L1 Travaux Pratiques de Biochimie –2006-2007

Notation des TP de l’unité BIO3

Les TP sont obligatoires. Toute absence devra être justifiée par un certificat et soumis à
l’approbation des responsables de L1

La note de TP compte pour 15% de la note finale de UE de Biochimie

La note est composée de deux parties, de rapport 50/50 :

1) Une note de contrôle continu correspondant à une interrogation écrite de 10
min, faite au début de la séance de TP. Les questions posées ont trait au TP
et sont abordées dans le polycopié, d'où l'importance de la lecture du
polycopié avant de venir en TP. N'essayez pas de retenir les détails
pratiques de l'expérimentation (volumes, par exemple), mais réfléchissez
sur le principe, le rôle de chaque étape, le mode d'action de chacun des
produits utilisés.- Exercez-vous à faire les calculs (dilutions...)

2) Un rapport de TP rédigé, pour les étudiants de SV, suivant les consignes

définies, pour le traitement de texte, en unité « Passeport Informatique ».
Pour les étudiants de SME, PCH/CHI, BIM le rapport sera manuscrit ou tapé
à l’ordinateur avec un programme de traitement de texte au choix de
l’étudiant. Pour toutes les filières suivant BIO3 ce rapport devra être rédigé,
quant à son contenu, suivant les consignes précisées ci-dessous.

Consignes générales:

• vous rédigerez un seul rapport par binôme de TP

• le TP comprend deux parties (dosage et chromatographie) ; vous ne rédigerez de

rapport que sur l'une des deux parties (soit dosage, soit chromatographie). Les
enseignants de TP vous dirons, à chaque séance, quelle partie vous rédigerez. Vous
remettrez le rapport au plus tard le 4 décembre
- un exemplaire imprimé à Mme Azou Yannick à destination des enseignants du TP de
biochimie. Un rendez vous sera fixé ultérieurement pour le lieu et l’heure. Ce
paragraphe concerne tous les étudiants de BIO3.
- un exemplaire sous forme de fichier StarWriter/OpenOffice (fichier .sxw ou
.odt).Vous rendrez le fichier à travers une interface web accessible depuis la page de
l'enseignant responsable du module "Passeport Informatique" (Carl Herrmann) sur
BioInteractif (disponible à partir de fin novembre) Ce paragraphe ne concerne pas
les étudiants de SME, PCH/CHI et BIM.

• la longueur du rapport sera de trois pages A4, courbes et tableaux compris.

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 • il comportera obligatoirement les parties suivantes
- un titre
- le nom des auteurs
- un résumé de 3-4 lignes, dans lequel vous exposez très brièvement le but du TP, les
techniques et les résultats.
- une partie "Introduction" (voir plus loin)
- une partie "Matériel et méthodes", dans laquelle vous décrirez précisément les
techniques mises en oeuvres et les étapes de la manipulation.
- une partie "Résultats", dans laquelle vous présenterez les résultats sous forme d'un
tableau et d'un diagramme faits avec le tableur StarCalc/OpenOffice Calc (vous
importerez les tableaux et diagrammes de StarCalc dans StarWriter). Pour les
étudiants non SV le choix du tableur est laissé à la discrétion de l’étudiant.
- une partie "Conclusion", dans laquelle vous conclurez brièvement sur la base des
résultats obtenus, avec le cas échéant une analyse critique des résultats.
- un en-tête reprenant le titre du TP, ainsi qu'un pied de page contenant la
numérotation des pages.

Contenu de la partie "Introduction"

La partie introduction est une présentation générale des molécules et/ou des techniques
étudiées en TP. Vous cherchez des informations, afin de présenter ces molécules étudiées ou
ces techniques, en élargissant, dans les deux cas, par rapport à ce que vous avez vu en TP.
Cependant cette introduction doit toujours être en rapport avec les molécules ou les
techniques que vous avez étudiées en TP

Tableau et diagramme
Pour la partie "dosage", vous ferez un diagramme représentant la courbe de dosage.
Pour la partie "chromatographie", vous présenterez dans un tableau les distances de migration
des échantillons de référence et de vos échantillons, et vous présenterez également le contenu
de ce tableau sous forme de diagramme ("histogramme"), avec en abscisse le nom de
l'échantillon, et en ordonnée la distance de migration.

Une feuille de bilan, à compléter au cours de la séance, vous sera fournie en début de TP. Ce
bilan est personnel et peut être corrigé à votre demande.

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 Consignes de sécurité et d’hygiène :

Le port d’une blouse est indispensable.

Vous allez manipuler des produits chimiques et biologiques, il est donc
fortement conseillé de vous laver les mains à la fin de la séance de TP.
Pour les mêmes raisons, il est interdit de manger, boire ou fumer dans
les salles.
Venez avec règle, crayon, de préférence HB ou 4B (nécessaire pour
écrire sur la plaque de cellulose) mais aussi machine à calcul, gros
feutre indélébile pour écrire sur du verre (type Pentel Pen N50).

Planning des TP de Biochimie structurale 1 2006-2007

dates 6 novembre 9 novembre 10 13 novembre 16 17 novembre

novembre novembre
heures 8-13h 13h30- 13h30- 8-13h 13h30- 8-13h
18h30 18h30 18h30
Groupes 15 12 13 16 14 SME+CHI+PCH

Le TP comporte 2 parties :

Une chromatographie d'acide acides aminés,

Un dosage de tyrosine

Les TP se déroulent au Département de Biologie dans le bâtiment TPR II (bâtiment

de la scolarité) au 4e étage salle 5 (au fond du couloir à gauche)

Attention les TP durent 5h donc 13h30-18h30 ou 8h-13h

Le nombre de places étant limité dans la salle de TP, les étudiants sont tenus
de respecter le jour où leur groupe de TD est convoqué en TP

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 2006-2007

L1 - TRAVAUX PRATIQUES DE
BIOCHIMIE STRUCTURALE

La composition en acides aminés (type et nombre d’acides aminés) des protéines est variable d’une
protéine à une autre. Il est possible, en réalisant une hydrolyse des liaisons peptidiques par méthode
chimique (HCl 6M, 110°C, plusieurs heures), de libérer tous les acides aminés d’une protéine. On peut
alors déterminer, par différentes méthodes, la composition en acides aminés de cette protéine. Au
cours de ce TP vous allez aborder deux techniques qui servent à obtenir des informations sur la
composition en acides aminés d’une protéine :
I- la détermination du nombre d’un acide aminé particulier, la tyrosine, grâce à un dosage
spécifique,
II- la détermination d’une composition en acides aminés par chromatographie sur couche mince.
Ces deux techniques ne permettent pas, à elles seules, de connaître la composition en acides aminés d’une
protéine mais donnent des informations partielles qui rajoutées à d’autres permettrons de connaître cette
composition.

I- Détermination du nombre de tyrosine de la caséine β à

partir du dosage dans un hydrolysat de la tyrosine libre

A- Principe du dosage de la tyrosine par le réactif de Folin-Ciocalteu

La caséine β est une protéine issue du lait. Sa masse moléculaire est d’environ 25,0 kDa. Un
hydrolysat de caséine a été obtenu par hydrolyse acide. Cet hydrolysat contient environ 40 % d’acides
aminés libres, le reste est constitué de peptides non totalement hydrolysés.
Afin d’évaluer le nombre de tyrosine contenues dans la caséine β, on réalise un dosage de cet
acide aminé à l’aide du réactif de Folin-Ciocalteu à partir d’une solution d’hydrolysat de caséine. En
milieu alcalin le réactif de Folin Ciocalteu (complexe phosphomolybdique-phosphotungstique) est
réduit par le noyau phénolique des résidus de tyrosine libres. Cette réaction donne une coloration bleue
permettant un dosage colorimétrique.
Pour quantifier la quantité de tyrosine libre de l’hydrolysat à étudier, il faut réaliser une gamme de
référence (ou gamme étalon) avec une solution pure, de concentration connue, de tyrosine.

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B) Réalisation du dosage
1) Solutions et réactifs
- HCl 0,2 mol/L (50 mL)
- NaOH 0,2 mol/L (50 mL)
- Réactif de Folin (dilué au ½)
- Hydrolysat de caséine : solution à 4,2 g de protéines/L (dite solution mère)
- Solution de référence (tyrosine) à 50 mg/L solubilisé dans HCl 0,2 mol/L (masse molaire de la
tyrosine = 181 g/mol)
Question : Comment préparer une solution de HCL à 0,2 mol/L à partir d’HCL concentré à 36%
(densité HCL= 1,14 ; masse molaire 36,5 g/mole) ?

2) Préparation de la gamme d’étalonnage

A partir de la solution de référence, réaliser une gamme de concentration allant de 0 à 50 mg/L dans
un volume de 1 mL final.
Vous pipeterez les solutions de tyrosine et d’ HCl 0,2 mol/L avec un Pipetman (P1000). Il est
nécessaire de changer de pointe lorsque vous changer de solution. Procéder, pour doser la quantité de
tyrosine suivant la procédure décrite ci dessous.

T 1 2 3 4 5
Tyr (mg/L) 0 10 20 30 40 50
Tyr (µL)
HCl qsp
1mL

Le tube T est un tube témoin : Quel est l’intérêt de ce tube ? Quel doit être sa composition ? Quelles
solutions et quels volumes allez-vous pipeter ?

3) Préparation des échantillons d’hydrolysat

Faire une solution diluée de moitié de la solution mère d’hydrolysat de caséine, dans un volume final
de 1ml, en utilisant la solution d’HCL 0,2mol/L. Procéder, pour doser la quantité de tyrosine dans la
solution mère d’hydrolysat (tube 6) et dans la solution diluée de moitié (tube 7), suivant la procédure
décrite ci-dessous « Réaction colorée de dosage de la tyrosine »
.
4) Réaction colorée de dosage de la tyrosine
Les réactions colorées sur les dilutions de la gamme étalon (tubes T et 1 à 5) et sur les
échantillons d’hydrolysat de caséine (tubes 6 et 7) doivent être faites toutes en même temps.

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Pour chaque échantillon (8 tubes =T+7) :
- Prélever 500 µL de la solution (solution de la gamme étalon ou solution d’hydrolysat),
- Ajouter 2,5 mL de NaOH 0,2 mol/L,
- Ajouter 0,25 mL de réactif de Folin,
- Agiter au vortex.
Attendre 5 à 10 min avant de lire les absorbances à 750 nm contre le témoin (T) noter les valeurs.

Question : Pourquoi utilise-t-on une solution diluée de l’hydrolysat de caséine pour réaliser le dosage
de la tyrosine libre ?

C) Résultats : concentration massique de tyrosine et nombre de tyrosine

A partir des valeurs d’absorbance en fonction de la concentration en tyrosine, tracer la courbe de

référence. En déduire la concentration massique de tyrosine dans l’hydrolysat de caséine ainsi que le
nombre de tyrosine par molécule de protéine.

II- Séparation des acides aminés d’un mélange par

chromatographie de partage
A- Principe de la chromatographie de partage
Lorsqu'une substance est mise en présence de 2 solvants non miscibles elle se répartit entre ces 2
solvants selon son coefficient de solubilité pour chacun des solvants. Ce coefficient est caractéristique de la
substance étudiée, indépendant de sa concentration et n'est pas affecté par la présence d'autres solutés.
Ce principe sera utilisé pour la séparation d’un mélange d’acides aminés par chromatographie sur
couche mince. Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire correspond au support polaire,
constitué de cellulose fixée sur un film plastique. La phase mobile est constituée d’un solvant apolaire qui
migre le long de la phase stationnaire par capillarité. Cette chromatographie est réalisée dans une cuve de
verre (dite « cuve sandwich »), close, dont l'atmosphère est saturée par la phase mobile. Le mélange à
analyser est déposé à l'une des extrémités de la feuille (voir figure 1). Cette extrémité est mise en contact
avec la phase mobile. Plus les substances du mélange sont solubles dans la phase mobile plus elles
migreront sur le support et plus les substances sont solubles dans la phase stationnaire moins elles
migreront. La solubilité des acides aminés dans la phase polaire (fixe) ou apolaire (mobile) va dépendre de
la structure chimique de leur chaîne latérale, la présence d’atome H, O ou N étant déterminante pour le
caractère hydrophile ou hydrophobe.
Afin de pouvoir comparer les migrations on définit le Rf : Distance parcourue par le composé
Distance parcourue par le solvant

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qui permet à tout moment d’exprimer la migration relative de l’acide aminé par rapport à une référence, ici
le solvant. Ce Rf est caractéristique d'une substance dans des conditions expérimentales données. Les
acides aminés hydrophiles resteront près du dépôt. Les acides aminés hydrophobes seront entraînés dans la
phase mobile et migreront loin du dépôt. Dans ces conditions le Rf des acides aminés hydrophiles aura une
valeur bien plus faible que le Rf des acides aminés hydrophobes.
Pour identifier un acide aminé inconnu il est nécessaire d’analyser, en parallèle sur la même plaque,
des acides aminés connus qui serviront de comparaison. Le Rf des acides aminés connus et inconnus sera
alors comparé.

cuve sandwich

plaque de cellulose

dépôt acides aminés

solvant
Figure 1

B- Application
Cette technique va être utilisée pour connaître la composition en acides aminés de tri peptides
hydrolysés.
1) Support utilisé :
Le support utilisé est un « film » dont la partie active (100 µm d'épaisseur sur le support en polyester)
est constituée par une couche de cellulose fabriquée à l'aide de cellulose spéciale et d'un liant. Celui-ci,
nécessaire pour assurer une souplesse, une adhérence et une cohésion convenable du film, a été choisi de
manière à ne pas influer sur les propriétés adsorbantes de la cellulose. Le pouvoir de résolution très élevé de
ces films permet d'obtenir de très bons résultats avec des migrations de 8 à 10 cm seulement.

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 2) Application des échantillons :
Chaque dépôt de solutions (hydrolysat de tripeptide ou solutions d’acide aminé connu) est effectué
avec des capillaires de sorte que le volume déposé en une fois soit de l'ordre de 0,2 µl à 0,5 µl afin de
donner des dépôts de petite dimension ayant 1 à 3 mm de diamètre.
Tracer la ligne de dépôt à 2 cm du bord inférieur du film (très légèrement avec un crayon HB ou 4B).
A partir du bord, délimiter sur cette ligne 10 repères tous les 1 cm. Déposer chaque acide aminé connu (8)
et 2 fois le mélange d'acides aminés à analyser, sur la ligne de dépôt, au milieu de l'intervalle entre les
repères. Ces dépôts sont séchés à l’air libre avant de faire la chromatographie.
ATTENTION : ne pas mettre les doigts sur la surface mate de la plaque de cellulose qui est la face active.

3) Réalisation de la chromatographie.
On utilisera une cuve dite "sandwich". L'évaporation est très réduite dans ce type de cuve et il n'est
pas nécessaire de prendre des précautions spéciales pour assurer la saturation. Le film sera placé entre les
deux plateaux de la cuve. Après avoir fixé les pinces de serrage, on place l'ensemble dans un bac contenant
120 ml du mélange de solvants. Le mélange monte par capillarité, c'est une chromatographie ascendante.
Quand la phase mobile atteint le sommet du film, le chromatogramme est retiré de la cuve. Le front
du solvant est souligné délicatement au crayon à papier. Le film est ensuite séché.
Mélange de solvants : Butanol normal 80 ml
Acide acétique conc. 20 ml
H2O distillée : 20 ml

4) Révélation du chromatogramme
Elle est obtenue en pulvérisant sur le film (sous la hotte, voir les enseignants), une solution de
ninhydrine à 0,2% dans le mélange éthanol-acide acétique (4V : 1V) et en séchant ensuite le
chromatogramme pendant 2 à 3 minutes dans une étuve à 80°C.
Exemple de préparation de la solution de ninhydrine à 0.2%. Pour préparer 200 ml de cette solution :
- on pèse 0,4g de ninhydrine (se présente sous forme de poudre)
- on prépare le mélange éthanol, acide acétique en mesurant 160 ml d'éthanol et en rajoutant 40 ml
d'acide acétique (mélange 4V : 1V)
- on dissout les 0,4 g de ninhydrine avec le mélange éthanol-acide acétique de façon que le volume
final soit de 200 ml.

C- Résultats : Faire un tableau des valeurs de Rf obtenues pour les acides aminés de référence et
ceux du mélange. En déduire la composition du mélange.