Séance de TP n°4

Estimation de la biomasse et du substrat au cours d’une culture

microbienne
1) Objectif :
L’objectif de cette séance est de se familiariser avec quelques méthodes
d’évaluation de certains paramètres de culture, à savoir :

- L’estimation de la biomasse microbienne.

- Le dosage du substrat carboné (ici c’est le glucose)
Ces paramètres (et bien d’autres non traités ici comme par exemples le
dosage de métabolites, évaluation des activités enzymatiques…) sont
généralement effectués au cours des cultures en milieux liquides et permettent de
dresser des profiles faciles à analyser, reflètent le comportement de ces cultures
sous différentes conditions expérimentales et permettent d’en déduire les
paramètres cinétiques et les rendements.

2) Culture utilisée :
La culture utilisée au cours de ce TP est une culture de Saccharomyces
cerevisiae (Levure de boulangerie). Le choix de ce microorganisme est dû au fait
que la levure n’est pas pathogène, facile à cultiver et capable de se développer sur
des quantités importantes de substrat carboné (ici il s’agit du glucose)

a) Estimation de la biomasse microbienne :

Le paramètre biomasse représente le paramètre central au cours des cultures
dans la mesure où ce sont les cellules qui réalisent les transformations des
constituants des milieux. L’estimation de la biomasse peut se faire soit par
dénombrement sur milieu gélosé ou encore sur milieu liquide. Ces méthodes ont
l’avantage de dénombrer des cellules vivantes. Cependant, elles nécessitent des
séries de dilutions parfois lourdes de réalisation et nécessitent des incubations
entrainant des lectures post culture (les résultats ne sont pas obtenus en temps réel
pour les mono cultures en milieux liquide).

Les cultures à grande échelle nécessitent des estimations de biomasse en

temps réel, pour plusieurs raisons parmi lesquelles on peut citer à titre d’exemple
la possibilité d’intervention soit pour corriger une culture qui dérive soit pour
modifier certaines conditions physicochimiques au cours de la croissance
(transition de la phase de croissance cellulaire vers la production de métabolites
d’intérêt, changement de la nature des substrats en fonction de la quantité de
biomasse atteinte). Au cours de cette séance de TP, l’estimation de la biomasse
est réalisée par spectrophotométrie à 650 nm. Pour la levure, une relation
prédéterminée permet de relier la DO à la biomasse en g/L (Une unité de DO à
650 nm correspond à 0,7 g/L de masse cellulaire à l’état sec)

b) Mesure du pH :
Le paramètre pH sonde généralement l’activité d’une culture microbienne
et sa mesure est souvent réalisée pour cette raison. Au cours de la plupart des
cultures microbiennes sa mesure est effectuée soit périodiquement soit de façon
continue et cela même en présence de pouvoir tampon des cultures, quand c’est
le cas, ou lorsque la valeur du pH est consignée.

Actuellement les mesures sont réalisées par le biais de sondes de pH

(électrodes de verre) intégrées à des pH-mètres.

c) Dosage du substrat :

Le dosage de substrat représente le deuxième paramètre du point de vue

importance après celui de la biomasse. Il existe plusieurs méthodes de
détermination quantitatives qui sont employées et qui dépendent la nature du
substrat et de la précision recherchée. Dans ce TP le dosage du substrat est réalisé
par une méthode chimique dont le principe est basé sur la propriété réductrice du
substrat (ici le glucose).

Principe :

À chaud et en milieu alcalin, il y a réduction de l'acide 3,5-

dinitrosalycilique ou DNS (aussi appelé acide 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoïque)
par le glucose qui joue le rôle du réducteur. Cette réaction donne de l’acide 3-
amino-5-nitrosalicylique (aussi appelé acide 3-amino-2-hydroxy-5-
nitrobenzoïque :

Le glucose, quant à lui, est oxydé en divers produits d'oxydation :

Glc → produits d'oxydation + ne–

L'acide 3-amino-5-nitrosalicylique est un composé rouge. Cette réaction

n'est pas stœchiométrique : il n'y a pas de bilan d'oxydoréduction. L'intensité de
la coloration rouge est proportionnelle à la concentration de l'ose réducteur (ici le
glucose) si l'on opère dans des conditions physico-chimiques constantes.
Partie Pratique : à rendre à la fin du TP

Noms et Prénoms du groupe de travail et groupe de TP

Manipulation n° 1 :

Mesure du pH à l’aide d’un pH mètre (mesure collectif)

Cette mesure sera réalisée sur une culture qui vous sera fournie.

……………………………………………………………………………………
………………………………………………….

Manipulation n°2 :

- Sur un échantillon (Environ 6 ml) de la même culture de levure, vous

réalisez des dilutions successives comme c’est indiqué sur le tableau ci-
dessous et compléter ce tableau (la lecture de DO se fera contre l’eau
distillée)
Tubes 1 2 3 4 5 6 7

Diluant
0 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
(eau )
Culture 3 ml du 3 ml du 3 ml du 3 ml du 3 ml du 3 ml du
Suspension
mère Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Tube 5 Tube 6
de cellules
(agiter) (agiter) (agiter) (agiter) (agiter) (agiter)
de levure
Non
Dilution
diluée 1 1 1 1 1 1
2 4 8 16 32 64

DO 650nm
 - Tracer le graphe DO 650nm en fonction de la dilution

DO 650 nm

Dilutions

………2ième dilution 1ième dilution sans dilution

- Faites une brève analyse de ce graphe :……………………………………………………………..

- Conclure :………………………………………………………………………………

Analyser les deux spectres ci-dessous : (En abscisse : la longueur d’onde ; en

ordonnée l’absorbance)

Spectre d'une suspension de cellules de levure

0,42

0,4
0 100 200 300 400 500 600 700

Figure 1 : Spectre d’une suspension de cellules de levure

 Spectre d'une solution de bleu de méthylène
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 100 200 300 400 500 600 700 800

Figure 2 : Spectre d’une solution diluée de bleu de méthylène.

Analyse :…………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
………………………………………….

Manipulation n° 3: La durée de la fermentation des sucres par la levure dépasse

la durée allouée au TP. Pour cette raison, le dosage du substrat (ici le glucose) se
fera sur une solution de glucose (portant un numéro sur le flacon) qui vous sera
fournie et dont la concentration est inconnue.

A l’aide de fioles jaugées (de capacité 25 ml ; 50 ml et 100 ml), vous devez diluer
cette solution 25 ou 50 fois avec de l’eau distillée.

Exemples de dilutions : Si par exemple on a une fiole jaugée de 50 ml et on veut

diluer une solution 25 fois, il faut mettre dans la fiole 2 ml de la solution mère et
compléter au trait de jauge avec de l’eau distillée et agiter pour homogénéiser. Ce
qui donne un facteur de dilution de 25.

Si c’est une fiole de 25 ml, la prise de la solution mère sera de 1 ml et on complète

au trait de jauge et on agite.
Vous allez disposer d’un portoir par binôme contenant 4 tubes à essai et la suite
des manipulations sera effectuée selon le tableau suivant :

Tube n°1 Tube n°2 Tube n°3 Tube n°4

Eau distillée 2 ml 0 ml 0 ml 0 ml
Solution étalon 0 ml 2 ml 0 ml 0 ml
de glucose à
1 g/L
Solution diluée 0 ml 0 ml 2 ml (solution 2 ml (solution
diluée 25 fois) diluée 50 fois)
Réactif au DNS 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
DO 640nm 0

La solution étalon à 1g de glucose/L vous sera fournie

- Après addition du réactif au DNS, porter les 4 tubes à ébullition pendant 15

min. Refroidir les tubes et lire les DO à 640 nm contre le zéro optique (le
tube n°1).
- Complétez le tableau ci-dessus.

Calcul de la concentration du glucose :

Glucose en g/L = DO (échantillon) divisée par DO (sol étalon) multipliée par le

facteur de dilution

Portez ici le numéro de la solution à doser :

Donner ici la valeur de la concentration correspondante :

g de glucose/L