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RANGER Hélène Compte rendu de TP de biologie cellulaire n°3

DUMARGNE Emilien Du 01/10/09

La réaction de Hill
1. Introduction
Le TP n°3 fait le 1er octobre a pour but l'étude des chloroplastes présents dans une feuille d'épinard
en plusieurs parties :
● De mettre en évidence les chloroplastes sur Malassez
● De les doser grâce au spectrophotomètre de 2 manières :
• Grâce à l'acétone
• Grâce à la réaction de Hill
L'intérêt de ces différentes expérimentations est de prouver l'effet de la lumière sur les chloroplastes
de plante verte.
Nous savons que les chloroplastes sont nombreux chez les plantes vertes (tel ici l'épinard) et qu'une
réaction chimique a lieu pour que les chloroplastes produisent de l'ADP grâce à la lumière, mais
quelles sont les longueurs d'ondes où l'absorbance de la chlorophyle A est forte et a quelle
concentration faut il qu'elle soit pour remplir son rôle.

2. Isolement, observation et comptage au microscope photonique des chloroplastes

Matériel et méthode
Une masse de 11,9 g de feuille d'épinard pur a été pesé sur une balance puis à l'aide des ciseaux
nous avons coupé ces feuilles qui ont maintenant sur balance de précision une masse de 2,22g. Nous
rajoutons par la suite la solution de tampon de broyage (35ml) en même temps que d'écraser à l'aide
d'un mortier les feuilles.
A l'aide d'une gaze le broya est filtré et mis dans un tube de 50 ml. Nous rajoutons un peu de
solution de broyage à la pipette pasteur pour égaliser avec l'autre groupe en face de nous pour avoir
un volume de 15,4 ml et on met le tube de solution mère à la centrifugeuse pendant 5 min à
2500Xg, à 4°C
Nous séparons le surnageant, puis nous ajoutons 8 ml de solution de lavage et enfin nous le plaçons
dans un autre tube de 50 ml.
Nous séparons ensuite le culot vert du fond amylacé et nous le laissons dans un petit tube en
plastique de 1,5 ml

Résultats
Nous observons par la suite une goutte de solution mère au microscope photonique pour compter le
nombre de chloroplastes cassés sur 30 chloroplastes vus, comme le montre le tableau ci dessous :

Tableau des résultats du dénombrement des cellules cassées sur une goutte de suspension mère
observée au microscope photonique
Nombre de cellules observées Nombre de cellules cassées Pourcentage de cellules cassées
30 9 30% (car 30x0,3=9)

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Nous dénombrons sur Malassez les chloroplastes et nous les comptons pour avoir la teneur en
chlorplastes/ml de la suspension mère.

Tableau de résultat du comptage du nombre de chloroplastes sur Malassez


Carreaux/Ligne 1 2 3 4 Total
s
1er carreau 47 41 53 60 201
eme
2 carreau 41 53 57 49 200
eme
3 carreau 60 63 57 63 223
eme
4 carreau 48 56 63 68 225

Calculs
Total sur les 4 cellules 849
Total sur Malassez 21225 (849x25)

3. Dosage des chlorophylles

Matériel et Méthode :
Nous avons prélevé sous la hotte grâce à une pipette graduée 800µL d’acétone et 200µL de tampon
et un autre avec 800µL de cétone et 200µL de suspension-mère de chloroplastes. Il a fallu 10sec au
vortex puis centrifuger pendant 5min à 14000 tours/min. Nous avons transféré le surnageant dans
une cuvette de spectro et nous avons pris les mesures d’absorbance à 647, 652,663nm.

Résultats :

ABS647 : 0,694
ABS652 : 0,903
ABS663 : 1,402

Formule de Bruinsma :
[Chlorophylle A] = 0,903/36 = 0,025 g/L= 25µg.L-1

Formule d'Arnon :
[Chlorophylle A] = 20,2x1,402-8,02x0,694 = 25,26 µg.L-1

Moyenne : (25+25,26)/2 = 25,17 µg.0,1mL-1


= 252 µg/mL
Donc on doit diluer par 4 la suspension mère pour la réaction de Hill car : 252/4 = 63 µg/mL de
chloroplastes total (proche de 60 µg/mL).

Teneur moyenne : 60/25,17 = 2,38 Chlorophylle A totale/ml

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4. Réaction de Hill

Matériel et Méthode :
Nous avons préparé 3 cuvette plastique :
➢ le témoin (fait le 0, il n'y a pas de réaction avec les
chloroplastes car il n'y en a pas, elle est composée en plus
de 1,75 ml de solution de lavage et de 0,25 de DCPIP)
➢ l'obscurité (le tube possède 0,25 ml de chloroplastes et a
été placé constamment dans l'obscurité pendant la réaction
de Hill et les mesures au spectrophotomètre, elle est
composée en plus de 1,50 ml de solution de lavage et de
0,25 de DCPIP )

➢ la lumière (le tube possède 0,25 ml de chloroplastes et a


été placé constamment sous une lampe allumée pendant la
réaction de Hill et les mesures au spectrophotomètre, elle
est composée en plus de 1,50 ml de solution de lavage et
de 0,25 de DCPIP )

Résultats :

temps T
0m 1,325
1m30 1,319
3m 1,314
4m30 1,322
6m 1,330
7m30 1,326

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9m 1,322
10m30 1,326
12m 1,312
13m30 1,323

temps L
30s 1,747
2m 1,53
3m30 1,267
5m 0,997
6m30 0,736
8m 0,674
9m30 0,664
11m 0,662
12m30 0,66
14m 0,657

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temps O
1m 1,736
2m30 1,751
4m 1,738
5m30 1,730
7m 1,728
8m30 1,717
10m 1,700
11m30 1,680
13m 1,684
14m30 1,681

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> La courbe L : l'absorbance diminue au cours du temps donc il y a réaction, la DCPIP est réduite
(nous observons une descente en escalier que nous expliquons par le temps d’attente entre chaque
mesure).
> La courbe T : c'est le témoin donc l'absorbance varie peu
> La courbe O : l'absorbance varie peu, donc il n'y a pas de réaction
Il n'y a que dans le tube L que la réaction a lieu, ce qui prouve qu'il faut de la lumière pour que la
réaction débute.

Calculs:
> Q = [2x(|0,736-1,747|)-(|1,680-1,728|)]/[1,26.107x1]
= 8,48.10-8

> ϕ = (22,4.103x8,48.10-8)/(2x(14,5-0,5))
=6,784.10-5 ml/min de dioxygène
Il y a 2 au dénominateur car on doit calculer le débit de dioxygène (O 2) et non d'oxygène donc on
doit diviser par 2.

> ϕ /m = 6,784.105x60(15,4/2)/2,22
=0,014 h/g de O2

5. Conclusion :
Grâce à la réaction de Hill nous avons mis en évidence que le couplage des électrons dans
les chloroplastes est possible seulement si il y a de la lumière (capture de photon), car l'absorbance
du tube à la lumière diminue, la solution est de moins en moins bleue. Le DCPIP prouve cela, car
une partie de celui-ci est réduite (devient incolore) lors de la réaction de Hill et car il y a
dégagement de O2. La capture des électrons par NADP+ provoque la phosphorylation de l'ADP en
ATP.

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