STAGE DE BIOLOGIE CELLULAIRE

CYTOMÉTRIE EN FLUX
L’histologie permet de distinguer des cellules selon leur taille et leur morphologie. Cependant, certaines cellules ne
sont pas distinguables par ces caractéristiques, comme certains lymphocytes.

On peut avoir des cellules identiques en tout point à l’exception d’une protéines. On utilise des anticorps pour
démontrer qu’elles ont des marqueurs différents. Ceux-ci identifieront de manière spécifiques la protéine. On couple
ces anticorps à des fluorochromes, qui peuvent être de couleurs différentes.
Le fluorochrome absorbe l’énergie d’une lumière à une longueur d’onde précise, et la réémet
par vibration/dissipation de chaleur et par émission de photons d’une longueur d’onde plus
élevée. Ceci lui permet de retourner à un état d’énergie plus stable.

Il existe différents types de marquages :

- Direct : l’anticorps est directement lié au fluorochrome (plus rapide)

- Indirect : l’anticorps utilisé pour détecter la protéine à la surface ne contient pas de
fluorochrome. Il est reconnu par un anticorps secondaire lié à un fluorochrome. Le 2ème
anticorps est dirigé vers le 1er anticorps. On peut ainsi utiliser plusieurs anticorps et
plusieurs fluorochromes : on amplifie le signal (plus
sensible).
L’anticorps peut aussi être lié à la biotine. Celle-ci sera
reconnue par la streptamidine, qui sera associée à des
fluorochromes. Le marquage est plus lent mais
beaucoup plus sensible.
CD : cluster designation number
Il y a 3 parties au cytomètre en flux :

- Fluidic : introduire et canaliser les cellules pour les emmener devant le laser
Les cellules passent devant le laser et sont excitées. Il vaut donc mieux qu’elles passent une à une afin que les signaux
ne se superposent pas. La pression doit être faible pour avoir une résolution haute.
Si toutes les cellules passent en même temps, elles sont toutes excitées en même temps et tous les signaux se
mélangent.

Le laser a un diamètre de 0,7 mm au départ ; 2 lentilles permettent de le focaliser pour obtenir un faisceau elliptique.
→ le laser ne doit pas être trop large pour ne pas englober plusieurs cellules à la fois.

Les cellules qui contiennent le fluorochrome réémettent de la lumière à une longueur d’onde supérieure à celle
d’excitation.

Une partie de l’information est donnée uniquement par la morphologie de la cellule : une partie de la lumière est
déviée mais reste à la même longueur d’onde. Il s’agit d’une diffusion axiale. Plus la cellule est grande, plus la lumière
est déviée. On parle de forward scatter (FSC).

Le side scatter (SSC) est une diffusion latérale de la lumière. Elle reflète l’intérieur de la cellule :
plus il y a d’organites, plus la diffusion latérale est grande. Le SSC prend aussi en compte la
fluorescence des cellules

On obtient un graphique SSC/FSC où chaque point représente une cellule. On peut distinguer des
populations en fonction de leur taille et de leur granulosité.
- Optic : composé de lasers et de filtres pour exciter, détecter et amplifier les différents signaux

Différentes fibres optiques permettent de dévier/laisser passer certaines longueurs d’ondes et pas d’autres, afin de
récupérer les informations.
 ▪ Short pass (ex : SP500) : filtre laissant passer toutes les longueurs d’ondes inférieures ou égales à 500 nm
▪ Band pass (ex : BP500/50) : filtre laissant passer toutes les longueurs d’ondes égales à 500 ± 25
▪ Long pass (ex : LP500) : filtre laissant passer toutes les longueurs d’ondes supérieures ou égales à 500 nm
On peut placer le filtre à 45° pour réfléchir les longueurs d’ondes qui ne peuvent pas passer à travers vers un autre
détecteur.

- Electronic : convertir les signaux optiques en des signaux électroniques, lisibles sur un ordinateur

Un photon frappe la photodiode. Un électron est relâché et amplifié entre plusieurs anodes pour amplifier le signal.
Le signal continu est transformé en unité arbitraire, binaire, qui sera analysée par l’ordinateur.

On obtient un graphique dépendant du nombre de cellules et de la fluorescence du fluorochrome.

! les spectres d’émission se recouvrent : le FITC est reconnu par son détecteur mais aussi par le détecteur du PE, ce
qui signifie que le signal mesuré ne correspond pas totalement au signal réel. On doit compenser afin de mettre les
populations au même niveau sur le dot plot. On doit pouvoir tirer une ligne horizontale entre la population marquée
et la population non-marquée.

! ceci est vrai quand les fluorochromes sont excités par les mêmes lasers. Si différents lasers excitent différents
fluorochromes, on peut différencier les longueurs d’onde.

Applications
- Immunophénotypage (= stage)
- Tri cellulaire : une seringue permet d’obtenir des gouttes de sorte que chaque goutte contienne une cellule.
Celle-ci est analysée et chargée selon son analyse. Si elle est chargée positivement, elle est envoyée vers la
borne négative et inversement. On peut ainsi séparer des populations cellulaires
- Prolifération cellulaire : on utilise un composé qui va entrer par diffusion passive dans la cellule. Au fur et à
mesure des divisions, on divise la fluorescence en 2. Chaque pic de fluorescence correspond à une division ;
chaque pic est de plus en plus bas.
- Contenu en ADN
- Mesure du calcium intracellulaire
- Détection de l’apoptose
- Détection de protéines cytoplasmiques
EXPÉRIENCES
1. Marquage cellulaire et cytométrie en flux

Isoler des splénocytes et des thymocytes dans le but d’apprendre à purifier des cellules, définir leur phénotype et
analyser des résultats en cytométrie de flux.
Compter les cellules : lame de Burker sur laquelle on met une suspension cellulaire

➔ Distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. Le bleu de trypan colore les cellules mortes en entrant
dans la cellules par des pores. On ne compte que 2 cotés du carré afin de ne pas compter des cellules 2x.

2. Culture cellulaire
But : apprendre à cultiver des cellules, définir le temps de doublement des cellules et définir une concentration
inconnue en IL-3
Baf/3 : cellules en suspension (plus grosses), lymphocytes B, prolifération IL-3 dépendante

Milieu de culture cellulaire :

- Acides aminés (essentiels ou limitants)

- Sels : osmolarité et cofacteurs
- Lipides : synthèse de nouvelles cellules
- Facteur de croissance : sérum de veau fœtal
- Vitamines : cofacteurs
- Antibiotiques et/ou antifongiques
- Indicateur pH (= rouge phénol) : permet de vérifier que le pH reste entre 7 et 7,4, tend vers le jaune quand le
milieu s’acidifie (ex : production de lactate)
- Bicarbonate de sodium : tampon → l’incubateur injecte du CO2 (5%) dans l’air afin que l’équation puisse rester
constante
𝐻2 𝑂 + 𝐶𝑂2 → 𝐻2 𝐶𝑂3 → 𝐻𝐶𝑂3− + 𝐻 +
- Glucose : source d’énergie et de carbone

! maintenir la stérilité : hotte à flux laminaire, matériel, milieu de culture, boites stériles

Dot plot
GR : plus petits, normalement peu granuleux mais paraissent plus granuleux à cause de leur forme biconcave

Thymus : population positive au CD4 et au CD8

➔ Perte de l’un des marqueurs au cours de la maturation cellulaire et migration vers les organes lymphoïdes
secondaires. Le thymus est le seul des 3 échantillons (thymus, rate lysée, rate non-lysée) à avoir des cellules
doublement marquées.

Rate lysée : moins de cellules doublement négatives, plus de cellules marquées CD4 ou CD8

➔ Les globules rouges ont été lysés par le tampon de lyse : il y a le même nombre de cellules mais les proportions
entre les différents marquages sont différentes

Concentration en IL-3 La couleur des solutions dans les puits n’est pas la même partout : les puits les plus
Sur la plaque : concentrés en IL-3 sont plus jaunes, donc plus acides, il y a donc plus de lactate, et
- [ ] connue en IL-3 donc plus de cellules.
- [ ] inconnue en IL-3 ➔ L’IL-3 inconnue est moins concentrée que l’IL-3 connue parce que les
- [0] en IL-3 solutions sont plus rouges, donc moins acides.
On utilise l’hexose aminidase pour mesurer l’absorbance : plus il y a de cellules, plus l’enzyme est présente, plus
l’absorbance est élevée.
 (𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒𝑚𝑎𝑥 −𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒𝑚𝑖𝑛 ) (1,338−0,227)
[IL-3] connue : ½ ABS = + 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒𝑚𝑖𝑛 = + 0,227 = 0,783
2 2

 Si 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 = 0,783, [𝐼𝐿 − 3] = 0,047 𝑛𝑔/𝑚𝐿

(𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒𝑚𝑎𝑥 −𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒𝑚𝑖𝑛 ) (1,370−0,136)

[IL-3] inconnue : ½ ABS = 2
+ 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒𝑚𝑖𝑛 = 2
+ 0,136 = 0,753

 Si 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 = 0,753, 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑒𝑢𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 = 102

[𝐼𝐿 − 3]𝑖𝑛𝑐𝑜𝑛𝑛𝑢𝑒 = [𝐼𝐿 − 3]𝑐𝑜𝑛𝑛𝑢𝑒 ⋅ 𝐹𝐷 = 0,047 ⋅ 102 = 4,79 𝑛𝑔/𝑚𝐿

Temps de doublement
141
𝑁𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑢𝑙𝑒𝑠 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑡é𝑒𝑠 ⋅10000 ⋅ 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 ⋅ 10000 ⋅ 2
Concentration initiale : 𝐷𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙𝑒
= 3
100
= 9, 4.103 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑢𝑙𝑒𝑠/𝑚𝐿
𝑁𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑢𝑙𝑒𝑠 ⋅10000 ⋅ 2 64
Concentration finale : 𝐷𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙𝑒
= 3
⋅ 10000 ⋅ 2 = 4, 27.105 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑢𝑙𝑒𝑠/𝑚𝐿

𝐶𝑖
2𝑛 = = 45,43 ↔ n = 5,50 divisions
𝐶𝑓
72 ℎ𝑒𝑢𝑟𝑒𝑠
𝑇𝑒𝑚𝑝𝑠 𝑑𝑒 𝑑𝑜𝑢𝑏𝑙𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡 = = 13 ℎ/𝑑𝑖𝑣𝑖𝑠𝑖𝑜𝑛
5,50 division