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ILNAS-EN 14123:2007

Produits alimentaires - Dosage de

l'aflatoxine B1 et de la somme des
aflatoxines B1, B2, G1 et G2 dans les
noisettes, les cacahuètes, les
Foodstuffs - Determination of aflatoxin
B1 and the sum of aflatoxin B1, B2, G1
and G2 in hazelnuts, peanuts, pistachios,
figs, and paprika powder - High
Lebensmittel - Bestimmung von Aflatoxin
B1 und der Summe von Aflatoxin B1, B2,
G1 und G2 in Haselnüssen, Erdnüssen,
Pistazien, Feigen und Paprikapulver -

12/2007
 ILNAS-EN 14123:2007

Avant-propos national

Cette Norme Européenne EN 14123:2007 a été adoptée comme Norme

Luxembourgeoise ILNAS-EN 14123:2007.

Toute personne intéressée, membre d'une organisation basée au Luxembourg, peut

participer gratuitement à l'élaboration de normes luxembourgeoises (ILNAS),
européennes (CEN, CENELEC) et internationales (ISO, IEC) :

- Influencer et participer à la conception de normes

- Anticiper les développements futurs
- Participer aux réunions des comités techniques
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https://portail-qualite.public.lu/fr/normes-normalisation/participer-normalisation.html

CETTE PUBLICATION EST PROTÉGÉE PAR LE DROIT D'AUTEUR

Aucun contenu de la présente publication ne peut être reproduit
ou utilisé sous quelque forme ou par quelque procédé que ce
soit - électronique, mécanique, photocopie ou par d'autres
moyens sans autorisation préalable !
 ILNAS-EN 14123:2007
NORME EUROPÉENNE EN 14123
EUROPÄISCHE NORM
EUROPEAN STANDARD Décembre 2007

ICS 67.050 Remplace EN 14123:2003

Version Française

Produits alimentaires - Dosage de l'aflatoxine B1 et de la somme

des aflatoxines B1, B2, G1 et G2 dans les noisettes, les
cacahuètes, les pistaches, les figues et le paprika en poudre -
Méthode par purification sur colonne d'immuno-affinité suivie
d'une chromatographie liquide à haute performance avec
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dérivation post-colonne

Lebensmittel - Bestimmung von Aflatoxin B1 und der
Summe von Aflatoxin B1, B2, G1 und G2 in Haselnüssen,
Erdnüssen, Pistazien, Feigen und Paprikapulver -
Hochleistungsflüssigchromatographisches Verfahren mit
Immunaffinitätssäulen-Reinigung und
Nachsäulenderivatisierung
Foodstuffs - Determination of aflatoxin B1 and the sum of
aflatoxin B1, B2, G1 and G2 in hazelnuts, peanuts,
pistachios, figs, and paprika powder - High performance
liquid chromatographic method with post-column
derivatisation and immunoaffinity column cleanup

La présente Norme européenne a été adoptée par le CEN le 12 novembre 2007.

Les membres du CEN sont tenus de se soumettre au Règlement Intérieur du CEN/CENELEC, qui définit les conditions dans lesquelles
doit être attribué, sans modification, le statut de norme nationale à la Norme européenne. Les listes mises à jour et les références
bibliographiques relatives à ces normes nationales peuvent être obtenues auprès du Centre de Gestion du CEN ou auprès des membres
du CEN.

La présente Norme européenne existe en trois versions officielles (allemand, anglais, français). Une version dans une autre langue faite
par traduction sous la responsabilité d'un membre du CEN dans sa langue nationale et notifiée au Centre de Gestion du CEN, a le même
statut que les versions officielles.

Les membres du CEN sont les organismes nationaux de normalisation des pays suivants: Allemagne, Autriche, Belgique, Bulgarie,
Chypre, Danemark, Espagne, Estonie, Finlande, France, Grèce, Hongrie, Irlande, Islande, Italie, Lettonie, Lituanie, Luxembourg, Malte,
Norvège, Pays-Bas, Pologne, Portugal, République Tchèque, Roumanie, Royaume-Uni, Slovaquie, Slovénie, Suède et Suisse.

COMITÉ EUROPÉEN DE NORMALISATION

EUROPÄISCHES KOMITEE FÜR NORMUNG
EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION

Centre de Gestion: rue de Stassart, 36 B-1050 Bruxelles

© 2007 CEN Tous droits d'exploitation sous quelque forme et de quelque manière que Réf. n° EN 14123:2007 F
ce soit réservés dans le monde entier aux membres nationaux du CEN.
 EN 14123:2007 (F) ILNAS-EN 14123:2007

Sommaire Page

Avant-propos.......................................................................................................................................................3
1 Domaine d'application...........................................................................................................................4
2 Références normatives .........................................................................................................................4
3 Principe...................................................................................................................................................4
4 Réactifs ...................................................................................................................................................4
5 Appareillage ...........................................................................................................................................8
6 Modes opératoires .................................................................................................................................9
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7 Fidélité ..................................................................................................................................................14
8 Rapport d’essai ....................................................................................................................................18
Annexe A (informative) Chromatogrammes types.........................................................................................19
Annexe B (informative) Données sur la fidélité..............................................................................................23
Bibliographie .....................................................................................................................................................28

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 ILNAS-EN 14123:2007 EN 14123:2007 (F)

Avant-propos
Le présent document (EN 14123:2007) a été élaboré par le Comité Technique CEN/TC 275 “Analyse des
produits alimentaires - Méthodes horizontales”, dont le secrétariat est tenu par DIN.

Cette Norme européenne devra recevoir le statut de norme nationale, soit par publication d'un texte identique,
soit par entérinement, au plus tard en juin 2008, et toutes les normes nationales en contradiction devront être
retirées au plus tard en juin 2008.

Le présent document remplace l’EN 14123:2003 avec les modifications suivantes :

a) Inclusion de données de validation sur les noisettes.

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AVERTISSEMENT — L'utilisation de la présente norme peut impliquer l’emploi de produits, la mise en

œuvre d’opérations ou l’utilisation d’appareils à caractère dangereux. Cette norme n’a pas pour
objectif de traiter tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation. Il est de la responsabilité de
l’utilisateur de cette norme d’établir, avant de l’utiliser, les procédures d’hygiène et de sécurité
appropriées et de déterminer si certaines restrictions réglementaires s’appliquent.

Selon le Règlement Intérieur du CEN/CENELEC, les instituts de normalisation nationaux des pays suivants
sont tenus de mettre cette Norme européenne en application : Allemagne, Autriche, Belgique, Bulgarie,
Chypre, Danemark, Espagne, Estonie, Finlande, France, Grèce, Hongrie, Irlande, Islande, Italie, Lettonie,
Lituanie, Luxembourg, Malte, Norvège, Pays-Bas, Pologne, Portugal, République tchèque, Roumanie,
Royaume-Uni, Slovaquie, Slovénie, Suède et Suisse.

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 EN 14123:2007 (F) ILNAS-EN 14123:2007

1 Domaine d'application

La présente Norme européenne peut être appliquée au dosage des aflatoxines B1, B2, G1 et G2 présentes dans
les noisettes, les figues, les pistaches, les cacahuètes et le paprika en poudre. La limite de quantification de la
méthode est d'au moins 0,8 ng/g pour chaque aflatoxine (valeur obtenue à partir d’une étude interne et d’une
étude interlaboratoire) selon l’équipement utilisé.

2 Références normatives

Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).

EN ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai (ISO 3696:1987).
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3 Principe

Une prise d’essai est extraite à l’aide d’une solution de solvant (méthanol/eau) ou de cette solution de solvant
additionnée d’hexane (ou de cyclohexane). L’extrait d’échantillon est filtré, dilué avec un tampon phosphate
(PBS) puis transféré dans une colonne d’immunoaffinité (CIA) contenant des anticorps dirigés spécifiquement
contre les aflatoxines B1, B2, G1 et G2. Les aflatoxines sont éluées de la colonne chromatographique
d’immunoaffinité à l’aide de méthanol. Les aflatoxines sont ensuite quantifiées par chromatographie liquide
haute performance (phase inverse) avec dérivation post-colonne par bromation suivie d’une détection
fluorimétrique. La dérivation post-colonne est réalisée soit avec du brome obtenu par voie électrochimique soit
avec de l’hydrobromure perbromure de pyridinium (PBPB).

4 Réactifs
4.1 Généralités

Sauf spécification contraire, utiliser exclusivement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau de
qualité 3 conforme à l’EN ISO 3696.

4.2 Eau, de qualité 1 conformément à l’EN ISO 3696

4.3 Tampon phosphate (PBS), pH = 7,4

Dissoudre 0,20 g de chlorure de potassium, 0,20 g de dihydrogénophosphate de potassium, 1,16 g

d’hydrogéno-orthophosphate dissodique (ou 2,92 g d'hydrogénophosphate 12 H2O) et 8,00 g de chlorure de
sodium dans 0,9 l d’eau. Après dissolution, ajuster le pH à 7,4 à l’aide d’HCl (0,1 mol/l) ou
de NaOH (0,1 mol/l) selon le cas. Diluer avec de l’eau jusqu’à obtention d’1 l de solution.

Il est également possible d’utiliser des comprimés de tampon PBS disponibles dans le commerce et
présentant des propriétés équivalentes.

4.4 Chlorure de sodium (NaCl)

4.5 Hydrobromure perbromure de pyridinium (PBPB), [CAS : 39416-48-3]

4.6 Bromure de potassium (KBr)

4.7 Acétonitrile, pour CLHP

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 ILNAS-EN 14123:2007 EN 14123:2007 (F)

4.8 Méthanol, pour CLHP

4.9 Méthanol, de qualité analytique

4.10 Toluène

4.11 Solvant d’extraction, solution de méthanol et d’eau

Mélanger 8 volumes de méthanol (4.9) avec 2 volumes d'eau.

4.12 n-Hexane ou cyclohexane, de qualité analytique

4.13 Acide nitrique, c(HNO3) = 4 mol/l

Diluer 28 ml d’acide nitrique (fraction volumique 65 %), ou 26 ml d’acide nitrique (fraction volumique 70 %)
avec de l’eau jusqu’à l’obtention d’un volume final de 100 ml.

4.14 Colonne d’immunoaffinité

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La colonne d’affinité doit contenir des anticorps dirigés contre les aflatoxines B1, B2, G1 et G2. Elle doit avoir
une capacité maximale d’au moins 100 ng d’aflatoxine B1 et un taux de récupération d’au moins 80 % pour les
aflatoxines B1, B2, G1 et d’au moins 60 % pour l’aflatoxine G2 lorsqu’une solution étalon aqueuse (10 % de
méthanol) contenant 5 ng de chaque toxine y est déposée. La concentration maximale en solvant dans la
colonne ne doit pas dépasser 12 % de méthanol.

4.15 Phase mobile pour CLHP (A), à utiliser avec du PBPB

Mélanger 6 volumes d'eau (4.2) à 2 volumes d'acétonitrile (4.7) et 3 volumes de méthanol (4.8). Dégazer la
solution avant utilisation. La phase mobile doit être exempte de particules et il convient de la filtrer avant
utilisation.

4.16 Phase mobile pour CLHP (B), à utiliser avec du brome obtenu par voie électrochimique

Mélanger 6 volumes d'eau (4.2) à 2 volumes d'acétonitrile (4.7) et 3 volumes de méthanol (4.8).
Ajouter 120 mg de bromure de potassium (4.6) et 350 µl d’acide nitrique (4.13) par litre de phase mobile.
Dégazer la solution avant utilisation.

4.17 Réactif post-colonne

Dissoudre 50 mg de PBPB (4.5) dans 1 l d’eau. Cette solution peut être utilisée jusqu’à 4 jours si elle est
conservée à l’abri de la lumière à température ambiante.

4.18 Mélange de toluène et d’acétonitrile

Mélanger 98 volumes de toluène (4.10) à 2 volumes d'acétonitrile (4.7).

4.19 Aflatoxines, sous forme de cristaux ou de films, conditionnés dans des ampoules ou sous forme de
solutions d’aflatoxines disponibles dans le commerce

AVERTISSEMENT 1 — Les procédures de décontamination des déchets d'aflatoxines de laboratoire

ont été mises au point par le Centre international de recherche sur le cancer (CIRC) [1] et [2].

AVERTISSEMENT 2 — Les aflatoxines se dégradent si elles sont exposées à la lumière. Protéger le

laboratoire dans lequel les analyses sont réalisées de la lumière du jour de manière appropriée. À cet
effet, placer des feuilles anti-ultraviolets (UV) contre les fenêtres et utiliser de la lumière tamisée (pas
de lumière du jour directe) ou encore des rideaux ou des stores en combinaison avec la lumière
artificielle (les tubes fluorescents sont acceptables).

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 EN 14123:2007 (F) ILNAS-EN 14123:2007

Protéger autant que possible de la lumière les solutions contenant de l’aflatoxine (conserver à l’obscurité,
utiliser du papier aluminium ou de la verrerie ambrée) et les stocker à la température recommandée par le
fabricant (par exemple, – 18 °C).

4.20 Solution mère d’aflatoxines

Dissoudre séparément de l’aflatoxine B1, B2, G1 et G2 dans le mélange toluène/acétonitrile (4.18) afin d’obtenir
des solutions distinctes de 10 µg/ml pour chaque aflatoxine. Envelopper soigneusement les fioles dans du
papier aluminium et les stocker à une température inférieure à 4 °C.

Pour déterminer la concentration exacte en aflatoxine de chacune des solutions mères, enregistrer le spectre
d’absorption entre 330 nm et 370 nm de longueurs d’onde à l’aide de cellules en quartz de 1 cm dans un
spectromètre en utilisant la solution toluène/acétonitrile (4.18) comme référence. Calculer la concentration
massique de chaque aflatoxine, ρi, en microgrammes par millilitre, à l’aide de l’équation (1) :

Amax × M i × 100
ρi = (1)
εi × b
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où

Amax est l’absorbance déterminée à la valeur maximale de la courbe d’absorption ;

Mi est la masse molaire de chaque aflatoxine, exprimée en grammes par mole ;

εi est le coefficient d’absorption molaire de chaque aflatoxine dans la solution de toluène et

d’acétonitrile (4.18), en mètres carrés par mole ;

b est la longueur du trajet optique de la cellule, en centimètres.

Les valeurs de Mi et de εi des aflatoxines B1, B2, G1 et G2 sont regroupées dans le Tableau 1.

Tableau 1 — Masse molaire et coefficient d'absorption molaire des aflatoxines B1, B2, G1 et G2
(Mélange toluène/acétonitrile (4.18))

Aflatoxine Mi εi
2
en g/mol en m /mol
B1 312 1930
B2 314 2040
G1 328 1660
G2 330 1790

4.21 Solution mère d’aflatoxines en mélange

A l’aide du mélange toluène/acétonitrile (4.18), préparer une solution mère d’aflatoxines en mélange
avec 1 000 ng/ml d’aflatoxine B1 et d’aflatoxine G1, 200 ng/ml d’aflatoxine B2 et d’aflatoxine G2 en diluant les
solutions mères d’aflatoxines (B1, B2, G1 et G2) (4.20) de manière appropriée.

NOTE En variante, il est possible d’utiliser une solution étalon d’aflatoxines totales, prête à l’emploi et disponible
dans le commerce dans un flacon de 1 000 ng/ml d’aflatoxines totales.