPLC de tous ces chantillons
de la mme srie ont t ralises sur une nuit.
Cinq niveaux de concentration (de 0,9 27,6 ng/l) ont t choisis. Le point le plus lev de
la gamme dtalonnage est lgrement infrieur celui de la gamme de validation. Comme le
rendement dextraction SBSE est infrieur 83 %, cela ne posera pas de problme car les
aires obtenues pour les chantillons de validations seront comprises dans la gamme des aires
des chantillons dtalonnage.
Une analyse par niveau a t ralise. Ce choix a t fait car dans lorganisation de la
semaine de travail, il ntait pas possible de raliser deux rptitions (le conditionnement des
barreaux demandant beaucoup de temps). Par ailleurs, le coefficient de variation caractrisant
la rptabilit de la mthode pour chaque HAP, dtermin notamment pour de leau Milli-Q
dope 5ng/l, est infrieur 10% (except pour le benzo(ghi)prylne : 12,8 %), ce qui a
confort ce choix.
Trois sries de mesures ont t ralises cest--dire trois jours, comme pour les chantillons
de validation.

1.7 tape 6 : ralisation des essais (validation et talonnage)

Pour les tapes 6 9, seuls les rsultats concernant le pyrne seront prsents, la
mthodologie tant la mme pour les 14 autres HAP.

Essais de validation

Tableau 1 : mesurages correspondant aux essais de validation (eau de pluie dope)

valeur ref Mesurages pyrne (aires)*


niveaux sries
(ng/L) rep 1 rep 2
1 36539 36785
1 2 1,9 60086 35295
3 57695 59731
1 102066 98495
2 2 4,7 99897 93547
3 115298 111584
1 188665 191294
3 2 9,5 188657 198683
3 221678 194983
1 595999 604704
4 2 28,5 520857 501025
3 557258 541355
* pour chaque srie, les aires contenues dans les blancs (matrice non dope) ont t soustraites aux aires
obtenues pour chaque niveau.

Le Cahier des Techniques de lInra


88
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Essais dtalonnage avec leau milli-Q dope subissant lintgralit du protocole

Tableau 2 : mesurages correspondant aux essais dtalonnage (eau milli-Q dope)

valeur ref
niveaux sries (ng/L) Mesurages pyrne (aires)
1 43083
1 2 0,9 24719
3 35684
1 117767
2 2 4,6 112319
3 115840
1 238120
3 2 9,2 202957
3 249807
1 450132
4 2 18,4 398342
3 440029
1 682393
5 2 27,6 611523
3 633748

1.8 tape 7 : Modle dtalonnage pour chaque srie

partir des donnes du tableau 2, pour chaque srie dtalonnage, les coefficients du modle
dtalonnage sont dtermins (tableau 3), sachant que dans notre cas, le modle dtalonnage
est une droite. Ensuite, partir des mesurages raliss sur les chantillons de validation
(tableau 1), ces coefficients permettent de calculer les concentrations retrouves des
chantillons de validation (tableau 4).

La figure 1 est une reprsentation graphique des tableaux 1 et 2.

Pyrne
800000
y = 24031x + 14563
700000 R2 = 0,9994
talonnage 1
y = 21757x + 5845,6
600000 talonnage 2
R2 = 0,9994
y = 22431x + 22707 talonnage 3
500000
R2 = 0,9972
aire

validation 1- rep1
400000
validation 1 - rep 2
300000 validation 2 - rep 1
validation 2 - rep 2
200000
validation 3 - rep 1
100000 validation 3 - rep 2

0
0 5 10 15 20 25 30
concentration (ng/L)

Figure 1 : reprsentation graphique des aires mesures lors des essais dtalonnage et de
validation, en fonction de la concentration

Numro spcial 2010


89
Application dans les laboratoires de lInra

Tableau 3 : dtermination des coefficients du modle dtalonnage pour chaque srie


a1 a0
talonnage srie 1 24031 14563
talonnage srie 2 21757 5845
talonnage srie 3 22431 22707

Tableau 4 : concentrations retrouves des chantillons de validation


Valeur de Concentrations pyrne (ng/l)
Niveaux Sries rfrence
Rp. 1 Rp. 2
(ng/l)
1 0,91 0,92
1 2 1,9 2,49 1,35
3 1,56 1,65
1 3,64 3,49
2 2 4,7 4,32 4,03
3 4,13 3,96
1 7,24 7,35
3 2 9,5 8,40 8,86
3 8,87 7,68
1 24,20 24,56
4 2 28,5 23,67 22,76
3 23,83 23,12

1.9 tapes 8 et 9 : calcul et trac du profil dexactitude


Les donnes du tableau 4 sont saisies dans le fichier Excel pour raliser les calculs et tracer
le profil dexactitude. Lexploitation des donnes de chaque HAP, comme prsente aux
paragraphes 1.7 1.9 permet de tracer le profil dexactitude pour chacun des HAP.

2. Rsultats et interprtations
2.1 Rsultats pour le pyrne
140%
Le trac du profil dexactitude
130%
pour le pyrne est prsent sur
120%
la figure 2.
110%
recouvrement (%)

100%
0 5 10 15 20 25 30
90%

80%

70%
Niveaux
60% Recouvrement (justesse)
Limite basse tolrance (%)
Limite haute tolrance (%)
50%
Limite d'acceptabilit basse
Limite d'acceptabilit haute
40%

Figure 2 : profil dexactitude pour le pyrne (daprs tableau 4), pour =20% et =80%

Le Cahier des Techniques de lInra


90
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

La mthode prsente un biais systmatique (la ligne de recouvrements moyens nest pas
100%) qui est explicable par un effet matrice. Or cela invalide la mthode puisque nous avons
besoin quelle soit juste. En traant les concentrations retrouves (donnes du tableau 4) en
fonction des concentrations thoriques pour les chantillons de validation (figure 3), il est
possible de dterminer la pente moyenne des taux de recouvrement. Linverse de cette pente
moyenne donne le facteur de correction (1,20) que lon peut appliquer chacune des
concentrations retrouves afin de retracer un profil dexactitude corrig (figure 4).
Pyrne
30
y = 0,79x + 0,40 y = 0,89x - 0,84
concentration retrouve

25
y = 0,83x + 0,33
y = 0,87x - 0,74 serie1 rep 1
20 serie 1 rep 2
(ng/L)

15
y = 0,81x + 0,10 serie 2 rep 1
y = 0,80x + 0,76 serie 2 rep 2
10 serie 3 rep 1
5 serie 3 rep 2

0
0 5 10 15 20 25 30
concentration thorique (ng/L)

Figure 3 : concentrations de pyrne retrouves en fonction des concentrations thoriques


des chantillons de validation

160%

140%
Recouvrement (%)

120%

100%
0 5 10 15 20 25 30

80%
Niveaux
Recouvrement (justesse)

60% Limite basse tolrance (%)


Limite haute tolrance (%)
Limite d'acceptabilit basse
40% Limite d'acceptabilit haute

Figure 4 : profil dexactitude pour le pyrne en appliquant un facteur de correction (1,20)


aux concentrations de validation (=20% et =80%)

Numro spcial 2010


91
Application dans les laboratoires de lInra

En corrigeant les valeurs retrouves avec le facteur de correction, la mthode devient juste
(biais infrieur 3% pour des concentrations entre 5 et 28 ng/l).
Afin de valider le facteur de correction, une nouvelle srie de mesures a t ralise
(chantillons de validation : 4 niveaux et 2 rptitions par niveau ; chantillons dtalonnage :
5 niveaux sans rptition). Le facteur de correction dtermin auparavant a t appliqu aux
concentrations retrouves. Les teneurs corriges se situent dans le profil dexactitude prsent
figure 4.

La limite de quantification basse est dtermine par lintersection entre la limite


dacceptabilit et la limite de tolrance. Elle est de 4,7 ng/l. La limite de quantification
haute correspond au point haut de gamme des chantillons de validation (28,5 ng/l).
La mthode est donc valide entre 4,7 et 28,5 ng/l ( = 20 % et = 80 %) car dans ce
domaine, lintervalle de tolrance est compris dans lintervalle dacceptabilit.
En dessous de 4,7 ng/l, les limites de tolrance haute et basse divergent trs rapidement et
de faon symtrique.
Vers 10 ng/l, la limite haute de tolrance est proche de la limite dacceptabilit haute, ce
qui signifie que le risque moyen davoir en routine une proportion moyenne de rsultats non
acceptables est proche de 1/10 (car = 80 %, soit une proportion moyenne de 1/5, et
lintervalle de tolrance est proche de la limite dacceptabilit sur la partie haute du profil
seulement, ce qui divise le risque par 2). Mais une proportion moyenne de 1/10 signifie
quelle peut varier autour de cette moyenne. Comme les intervalles de tolrance se resserrent
de 10 28 ng/l, ce risque diminue fortement.

Le profil dexactitude peut tre employ pour choisir les teneurs des contrles qualits
(CQ) qui seront employs lors des analyses en routine. En effet, on pourra choisir un CQ
proche de 10 ng/l. Le CQ se comportant comme les chantillons, sil ne passe pas, il faudra
refaire la srie danalyse. Si on choisit dutiliser 3 CQ de niveaux de concentrations diffrents,
on peut choisir un CQ 5 ng/l (proche de la limite de quantification basse), un CQ 10 ng/l
(concentration critique du profil) et un CQ 25 ng/l (proche de la limite haute).
Les rsultats prsents la figure 1 ont t obtenus en prenant une droite (a1 X + a0) comme
modle dtalonnage. Dautres modles dtalonnage ont t tests (droite passant par zro,
modle quadratique), ainsi que des pondrations (1/X) de ces modles. Ces modles
dtalonnage, pondrs ou non, ont t dtermins partir des donnes du tableau 2, en
utilisant le logiciel Statgraphics Plus 4.1. Les coefficients de ces modles ont t appliqus
aux donnes du tableau 1 afin de dterminer les concentrations de pyrne retrouves dans
chaque chantillon de validation. Les profils dexactitude (avec application dun facteur de
correction aux donnes de validation) correspondant chaque modle ont t tracs (figure 5).

Aucun modle ne donne de profil plus satisfaisant (justesse, troitesse de lintervalle de


tolrance, tendue du domaine de validit de la mthode) que le profil obtenu avec le modle
linaire avec facteur de correction (figure 4).

Le Cahier des Techniques de lInra


92
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

160% 160%

140% a 140% b
R ecou v rem en t (% )

120%

R e couv re m en t (% )
120%

100% 100%
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

80% 80%
Niveaux Niveaux

60% 60%

40% 40%

160%
160%

140%
c 140%
d
120% 120%
R ecou v rem en t (% )

R ecou vrem ent (% )

100% 100%
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

80% 80%
Niveaux Niveaux

60% 60%

40% 40%

Figure 5 : profils dexactitude pour le pyrne (=20% et =80%)


(a) modle linaire (a1 X + a0) pondr (1/X), facteur de correction (1,20)
(b) modle linaire passant par zro (a1 X), facteur de correction (1,16)
(c) modle linaire passant par zro (a1 X) pondr (1/X), facteur de correction (1,16)
(d) modle quadratique (a2 X2 + a1 X + a0) , facteur de correction (1,20)

Nous avons choisi dappliquer aux chantillons dtalonnage lensemble du protocole


exprimental (extraction SBSE, dsorption, analyse HPLC) (cf. tape 5). Cependant, nous
pourrions choisir comme chantillons dtalonnage des solutions dans un solvant organique
(HAP dans lactonitrile), qui ne subiraient pas le protocole dextraction. Cette mthode
prsente lavantage de raccourcir la dure des exprimentations, mais linconvnient de ne pas
montrer limpact de lextraction sur la fonction de rponse (droite dans notre cas). Le profil
dexactitude, figure 6, a t dtermin en ralisant les essais dtalonnage avec des talons de
HAP dans lactonitrile (4 niveaux de concentrations, 2 rptitions par niveau, 3 sries, qui
ont t injects en HPLC en mme temps que les chantillons de validation et les chantillons
dtalonnage subissant lintgralit du protocole), et en appliquant un facteur de correction
de 1,5. La mthode nest juste (biais infrieur 5 %) quentre 10 et 28 ng/l et la limite de
quantification infrieure est assez leve (13,4 ng/l), ce qui nous conforte dans notre choix de
faire subir aux chantillons dtalonnage lintgralit du protocole extraction-analyse.

Numro spcial 2010


93
Application dans les laboratoires de lInra

160% Recouvrement (justesse)


Limite basse tolrance (%)
Limite haute tolrance (%)
140%
Limite d'acceptabilit basse
Limite d'acceptabilit haute
Recouvrement (%)

120%

100%
0 5 10 15 20 25 30

80%
Niveaux

60%

40%

Figure 6 : profil dexactitude pour le pyrne en appliquant un facteur de correction (1,5)


aux concentrations de validation ( = 20% et = 80 %).
Les chantillons dtalonnage taient des talons de HAP dans lactonitrile
et nont pas subi le protocole dextraction.

2.2 Autre exemple de rsultats : le benzo(k)fluoranthne

Pour le benzo(k)fluoranthne (figure 7a), la mthode prsente un biais (effet matrice) qui est
plus important que dans le cas du pyrne (car celui-ci est plus apolaire que le pyrne et
prsente de plus fortes interactions avec la matire organique dissoute de leau de pluie).
Aprs application dun facteur de correction (figure 7b), le biais est corrig pour les teneurs
entre 8 et 18 ng/L, mais il subsiste un biais qui saccentue quand la concentration diminue.
La mthode non corrige est assez fidle (figure 7a), mais aprs application du facteur de
correction (figure 7b), les intervalles de tolrance slargissent considrablement. Ce qui
normal puisque le facteur de correction est suprieur 1 et a pour effet daugmenter les
carts-types.
Aprs application du facteur de correction, la limite haute de tolrance dpasse la limite haute
dacceptabilit 17,5 ng/l, ce qui correspond la limite basse de quantification. Sachant que
les teneurs en benzo(k)fluoranthne dans les chantillons deau de pluie sont gnralement
infrieures cette valeur, la mthode nest donc pas valide pour raliser les analyses de ce
compos.

Le Cahier des Techniques de lInra


94
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

130% Recouvrement (justesse)


a Limite basse tolrance (%)
120% Limite haute tolrance (%)
Limite d'acceptabilit basse
110% Limite d'acceptabilit haute

100%
Recouvrement (%)

0 5 10 15 20 25 30
90%

80%

70%

60%
Niveaux
50%

40%

30%

130% b
120%

110%

100%
0 5 10 15 20 25 30
90%

80%

70%

60%
Niveaux
50% Recouvrement (justesse)
Limite basse tolrance (%)
Limite haute tolrance (%)
40%
Limite d'acceptabilit basse
Limite d'acceptabilit haute
30%

Figure 7 : profils dexactitude pour le benzo(k)fluoranthne pour =20% et =80%, modle


dtalonnage : droite
(a) trac partir des valeurs des plans dexpriences dtalonnage et de validation
(b) aprs application dun facteur de correction (1,81)

Pour que la mthode soit valide, le facteur pourrait tre diminu (70 % par exemple,
figure 8) ; dans ce cas, le risque moyen davoir un rsultat qui ne sera plus acceptable serait
augment et il est peu raisonnable daugmenter ce risque (on choisit en gnral un dau
minimum 80 %).

Numro spcial 2010


95
Application dans les laboratoires de lInra

140%

130%

120%

110%
Recouvrement (%)

100%
0 5 10 15 20 25 30
90%

80%

70%
Recouvrement (justesse) Niveaux
60% Limite basse tolrance (%)
Limite haute tolrance (%)
50%
Limite d'acceptabilit basse
40% Limite d'acceptabilit haute

Figure 8 : profil dexactitude pour le benzo(k)fluoranthne


pour = 20 % et = 70 %, avec facteur de correction (1,81)

En revanche, augmenter la limite dacceptabilit 25 % (avec = 80 %) (figure 9)


permet de valider la mthode sur un domaine plus large (entre 6 et 28,5 ng/l), tout en
conservant un risque acceptable. Augmenter de 20 25% signifie que pour une teneur de
10 ng/l, le rsultat sera compris au maximum entre 7,5 et 12,5 ng/l (au lieu de 8 12 ng/l).
Ceci reste acceptable pour lutilisation des rsultats quil est prvu de faire. la limite de
quantification basse (6 ng/l), le biais est de 10%. Il devient infrieur 3% entre 8 et 28 ng/l.

140%

130%

120%

110%
Recouvrement (%)

100%
0 5 10 15 20 25 30
90%

80%

70%
Recouvrement (justesse) Niveaux
60% Limite basse tolrance (%)
Limite haute tolrance (%)
50%
Limite d'acceptabilit basse
40% Limite d'acceptabilit haute

Figure 9 : profil dexactitude pour le benzo(k)fluoranthne


pour = 25% et = 80 %, avec facteur de correction (1,81)

Le Cahier des Techniques de lInra


96
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Dautres profils dexactitude ont t tracs avec diffrents modles dtalonnages (pondrs
ou non). Il savre que le modle linaire donne le profil (figure 9) le plus adapt aux
objectifs de la mthode (intervalle de tolrance le plus troit, meilleure justesse, limite de
quantification la plus basse).

Comme dans le cas du pyrne, nous avons trac le profil dexactitude en utilisant des
chantillons dtalonnage dans lactonitrile (ne subissant pas le protocole dextraction)
(figure 10), et aprs application dun facteur de correction (2,45). La figure 10 est comparer
avec la figure 7b, o les chantillons dtalonnage ont subi lintgralit du protocole
extraction-analyse.

140%

130%

120%

110%
Recouvrement (%)

100%
0 5 10 15 20 25 30
90%

80%

70%
Niveaux
60%

50%

40%

Figure 10 : profil dexactitude pour le benzo(k)fluoranthne


pour = 20 % et = 80%, aprs application dun facteur de correction (2,45)

La mthode est juste entre 8 et 28 ng/l (biais infrieur 5 %), comme ctait le cas figure 7b.
En revanche, figure 10, lintervalle de tolrance se situe lintrieur des limites
dacceptabilit entre 8,8 et 28 ng/l. Le domaine de validit de la mthode ainsi dfini, avec
= 20 % et = 80 %, est plus tendu que celui du profil dexactitude figure 7b. Pour valider
la mthode en utilisant des talons qui subissent le protocole dextraction, nous avions t
contraints daugmenter 25 % (figure 9), mais le domaine de validit tait plus tendu
(entre 6 et 28 ng/l). Dans le cas du benzo(k)fluoranthne, le choix de la mthode dtalonnage
est orienter en fonction des besoins scientifiques : domaine de validit tendu et = 25 %
(ce que nous avons choisi) ou domaine de validit plus restreint (limite basse de quantification
plus leve) et = 20 %.

Numro spcial 2010


97
Application dans les laboratoires de lInra

Conclusion

Nous avons ralis un total de 47 essais pour essayer de valider la mthode danalyse
de 15 HAP contenus dans de leau de pluie selon la mthode du profil dexactitude. Les
expriences ont t ralises avec le mlange des 15 HAP (mthode multi-analytes), mais les
rsultats ont t traits individuellement pour chaque HAP.
Ltendue du domaine de validation varie selon les HAP. Pour la plupart des HAP, il est
ncessaire dappliquer un facteur de correction afin de corriger le biais (effet matrice) et de
valider la mthode. Pour certains HAP, nous avons choisi daugmenter la limite
dacceptabilit 25 % (au lieu de 20 %) afin de valider la mthode sur un domaine de
concentration plus large (mais toujours compris entre les niveaux bas et haut des chantillons
de validation, lextrapolation hors du domaine test tant proscrite).
Outre lintrt pour la validation de la mthode, le profil dexactitude est galement un outil
diagnostic pour dterminer les points faibles de la mthode et galement pour choisir
judicieusement les contrles qualit qui seront employs en routine. Le trac des profils
dexactitude pour des modles dtalonnages varis, pondrs ou non, permet de dterminer le
modle dtalonnage qui donnera le profil le plus en adquation avec les objectifs
scientifiques. De mme, le trac des profils dexactitude en prenant des chantillons
dtalonnage qui subissent ou non le protocole dextraction permet de dterminer la procdure
dtalonnage qui valide la mthode.

Bibliographie
Azimi S., Rocher V., Muller M., Moilleron R., Thevenot D. (2005) Source, distribution and
variability of hydrocarbons and metals in atmospheric deposition in an urban area (Paris,
France). Sci. Total Environ. 337:223-239
Bourdat-Deschamps M., Daudin J.-J., Barriuso E. (2007) An experimental design approach to
optimize the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons from rainfall water using
stir bar sortpive extraction and high performance liquid chromatography fluorescence. J.
Chromatogr. A. 1167 :143-153
Feinberg M. (2010b) Mise en uvre du profil dexactitude in Validation des mthodes
danalyse quantitatives physicochimiques par le profil dexactitude. Le Cahier des
Techniques de lInra, numro spcial : 27-44

Le Cahier des Techniques de lInra


98
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Validation de la mthode de dosage du pigment chlorophylle a


dans leau douce par extraction et par HPLC-DAD

Jrme Lazzarotto1, Jennifer Maherou

Rsum : La chlorophylle a est un pigment vert prsent dans tous les vgtaux, dont les algues.
Lunit mixte de recherche CARRTEL de lInra de Thonon-les-Bains, mesure la concentration de ce
pigment dans des lacs alpins afin dtudier ces cosystmes. Ce pigment est dos dans leau par
HPLC-DAD aprs une tape de filtration / extraction. Cette mthode qui fait lobjet dun protocole
dfini, est utilise depuis plusieurs annes au laboratoire de lunit. Afin de mieux rpondre aux
besoins des chercheurs et de se conformer la dmarche qualit de lInra, cette mthode a t valide
par un profil dexactitude. Cette validation a t effectue en deux tapes afin dvaluer la mthode
dans son ensemble : une tape avec un matriau de rfrence puis partir de cultures dalgues. Cet
article dcrit le plan dexprience et la validation de cette mthode avec un profil dexactitude dans ce
contexte.

Mots cls : limnologie, phytoplancton, chlorophylle a, validation, profil dexactitude

Introduction
Lunit mixte de recherche CARRTEL de lInra de Thonon-les-Bains tudie les cosystmes
lacustres ; son laboratoire de chimie ralise les analyses des eaux et des sdiments lors
dtudes limnologiques. Depuis plusieurs annes, le laboratoire de chimie est engag dans une
dmarche qualit selon le Rfrentiel Inra. Un des objectifs du plateau technique est que toute
mthode utilise en routine soit valide.
Afin dtudier les cosystmes lacustres, la biomasse algale des lacs doit tre value. Cette
biomasse peut tre value soit par une dtermination taxonomique soit par une estimation en
quantifiant les pigments prsents.
Nous traiterons ici de la validation de la mthode danalyse de la chlorophylle a par
chromatographie liquide avec dtections sur barrette de diodes (HPLC-DAD) aprs extraction
liquide-solide avec la mthode du profil dexactitude (Max Feinberg, 2010b).

1. Contexte dapplication de la mthode


Depuis le milieu du XXme sicle, la qualit de leau des grands lacs sest fortement dgrade
avec le phnomne deutrophisation. Un apport excessif en nutriments par les effluents
urbains et par les terres agricoles a provoqu une abondante prolifration phytoplanctonique.
La dcomposition de cette importante biomasse a entran une dsoxygnation des eaux. Le
phosphore est le facteur limitant de ce phnomne deutrophisation (Barroin, 2004). Il est
aussi lun des principaux indicateurs de la qualit de leau avec la biomasse algale et la
transparence (DCE, 2000 ; Seq-EAU, 1999).
La chlorophylle a est le pigment le plus rpandu dans les diffrentes classes dalgues. Sa
quantification permet une estimation de la biomasse algale en prsence.

1
UMR0042 CARRTEL Centre alpin de recherche sur les rseaux trophiques des cosystmes mimniques
INRA - F-74200 Thonon-les-bains 04 50 26 78 21 lazzarotto@thonon.inra.fr

99 Numro spcial 2010


Application dans les laboratories de lInra

Lanalyse de la chlorophylle a est ralise en routine par le laboratoire de chimie de lunit


CARRTEL par extraction liquide-solide puis HPLC-DAD.
Ces analyses sont effectues lors de programmes de recherche limnologique afin dvaluer la
qualit dun milieu lacustre (Lazzarotto et Rapin, 2008). Le stade deutrophisation dun
milieu est estim daprs plusieurs paramtres, dont la chlorophylle a : oligotrophe : Chl a <
35 g/l ; msotrophe : 35g/l < Chl a < 100 g/l ; et eutrophe : Chl a > 100 g/l
(Vollenweider and Kerekes, 1982). Dautre part ces tudes sont effectues avec plusieurs
analyses, au minimum 4 prlvements diffrents dans lanne.
Les exigences des demandeurs danalyses seront fixes selon ces frquences dobservation et
les distinctions entre les stades deutrophisation.

2. Matriel et mthode
Leau est filtre pour mesurer sa teneur en chlorophylle a. Lanalyse de la chlorophylle a est
ralise par extraction liquide-solide partir du filtre puis HPLC-DAD.
Cette mthode est tablie et fixe par un mode opratoire, inspir de la norme NF T90 116.
Les pigments sont photosensibles et thermosensibles, les chantillons sont donc conservs au
froid et lobscurit jusqu lanalyse.

2.1 Filtration Extraction

Leau brute est filtre sur un filtre GFC. Le volume filtr est choisi entre 50 ml et 5 l selon la
transparence de lchantillon. Les algues contenant les pigments sont retenues sur ce filtre.
Les filtres sont dposs dans un tube centrifuger avec
le solvant dextraction (mthanol/actate dammonium 0.5 M (98/2 ; v/v)). Ils sont soumis
des ultra-sons afin de briser les cellules algales et de librer les pigments. Les tubes sont
ensuite centrifugs.
Le surnageant est rcupr et filtr travers un filtre seringue pour le sparer des dbris

2.2 HPLC-DAD

Lextrait est ensuite analys par HPLC-DAD, sur une chaine Waters avec un passeur
dchantillons. 100 l sont injects et lus selon un gradient dlution base de 3 luants
(mthanol / 0,5 M actate dammonium (80/20) ; actonitrile/eau (90/10) ; thyle actate)
de 30 mn.
La chlorophylle a est identifie par son temps de rtention ainsi que par son spectre
dabsorption spcifique (Jeffrey et al., 1997).

2.3. Expression du rsultat

La quantification est permise grce un talonnage externe partir dtalons certifis de


chlorophylle a dissous dans du mthanol. La quantit mesure dans le volume inject est
rapporte au volume deau filtr. La concentration ainsi mesure est exprime en g Chl a/l.

3. Dmarche de validation avec le profil dexactitude


Afin de valider cette mthode, nous avons utilis la mthode du profil dexactitude. Cet outil
permet de vrifier si une mthode rpond aux exigences fixes. En effectuant plusieurs

Le Cahier des Techniques de lInra 100


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

analyses sur plusieurs jours, il dtermine les paramtres pris en compte pour la validation de
mthode tels que la justesse, la fidlit intermdiaire et les incertitudes.
Pour cette dmarche, nous avons choisi de diffrencier les deux tapes de la mthode :
lextraction puis la quantification. Dans un premier temps, nous tablissons le profil
dexactitude pour la quantification seule via HPLC-DAD, avec des matriaux de rfrence
certifis (MRC) et diffrents de ceux utiliss pour effectuer ltalonnage. Nous validons ainsi la
justesse de la mthode et nous estimerons la variabilit de cette tape.
Dans un second temps, nous tablissons le profil dexactitude pour la mthode entire, soit
lextraction puis la quantification. Pour ce faire, nous utilisons plusieurs cultures dalgues.

Ltape dextraction peut apporter un biais quil faut considrer. Les pigments prsents dans
lchantillon initial peuvent ne pas tre extraits en totalit. Nous ne pouvons pas dterminer le
recouvrement rel de la mthode. Nous avons estim en tude prliminaire le rendement
maximum de la mthode. Nous avons effectu des mesures en modifiant la mthode et en
utilisant une mthode dextraction considre comme optimale, avec une tape
supplmentaire de broyage du filtre. Le recouvrement observ par rapport la mthode
considre comme optimale est de 78 % pour des quantits entre 0.1 g Chl a et 6 g Chl a
extraites. Ce recouvrement nest pas un recouvrement absolu mais relatif et correspond au
recouvrement maximum possible de la mthode.

Daprs ces connaissances de la mthode que nous utilisons en routine, nous suivons la
dmarche de validation dcrite par Max Feinberg (2010b)

3.1 La quantit mesure

La quantit mesure est la concentration en chlorophylle a dans le phytoplancton de leau. La


mthode est une mthode indirecte qui ncessite un talonnage partir dextraits
mthanoliques talons.
Les rsultats sont exprims en g Chl a extrait, cette quantit est ensuite reporte au volume
filtr. Lexpression finale du rsultat est en g Chl a/l.

3.2 Les objectifs de la validation

3.2.1 Le domaine de validation

Les rsultats habituels observs varient entre 0,2 et 100 g Chl a/L, avec des volumes filtrs
entre 50 ml et 5 l. La quantit extraite varie donc entre 1 et 5 g Chl a.
Le domaine de validation est exprim en quantit extraite. Il est choisi plus large
quentre 1 et 5 g Chl a extraite afin de pouvoir mesurer le pigment si le volume filtr nest
pas optimal et de ne pas avoir refaire une filtration. Le domaine de validation choisi est
de 0,4 8,0 g Chl a extrait.

3.2.2 Les limites dacceptabilit et intervalle de tolrance

Les exigences des demandeurs danalyses sont fixes selon les frquences dobservation et les
distinctions entre stades deutrophisation explicites en 1. Il est souhait que au
moins 3 analyses sur 4 donnent un rsultat +/- 25 % de la valeur vraie de lchantillon, soit
que 75 % des rsultats obtenus aient un recouvrement de 25 %.
Ainsi les limites dacceptabilit ( ) sont de 25 % et lintervalle de tolrance ( ) est de 75 %.

101 Numro spcial 2010


Application dans les laboratories de lInra

3.3 Les chantillons de validation

Il existe des talons certifis dextrait de chlorophylle a mthanolique. Mais il nexiste pas de
solution dalgue avec une concentration connue en chlorophylle a, du fait des problmes lis
lvolution des algues. Il est impossible aussi de doper une matrice puisque le pigment mesur
est lintrieur des cellules de plancton.

Pour cette validation, nous avons choisi de diffrencier les deux tapes de la mthode :
lextraction puis la quantification.
Dans un premier temps, nous tablirons un profil dexactitude pour la quantification seule via
HPLC-DAD, avec des talons dextrait de chlorophylle a mthanolique certifis. Nous validons
ainsi la justesse de la mthode et la variabilit lie cette tape.

Dans un second temps, nous tablirons deux profils dexactitude pour la mthode entire, soit
lextraction puis la quantification. Pour ce faire, nous utilisons deux cultures dalgues, afin de
contrler les espces dalgues en prsence et lvolution de la biomasse. Nous ne connaissons
pas la valeur vraie de la concentration en chlorophylle a de ces cultures. Ces profils
dexactitude nous renseignerons sur la variabilit globale de la mthode.
Ces profils sont effectus pour deux algues cultives spcifiques : diatomes et
cyanobactries. Ces cultures seront filtres dans les mmes conditions que les chantillons.

3.4 Les essais de validation

3.4.1 Etape HPLC-DAD

Nous avons choisi 4 niveaux de quantit de chlorophylle a : 0,4 ; 0,8 ; 2,0 ; 8,0 g Chl a. Afin
dvaluer la rptabilit et la fidlit intermdiaire de cette tape, nous avons ralis pour
chacune de ces quantits 3 rplicats et cela pendant 3 jours. Soit 9 mesures par niveau, soit 36
mesures au total.

3.4.2 Analyse globale extraction HPLC-DAD

Nous avons filtr diffrentes quantits des cultures dalgues afin dapprocher les quantits
values lors de la premire tape : 1 ml ; 3 ml ; 10 ml ; 90 ml. Afin dvaluer la rptabilit
de cette tape, nous avons ralis pour chacune de ces filtrations 3 rplicats. Etant donn que
la culture dalgues volue dans le temps, la fidlit intermdiaire ne peut tre dtermine en
effectuant plusieurs mesures sur diffrents jours, nous avons donc effectu 3 sries de
filtration dans la mme journe avec deux oprateurs. Soit 9 mesures par niveau, 36 mesures
par culture dalgues et 72 mesures au total.

3.5 Ltalonnage

Ltalonnage est effectu avec des solutions talons mthanoliques injectes 3 niveaux :
0,28 g Chl a ; 4,60 g Chl a ; 9,20 g Chl a. Ltalonnage est effectu avec une analyse par
niveau.
Ltalonnage devant tre effectu chaque srie du plan de validation, il sera effectu lors
des 3 sries de mesures pour les talons certifis ainsi que pour les algues.

Le Cahier des Techniques de lInra 102


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

4. Rsultats

La fonction dtalonnage est linaire. Les quantits extraites lors de chaque srie sont
calcules partir des fonctions linaires dtermines chaque talonnage.
Tableau 1 : Rsultats des talonnages obtenus lors de chaque srie du plan (Aire = a x [Chl a] + b

ESSAIS Etalons certifis ESSAIS Culture cyanobactries ESSAIS Culture diatomes


I II III I II III I II III
a 5 851 243 5 920 726 5 955 871 5 603 378 5 738 962 5 465 850 5 451 452 5 515 275 5 645 598
b -3 636 -6 268 1 621 -922 -5 150 -1 359 3 490 3 650 5 696
r 1.0000 0.9999 0.9999 1.0000 0.9999 1.0000 1.0000 0.9999 0.9997
n 4 4 4 4 4 4 4 4 4

Les rsultats des essais de validation sont insrs dans le fichier Excel
(https://intranet.inra.fr/mission_qualite/acces_thematiques/formations_et_ecoles/ecole_des_te
chniques_validation_methodes/profil_d_exactitude). Le fichier gnre automatiquement les
tableaux de calcul

4.1 Profil dexactitude de ltape analytique HPLC-DAD seule

Le profil dexactitude de cette tape analytique (figure 1) nous indique que la mthode est
juste et rptable dans le domaine de 0,4 8,0 g Chl a. Les incertitudes relatives sont de
lordre de 10 % et les limites de tolrance sont comprises dans les limites dacceptabilit
jusqu la valeur basse de 0,4 g Chl a.

Figure 1 : profil dexactitude de la mthode danalyse HPLC-DAD de la chlorophylle a


avec des matriaux de rfrence

103 Numro spcial 2010


Application dans les laboratories de lInra

4.2 Profils dexactitude de la mthode globale extraction - analyse HPLC-DAD partir de


cultures dalgues

Les profils dexactitude partir des cultures dalgues ne renseignent pas sur la justesse de la
mthode. La valeur cible correspond la moyenne des mesures. Ces profils indiquent la
variabilit de la mthode dans son ensemble : lextraction et lanalyse HPLC-DAD.
Les figures 2 et 3 reprsentent ces profils.

Figure 2 : profil dexactitude de la mthode danalyse HPLC-DAD de la chlorophylle a


avec une culture de cyanobactries

Figure 3 : profil dexactitude de la mthode danalyse HPLC-DAD de la chlorophylle a


avec une culture de diatomes

Le Cahier des Techniques de lInra 104


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Ces profils sont diffrents selon la culture dalgues. Lhomognit des pigments dans les
algues et les solutions ne sont donc pas les mmes selon les cultures dalgues. La variabilit
est acceptable de 1,8 g Chl a 12 g Chl a pour la culture de diatomes et de 0,5 g Chl a
4,1 g Chl a pour la culture de cyanobactries.

Conclusion
Ltape danalyse HPLC-DAD est valide selon les exigences spcifies : la justesse de la
mthode est valide dans le domaine de 0,4 8,0 gChl a.
Les rsultats des essais de la mthode globale extraction HPLC-DAD indique une
variabilit diffrente selon les algues en prsence.

En prenant en considration ces rsultats, la mthode est valide selon les exigences
spcifies dans le domaine de 4,1 g Chl a 8 g Chl a, soit avec des volumes filtrs
de 50 ml 5 l de 0,8 160 g Chl a/l. Le domaine valid correspond aux besoins
usuels. 75 % des rsultats indiqueront des valeurs autours de 25 % de la valeur vraie.
tant donn limportance de la variabilit due au prlvement et aux classes dalgues en
prsence, il est conseill dapporter un soin particulier lchantillonnage sur le terrain, en
effectuant par exemple plusieurs chantillons pooler.
Une carte de contrle partir de solutions de chlorophylle a certifies, est effectue afin de
garantir la stabilit de la mthode valide.
Loutil profil dexactitude a facilit cette validation et a permis de confronter les exigences
des demandeurs danalyses avec les possibilits du laboratoire.

Bibliographie
Barroin G. (2004) Phosphore, azote, carbone Du facteur limitant au facteur de matrise.
Courrier Env. INRA, 52, 23-30.
DCE, Directive Cadre Eau (2000) Directive 2000/60/CE JO CE L 327/1 du 22.12.2000, p. 72
Feinberg Max (2010b) Mise en uvre du profil dexactitude in Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 27-44
Lazzarotto J., Rapin F. (2008) volution physico-chimique des eaux du Lman. Rapports sur
les tudes et recherches entreprises dans le bassin lmanique. Programme quinquennal
2006-2010. Campagne 2007, p. 31-55
SEQ-Eau (1999) Systme d'valuation de la qualit des cours d'eau, rapport de prsentation
SEQ-Eau. Agences de l'eau, les tudes des agences de l'eau n 64 - 59p.
Vollenweider, R.A., and Kerekes, J. (1982) Eutrophication of waters. Monitoring, assessment
and control. OECD Cooperative programme on monitoring of inland waters
(Eutrophication control), Environment Directorate, OECD, Paris. P. 154

105 Numro spcial 2010


Application dans les laboratories de lInra

Le Cahier des Techniques de lInra 106


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Validation dune mthode automatise de titration


de lalcalimtrie complte dans leau douce

Jrme Lazzarotto1

Rsum : Le titre alcalimtrique complet (TAC) dune eau est la mesure du pouvoir alcalin
de la solution. Le TAC est principalement expliqu par le pH et la concentration en ions
carbonate. Cette titration est effectue de manire automatise lunit mixte de recherche
CARRTEL de lInra de Thonon-les-Bains
Cette mthode a t valide avec un profil dexactitude afin de comparer les besoins des
tudes utilisant cette mesure avec ses caractristiques.
Cet article dcrit le plan dexprience choisi pour cette validation ainsi que les rsultats.

Mots clefs : limnologie, hydrologie, titre alcalimtrique complet, carbonate, validation,


profil dexactitude

Introduction

Lunit mixte de recherche CARRTEL de lInra de Thonon-les-Bains tudie les cosystmes


lacustres et son laboratoire de chimie ralise les analyses des eaux et sdiments lors dtudes
limnologiques, notamment pour son observatoire de recherche environnemental : ORE Lacs.
Depuis plusieurs annes, le laboratoire de chimie est engag dans une dmarche qualit selon
le Rfrentiel Inra, et lun de ses objectifs est que toute mthode utilise en routine soit
valide. La mesure du TAC est effectue en routine dans ltude des lacs et des rivires des
bassins versants de lORE Lacs.
Nous traiterons ici de la validation de la mthode automatise de titration de lalcalimtrie
complte avec la mthode du profil dexactitude (Feinberg M., 2010b- 2010c).

1. Contexte dapplication de la mthode


LORE Lacs reprsente un suivi tabli depuis plusieurs dizaines dannes des trois grands lacs
alpins (Lman, Annecy et Bourget). Durant ce suivi, les paramtres physico-chimiques de
base sont analyss dans les eaux. Le TAC fait partie de ces paramtres.
Dans ltude dun cosystme lacustre, la connaissance du TAC est ncessaire pour le calcul
de la production primaire. Il estime le carbone inorganique prsent pouvant tre consomm
avec les nutriments lors de la photosynthse (Lazzarotto J. et Rapin F., 2008). Dautre part,
dans un cours deau et un lac, le TAC est un des paramtres indiquant la minralisation dune
eau.
Le TAC nest pas un polluant, mais le systme d'valuation de la qualit des cours d'eau
(SEQ-Eau) indique des seuils de variations pour lutilisation en production deau potable et en
tant quindicateur de la qualit de leau par altration (Seq-EAU, 2003). Ces seuils et les
indices daptitude correspondants sont dcrits dans le tableau 1.

1
UMR0042 CARRTEL Centre alpin de recherche sur les rseaux trophiques des cosystmes mimniques
INRA - F-74200 Thonon-les-bains 04 50 26 78 21 lazzarotto@thonon.inra.fr

107 Numro spcial 2010


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Tableau 1 : valeurs seuils du TAC selon le SEQ-Eau

TAC (f) 8 40 5 58 3 75 0 100


TAC (mq/l) 1,6 8,0 1,0 11,6 0,6 15,0 0,0 20,0
tat du milieu Trs bon Bon Mauvais Trs mauvais
(bleu) (vert) (orange) (rouge)

2. Matriel et mthode
La mesure de lalcalinit complte est une titration acide-base. Au laboratoire de lunit
CARRTEL, la mthode utilise est une titration automatique avec mesure du point final
dtermin laide de la drive seconde du pH en fonction du volume dacide. Cette mthode
est inspire de la norme NF T90-036 qui utilise une titration manuelle avec indicateur color.
Le pH est mesur avec une lectrode de verre connecte au titrateur. Le titrateur utilis est un
Metrohm Basic Titrino 794 avec un passeur dchantillons 730.
La prise dessai est de 100 ml. La burette a un volume de 20 ml de HCl 0.1 mol/l. Le TAC
est calcul par quivalence de la quantit dacide ayant ragi avec lensemble des espces
alcalines de la solution.

3. Dmarche de validation avec le profil dexactitude


Afin de valider cette mthode, nous avons utilis la mthode du profil dexactitude. Cet outil
permet de vrifier si une mthode rpond aux exigences fixes. En effectuant plusieurs
analyses sur plusieurs jours, il dtermine les paramtres pris en compte pour la validation de
mthode tels que la justesse, la fidlit intermdiaire et les incertitudes.
La mesure du TAC utilise la mesure du pH. La mthode de pH a t valide, ltalonnage est
effectu lors de chaque essai avec des solutions de rfrence certifies. La stabilit du systme
est contrle avec une carte de contrle.
Pour cette validation, nous suivons la dmarche de validation dcrite par Max Feinberg
(2010b).

3.1 La quantit mesure

La quantit mesure est la quantit despces alcalines prsentes dans leau analyser. Cette
quantit est ramene au volume de la prise dessai. Le rsultat est exprim en mq/l.

3.2 Les objectifs de la validation

Le domaine de validation
Les eaux douces des cosystmes que nous tudions ont un TAC qui varie entre 1 et 5 mq/l.
Le volume de la burette permet datteindre des valeurs de 20 mq/l.
Afin que le domaine dutilisation soit compris dans le domaine de validation, nous
choisissons un domaine de 0,5 10,0 mq/l.

Le Cahier des Techniques de lInra 108


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Les limites dacceptabilit et intervalle de tolrance


Les exigences pour ces analyses sont dfinies en fonction de leur utilisation dans lORE Lacs
et daprs les seuils indiqus par le SEQ-Eau. Les carts entre les valeurs minimales
(environ 1 mq/l) sont de lordre de 0,5 mq/l et de lordre de 4 mq/l pour les valeurs
maximales (environ 15 mq/l), soit des variations de 36 50 %. La limite dacceptabilit doit
donc tre infrieure 36 % afin de pouvoir discriminer deux valeurs de seuils maximales. La
limite dacceptabilit est donc choisie 25 %.
Par rapport la frquence des chantillonnages et des analyses de lORE, il est souhait que
au moins 4 rsultats sur 5 soient dans les limites dacceptabilit, soit 80 % des rsultats avec
un recouvrement de 25 %.
Ainsi les limites dacceptabilit ( ) sont de 25 % et lintervalle de tolrance ( ) est de 80 %.

3.3 Les chantillons de validation

tant donn que le volume de la prise dessai est important (100 ml) et quun plan
dexprience minimal ncessitera au minimum 27 mesures (avec 3 rplicats 3 niveaux
pendant 3 jours), le volume minimal dtalon utilis serait de 2,7 l. Le cot de cette validation
serait donc trop lev si nous utilisons des solutions de rfrence certifies, par rapport
lutilisation de la mesure.
Nous choisissons donc de raliser des solutions talons base de carbonate de sodium et
dhydrognocarbonate de sodium.
Les chantillons de validation seront donc prpars partir de poudres sches puis peses sur
des balances vrifies, ensuite dissoutes dans des fioles de classe A vrifies.

3.4 Les essais de validation

tant donn que la mthode est automatise et que le domaine est grand, nous choisissons 5
niveaux de TAC dans le domaine de validation. Les 5 niveaux choisis sont : 0,5 ; 1,0 ; .5 ; 5.0
et 10,0 mq/l. Afin dvaluer la rptabilit et la fidlit intermdiaire de cette tape, nous
avons ralis pour chacun de ces niveaux 3 rplicats et cela pendant 5 jours, soit 15 mesures
par niveaux, soit 75 mesures au total.

3.5 Ltalonnage

La dtermination du TAC est une mthode directe qui ne ncessite pas dtalonnage.

4. Rsultats

Les rsultats des essais de validation sont insrs dans le fichier Excel
(https://intranet.inra.fr/mission_qualite/acces_thematiques/formations_et_ecoles/ecole_des_te
chniques_validation_methodes/profil_d_exactitude ). Le fichier gnre automatiquement les
tableaux de calcul et le profil dexactitude (figure 1).

109 Numro spcial 2010


Application dans les laboratories de lInra

130% Recouvrement (justesse) Limite basse tolrance (%)


Limite haute tolrance (%) Limite d'acceptabilit basse
Limite d'acceptabilit haute

120%

110%
Biais (%)

100%
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0

90%

80%

70% Niveaux

Figure 1 : profil dexactitude de la mthode de titration de lalcalimtrie complte dune eau

Le profil dexactitude de cette mthode indique que la mthode est valide par rapport aux
exigences pour lensemble du domaine de validation, de 0,5 10,0 mq/l. Le fichier du profil
dexactitude calcule lincertitude de la mthode pour chaque niveau en fonction de la fidlit
mesure. Lincertitude relative de cette mthode varie entre 4 et 2 %.

Conclusion

La mthode de dtermination du TAC a t valide dans le domaine de 0,5 10,0 mq/l avec
une limite dacceptabilit de 25 % et un intervalle de tolrance de 80 %.

Bibliographie
AFNOR (1996) Norme NF T90-036 / NF EN ISO 9963-1 : Dtermination de lalcalinit. Qualit
de leau, T2 :115-125
Feinberg Max (2010b) Mise en uvre du profil dexactitude in Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 27-44
Feinberg M. (2010c) Interprtation du profil dexactitude in Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial : 45-59
Lazzarotto J., Rapin F. (2008) volution physico-chimique des eaux du Lman. Rapports sur
les tudes et recherches entreprises dans le bassin lmanique. Programme quinquennal
2006-2010. Campagne 2007, 31-55
SEQ-Eau (2003) Systme d'valuation de la qualit des cours d'eau, rapport de prsentation
SEQ-Eau. Agences de l'eau, les tudes des agences de l'eau n 64, p. 59

Le Cahier des Techniques de lInra 110


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Mthode dapproche globale de lestimation


des incertitudes de mesure

Annie Guerin et Henri Ciesielski1

Rsum : Afin de rpondre aux besoins des chercheurs ainsi quaux exigences de la norme
ISO 17025, lInra, le LAS, unit de service accrdite par le COFRAC (comit franais
daccrditation), a dvelopp une mthode originale destimation des incertitudes de
mesures. Cette mthode, base sur le traitement des donnes issues de cartes de contrle et de
rsultats dessais sur des sols dun circuit dessais daptitude, permet dtablir une relation
simple entre un rsultat (concentration en un lment) et lincertitude associe, pour
lensemble des analyses proposes.

Mots clefs : incertitude de mesure, analyse de sols

Introduction

Le laboratoire danalyses des sols dArras (LAS) est une unit de services de lInra, accrdite
par le COFRAC. Au LAS, les critres de validation dune mthode danalyse sont choisis en
fonction des objectifs de la mthode, des besoins exprims par nos partenaires et des
exigences rglementaires auxquelles nous devons nous conformer. Parmi ces critres,
lincertitude des mesures occupe une place particulire non seulement pour son intrt
scientifique mais aussi pour la difficult lestimer de faon rapide, conomique et
compatible avec le nombre dchantillons et de donnes traiter.
Lincertitude des mesures est le reflet de leur variabilit. Les sources de variabilit sont
diverses (Feinberg et Laurentie, 2006) et notamment : la prparation des chantillons
(conditions ambiantes, ractifs), la mthode de mesure (talonnage, instrument) et
lexprience de loprateur ainsi que la nature mme de lchantillon et de lanalyte considr.
Lincertitude totale (It) est donc propre un laboratoire, une matrice et un niveau de
concentration. Son calcul repose sur la rptition des analyses au sein dune mme srie mais
aussi sur la rptition des sries.
Le LAS traite plus de 25 000 chantillons de sols par an, correspondant
environ 200 000 analyses par an. Dans ces conditions, on comprendra aisment quil nest pas
envisageable destimer exprimentalement les incertitudes de mesure par des rptitions
systmatiques ncessitant du temps, une quantit dchantillons importante et pour un cot
non ngligeable. Lidal serait de disposer dun modle mathmatique simple reliant
lincertitude la mesure. Mais ce modle nexiste pas dans la littrature. Cest pourquoi nous
avons dvelopp une stratgie dvaluation des incertitudes de mesure avec pour objectif de
dfinir une relation entre la concentration en analyte et lincertitude associe. Afin dillustrer
cette dmarche, nous exposons les rsultats obtenus pour le dosage du Cadmium total dans les
sols, dos aprs minralisation totale par de lacide fluorhydrique (suivant la norme NF X 31-147).

1
US0010 LAS - Laboratoire danalyses des sols, INRA -F- 62000 ARRAS www.lille.inra.fr/las
03 21 21 86 38 Annie.Guerin@arras.inra.fr

111 Numro spcial 2010


Application dans les laboratoires de lInra

1. Principe et mthode

1.1 Dmarche gnrale


Au LAS, le suivi de la qualit des rsultats est ralis dune part laide de cartes de contrle
labores pour chaque analyse avec un sol tmoin (chantillon de contrle interne) et dautre
part en participant rgulirement des circuits inter-laboratoires. Nous avons mis
lhypothse que les donnes ainsi obtenues peuvent tre exploites pour apporter des
informations sur les incertitudes de mesure et tablir un modle mathmatique de calcul. On
peut galement supposer quen tudiant une population reprsentative des sols, compose de
sols issus dun circuit dessais daptitude, il est envisageable destimer une incertitude
sadaptant lensemble des sols.
Lincertitude totale (It) est dfinie mathmatiquement par la relation : It = k stotal (1)
avec k, facteur dlargissement, = 2 ou 3 selon de niveau de confiance choisi
(2 pour P = 0.05 et 3 pour P = 0.01)
et stotal est lcart type global.
Cet cart type global est tel que stotal = (sintra2 + sinter2)1/2 (2)
o sintra est lcart type intra srie (rptitions au sein dune mme srie)
et sinter est lcart type inter sries (li aux rptitions des sries).

Ainsi, daprs les relations (1) et (2), pour estimer lincertitude totale il nous faut valuer les
carts types intra et inter sries correspondants.
Lapproche originale dveloppe au LAS consiste estimer dune part sintra en fonction de la
concentration de lanalyste et dautre part sinter en fonction de sintra. Elle est base sur les
rsultats dessais de rptitions sur une population de sols dun circuit dessais daptitude
judicieusement choisis ainsi que sur ltude de nos cartes de contrle.
Trois hypothses sont avances pour justifier cette dmarche. Dune part, on considre que la
meilleure estimation disponible des influences respectives des facteurs de rptabilit et de
fidlit intermdiaire exprime par r = sinter / sintra est issue des cartes de contrle du LAS.

Dautre part, ayant observ sur nos cartes de contrle que le rapport r est stable pour des
analyses de mme nature (ensemble des teneurs totales en lments en traces dans les sols par
exemple), on considre quil peut tre gnralis lensemble des chantillons et divers
niveaux de concentration.
Enfin, les ventuels carts en justesse ne sont pas quantifis et sont considrs comme non
significatifs, dans la mesure o les rsultats fournis pour des essais daptitude sinscrivent
dans les fourchettes de tolrance des circuits correspondants.

1.2 Evaluation de sintra


Afin de mettre en vidence une relation entre lcart type intra srie, sintra, et la concentration
de lanalyte, C, nous avons tudi la rptabibilit des analyses de 20 sols du circuit dessais
daptitude du Bipea (Bureau InterProfessionnel dEtudes Analytiques) de caractristiques
physico-chimiques varies (tableau 1). Il sagit de sols des annes 2005, 2006 et 2007.
Ltude de la rptabilit des mesures sur un nombre restreint de sols de caractristiques
contrastes permet dvaluer sintra diffrents niveaux de concentration. Les dterminations
tudies sont de type agronomique (pH, oligo-lments, cations changeables,) et
environnementale (lments en traces mtalliques). Pour chaque type danalyse, 3 rptitions
ont t ralises. A partir des donnes obtenues, les sintra de chaque chantillon ont t calculs

Le Cahier des Techniques de lInra 112


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

puis des relations linaires de type sintra = a C + b (3) ont t recherches pour chaque
paramtre dtermin (a et b tant respectivement la pente et lordonne lorigine de la droite
de rgression linaire).

Tableau 1 : Quelques caractristiques physico-chimiques globales des sols tudis.


pH eau CEC Cd Total Argiles Limons Sables C N
(cmol+/kg) (mg/kg) (g/kg) (g/kg) (g/kg) (g/kg) (g/kg)
Mini 5.48 3.27 0.06 82 96 34 4.49 0.42
Maxi 8.38 16.2 1.04 374 825 819 112 2.44
Mdiane 7.42 13.1 0.25 180 554 217 16.4 1.35
Moyenne 7.28 11.3 0.31 203 527 270 25.0 1.39

1.3 Evaluation de sinter


Lintrt de dfinir une mthode dvaluation de sinter en fonction de sintra est de pouvoir
saffranchir de rpter les rptitions des analyses de sols du Bipea ralises pour
valuer sintra.
Le LAS dispose de cartes de contrle pour chaque type de paramtre propos, construites
partir des donnes de rptitions intra-srie et inter-sries dun chantillon de contrle interne.
A partir de ces donnes, nous avons recherch des relations de type sinter = K sintra (4) entre
les carts types intra-srie et les carts types inter-sries obtenus pour un groupe dlments
cohrent (diffrents lments doss par une mme mthode analytique par exemple) sur une
priode dun semestre. Dans le cas du dosage du cadmium total, nous avons recherch une
relation entre les sinter et les sintra obtenus pour Cd, Cr, Cu, Co, Mo, Ni, Pb, Tl et Zn, ces
lments tant tous doss par des techniques spectromtriques (ICP-AES et ICP-MS) dans le
mme minralisat de sol.

1.4 Evaluation de lincertitude de mesure


Si lon reprend les quations (1) et (2), nous obtenons :
It = k (sintra2 + sinter2)1/2
En intgrant lquation (4), cette relation devient :
It = k [sintra2 + (K sintra)2]1/2
do It = k [sintra2 (K2 + 1)]1/2
et It = k sintra (K2 + 1)1/2
En intgrant la relation (3), nous obtenons :
It = k (a C + b) (K2 + 1)1/2
do It = k a (K2 + 1)1/2 C + k b (K2 + 1)1/2
que lon peut reformuler en :
It = a C + b
avec a = k a (K2 + 1)1/2 (5)
et b = k b (K2 + 1)1/2 (6)
Ainsi, en valuant exprimentalement a et b partir de a , b et K nous
pouvons estimer lincertitude totale de mesure en fonction de la concentration mesure.

113 Numro spcial 2010


Application dans les laboratoires de lInra

2. Rsultats

Afin dallger la prsentation des rsultats, seuls quelques exemples reprsentatifs sont
exposs ci-aprs et plus particulirement celui du dosage de la teneur en cadmium total dans
les sols. La figure 1 montre la bonne relation obtenue entre les carts types intra-srie sintra et
les teneurs en Cd des 20 sols de circuit dessais daptitude tudis. Ainsi, pour Cd,
sintra=0.026C-0.001. Le coefficient a (pente de la droite) est troitement li au coefficient de
variation des mesures (CV) : une relation satisfaisante entre C et sintra est le reflet dun CV
relativement constant sur lensemble de la gamme de concentration tudie. De fait, lorsque la
relation obtenue nest pas satisfaisante, a est calcul partir du CV moyen obtenu pour
lensemble des 17 sols (a = CVm/100) et b (ordonne lorigine) est fix comme tant gal au
plus faible sintra de la srie. Il est galement possible davoir a = 0; dans ce cas lincertitude est
indpendante de la concentration, comme constat pour le pHeau (figure 2). La valeur de b
est alors fixe comme tant gale au sintra de lchantillon de contrle interne du LAS.
La figure 3 reprsente la relation entre les sinter et les sintra de lchantillon de contrle interne
du LAS issus des cartes de contrle de Cd, Cr, Cu, Co, Mo, Ni, Pb, Tl et Zn (doss aprs
minralisation totale suivant la norme Afnor NF X 31-147). Pour lensemble de ces lments,
nous considrons donc que sinter = 0.95 sintra, do K 1.
Au final, si nous reprenons comme exemple le cas de Cd total, quen est-il de lestimation de
lincertitude des mesures ?
Nous avons dfini que :
sintra = 0.026 C - 0.001 (figure 1)
sinter = 1 sintra (figure 3)
avec a = 0.026, b = -0.001 et K = 1
do, si lon reprend les relations (5) et (6) :
a = k 0.026 21/2 = k 0.037
b = k (-0.001) 21/2 = k (-0.001)
Avec k = 3, nous obtenons :
It = 0.11 C + 0.004
Ainsi, partir de cette formule, il nous est possible destimer lincertitude de mesure de la
concentration C en cadmium total dans les sols.

Figure 1 : relation entre la concentration en Cd total dans les sols et lcart type intra srie

Le Cahier des Techniques de lInra 114


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Figure 2 : relation entre le pHeau des sols et lcart type intra srie.

Figure 3 : relation entre sintra et sinter de lments en traces (Cd, Cr, Co, Cu, Mo, Ni, Pb, Tl et
Zn) dans les minralisats HF de lchantillon de contrle interne du LAS.

3. Conclusion
A partir de ltude de 20 sols de nature varie, issus dun circuit dessais daptitude et en
exploitant les donnes de ses cartes de contrle internes, le LAS a dfini une mthode propre
destimation des incertitudes de mesure dune partie des dterminations quil propose. Afin de
couvrir lensemble des dterminations du catalogue du LAS, des tudes similaires ont t

115 Numro spcial 2010


Application dans les laboratoires de lInra

ralises avec dautres sols de circuits inter-laboratoires ainsi quavec des boues. De fait, les
coefficients a et b utiliss pour estimer lincertitude des mesures sont disponibles et fournis
sur demande auprs du LAS.

Bibliographie

Bipea, rapports 2005, 2006, 2007


Feinberg M., Laurentie M. (2006) A global approach to method validation and measurement
uncertainty. Accred Qual Assur, 11: 3-9.
Norme NF X 31-147 : (Qualit des sols) : Sols, sdiments Mise en solution totale par
attaque acide

Le Cahier des Techniques de lInra 116


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Validation dune mthode de chimie analytique

Application au dosage des anions fluorure, chlorure, nitrite, bromure,


nitrate, phosphate et sulfate par chromatographie ionique

Monique Mayor, Guilhem Bourri1

La validation dune mthode de chimie analytique passe par lestimation de lerreur de


justesse, ou biais systmatique, et de lerreur alatoire, quil faut combiner pour vrifier si la
mthode remplit les objectifs qui lui ont t assigns. La construction dun modle statistique
permet dvaluer quantitativement ces notions, qui peuvent tre visualises graphiquement,
suivant la mthode du profil dexactitude (Feinberg, 2010a, b et c), et de se donner les
moyens de contrler le maintien dans le temps des performances de la chane de mesure, par
la construction des cartes de contrle.

Rsum : La validation dune mthode danalyse passe par diffrentes tapes qui visent :
(i) tester la normalit de la distribution des mesures ; (ii) estimer les composantes de
lincertitude de mesure, fidlit, justesse, spcificit ; (iii) dfinir des tests de contrle de la
non dgradation des performances de la mthode. Aprs un rappel des dfinitions et des
concepts mtrologiques, cet article prsente les diffrentes tapes qui permettent de valider
une mthode d'analyse. La mthode consiste en la construction dun modle statistique, dun
plan dexprience et lutilisation dun matriau de rfrence certifi (MRC), utilis (i) pour
valuer le biais (ou erreur systmatique ), (ii) pour calculer lincertitude compose ,
somme de lincertitude sur la moyenne ( erreur alatoire ) et de lincertitude sur la valeur
exacte du MRC et (iii) pour construire les cartes de contrle. Cette mthode est applique au
dosage des anions contenus en solution aqueuse par chromatographie ionique, et le modle
choisi est linaire. Les rsultats montrent : (i) que les distributions ne sont pas
significativement diffrentes de la loi normale ; (ii) quil existe gnralement un biais
significativement diffrent de zro et quil faut corriger ; (iii) quil n'existe aucune liaison
entre le biais et la concentration de lanalyte ; (iv) que lintervalle de confiance peut tre
calcul par application de la loi de Student avec lincertitude compose. La reprsentation
graphique suivant la mthode du profil dexactitude aide visualiser les performances de
la mthode pour chacun des analytes. La mthode des ajouts doss permet de vrifier la
spcificit de la mthode et dtablir le pourcentage de recouvrement. Les droites de
rgression obtenues permettent de corriger les concentrations brutes de lerreur
systmatique. Les cartes de contrle permettent de dceler la dgradation des performances
dans le temps et la stabilit des talonnages.

Mots cls : Anions, bromure, chimie analytique, chimiomtrie, chromatographie ionique,


chlorure, talonnage, fluorure, incertitude, nitrate, nitrite, phosphate,
statistiques, sulfate, validation.

1
UR1119, Gochimie des sols et des eaux - INRA F-13545 Aix-en-Provence
04 42 90 85 42 monique.mayor@aix.inra.fr.

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117
Application dans les laboratoires de lInra

Introduction

Toute analyse chimique ncessite des procdures de mise au point de mthodes de dosage,
dtalonnage et de validation des rsultats. La dmarche Qualit a pour objectif d'assurer la
fiabilit et la traabilit des rsultats. Nous prsentons ici le protocole exprimental et les
mthodes statistiques utilises pour valider une mthode danalyse. La dmarche est
applique ici au dosage danions en solution par chromatographie ionique et peut tre tendue
sans difficults d'autres mthodes. Plus prcisment, lobjectif de cet article est dvaluer
statistiquement la validit de cette mthode de dosage dans le domaine de concentration de
10-5 10-3 M, et de dcrire les procdures dtalonnage multiparamtrique, de correction de
biais, de calcul d'incertitude par lutilisation dtalons certifis et la mthode d'ajouts doss.

1. Principe de la mthode et description de la technique


Le choix d'une mthode analytique doit tre fait en fonction du problme pos. Au centre Inra
dAvignon, les travaux de lunit Gochimie des sols et des eaux ncessitent lanalyse des
eaux dans les sols hydromorphes et les sols sals. Dans ces milieux, la salinit totale varie trs
largement. La chromatographie ionique a lavantage dtre multiparamtrique, de ncessiter
peu dchantillon, environ 2 ml, et dtre rapide. Le dtecteur utilis ici est conductimtrique
et peu coteux.

Figure 1 : lchange ionique : (1) lanion dplace lluant ; (2) lluant dplace lanion

1.1 Principe de la chromatographie ionique

La chromatographie est une technique de sparation despces dans un mlange par partage
entre une phase mobile (gaz ou liquide) et une phase stationnaire (liquide ou solide). Chaque
solut inject dans la colonne est soumis deux effets antagonistes : lentranement par la
phase mobile dans laquelle il est soluble et la rtention par la phase stationnaire avec laquelle
il interagit. La sparation est possible grce aux diffrences daffinits de ces composs pour

Le Cahier des Techniques de lInra


118
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

les phases mobile et stationnaire. La phase stationnaire, la colonne, est un changeur dions
constitu de particules de rsine (figure 1).
Lappareil utilis est un chromatographe ionique Dionex hautes performances monocanal
modle DX 100 muni dun passeur diluteur Dionex modle AS50, le tout pilot par le logiciel
de gestion Chromlon CM-CHM-1-IC version 6.5.

Figure 2 : schma de principe d'un quipement de chromatographie ionique

1.2 Mise au point de la mthode

Il est ncessaire avant de valider une mthode doptimiser les conditions danalyse, en faisant
varier le dbit, la temprature, en modifiant la nature ainsi que la concentration de lluant, en
optimisant le choix de la colonne. On peut ainsi minimiser le temps de lanalyse, fix par le
temps du dernier compos lu, tout en prservant une bonne rsolution pour que la mthode
reste spcifique, cest--dire quelle produise une rponse uniquement pour lanalyte dintrt.

a. Colonne neuve b. Colonne dgrade


Figure 3 : dgradation des performances dune colonne de chromatographie ionique.

La rsolution de la mthode est le pouvoir de sparation des composs, elle est quantifiable
par exemple par le rapport R = d/m, o d est la distance sparant les sommets des 2 pics, et m
la moyenne des largeurs la base des pics. Si on considre des pics rapprochs, par exemple
les pics du phosphate et du sulfate, il apparat quune rsolution R = 1,12 nest pas suffisante,
mais quavec une rsolution suprieure 2, les pics sont bien rsolus. La figure 3 montre la
diffrence entre une bonne rsolution et une rsolution incorrecte due la dgradation des
performances de la colonne avec le temps.

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119
Application dans les laboratoires de lInra

2. Thorie, modle statistique et mthodes de traitement des donnes

2.1 Modle statistique

La construction dun modle statistique permet dvaluer quantitativement les grandeurs


mtrologiques dfinies ci-dessus partir de sries de rsultats exprimentaux. Le modle
choisi ici est additif : Rsultat = valeur vraie + erreur systmatique + erreur alatoire.
La dmarche choisie consiste dabord tester la normalit de la distribution des rsultats, puis
valuer lerreur systmatique, lerreur alatoire, lincertitude compose, la spcificit de la
mthode, les limites de dtection et de quantification, lintervalle de confiance du rsultat de
mesure, enfin construire la procdure de carte de contrle.

2.2 Mthodes

2.2.a Normalit

La normalit est teste en construisant la droite de Henry : si les points sont aligns sur la
droite, on ne peut pas infirmer lhypothse de normalit de la distribution.

2.2.b valuation du domaine danalyse

La dtermination du domaine danalyse permet de vrifier si la technique est adapte aux


valeurs ou aux concentrations recherches. La courbe dtalonnage peut tre linaire mais cela
ne fait pas partie des exigences. Lexigence de linarit sapplique la relation entre la
concentration calcule et la concentration introduite et non pas la fonction de rponse qui est
la relation entre le signal et la concentration introduite. Il est en revanche ncessaire que la
fonction de rponse soit strictement croissante ou dcroissante. Le calcul de la courbe
dtalonnage par la mthode des moindres carrs suppose la constance de la variance de la
rponse toutes les concentrations.

2.2.c Calcul des limites de dtection et de quantification

partir dune mesure faite sur un blanc analytique, on calcule lcart type du signal. La limite
de dtection LOD correspond la concentration qui conduit un signal dont lintensit est
gale 3 fois celle de lcart type du blanc yd = yb +3 sb. La limite de quantification LOQ est
calcule en prenant comme valeur du signal 10 fois la valeur de lcart type du blanc yq = yb
+10 sb. (ACS, 1980).

2.2.d Calcul des incertitudes

Lincertitude de la mesure, qui caractrise la dispersion, est exprime sous la forme dun
cart-type s qui est la racine carre de la somme de lensemble des variances associes aux
sources derreur :
- le biais du rsultat ou erreur systmatique est la diffrence entre lesprance des rsultats
dessais et la valeur de rfrence accepte, et dpend de la mthode, de loprateur et de
linstrument. Lestimation de lerreur systmatique, cest--dire lincertitude systmatique,
est value en utilisant un talon certifi. On obtient alors un facteur de correction, quon
applique au rsultat de mesure. Mais comme ltalon certifi (MRC) nest connu quavec

Le Cahier des Techniques de lInra


120
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

une certaine incertitude, soit umrc, celle-ci doit tre compte dans lincertitude de mesure.
Cette incertitude est donne par lorganisme certificateur, sous la forme de lincertitude
largie, Umrc, telle que : U mrc = kmrcumrc . Sauf indication contraire, dment documente,
kmrc = 2 pour un niveau de confiance de 95 % (Taylor et Kuyatt, 1994) ;

- la fidlit ou erreur alatoire, est dfinie comme la dispersion de la moyenne. Son


estimation, ou incertitude alatoire est :
ua = s / n , (1)
O n est le nombre de mesures. Le matriau de rfrence certifi doit avoir une matrice
identique celle des chantillons. Ceci implique lgalit des variances et peut galement tre
test par la mthode des ajouts doss. Dans ces conditions, s est mesur sur le MRC. On
obtient donc lincertitude compose :
2 2
2 U s
uc = umrc + ua2 , ou encore uc = mrc + . (2)
k mrc n

2.2.e Calcul de lintervalle de confiance du rsultat

Lintervalle de confiance au seuil (niveau de confiance 1-) dlimite la zone dans laquelle
se trouve probablement la moyenne de la population do est extrait lchantillon. On fixe le
risque acceptable pour cette affirmation. Lintervalle de confiance 95 % signifie que lon
accepte un risque de 5 % de se tromper en affirmant que la moyenne de la population est
comprise entre [moyenne - IC et moyenne + IC].
Si x est la grandeur recherche (exemple la concentration) et y la grandeur mesure (exemple
la hauteur du pic) et si ltalonnage linaire est donn par la droite de rgression de x par
rapport y, alors x = C1 y + C2, et lintervalle de confiance de la moyenne de n mesures est :
x k ( , v )uc , (3)

O x est la moyenne corrige de toutes les erreurs systmatiques identifies, k suit une loi de
Student degrs de libert, = n 1, est le niveau de confiance, gnralement = 0,05
pour P = 0,95, n est la taille de l'chantillon, et uc est lincertitude compose dfinie ci-dessus.
Le produit Uc = kuc est lincertitude largie.

2.2.f Spcificit

La spcificit est la capacit tablir lexistence de la substance analyser en prsence


dautres composants prsents. Il sagit de dmontrer que la substance analyse au sein de la
matrice est bien lanalyte recherch. La spcificit se fonde sur une absence dinterfrences.
Elle sera estime par la mthode des ajouts doss en calculant le pourcentage de
recouvrement.

Numro spcial 2010


121
Application dans les laboratoires de lInra

3. Protocole exprimental

Le protocole exprimental est prsent dans le tableau 1, et lensemble des tapes dans le
tableau 2.
Tableau 1 : protocole exprimental

Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4 Jour 5

Prparation des Plan dtalonnage Plan dtalonnage Plan dtalonnage


solutions multilments Fidlit Fidlit Fidlit
Mettre les sels 3 rptitions des 3 rptitions des 3 rptitions des
dshydrater dans 0, 1 ; 0,25 ; 0,5 et 1 solutions solutions solutions
ltuve 105 C mmol/l en Fluorure, multilments, multilments, multilments,
pendant 24 h en vue de Chlorure, Nitrite, niveaux niveaux niveaux
la prparation de la Bromure, Nitrate, 1, 2, 3, 4 1, 2, 3, 4 1, 2, 3, 4
solution multilments Phosphate, Sulfate
Dilution de la solution Plan de validation Plan de validation Plan de validation
certifie multilment Justesse Justesse Justesse
1 mmol/l au 1/10 ; 1/4 ; 5 rptitions des 5 rptitions des 5 rptitions des
1/2 en Fluorure, Chlorure, solutions certifies, solutions solutions
Nitrite, Bromure, Nitrate, niveaux 1, 2, 3, 4 certifies, niveaux certifies, niveaux
Phosphate, Sulfate 1, 2, 3, 4 1, 2, 3, 4
Normalit de la Spcificit
distribution : 30 Doser la matrice
rptitions de la solution seule et la matrice
certifie 0,5 mmol/L + 3 concentrations
dajouts doss

- Pour vrifier la normalit de la distribution, nous mesurons 30 fois le matriau de


rfrence certifi sous des conditions de rptabilit.

- Pour apprcier la fidlit, nous utilisons le plan dtalonnage en faisant 9 rptitions des
solutions multilments prpares sans la matrice, 4 niveaux de concentrations, (0,1
mmol/l; 0,25 mmol/l ; 0,5 mmol/l et 1 mmol/l) ; les dosages sont raliss sur 3 jours avec
le mme oprateur. Lquation de la droite dtalonnage journalire est utilise pour
calculer les concentrations qui serviront pour le calcul de justesse. Le coefficient de
variation CV des aires est calcul pour les 7 analytes, ceci pour les diffrents niveaux de
concentration.

- Pour apprcier la justesse, nous mesurons 15 rptitions du matriau de rfrence certifi


multilment (MRC) de valeurs connues, ralises sur 3 jours ceci aux 4 niveaux de
concentrations ci-dessus (tableau 1), ce qui permet dapprcier la correction apporter au
rsultat obtenu, ainsi que deffectuer les calculs dincertitudes.

- Pour apprcier la spcificit et les effets de matrice, nous dosons un chantillon de


solution du sol reprsentatif du contexte gochimique tudi, dabord seul, puis aprs
addition de lanalyte trois concentrations diffrentes.

Le Cahier des Techniques de lInra


122
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Tableau 2 : rsum des diffrentes tapes de la validation

Principales tapes Protocole Tests et calculs


30 rptitions du matriau de rfrence
certifi : MRC multilment une
Vrification de la
concentration de 0,5 mmol/l en Fluorure,
normalit de la Vrification visuelle et droite de Henry
Chlorure, Nitrite, Bromure, Nitrate,
distribution
Phosphate, Sulfate sous des conditions de
rptabilit.
9 rptitions des Solutions multilments Calcul de la moyenne, variance, cart-
Plan dtalonnage : prpares sans la matrice, 4 niveaux de type des 9 mesures et du coefficient de
Fidlit concentrations, dosages raliss 3 jours s
variation CV = 100.
diffrents avec le mme oprateur. x
15 rptitions du matriau de rfrence Biais ou erreur systmatique :
certifi multilment de valeurs connues Diffrence entre rsultat obtenu et valeur
Plan de validation : fournie par le laboratoire certifi.
raliss sur 3 jours diffrentes, ceci 4
Justesse
niveaux de concentrations, ce qui permet Erreur alatoire : ua = s / n
dapprcier la correction apporter au
tenir compte de lincertitude de ltalon
rsultat obtenu ainsi que les calculs des
incertitudes. U crm = kcrmucrm
Incertitude de la mesure :
uc = ucrm 2 + ua 2
Intervalle de confiance du rsultat
(t de Student) x t ( , )uc
Spcificit
Calculer le taux de recouvrement,
Vrification de
partir des pentes des droites de
labsence dun effet de
Par la mthode des ajouts doss, en dosant rgression et dmontrer la linarit entre
matrice
un chantillon de solution du sol sans ajout les concentrations calcules et les
et avec 3 ajouts successifs. concentrations introduites.
LOD : yd = yb +3 sb,
A laide de mesures faites sur un blanc
LOQ : yd = yb +10 sb,
analytique, on dduit la valeur du bruit de
Dduire les concentrations de LOD et
valuation du fond yb qui est la rponse au blanc
LOQ partir de la valeur de leur signal
domaine danalyse, terrain
grce lquation : x = C1 y + C2 de la
Limite de Dtection et
droite dtalonnage de chaque lment.
de Quantification
Courbe dtalonnage : sassurer que la
Et on calcule lcart-type de la rponse au
fonction de rponse est strictement
blanc terrain sb
croissante ou dcroissante.

Pour valider une mthode, il faut :

- que les CV dans des conditions de fidlit intermdiaire soient infrieurs une valeur de
tolrance, par exemple 10 % ;

- que la rgression permettant de relier les concentrations calcules aux concentrations


introduites soit parfaitement linaire dans la gamme de concentrations tudies ;

- que la diffrence entre le rsultat obtenu et la valeur vraie inconnue de lchantillon soit
petite ou du moins infrieure une limite dacceptation : pour cela, les estimateurs de biais
et de variance obtenus grce des expriences effectues sur des chantillons connus nous
renseignent si la procdure va pouvoir quantifier avec une exactitude suffisante.

Numro spcial 2010


123
Application dans les laboratoires de lInra

4. Rsultats et discussion
Les rsultats (histogramme et droite de Henry) montrent que lhypothse de normalit de la
distribution ne peut pas tre rejete.
4.1 La fidlit
Les rsultats complets pour la fidlit sont reports dans le tableau 3. Toutes les valeurs des
coefficients de variation sont infrieures 4 %. La valeur admise dans notre protocole est de 10 %.
Tableau 3 : rsultats du test de fidlit, aux quatre niveaux de concentration des solutions multilments.
Valeurs en aires de pics (S min)
F- Cl - NO2- Br - NO3- P-PO43- SO42
Solution multilment 0,10 mmol/l
Moyenne 0,547 0,688 0,526 0,655 0,658 0,502 1,324
cart type 0,015 0,017 0,018 0,013 0,021 0,019 0,034
Variance 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,001
CV 2,74 % 2,44 % 3,40 % 1,98 % 3,25 % 3,79 % 2,59 %
Solution multilment 0,25 mmol/l
Moyenne 1,439 1,883 1,416 1,730 1,661 1,324 3,463
cart type 0,032 0,038 0,027 0,032 0,028 0,026 0,066
Variance 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,004
CV 2,24% 2,02% 1,88% 1,83% 1,66% 1,99% 1,90%
Solution multilment 0,5 mmol/l
Moyenne 2,974 3,750 2,900 3,514 3,409 2,747 7,104
cart type 0,094 0,122 0,089 0,104 0,103 0,065 0,210
Variance 0,009 0,015 0,008 0,011 0,011 0,004 0,044
CV 3,17% 3,25% 3,09% 2,97% 3,03% 2,38% 2,95%
Solution multilment 1 mmol/l
Moyenne 6,167 8,184 6,168 7,682 7,369 5,815 15,358
cart type 0,155 0,165 0,105 0,147 0,140 0,126 0,338
Variance 0,024 0,027 0,011 0,022 0,020 0,016 0,114
CV 2,51% 2,02% 1,70% 1,91% 1,90% 2,17% 2,20%

4.2 La justesse
Les rsultats du test de justesse montrent (non prsents ici, donnes disponibles sur demande) que
le biais (estimation de lerreur systmatique) est significativement diffrent de zro, en gnral
positif, ce qui correspond une surestimation ; il est ngatif pour le chlorure et pour le fluorure et
pour ce dernier, le biais maximum est observ la concentration 0,1 et atteint - 6,2 %, ce qui est
considrable. On nobserve pas de variation ordonne du biais avec la concentration. Il faut donc
corriger les valeurs mesures de ce biais estim.
Une fois corriges de ce biais, les valeurs sont accompagnes dune incertitude compose obtenue
selon lquation ci-dessus (q. 2), qui permet de calculer lintervalle de confiance du rsultat. Ici, le
nombre de mesures effectues pour estimer la moyenne de la concentration dun chantillon
inconnu est de 5. Lintervalle de confiance est donc obtenu par application de lquation (3) avec n
= 5, k (0,95 ; 4) = 2,78 et uc lincertitude compose. Les rsultats obtenus montrent que les
moyennes journalires sont comprises dans les intervalles de confiance de la moyenne ainsi
calculs. Elles peuvent donc tre considres comme des estimations indpendantes de la mme
grandeur. Ceci veut dire que les performances instrumentales et que ltalonnage sont rests stables
pendant les 3 jours conscutifs des mesures. On peut en dduire galement le nombre de mesures
ncessaires pour obtenir un intervalle de confiance sur la moyenne donne, puisquon est dans les
conditions de validit de la loi normale.

Le Cahier des Techniques de lInra


124
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

4.3 Les profils dexactitude


Une autre reprsentation possible est celle du profil dexactitude (Feinberg, 2000a et b, 2006,
2010a, b, c,). On se fixe une limite dacceptabilit (ici 10 %) et une probabilit de tolrance (95 %).
Par exemple pour le sulfate (tableau 4, figure 4) au niveau 3, concentration moyenne du MRC, le
biais a une valeur de 3,9 % avant correction et le taux de recouvrement est de 103,9 %.

Tableau 4 : profil dexactitude du sulfate


Avant correction du biais Aprs correction du biais
Probabilit tolrance (bta) 95 % 95 %
Limite d'acceptabilit 10 % 10 %
Niveaux 1 2 3 4 1 2 3 4
Valeur cible 0,100 0,250 0,500 1,000 0,100 0,250 0,500 1,000
Moyenne niveau 0,101 0,259 0,519 1,020 0,097 0,249 0,500 0,981
cart-type de fidlit (sFI) 0,002 0,006 0,003 0,021 0,002 0,006 0,004 0,021
Valeur basse tolrance 0,097 0,246 0,512 0,974 0,093 0,236 0,492 0,935
Valeur haute tolrance 0,105 0,271 0,527 1,066 0,101 0,261 0,509 1,027
Biais (%) 1,07 3,49 3,89 2,00 -2,90 -0,51 0,05 -1,90
Recouvrement (justesse) (%) 101,07 103,49 103,9 102,00 97,10 99,49 100,05 98,10
Limite basse tolrance (%) 97,18 98,57 102,38 97,42 93,27 94,57 98,37 93,52
Limite haute tolrance (%) 104,95 108,42 105,40 106,58 100,93 104,42 101,74 102,68
Limite d'acceptabilit basse 90,00 90,00 90,00 90,00 90,00 90,00 90,00 90,00
Limite d'acceptabilit haute 110,00 110,00 110,00 110,00 110,00 110,00 110,00 110,00

a)

b)
Figure 4 : profil dexactitude du sulfate
a) avant correction du biais ; b) aprs correction du biais

Numro spcial 2010


125
Application dans les laboratoires de lInra

La correction du biais (figure 4b) permet de satisfaire plus largement au critre


dacceptabilit, et ramne le taux de recouvrement 100 %. Les profils dexactitude pour les
autres analytes sont reprsents sur les figures 5 10 et dmontrent que la mthode pour ces
lments est parfaitement adapte aux objectifs fixs : elle est donc valide sans avoir
affecter un facteur de correction aux futures mesures.

Figure 5 : profil dexactitude du fluorure

Figure 6 : profil dexactitude du bromure

Figure 7 : profil dexactitude du chlorure

Le Cahier des Techniques de lInra


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Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Figure 8 : profil dexactitude du nitrate

Figure 9 : profil dexactitude du nitrite

Figure 10 : profil dexactitude du phosphate

Numro spcial 2010


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Application dans les laboratoires de lInra

4.4 La spcificit et labsence deffets de matrice


Elles sont estimes par la mthode des ajouts doss (figure 11 et tableau 5). Dans tous les
cas, on observe une trs bonne linarit entre la concentration retrouve et la concentration
ajoute. Toutes les valeurs du test de Fisher sont largement suprieures la valeur limite. Les
pourcentages de recouvrement obtenus par la mthode des ajouts doss sont dduits des
pentes des droites de rgression. Des tests sur les ordonnes lorigine ont montr que celles-
ci ntaient pas significativement diffrentes de zro. Les pentes des droites de rgression ont
donc t recalcules en forant le passage par lorigine. Les pentes des droites de rgression
donnent alors directement le pourcentage de recouvrement.

Figure 11 : relation linaire entre concentration retrouve et concentration ajoute par la


mthode des ajouts doss. Cas du fluorure

Tableau 5 : pourcentages de recouvrement obtenus par la mthode du profil dexactitude et


par la mthode des ajouts doss.
a. moyenne des 4 valeurs de gamme ; b. pente de la droite de rgression force passer par lorigine

Analyte Profil dexactitude a Ajouts doss b


Fluorure 98,0 98,3
Chlorure 100,0 102,2
Nitrite 102,0 96,5
Bromure 102,0 95,0
Nitrate 101,6 95,4
Phosphate 100,5 97,9
Sulfate 102,6 100,2

Les valeurs obtenues par les pentes des droites de rgression sont diffrentes des valeurs
obtenues par la mthode du profil dexactitude, et plus loignes de 100 %. Ceci peut tre
attribu au fait que la mthode du profil dexactitude a t applique des solutions
multilments en solution pure, tandis que la mthode des ajouts doss intgre leffet de
matrice sur un chantillon naturel reprsentatif du milieu gochimique tudi. On peut
considrer que la mthode du profil dexactitude (figures 4 10) permet de visualiser lordre
de grandeur des biais des mthodes, mais quil vaut mieux utiliser les droites de rgression
obtenues (figure 11) pour corriger les concentrations brutes, car ces droites tiennent compte
de leffet de matrice.

Le Cahier des Techniques de lInra


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Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Dans ces conditions, le rsultat danalyse est simultanment corrig des effets de matrice et
du biais suivant la relation :
x = (C1 y + C2 ) / C3 k ( , v)uc , (4)

O C1 et C2 sont les coefficients de la courbe de rponse, ici suppose linaire, et C3 le


pourcentage de recouvrement divis par 100.

4.5 Les limites de dtection (LOD) et de quantification (LOQ)

Elles sont reportes dans le tableau 6. Par convention :


y < LOD : lanalyte nest pas dtect ;

LOD < y < LOQ : lanalyte est dtect, mais non quantifiable ;

LOQ < y : lanalyte est quantifiable.

Tableau 6 : limites de dtection et de quantification des mthodes (mmol/l)

Analyte Fluorure Chlorure Nitrite Bromure Nitrate Phosphate Sulfate


LOD 0,018 0,013 0,018 0,014 0,015 0,019 0,007
LOQ 0,060 0,045 0,060 0,047 0,050 0,063 0,024

Les LOD sont toutes de lordre de 15 20 mol/l, sauf celle du sulfate, qui est deux fois plus
faible. Ceci est d la pente plus grande de la droite dtalonnage, qui traduit une sensibilit
plus grande, du fait que le sulfate est un ion bivalent. La chromatographie ionique semble
donc plus performante pour le dosage des sulfates, qui pose problme avec les mthodes
traditionnelles comme la nphlomtrie aprs prcipitation du sulfate de baryum.

5. Tests de conformit
Les tests de conformit sont des tests permettant de vrifier que, pendant lanalyse, les
performances du systme restent compatibles avec le cahier des charges de la mthode.
La vrification permet de sassurer que les carts entre les valeurs indiques par un appareil
de mesure et les valeurs connues correspondantes dune grandeur mesure sont tous infrieurs
aux erreurs maximales tolres.

5.1 Construction de la carte de contrle et calcul des erreurs maximales tolres.

La carte de contrle est un enregistrement utilis pour contrler la stabilit dune mthode
dans le temps. On utilise comme talon de surveillance le Matriau de Rfrence Certifi
(MRC) qui a servi au contrle de la justesse. On ralise un nombre assez important de
mesures groupes en sries, les rsultats sont reports sur un graphique. Il est prfrable de
faire une moyenne sur une trentaine de rptitions au moins et dans ces conditions, les valeurs
du t de Student peuvent tre prises gales 2 et 3 respectivement.

Numro spcial 2010


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Application dans les laboratoires de lInra

Les limites de surveillance LS et de contrle LC sont calcules suivant les formules :


LS = moyenne 2 uc, (5)
LC = moyenne 3 uc, (6)
et reportes sur la carte.

5.2 Surveillance
La surveillance complte les oprations de vrification et dtalonnage afin de dtecter les
drives ventuelles de lquipement entre ces mesures.
Il sagit denregistrer les carts entre les valeurs dindication de lquipement de mesure et les
valeurs vraies du contrle certifi. Ces oprations de surveillance sont consignes sur des
enregistrements tels que la carte de contrle. A chaque nouvelle analyse, le rsultat du
contrle est ajout, ce qui permet de vrifier sil est bien lintrieur des limites admises, et
ainsi dentreprendre des actions correctives si ncessaire. Cela permet galement de contrler
au cours du temps que les valeurs exprimentales sont rparties dune faon alatoire par
rapport la moyenne et de nous alerter sur une ventuelle drive de lappareil (Tableau 7).

Tableau 7 : rsum des tapes de la surveillance


Principales tapes Protocole Tests
d
R= ,
1-Vrification m
dun taux de rsolution correct d est la distance sparant les sommets des 2
R > 1,2 pics, et m la moyenne des largeurs la base
des pics.
dune bonne rptabilit CV < 5% s
coefficient de variation CV = 100,
x
Calculer, Moyenne, Variance s2
- Erreur alatoire : ua = s / n
- Incertitude de la mesure :
2 2
30 rptitions du matriau uc = umrc + ua
de rfrence certifi MRC tenir compte de lincertitude de ltalon
multilment, une U mrc = k mrc umrc
concentration de 0,5 mmol/L -Intervalle de confiance du rsultat (t de
2-Construction de la carte de
en Fluorure, Chlorure, Student) x t( , )uc
contrle
Nitrite, Bromure, Nitrate,
valuer les limites de surveillance et de
Phosphate, Sulfate,
contrle
sous des conditions de
LS = moyenne 2 uc,
reproductibilit
LC = moyenne 3 uc
Construire la carte de contrle avec les
limites infrieures et suprieures des LS et
LC en fonction de la valeur moyenne de la
solution certifie .
Sassurer que les valeurs du MRC sont
comprises lintrieur des limites de
Insrer dans la squence
surveillance
analytique le MRC peu
3-Surveillance quotidienne Pour les chantillons analyser, sassurer
prs tous les 5 chantillons, il
que la concentration obtenue est suprieure
sert de contrle
la Limite de Quantification et se trouve bien
lintrieur du domaine danalyse

Le Cahier des Techniques de lInra


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Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

On fait correspondre sur cet enregistrement un point chacune des valeurs dune statistique
calcule sur des chantillons successifs ; chacun de ces points a pour abscisse le numro de
lchantillon et pour ordonne la valeur de la statistique calcule sur cet chantillon.
Le but de ces tests de surveillance est de nous alerter en cas danomalie. Reste dfinir quels
seront les critres utiliss pour considrer ce qui sera anormal. Nous dcidons dans notre cas
dtre vigilants lorsquune mesure sort des limites de contrle, ce qui dclenchera la rptition
du contrle pour confirmer ou infirmer la drive et nous alertera lorsque la rpartition des
mesures fait suspecter un comportement non alatoire. Un exemple de test de surveillance
donn par le logiciel Chromlon est report sur la figure 12. On peut constater que le
contrle ne sort pas des limites autorises.

Figure 12 : test de surveillance quotidienne


Conclusion
La dmonstration de la normalit des distributions ne ncessite pas dtre rpte. Lors de la
mise au point de la mthode danalyse, ce test est ncessaire et permet dassurer la validit de
lemploi des statistiques classiques et de leur puissance. Nous avons utilis ici un modle
statistique linaire, qui permet destimer le biais ou incertitude systmatique ( erreur
systmatique) et lincertitude alatoire. Les rsultats montrent que le biais nest pas
ngligeable et doit tre corrig. Lemploi dun Matriau de Rfrence Certifi (MRC)
simpose cette fin. Ce MRC tant lui-mme connu avec une incertitude, donne par le
fabricant, cette incertitude doit tre ajoute lincertitude alatoire, pour donner lincertitude
compose. Cest cette dernire qui est utilise pour calculer lintervalle de confiance de la
mesure. Ici, comme aucune relation na t observe entre lincertitude compose et la
concentration, la valeur de lincertitude compose obtenue pour une valeur de concentration
moyenne (milieu de gamme) a t retenue par souci de simplification. La mthode du profil
dexactitude visualise lintrt de corriger du biais et les limites dacceptabilit. La mthode
des ajouts doss permet destimer le pourcentage de recouvrement et de vrifier la linarit
entre concentration retrouve et concentration ajoute dans la matrice mme des chantillons
analyss, cest--dire pour des chantillons reprsentatifs des milieux tudis. Les droites de
rgression obtenues sont utilises pour corriger des biais systmatiques les concentrations

Numro spcial 2010


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Application dans les laboratoires de lInra

brutes donnes par la courbe de rponse. Lincertitude compose est galement utilise pour
calculer les limites de lintervalle de confiance acceptables, par une mesure rgulire du
MRC, qui sert ainsi effectuer les tests de surveillance et alerter en cas de dgradation des
performances de la chane de mesure. Lchantillon doit bien sr dabord se situer au dessus
de la limite de quantification LOQ.

Matriel supplmentaire :

Lensemble des donnes et des tableaux peuvent tre fournis sur demande.

Bibliographie
ACS (1980) Guidelines for Data Acquisition and Data Quality Evaluation in Environmental
Chemistry, Analytical chemistry, 52, 14, 2242-2249
AFNOR (1994a) Norme franaise NF X 07-001 -Vocabulaire International des termes
fondamentaux et gnraux de mtrologie
AFNOR (1994b) Norme NF ISO 5725-1 : Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure. Partie 1 : Principes gnraux et dfinitions.
AFNOR (1994c) Norme NF ISO 5725-2 : Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure. Partie 2 : Mthodes de base pour la dtermination de la
rptabilit et de la reproductibilit dune mthode de mesure normalise.
AFNOR (1994d) Norme NF ISO 5725-4 : Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure. Partie 4 : Mthodes de base pour la dtermination de la justesse
dune mthode de mesure normalise.
AFNOR (1996) Mtrologie dans lentreprise : outil de la qualit.
AFNOR (1998) Norme NF ISO 5725-5 : Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure. Partie 5 : Mthodes alternatives pour la dtermination de la
fidlit dune mthode de mesure normalise.
AFNOR (1999) Norme XP T90-210 : Protocole dvaluation dune mthode alternative
danalyse physico-chimique quantitative par rapport une mthode de rfrence.
Feinberg M. (2000) La validation des mthodes danalyse. Le cahier des Techniques de
lInra, 44, 19-49.
Feinberg M. (2003) Lincertitude des mesures analytiques. Le cahier des Techniques de
lInra, 50, 3-10
Feinberg, M. (2006) Approche globale et harmonise de la validation. Spectra Analyse, 249,
avril-mai 2006, 16-23.
Feinberg M. (2010a) Principes et vocabulaire in Validation des mthodes danalyse
quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra, numro
spcial, 13-25
Feinberg M. (2010b) Mise en uvre du profil dexactitude in Validation des mthodes
danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial, 27-44

Le Cahier des Techniques de lInra


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Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Feinberg M. (2010c) Interprtation du profil dexactitude in Validation des mthodes


danalyse quantitative par le profil dexactitude. Le Cahier des Techniques de lInra,
numro spcial, 45-59
ISO (1997) Guide 32 : talonnage en chimie analytique et utilisation de matriaux de
rfrence certifis.
ISO (2000) Guide 33 : Utilisation des matriaux de rfrence certifis.
Taylor B.N. et Kuyatt C.E. (1994) Guidelines for Evaluating and expressing the Uncertainty
of NIST Measurement Results, NIST Technical Note 1297, 1-20

Numro spcial 2010


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Application dans les laboratoires de lInra

Le Cahier des Techniques de lInra


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Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Conclusion

Franois Jacquet1

La validation des mthodes danalyse quantitative physico-chimique utilises


pour produire des mesures justes et fiables est une proccupation constante des
analystes et des destinataires des rsultats des analyses, car elle permet de
renforcer la confiance dans la qualit de ces rsultats mesurables en assurant leur
fiabilit.
La validation des mthodes est un deuxime pilier, complmentaire la matrise
des instruments et des quipements, pour atteindre l'objectif de validit des
rsultats mesurables qui est lun des objectifs de la politique qualit de lInra. La
rflexion est en cours pour lintgration de la validation des mthodes danalyse
quantitative dans une future version du rfrentiel qualit Inra.

Afin de dcrire et dexpliquer cette dmarche de validation des mthodes dans


les laboratoires, deux coles des techniques Validation des mthodes d'analyse
quantitative physico-chimique , en 2007 et 2008, ont rassembl plus de cent
participants.
Je remercie tous les collgues qui ont contribu ces coles, en les organisant
et / ou en y intervenant : Sandra Arrault, Olivier Berdeaux, Laurent Debrauwer,
Marjolaine Deschamps, Martine Dupupet, Denys Durand, Max Feinberg,
Christophe Garin, Annie Guerin, Guy Jamet (DGCCRF), Anne Jaulin,
Michel Laurentie (AFSSA), Jrme Lazzarotto, Patricia Manzanno,
Marie-Andre Piedallu, Thierry Prunet et Agns Thomas. Ces coles ont t
soutenues par les Dpartements ALIMH, CEPIA, EA et PHASE, la Formation
permanente nationale et la Mission qualit / Dlgation la qualit.

1
Dlgu la qualit de lINRA - F- 75338 Paris cedex 03 francois.jacquet@paris.inra.fr

135 Numro spcial 2010


Plusieurs approches, normes, mthodologies sont dcrites pour la validation des
mthodes. Le profil dexactitude est lapproche, tout rcemment intgre dans
une norme (V03-110:2010), que nos experts et praticiens ont juge la mieux
adapte au contexte des laboratoires de recherche.
Ce numro du Cahier des Techniques de lInra sera une aide prcieuse pour les
quipes dans la mise en uvre de la validation de leurs mthodes danalyse par
le profil dexactitude.
Je remercie les auteurs des articles de ce numro du Cahier des Techniques, et
plus particulirement Max Feinberg et Michel Laurentie (AFSSA) qui ont mis leur
expertise au service de la relecture des articles, ainsi que Marie Huyez-Levrat,
cheville ouvrire du Cahier des Techniques de lInra, et la Dlgation au
partenariat avec les entreprises de la Direction de la valorisation de lInra.

La Dlgation la qualit soutient les actions des dpartements de recherche qui


vont favoriser et accompagner cette mise en uvre, en particulier par des
formations, et contribuera toute autre action utile pour la gnralisation de la
validation des mthodes danalyse :
mise en application de la validation des mthodes danalyse qualitative
physico-chimique telle que prsente dans ce cahier ;
adaptation de ces mthodes dautres natures danalyse quantitative ;
travaux en vue de la construction doutils et mthodes de validation de
mthodes danalyse semi-quantitatives ou qualitatives.

Pour la mise en uvre, vous pourrez aussi faire appel, via la liste de diffusion
validation-analytique-et-maitrise :
http://listes.inra.fr/wws/info/validation-analytique-et-maitrise 2
et, aux experts et praticiens de la validation des mthodes, que je remercie de
poursuivre ainsi leur implication dans la diffusion de ces mthodes, et de
contribuer lamlioration de la garantie de la fiabilit des rsultats sur lesquels
nombre de publications se fondent.

Avec tous mes encouragements et vux de russite pour vos mises en


application dans vos laboratoires.

2
Pour sy abonner, contacter Christophe.Garin@paris.inra.fr

Le Cahier des Techniques de lInra 136


Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Index des auteurs

Nom Prnom page

Bourdat-Deschamps Marjolaine 85
Bourri Guilhem 117,
Ciesielki Henri 111
Durand Denys 73
Feinberg Max 5, 13, 27, 45
Guerin Annie 111
Laurentie Michel 61
Lazzarotto Jrme 99, 107
Maherou Jennifer 99
Mayor Monique 117
Ortigues-Marty Isabelle 73

137 Numro spcial 2010


Le Cahier des Techniques de lInra 138
Validation des mthodes danalyse quantitative par le profil dexactitude

Index des articles

page

3
Introduction
5 Tmoignages de directeurs dunit sur les coles techniques

11 Chapitre 1 Validation des mthodes

13 Principe et vocabulaire, Max Feinberg


27 Mise en uvre du profil dexactitude, Max Feinberg
45 Interprtation du profil dexactitude, Max Feinberg
61 Complment sur la quantification : pondration et transformation, Michel Laurentie

71 Chapitre 2 Application dans les laboratoires lInra

73 Enjeux de la validation pour lexprimentation en nutrition animale, Agns Thomas,


Denys Durand et Isabelle Ortigues-Marty
85 Validation de lanalyse des HAP dans les eaux de pluie par la mthode du profil
dexactitude, Marjolaine Bourdat-Deschamps
99 Validation de la mthode de dosage du pigment chlorophylle a dans leau douce par
extraction et par HPLC-DAD, Jrme Lazzarotto et Jennifer Maherou
107 Validation dune mthode automatise de titration de lalcalimtrie complte dans
leau douce, Jrme Lazzarotto
111 Mthode dapproche globale de lestimation des incertitudes de mesure, Annie
Guerin et Henri Ciesielki
117 Validation dune mthode de dosage des anions fluorure, chlorure, nitrite, bromure,
nitrate, phosphate et sulfate par chromatographie ionique, Monique Mayor et
Guilhem Bourri

Conclusion

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Le Cahier des Techniques de lInra 140
Numro spcial

Anne 2010

Validation des mthodes danalyse quantitative


par le profil dexactitude

Sommaire

Introduction p. 03

Tmoignages sur les coles techniques p. 05

Chapitre I : Validation des mthodes p. 11

Chapitre II : Application dans les laboratoires lInra p. 71

Conclusion p. 135

Index des auteurs p. 137

Index des articles p. 139

Participation de la Dlgation la qualit et des dpartement s : AlimH, Cpia, EA, Phase , SA et SPE Responsables scientifiques :
Max Feinberg et Michel Laurentie Comit ditorial : Christophe Garin, Annie Gurin, Marie Huyez-Levrat, Franois Jacquet,
Directeur de la Publication : Jean-Franois Quillien , Responsable du Cahier des Techniques de lInra : Marie Huyez-Levrat


Photos Inra - Impression : Jouve 18, rue saint Denis 75001 Paris - N ISSN 0762 7939

https://intranet.inra.fr/cahier_des_techniques