QCsequencing Fastq

PlateForMe
InstItut de GénétIque et de BIoloGIe MoléculaIre et cellulaIre
Control qualité des données brutes,

ne2oyage des données
Manipula7on des fichiers FASTQ

Stéphanie Le Gras
DU Dijon
PlateForMe
Objec7fs
• Comprendre ce que sont les données brutes de
séquençage haut débit (type Illumina)
• Comprendre comment elles sont obtenues
• Comprendre d’où peuvent provenir les biais du
Séquençage Haut débit (SHD)
• Apprendre à préparer les données de SHD pour
l’analyse secondaire des données
– Vérifier la qualité des données et si nécessaire les ne2oyer
(enlever ce qui pourrait bruiter le signal i.e générer la
détec7on de faux variants)
2 08/12/2014
PlateForMe
Plan
• Introduc7on
– Rappel : séquençage
– Exemple de contrôles qualités du séquençage
• Données brutes : Le format FastQ
• Qualité des données brutes
• Ne2oyage des données brutes
3 08/12/2014
PlateForMe
RAPPEL : SEQUENÇAGE
4 08/12/2014
PlateForMe
Séquençage haut débit
• 3 étapes principales
• Prépara7on des libraries
• Généra7on des clusters
• Séquençage
• Analyse primaire
5 08/12/2014
PlateForMe
Prépara7on des librairies
6 08/12/2014
PlateForMe
Généra7on des clusters
• Un cluster : ~1000 fois la même séquence d’ADN

• Nécessaire pour détecter la fluorescence pendant le séquençage
7 08/12/2014
PlateForMe
Séquençage
• Séquençage Illumina : Séquençage massivement parallèle
8 08/12/2014
PlateForMe
Analyse primaire
• Pipeline Illumina
• Analyse d’image
( extrac7on des intensités )
• Appel de base
• Iden7fica7on des nucléo7des
• Calcul d’un score de qualité
rela7f à la probabilité d’erreur
du nucléo7de (0 <= Q <= 41)
9 08/12/2014
PlateForMe
QC pendant le séquençage
• L’analyse primaire est réalisée pendant le séquençage. On peut donc suivre en temps
réel les sta7s7ques du séquençage
10 08/12/2014
PlateForMe
11 08/12/2014
PlateForMe
12 08/12/2014
PlateForMe
Les biais du séquençage Illumina
• (données du CNS)

• 98,5% de lecture alignées
• Taux d‘erreur moyen : 0,38%
• 3% dele7ons, 2% inser7ons, 95% subs7tu7ons
• Biais dans la couverture des régions riches en
AT
13 08/12/2014
PlateForMe Comment obtenir des données de SHD
• En produisant vos propres données de séquençage

– Centre Na7onal de Séquençage/Génotypage
– Plateforme technologique
– Compagnie privée
• En u7lisant des données publiques
– SRA : NCBI Sequence Read Archive
– ENA : EMBL/EBI European Nucleo7de Archive
14 08/12/2014
PlateForMe
DONNÉES BRUTES :
LE FORMAT FASTQ
15 08/12/2014
PlateForMe
Le format FastQ
• Extension *.fastq
• Fichier texte : peut être ouvert avec un simple éditeur de texte (! taille)
• Con7ent des séquences nucléo7diques + valeurs de qualité (fasta + Qualité)
• Aucune informa7on rela7ve à un génome
Iden7fiant
Séquence
Qualité
16 08/12/2014
PlateForMe
Significa7on de l’iden7fiant
• @HWI-‐ST1136:117:HS055:3:1101:1134:2244 1:N:0:GCCAAT
– HWI-‐ST1136 : Nom du séquenceur
– 117 : iden7fiant du run
– HS055 : iden7fiant de la flowcell
– 3 : numéro de ligne
– 1101 : numéro du 7le
– 1134 : coordonnée X
– 2244 : coordonnée Y
– 1 : Numéro de la paire (1 ou 2)

– N : booléen indiquant le passage du filtre qualité
• Y : La séquence est de mauvaise qualité
• N : la séquence a passé le filtre de qualité
– 0 : 0 lorsque aucun des bit contrôles n'est ac7vé, sinon c'est un nombre
– GCCAAT : Index de la librairie (en cas de mul7plexage)
17 08/12/2014
PlateForMe
Exemple de données pairées
LCD-‐01_1_ATCACG_L007_R1_045.fastq.gz LCD-‐01_1_ATCACG_L007_R2_045.fastq.gz
• Conven7on : Les lectures sens 1 et sens 2 du même cluster sont à la même ligne entre
les deux fichiers (R1 et R2)
18 08/12/2014
PlateForMe
L’encodage de la
qualité
• Score de qualité = Score Phred

• Score de qualité donné par le
séquenceur
• 1 symbole ASCII = 1 valeur de qualité
• ASCII : Norme de codage de
caractère en informa7que
• Score Phred (Sanger) : ASCII – 33
– 0 <= p <= 41
• Score Phred = -‐10 log10 p

• p : probabilité d’avoir une erreur de
séquençage
19 08/12/2014
PlateForMe
Exemple
– 1er nucléo7de : G
– Qualité associée : @
– Par7e Pra7que : Déterminez la valeur de
qualité associée
• Score Phred = 64 – 33 = 31
• -‐10 log10 p = 31
• p = 10^(-‐31/10) = 7,9x10-‐3
20 08/12/2014
PlateForMe Exemple : Graphe de qualité moyenne
p = 10-‐4
p = 10-‐3
p = 10-‐2
p = 10-‐1
Q30 = propor7on de nucléo7des ayant une qualité supérieure à 30

21 08/12/2014
A2en7on à la version de l’encodage des
PlateForMe
qualités (Illumina)
22 08/12/2014
PlateForMe
NOS DONNÉES TESTS
23 08/12/2014
PlateForMe
Syndrome Bardet-‐Biedl
• Redin et al., 2012
• Gene7que
– Autosomique recessive
– hautement hétérogène : 16 gènes BBS (274 exons, ~45kb)
– Rare ~1/100000 -‐ ~1/150000
• Phenotype
Main Features Minor features
Myopia, cataract, as7gma7sm,

Re7nal dystrophy
strabism
ReDnopathy
Polydactyly CogniDve defects Postaxial Polydactyly Syndactyly, Brachydactyly
Intellectual disability,
Hearing defects, Smell defects
Developmental delay
Renal dysfunc7on Diabetes, glucidic intolerance
Hypogonadism/
Cardiopathy, liver fibrosis
Hydrometrocolpos
Renal
Obesity anomalies Hypogonadism Hypertension Ataxias
Beales et al 1999
24 08/12/2014
PlateForMe
Ciliopathies
• Toughness of differenDal clinical diagnosDc:
very overlapping/similar phenotypes
25 08/12/2014
PlateForMe
Diagnos7c BBS
• Séquençage Sanger exhaus7f

– Couteux
– Beaucoup de gènes impliqués
• Screening des muta7on récurrentes et des gènes
fréquemment mutés (BBS1, BBS10, BBS12)
combinés à de l’alignement hétérozygote
• Screening systéma7que et automa7que de tous
les gènes BBS
– Capture + NGS
26 08/12/2014
PlateForMe
Design expérimental
• Design de la capture (à la carte): exons de 30
genes (16 gènes BBS + 14 gènes d’autres
ciliopathies)
• 52 pa7ents:
– Cohort de preuve de principe: 14 pa7ents dont les
muta7on sont connues (iden7fiées en Sanger)
– 1 cohort: 38 pa7ents avec muta7on inconnue
• Le pa7ent provient d’une autre cohorte
analysée après la valida7on de la preuve de
principe et après les bons résultats sur la
première cohorte
27 08/12/2014
PlateForMe
QUALITÉ DES DONNÉES BRUTES

28 08/12/2014
PlateForMe
Prépara7on
• Créer un répertoire pour les analyses réalisées
aujourd’hui
$ mkdir coursQC_Mapping
• Aller dans le répertoire préalablement créé

$ cd coursQC_Mapping
• Copier les données de travail dans votre répertoire
de travail
$ cp /user2/c-shd/shared/data/module_2/coursQC_Mapping/
Data/CRN-107_11-R*.fastq.gz.
• Décompresser les fichiers fastq
$ gunzip CRN-107_11-R1.fastq.gz
$ gunzip CRN-107_11-R2.fastq.gz
29 08/12/2014
PlateForMe
• Par7e pra7que n°1

– Objec7f : Nous venons de recevoir les données du
séquenceur et nous voulons savoir combien de lectures
ont été séquencées
– Fichiers :
• CRN-‐107_11-‐R1.fastq
• CRN-‐107_11-‐R2.fastq
– Ou7l à u7liser :
• Command bash : wc
– Aide :
• Il faut compter le nombre de ligne
• Combien de lignes y a-‐t’il dans un fichier fastq par lecture
séquencée?
30 08/12/2014
PlateForMe
• Solu7on : par7e pra7que 1

$ wc -l CRN-107_11-R1.fastq CRN-107_11-R2.fastq
1122032 CRN-107_11-R1.fastq
1122032 CRN-107_11-R2.fastq

– Il y a donc 1122032/4 = 280508 lectures
31 08/12/2014
PlateForMe
• Il existe plusieurs ou7ls développés pour la ges7on

des données brutes issues du séquenceur :
– Evaluer la qualité des données
– Corriger les problèmes de qualité
– Manipuler les fichiers (transforma7on de formats).
• Toujours penser à lire les spécifica7ons pour être sûr
que l’ou7l fait ce que vous souhaitez (A2en7on aux
surprises!)
32 08/12/2014
PlateForMe
Processus
Données brutes
Evalua7on de la qualité des

données brutes
Enlèvement de bases
Enlèvement des séquences

d’adaptateurs
Enlèvement des par7es de

lectures de mauvaise
qualité
33 08/12/2014
PlateForMe
34 08/12/2014
PlateForMe
Processus
Données brutes

données brutes

d’adaptateurs

qualité
35 08/12/2014
PlateForMe Evalua7on de la qualité des données brutes
• Ou7ls : FastQC, SolexaQA, Fastx-‐toolkit, NGS QC

toolkit…
• FastQC (Babraham Ins7tute)
– Import de fichiers BAM, SAM, FastQ (tous les encodages
de qualité sont supportés)
– Lancement en ligne de commande ou via une interface
– Fournit un rapport sur la qualité des données
– Permet d’évaluer les problèmes
– Rapport con7ent des tableaux et des graphes
– HTML
– Fonc7onne sur des fichiers compressés
– Es7ma7on sur un échan7llon du fichier d’entrée pour
accélérer le temps de calcul
36 08/12/2014
PlateForMe Evalua7on de la qualité des données brutes

– Objec7f : Nous venons de recevoir les données du
séquenceur et nous voulons évaluer la qualité des
données.
– Fichiers :
• CRN-‐107_11-‐R1.fastq
• CRN-‐107_11-‐R2.fastq
• FastQC
– Aide:
• On souhaite voir la qualité pour toutes les bases
• Me2re les résultats dans le répertoire fastqc
37 08/12/2014
PlateForMe

– Créer le répertoire de sor7e
$ mkdir Fastqc
– Lancer la commande fastqc sur les deux fichiers fastq

$ fastqc --nogroup CRN-107_11-R1.fastq --outdir Fastqc
$ fastqc --nogroup CRN-107_11-R2.fastq --outdir Fastqc
– Regarder les résultats

$ firefox Fastqc/CRN-107_11-R1_fastqc/fastqc_report.html
$ firefox Fastqc/CRN-107_11-R2_fastqc/fastqc_report.html

38 08/12/2014
PlateForMe

– Créer le répertoire de sor7e
$ mkdir Fastqc
– Copier les données analysées

$ cp -r /user2/c-shd/shared/data/module_2/
coursQC_Mapping/Data/Fastqc/* .
39 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
40 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
41 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
42 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
Données de bonne qualité Données de mauvaise qualité
43 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
44 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
45 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
46 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
47 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
48 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
49 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
50 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
51 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
52 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
53 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
54 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
55 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
56 08/12/2014
PlateForMe
Données
biaisées
57 08/12/2014
PlateForMe
FastQC
58 08/12/2014
PlateForMe
NETTOYAGE DES DONNÉES BRUTES
59 08/12/2014
PlateForMe
Processus
Données brutes

données brutes

d’adaptateurs

qualité
60 08/12/2014
PlateForMe
Enlèvement de la dernière base
• La taille des lectures a2endue est 2x100 et

non pas 2x101
• Lorsque l’on séquence, nous séquençons
toujours une base de plus car les bases n+1
sont u7lisées pour calculer les sta7s7ques des
bases à la posi7on n
• La dernière base doit être enlevée
61 08/12/2014
PlateForMe
FastX toolkit
• Par7e pra7que n°3a
– Objec7f : Enlever la dernière base des lectures
– Fichiers d’entrée:
• CRN-‐107_11-‐R1.fastq
• CRN-‐107_11-‐R2.fastq
– Fichiers de sor7e
• CRN-‐107_11-‐R1_shorter.fastq
• Fastx toolkit : fastx_trimmer
– Aide:
• On souhaite obtenir des lectures de taille 100
• On souhaite enlever la dernière base.
62 08/12/2014
PlateForMe
• Lancer fastx trimmer

$ fastx_trimmer -f 1 -l 100 -Q 33 -i CRN-107_11-
R1.fastq -o CRN-107_11-R1_shorter.fastq
$ fastx_trimmer -f 1 -l 100 -Q 33 -i CRN-107_11-

R2.fastq -o CRN-107_11-R2_shorter.fastq
63 08/12/2014
PlateForMe
FastX toolkit
• Par7e pra7que n°3b
– Objec7f : Vérifier que les séquences font bien 100nt à
présent
– Fichiers d’entrée:
• Bash : head
• Bash : tail
• Bash : wc
– Aide
• Il y a un caractère caché qui est comptabilisé
• Le faire également sur les fichiers non tronqués
64 08/12/2014
PlateForMe
• Compter le nombre de caractères dans le fichier

tronqué
$ head -2 CRN-107_11-R1_shorter.fastq | tail -1 | wc –c
• Compter le nombre de caractère dans le fichier non

tronqué
$ head -2 CRN-107_11-R1.fastq | tail -1 | wc –c
65 08/12/2014
PlateForMe
Processus
Données brutes

données brutes

d’adaptateurs

qualité
66 08/12/2014
PlateForMe Elimina7on des séquences contaminantes
• Quel type de contamina7on?

– Adaptateurs
– Primer de séquençage
– Autres…
• Pourquoi ces contaminants?
– Les fragments d’ADN séquencés sont plus pe7ts que
la taille des lectures
– Des dimers d’adaptateurs se sont formés lors de la
prépara7on de la librairies.
• Pourquoi les enlever?
– Ces séquences non génomiques peuvent poser un
problème lors de l’alignement.
67 08/12/2014
• A quoi dois-‐je faire a2en7on ?

– Certains ou7ls n’enlèvent la séquence d’adaptateur que si
les lectures con7ennent exactement la séquence
d’adaptateur (pas de ges7on des erreurs de séquençage).
– A2en7on aux données pairées! On ne peut pas enlever
une lecture d’un sens sans enlever la lecture de l’autre
sens. Il faut donc analyser les deux fichiers fastq en même
temps.
– Certains ou7ls ne fonc7onnent pas sur des données
pairées
• Ou7ls: ClipReads (GATK), fastx-‐toolkit, homerTools,
Trimmoma7c Cutadapt…
68 08/12/2014

– Objec7f : Nous voulons enlever les séquences
d’adaptateurs se trouvant dans les lectures
– Fichiers d’entrée :
• Séquence d’adaptateur : adapterSeq.fa
– Fichiers de sor7e :
• CRN-‐107_11-‐R1_trimmed.fastq
• Cutadapt
– La séquence d’adaptateur est: AGATCGGAAGAGC
69 08/12/2014
PlateForMe
Comprendre les adaptateurs
h2p://tucf-‐genomics.tu‚s.edu/documents/protocols/TUCF_Understanding_Illumina_TruSeq_Adapters.pdf
70 08/12/2014
PlateForMe
• Lancer une première fois cutadapt :

$ cutadapt -a AGATCGGAAGAGC --minimum-length 30 --
paired-output tmp.2.fastq -o tmp.1.fastq CRN-107_11-
R1_shorter.fastq CRN-107_11-R2_shorter.fastq
• Lancer une seconde fois cutadapt :

$ cutadapt -a AGATCGGAAGAGC --minimum-length 30 --
paired-output CRN-107_11-R1_trimmed.fastq -o
CRN-107_11-R2_trimmed.fastq tmp.2.fastq tmp.1.fastq
• Enlèvement des fichiers temporaires

$ rm tmp.2.fastq tmp.1.fastq
71 08/12/2014
PlateForMe
Cutadapt : sens 1
72 08/12/2014
PlateForMe
Cutadapt : sens 2
73 08/12/2014
PlateForMe
Processus
Données brutes

données brutes

d’adaptateurs

qualité
74 08/12/2014
Elimina7on des par7es de lectures de mauvaise
PlateForMe
qualité
• Pourquoi est ce que la fin des lectures est de moins
bonne qualité?
– Problème de chimie
• Quelle conséquence?
– Les suites de nucléo7des de mauvaise qualité à la fin des
lectures peuvent induire des variants détectés à tord lors
de la détec7on des variants.
• Comment corriger le problème?
– Enlever les nucléo7des de mauvaise qualité
– A2en7on aux données pairées!
• Ou7l : Fastqx toolkit, SolexaQA…
75 08/12/2014
Elimina7on des par7es de lectures de mauvaise
PlateForMe
qualité

– Objec7f : Eliminer les par7es de lecture de mauvaise
qualité sur les fichiers fastq générés après avoir re7rer les
séquences d’adaptateurs.
• SolexaQA : le script DynamicTrim.pl
– Paramètres :
• Seuil de qualité : Score Phred > 10
• A2en7on à l’encodage de la qualité
76 08/12/2014
PlateForMe
• Créer un répertoire de sor7e des résultats

$ mkdir SolexaQA

• Lancer l’ou7l DynamicTrim
$ DynamicTrim.pl -h 10 -d SolexaQA CRN-107_11-
R1_trimmed.fastq CRN-107_11-R2_trimmed.fastq

• Renommer les fichiers
$ mv SolexaQA/CRN-107_11-
R1_trimmed.fastq.trimmed CRN-107_R1.fastq
$ mv SolexaQA/CRN-107_11-
R2_trimmed.fastq.trimmed CRN-107_R2.fastq
77 08/12/2014
PlateForMe
SolexaQA
78 08/12/2014
PlateForMe

– Objec7f : Compressez tous les fichiers générés
• CRN-‐107_11-‐R1.fastq CRN-‐107_11-‐R2.fastq
• CRN-‐107_11-‐R1_shorter.fastq CRN-‐107_11-‐R2_shorter.fastq
• CRN-‐107_11-‐R1_trimmed.fastq CRN-‐107_11-‐R2_trimmed.fastq
• CRN-‐107_R1.fastq CRN-‐107_R2.fastq
• gzip
79 08/12/2014
PlateForMe
$ gzip CRN-107_11-R1.fastq CRN-107_11-R2.fastq
$ gzip CRN-107_11-R1_shorter.fastq CRN-107_11-

R2_shorter.fastq
$ gzip CRN-107_11-R1_trimmed.fastq CRN-107_11-

R2_trimmed.fastq
$ gzip CRN-107_R1.fastq CRN-107_R2.fastq
80 08/12/2014
PlateForMe

– Objec7f : Me2re tous les fichiers temporaires dans le
répertoire intermedFastqFiles
• CRN-‐107_11-‐R1_shorter.fastq.gz CRN-‐107_11-‐R2_shorter.fastq.gz
• CRN-‐107_11-‐R1_trimmed.fastq.gz CRN-‐107_11-‐
R2_trimmed.fastq.gz
• bash: mkdir
• bash : mv
81 08/12/2014
PlateForMe
• Crea7on du répertoire

$ mkdir intermedFastqFiles
• Déplacement des fichiers compressés

$ mv CRN-107_11-R1_shorter.fastq.gz CRN-107_11-
R2_shorter.fastq.gz intermedFastqFiles
$ mv CRN-107_11-R1_trimmed.fastq.gz CRN-107_11-
R2_trimmed.fastq.gz intermedFastqFiles
82 08/12/2014
PlateForMe

– Objec7f : Relancer FastQC sur les fichiers finaux (sens 1)
• CRN-‐107_R1.fastq.gz
• bash: fastqc
– Me2re les résultats dans le répertoire Fastqc_final

83 08/12/2014
PlateForMe
$ mkdir Fastqc_final
• Lancement de FastQC sur les données fastQ finales

$ fastqc --nogroup CRN-107_R1.fastq.gz --outdir
Fastqc_final
• Copier les résultats de FastQC

$ cp -r /user2/c-shd/shared/data/module_2/
coursQC_Mapping/Data/Fastqc_final .
84 08/12/2014
PlateForMe
FastQC (avant)
85 08/12/2014
PlateForMe
FastQC (après)
86 08/12/2014
PlateForMe
FastQC (avant)
87 08/12/2014
PlateForMe
FastQC (après)
88 08/12/2014
PlateForMe
Processus
Données brutes

données brutes

d’adaptateurs

qualité
89 08/12/2014
PlateForMe
Références
• FastQC (
h2p://www.bioinforma7cs.babraham.ac.uk/
projects/fastqc/)
• Murray P. Cox, Daniel A. Peterson, and Patrick J.
Biggs. SolexaQA: at-‐a-‐glance quality assessment
of illumina second-‐genera7on sequencing data.
BMC Bioinforma7cs , 11(1):485, September 2010.
PMID:20875133.
• Cutadapt (h2p://code.google.com/p/cutadapt/)
• Fastx-‐toolkit (
h2p://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)
90 08/12/2014
PlateForMe
Brief Bioinform (2013) doi: 10.1093/bib/

bbs086
91 08/12/2014
PlateForMe
Analyse primaire
Ligne 1, tile 1101, cycle 1
• Chaque cluster est localisé sur
la flowcell par ses coordonnées
X et Y
(X,Y)
• A chaque posi7on où un cluster
est détecté, les intensités des 4
A C G T bases sont extraites.
92 08/12/2014
Analyse primaire
PlateForMe
Ligne 1, tile 1101, cycle 1
A C G T
168.9 347.7 739.1 24966.8
• Le nucleo7de conservé sera un T

• Un score est calculée pour es7mer les chances de s’être trompé en appelant
un nucléo7de plutot qu’un autre (0 <= Score <= 41)
• Extrac7on des intensités pour chaque image de chaque ligne, 7le et chaque
cycle (1 cycle par base)
93 08/12/2014

QCsequencing Fastq

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

QCsequencing Fastq

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

PlateForMe

InstItut de GénétIque et de BIoloGIe MoléculaIre et cellulaIre

Control qualité des données brutes,

• Un cluster : ~1000 fois la même séquence d’ADN

• Séquençage Illumina : Séquençage massivement parallèle

• (données du CNS)

• En produisant vos propres données de séquençage

– 1 : Numéro de la paire (1 ou 2)

• Score de qualité = Score Phred

• Score Phred = -­‐10 log10 p

Q30 = propor7on de nucléo7des ayant une qualité supérieure à 30

NOS DONNÉES TESTS

Myopia, cataract, as7gma7sm,

Renal dysfunc7on Diabetes, glucidic intolerance

• Séquençage Sanger exhaus7f

QUALITÉ DES DONNÉES BRUTES

• Aller dans le répertoire préalablement créé

• Par7e pra7que n°1

• Solu7on : par7e pra7que 1

• Il existe plusieurs ou7ls développés pour la ges7on

Evalua7on de la qualité des

Enlèvement de bases

Enlèvement des séquences

Enlèvement des par7es de

Evalua7on de la qualité des

Enlèvement de bases

Enlèvement des séquences

Enlèvement des par7es de

• Ou7ls : FastQC, SolexaQA, Fastx-­‐toolkit, NGS QC

• Par7e pra7que n°2

• Solu7on : par7e pra7que 2

– Lancer la commande fastqc sur les deux ﬁchiers fastq

– Regarder les résultats

• Solu7on : par7e pra7que 2

– Copier les données analysées

Données de bonne qualité Données de mauvaise qualité

Données de bonne qualité Données de mauvaise qualité

Données de bonne qualité Données de mauvaise qualité

Données de bonne qualité Données de mauvaise qualité

Données de bonne qualité Données de mauvaise qualité

Données de bonne qualité Données de mauvaise qualité

NETTOYAGE DES DONNÉES BRUTES

Evalua7on de la qualité des

Enlèvement de bases

Enlèvement des séquences

Enlèvement des par7es de

• La taille des lectures a2endue est 2x100 et

• Lancer fastx trimmer

$ fastx_trimmer -f 1 -l 100 -Q 33 -i CRN-107_11-

• Compter le nombre de caractères dans le ﬁchier

• Compter le nombre de caractère dans le ﬁchier non

Evalua7on de la qualité des

Enlèvement de bases

Enlèvement des séquences

Enlèvement des par7es de

• Quel type de contamina7on?

• A quoi dois-­‐je faire a2en7on ?

• Par7e pra7que n°4

• Lancer une première fois cutadapt :

• Lancer une seconde fois cutadapt :

• Enlèvement des ﬁchiers temporaires

Evalua7on de la qualité des

Enlèvement de bases

• Score Phred = -‐10 log10 p

• Ou7ls : FastQC, SolexaQA, Fastx-‐toolkit, NGS QC

• A quoi dois-‐je faire a2en7on ?