UNIVERSITE HASSAN II

FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE DE CASABLANCA

Manuel des travaux pratiques

d’hématologie biologique

2ème année de pharmacie

2023 - 2024

Pr. Norddine HABTI

Dr. Ahmed TISSENT
Mr. Driss LABIED
 Avant-propos
Avertissement : l’enseignement théorique et pratique sont complémentaires et indivisibles du
module d’hématologie biologique. L’étudiant se doit d’intégrer et de mobiliser toutes ses
connaissances.

Planning des TP
9h - 10h30 : TP n°1 : Frottis sanguin
10h30 – 12h : TP n°2 + TP n°3 : Groupage sanguin et test de Coombs direct

Instructions aux étudiants :

Avant les TP
L’étudiant doit avoir rédigé les parties « Introduction et Matériels et méthodes » de son compte-rendu
qu’il complètera pendant la séance du TP. Pour ce faire, l’étudiant doit connaître le but et le principe
de ces expériences et leur déroulement avant de les commencer. Toutes les informations nécessaires à
la réalisation des expériences sont contenues dans le polycopié. L’étudiant doit avoir lu le polycopié
et préparé ses questions avant de venir en TP. Il doit imaginer quel type de résultat obtenir et comment
l’obtenir et l’exploiter. Un lien de vidéo de démonstration technique est communiqué aux étudiants.

Pendant les TP
Lors de la réalisation des expériences, il faut noter de façon claire et précise ce que l’on exécute et les
résultats obtenus pour chaque échantillon, de façon à être capable de dire à quoi ils correspondent des
mois plus tard. La reproductibilité des résultats dépend de l’attention que l’on porte aux détails.
L’étudiant doit :
1. Se munir de :
- Une trousse complète : marqueur feutre permanent, crayon, gomme, règle…
- Papier mouchoir (absorbant).
2. Présenter sa carte d’étudiant ou une pièce d’identité au début de la séance
3. Respecter les horaires
4. Préparer son TP au préalable : étudier le manuel et la vidéo de démonstration
5. Respecter la répartition des groupes
6. Vérifier au début de la séance, le matériel nécessaire aux manipulations et s’assurer qu’il ne
manque rien
7. Porter une blouse blanche et des gants pendant les séances des TP
8. Signaler à l’enseignant toute détérioration de matériel et incident au cours de la séance
9. S’abstenir de fumer, manger ou boire pendant la séance
10. Avant de quitter la salle, nettoyer la paillasse et le matériel utilisé et le ranger
11. Rédiger des comptes rendus individuels : voir consignes et recommandations ci-après
12. Remettre les comptes rendus des TP : voir les instructions de l’administration

Tout étudiant ne respectant pas ce règlement sera sanctionné

 Consignes et recommandations pour la rédaction du compte-rendu
Le compte-rendu (texte et figures) doit être réalisé comme un article scientifique et remis à l’enseignant
à la fin chaque séance. Il doit comporter au maximum 4 pages
- 1 page de garde avec titre du compte rendu, nom de l’étudiant, n° du binôme
- 1/2 page maximum d’introduction
- 1/2 page maximum de matériel et méthodes
- 1 page maximum de résultats
- 1/2 page maximum de discussion et conclusion

Introduction : elle doit expliquer «la théorie et le pourquoi » de l’expérience ainsi que les objectifs
que l’on espère atteindre. Il faut décrire clairement le but de l’expérience et présenter les questions
auxquelles l’expérience tente de répondre. Il faut aussi donner toutes les informations complémentaires
pré-requises pour comprendre le problème et les questions posées.

Matériel et méthodes : ce paragraphe doit expliquer ce que vous avez fait. C’est un résumé bref de la
méthode utilisée. N’oubliez pas d’indiquer toutes déviations par rapport aux indications du polycopié.

Résultats : ils doivent être présentés sous la forme de tableaux explicatifs et/ou un graphe. Tous les
tableaux et toutes les figures doivent être numérotés, légendés et rappelés par leur numéro dans le texte
(Tab. x ; Fig. y). Montrez 2 ou 3 tableaux ou graphes ou photos que vous avez obtenus. Ne donnez pas
les valeurs brutes. Si vous avez fait une moyenne, mettre n (= nombre d’essais). Le texte doit être un
simple commentaire des illustrations, tableaux ou figures, sans aucune interprétation (gardez cela pour
la discussion). On doit rappeler brièvement ce que l’on a fait et décrire ce que l’on a obtenu sans
expliquer les résultats.

Discussion et conclusion : la discussion doit relier les observations que vous avez
décrites dans les résultats à la théorie, aux objectifs ou au cours (c’est-à-dire à tout ce que l’on sait par
ailleurs). On doit y expliquer ses résultats, suggérer pourquoi les résultats diffèrent de ceux espérés.
On doit conclure en expliquant ce que l’expérience a apporté par rapport à ce que l’on savait par
ailleurs, les nouvelles questions que l’expérience soulève et les expériences qui devraient permettre
d’y répondre.
 Objectifs des TP
L’objectif général des TP est d’acquérir des compétences et des connaissances techniques et
scientifiques, d’analyse et de synthèse, les objectifs spécifiques étant de :
- compléter l’enseignement théorique
- apprendre des techniques utilisées dans les laboratoires de recherche et d’analyses biomédicales
- approcher les méthodes scientifiques permettant de répondre à la question que l’on se pose
- approcher les instruments de laboratoire
- apprendre à organiser et à mener un travail du début à la fin.
- apprendre à penser et à surmonter les problèmes rencontrés lors de la réalisation d’un travail.
- apprendre à valider et analyser les résultats expérimentaux en mobilisant ses connaissances
- communiquer en rédigeant un compte rendu scientifique
 TP N°1 Frottis sanguin pour examen hématologique

Frottis sanguin pour examen hématologique

I. Hématopoïèse : quelques rappels (cf. cours)
1- Généralités
Le développement des cellules sanguines commence dès la 3ème semaine chez l'embryon et l'évolution
se fait en 3 stades :
 Le stade mésodermique : la différenciation des premières cellules sanguines, essentiellement
des érythroblastes, a lieu dans le mésoderme (tissu conjonctif embryonnaire) à l'intérieur d'ilôts
sanguins.
 Le stade hépato-splénique : du 3ème au 6ème mois les ilots sanguins se développent dans le
foie et la rate. Les érythroblastes ainsi que de rares granulocytes et mégacaryocytes se forment.
 Le stade médullaire : à partir du 4ème mois, la moelle osseuse apparaît et l'hématopoïèse
médullaire remplace progressivement celle du foie et de la rate.

A la naissance et jusque l’âge de 20 ans environ, la moelle osseuse (moelle rouge) des os plats et des
os longs est le siège de l’hématopoïèse. Après 20 ans, l’hématopoïèse est réduite aux os plats : la
moelle rouge active est remplacée par la moelle jaune inactive (tissus adipeux).
Les organes lymphoïdes secondaires, sont le siège de la maturation des lymphocytes.

2- Schéma général de l'Hématopoïèse

Figure 1 : schéma général de l’hématopoïèse (légende : cf.cours)

2- Régulation
L’hématopoïèse est régulée par un grand nombre de facteurs. Certains sont mono-spécifiques qui
n’agissent que sur une lignée tandis que d'autres peuvent agir sur plusieurs lignées.
Les principaux facteurs sont :
- Erythropoiètine (EPO) pour la lignée des globules rouges
- M-CSF pour la lignée des monocytes
- G-CSF pour la lignée des leucocytes granuleux
- Il 5 pour la lignée des éosinophiles
- MK-CSF et la thrombopoiétine pour la lignée des plaquettes
- GM-CSF et Il-3 agissant sur plusieurs lignées

II- Technique de confection d’un frottis sanguin pour examen hématologique

1- But
- Observer, reconnaître et estimer la numération des éléments figurés du sang
- Compter et établir la formule leucocytaire
- Observer et décrire la cyto-morphologie des éléments figurés du sang
- Valider les résultats des constantes érythrocytaires, des réticulocytes et de la vitesse de sédimentation.

2- Principe
Le principe est basé sur l’utilisation de réactifs acidobasiques, colorants complémentaires, sur une
monocouche uniforme d’éléments figurés, obtenue par étalement d’une goutte de sang sur une lame
porte-objet. Leurs réactivités chromatiques spécifiques avec les constituants cellulaires sont alors
analysées.

3- Méthode de May-Grüwald-Giemsa MGG

La coloration MGG est réalisée en deux temps : fixation et coloration
3.1- Préparation de l’eau tamponnée à pH 7.
A partir des solutions tampons de Sörensen
Solution A : KH2PO4…………………………..9,1 g/l
Solution B : Na2HPO4…………………………9,5 g/l
Ou Na2HPO4, 2H2O…………………11,9 g/l
Ou Na2HPO4, 12H2O…………………24 g/l
Mélanger dans les proportions suivantes :
Solution A………………………………….. 38 ,9 ml
Solution B………………………………….. 61.1 ml

3.2- Réactifs – Colorants MGG

Les colorations au Wright, Wright-Giemsa et May-Grünwald-Giemsa sont les plus utilisées dans les
laboratoires d’hématologie. Ce sont des variantes de la coloration de Romanowsky.
Les critères de qualité relatifs à l’identification, à la préparation, à la vérification et aux conditions de
conservation des colorants, doivent être strictement respectés en suivant les procédures de
normalisation référenciées des techniques en hématologie. Une coloration adéquate est garante d’une
bonne différenciation des éléments cellulaires et de l’exactitude du résultat. La méthode la plus
couramment utilisée au Maroc est la coloration de May-Grünwald-Giemsa MGG (coloration
panoptique, coloration de Pappenheim). Elle repose sur l’action complémentaire de deux mélanges
complexes de colorants et de leurs dérivés chimiques utilisés par May et Grünwald (éosine + bleu de
méthylène non oxydé + azur B (I) ) et par Giemsa (éosinate d’azur I (B) + bleu de méthylène + violet
de méthylène). Le mélange (bleu de méthylène non oxydé + azur B) est aussi appelé azur II de
méthylène. Les deux colorants MGG sont solubilisés dans le méthanol et sont inactifs et neutres dans
cette solution. C’est l’adjonction de l’eau qui leur donne leur pouvoir colorant spécifique, les sels sont
alors dissociés en colorant acide (éosinate de méthylène) et en colorant basique (bleu de méthylène
ou azurs de méthylène). L’azur de méthylène est de couleur bleue qui devient rouge pourpre après
fixation sur les constituants cellulaires azurophiles. On parle de coloration métachromatique. Quand
le colorant garde sa couleur après fixation sur les constituants cellulaires, on parle de coloration
orthochromatique (bleu de méthylène et éosine)

3.3- Confection du frottis sanguin

- Déposer la lame porte-objet propre sur la paillasse après y avoir identifié le prélèvement sanguin
- Observer la qualité du prélèvement : hématocrite, hémolyse, aspect du plasma, caillot….
- Homogénéiser le sang par retournements (ne pas agiter)
- A 2 cm de l’extrémité de la lame porte-objet, déposer une petite goutte de sang (3 mm de diamètre)
- Immobiliser la lame porte-objet par l’index
- Incliner à 45° la lame à bord rodé juste en avant de la goutte et l’amener au contact de la goutte
- Laisser diffuser le sang le long de l’arête de la lame rodée
- D’un geste maîtrisé (vitesse et pression contrôlées), étaler le sang vers l’extrémité de la lame
horizontale
- Sécher rapidement, par agitation à l’air

1 : Lame rodée à 45° placée devant puis glissée

en arrière pour mise en contact avec le sang

2 : Au contact, diffusion du sang le long de l’arête

3 : Au contact de 3/4 de l’arrête, glisser

la lame rodée pour étaler le sang

Corps

4 : Résultat
Tête
Queue

Figure 2 : schéma de la confection d’un frottis sanguin

Figure 3 : exemple de frottis sanguin réussi Figure 4 : exemples de frottis sanguin à éviter

3.4- Critères de validité technique d’un frottis sanguin

Exécuter le geste technique avec la bonne quantité du sang, le bon angle entre les deux lames, la bonne
vitesse d’étalement et la bonne pression.

Pour être valable, il est vivement recommandé pour un frottis sanguin de :

- ne pas réfrigérer l’échantillon sanguin avec EDTA
- réaliser le frottis sanguin dans l’heure suivant le prélèvement. Cependant, la qualité du frottis
pourrait encore être acceptable dans les délais de moins de 4 heures pour un échantillon veineux avec
EDTA : des variations par rapport aux normes cellulaires pourraient apparaitre rapidement chez des
individus présentant des anomalies hématologiques.
- ne pas être trop épais : les éléments seront condensés et non identifiables
- ne pas être trop mince : il sera trop pauvre en éléments pour permettre une lecture convenable
- ne pas présenter de trous (vides): lame mal dégraissée / Mauvaise répartition: mauvaise appréciation
quantitative
- n’atteindre ni les bords, ni les extrémités de la lame : occuper les 2/3 environ, sinon mauvaise
répartition
- être régulier : sinon la répartition des éléments est hétérogène et le décompte varie suivant les champs
examinés
- terminer en pointe arrondie ou carrée : signe d’un bon geste technique (angle, vitesse et pression)
- être correctement séché : être séché complètement et rapidement à l’air avant la coloration afin
d’éviter la formation d’artéfacts et une altération de la morphologie des érythrocytes. Ces derniers
peuvent présenter une pseudo-hypochromie lorsque le séchage est trop lent.
3.5- Fixation :
- Mettre la lame porte-objet dans le portoir de coloration
- Mettre le portoir dans le bac I (May-Grünwald non dilué : fixation par l’alcool sans coloration
spécifique). Après 2 minutes retirer le portoir du bac I et l’égoutter avant coloration

3.6- Coloration :
- Mettre le portoir dans le bac II (May-Grünwald dilué au 1/2 : libération et action des colorants acide
et basique). Agiter doucement toutes les 30 secondes. Après 3 minutes retirer le portoir du bac II et
l’égoutter sur du papier absorbant
- Mettre le portoir dans le bac III (Giemsa dilué au 1/20). Agiter toutes les 2 minutes. Après 20 minutes
retirer le portoir du bac III et l’égoutter sur du papier absorbant
- Rincer les lames par agitation douce dans 3 bacs successifs contenant l’eau tamponnée (2 min / bac)
- Retirer les lames du portoir et les incliner sur un plan vertical pour les sécher sur du papier absorbant

3.7- Examen du frottis sanguin :

IL comporte les étapes suivantes :
i- Examen macroscopique :
Pour vérifier la qualité de l’étalement du frottis et, sommairement, la qualité de la coloration.

ii- Observation au microscope optique à faible grossissement (x10) :

Un grossissement de 200 fois (objectif x20) suffit pour vérifier la coloration, la distribution
des éléments figurés du sang, la présence ou l’absence d’anémie, pour estimer la numération
leucocytaire ainsi que pour choisir la zone idéale pour établir la formule leucocytaire.

iii- Examen microscopique à fort grossissement

Le frottis peut être examiné avec un objectif à sec à en appliquant la technique de l’immersion
à l’huile pour observer les détails des cellules et effectuer la formule leucocytaire, l’estimation
plaquettaire et l’évaluation morphologique des éléments figurés du sang.

iv- Critères de reconnaissance des éléments figurés sur un frottis sanguin :

a. Taille : forme de la cellule aussi bien que celle du Noyau, aspect de la chromatine,
présence ou absence de granulations, couleur du cytoplasme
b. Noyau : Coloration rouge, rose ou violette.
Chromatine plus ou moins foncée et mottée…d’autres descriptions plus fines de la
chromatine, surtout pour les cellules de la MO.
c- Cytoplasme :
Acidophile: rose orangée comme les hématies
Basophile: bleu, toute la gamme du bleu, faiblement ou fortement basophile
Polychromatophile : grisâtre, mélange d’acidophiles et de basophiles
d- Granulations :
Neutrophiles : marrons, brunes
Eosinophiles : orangées
Basophiles : violet foncé, pas la même coloration que pour le cytoplasme
Azurophiles : rouge pourpre intense (éosinate d’azur).
III- Résultats de l’observation
1. Hématie ou globule rouge (GR)
a. Définition et fonction
L'hématie est ce qui reste de l'érythroblaste après l'expulsion du noyau. C'est donc une « cellule »
sans noyau dont le cytoplasme est essentiellement constitué d'hémoglobine transporteur de gaz.

b. Morphologie
-Taille : 7à 8 µm de diamètre
- Forme : Arrondie, disque biconcave
- Noyau : Absent
- Coloration du cytoplasme : Acidophile
- Granulations : Absence
- Contenu : Hémoglobine

2. Polynucléaire Neutrophile (PNN)

a. Définition et fonction
Les neutrophiles sont les leucocytes les plus communs. Ils ont un diamètre de 12 à 18 µm. Le noyau
est polylobé (2 à 5 lobes reliés par un mince filament nucléaire). Les PNN phagocytent très
activement les bactéries et sont présents en nombre élevé dans le pus des plaies. Ces cellules sont
incapables de renouveler les lysosomes utilisés dans la digestion des microbes et meurent après en
avoir phagocyté quelques-uns.

b. Morphologie
- Taille : 12 à 18 µm
- Forme arrondie
- Noyau segmenté (2 à 5 lobes)
- Chromatine mottée, dense et nucléole absent
- Cytoplasme hyalin, vacuoles possibles selon l'activité de phagocytose
- Granulations neutrophiles nombreuses (80%)

3. Polynucléaire éosinophile (PNE)

a. Définition et fonction
Les éosinophiles sont assez rares dans le sang. Leur taille est la même que celle des neutrophiles. Leur
noyau comporte généralement deux lobes. Le cytoplasme est rempli de granules qui prennent une
couleur rose orangée caractéristique, visible même au-dessus du noyau. Les PNE attaquent les
parasites et phagocytent les complexes antigènes-anticorps et ont un rôle dans l’allergie.

b. Morphologie
- Taille : 12 à 18 µm
- Forme : Ronde
- Forme du Noyau 2 lobes en bissac
- Chromatine dense et nucléole absent
- Coloration du Cytoplasme : Hyalin
- Granulations Eosinophiles nombreuses
4. Polynucléaire basophile (PNB)
a. définition et fonction
Les basophiles sont les leucocytes les plus rares, avec un taux de moins de 1 %. Le cytoplasme
est très riche en granules qui prennent une couleur pourpre foncée. Le noyau compte deux ou trois
lobes, mais il est difficile de le voir en raison du nombre de granules qui le cachent. Les PNB possèdent
le récepteur du fragment Fc des IgE. La fixation des IgE sur leurs récepteurs a pour conséquence, la
sécrétion des substances anticoagulantes et vasodilatatrices comme les histamines et la sérotonine.
Malgré leur capacité phagocytaire, leur principale fonction est de sécréter les substances qui servent à
la médiation de la réaction d'hypersensibilité immédiate.

b. Morphologie
- Taille : 12 à 18 µm
- Forme : Ronde
- Forme du noyau : polylobé
- Chromatine : dense
- Nucléole : absent
- Coloration du cytoplasme : Hyalin
- Grosses granulations métachromatiques de couleur violet foncé (MGG).
Elles sont hydrosolubles et colorées en bleu par le bleu de Toluidine

5. Lymphocytes
a. Définition et fonction
Les lymphocytes sont des cellules qui, outre leur présence dans le sang, peuplent aussi les
tissus lymphoïdes et les organes de même que la lymphe circulant dans les vaisseaux lymphatiques.
Le lymphocyte peut être T, B ou NK. Les organes lymphoïdes comprennent le thymus, la moelle
osseuse (Bourse séreuse de Fabricius des oiseaux), la rate, les nodules lymphoïdes, les amygdales
palatines, les plaques de Peyer et les tissus lymphoïdes du système respiratoire et du tube digestif
(FLAM).
La plupart des lymphocytes qui circulent dans le sang se trouvent en état de repos. Ce sont de
petites cellules ayant un noyau circulaire compact qui occupe la quasi-totalité du volume cellulaire. Le
cytoplasme est très réduit. Les lymphocytes des organes et des tissus lymphoïdes peuvent être activés
par stimulation antigénique. Dans le sang, les lymphocytes représentent 20 à 40 % des leucocytes. Les
lymphocytes sont les principaux éléments du système immunitaire, qui assurent la défense contre les
attaques de micro-organismes pathogènes comme les virus, bactéries, champignons et parasites. Les
lymphocytes B (plasmocytes) produisent aussi des anticorps. L'anticorps est une molécule capable de
se lier à d'autres molécules de formes complémentaires appelés antigènes.
b. Morphologie
- Taille : 8 à 12 µm
- Forme Arrondie
- Noyau Rond
- Chromatine Mature
- Nucléole présent seulement lorsque la cellule est activée
- Cytoplasme : Rapport N/C = 0,9
- Coloration du cytoplasme : hyalin à légèrement basophile
- Absence de granulations

6. Monocytes
a. Définition et fonction
Les monocytes sont les plus gros leucocytes (15 à 25 µm). Ils ont un grand noyau réniforme ou
en forme de fer à cheval, dans certains cas à deux lobes. Le cytoplasme est transparent, mais à
l'apparence du verre dépoli. Les monocytes sont les précurseurs des macrophages. Ce sont des
cellules sanguines qui, après avoir atteint leur maturité dans la moelle osseuse, entrent dans le flux
sanguin où elles demeurent pendant de 24 à 36 heures. Elles migrent ensuite vers les tissus conjonctifs,
où elles deviennent des macrophages et se déplacent dans les tissus. La phagocytose n'est pas le rôle
exclusif de ces cellules car elles ont aussi une activité de sécrétion intense. Elles produisent des
substances exerçant des fonctions de défense comme les lysozymes, les interférons et des substances
qui modulent la fonctionnalité d'autres cellules. Les macrophages participent à la défense immunitaire
comme des cellules présentatrices d’antigènes (CPA). Ils exposent les molécules de corps digérés sur
leur membrane en association avec les molécules HLA du CMH et les présentent à des cellules plus
spécialisées, comme les lymphocytes B et T auxiliaires.

b. Morphologie
- Taille : 15 à 25 µm
- Cytoplasme grisâtre avec des vacuoles
- Granulations : quelques grains azurophiles
- Noyau réniforme typique (fer à cheval, haricot) ou
forme indéfinissable très irrégulière
- Chromatine mature, ni fine, ni blastique
- Nucléole : Absent
7. Plaquettes
a. Définition et fonction
Ce sont de petits éléments discoïdes biconvexes. Même si les plaquettes sont en apparence
plutôt rondes, ce ne sont pas de véritables cellules. En raison de leur diamètre d'environ 2-4 µm, elles
sont beaucoup plus petites que les érythrocytes. Dans les frottis colorés au Giemsa, elles prennent une
couleur pourpre intense. Leur nombre dans le sang est de 150 à 400 G/L. Leur durée de vie est de 8 à
10 jours. La fonction principale des plaquettes, ou thrombocytes, est de faire cesser l'écoulement du
sang par les plaies (hémostase). A cette fin, elles s'agrègent et libèrent des facteurs favorisant la
coagulation du sang : la sérotonine vasoconstrictrice, qui réduit le calibre des vaisseaux lésés et ralentit
le flux sanguin, et la fibrine qui piège les cellules et donne lieu à la coagulation.

b. Morphologie
- Taille : diamètre de 2 à 4 µm
- Forme discoïde biconvexe
- Cytoplasme : Hyalin
- Granulations azurophiles au MGG : granulomère

8- Autres résultats
Présence d’anomalies et correction
Malgré des automates sophistiqués en hématologie, l’estimation au microscope reste encore
très utile pour contrôler et valider les résultats quantitatifs obtenus à l’aide de ces automates, selon un
protocole détaillé pour chaque élément figuré. La présence anormale d’un élément sur le frottis (ex :
érythroblaste) ou d’autres sources d’interférences (ex : agglutinines froides, lactescence,
hyperleucocytose, etc.) impose la correction des valeurs selon une méthode appropriée.
Les méthodes de correction sont détaillées au niveau de chaque laboratoire d’hématologie.

Artéfacts du frottis sanguin

Avec les échantillons prélevés avec EDTA et conservés à la température de 18 à 24 °C, on
observe : *une légère vacuolisation des monocytes après une heure de conservation et celle des
monocytes et des granulocytes neutrophiles après 3 à 4 heures.
*une augmentation du pourcentage des granulocytes et une diminution du pourcentage des
lymphocytes et des monocytes après 8 heures de conservation
*des érythrocytes crénelés après 6 heures de conservation

Cellules éclatées
En établissant la formule leucocytaire, on devrait retrouver moins de 0,05 % de leucocytes
éclatés ou non identifiables, sauf en cas de pathologie comme la leucémie lymphoïde chronique. La
formule leucocytaire ne doit pas tenir contenir des leucocytes altérés et non identifiables. Ces
derniers doivent figurer sur le compte rendu comme tels et rapportés dans les commentaires sur le
résultat final.
 TP N°2 Groupage sanguin

Groupage sanguin
I- Généralité sur le système ABH / ABO
La notion d’alloréactivité a été mise en évidence en 1900 par Karl Landsteiner qui, en
1901, a défini 3 groupes sanguins appelés 1, 2 et 3 correspondants aux groupes A, B et O. La
poursuite de ses travaux par ses collaborateurs a abouti en 1902 à la définition du groupe 4
correspondant au groupe sanguin AB. En 2019, plus de 600 antigènes regroupés en 31 systèmes
de groupes sanguins ont été définis par la société internationale de transfusion sanguine ISBT:
ABO, Rhésus, Kell, Kidd, MNSs, P, Ii, Lewis, Duffy, Luthéran, Diégo, Dombroc, Gerbich,
Sciana.

1- Importance des antigènes ABH en transfusion

Le système de groupe sanguin ABO est le plus important de tous les systèmes en
transfusion sanguine et même en transplantation d’organe du fait des deux
caractéristiques suivantes :
•La présence constante d’anticorps « naturels » anti-A et anti-B correspondants aux
antigènes absents des globules rouges ;
•Les antigènes ABH sont aussi présents sur la plupart des tissus et dans les liquides
biologiques. Ils sont en fait de véritables antigènes tissulaires.

L’objectif de l’immunohématologie en transfusion sanguine est d’éviter l’immunisation

du receveur contre un ou plusieurs antigènes de groupes sanguins. Quand cette immunisation
préexiste, il est obligatoire d’éviter le contact entre l’antigène et l’anticorps.

2- Biochimie des antigènes ABH : polymorphisme génétique et phénotypique

Les antigènes ABH sont des chaînes oligosaccharidiques liées soit aux sphingolipides
et ancrées dans la membrane cellulaire, soit aux polypeptides et solubles dans les liquides de
sécrétion des sujets sécréteurs. La biosynthèse des antigènes ABH est étroitement liée à celle
d’autres antigènes (Lewis, Ii, T, Tn, Forssman…), ce qui rend difficile l’appréhension de tous
les mécanismes de synthèse inhérents. Elle fait intervenir principalement 4 systèmes génétiques
Lewis (Lele), Hh, Sécréteur (Sese) et ABO. Le contrôle par ces systèmes diffère selon que la
synthèse a lieu dans les érythroblastes ou dans les cellules muqueuses.
La synthèse fait intervenir 2 systèmes génétiques indépendants ABO et Hh. Elle
s’effectue à partir d’une substance de base dissacharidique présente sur la membrane de
l’érythroblaste. L’antigène H est construit à partir de cette substance de base par une
fucosyltransférase H sous contrôle du gène FUT1 (ou gène H) localisé sur le chromosome 19
en 19q13.3. Le gène H est aussi exprimé dans les tissus d’origine mésodermique et
ectodermique (peau, cellules endothéliales, cellules sanguines…). La figure 1 schématise les
niveaux d’action des produits des gènes des systèmes Hh et ABO à partir d’une substance
fondamentale. Le système Hh est monomorphe car plus de 99% des individus expriment l’allèle
H. L’allèle h est amorphe et donne le phénotype bombay.
Figure 1 : Niveaux d’action et produits des gènes de systèmes Hh et ABO

L’antigène H est la substance de base pour la synthèse des antigènes A et B. Cette

dernière est catalysée par 2 glycosyltransférases contrôlées par 2 allèles A et B du gène ABO
qui est localisé sur le bras long du chromosome 9 (9q34.1-q34.2). Le gène ABO comprend 7
exons et 6 introns. Les exons 6 et 7 codent pour 91 % des AA du site catalytique. L’allèle O est
non fonctionnel, et aucune enzyme active n’est produite. Les 2 allèles A et B sont codominants.
La présence des 2 allèles fonctionnels conduit à l’expression phénotypique des 2 antigènes.
L’allèle O est récessif par rapport aux allèles A et B. La forte expression des antigènes A et B
donne les phénotypes A1 et B1. Leur faible expression donne les phénotypes faibles appelés A2,
A3, Ax, Aend, Ael, Aint, Am, Afinn, Abantu, Alae, Ay, B3, Bx et Bel. En techniques
immunohématologiques les sous-groupes faibles de A montrent une agglutination réduite ou
négative avec les réactifs anti-A et / ou anti-AB. Un globule rouge de phénotype A1 présente
en moyenne un million de sites antigéniques. Ce nombre est de 2 x 105 pour A2. Pour Ax, Am,
Ay, Ael, B3, Bx, et Bel, le nombre de sites antigéniques par globule varie de 1000 à 5000. Environ
80 % des individus du groupe A et du groupe AB sont A1 ou A1B et 20% sont A2 ou A2B. Les
antigènes A et B sont construits sur la substance de base H. Dans les phénotypes A1 et A1B, la
substance H est presque totalement transformée et dans les phénotypes A2, A2B, et A faibles la
transformation de H est incomplète. Dans ce dernier cas, une agglutination par les anticorps
anti-A et anti-H est observée.
Au polymorphisme phénotypique correspond un polymorphisme génétique représenté
par au moins 70 allèles ABO

3- Distribution des antigènes ABH dans l’organisme

Les antigènes A et B sont largement distribués dans l'organisme en particulier sur les
cellules sanguines (hématies et plaquettes) et sur tous les tissus humains tels que l’utérus, le
foie, le rein, le pancréas, l’estomac, l’ovaire…, sauf sur le tissu conjonctif et le système nerveux
central. Ils se trouvent également sous forme soluble dans les sécrétions (salive, muqueuse, lait,
sperme) de sujets dits sécréteurs. Les antigènes A et B apparaissent très tôt au cours de la vie
embryonnaire et leur développement se poursuit après la naissance. La quantité d'antigènes A
est deux fois plus faible chez le nouveau-né par rapport à l'adulte. Elle augmente ensuite pour
égaler celle de l'adulte vers l'âge de deux ou trois ans. Ceci explique que la moitié des
échantillons des hématies A du nouveau-né se comportent comme un sous-groupe A2 de
l'adulte. Les chaînes A et H non ramifiées existent sur les érythrocytes chez le fœtus humain et
dans le cordon ombilical, alors que les chaînes A et H ramifiées sont les composantes majeures
des érythrocytes de l’adulte. Ainsi, les isoformes de A et H ramifiées et non ramifiées reflètent
différents stades du développement. Sur les globules rouges, toutes les structures actives des
antigènes ABH sont synthétisées sur les chaînes de type 2 dont 80 % de ces chaînes sont
attachées aux protéines et 20% existent sous forme de glycolipides

II. Techniques de groupage sanguin

1- But : déterminer le groupe sanguin ABO et Rhésus D d’un individu

2- Principe
Le groupage sanguin consiste à :
- déterminer l’antigène ou agglutinogène porté par les globules rouges à l’aide de sérums
tests connus contenant des anticorps anti-A, anti-B et anti-AB. C’est l’épreuve
globulaire dite de Beth Vincent-Tszanck
- déterminer le groupe sanguin en mettant en évidence les agglutinines ou anticorps
contenus dans le sérum ou plasma, à l’aide de globules rouges connus A et B. C’est
l’épreuve sérique dite de Simonin
Les deux réactions doivent êtres concordantes
Le groupe Rhésus D est déterminé selon l’épreuve globulaire seulement.

3- Matériel et réactifs
- Pipettes pasteur
- Tubes à hémolyse
- Plaques d’opaline
- Verres à pied ou béchers
- Le sang à grouper : le sang prélevé par ponction veineuse dans des tubes stériles
contenant l’anticoagulant est centrifugé à 400g pendant 3 min pour séparer le plasma
des éléments figurés du sang. Le sérum ou plasma séparé est transvasé dans un tube
identifié. Les hématies sont lavées une fois en solution saline (0,9 %) et sont mises en
suspension à 20 % dans un autre tube identifié
- Les hématies-témoins :
*Hématies-témoins A, lavées 1 fois, et mises en suspension saline à 10 - 40 %
*Hématies-témoins B, lavées 1 fois, et mises en suspension saline à 10 - 40 %
**Hématies-témoins O, lavées 1 fois, et mises en suspension saline à 10 - 40 %

- Les serum-tests
Aujourd’hui il n’y a pratiquement plus que les réactifs à base d’anticorps monoclonaux qui sont
utilisés. Ils sont souvent fabriqués pour réagir à temperature ambiante quell que soit le type de
groupe à determiner.
*Sérum-test anti-A : coloration bleue
*Sérum-test anti-B : coloration jaune
*Sérum-test anti-AB : incolore
*Sérum-test anti-D incolore
4- Méthode
4.1- Détermination des groupes sanguins ABO

Epreuve de Beth Vincent-Tzanck

- Sur une plaque d’opaline, déposer 75 µl de chaque réactif (anti-A, anti-B, anti-AB et anti-D)
et 75 µl de GR 20 % à grouper (voir figure 2).
- Mélanger soigneusement les deux gouttes avec le fond d’un tube à hémolyse
- Essuyer le fond du tube entre chaque réaction.
- Prendre la plaque d’opaline entre les mains et la faire chalouper
- Observer les agglutinations au bout de 3 minutes

Epreuve de Simonin
Sur une plaque d’opaline, déposer 75 µl de chaque type de GR 20 % (GRA, GRB et GR du
propre sujet = témoin auto) et 100 µl du sérum ou plasma du sujet à grouper (voir figure 2).
- Mélanger soigneusement les deux gouttes avec le fond d’un tube à hémolyse
- Essuyer le fond du tube entre chaque réaction.
- Agiter la plaque en chaloupant pour obtenir un mouvement circulaire
- Lire les agglutinations au bout de 3 minutes.

Témoins
Témoin auto : sérum ou plasma échantillon + GR échantillon (contrôle des 2 épreuves)
Témoin allo : sérum ou plasma échantillon + GR O connu (contrôle de Simonin)
Témoin AB : sérum ou plasma AB + GR échantillon
Tous les témoins doivent être négatifs

4.2- Détermination du groupe Rhésus D

Epreuve globulaire
- Déterminer le groupe RhD en même temps que le groupe ABO.
- Les hématies ne sont pas lavées. Elles sont mises en suspension à 20-40% dans leur
propre plasma.
- Mélanger 75 µl de la suspension à 20 % - 40 % de globules rouges à grouper avec 75 µl
du réactif anti-D.
- Exécuter les mêmes étapes que pour le groupage ABO.

Témoins
Témoin positif : anti-D + GR RhD+ connu (contrôle du réactif)
Témoin négatif : anti-D GR RhD- connu (contrôle du réactif)
Témoin auto-agglutinant, doit être négatif : GR échantillon sans anti-D (contrôle de
l’échantillon)
III- Résultats
1- Profils de réactivités sur plaque d’opaline

La figure 2 montre les profils de réactivités les plus fréquents parmi la population.

Epreuve Beth-Vincent-Tzanck Simonin

Réactif Anti-A Anti-B Anti-AB GR-A GR-B T. auto
Groupe A

Groupe B

Groupe
AB

Groupe O

Figure 2 : profil de réactivités des groupes sanguins ABO sur plaque d’opaline

2- Profils de réactivités sur autres supports de groupage sanguin

Le groupage sanguin peut être réalisé soit en tube à hémolyse, en gel, en microplaque
ou sur plaque d’opaline ou en techniques automatiques (Figure 3).

A B C

Figure 3 : Groupage en Tubes à hémolyse (A), sur colonne de gel (B) et en microplaque (C)
3- Causes d’erreurs de groupage sanguin

Faux positifs : - Contamination bactérienne du sérum

- Hématies en rouleaux
- Sérum test contaminé avec d’autres anticorps
- Erreur d’étiquetage (Identification)

Faux négatifs : - Sérums tests défectueux, non conformes aux normes

- Hémolyse des globules rouges
- Sous groupes A3, Ax… sont faiblement ou pas agglutinés
- Grande concentration de GR ou de réactif (effet de zone)
- Erreur d’étiquetage (Identification)

Autres difficultés : - Ployagglutinabilté

- Double population
- Discordance avec un témoin
- Hémolyse
 TP N°3 Test de Coombs

Test de Coombs
I- Principe du test de Coombs
Le principe du test de Coombs est basé sur le fait que les anticorps incomplets peuvent se fixer
sur les hématies sans provoquer leur agglutination en milieu salin ; les hématies sont alors dites
sensibilisées. Pour les révéler, il faut adjoindre une anti-globuline appelée réactif de Coombs.
Il existe deux variantes du test de Coombs : le test direct et le test indirect.

II- Test direct de Coombs (TDC)

1- But du TDC
Mettre en évidence (révéler) la sensibilisation (la fixation) in vivo des hématies humaines par
des anticorps de nature IgG et/ou des fractions du complément. Ce test doit être réalisé sur un
échantillon de préférence non coagulé.

2- Principe du TDC
La figure 1 illustre le principe de la révélation, en un temps, des anticorps incomplets ou des
fractions du complément C3d fixés in vivo sur des hématies, en utilisant une (des) anti-
globuline(s) humaine(s). La réalisation de cette analyse impose d'utiliser de façon simultanée
et indépendante une antiglobuline anti-IgG et un anti-C3d ainsi que des réactifs témoins
appropriés.

Figure 1 : principe du Test Direct de Coombs

3- Indications du TDC
Le TDC est indiqué lors de :
- Bilan d’une incompatibilité foeto-maternelle (sang de foetus ou de nouveau-né,
éventuellement sang de cordon).
- Anémie immuno-hémolytique.
- Réaction transfusionnelle : hémolyse post-transfusionnelle.

4- Matériel et réactifs
- Hématies à tester
- Antiglobuline polyvalente ou spécifique (anti-IgG, anti-C3d)
- Eau physiologique
- Tubes à hémolyses
- Centrifugeur

5- Méthode
Après séparation des hématies du plasma par centrifugation, le lavage est réalisé afin d’éliminer
toutes les immunoglobulines et les protéines plasmatiques d’inhiber l’anti-globuline. Le lavage
est réalisé 3 fois avec de l’eau à 0,9 % NaCl en centrifugeant à 800 g pendant 5min. La technique
consiste en la mise en contact des hématies à tester, avec l’anti-globuline polyvalente ou
spécifique (anti-IgG, anti-IgM, anti-C3d et anti-IgA). La lecture de l’agglutination est effectuée
après centrifugation.

Résumé des étapes du TDC :

- Laver 3 fois et suspendre les hématies à 5% : 50 microlitres des hématies lavées + 950
microlitres d’eau physiologique 0,9 % NaCl.
- Mettre 100 µl de la suspension dans un tube de à hémolyse et centrifuger pour éliminer le
surnageant. Bien assécher par pipetage d’eau à l’aide d’une pipette Pasteur.
- Décoller le culot globulaire en tapotant doucement le fond du tube sur la paillasse
- Ajouter 100 µl d’antiglobuline
- Laisser agir 2 min à température ambiante
- Centrifuger à 200 g pendant 2 min
- Lire l’agglutination en décollant le culot par agitation douce
III- Test indirect de Coombs TIC
1- But
Le test indirect de Coombs permet le dépistage des anticorps incomplets libres dans le
plasma. Il permet aussi la détermination d’un phénotype.

2- Principe
La figure 2 illustre le principe de la révélation en deux temps des anticorps incomplets libres
dans le plasma et fixés in-vitro sur des hématies. Le premier temps de la réaction consiste à
fixer l'anticorps recherché sur des érythrocytes connus, ou à fixer l'anticorps connu sur les
érythrocytes dont on veut déterminer un phénotype de groupe sanguin. Le deuxième temps de
la réaction consiste à révéler l’anticorps fixé sur les hématies (hématies sensibilisées) par
l’antiglobuline polyvalente.

Figure 2 : principe de test indirect de Coombs

3- Indications du TCI
Le TCI est indiqué lors de :
- Test de compatibilité majeur : plasma/sérum du receveur et hématies du donneur.
- Recherche d’anticorps irréguliers : plasma/sérum du patient et hématies d’un panel
(antigènes connus).
- Recherche d’un phénotype érythrocytaire : érythrocytes du patient et antisérum connu
(anticorps connus).

4- Matériel et réactifs
- Sérum à tester
- Hématies tests (connues)
- Antiglobuline polyvalente (Réactif de Coombs)
- Eau physiologique 0,9% NaCl
- Tubes à hémolyses
- Centrifugeur
5- Méthode
Après séparation des hématies du plasma par centrifugation, le lavage est réalisé afin d’éliminer
toutes les immunoglobulines et les protéines plasmatiques. Cette étape est nécessaire avant la
sensibilisation des hématies par les anticorps libres dans le plasma ou sérum à tester. Le lavage
est réalisé 3 fois avec de l’eau à 0,9 % NaCl en centrifugeant à 800 g pendant 5min. Ensuite,
100 μl du plasma ou sérum à tester sont mélangés avec 100 μl d’une suspension d’hématies à 5
% de groupes sanguins connus. Après sensibilisation (fixation), les hématies sont lavées 3 fois
pour éliminer l’excès des anticorps non fixés. Le culot des hématies est asséché par pipetage
d’eau à l’aide d’une pipette Pasteur. La dernière étape consiste à révéler la présence ou
l’absence de l’anticorps fixé sur les hématies en ajoutant 100 μl d’anti-globuline polyvalente.
La lecture de l’agglutination est effectuée après centrifugation à 200 g pendant 2 minutes.

Résumé des étapes du TCI :

- Laver et suspendre les hématies à 5% : 50 microlitres des hématies lavées + 950 microlitres
d’eau physiologique 0,9 % NaCl.
- Ajouter 100 µl du sérum à tester à 100 µl d’hématies 5% dans un tube à hémolyse
- Incuber le mélange 45 min à 37°C
- Laver 3 fois à 400 – 600 g pendant 2 min et bien assécher le culot
- Ajouter 100 µl d’antiglobuline
- Laisser agir 2 min à température ambiante
- Centrifuger à 200 g pendant 2 min
- Lire l’agglutination en décollant le culot par agitation douce

IV- Résultats
Présence ou absence d’agglutination :
- TCD positif ou négatif
- TCI positif ou négatif

Principales références de techniques manuelles pour les travaux pratiques :

- Les examens de laboratoire
Techniques en immunohématologie
A. MARCELLI, M. DAVEAU, J.M. FINE, J.C. HOMBERG, A. MULLER, L. RIVAT-PERAN
Ed : Flammarion, Médecine-Science – 1981

- Techniques en hématologie
C. SULTAN, G. PRIOLET, Y. BENZARD, R. ROSA, F. JOSSO
Ed : Flammarion, Médecine-Science – 1982