TP de la méthode de séparation

Fait par :
Khmiri farah
1 zre année cycle ingénieur en
genie chimique
Enseignant : M. Olfa Dachraoui
 Pictogrammes du SIMDUT
Système d’information sur les matières Flamme sur un cercle
dangereusesutilisées au travail (SIMDUT)
Comburant
Flamme
Inflammable Bombe explosant
Autoréactive Explosif*
Autoréactive (danger aigu)
Pyrophorique
Peroxyde organique
Auto-échauffant (danger aigu)
Dégage des gaz
inflammables au Bouteille à gaz
contact de l’eau
Peroxyde organique Gaz sous pression
Produits chimiques sous Produits chimiques
pression (inflammables) sous pression

Tête de mort sur Corrosion

deux tibias Lésions oculaires graves
Corrosion cutanée
Toxicité aiguë
(danger mortel ou toxique) Corrosif pour les métaux

Point d’exclamation
Danger biologique
Irritation
Matières infectieuses (cutanée ou oculaire)
présentant un danger
biologique Sensibilisation cutanée
Toxicité aiguë (nocif)
Danger pour la santé Toxicité pour certains
organes cibles
Cancérogénicité (somnolence ou vertiges
Sensibilisation respiratoire ou irritation des voies
respiratoires)
Toxicité pour la
reproduction Danger pour la couche
d’ozone*
Toxicité pour certains
organes cibles
Mutagénicité pour les Environnement
cellules germinales Toxicité pour organismes
Danger par aspiration aquatiques*

NOTE : Il n’y a pas de pictogrammes spécifiques d’attribués à certaines classes de

Pictogramme approprié au danger
Dangers physiques non classifiés ailleurs
Dangers pour la santé non classifiés ailleurs
dangers, telles que les poussières combustibles et les asphyxiants simples, ainsi
qu’à certaines catégories de dangers moins sévères. Produits chimiques sous
pression : les catégories 1 et 2 doivent être représentées à la fois par des
pictogrammes de flamme et de bouteille à gaz.
* N’est pas prescrit par le SIMDUT, mais peut être utilisé.


 plan

TP1 : LA CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE DE COLORANTS

ALIMENTAIRES

TP 2: CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE

TP CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE À HAUTE PERFORMANCE

(HPLC)
TP1 : LA CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE
MINCE DE COLORANTS ALIMENTAIRES
 plan

I. Introduction

II. Partie théorique

• Objectif
• Définition
• Principe
• Domaine d’application

III. Partie pratique

• Matériels et consommables
• Mode opératoire

IV. Expression des résultats

V. Conclusion
 Introduction

La chromatographie est une technique permettant de séparer plusieurs constituants

d'un mélange en les faisant migrer, sur une phase immobile, par une phase liquide ou
gazeuse. Cet article présente les principaux types de chromatographie, avec leur
principe de séparation et leurs principales indications. Il propose, en dernière partie,
une comparaison de ces différentes techniques.
La chromatographie est une technique séparative analytique et/ou préparative. Elle
consiste à faire migrer les constituants à séparer sur une phase stationnaire immobile,
à l’aide d’une phase mobile, liquide ou gazeuse, de nature différente. Chaque molécule
sera plus ou moins rapidement entraînée selon son affinité pour, respectivement, la
phase stationnaire et la phase mobile, permettant la séparation des différents
constituants présents.

À partir de ce principe très général, il existe de très nombreux types de

chromatographie en fonction de la nature de la phase stationnaire, de la nature de la
phase mobile, et de la nature des interactions entre ces phases et les molécules à
purifier. En effet, selon les cas, les facteurs physico-chimiques qui interviennent
comme critère de séparation sont totalement différents : ce peut être la masse
moléculaire, la charge, l’hydrophilie/hydrophobicité, la structure tridimensionnelle,
etc. Évidemment, le choix est effectué au cas par cas en fonction des besoins. Il n’est
d’ailleurs pas rare d’utiliser successivement plusieurs types de chromatographies
différentes au cours d’une même purification.
Partie théorique
Objectif :
• Connaître le principe de la chromatographie
• Réaliser et interpréter une chromatographie sur couche mince (CCM) pour
des mélanges d’espèces chimiques colorés (colorant alimentaire).

Définition :
Histoire de la technique
 À l’origine, cette technique servait à séparer des espèces chimiques
végétales colorées contenues dans un mélange. Son nom vient d’ailleurs de
la racine grecque Khrôma et fut employé pour la première fois par le
botaniste russe Mikhaïl Tswett en 1906 qui sépara les pigments d'une
feuille d'épinard.
 La chromatographie est aujourd’hui une méthode de séparation, mais
également d'identification des constituants d’un mélange.

Principe de la méthode
La Chromatographie sur Couche Mince (C.C.M) est une technique qui permet
d’identifier les constituants d’un mélange.
Les constituants d'un mélange homogène sont séparés par entrainement au moyen
d'un solvant (nommé éluant ou phase mobile) sur un support (nommé phase
fixe ou stationnaire).
Dans le cas de la chromatographie sur couche mince (C.C.M.), voici le principe
général.
1. Une petite quantité du mélange à séparer est déposée sur le support (la
plaque de chromatographie).
2. Le support est ensuite placé au contact de l’éluant.
3. L’éluant migre de bas en haut, par capillarité, le long du support.
4. L’éluant entraine ainsi les constituants du mélange vers le haut du support.
C’est le phénomène d’élution.
5. Chaque constituant migre d’une certaine hauteur, caractéristique de la
substance. C’est la migration différentielle.
6. Il suffit alors de comparer la migration de ces constituants avec des espèces
chimiques de référence ou témoins. C’est l’analyse comparative.

Domaine d’application :
La CCM est une méthode extrêmement flexible et fréquemment utilisée, avec des
applications allant de l'analyse chimique et du contrôle qualité aux enquêtes
médico-légales et à l'identification de produits naturels. Sa facilité d'utilisation,
son faible coût et son large éventail d'applications en font un instrument précieux
dans une variété de domaines scientifiques.voici quelques exemples :
Industrie alimentaire et cosmétique : La TLC est utilisée dans les industries
alimentaires et cosmétiques pour séparer et identifier les colorants, les
édulcorants, les conservateurs et d'autres composants utilisés dans la fabrication
de produits alimentaires et cosmétiques.

Tests qualitatifs des médicaments : La TLC est utilisée pour les tests qualitatifs de
différents médicaments, notamment les sédatifs, les anesthésiques locaux, les
anticonvulsivants, les tranquillisants, les analgésiques, les antihistaminiques, les
stéroïdes et les hypnotiques.
M
O
D
E
O
P
E
R
A
T
O
I
R
E
Matériels et produits:
- Cuve à élution (tel qu’un grand bécher)
- Béchers de capacité 50 et 100 mL
- Spatule
- Plaque chromatographique

Les consommables :
- Jaune tartrazine (E102)
- Bleu patenté (E131)
- Sirop de menthe
- Chlorure de sodium pure (NaCl)
- Ethanol 95%
- Eau distillée

Mode opératoire
Préparation des échantillons
 On prépare 50 mL d’une solution d’eau salée de concentration 40 g/L .puis on
prepare la solution d’éluant en mélangeant 10 mL d’éthanol pur et 10 mL
d’eau salée.
 Préparation de la plaque de chromatographie:
Il faut la prendre par les côtés la plaque chromatographique pour éviter les traces
de doigts qui fausseraient l’expérience.
 Découper une bande dont les dimensions sont, en largeur, légèrement
inférieure au diamètre de la cuve et en hauteur, légèrement inférieure à la
hauteur totale de la cuve.
 Tracer avec un crayon de papier un trait horizontal à 2,5 cm du bas: c’est la
ligne de dépôt. Ce trait ne doit pas tremper dans le solvant contenu dans la
cuve.
 Tracer sur cette ligne des croix régulièrement espacées. Inscrire sous chaque
croix un code ou un chiffre pour se souvenir de l’espèce déposée.
  A l’aide d’une pipette pasteur, déposer une microgoutte ( inutile d’en mettre
trop) les produits à analyser. Faire attention à laisser suffisamment d’espace
entre les différents produits déposés.

 Verser l’éluant dans la cuve.

 Tremper verticalement le papier dans l’éluant, en faisant bien attention à ce que

la ligne de dépôt soit au-dessus du niveau de l’éluant.

 Fermer la cuve et ne pas la déplacer.

 Observer attentivement.

 Quand l’éluant a fini de migrer, sortir le papier de la cuve et repérer le niveau

atteint par ce dernier (appelé front de l’éluant) à l'aide d'un crayon puis laissez
sécher le papier.

Expression des résultats :

1. Une chromatographie sert a la séparation et la purification des constitutions
2. La difference de migration est du a la polarisation des solvants tel que le solvant
qui passede h le plus important (hv1) est le plus elué donc il et le plus polaire
3. H=7cm
hv1=6,8cm
hv2=5,5cm
hB=5,6cm
hT= 6,9cm
4. On calcule, pour chaque constituant, sa « vitesse de déplacement » ou « rapport
frontal Rf »
5. d’après la relation suivante : Rf=h\H
• Rf1=hv1\H= 6,9\7=0,98
• Rf3=hv2\H=5,5\7=0,78
• Rf2=hB\H= 5,6\7=0,8
• Rf4=hT\H=6,9\7=0,98

6. Oui Rf depend de l’eluant plus le h est importante plus l’effet de solvant est
important plus Rf est grande
 Conclusion

Nous avons vu que la technique de CCM est une technique fiable et

rapide. Ceci explique son emploi très fréquent dans les laboratoires.
Notons cependant qu'il est parfois indispensable d'utiliser d'autres
méthodes de révélation.

Quels sont donc les autres techniques ?

TP 2 : CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE À
HAUTE PERFORMANCE
 Plan

I. Introduction
II. Partie théorique

• Objectif

• définition

• Principe

• Domaine d’application

III. Partie pratique

• Matériels et consommables

• Mode opératoire

IV. Expression des résultats

V. Conclusion
 Introduction

La technique présentée ici est la chromatographie sur colonne, elle utilise

une phase stationnaire introduite dans une colonne de verre. C'est une
technique très largement utilisée notamment lors de réaction en chimie
organique, pour séparer et purifier les différents constituants d'un
mélange. Elle fut découverte en 1906 par le botaniste russe Tswett, qui
montra que l'on pouvait séparer des colorants végétaux en faisant passer
leur solution dans l'éther de pétrole à travers une colonne remplie de
carbonate de calcium.
Objectif :
Le chimiste utilise la chromatographie sur couche mince lorsqu'il souhaite analyser un
mélange. En utilisant le principe à la base de cette technique on va séparer , purifier
et identifier les colorants d’un sirop de menthe.

Définition :
La chromatographie sur colonne est fondée sur le même principe que la
chromatographie sur couche mince, sauf que la silice ne se trouve pas sur une plaque
mais dans une colonne. Cette technique est très utilisée dans la purification en chimie
organique. La séparation des composés est provoquée par l'écoulement continu d'un
éluant passant dans la colonne par gravité ou sous l'effet d'une faible pression. Les
composés sont entraînés par l’éluant à des vitesses différentes en fonction de leurs
affinités avec la silice et avec l’éluant. Ce procédé permet de séparer les différents
composants d’un produit mais aussi de purifier le produit d’une réaction.

Principe :
La chromatographie est une méthode physique de séparation dans laquelle on utilise
deux phases (phase fixe et phase mobile) et l'affinité d'une espèce chimique à «
s'associer » davantage à l'une qu'à l'autre.
Dans le cas de la chromatographie sur colonne, on cherche à séparer de petites
quantités d'un mélange. Cette méthode est particulièrement adaptée aux mélanges
colorés. En classe de seconde, la phase mobile est liquide (éluant) et la phase fixe est
solide.
Chaque constituant étant plus ou moins facilement absorbé par la phase fixe et plus
ou moins dissout dans la phase mobile, sa migration au travers de la colonne se fera à
une certaine vitesse. Il faut parfois utiliser plusieurs solvants les uns après les autres
pour entraîner au mieux les différents constituants.
Domaine d’application :
Dans l'ensemble, la chromatographie sur colonne joue un rôle crucial dans diverses
disciplines scientifiques, notamment la chimie, la biochimie, les produits
pharmaceutiques et la biotechnologie. Ses applications vont de l'analyse et de la
purification de routine aux efforts de recherche complexes, contribuant aux progrès
dans divers domaines.
Estimation des médicaments : La chromatographie sur colonne est utilisée pour
l'analyse quantitative et l'estimation de médicaments dans des formulations ou des
extraits bruts. Il permet la détermination des concentrations de médicaments et
peut être appliqué aux processus de contrôle qualité dans les industries
pharmaceutiques.

Recherche et Développement: La chromatographie sur colonne est un outil précieux

dans les activités de recherche et de développement. Il permet la séparation, la
purification et l'isolement de composés pour une analyse, une identification et une
caractérisation plus poussées. Cela facilite l'étude des propriétés des composés, des
interactions et des applications potentielles.
Partie théorique
Matériels et produits
 Matériels :
On a utilisé dans cette manipe les matériels suivants :
• Colonne de séparation
• Pipettes pasteur
• 2 bécher de capacité 50ml
• Entonnoir
• Balance a 0,1mg près
 Consommables :

• Eluant1: NaCl
• Eluant 2:Ethanol
• Solution verte
• Eau distillée

Mode opératoire :
Préparation de colonne :
En premier lieu on a fixé verticalement la colonne a l’aide d’une pince, puis on a pesé
30g de la silice et on lui ajoute assez d’eluant n°1 toute en mélangeant avec la baguette
en vers pour obtenir a la fin un gel qu’on puisse faire couler, par la suite on a versé ce
gel obtenu a l’aide d’un entonnoir dans la colonne et on la remplie d manière régulière
et a l’aide d’une pipette en plastique on a assuré qu’il ne reste pas de gel sur les parois
grâce a notre éluant.
On a attende plusieurs minutes pour que le gel de silice se tasse puis on a placer un
bécher sous la colonne et on a ouvrer la robinet. En 8èmme étapes on a tapoter la
colonne suffisamment afin d’éliminer les bulles d’air et enfin on a remis éventuellement
une bonne quantité d’eluants n°1 jusqu’à ce que celle – ci soit a environ 2cm au-dessus
de la surface plane de la colonne.
Dépôt de l’échantillon a séparer :
1. Déposer doucement a l’aide d’une pipette environs 2 ou 3mm de la solution verte
en la faisant écouler sur la paroi de’ la colonne
2. Une fois l’échantillon pénétré a la surface de la phase stationnaire , éluer avec
l’eau salée a 50g\L en remplissant la colonne
3. Lorsque la première espèce coloré arrive en bas de la colonne , la récupérer dans
un premier bécher
4. Éluer une nouvelle fois, cette fois ci avec l’éthanol pur
5. Lorsque le second colorant arrive en bas de la colonne , la repérer dans un second
bécher .

Exploitation des résultats :

Éluant: une bonne quantité de NaCl (250ml a 5Og\L)

Puis on ajoute l’éthanol
Phase stationnaire: silice(30g)
Explication :
Soit deux produits de polarité différentes ( Jaune et bleu ) qui migrent à travers une
colonne de silice.
 Le composé Jaune est moins polaire
donc moins retenu.
 Sort en premier (par l’ajout de NaCl)
Le composé bleu est plus polaire
Donc plus retenu.
 Sort en deuxième (après l’ajout de l’éthanol)

a) Les bulle d’air bloque le flux

d’échantillon d’où perte du temps et
perte de la matière
jaune: tetrazine
bleu: patenté
d) Phase mobile = solvant= NaCl et
ethanol
Le NaCl a poussé le couleur jaune de
sortir en premier lieu grâce a son
affinité et sa polarité tq ;
La polarité et l'affinité du solvant ont
un impact sur la solubilité et la
séparation des solutés. Un solvant
polaire est un solvant qui possède des
molécules polaires, c'est-à-dire des
molécules qui ont des liaisons
polarisées et des charges partielles
positives et négatives.

Résultat de la colonne de notre expérience

en classe.
Les solvants polaires sont capables d'interagir avec les solides ioniques et les
solides moléculaires polaires, favorisant ainsi leur dissolution.. La solubilité
d'un soluté dans un solvant dépend de la polarité du solvant et du soluté,
ainsi que de la température. Les molécules du solvant et du soluté sont
sensibles aux mêmes types d'interactions. Les molécules du solvant polaire
sont attirées par les charges partielles positives et négatives des molécules du
soluté, tandis que les molécules du solvant apolaire sont attirées par les
forces de Van der Waals entre les molécules du soluté. En chromatographie,
la polarité et l'affinité du solvant sont utilisées pour séparer les constituants
d'un mélange en fonction de leur polarité et de leur affinité pour la phase
stationnaire. Les solutés qui ont une polarité et une affinité similaires à la
phase stationnaire sont retenus plus longtemps, tandis que les solutés qui ont
une polarité et une affinité similaires à la phase mobile sont élués plus
rapidement et d’une autre part on a changé l’eluant (ethanol) parce que la
polarité de NaCl n’été pas suffisante pour agit et poussé le couleur bleu).
Intérêt : La chromatographie sur colonne trouve des applications dans la
séparation, la purification, l'isolement de composés, l'analyse de mélanges,
l'estimation de médicaments dans des formulations et l'extraction de
métabolites à partir de fluides biologiques.

Conclusion

La technique de la chromatographie sur colonne permet la séparation des

différents constituants d'un mélange, mais elle peut être utilisée couplée à un
moyen de détection, comme par exemple une spectroscopie UV – visible ou
une spectrométrie de masse et on obtient ainsi une chaîne complète
automatisable d'analyse.
Chromatographie en phase liquide à
haute performance (HPLC)
 Plan

I.Introduction

II.Partie théorique
• Objectif
• Définition
• Principe
• Notions fondamentales

III.Partie théorique

• Matériel et produits
• Mode opératoire

IV.Expression des résultats

V.Conclusion
 Introduction
 Bref historique :
L’acronyme HPLC, créé par feu le professeur Csaba Horváth dans son article du Pittcon
de 1970, indiquait à l’origine qu’une pression élevée servait à générer le débit
nécessaire à la chromatographie liquide dans des colonnes garnies de particules. Au
début, les pompes n’avaient qu’une capacité de pression de 500 psi, soit 35 bar. Cette
technique fut baptisée « chromatographie liquide haute pression », ou HPLC. Au début
des années 1970, des progrès technologiques considérables ont permis de grandes
avancées, et les nouveaux instruments HPLC ont alors pu développer jusqu’à 6 000 psi
(400 bar) de pression et ont intégré des injecteurs, des détecteurs et des colonnes
améliorés. La HPLC a réellement commencé à s’imposer entre le milieu et la fin des
années 1970. Si la technique s’est continuellement améliorée pendant cette période
(particules plus petites, pression encore plus élevée), le sigle HPLC est resté identique,
mais sa signification a changé pour désormais correspondre à « High Performance
Liquid chromatography », soit « chromatographie liquide haute performance ».

La chromatographie liquide haute performance est à présent l’un des outils les plus
puissants de la chimie analytique. Elle permet de séparer, d’identifier et de quantifier
les composés présents dans tout échantillon pouvant être dissous dans un liquide.
Aujourd’hui, des composés à l’état de traces à l’échelle des parties par billion (ppt pour
« parts per trillion ») peuvent facilement être identifiés. La HPLC peut être (et est
d’ailleurs) appliquée à pratiquement tous les échantillons, tels que des produits
pharmaceutiques, des denrées alimentaires, des produits nutraceutiques, des
cosmétiques, des matrices environnementales, des échantillons médico-légaux et des
produits chimiques industriels.
Partie théorique
Objectif :
Notre objectif sert a la séparation par chromatographie liquide a haute performance.

Définition :
La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est une technique analytique
puissante largement utilisée dans divers domaines scientifiques, notamment la chimie,
la pharmacie, la biochimie et l'analyse environnementale. Il permet la séparation,
l'identification et la quantification des composants individuels dans un mélange avec
une précision et une exactitude élevées.

Principe :
Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est
introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles
interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne
chromatographique.

La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système
chromatographique.
Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système
chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité
entre la phase mobile et la phase stationnaire.

En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont

caractérisés par un pic. L’ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme.
 Notions fondamentales

La phase stationnaire est un support plus ou moins poreux recouvert d’un gel (liquide
greffé) qui a les propriétés désirées pour retenir les molécules de solutés.
La phase mobile ou éluant est un liquide qui entraîne les solutés à travers la colonne.

Notion de temps
t0 est le temps du début de l’injection
Le temps mort tm est le temps mis par un composé non retenu par la phase
stationnaire pour traverser la colonne (temps passé dans la phase mobile)
Le temps de rétention tr est le temps mis par un soluté pour traverser la colonne. C’est
le temps passé dans la phase stationnaire et dans le volume mort de la colonne. Ce
temps est caractéristique d’un soluté dans des conditions d’analyse donnée. La surface
du pic est fonction de la quantité du constituant dont il est la trace.
Le temps de rétention réduit t’r est le temps passé par un soluté dans la phase
stationnaire, soit :

Notion de concentration
Le coefficient de partage K :
A un instant donné, le soluté est à la concentration Cm dans la phase mobile et Cs dans
la phase stationnaire. Leur rapport à l’équilibre est appelé coefficient de partage K
Ce coefficient est fonction de 3 types d’affinités :
• celle entre le soluté et la phase mobile
• celle entre le soluté et la phase stationnaire
• celle entre les phases mobile et stationnaire
Le facteur de capacité K’ est le rapport de la quantité d’un soluté dans la phase stationnaire et
dans la phase mobile.

Vs : volume de la phase stationnaire

Vm : volume de la phase mobile ou volume mort
K’ est aussi le rapport du temps passé par un soluté dans la phase stationnaire sur le
temps passé par ce même soluté dans la phase mobile.

Notion d’efficacité

La largeur d’un pic est caractéristique de l’efficacité de la séparation : plus le pic est fin
plus la chromatographie est efficace. L’efficacité est mesurée par :
le nombre de plateaux théoriques Nth
tr : temps de rétention
w 1/2 : largeur du pic à mi-hauteur
Remarque :
Nth est très utilisé en HPLC. Pourtant il serait plus judicieux d’utiliser Neff (nombre de
plateaux effectifs) puisqu’il dépend vraiment du temps passé dans la phase stationnaire.
Expérimentalement tm est difficile à déterminer d’ou l’utilisation de Nth.
La hauteur équivalente à un plateau théorique : HEPT, qui est définit comme :
L : Longueur de la colonne
Nth : Nombre de plateaux théoriques

En conséquence, pour maintenir le débit constant dans la colonne il faut augmenter la

pression plus la granulométrie de la phase stationnaire est faible.

En HPLC on travaille, en tête de colonne, à des pressions entre 20 et 150 bars.

 Appareillage

La phase mobile est pompée à partir d’une bouteille et parcourt en permanence le

chromatographe : l’injecteur, la colonne dans le four et le détecteur. La température du
four est maintenue constante.
Le signal du détecteur est amplifié et enregistré.

Réservoir de la phase mobile (solvant)

Le plus souvent ce réservoir est une bouteille en verre dans lequel plonge un tube avec
une extrémité filtrante en téflon. S’il est nécessaire le dégazage peut se faire par
agitation puis conservation du solvant sous atmosphère d’hélium.
Pompe
Elle délivre en continu la phase mobile. Elle est définit par la pression qu’elle permet
d’atteindre dans la colonne, son débit, et la stabilité du flux. Actuellement les
paramètres d’une pompe sont
* débit : 0,01 à 10 mL/min
* stabilité < 1% (<0,2% pour des chromatographies d’exclusion diffusion)
* pression maximale > 350 bars
Certaines sont pilotées par informatique (bien utile lors de l’utilisation de gradient
d’élution).
Injecteur
Le type d’injecteur le plus couramment utilisé comporte une vanne à boucle
d’échantillonnage d’une capacité fixe (10, 20, 50 µL…). Cette boucle permet d’introduire
l’échantillon sans modifier la pression dans la colonne.
Vanne à boucle d’échantillonnage
Elle possède 2 positions. La première permet le remplissage de la boucle d’injection de
volume fixe (load), la seconde permet la mise en circulation de l’échantillon dans le
système chromatographique (inject).
Le remplissage de la boucle d’injection se fait à l’aide d’une seringue.

Fig :Seringue pour le remplissage de la boucle

Prise en classe

Colonne
En mode analytique, les colonnes en inox ont généralement un diamètre interne de
4,6mm. La longueur est de 5, 10, 15, ou 25cm. Le remplissage (en silice, silice greffée ou
particules polymériques) a une granulométrie de 3, 5, ou 10µm. Le diamètre interne
d’une colonne est usuellement de 4 ou 4,6 mm. Si des substances pures doivent être
collectées en fin de chromatogramme des colonnes de gros diamètre seront
nécessaires.
Détecteurs

Le détecteur suit en continu l’apparition des solutés. Pour détecter, on utilise différents
phénomènes physico-chimiques. Le signal obtenu est enregistré en fonction du temps.
Généralement, on compare le signal obtenu pour la phase mobile et le soluté à celui de
la phase mobile seule.
Le détecteur le plus utilisé en CLHP est un spectrophotomètre d’absorption UV-visible (190-600 nm) relié à la sortie
de colonne.

Intégrateur
La chromatographie est une méthode de séparation utilisée en vue d’un dosage. Il faut
donc avant tout chercher à séparer correctement les pics avant de les intégrer. Une
intégration consiste à mesurer la surface sous un pic.
La détection d’un pic chromatographique par l’intégrateur, dépend de 2 paramètres :
* la largeur attendue des pics
* le seuil d’intégration (sensibilité)
La largeur de pic est à peu près prévisible en fonctions de la technique d’analyse et des
conditions opératoires. Elle détermine la fréquence d’échantillonnage du signal. Le pic
est alors découpé en tranches. Le seuil d’intégration est la valeur du signal à partir de
laquelle le calculateur repère un début de pic.
Partie pratique
Matériel et produits:
Materiel :
Injecteur manuel a boucle d’injection de 20ul
Colonne de silice gaffée dont les caractéristiques sont les suivants:
* Une longeur L=150mm
*Un diametre d=4,6mm
* Une porosité : ε=0,6
Debit =1ml\min
detecteur spectrophotometrique a lecture continue reglé a λ=254nm
-Enregistrement information et integration informatique des données

Produit chimique et reactifs:

-Methanol
-Eau distillé de qualité1
Def: eau distillé de qualité1: C'est une eau débarrassée de tout contaminant
organique ou ionique, qu'il soit dissous ou colloïdal et convenant aux applications les
plus pointues comme la chromatographie liquide.

Mode opératoire:
On assure que la quantité de solvant filtré dans les bouteilles contenats l’eau de qualité
1 et le methanol est suffisante , puis on programme l’elution isocratique en methanol et
on Met en route le pectrophotometre en ligne , en 4emme lieu on regle la longeur
d’onde et on met en route la pompe a 1ml\min, toute en attendant environ 20min pour
que la colonne s’equilibre parfaitement.
Enfin, dé que l’analyse commance on repere les position<LOAD> et <Inject> de
l’injecteur manuel
L’enregistrement se declanche a la position <inject>.
Exercice d’application :
 Conclusion

En résumé, la chromatographie liquide à haute performance (HPLC)

est une technique analytique sophistiquée qui permet la séparation,
l'identification et la quantification des composants d'un mélange.
Avec son fonctionnement à haute pression et son contrôle précis des
conditions de séparation, la CLHP est devenue un outil indispensable
dans la recherche scientifique, le contrôle qualité et diverses
industries, contribuant aux progrès dans des domaines allant du
développement pharmaceutique à la surveillance environnementale.