Méthodes de Détection Et de Dénombrement de Legionella Dans L - Eau

Mthodes
de dtection
et de dnombrement
de Legionella
dans leau
Avis de lAnses
Rapport dexpertise collective
Avril 2011
dition scientifique
Mthodes
de dtection
et de dnombrement
de Legionella
dans leau
Caractristiques dtailles
et pertinence de leur mise
en uvre dans les eaux chaudes
sanitaires et les tours
arorfrigrantes
Avis de lAnses
Rapport dexpertise collective
Avril 2011
dition scientifique
Anses Saisine 2009-SA-330
Maisons-Alfort, le 7 avril 2011,

Le directeur gnral
AVIS
de lAgence nationale de scurit sanitaire de lalimentation,

de lenvironnement et du travail
relatif la saisine Mthodes de dtection et de dnombrement de Legionella dans
leau
LAnses a pour mission de contribuer assurer la scurit sanitaire dans les domaines de
lalimentation, de lenvironnement et du travail et dvaluer les risques sanitaires quils
peuvent comporter.
Elle fournit aux autorits comptentes toutes les informations sur ces risques ainsi que
lexpertise et lappui technique ncessaires llaboration des dispositions lgislatives et
rglementaires et la mise en uvre des mesures de gestion du risque (article L.1313-1
du Code de la sant publique).
1. PRESENTATION DE LA QUESTION POSEE

LAgence franaise de scurit sanitaire de lenvironnement et du travail (Afsset)1 a t
saisie le 29 juillet 2009 par la Direction gnrale de la sant (DGS) et la Direction gnrale
de la prvention des risques (DGPR) afin de :
1. Dcrire les mthodes pr-analytiques (prparation de lchantillon avant analyse) et
analytiques connues pour la dtection et le dnombrement spcifique de lgionelles dans
leau (culture, biologie molculaire (Polymerase Chain Reaction : PCR), immuno-dtection,
etc.). Cette description avait notamment pour finalit didentifier les questions auxquelles
rpondent les mthodes et leurs limites thoriques. Elle devait tre base sur une
recherche bibliographique ;
2. Etudier la pertinence (avantages et inconvnients) de la mise en uvre de ces
mthodes analytiques pour le contrle sanitaire des eaux chaudes et le contrle
rglementaire des eaux de circuits de refroidissement des tours arorfrigrantes, en
fonction de leurs besoins et contraintes respectives :
$ dans un premier temps, cette tude devait viser analyser les avantages et
inconvnients des diffrentes mthodes, notamment sur les questions des
contraintes de faisabilit technique et des cots ;
$ dans un second temps, si des mthodes apportant une plus-value technique par
rapport la mthode par culture taient mises en vidence, la pertinence de leur
mise en uvre dans le cadre des contrles rglementaires devait tre value.
Sagissant des mthodes identifies, une rflexion pouvait notamment tre mene
concernant les seuils rglementaires et, le cas chant, leur rvision.
3. Si ncessaire, identifier les essais exprimentaux permettant de vrifier ou dinfirmer les
hypothses avances concernant la pertinence des mthodes recenses, et le cas chant
le lancement des tudes ncessaires.
1
LAfsset et lAgence franaise de scurit sanitaire des aliments (Afssa) ont fusionn pour donner naissance lAgence
nationale de scurit sanitaire (Anses), le 1er juillet 2010.
Agence nationale de scurit sanitaire de lalimentation, de lenvironnement et du travail,
27-31 av. du Gnral Leclerc, 94701 Maisons-Alfort Cedex - Tlphone : + 33 (0)1 49 77 13 50 - Tlcopie : + 33 (0)1 46 77 26 26 - www.anses.fr
1 / 12
2. CONTEXTE
Lincidence de la lgionellose a diminu en France depuis 2006 pour se stabiliser aux
alentours de 1200 cas dclars par an (1206 cas enregistrs en 2009, BEH n31-32 du 27
juillet 2010), grce notamment une meilleure identification des sources potentielles de
contamination.
La surveillance environnementale de Legionella spp. ou de Legionella pneumophila est
encadre par la rglementation :
$ elle est obligatoire :
o dans les eaux minrales destines des usages thrapeutiques dans les
tablissements thermaux, une fois par mois aux points dusage les plus sensibles
(arrt 19 juin 2000) 1 ;
o dans les tours arorfrigrantes, une fois par mois (en cas dautorisation) ou tous
les deux mois (en cas de dclaration) pendant la priode de fonctionnement de
linstallation (arrts du 13 dcembre 2004) 2 ;
o dans les rseaux deau chaude sanitaire des tablissements de sant, les
tablissements sociaux et mdico-sociaux dhbergement pour personnes ges,
les autres tablissements sociaux et mdico-sociaux, les htels, les rsidences
de tourisme, les campings et les tablissements, pnitentiaires une fois par an
aux points dusage reprsentatifs (arrt du 1er fvrier 2010) 3 ;
$ compter du 1er janvier 2012, larrt du 1er fvrier 2010 la rend obligatoire dans les
autres tablissements recevant du public, une fois par an, aux points dusage
reprsentatifs des rseaux deau chaude sanitaire.
Cette rglementation impose lutilisation de la mthode par culture, telle que dcrite dans
la norme NF T90-431 "Recherche et dnombrement de Legionella spp. et de Legionella
pneumophila par culture sur milieux gloss".
La DGS et la DGPR soulignent dans la lettre de saisine que la mthode par culture, telle
que dcrite dans la norme NF T90-431, prsente certains inconvnients :
$ le rendu des rsultats dfinitifs ncessite un dlai minimum de 8 jours aprs la mise
en culture (des rsultats intermdiaires pouvant cependant tre rendus au bout de 3
5 jours). Ce dlai peut poser des problmes pour la gestion des installations
concernes, notamment pour lever des mesures restrictives dutilisation deau ;
$ lensemble des diffrentes formes de Legionella potentiellement prsentes dans leau
nest pas pris en compte par cette mthode. En effet elle ne permet de dnombrer que
les Legionella libres, viables et cultivables, dans les chantillons deau.
3. ORGANISATION DE LEXPERTISE
Lexpertise a t ralise dans le respect de la norme NF X 50-110 Qualit en expertise
Prescriptions gnrales de comptence pour une expertise (Mai 2003) avec pour
objectif de respecter les points suivants : comptence, indpendance, transparence,
traabilit.
1
2
Arrt du 19 juin 2000 modifiant l'arrt du 14 octobre 1937 modifi relatif au contrle des sources d'eaux minrales
Arrt du 13 dcembre 2004 relatif aux prescriptions gnrales applicables aux installations classes pour la protection de
l'environnement soumises dclaration sous la rubrique n 2921 Installations de refroidissement par dispersion d'eau dans
un flux d'air
Arrt du 13 dcembre 2004 relatif aux installations de refroidissement par dispersion d'eau dans un flux d'air soumises
autorisation au titre de la rubrique n 2921
3
Arrt du 1er fvrier 2010 relatif la surveillance des lgionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution d'eau chaude sanitaire
2 / 12
Ces problmatiques relvent des comptences du comit dexperts spcialises (CES)

valuation des risques lis aux eaux et aux agents biologiques . LAnses a confi
lexpertise au groupe de travail Mthodes de dtection et de dnombrement de
Legionella dans leau . Les travaux ont t soumis rgulirement au CES tant sur les
aspects mthodologiques que scientifiques. Ce dernier en a adopt les conclusions le 25
fvrier 2011.
Cette expertise est ainsi issue dun collectif dexperts aux comptences complmentaires.
Le prsent avis se fonde pour les aspects scientifiques sur le rapport final issu de cette
expertise collective (Mthodes de dtection et de dnombrement de Legionella dans leau
- Caractristiques dtailles et pertinence de leur mise en uvre dans les eaux chaudes
sanitaires et les tours arorfrigrantes).
4. ARGUMENTAIRE
Afin de rpondre la saisine, lexpertise a pris en compte les lments suivants.
4.1. Les espces de Legionella responsables de lgionelloses
A ce jour 58 espces de bactries du genre Legionella ont t identifies. Ces espces
sont sub-divises en srogroupes (environ 70 srogroupes actuellement connus). En
France, Legionella pneumophila est responsable de 98 % des cas dclars de
lgionellose qui ont fait lobjet dune identification aprs un prlvement pulmonaire 4.
Des espces autres que Legionella pneumophila peuvent cependant tre lorigine de
lgionelloses, en particulier chez les sujets dont limmunit est compromise (patients
haut risque 5). Les souches responsables de certains de ces cas ont pu tre retrouves
dans des circuits deau chaude sanitaire utiliss par, ou proximit du malade.
En revanche, la bibliographie ne met pas en vidence de cas de lgionellose li une
espce autre que Legionella pneumophila qui soit imputable une tour arorfrigrante.
Par ailleurs, les donnes franaises ne mettent pas en vidence de cas de lgionellose
dclare, imputable une Legionella dune autre espce que pneumophila et qui aurait
pour origine la contamination dune tour arorfrigrante.
Nanmoins, il faut souligner la difficult que prsente lidentification de lorigine
environnementale des cas de lgionellose. En France, o le systme de surveillance des
lgionelloses est trs dvelopp, cette origine reste cependant non identifie dans 80%
des cas.
Quoi quil en soit, dun point de vue sanitaire, Legionella pneumophila apparat comme
lespce la plus pertinente dnombrer aussi bien dans les circuits deau chaude sanitaire
que dans les tours arorfrigrantes.
4.2. Les bases sanitaires et techniques du choix des espces de Legionella
dnombrer dans le cadre de la surveillance rglementaire
Les diffrents textes rglementaires qui encadrent la surveillance environnementale des
Legionella rendent obligatoire le dnombrement de Legionella pneumophila, lespce la
plus pertinente dun point de vue sanitaire, lexception des deux arrts du 13 dcembre
2004 relatifs aux installations de refroidissement par dispersion deau dans un flux dair
4
5
Prlvement des scrtions respiratoires.
Circulaire DGS 2002 243, du 22 avril 2002 : les patients dits patients haut risque sont les immunodprims svres,
et particulirement les immunodprims aprs transplantation ou greffe d'organe et les immunodprims par corticothrapie
prolonge (0,5 mg/kg de prednisone pendant 30 jours ou plus, ou quivalent) ou rcente et haute dose (c'est--dire
suprieure 5 mg/kg de prednisone pendant plus de 5 jours)
3 / 12
soumises autorisation et dclaration, communment appeles tours arorfrigrantes.

Ces deux arrts rendent obligatoire le dnombrement de Legionella spp., alors que ce
choix nest pas tay dun point de vue sanitaire.
Dun point de vue technique, le dnombrement de Legionella spp. peut nanmoins avoir
une utilit pour les gestionnaires dinstallations, notamment pour dtecter des
dysfonctionnements. Toutefois, cette question na pas fait lobjet dune rflexion
approfondie dans le cadre de la prsente expertise.
4.3. Critres prendre en compte pour valuer une mthode de dnombrement de
Legionella
La performance attendue dune mthode de dnombrement de micro-organismes en
routine est value sur la base des critres communment admis suivants : slectivit,
spcificit, sensibilit, rptabilit, reproductibilit, justesse, fidlit, rendement. Dans le
contexte particulier des eaux chaudes sanitaires et des tours arorfrigrantes, des
critres supplmentaires devront tre pris en compte. Ces critres ont t rpertoris et
hirarchiss. Ils concernent :
$ le dnombrement spcifique des Legionella (Legionella spp., Legionella pneumophila,
Legionella pneumophila du srogroupe 1, autres srogroupes, etc.) ;
$ ltat physiologique des Legionella dtectes ;
$ linterprtation des rsultats ;
$ les champs dapplication des mthodes (types deau, etc.).
La liste dtaille et la hirarchisation de ces critres sont prsentes dans le rapport
dexpertise et la note de synthse associs cet avis.
Le critre de cot est important prendre en compte dans le choix dune mthode
analytique. Cependant, dans le cas prsent, il doit tre considr comme moins prioritaire
que la pertinence dune mthode de dnombrement des lgionelles dans leau pour
assurer une surveillance sanitaire efficace des eaux chaudes sanitaires et des tours
arorfrigrantes. Les cots des mthodes plus particulirement investigues sont
aujourdhui du mme ordre de grandeur mais sont par ailleurs susceptibles dvoluer en
fonction des dveloppements venir. Ce critre conomique na donc pas t pris en
compte dans le cadre de cette expertise et il pourra tre valu une fois lefficacit des
techniques bien documente : caractristiques intrinsques et capacit rpondre aux
besoins des utilisateurs en routine.
4.4. Les mthodes values
Lanalyse des avantages et inconvnients propres chaque mthode a t ralise au
regard des critres voqus dans le chapitre 4.3. Elle a t applique :
$ aux tapes de prtraitement ncessaires : filtration, centrifugation, sparation
immuno-magntique.
$ aux mthodes de dnombrement spcifiques de Legionella bases sur un principe
unique :
o croissance : culture, Direct Viable Count (DVC), etc. ;
o amplification gnique : PCR quantitative en temps rel (q-PCR), PCR Viable (vPCR), etc. ;
o affinit molculaire (immuno-dtection, hybridation in situ par molcules
fluorescentes (FISH), etc. ;
$ aux mthodes de dnombrement spcifiques de Legionella bases sur plusieurs
principes : Immunological double-staining (IDS), culture-FISH, et dautres volutions
possibles (DVC-FISH, Desorption-ionisation laser assiste par matrice (MALDI-TOF),
Chromatographie liquide haute pression en condition dnaturante (dHPLC) couple
la PCR, Sparation immuno-magntique (IMS) - ATP-mtrie) ;
4 / 12
aux techniques danalyses complmentaires : analyse de la flore totale (culture, ATPmtrie), dtection des amibes, analyse du biofilm, des arosols.
Le dtail de la description des mthodes figure dans le rapport dexpertise. De lanalyse

des avantages et des inconvnients propres chaque mthode, il ressort que les
mthodes qui rassemblent le plus grand nombre davantages sont : la culture, la q-PCR et,
pour autant quon puisse la juger compte tenu du peu dexemples dutilisation publis, la vPCR. Cependant ce criblage trs factuel ne prend pas en compte les niveaux de
dveloppement respectifs, parfois trs diffrents, de chacune des mthodes et leur
adquation une application en routine.
4.5. Les mthodes pertinentes pour une utilisation en routine court terme
Le choix dune mthode de dnombrement ne peut se fonder seulement sur ses
avantages et ses inconvnients intrinsques. En effet, certains avantages identifis
lchelon exprimental peuvent tre pris en dfaut lorsque la mthode est confronte aux
ralits du terrain. Aussi, il apparat important de prendre en compte le niveau de
dveloppement de la mthode : standardisation du protocole, confirmation de ses
performances par diffrents laboratoires, application possible diffrents types
dchantillons environnementaux, robustesse, existence de standards et dtalons, etc.
Pour une application en routine dans le cadre de la surveillance rglementaire, il importe
de disposer dune mthode prouve, dont le protocole est valid par de nombreux
laboratoires et sur un grand nombre dchantillons. Actuellement, seules les mthodes de
dnombrement des Legionella dans leau par culture (normes NF T90-431 et NF EN ISO
11731-2 6) et par q-PCR (norme NF T90-471) offrent ces garanties, ces deux normes
intgrant le prtraitement des chantillons. Les recommandations en vue dune mise en
uvre court terme dans un cadre rglementaire ne peuvent donc raisonnablement
porter que sur la culture et la q-PCR.
Dautres mthodes semblent prometteuses mais elles demandent tre dveloppes,
stabilises et testes grande chelle, avant denvisager leur application en routine.
4.6. Choix des critres dinterprtation des rsultats selon les mthodes
Lutilisation dune mthode analytique va de pair avec la dfinition de critres
dinterprtation de ses rsultats. Aussi, avant denvisager lutilisation dune mthode de
dnombrement de Legionella, dans le cadre de la surveillance sanitaire des eaux chaudes
sanitaires et des tours arorfrigrantes, il apparat ncessaire de fixer des valeurs cibles
au-del desquelles des actions de gestion pourraient tre envisages.
A lheure actuelle, ces valeurs cibles ne peuvent pas tre bases sur les seules donnes
pidmiologiques du fait :
$ du peu de publications disponibles sur le sujet et des fortes incertitudes quelles
mettent en vidence ;
$ de la difficult didentification de lorigine environnementale des cas de lgionellose
(possible dans 20% des cas dclars) ;
$ du grand nombre de facteurs autres que la concentration en Legionella pneumophila
dans leau des installations intervenant dans la survenue des lgionelloses
(mtorologie, taille des gouttelettes produites par les installations, tat de viabilit et
de virulence des souches de Legionella prsentes dans leau, etc.).
Aussi, la dtermination des valeurs cibles doit se fonder sur une approche pragmatique,
en exploitant les lments disponibles.
Etant donn le peu dexemples dapplication de la norme NF EN ISO 11731-2 en France, les prsentes recommandations
sont essentiellement bases sur la norme NF T90-431.
5 / 12
4.6.1.Valeurs cibles pour la mthode par culture
En 2001, le Conseil suprieur dhygine publique de France (CSHPF) a propos des

valeurs cibles, sur la base des connaissances scientifiques et des observations de terrain
disponibles la date de cette proposition. Les valeurs cibles proposes ntaient pas
fondes sur une dose-rponse 7 chez lhomme.
Ces valeurs cibles ont t reprises dans la rglementation franaise.
$
Dans le cas des eaux chaudes sanitaires
Pour la population gnrale, la rglementation franaise en vigueur, fixe la valeur cible en

L. pneumophila 103 UFC/L.
Pour les patients haut risque (immunodprims), la rglementation prconise de ne pas
dpasser le seuil de dtection de la mthode par culture (selon la norme NF T90-431).
Selon les donnes de la littrature, la concentration en L. pneumophila en dessous de
laquelle le risque de lgionellose est ngligeable ou acceptable pour la population
gnrale est comprise entre 104 ou 105 UFC/L dans les eaux chaudes sanitaires, malgr
labsence de dose-rponse connue chez lhomme.
Lexamen de la bibliographie et les auditions dacteurs du systme de surveillance des
Legionella dans les eaux chaudes sanitaires nont pas mis en vidence dargument
justifiant, dun point de vue sanitaire, une modification de ces valeurs cibles.
$
Dans le cas des tours arorfrigrantes
La rglementation franaise en vigueur, concernant les tours arorfrigrantes, fixe des

valeurs cibles en Legionella spp. :
- seuil dacceptabilit de leau dappoint : limite de quantification de la mthode
normalise utilise ;
- seuil daction pour leau de linstallation : 103 UFC/L ;
- seuil darrt pour leau de linstallation : 105 UFC/L.
La littrature et les auditions dacteurs du systme de surveillance des tours
arorfrigrantes mettent en vidence une difficult dinterprtation des rsultats lie au
choix de la cible du dnombrement. En effet, lespce responsable de la plupart des cas
de lgionelloses dclars tant Legionella pneumophila, il est difficile dinterprter un
dpassement de seuil en Legionella. spp. dun point de vue sanitaire. Ces valeurs doivent
avant tout tre considres comme des valeurs de gestion.
4.6.2.Valeurs cibles pour la mthode par q-PCR
Le niveau de connaissance actuel ne permet pas dtablir une valeur cible de L.

pneumophila la q-PCR (en UG/L) sur les bases dune dose rponse chez lhomme.
Cependant, les bnfices sanitaires potentiels de lutilisation de la q-PCR, du simple fait
de la rapidit de sa mise en uvre et de lobtention de rsultats spcifiques de L.
pneumophila, incitent mettre en place les outils permettant lutilisation de cette technique
en routine. En effet, dans de nombreux cas, elle permettrait de dtecter et donc de grer la
contamination dune installation beaucoup plus rapidement que la mthode par culture.
Dans ce contexte, ltablissement de valeurs cibles est primordial.
Les seuls rfrentiels actuels sont les valeurs cibles dj prsentes dans la rglementation
pour la mthode par culture. Les retours dexprience lis leur utilisation pour la
surveillance des lgionelles dans leau ne mettent pas en vidence la ncessit de les
modifier. Il apparat donc raisonnable de dfinir les valeurs cibles applicables la q-PCR
7
Relation spcifique dune voie entre des niveaux dexposition un agent dangereux et lindice observ dun
effet donn.
6 / 12
de manire ce que le taux de rsultats suprieurs ces valeurs cibles, obtenues avec
une mme srie de prlvement, soit quivalent pour la culture et pour la q-PCR.
Cependant les units des diffrentes mthodes de dnombrement de Legionella
apparaissent htrognes et difficilement comparables : units gnomes/L (UG/L) pour les
mthodes par biologie molculaire et units formant colonies/L (UFC/L) pour les mthodes
par culture. En labsence de donnes publies, les valeurs proposes sont principalement
bases sur les rsultats de la surveillance des lgionelles dans lenvironnement, prsents
par deux acteurs auditionns.
$
Sur la base de ce raisonnement des valeurs cibles peuvent tre labores pour les points
dusage risque 8 dans les tablissements recevant du public, lexclusion de ceux utiliss
par des patients haut risque.
En ce qui concerne les points dusage risque utiliss par des patients haut risque dans
les tablissements de sant, pour assurer une protection sanitaire maximale, il semble
raisonnable de proposer des valeurs cibles gales au seuil de dtection de la mthode.
$
Ltablissement de valeurs cibles en Legionella. spp., adaptes la q-PCR, pourrait tre

envisag sur la base du raisonnement dvelopp ci-dessus.
Cependant, certains essais montrent une bien meilleure concordance relative entre les
rsultats obtenus par culture et par q-PCR pour le dnombrement de L. pneumophila que
pour celui de Legionella. spp. Dun point de vue analytique, il semble donc plus adapt de
dterminer une valeur cible en L. pneumophila pour la q-PCR.
Dun point de sanitaire, ltablissement de valeurs cibles en L. pneumophila apparat
galement plus pertinent.
Les valeurs rglementaires actuelles en Legionella. spp. pourraient tre considres plus
protectrices dun point de vue sanitaire que les mmes valeurs appliques L.
pneumophila, dans la mesure o ces dernires font partie des Legionella spp. On
rappellera nanmoins que :
- ce jour, aucune autre espce que L. pneumophila na pu tre identifie chez un
patient atteint de lgionellose, dont lorigine de la contamination ait t attribue
une tour arorfrigrante ;
- la proportion de L. pneumophila parmi les Legionella spp. varie fortement dans le
temps et il nexiste pas doutil fiable permettant de la prvoir.
Aussi, il parat fond de proposer aujourdhui des valeurs cibles en L. pneumophila, pour la
surveillance sanitaire des tours arorfrigrantes, aussi bien pour la mthode par culture
que pour la mthode par q-PCR.
Ce dispositif prsente trois avantages importants :
- dun point de vue sanitaire :
o faciliter linterprtation des rsultats de surveillance ;
o ouvrir la possibilit dutiliser la q-PCR pour la surveillance des tours
arorfrigrantes, pour bnficier de la grande ractivit de cette technique,
avec la possibilit de dtecter une contamination beaucoup plus rapidement
que ce nest le cas actuellement ;
8
Larrt du 1er fvrier 2010 relatif la surveillance des lgionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution deau chaude sanitaire, dfinit point dusage risque comme tout point dusage accessible au public et
pouvant produire des arosols deau chaude sanitaire susceptible dtre contamine par les lgionelles ; il sagit notamment
des douches, des douchettes, des bains remous ou jets.
7 / 12
du point de vue de la gestion des installations : le choix de dnombrer L.

pneumophila dans les tours arorfrigrantes la place de Legionella spp.
permettrait :
o darrter les installations uniquement pour une raison sanitaire. Le nombre
darrts de fonctionnement des tours arorfrigrantes sans fondement
sanitaire sen verrait significativement rduit ;
o de vrifier plus rapidement lefficacit des actions correctives menes en cas
darrt dune installation.
5. CONCLUSIONS ET RECOMMANDATIONS
Les conclusions et recommandations qui suivent sont bases sur les arguments
dvelopps dans le chapitre prcdent. Pour autant, ces conclusions ne rsultent pas
dune valuation des risques sanitaires, ce qui ntait pas lobjet de la saisine.
5.1. Conclusions et recommandations court terme
5.1.1. Choix dune mthode applicable aux eaux chaudes sanitaires et aux eaux des
tours arorfrigrantes
En situation de surveillance de routine, dans lesquels les dlais de recueil des rsultats
danalyse ne constituent pas un critre prioritaire, il est recommand de laisser le choix au
gestionnaire dutiliser, soit la mthode par culture, soit la mthode par q-PCR. Ce
choix pourra tre fait selon laccessibilit de la mthode danalyse, la prsence ou non
dinhibiteurs dans leau, la prsence de flore interfrente, etc. En cas de dpassement
des valeurs cibles rglementaires, lorsque lanalyse aura t ralise par q-PCR, il est
prconis une mise en culture de lchantillon, afin de disposer de la souche dnombre,
en vue dventuelles analyses complmentaires.
En situation durgence sanitaire, en prsence de cas groups de lgionellose ou de
cas nosocomial, il est recommand dutiliser la mthode qui fournira les rsultats
dans le temps le plus court. La mthode de q-PCR semble approprie dans ce cas, au
regard de la rapidit dobtention de ses rsultats. Un dnombrement par q-PCR doit, dans
ce cas, tre complt par la mise en culture dune partie des chantillons prlevs, afin de
confronter les souches environnementales et cliniques lorsquelles sont disponibles. Au
cas o la q-PCR ne serait pas disponible, la mthode par culture est prconise. Elle
devra inclure lidentification du srogroupe en prsence dune lgionellose L.
pneumophila, ou lidentification de lespce dans le cas dune lgionellose Legionella
spp.
5.1.2. Propositions de valeurs cibles
Les valeurs cibles proposes reposent sur un avis dexpert, en ltat actuel des
connaissances. Elles sont proposes dans lobjectif damliorer le niveau de scurit
sanitaire.
Les valeurs cibles proposes pour la q-PCR ncessitent dtre consolides durant une
priode probatoire, pendant laquelle une tude mtrologique devrait tre mene afin de
comparer les rsultats danalyse obtenus avec les deux mthodes utilises en parallle
portant sur un nombre suffisant dchantillons.
Les valeurs proposes sont propres chaque mthode. Elles visent cependant atteindre
les mmes objectifs en termes de gestion des risques.
8 / 12
5.1.2.1.
Eaux chaudes sanitaires
$ En situation de surveillance de routine
Comme justifi prcdemment, pour la surveillance des eaux chaudes sanitaires, lagence
propose des valeurs cibles en L. pneumophila (tableau 1).
Tableau 1 : synthse des valeurs cibles en L. pneumophila proposes pour la qPCR,
compares aux valeurs rglementaires par culture
Culture
q-PCR
Dans le cas des eaux destines la consommation humaine fournies

9
au niveau de points dusage risque dans des tablissements
recevant du public, lexclusion de ceux utiliss par des patients
10
haut risque dans les tablissements de sant
10 UFC /L
5.10
UG /L
Dans le cas des eaux destines la consommation humaine fournies

au niveau de points dusage risque utiliss par des patients haut
risque dans les tablissements de sant
Limite de
dtection
Limite de
dtection
Dun point de vue sanitaire, concernant les points dusage risque utiliss par des patients
haut risque, il est recommand en plus de la surveillance de Legionella pneumophila, de
procder des analyses tendues au genre Legionella et toutes autres bactries
pathognes, quelle que soit la mthode analytique utilise : culture ou q-PCR.
$
En situation de surveillance aprs une dcontamination
Le circulaire DGS 2002 / 243 du 22 avril 2002 requiert une vrification de lefficacit dune
dcontamination chimique ou thermique, par le dnombrement de L. pneumophila dans un
chantillon prlev quelques jours aprs le traitement. Le fascicule de documentation FD
T90-522, "Guide technique de prlvement pour la recherche de Legionella dans les eaux"
(2006), prconise de raliser le prlvement au minimum 48 heures aprs un traitement
de dcontamination choc, afin de minimiser les faux positifs (en q-PCR) et ngatifs (en
culture).
LAnses souligne limportance du respect de la prconisation ci-dessus pour obtenir des
rsultats de dnombrement de Legionella interprtables.
Le choix de la mthode de dnombrement la plus approprie, culture ou q-PCR, peut tre
laiss la discrtion du gestionnaire de linstallation. Dans le cas de la culture, comme
dans celui de la q-PCR, la dcontamination pourra tre considre suffisante si le rsultat
de lanalyse met en vidence un nombre de L. pneumophila infrieur ou gal la valeur
cible prcdemment propose (tableau 1). Dans le cas contraire, lAnses recommande de
nouvelles actions de gestion jusqu ce que les analyses fassent tat de rsultats
infrieurs cette valeur cible.
pouvant produire des arosols deau chaude sanitaire susceptible dtre contamine par les lgionelles ; il sagit notamment
des douches, des douchettes, des bains remous ou jets.
10
Circulaire DGS 2002 243, du 22 avril 2002 : les patients dits patients haut risque sont les immunodprims
svres, et particulirement les immunodprims aprs transplantation ou greffe d'organe et les immunodprims par
corticothrapie prolonge (0,5 mg/kg de prednisone pendant 30 jours ou plus, ou quivalent) ou rcente et haute dose
(c'est--dire suprieure 5 mg/kg de prednisone pendant plus de 5 jours)
9 / 12
5.1.2.2.
Eaux de tour arorfrigrante
$ En situation de surveillance de routine
Comme justifi prcdemment, pour la surveillance des tours arorfrigrantes, lagence
propose des valeurs cibles en L. pneumophila (tableau 2).
Tableau 2 : valeurs cibles en L. pneumophila proposes
Eau dappoint : valeur cible

Eau de linstallation :
valeur cible daction
valeur cible darrt
Culture
q-PCR
Limite de
quantification
Limite de
quantification
10 UFC /L
5
10 UFC /L
5.10 UG /L
5
5.10 UG /L
Dun point de vue technique, le suivi de Legionella spp. peut prsenter un intrt pour les
gestionnaires dinstallation, notamment pour dtecter des dysfonctionnements ou limiter
les drives de concentration en microorganismes, en particulier celles lies aux Legionella
autres que pneumophila.
Par mesure de prudence, le remplacement ventuel des seuils rglementaires actuels, en
Legionella spp., par les valeurs cibles proposes ci-dessus mriterait dtre subordonn
une valuation de la pertinence des modalits de surveillance et de gestion des
prolifrations microbiennes dans les tours arorfrigrantes. L'opportunit du suivi
spcifique de Legionella spp. parmi les paramtres de surveillance devrait tre galement
considre cette occasion.
Une augmentation relative de 2 log ou plus de la concentration en Legionella spp. dans
leau de linstallation par rapport leau dappoint, pourrait titre dexemple, constituer un
indicateur de dysfonctionnement de la tour arorfrigrante. Le mme principe de suivi
dune variation relative pourrait, par ailleurs, sappliquer dautres indicateurs bactriens,
plus gnraux, tels que lATP-mtrie.
$
En cas de dcontamination d'une installation dj l'arrt, suite une contamination

excessive ou un cas de lgionellose, la rglementation recommande de rincer les circuits
afin d'vacuer les bactries prsentes dans leau et, le cas chant, les rsidus de
produits chimiques. Les procdures de dsinfection spcifient que labsence de rsidus de
dsinfection doit tre vrifie aprs le rinage.
Dans ces conditions, le dnombrement de Legionella sera peu perturb par la prsence
de dsinfectant (sagissant de la mthode par culture) ou la prsence de bactries mortes
(sagissant de la mthode par q-PCR). Il est recommand de laisser au gestionnaire le
choix de la mthode (culture ou q-PCR).
5.1.3. Besoins dtudes et de recherches
En ce qui concerne la q-PCR et la culture, il convient de mener une tude comparative sur
diffrentes qualits deaux (Eaux chaudes sanitaires et tours arorfrigrantes), avec un
grand nombre dchantillons, afin de tester et le cas chant daffiner les valeurs cibles
proposes dans le cadre de cette expertise.
5.2. Conclusions et recommandations moyen et long termes
$
De lanalyse des diffrentes mthodes, il ressort quactuellement, aucune des

mthodes alternatives la culture et la q-PCR ne rpond tous les besoins
10 / 12
exprims en lien avec les critres spcifiques dtaills dans le rapport dexpertise,
pour le dnombrement de Legionella dans les eaux chaudes sanitaires et les tours
arorfrigrantes. Cependant, les principes et objectifs de certaines permettent
denvisager de repousser certaines des limites, il est donc important dencourager leur
dveloppement :
o
o
o
o
o
o
la q-PCR, la v-PCR, la culture, le FISH et lIDS pourraient, sous certaines

conditions, permettre une prise en compte des Legionella intra-amibiennes ou
intra-vsiculaires dans la quantification ;
la DVC, la v-PCR, lIDS, le DVC-FISH ou la culture-FISH semblent permettre de
dtecter uniquement les bactries viables ou de distinguer les bactries viables
et non viables ;
la q-PCR, la v-PCR, limmuno-dtection, le FISH, et lIDS pourraient permettre
de dtecter lensemble des Legionella viables et potentiellement pathognes ;
la DVC, la q-PCR, la v-PCR, limmuno-dtection, le FISH, et lIDS permettent
une obtention relativement rapide des rsultats danalyse ;
le dlai dobtention des rsultats par culture pourrait tre rduit par une
optimisation des milieux de culture ;
limmuno-dtection, le FISH, lIDS, la q-PCR et la culture-FISH pourraient
permettre damliorer la distinction et la quantification des srogroupes de L.
pneumophila autres que le srogroupe 1.
Besoins dtudes et de recherches
A titre indicatif et sans tre exhaustif, lagence suggre des pistes dtudes et de
recherches sur les thmes suivants :
Pathognicit et gnomique
Amliorer les connaissances sur la pathognicit des Legionella viables non cultivables
ainsi que leur dose infectieuse et sur la dtection et la pathognicit des diffrents clones
de L. pneumophila sg1 identifis.
Prlvement et chantillonnage
Dvelopper des mthodes de prlvement et dchantillonnage applicables aux arosols
et aux biofilms.
Pr-traitement des chantillons
Dvelopper et optimiser le pr-traitement des chantillons afin de ladapter aux
caractristiques de la mthode de dtection pourraient permettre damliorer le rendement
du dnombrement de Legionella.
Dvelopper des techniques de capture des bactries par le biais danticorps spcifiques
(sparation immuno-magntique, etc.) dans le cas des eaux trs charges pour lesquelles
le dnombrement reste problmatique, quelque soit la mthode danalyse.
Techniques analytiques
Etudier la slectivit des diffrents milieux de culture vis--vis des diffrentes espces et
sous-types de Legionella.
Mettre au point de nouveaux milieux de culture plus adapts la croissance de la fraction
non cultivable, pour amliorer la mthode par culture. Afin de rendre plus efficace la
discrimination entre Legionella et la flore interfrente, de nouveaux antibiotiques devront
tre dvelopps.
Sagissant de la q-PCR, encourager les dveloppements visant limiter limpact des
inhibiteurs et optimiser ltape dextraction de lacide dsoxyribonuclique (ADN).
11 / 12
La v-PCR pourrait fournir des informations sur ltat de viabilit des bactries. Des tudes
visant tester cette mthode sur des eaux environnementales sont ncessaires pour
vrifier son potentiel.
Lhybridation molculaire peut galement contribuer rpondre au problme du
dnombrement de Legionella dans des eaux trs charges. Elle est moins sensible aux
inhibiteurs que lamplification gnique et permet par ailleurs de dtecter aussi bien les
cellules cultivables que les VBNC. Son dveloppement est encourager.
Outils utilisables sur site
Encourager le dveloppement doutils analytiques utilisables sur site afin de gnrer le
plus rapidement possible des rponses permettant damliorer lefficacit de la
surveillance de la qualit des eaux des installations.
Matrices et cosystmes
Les cosystmes des lgionelles sont encore mal caractriss. Des tudes
complmentaires sur les conditions environnementales permettraient de faire progresser
les connaissances dans ce domaine.
Bien que leau soit la source principale de contamination, les arosols sont la source
principale de diffusion de Legionella. Le comportement des Legionella dans les arosols
est encore trop mconnu et requiert des tudes supplmentaires.
Des tudes portant sur les cosystmes microbiens complexes permettraient de faire
progresser les connaissances dans ce domaine et en particulier, ltude des biofilms et de
leur capacit servir de rservoir aux Legionella.
Etudier la contribution des protozoaires au dveloppement des Legionella dans les
installations risque.
Des tudes visant comparer les stratgies de suivi des installations, au moyen de
diffrentes mthodes de dnombrement, notamment la culture et la q-PCR, sont
encourages, pour optimiser les dlais entre les traitements de dcontamination et les
prlvements.
Interprtation des rsultats
Mettre en uvre des tudes comparatives prenant en compte les diffrentes mthodes
ds que leur protocole est suffisamment standardis.
Aspect conomique
Lorsque plusieurs mthodes auront atteint un niveau de dveloppement et de robustesse
similaire, il semble pertinent dintroduire dans lanalyse le critre conomique. Il sera alors
envisageable dvaluer le cot / bnfice de leur utilisation, dans le contexte danalyse de
routine pour la surveillance des eaux chaudes sanitaires et des tours arorfrigrantes.
Pour cela, il conviendrait au-del du simple cot analytique unitaire de disposer
destimations complmentaires concernant notamment le cot sanitaire supplmentaire li
la lgionellose en cas de dfaut de surveillance des installations.
Fait en six exemplaires,
Le Directeur gnral
Marc Mortureux
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Mthodes de dtection et de dnombrement de

Legionella dans leau
Caractristiques dtailles et pertinence de leur mise en uvre dans les eaux
chaudes sanitaires et les tours arorfrigrantes
Saisine : 2009-SA-330
Rapport
Comit dexpert spcialis "Evaluation des risques lis aux eaux et aux agents
biologiques"
Groupe de travail "Mthode de dtection et de dnombrement de Legionella
dans leau"
Version du 25/02/2011
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Anses
Mots cls
Mthodes analytiques, dnombrement, Legionella, Legionella pneumophila, Legionella spp., eaux,
eaux chaudes sanitaires, tours arorfrigrantes, seuils.
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Anses
Table des matires

Table des matires .................................................................................................................................. 3
Expertise collective : synthse et conclusions ........................................................................................ 5
Prsentation des intervenants ............................................................................................................... 19
Abrviations et acronymes .................................................................................................................... 23
Introduction ............................................................................................................................................ 25
Contexte ................................................................................................................................................ 25
Objet de la saisine ................................................................................................................................. 26
Modalits de traitement : moyens mis en uvre et organisation.......................................................... 26
1
Description et spcificits du genre Legionella ............................................................................ 28
1.1
Caractristiques gnrales....................................................................................................... 28
1.2
Association de Legionella avec dautres composantes du milieu ............................................ 28
1.2.1
Association avec les protozoaires ................................................................................. 28
1.2.2
Association avec le biofilm ............................................................................................ 30
1.3
Mcanismes conduisant la contraction dune lgionellose ................................................... 31
1.4
Pertinence du dnombrement de Legionella versus dtection ................................................ 31
1.5
Pertinence de la recherche de L. pneumophila versus L. spp ................................................. 32
1.6
Signification sanitaire de la prsence de Legionella viables non cultivables ........................... 33
2
Dfinitions des paramtres de caractrisation et de choix des mthodes danalyses ................. 35
2.1
Paramtres de performances ................................................................................................... 35
2.1.1
Justesse......................................................................................................................... 35
2.1.2
Fidlit ........................................................................................................................... 36
Sensibilit ...................................................................................................................... 37
2.1.3
2.1.4
Spcificit et slectivit ................................................................................................. 38
2.1.5
Rendement .................................................................................................................... 39
2.1.6
Linarit ......................................................................................................................... 39
2.2
Autres paramtres de choix dune mthode analytique ........................................................... 39
2.2.1
Rapidit.......................................................................................................................... 39
2.2.2
Champ d'application ...................................................................................................... 39
2.2.3
Robustesse.................................................................................................................... 40
2.2.4
Simplicit ....................................................................................................................... 40
3
Attentes relatives une mthode de dnombrement de Legionella dans leau........................... 41
4
Description des tapes de prparation et de prtraitement des chantillons pralables un
dnombrement de Legionella ................................................................................................................ 43
4.1
Echantillonnage ........................................................................................................................ 43
4.2
Etape de concentration............................................................................................................. 43
4.2.1
Filtration ......................................................................................................................... 43
4.2.2
Centrifugation ................................................................................................................ 44
4.2.3
Sparation immuno-magntique (IMS) ......................................................................... 45
5
Description des mthodes de dnombrement slectives de Legionella utilisant un principe
unique .................................................................................................................................................... 46
5.1
Mthodes bases sur la croissance. ........................................................................................ 46
5.1.1
Culture ........................................................................................................................... 46
Direct Viable Count (DVC)............................................................................................. 50
5.1.2
5.1.3
Evolutions possibles des mthodes bases sur la croissance, peu ou pas testes pour
rechercher Legionella dans leau.................................................................................................. 52
5.2
Mthodes bases sur l'amplification gnique........................................................................... 53
5.2.1
Raction de polymrisation en chane quantitative en temps rel (q-PCR) ................. 53
5.2.2
PCR viable (v-PCR)....................................................................................................... 58
5.2.3
Evolutions possibles des mthodes bases sur lamplification gnique, peu ou pas
testes pour rechercher Legionella dans leau............................................................................. 61
5.3
Mthodes bases sur l'affinit molculaire .............................................................................. 63
5.3.1
Immuno-dtection .......................................................................................................... 63
5.3.2
Fluorescence In Situ Hybridation (FISH) ....................................................................... 66
5.3.3
Evolutions possibles des mthodes bases sur laffinit molculaire, peu ou pas
testes pour rechercher Legionella dans leau............................................................................. 68
6
Description des mthodes de dnombrement slectif de Legionella utilisant plusieurs principes70
6.1
Double marquage immunologique (IDS) .................................................................................. 70
6.2
Culture-FISH............................................................................................................................. 72
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Anses
6.3
Evolutions possibles des mthodes utilisant plusieurs principes, peu ou pas testes pour
rechercher et identifier Legionella dans leau........................................................................................ 74
6.3.1
DVC-FISH...................................................................................................................... 74
6.3.2
Desorption-ionisation laser assiste par matrice (Spectromtrie de masse MALDI-TOF)
....................................................................................................................................... 74
6.3.3
La chromatographie liquide haute pression en condition dnaturante (dHPLC) couple
la PCR ....................................................................................................................................... 75
6.3.4
IMS - ATP-mtrie ........................................................................................................... 76
7
Analyses susceptibles dapporter une information dcisionnelle complmentaire. ..................... 77
7.1
Recherche de flore totale ......................................................................................................... 77
7.1.1
Culture ........................................................................................................................... 77
7.1.2
ATP-mtrie..................................................................................................................... 77
7.2
Recherche damibes................................................................................................................. 77
7.3
Analyse du biofilm .................................................................................................................... 78
7.4
Analyse des arosols ............................................................................................................... 78
8
Comparaison des diffrentes mthodes ....................................................................................... 80
8.1
Critres dquivalence de mthodes de dnombrement de microorganismes ........................ 80
8.2
Comparabilit des units .......................................................................................................... 81
8.3
Comparabilit des limites de dtection et de quantification ..................................................... 82
8.4
Comparaison des mthodes en fonction des diffrents types deau ....................................... 83
8.4.1
Eaux ensemences exprimentalement ....................................................................... 83
8.4.2
Eaux environnementales ............................................................................................... 86
9
Rflexion sur la signification des rsultats et des valeurs cibles.................................................. 90
9.1
Elments prendre en compte dans linterprtation des rsultats des mthodes de
dnombrement de Legionella ................................................................................................................ 90
9.1.1
Consquence de lexistence de Legionella viables non cultivables et non viables vis-vis des mthodes de dnombrement............................................................................................ 90
9.1.2
Consquence de lassociation de Legionella avec les amibes ..................................... 90
9.1.3
Consquence de lassociation de Legionella avec le biofilm ........................................ 91
9.2
Seuils de gestion et mesures prconises par la rglementation en vigueur.......................... 92
9.2.1
Cas gnral des eaux chaudes sanitaires .................................................................... 92
9.2.2
Cas des eaux chaudes sanitaires dans les tablissements de sant ........................... 92
9.2.3
Cas des tours arorfrigrantes et autres installations risque ................................... 93
9.3
Signification sanitaire des valeurs cibles actuelles .................................................................. 96
9.3.1
Cas gnral ................................................................................................................... 96
9.3.2
Cas des eaux chaudes sanitaires.................................................................................. 97
9.3.3
Cas des tours arorfrigrantes .................................................................................... 97
9.4
Dtermination de valeurs cibles pour les mthodes alternatives la culture. ......................... 97
9.4.1
Cas des eaux chaudes sanitaires.................................................................................. 98
9.4.2
Cas des tours arorfrigrantes .................................................................................... 98
10 Synthse des lments recueillis ................................................................................................. 99
10.1
Synthse sur la base des lments bibliographiques .............................................................. 99
10.2
Synthse sur la base des auditions........................................................................................ 103
11 Conclusions et recommandations............................................................................................... 110
11.1
Conclusions et recommandations gnrales court terme ................................................... 110
11.2
Conclusions et recommandations moyen et long termes ................................................... 116
Rfrences bibliographiques ............................................................................................................... 119
Annexes............................................................................................................................................... 130
Annexe 1 : Courrier de saisine de lAfsset par la DGS et la DGPR sur les mthodes de dtection des
lgionelles dans leau .......................................................................................................................... 130
Annexe 2 : Textes rglementaires et lgislatifs relatifs aux Legionella,.............................................. 132
Annexe 3 : Normes rfrences dans le rapport ................................................................................ 135
Annexe 4 : Rglementation et guides internationaux.......................................................................... 136
Annexe 5 : Exemples de courriers de sollicitation utiliss pour prparer les auditions menes par le
groupe de travail "Dtection des lgionelles dans leau". ................................................................... 137
Annexe 6 : Synthse des dclarations publiques dintrts des experts par rapport au champ de la
saisine.................................................................................................................................................. 140
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Mthodes de dtection et de dnombrement de

Legionella dans leau
Caractristiques dtailles et pertinence de leur mise en uvre dans les eaux
chaudes sanitaires et les tours arorfrigrantes
Saisine : 2009-SA-330
Synthse et conclusions
Comit dexpert spcialis "valuation des risques lis aux eaux et aux agents
biologiques"
Groupe de travail "Mthode de dtection et de dnombrement de Legionella
dans leau"
Version du 25/02/2011
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Anses
Prsentation de la question pose
LAgence franaise de scurit sanitaire de lenvironnement et du travail (Afsset) a t saisie le 29

juillet 2009 par la Direction gnrale de la sant (DGS) et la Direction gnrale de la prvention des
risques (DGPR) afin de :
1. Dcrire les mthodes pr-analytiques (prparation de lchantillon avant analyse) et analytiques
connues pour la dtection et le dnombrement spcifique de lgionelles dans leau (culture, biologie
molculaire (Polymerase Chain Reaction : PCR), immuno-dtection, etc.). Cette description avait
notamment pour finalit didentifier les questions auxquelles rpondent les mthodes et leurs limites
thoriques. Elle devait tre base sur une recherche bibliographique ;
2. Etudier la pertinence (avantages et inconvnients) de la mise en uvre de ces mthodes
analytiques pour le contrle sanitaire des eaux chaudes et le contrle rglementaire des eaux de
circuits de refroidissement des tours arorfrigrantes, en fonction de leurs besoins et contraintes
respectives :
$ dans un premier temps, cette tude devait viser analyser les avantages et inconvnients des
diffrentes mthodes, notamment sur les questions des contraintes de faisabilit technique et
des cots ;
$ dans un second temps, si des mthodes apportant une plus-value technique par rapport la
mthode par culture taient mises en vidence, la pertinence de leur mise en uvre dans le
cadre des contrles rglementaires devait tre value. Sagissant des mthodes identifies,
une rflexion pouvait notamment tre mene concernant les seuils rglementaires et, le cas
chant, leur rvision.
hypothses avances concernant la pertinence des mthodes recenses, et le cas chant le
lancement des tudes ncessaires.
Contexte
Lincidence de la lgionellose a diminu en France depuis 2006 pour se stabiliser aux alentours de
1200 cas dclars par an (1206 cas enregistrs en 2009, BEH n31-32 du 27 juillet 2010), grce
notamment une meilleure identification des sources potentielles de contamination.
La surveillance environnementale de Legionella spp. ou de Legionella pneumophila est encadre par
la rglementation :
$ elle est obligatoire :
o dans les eaux minrales destines des usages thrapeutiques dans les tablissements
1
thermaux, une fois par mois aux points dusage les plus sensibles (arrt 19 juin 2000) ;
o dans les tours arorfrigrantes, une fois par mois ou tous les deux mois pendant la priode
2
de fonctionnement de linstallation (arrts du 13 dcembre 2004) ;
o dans les rseaux deau chaude sanitaire des tablissements de sant, les tablissements
sociaux et mdico-sociaux dhbergement pour personnes ges, les autres tablissements
sociaux et mdico-sociaux, les htels, les rsidences de tourisme, les campings et les
er
tablissements, pnitentiaires une fois par an aux points dusage reprsentatifs (arrt du 1
3
fvrier 2010) ;
er
$ compter du 1er janvier 2012, larrt du 1 fvrier 2010 la rend obligatoire dans les autres
tablissements recevant du public, une fois par an, aux points dusage reprsentatifs des rseaux
deau chaude sanitaire.
Arrt du 19 juin 2000 modifiant l'arrt du 14 octobre 1937 modifi relatif au contrle des sources d'eaux minrales
Arrt du 13 dcembre 2004 relatif aux prescriptions gnrales applicables aux installations classes pour la protection de
l'environnement soumises dclaration sous la rubrique n 2921 Installations de refroidissement par dispersion d'eau dans un
flux d'air
Arrt du 13 dcembre 2004 relatif aux installations de refroidissement par dispersion d'eau dans un flux d'air soumises
autorisation au titre de la rubrique n 2921
3
2
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Anses
Cette rglementation impose lutilisation de la mthode par culture, telle que dcrite dans la norme NF
T90-431 "Recherche et dnombrement de Legionella spp. et de Legionella pneumophila par culture
sur milieux gloss".
La DGS et la DGPR soulignent dans la lettre de saisine que la mthode par culture, telle que dcrite
dans la norme NF T90-431, prsente certains inconvnients :
$ le rendu des rsultats dfinitifs ncessite un dlai minimum de 8 jours aprs la mise en culture
(des rsultats intermdiaires pouvant cependant tre rendus au bout de 3 5 jours). Ce dlai
peut poser des problmes pour la gestion des installations concernes, notamment pour lever
des mesures restrictives dutilisation deau ;
$ lensemble des diffrentes formes de Legionella potentiellement prsentes dans leau nest pas
pris en compte par cette mthode. En effet elle ne permet de dnombrer que les Legionella
libres, viables et cultivables, dans les chantillons deau.
Modalits de traitement : moyens mis en uvre et organisation
Lexpertise a t mene conformment aux exigences de la norme NF X 50-110 relative la qualit

en expertise (AFNOR, 2003), avec lappui du Comit dexpert spcialis (CES) "valuation des
risques lis aux eaux et aux agents biologiques".
Un groupe de travail (GT) a t constitu en veillant notamment la comptence et lindpendance de
ses membres. Le GT sest runi 21 reprises entre le 15 fvrier 2010 et le 14 octobre 2010. Sur la
base dune synthse bibliographique produite par lAfsset, le GT a poursuivi la collecte dlments
4
bibliographiques, procd 7 auditions formelles et analys lensemble des donnes collectes pour
formuler ses conclusions et recommandations. Ces auditions ont permis de complter les informations
recueillies dans la bibliographie, en les comparants avec les tendances et hypothses dj publies.
Le rapport tablit une distinction entre les lments issus de la bibliographie et ceux issus des
auditions.
Les travaux ont t soumis rgulirement au Comit dexperts spcialis Evaluation des risques lis
aux eaux et aux agents biologiques pour avis et commentaires et adopt le 24 fvrier 2011.
Argumentaire
Pour rpondre aux objectifs de la saisine et du contrat dexpertise, le GT charg de lexpertise a pris
en compte les lments suivants.
4.1
Les espces de Legionella responsables de lgionelloses
A ce jour 58 espces de bactries du genre Legionella ont t identifies. Ces espces sont subdivises en srogroupes (environ 70 srogroupes actuellement connus). En France, Legionella
pneumophila est responsable de 98 % des cas dclars de lgionellose qui ont fait lobjet dune
5
identification aprs un prlvement pulmonaire .
Des espces autres que Legionella pneumophila peuvent cependant tre lorigine de lgionelloses,
6
en particulier chez les sujets dont limmunit est compromise (patients haut risque ). Les souches
responsables de certains de ces cas ont pu tre retrouves dans des circuits deau chaude sanitaire
utiliss par un malade, ou proximit dun malade.
En revanche, la bibliographie ne met pas en vidence de cas de lgionellose li une espce autre
que Legionella pneumophila qui soit imputable une tour arorfrigrante. Par ailleurs, les donnes
franaises ne mettent pas en vidence de cas de lgionellose dclare, imputable une Legionella
dune autre espce que pneumophila et qui aurait pour origine la contamination dune tour
arorfrigrante.
Les 7 organismes auditionns sont : lInstitut Pasteur Lille (IPL) sant environnement durable, Suez environnement, Veolia
environnement, EDF, le prsident de la Commission T 90E de lAfnor, lAssociation gnrale des laboratoires d'analyse de
l'environnement (AGLAE) et des participants au projet europen Emile. Ces organismes ont t slectionns par le GT aprs
en avoir contact pralablement prs de 45 pour valuer la ncessit dune audition
5

Circulaire DGS 2002 243, du 22 avril 2002 : les patients dits patients haut risque sont les immunodprims svres, et
particulirement les immunodprims aprs transplantation ou greffe d'organe et les immunodprims par corticothrapie
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Anses
Nanmoins, il faut souligner la difficult que reprsente lidentification de lorigine environnementale
des cas de lgionellose. En France, o le systme de surveillance des lgionelloses est trs
dvelopp, cette origine reste cependant non identifie dans 80% des cas.
Quoi quil en soit, dun point de vue sanitaire, Legionella pneumophila apparat comme lespce la
plus pertinente dnombrer aussi bien dans les circuits deau chaude sanitaire que dans les tours
arorfrigrantes
4.2
Les bases sanitaires et techniques du choix des espces de Legionella

dnombrer dans le cadre de la surveillance rglementaire
Les diffrents textes rglementaires qui encadrent la surveillance environnementale des Legionella
rendent obligatoire le dnombrement de Legionella pneumophila, lespce la plus pertinente dun point
de vue sanitaire, lexception des deux arrts du 13 dcembre 2004 relatifs aux installations de
refroidissement par dispersion deau dans un flux dair soumises autorisation et dclaration,
communment appeles tours arorfrigrantes. Ces deux arrts rendent obligatoire le
dnombrement de Legionella spp., alors que ce choix nest pas tay dun point de vue sanitaire.
Dun point de vue technique, le dnombrement de Legionella spp. peut nanmoins avoir une utilit
pour les gestionnaires dinstallations, notamment pour dtecter des dysfonctionnements. Toutefois,
cette question na pas fait lobjet dune rflexion approfondie dans le cadre de la prsente expertise.
4.3
Les critres prendre en compte pour valuer la pertinence dune mthode de

dnombrement de Legionella
Le GT a dfini les critres de performance attendus dune mthode de dnombrement de Legionella

en routine, au premier rang desquels les spcifications techniques telles que : slectivit, spcificit,
sensibilit, rptabilit, reproductibilit, justesse, fidlit ou encore rendement. Cependant, la prise en
compte dautres critres est apparue galement ncessaire pour valuer la pertinence dune mthode
de dnombrement de Legionella dans leau dans les contextes particuliers des eaux chaudes
sanitaires (ECS) et des tours arorfrigrantes (TAR). Le tableau 1 prsente les critres retenus dans
le cadre de cette expertise, ainsi que le niveau dimportance relatif qui leur a t attribu, au regard de
la problmatique pose.
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Tableau 1 : Pertinence, pour le contrle sanitaire et la surveillance, des critres de slection dune mthode de dnombrement
de Legionella dans leau, dans les contextes du suivi des ECS, des TAR et des dcontaminations.
ECS
TAR
Dconta
mination
++++
+++
++++
+++
++++
+/-
++
++
+/-
++
++
+/-
+/++
+/-
+++
+++
+++
+/-
+/-
+/-
+++
+++
+++
+++
+++
+++
Critres relatifs au contexte pratique de mise en uvre

Rapidit des rsultats (hors crise)
Faisabilit, simplicit
Equipements ncessaires limits
Faibles cots (global)
Temps technicien faible
+++
++
++
++
++
+++
++
++
++
++
+++
++
++
++
++
Critres relatifs linterprtation des rsultats

Interprtation technique simple des rsultats bruts
Interprtation pour le risque sanitaire disponible
++
+++
++
+++
++
+++
Critres relatifs aux champs dapplication

Applicable sur des chantillons deau charge
Applicable sur des chantillons deau traite
Permet de disposer de souches pour des tudes complmentaires
++
+++
++
++
+++
++
+/+++
++
Critres relatifs aux cibles

Quantification de Legionella pneumophila
Quantification de Legionella pneumophila avec distinction du
srogroupe 1
Distinction et quantification des srogroupes autre que sg1
Quantification de lensemble des Legionella species
Identification des diffrentes espces de Legionella prsentent
dans lchantillon
Prise en compte des Legionella intra amibiennes ou intra
vsiculaires dans la quantification
Quantification slective des Legionella intra amibiennes ou intra
vsiculaires
Critres relatifs ltat physiologique des Legionella
dtectes
Non dtection des Legionella mortes
Dtection notamment de lensemble des Legionella viables et
potentiellement pathognes
++++ indispensable ; +++ priorit leve ; ++ priorit modre ; +/- peu ou pas pertinent
Le critre de cot est important prendre en compte dans le choix dune mthode analytique.
Cependant, dans le cas prsent, il doit tre considr comme moins prioritaire que la pertinence dune
mthode de dnombrement des lgionelles dans leau pour assurer une surveillance sanitaire efficace
des eaux chaudes sanitaires et des tours arorfrigrantes. Les cots des mthodes plus
particulirement investigues sont aujourdhui du mme ordre de grandeur mais sont par ailleurs
susceptibles dvoluer en fonction des dveloppements venir. Ce critre conomique na donc pas
t pris en compte dans le cadre de cette expertise et il pourra tre valu une fois lefficacit des
techniques bien documente : caractristiques intrinsques et capacit rpondre aux besoins des
utilisateurs en routine.
4.4
Les mthodes values
La rflexion a port sur les caractristiques techniques des mthodes qui ont t rpertories par le
groupe de travail, avec une description :
- des tapes de prtraitement : filtration, centrifugation, sparation immuno-magntique ;
- des mthodes de dnombrement spcifiques de Legionella utilisant un principe unique :
o croissance : culture, Direct Viable Count (DVC), etc. ;
o amplification gnique : q-PCR (PCR quantitative en temps rel), v-PCR (PCR Viable), etc. ;
o affinit molculaire (immuno-dtection, hybridation in situ fluorescente (FISH), etc. ;
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Anses
-
des mthodes de dnombrement spcifique de Legionella utilisant plusieurs principes :

Immunological double-staining (IDS), culture-FISH, et dautres volutions possibles (DVC-FISH,
Desorption-ionisation laser assiste par matrice (MALDI-TOF), dHPLC, Sparation immunomagntique (IMS) - ATP-mtrie) ;
des analyses complmentaires : flore totale (culture, ATP-mtrie), amibes, biofilm, arosols.
Dans le rapport dexpertise, chaque description de mthode est assortie dun tableau prsentant les
avantages et les inconvnients intrinsques thoriques de la mthode, tels que dfinis en fonction,
des critres lists et prioriss dans le tableau 1. Le tableau 2, prsente ci-aprs une synthse des
rsultats de cette analyse.
Tableau 2 : Avantages (+), inconvnients (-) ou critres non valus (?) pour les diffrentes mthodes de dnombrement de
Legionella examines par le groupe de travail, en regard des critres de slection prcdemment valus comme de priorit
leve ou modre.
Mthodes
Culture DVC q-PCR v-PCR
ImmunoFISH
IDS
Culturedtection
FISH
Critres priorit leve
+
?
+
+
+
+
+
+
+
?
+
+
+
?
+
?
avec distinction du srogroupe 1
Prise en compte des Legionella intra
?
+
+
?
?
amibiennes ou intra vsiculaires dans la
quantification
+
+
+
?
+
Dtection notamment de lensemble des
?
+
+
+
+
+
Legionella viables et potentiellement
pathognes
Rapidit des rsultats
+
+
+
+
+
+
+
Critres dinterprtation pour le risque
+
sanitaire disponibles
+
+
+
?
?
?
?
?
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
?
+
+
+
?
+
+
+
+
Critres priorit modre

Distinction et quantification des srogroupes
Lp autre que sg1
Quantification de lensemble des Legionella
species
Equipements ncessaires faibles
Interprtation technique simple des rsultats
bruts
Permet de disposer de souches pour des
tudes complmentaires
4.5
Les mthodes pertinentes pour une utilisation en routine court terme
Le choix dune mthode de dnombrement ne peut se fonder seulement sur ses avantages et ses
inconvnients intrinsques. En effet, certains avantages identifis lchelon exprimental peuvent
tre pris en dfaut lorsque la mthode est confronte aux ralits du terrain. Aussi, il apparat
important de prendre en compte le niveau de dveloppement de la mthode : standardisation du
protocole, confirmation de ses performances par diffrents laboratoires, application possible
diffrents types dchantillons environnementaux, robustesse, existence de standards et dtalons,
etc.
Pour une application en routine dans le cadre de la surveillance rglementaire, il importe de disposer
dune mthode prouve, dont le protocole est valid par de nombreux laboratoires et sur un grand
nombre dchantillons. Actuellement, seules les mthodes de dnombrement des Legionella dans
7
leau par culture (normes NF T90-431 et NF EN ISO 11731-2 ) et par q-PCR (norme NF T90-471)
offrent ces garanties, ces deux normes intgrant le prtraitement des chantillons. Les
recommandations en vue dune mise en uvre court terme dans un cadre rglementaire ne peuvent
donc raisonnablement porter que sur la culture et la q-PCR.
7
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Anses
Dautres mthodes semblent prometteuses mais elles demandent tre dveloppes, stabilises et
testes grande chelle, avant denvisager leur application en routine.
4.6
Comparaison de mthodes recenses dans la bibliographie
Les tudes de comparaison des diffrentes mthodes de dnombrement de Legionella rpertories

dans la bibliographie ont t examines. Les units dans lesquelles sont exprims les rsultats issus
des mthodes considres ne sont souvent pas comparables. Toutefois, lorsquelles existent, des
corrlations entre des rsultats de dnombrement exprims dans diffrentes units, permettent
dalimenter la rflexion relative llaboration de rgles dinterprtation des mthodes alternatives la
culture. Pour lanalyse deaux environnementales, dont les qualits sont trs variables, les diffrentes
mthodes apparaissent rarement quivalentes. Nanmoins, les corrlations observes entre les
rsultats des mthodes compares sont sensiblement meilleures, pour lanalyse deaux relativement
peu charges, comme les eaux de rseaux domestiques, que pour lanalyse deaux charges, comme
les eaux de tours arorfrigrantes.
4.7
Choix des critres dinterprtation des rsultats selon les mthodes
Lutilisation dune mthode analytique va de pair avec la dfinition de critres dinterprtation de ses
rsultats. Aussi, avant denvisager lutilisation dune mthode de dnombrement de Legionella, dans
le cadre de la surveillance sanitaire des eaux chaudes sanitaires et des tours arorfrigrantes, il
apparait ncessaire de fixer des valeurs cibles au-del desquelles des actions de gestion pourraient
tre envisages.
$ du peu de publications disponibles sur le sujet et des fortes incertitudes quelles mettent en
vidence ;
$ de la difficult didentification de lorigine environnementale des cas de lgionellose (possible
dans 20% des cas dclars) ;
$ du grand nombre de facteurs autres que la concentration en Legionella pneumophila dans leau
des installations intervenant dans la survenue des lgionelloses (mtorologie, taille des
gouttelettes produites par les installations, tat de viabilit et de virulence des souches de
Legionella prsentes dans leau, etc.).
Aussi, la dtermination des valeurs cibles doit se fonder sur une approche pragmatique, en exploitant
les lments disponibles.
4.7.1
Valeurs cibles pour la mthode par culture
En 2001, le Conseil suprieur dhygine publique de France (CSHPF) a propos des valeurs cibles,
sur la base des connaissances scientifiques et des observations de terrain disponibles la date de
8
cette proposition. Les valeurs cibles proposes ntaient pas fondes sur une dose-rponse chez
lhomme.
$
Pour la population gnrale, la rglementation franaise en vigueur, fixe la valeur cible en L.

3
pneumophila 10 UFC/L.
Pour les patients haut risque (immunodprims), la rglementation prconise de ne pas dpasser le
seuil de dtection de la mthode par culture (selon la norme NF T90-431).
Selon les donnes de la littrature, la concentration en L. pneumophila en dessous de laquelle le
risque de lgionellose est ngligeable ou acceptable pour la population gnrale est comprise entre
4
5
10 ou 10 UFC/L dans les eaux chaudes sanitaires, malgr labsence de dose-rponse connue chez
lhomme.
Lexamen de la bibliographie et les auditions dacteurs du systme de surveillance des Legionella
dans les eaux chaudes sanitaires nont pas mis en vidence dargument justifiant, dun point de vue
sanitaire, une modification de ces valeurs cibles.
8
Relation spcifique dune voie entre des niveaux dexposition un agent dangereux et lindice observ dun effet donn. Il
existe trs peu dagents biologiques pour lesquels sont publies des donnes dose-rponse .
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$
La rglementation franaise en vigueur, concernant les tours arorfrigrantes, fixe des valeurs
cibles en Legionella spp. :
- seuil dacceptabilit de leau dappoint : limite de quantification de la mthode normalise
utilise ;
3
5
La littrature et les auditions dacteurs du systme de surveillance des tours arorfrigrantes
mettent en vidence une difficult dinterprtation des rsultats lie au choix de la cible du
dnombrement. En effet, lespce responsable de la plupart des cas de lgionelloses dclars tant
Legionella pneumophila, il est difficile dinterprter un dpassement de seuil en Legionella. spp. dun
point de vue sanitaire. Ces valeurs doivent avant tout tre considres comme des valeurs de
gestion.
4.7.2
Valeurs cibles pour la mthode par q-PCR
Le niveau de connaissance actuel ne permet pas dtablir une valeur cible de L. pneumophila la qPCR (en UG/L) sur les bases dune dose rponse chez lhomme.
Cependant, les bnfices sanitaires potentiels de lutilisation de la q-PCR, du simple fait de la rapidit
de sa mise en uvre et de lobtention de rsultats spcifiques de L. pneumophila, incitent mettre en
place les outils permettant lutilisation de cette technique en routine. En effet, dans de nombreux cas,
elle permettrait de dtecter et donc de grer la contamination dune installation beaucoup plus
rapidement quavec la culture. Dans ce contexte, ltablissement de valeurs cibles est primordial.
Les seuls rfrentiels actuels sont les valeurs cibles dj prsentes dans la rglementation pour la
mthode par culture. Les retours dexprience lis leur utilisation pour la surveillance des lgionelles
dans leau ne mettent pas en vidence la ncessit de les modifier. Il apparat donc raisonnable de
dfinir les valeurs cibles applicables la q-PCR de manire ce que le taux de rsultats suprieurs
ces valeurs cibles, obtenus avec une mme srie de prlvements, soit quivalent pour la culture et
pour la q-PCR.
Cependant les units des diffrentes mthodes de dnombrement de Legionella apparaissent
htrognes et difficilement comparables : units gnomes/L (UG/L) pour les mthodes par biologie
molculaire et units formant colonies/L (UFC/L) pour les mthodes par culture. En labsence de
donnes publies, les valeurs proposes sont principalement bases sur les rsultats de la
surveillance des lgionelles dans lenvironnement, prsents par deux acteurs auditionns.
$

9
dusage risque dans les tablissements recevant du public, lexclusion de ceux utiliss par
des patients haut risque.
En ce qui concerne les points dusage risque utiliss par des patients haut risque dans les
tablissements de sant, pour assurer une protection sanitaire maximale, il semble raisonnable
de proposer des valeurs cibles gales au seuil de dtection de la mthode.

Cependant, certains essais montrent une bien meilleure concordance relative entre les rsultats
obtenus par culture et par q-PCR pour le dnombrement de L. pneumophila que pour celui de
Legionella. spp. Dun point de vue analytique, il semble donc plus adapt de dterminer une
valeur cible en L. pneumophila pour la q-PCR.
Dun point de sanitaire, ltablissement de valeurs cibles en L. pneumophila apparat galement
plus pertinent.
pouvant produire des arosols deau chaude sanitaire susceptible dtre contamine par les lgionelles ; il sagit notamment des
douches, des douchettes, des bains remous ou jets.
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protectrices dun point de vue sanitaire que les mmes valeurs appliques L. pneumophila,
dans la mesure o ces dernires font partie des Legionella spp. On rappellera nanmoins que :
o ce jour, aucune autre espce que L. pneumophila na pu tre identifie chez un patient
atteint de lgionellose, dont lorigine de la contamination ait t attribue une tour
arorfrigrante ;
o la proportion de L. pneumophila parmi les Legionella spp. varie fortement dans le temps
et il nexiste pas doutil fiable permettant de la prvoir.
Aussi, il parait fond de proposer aujourdhui des valeurs cibles en L. pneumophila, pour la
surveillance sanitaire des tours arorfrigrantes, aussi bien pour la mthode par culture que
pour la mthode par q-PCR.
Ce dispositif prsente quatre avantages importants :
o dun point de vue sanitaire :
- faciliter linterprtation des rsultats de surveillance ;
- ouvrir la possibilit dutiliser la q-PCR pour la surveillance des tours arorfrigrantes,
pour bnficier de la grande ractivit de cette technique, avec la possibilit de dtecter
une contamination beaucoup plus rapidement que ce nest le cas actuellement ;
o du point de vue de la gestion des installations : le choix de dnombrer L. pneumophila dans les
tours arorfrigrantes la place de Legionella spp. permettrait :
- darrter les installations uniquement pour une raison sanitaire. Le nombre darrts de
fonctionnement des tours arorfrigrantes sans fondement sanitaire sen verrait
significativement rduit ;
- de vrifier plus rapidement lefficacit des actions correctives menes en cas darrt
dune installation.
5
5.1
Conclusions et recommandations
Conclusions et recommandations gnrales court terme
Les conclusions et recommandations qui suivent sont bases sur les arguments dvelopps dans le
chapitre prcdent. Pour autant, ces conclusions ne rsultent pas dune valuation des risques
sanitaires, ce qui ntait pas lobjet de la saisine.
5.1.1
Choix dune mthode applicable aux eaux chaudes sanitaires et aux eaux des tours
arorfrigrantes
En situation de surveillance de routine, dans lesquels les dlais ne constituent pas un critre
prioritaire, il est recommand de laisser le choix au gestionnaire dutiliser, soit la mthode par
culture, soit la mthode par q-PCR. Ce choix pourra tre fait selon laccessibilit de la mthode
danalyse, la prsence ou non dinhibiteurs dans leau, la prsence de flore interfrente, etc. En cas
de dpassement des valeurs cibles rglementaires, lorsque lanalyse aura t ralise par q-PCR,
il est prconis une mise en culture de lchantillon, afin de disposer de la souche dnombre, en vue
dventuelles analyses complmentaires.
En situation durgence sanitaire, en prsence de cas groups de lgionellose ou de cas
nosocomial, il est recommand dutiliser la mthode qui fournira les rsultats dans le temps le
plus court. La mthode de q-PCR semble approprie dans ce cas, au regard de la rapidit
dobtention de ses rsultats. Un dnombrement par q-PCR doit, dans ce cas, tre complt par la
mise en culture dune partie des chantillons prlevs, afin de confronter les souches
environnementales et cliniques lorsquelles sont disponibles. Au cas o la q-PCR ne serait pas
disponible, la mthode par culture est prconise. Elle devra inclure lidentification du srogroupe en
prsence dune lgionellose L. pneumophila, ou lidentification de lespce dans le cas dune
lgionellose Legionella spp.
5.1.2
Propositions de valeurs cibles
Les valeurs cibles proposes ici reposent sur un avis dexpert en ltat actuel des connaissances.
Elles sont proposes dans lobjectif damliorer le niveau de scurit sanitaire.
Les valeurs cibles proposes pour la q-PCR ncessitent dtre consolides durant une priode
probatoire, pendant laquelle une tude mtrologique serait mene afin de comparer les rsultats
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danalyse obtenus avec les deux mthodes utilises en parallle sur un nombre suffisant
dchantillons.
Les valeurs proposes ici sont propres chaque mthode. Elles visent cependant atteindre les
mmes objectifs en termes de gestion des risques.
5.1.2.1
Eaux chaudes sanitaires :
En situation de surveillance de routine
"
Dans le cas des eaux destines la consommation humaine fournies au niveau de points
10
dusage risque dans des tablissements recevant du public, lexclusion de ceux utiliss par
11
des patients haut risque dans les tablissements de sant :
Pour les rsultats danalyses obtenus par culture, aucune des donnes rpertories ne permet de
justifier une modification de la rglementation en vigueur en France concernant lobjectif de
3
concentration en L. pneumophila ne pas dpasser, soit 10 UFC /L.
Pour les rsultats obtenus par q-PCR, la valeur cible en L. pneumophila ne pas dpasser est de
3
5.10 UG /L.
Ces deux valeurs cibles sont indpendantes et ne sont pas sensu stricto quivalentes.
En cas de dpassement des valeurs cibles proposes et en fonction de la mthode de dnombrement
choisie, des actions de gestion doivent tre envisages par le responsable de linstallation. Au cas o
12
des rsultats non satisfaisants sont obtenus, il convient de rechercher lorigine de la contamination
en confrontant les rsultats danalyse deau prleve en diffrents points du rseau de distribution
deau chaude. Il importe aussi de vrifier la concentration en L. pneumophila dans leau du rseau
deau froide. Le taux de points conformes et la localisation des points non-conformes peuvent
galement apporter des informations utiles au gestionnaire de linstallation. Les mesures de gestion
de la qualit des eaux incluent outre la dsinfection, des amliorations envisager telles que la
suppression de bras morts, et de points de soutirage non utiliss ou lquilibrage du dbit. Dans tous
les cas, une vrification de lefficacit des mesures de gestion choisies sera indispensable.
La gestion technique des installations deau chaude sanitaire peut permettre de dtecter, voire
danticiper des dysfonctionnements. Elle peut tre ralise par le dnombrement de Legionella spp
comme par des indicateurs beaucoup plus simples, tels quun suivi rigoureux de temprature bas sur
un nombre suffisant de points de mesure.
"
dusage risque utiliss par des patients haut risque dans les tablissements de sant :
13
Selon la rglementation en vigueur en France, (Arrt du 1er fvrier 2010 ) lobjectif de concentration
14
en L. pneumophila ne pas dpasser est le seuil de dtection de la mthode par culture . Le groupe
de travail prconise de conserver cet objectif pour les rsultats de surveillance obtenus par culture et
recommande dappliquer ce mme objectif de non dpassement du seuil de dtection de la mthode
15
utilise, aux rsultats obtenus par q-PCR .
Concernant les points dusage risque utiliss par des patients haut risque, il convient, en plus de la
surveillance vis--vis de Legionella pneumophila, de procder une analyse de risque tendue au
genre Legionella et toutes autres bactries pathognes..
$
10
11
12
Dpassement des seuils de gestion fixs
13
14
50 UFC /L
15
Selon la norme NF T90-471, le seuil de dtection de la mthode par q-PCR est variable en fonction des ventuelles dilutions
appliques lchantillon en prsence dinhibiteurs. Il est important que les dilutions ventuelles nimpactent pas la valeur cible.
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Aprs une dcontamination chimique ou thermique, il est ncessaire de vrifier son efficacit en
dnombrant L. pneumophila dans un chantillon prlev quelques jours aprs le traitement (circulaire
DGS 2002 / 243 du 22 avril 2002). Le fascicule de documentation FD T90-522, "Guide technique de
prlvement pour la recherche de Legionella dans les eaux" (2006), prconise de raliser le
prlvement au minimum 48 heures aprs un traitement de dcontamination choc. Ce dlai est
notamment prvu pour permettre le renouvellement de leau dans le rseau et llimination des
ventuelles bactries mortes. En termes dimpact sur les rsultats des mthodes, les risques de
dnombrement de fortes proportions de bactries mortes, par q-PCR, ou de non dnombrement de
fortes proportions de bactries viables mais non cultivables (VBNC) par culture sont limits. De
surcrot, dans le cas dun traitement de leau par un dsinfectant chlor, il est ncessaire de traiter
l'chantillon d'eau par du thiosulfate de sodium pour neutraliser le chlore. Dans ce cas, le risque
dinhibition par le chlore de la croissance des bactries sur les milieux de culture et donc le risque de
faux ngatifs, sont limits.
Le choix de la mthode la plus approprie (culture ou q-PCR) peut tre laiss la discrtion du
gestionnaire de linstallation. Dans le cas de la culture, comme dans celui de la q-PCR, la
dcontamination peut tre considre suffisante si le rsultat de lanalyse met en vidence un nombre
de L. pneumophila infrieur ou gal la valeur cible prcdemment propose. Dans le cas contraire,
une nouvelle action de gestion doit tre envisage jusqu ce que les analyses fassent tat de
rsultats infrieurs cette valeur cible.
5.1.2.2
$
Eaux de tour arorfrigrante :
En situation de suivi de routine
Actuellement, dans un contexte sanitaire, les seuils relatifs aux tours arorfrigrantes fixs par la
rglementation franaise concernent Legionella spp. Le groupe de travail propose de ne plus
rechercher Legionella spp., mais seulement L. pneumophila. Les valeurs cibles en L.
pneumophila prconises sont les suivantes :
Rsultats obtenus par culture :
- valeur ne pas dpasser pour leau dappoint : 250 UFC/L (limite de quantification de la
mthode) ;
3
- valeur cible daction pour leau de linstallation : 10 UFC /L ;
5
- valeur cible darrt pour leau de linstallation : 10 UFC /L.
Rsultats obtenus par q-PCR :
- valeur ne pas dpasser pour leau dappoint : limite de quantification de la mthode (limite
variable) ;
3
- valeur cible daction pour leau de linstallation : 5.10 UG /L ;
5
- valeur cible darrt pour leau de linstallation : 5.10 UG /L.
Les valeurs cibles proposes pour la culture et pour la q-PCR sont indpendantes et ne sont
pas sensu stricto quivalentes.
Par ailleurs, une augmentation relative significative de la teneur en Legionella spp. par rapport leau
dappoint (2 log ou plus) pourrait constituer un indicateur de dysfonctionnement de la tour
arorfrigrante. Le mme principe pourrait par ailleurs sappliquer dautres indicateurs bactriens,
tels que lATP-mtrie.
$
En cas de traitement de dcontamination d'une installation l'arrt, par suite dune contamination
excessive ou dun cas de lgionellose, il est ncessaire de rincer les circuits afin d'vacuer les
bactries prsentes dans leau et le cas chant les rsidus de produits chimiques. Les procdures de
dsinfection spcifient que labsence de rsidus de dsinfection doit tre vrifie aprs le rinage.
Ainsi, le risque de voir un dnombrement perturb par la prsence de dsinfectant (pour la mthode
par culture) ou la prsence de bactries mortes (pour la mthode par q-PCR), est diminu. Il est donc
recommand de laisser la possibilit dutiliser la mthode par culture ou la mthode par q-PCR. Il
convient cependant de mettre les rsultats disposition du gestionnaire le plus rapidement possible
(q-PCR ou culture selon les contextes locaux). Linterprtation des rsultats devra prendre en compte
les performances analytiques et la particularit des mthodes utilises.
Selon la rglementation en vigueur, dans le cadre du suivi de dcontamination, en cas de
dpassement du seuil daction, il est ncessaire de dnombrer L. pneumophila dans un chantillon
prlev au maximum deux semaines aprs le traitement. En cas de dpassement du seuil darrt, la
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rglementation demande un prlvement de contrle 48h aprs la remise en service (Arrt du 13
dcembre 2004). La dcontamination est suffisante si le rsultat de lanalyse met en vidence un
nombre de L. pneumophila infrieur aux seuils daction.
En cas de contaminations rcurrentes dun mme site, il convient de raliser des investigations
complmentaires incluant la conception hydraulique des installations, la prsence de biofilms ainsi
que celle de protozoaires.
5.1.3
Labsence de critres dinterprtation des rsultats du point de vue sanitaire, quelles que soient les
mthodes alternatives la culture, tient principalement au manque de donnes analytiques obtenues
par ces diffrentes mthodes. A court terme, il est ncessaire daffiner les critres dinterprtation des
rsultats retenus pour la q-PCR. A moyen ou long terme, il convient dlaborer des critres pour les
autres mthodes qui atteindront un niveau de dveloppement suffisant.
5.2
Conclusions et recommandations moyen et long termes
Des critres de choix des mthodes ont t dfinis, discuts et hirarchiss dans le tableau 1
"Pertinence, pour le contrle sanitaire et la surveillance, des critres de slection dune mthode de
dnombrement de Legionella dans leau, dans les contextes du suivi des ECS, des TAR et des
dcontaminations".
Les mthodes actuelles ne rpondent pas tous les besoins exprims. Les deux mthodes
normalises (culture et q-PCR) qui font lobjet des recommandations court terme prsentent des
limites largement voques dans le rapport. Des informations supplmentaires sont
potentiellement apportes par certaines mthodes alternatives, sous rserve de
dveloppements et dvaluations in situ
Aucune des mthodes alternatives de dnombrement de Legionella dcrites dans le rapport ne
semble pouvoir satisfaire lensemble des attentes identifies par les experts. Cependant, les
principes et objectifs de certaines mthodes dcrites permettent denvisager de repousser certaines
des limites et il est important dencourager leur dveloppement.
Les mthodes par q-PCR, v-PCR, culture, FISH et IDS, pourraient sous certaines conditions,
permettre une prise en compte des Legionella intra-amibiennes ou intra-vsiculaires dans la
quantification.
Les mthodes de dnombrement par DVC, v-PCR, IDS, DVC-FISH ou culture-FISH semblent
permettre de dtecter uniquement les bactries viables ou de distinguer les bactries viables et non
viables.
Les mthodes de dnombrement par q-PCR, v-PCR, immuno-dtection, FISH, et IDS permettent
thoriquement de dtecter lensemble des Legionella viables et potentiellement pathognes.
Les mthodes de dnombrement par DVC, q-PCR, v-PCR, immuno-dtection, FISH, et IDS
permettent une obtention relativement rapide des rsultats danalyse.
Des amliorations des milieux utiliss pour les mthodes de dnombrement par culture pourraient
galement permettre une rduction du temps dobtention des rsultats de ces mthodes.
Les mthodes de dnombrement par immuno-dtection, FISH, IDS, q-PCR et culture-FISH permettent
thoriquement damliorer la distinction et la quantification des srogroupes de L. pneumophila autres
que le srogroupe 1.
Les experts ont mis en vidence des manques de connaissances qui pourraient justifier la
ralisation dtudes ou dessais exprimentaux. A titre indicatif, et sans tre exhaustif, quelques
pistes dtudes et de recherches sont proposes.
Il semble opportun de mener des recherches pour amliorer les connaissances sur les Legionella
pathognes, notamment des diffrents clones de L. pneumophila sg1 dj identifis en pathologie
humaine et leur dtection. De mme, des recherches pourraient tre menes pour amliorer les
connaissances sur la notion de dose infectieuse ainsi que sur la pathognicit des Legionella viables
non cultivables.
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Echantillonnage
Le prlvement et lchantillonnage constituent un enjeu fort des futurs travaux de dveloppements.
En effet, dans ces deux cas, les mthodes analytiques applicables leau sont utilisables en ltat,
condition darriver disposer dun chantillon reprsentatif. Aussi, il convient dencourager le
dveloppement de mthodes de prlvement et dchantillonnage applicables aux arosols et
biofilms.
Prtraitement des chantillons
Le dveloppement et loptimisation des prtraitements des chantillons, pour adapter leurs
caractristiques aux mthodes de dtection dj utilises ou en cours de dveloppement, pourraient
permettre damliorer les rendements globaux des dnombrements de Legionella.
Lanalyse des eaux trs charges, reste problmatique pour lensemble des mthodes utilises. La
capture des bactries par le biais danticorps spcifiques (sparation immuno-magntique, etc.)
est, dans ce domaine, une piste intressante qui demande tre dveloppe.
Chaque mthode tudie possde ses points faibles, que les dveloppements ultrieurs devront
sattacher attnuer.
Ainsi, il sagit de sassurer que les milieux slectifs utiliss en culture prsentent une slectivit
quivalente en termes de dnombrement pour les diffrentes espces et sous-types de Legionella.
Par ailleurs, la mise au point de nouveaux milieux de cultures plus adapts, en particulier
permettant la croissance de la fraction actuellement non cultivable, est sans nul doute une voie
damlioration de la mthode par culture. Il convient galement dvaluer lefficacit de nouveaux
antibiotiques, diffrents de ceux actuellement utiliss dans le milieu Glycine Vancomycine Polymyxine
Cycloheximide (GVPC), afin de rendre plus efficace la discrimination entre Legionella et flore
interfrente.
La q-PCR pourrait galement faire lobjet damliorations. Des dveloppements visant limiter
limpact des inhibiteurs et optimiser ltape dextraction de lacide dsoxyribonuclique (ADN)
semblent une voie damlioration intressante.
La v-PCR semble fournir une information sur ltat de viabilit des bactries. Des tudes visant
tester cette mthode sur des eaux environnementales sont cependant encore ncessaires pour
vrifier son potentiel.
Lhybridation molculaire, peut galement contribuer rpondre au problme du dnombrement de
Legionella dans des eaux trs charges. Elle est moins sensible aux inhibiteurs que lamplification
gnique et est par ailleurs capable de dtecter aussi bien les cellules cultivables que les VBNC.
Le dveloppement de kits prts lemploi, bass sur les diffrents principes dj voqus semble
galement une voie damlioration prometteuse.
Une demande a t fortement exprime lors des auditions par diffrents acteurs. Elle concerne un
besoin de dveloppement doutils utilisables sur site afin de gnrer le plus rapidement possible,
directement sur les lieux dinstallation, des rponses non ambigus permettant damliorer lefficacit
de la surveillance de la qualit des eaux.
Les cosystmes des lgionelles sont encore mal caractriss. Des tudes complmentaires sur les
conditions environnementales permettraient de faire progresser les connaissances dans ce domaine.
Bien que leau soit la source principale de contamination, les arosols sont sa source principale de
diffusion. Leur comportement et constitution sont encore trop mconnus et requirent des tudes
supplmentaires.
Une lacune dans la connaissance des cosystmes microbiens complexes, en particulier des
biofilms et de leur capacit servir de rservoir aux Legionella a t mise en vidence. Cette lacune
impacte de faon dommageable les possibilits de contrle et il est prconis de la combler.
Le suivi des protozoaires (amibes et cilis) dans les installations et leur contribution la dangerosit
des installations risque est trop largement nglig. Une maitrise complte du risque ne pourra tre
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envisage sur le long terme que si ces deux paramtres sont pris en compte et un effort sensible de
la recherche dans ces deux domaines est prconis.
Des tudes comparant les stratgies de suivi des installations mettant en uvre les diffrentes
mthodes de dnombrement disponibles, en commenant par la culture et la q-PCR, pourraient tre
proposes, notamment en cas de dcontamination, pour optimiser les dlais entre traitements et
prlvements en fonction des mthodes.
Enfin, il semble important que le dveloppement des futurs rseaux intgre la problmatique des
Legionella et anticipe autant que possible les problmes hydrauliques lorigine de dveloppement
bactrien.
Le manque de cohrence des essais comparatifs mettant en uvre les diffrentes technologies
justifie de mettre en uvre des essais grande chelle sagissant des mthodes non encore
rodes. Ces essais permettront daboutir terme une standardisation des protocoles, voire
leur normalisation et de disposer de donnes suffisantes pour pouvoir les comparer.
Le Comit dexpert spcialis Eaux et agents biologique adopte le rapport dexpertise associ
cette synthse et valide cette dernire, le 25 fvrier 2011.
er
Maisons-Alfort, le 1 mars 2011,
Au nom des experts du CES Eaux et agents biologique ,

Madame la prsidente du CES
Sylvie Rauzy
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Prsentation des intervenants

Groupe de travail Dnombrement des lgionelles dans leau
Prsident :
M. Claude-Olivier SARDE : Enseignant chercheur lUniversit de Technologie de Compigne
Membres :
M. Pierre ABASQ : Responsable du laboratoire de microbiologie Environnement Sant de lIDAC
(Nantes).
Mme Sverine ALLEGRA : Enseignant chercheur de lUniversit Jean Monnet (Saint-Etienne) ;
M. Philippe CHANTELOUP : Chef du service de microbiologie environnementale du laboratoire du
Conseil Gnral du Var (Draguignan) ;
M. Didier HILAIRE : Chef du dpartement toxines bactriennes du Centre dtudes du Bouchet (Vert
le Petit).
Mme Sophie JARRAUD : Co-directeur du Centre National de Rfrence des lgionelles (Lyon).
Mme Christine LAWRENCE : Responsable de lquipe oprationnelle dhygine de lHpital Raymond
Poincar (Garches).
M. Pierre LE CANN : Enseignant chercheur lEcole des Hautes Etudes en Sant Publique (Rennes).
Mme Marylin LECSO : Praticien attach dans le service de Bactriologie-Hygine du groupe
hospitalier de la Piti Salptrire (Paris), Matre de confrences luniversit Ren Descartes (Paris)
M. Fabien SQUINAZI : Directeur du Laboratoire dHygine de la Ville de Paris (LHVP).
Anses
Coordination scientifique
M. Rmi POIRIER : Chef de projet lUnit dvaluation des risques lis leau et aux agents
biologiques
Relecture
Mme Sylvie ZINI : Chef de lUnit dvaluation des risques lis leau et aux agents biologiques
Secrtariat administratif
Mme Sverine BOIX : Assistante la Direction dvaluation des risques
Adoption du rapport par le comit dexperts spcialis

Le prsent rapport a t prsent au Comit dexperts spcialis Evaluation des risques lis aux
eaux et aux agents biologiques pour avis et commentaires et adopt le 25 fvrier 2011.
Prsident du Comit dexperts spcialis
Mme Sylvie RAUZY. Docteur en hydrologie. Responsable qualit. Office national de leau et des
milieux aquatiques (ONEMA). Chimie analytique
Membres du Comit dexperts spcialis
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Anses
M. Rafik ABSI. Docteur, Ingnieur, Enseignant-chercheur lcole de biologie Industrielle CergyPontoise. Recherche en mcanique des fluides, hydraulique et modlisation.
M. Jean-Jacques BALLET. Mdecin immunologiste. Professeur luniversit et au CHU de Caen et
au Laboratoire dImmunologie et Immunopathologie. Immunopathologie, infections (na pas particip
aux travaux concernant cette saisine).
M. Jean-Marc BERJEAUD. Matre de confrences. Universit de Poitiers et laboratoire de
microbiologie fondamentale et applique.
M. Jean-Luc BOUDENNE. Matre de confrences. Universit de Provence, Chef de lquipe chimie et
mtrologie des eaux au Laboratoire de Chimie Environnement. Mtrologie des eaux, chimie et qualit
des eaux.
Mme Jeanne BRUGERE-PICOUX. Professeur, spcialiste de pathologie mdicale du btail et des
animaux de basse-cour. cole Nationale Vtrinaire dAlfort.
M. Pierre-Jean CABILLIC. Ingnieur ENGEES et Ingnieur du Gnie Sanitaire. Chef du dpartement
Sant Environnement de la DDASS du Morbihan. Retrait. Qualit des eaux, assainissement,
baignades et process de traitement.
M. Patrick CAMUS. Cadre de Recherche, Chef de laboratoire lInstitut franais de recherche pour
lexploitation de la mer (IFREMER). cologie, hydrologie, pollution et surveillance des eaux marines.
M. Edmond CREPPY. Professeur lUniversit de Bordeaux 2, Directeur du Laboratoire de
Toxicologie et d'Hygine Applique. Modes d'action des toxiques de l'environnement.
M. Christophe CUDENNEC. Matre de confrences HDR en hydrologie, Agrocampus Ouest et INRA
Rennes. Hydrologie, ressources en eau, amnagement du territoire, modlisation.
M. Christophe DAGOT. Professeur, Responsable Eau et Environnement de lUniversit de Limoges et
de lEcole Nationale suprieures dingnieurs de Limoges (ENSIL). Gnie des procds, traitement
des eaux.
M. Sam DUKAN. Docteur en Microbiologie, Responsable dquipe au Laboratoire de Chimie
Bactrienne au centre national de recherche scientifique (CNRS) de Marseille. Chimie bactrienne,
mcanismes de survie bactrienne (na pas particip aux travaux concernant cette saisine).
M. Jean-Franois GEHANNO. Mdecin du travail. Matre de Confrences des Universits - Praticien
Hospitalier au centre hospitalier universitaire (CHU) de Rouen au Service Mdecine du Travail et
Pathologie Professionnelle - Risques professionnels en particulier biologiques et toxiques.
M. Jean-Pierre GUT. Professeur hospitalo-universitaire. Directeur de l'Institut de virologie. Universit
Louis Pasteur. Strasbourg.
M. Didier HILAIRE. Docteur, expert en microbiologie, Expert dcontamination la DGA - Dsinfection
des agents du risque biologique et stabilit des agents biologiques dans lenvironnement.
M. Jean-Franois HUMBERT. Docteur, Directeur de Recherche lInstitut national de recherche
agronomique (INRA) de Thonon-les-Bains. cologie microbienne.
M. Abdel LAKEL. Ingnieur de recherche, co-responsable du domaine Air/Eau-Pollution Sant, Pilote
du dpartement Climatologie arodynamique pollution puration au Centre scientifique des
techniques du btiment (CSTB). Dpollution des eaux uses.
Mme Colette LE BACLE. Mdecin du travail, Conseiller mdical en Sant au Travail, Pilote de la
thmatique Risques Biologiques lInstitut national de recherche et de scurit (INRS). Risques
biologiques professionnels.
M. Patrick MARCHANDISE. Membre permanent du Conseil gnral de lenvironnement et du
dveloppement durable (CGEDD), MEEDDM. Eau, assainissement, risques sanitaires
Mme Laurence MATHIEU. Matre de confrences HDR, Ecole pratique des hautes tudes. LCPME,
UMR 7564 CNRS/Nancy Universit. Microbiologie, eau, arosol, exposition aux contaminants
biologiques
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Anses
M. Grard MOGUEDET. Professeur, Hydrogologue agre en matire dhygine publique, Vice
Prsident de lUniversit dAngers. Hydrologie, hydrogologie et pollution des eaux.
Mme Catherine MOUNEYRAC. Professeur en cotoxicologie aquatique, Directrice de lInstitut de
Biologie et dcologie Applique lUniversit Catholique de lOuest. Ecotoxicologie, biomarqueurs.
Mme Anne-Marie POURCHER. Matre de confrences, enseignant - Chercheur au CEMAGREF de
Rennes dans lUnit Gestion Environnementale et Traitement biologique des dchets - Aspect
sanitaire des traitements biologiques des dchets liquides et solides, survie bactrienne.
Mme Rene RUNIGO-MAGIS. Ingnieur du centre national des arts et mtiers (CNAM) en Scurit
au Travail, Ingnieur Scurit lassistance publique-hpitaux de Paris (APHP).Hygine et scurit
professionnelle.
Mme Marie-Pierre SAUVANT-ROCHAT. Professeur de sant publique, Chef de service lUniversit
dAuvergne au Laboratoire Sant publique et Environnement. Sant publique et pidmiologie.
Mme Nicole TANDEAU DE MARSAC. Docteur es Science, Directeur de recherche mrite au
Laboratoire de chimie bactrienne au Centre national de la recherche scientifique (CNRS) de
Marseille. Microbiologie, cyanobactries.
Mme Michle TREMBLAY. Mdecin en sant communautaire, Mdecin conseil en maladies
infectieuses et en sant au travail lInstitut national de sant publique du Qubec (INSPQ) la
Direction de la sant publique de Montral. Risques biologiques professionnels lis aux eaux.
M. Bernard TRIBOLLET. Ingnieur de lcole Suprieure dlectricit, Docteur dtat, Directeur de
Recherches lUniversit de Jussieu au Laboratoire Interfaces et Systmes lectrochimiques.
Biofilms, entartrage, corrosion des matriaux en milieux naturels.
Mme Isabelle VILLENA. Mdecin biologiste, Professeur des Universits - Praticien Hospitalier au CHU
de Reims au Laboratoire de Parasitologie et Mycologie. Parasitologie et mycologie, diagnostic et
traitement de zoonoses.
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Auditions
IPL sant environnement durable : M. Matthieu BERNIER, laboratoire IPL Midi-Pyrnes
Suez environnement :
- Mme Sophie COURTOIS : ple Analyse et Sant, CIRSEE (Centre de Recherche sur leau et
lEnvironnement)
- M. Samuel ROBERT : dpartement Sant et Environnement, Ple Analyse et Sant, CIRSEE
Veolia environnement :
- Mme Karine DELABRE : Veolia environnement recherche et innovation (VERI)
- Mme Florence POTY : Veolia environnement Centre danalyse environnementale (CAE)
- M. Jean-Philippe PUIBARAUD : Veolia Environnement Dalkia (Veolia nergie), Direction
technique, charg du risque lgionelle
EDF :
- Mme Marie BINET : service de recherche et dveloppement
- Mme France WALLET : service des Etudes Mdicales
Commission T 90E de lAfnor (charge de llaboration de la norme NF T90-471) : M. Laurent
GARRELLY, prsident de la commission
Association gnrale des laboratoires d'analyse de l'environnement (AGLAE)

-
M. Philippe GARINI : Directeur dAGLAE

M. Olivier MOLINIER : Statisticien dAGLEA
M. Jean-Marie DELATTRE : Prsident dAGLAE
Participants au projet europen Emile (Environmental Monitoring Investigation of Legionella in

Europe)
- Mme Sirine ASSAF : GeneSystems
- M. Bertrand COISSAC : GeneSystems
- M. Philippe HARTEMANN : Universit de Nancy
Lorganisation des auditions menes par le groupe de travail a t prcde dune phase de prise de
contact pralable avec prs de 45 laboratoires, industriels, organismes et personnalits comptentes
dans le domaine du dnombrement de Legionella (utilisateurs de mthodes, dveloppeurs de
mthodes). Compte tenu du temps disponible pour raliser cette tude, il ntait pas envisageable que
le groupe de travail les auditionne tous. Ainsi, ces contacts pralables, raliss par tlphone ou mail,
ont fait lobjet de comptes-rendus au groupe de travail, qui a ainsi pu valuer lintrt de les complter
ou non par une audition. Le choix des organismes et personnalits auditionns a ainsi t bas sur
leur capacit potentielle fournir des informations dont le groupe de travail ne disposait pas dj.
Pralablement aux auditions, chaque organisme auditionn a t sollicit par un courrier prcisant les
informations que le groupe de travail souhaitait aborder (exemples de courriers en annexe 5).
Lobjectif premier de ces auditions tait de collecter des informations provenant dobservations de
terrain ou dtudes en cours. Il ny a pas eu de questionnaire mais une liste de points sur lesquels le
groupe de travail souhaitait recueillir la position ou une description des pratiques des personnes
entendues. Les points que le groupe de travail souhaitait aborder en priorit portaient sur : les
mthodes utilises, les contextes dutilisation, (rglementaires, technique, etc.), les informations
attendues, linterprtation des rsultats, le type de dcision que pouvaient engendrer les rsultats
obtenus et les essais de comparaison inter laboratoire.
En pratique, les auditions se sont droules sous la forme de prsentations des personnes
auditionnes, suivies de discussion de 1 2 heures avec le groupe de travail. Chaque audition a fait
lobjet dun compte rendu valid par les personnes auditionnes.
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Abrviations et acronymes
ADN : acide dsoxyribonuclique,
ADNc : ADN complmentaire
ADNr : ADN ribosomal
AFNOR : Agence franaise de normalisation
AFSSA : Agence franaise de scurit sanitaire des aliments
AFSSET : Agence franaise de scurit sanitaire de l'environnement et du travail
ANSES : Agence nationale de scurit sanitaire alimentation, environnement, travail
ARN : Acide ribonuclique
ARNr : ARN ribosomal
ATP : Adnosine triphosphate
BCYE : Buffered charcoal yeast extract ; glose tamponne l'extrait de levure et au charbon actif
CCLIN : Centre de coordination de la lutte contre les infections nosocomiales
CNRL : Centre national de rfrence des lgionelles
CSHPF : Conseil suprieur d'hygine publique de France
DGS : Direction gnrale de la sant
dATP : Dsoxyadnosine tri-phosphate
dCTP : Dsoxycytidine tri-phosphate
dGTP : Dsoxyguanosine tri-phosphate
dHPLC: Denaturing High Performance Liquid Chromatography; Chromatographie liquide haute
pression en condition dnaturante
dNTP : Dsoxynuclotides tri-phosphates
dTTP : Dsoxythymidine tri-phosphate
DVC : Dead and Viable Count ; comptage viable direct
ECS : Eau chaude sanitaire
EMA : Monoazide dthidium
EWGLI : European Working Group for Legionella Infections
FAO : Food and Agricultural Organization ; Organisation des nations unies pour lalimentation et
lagriculture
FCM : Flow Cytometer ; cytomtre en flux
FISH : Fluorescence In Situ Hybridation ; Hybridation in situ fluorescente
GT : Groupe de travail
GVPC : Glycine Vancomycine Polymyxine Cycloheximide
IDS : Immunological Double Staining ; double marquage immunologique
IMS : Sparation immuno-magntique
InVS : Institut de veille sanitaire
IRDEFA : Installations de refroidissement par dispersion deau dans un flux dair
ISO : International Standard Organization ; Organisation internationale de normalisation
LD : Limite de dtection
LPS : lipopolysaccharides
LQ : Limite de quantification
MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption Ionization ; desorption-ionisation laser assiste par matrice
mip : Macrophage Infectivity Potentiateur ; potentiateur dinfectivit des mcrophages
PCR : Polymerase Chain Reaction ; raction de polymrisation en chane
PMA : Monoazide de propidium
q-PCR : real time quantitative PCR ; PCR quantitative en temps rl
RT-PCR : Reverse Transcriptase PCR ; PCR aprs transciption inverse
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2
r : Coefficient de corrlation
TAR : tour arorfrigrante
TOF : Time-Of-Flight : temps de vol
TVC : Total Viable Count ; comptage viable total
UFC : Unit formant colonie
UG : Unit gnome
VBNC : Viable But NonCulturable ; Viable mais non cultivable
VLEP : Valeurs limites dexposition professionnelle
v-PCR : viability PCR ; PCR Viable
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Introduction
Contexte
Lincidence de la lgionellose a diminu en France depuis 2006 pour se stabiliser aux alentours de
1200 cas dclars par an (1206 cas enregistrs en 2009, BEH n31-32 du 27 juillet 2010), grce
notamment une meilleure identification des sources potentielles de contamination. Cependant, cette
identification se heurte aux limites des mthodes de dtection et de dnombrement des lgionelles
(Legionella) dans lenvironnement.
Selon la rglementation franaise actuellement en vigueur, la recherche et le dnombrement de
Legionella spp. et / ou de Legionella pneumophila :
- est obligatoire :
o dans les tours arorfrigrantes, une fois par mois pendant la priode de fonctionnement de
1
linstallation (arrts du 13 dcembre 2004) ;
o dans les eaux minrales destines des usages thrapeutiques dans les tablissements
thermaux, une fois par mois aux points dusage les plus sensibles (arrt 19 juin 2000) ;
o dans les rseaux deau chaude sanitaire des tablissements de sant, des tablissements
sociaux et mdico-sociaux dhbergement pour personnes ges, des autres tablissements
sociaux et mdico-sociaux, des htels, des rsidences de tourisme, des campings et des
er
tablissements pnitentiaires, une fois par an aux points dusage reprsentatifs (Arrt du 1
fvrier 2010) ;
er
- sera obligatoire, une fois par an aux points dusage reprsentatifs (Arrt du 1 fvrier 2010),
er
compter du 1 janvier 2012 pour les autres tablissements recevant du public.
Il est clairement indiqu dans les arrts du 13 dcembre 2004, relatifs aux installations de
er
refroidissement par dispersion d'eau dans un flux d'air soumises autorisation et du 1 fvrier 2010,
relatif la surveillance des lgionelles dans les installations de production, de stockage et de
distribution deau chaude sanitaire, que seuls les rsultats danalyse produits avec la mthode par
culture, telle que dcrite dans la norme NF T90-431 "Recherche et dnombrement de Legionella spp.
et de Legionella pneumophila par culture sur milieux gloss", sont reconnus par les pouvoirs publics.
Les valeurs cibles rglementaires, tablies en units formant colonies (UFC) par litre, reposent donc
sur la mthode par culture. Elles sont dtailles dans le chapitre "Seuils de gestion et mesures
prconises par la rglementation en vigueur".
Cette mthode par culture est galement systmatiquement mise en uvre lors dinvestigations
pidmiologiques de cas de lgionellose.
Toutefois la mthode par culture, telle que dcrite dans la norme NF T90-431, prsente certains
inconvnients :
$
le rendu des rsultats dfinitifs ncessite un dlai minimum de 8 jours aprs la mise en culture
(des rsultats intermdiaires pouvant cependant tre rendus au bout de 3 5 jours). Ce dlai
peut poser des problmes pour la gestion des installations concernes, notamment pour lever
des mesures restrictives dutilisation deau (ex : interdiction dutilisation de douches dans
lattente de rsultats ngatifs, etc.) ;
$ lensemble des diffrentes formes de Legionella potentiellement prsentes dans leau nest
pas pris en compte par cette mthode. En effet :
2
- la mthode permet le dnombrement de Legionella libres, viables et cultivables , dans
les chantillons deau ;
- elle ne permet pas le dnombrement de Legionella viables non cultivables ;
- le dnombrement par culture de Legionella contenues dans des protozoaires ou des
vsicules externes de ces protozoaires est peu document et il existe des incertitudes
quant la capacit de cette mthode les dnombrer correctement.
Face ces inconvnients, plusieurs autres techniques danalyses ont vu le jour et sont aujourdhui
3
utilises ou en cours de dveloppement par les exploitants pour lautosurveillance des installations.
1
Si, pendant une priode dau moins 12 mois continus, les rsultats des analyses mensuelles sont infrieurs 1 000 units
formant colonies par litre deau, la frquence des prlvements et analyses des Legionella spp selon la norme NF T90-431
pourra tre au minimum trimestrielle
2
Ces termes sont dfinis dans le chapitre 1.6.
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Anses
Par ailleurs de nouvelles approches bases sur des mthodes ayant fait leurs preuves pour dautres
applications ou sur des technologies mergentes apparaissent dans la littrature ou sur le march.
Pour pouvoir valuer la pertinence de chacune des mthodes disponibles, pralablement toute
tude dquivalence, il apparat ncessaire de conduire une tude des caractristiques et des
performances pour le dnombrement de Legionella dans les rseaux deau chaude sanitaire et dans
les eaux des circuits de refroidissement des tours arorfrigrantes, de manire valuer la
pertinence de leur mise en uvre en fonction du type deau analyser.
En complment de cette description du contexte, des listes des textes rglementaires, lgislatifs et
normatifs relatifs aux Legionella sont proposes en annexes 2 et 3 du prsent document.
Objet de la saisine
LAgence franaise de scurit sanitaire de lenvironnement et du travail (Afsset) a t saisie le 29
juillet 2009 par la Direction gnrale de la sant (DGS) et la Direction gnrale de la prvention des
4
risques sur les mthodes de dtection des lgionelles dans leau (Annexe 1).
Les objectifs du contrat dexpertise taient plus particulirement les suivants :
1. Dcrire les mthodes pr-analytiques (prparation de lchantillon avant analyse) et analytiques
connues pour la dtection et le dnombrement spcifique de lgionelles dans leau (culture, biologie
molculaire (PCR), immuno-dtection, etc.). Cette description avait notamment pour finalit didentifier
les questions auxquelles rpondent les mthodes et leurs limites thoriques. Elle devait tre base
sur une recherche bibliographique ;
2. Etudier la pertinence (avantages et inconvnients) de la mise en uvre de ces mthodes
analytiques pour le contrle sanitaire des eaux chaudes et le contrle rglementaire des eaux de
circuits de refroidissement des tours arorfrigrantes, en fonction de leurs besoins et contraintes
respectives :
$ dans un premier temps, cette tude devait viser analyser les avantages et inconvnients des
diffrentes mthodes, notamment sur les questions des contraintes de faisabilit technique et
des cots ;
$ dans un second temps, si des mthodes apportant une plus-value technique par rapport la
mthode par culture taient mises en vidence, la pertinence de leur mise en uvre dans le
cadre des contrles rglementaires devait tre value. Sagissant des mthodes identifies,
une rflexion pouvait notamment tre mene concernant les seuils rglementaires et, le cas
chant, leur rvision.
hypothses avances concernant la pertinence des mthodes recenses, et le cas chant le
lancement des tudes ncessaires.
Modalits de traitement : moyens mis en uvre et organisation

Lexpertise a t mene conformment aux exigences de la norme NF X 50-110 relative la qualit
en expertise (AFNOR, 2003), avec lappui du CES "Evaluation des risques lis aux eaux et aux agents
biologiques".
Un groupe de travail (GT) a t constitu en veillant notamment la comptence et lindpendance de
ses membres.
Le GT sest runi 21 reprises entre le 15 fvrier 2010 et le 14 octobre 2010. Sur la base dune
synthse bibliographique produite par lAfsset, le GT a poursuivi la collecte dlments
5
bibliographiques, procd 7 auditions formelles et analys lensemble des donnes collectes pour
formuler ses conclusions et recommandations. Ces auditions ont permis de complter les informations
recueillies dans la bibliographie, en les comparant avec les tendances et hypothses dj publies. Le
rapport tablit une distinction entre les lments issus de la bibliographie et ceux issus des auditions.
3
Surveillance ralise par les exploitants dinstallation, distinguer du contrle rglementaire, reconnu par les autorits.
LAfsset et lAgence franaise de scurit sanitaire des aliments (Afssa) ont fusionn pour donner naissance lAgence
nationale de scurit sanitaire (Anses), le 1er juillet 2010. Ainsi, la rponse la saisine de lAfsset est donne sous forme dun
rapport de lAnses.
5
Les 7 organismes auditionns sont : lIstitut Pasteur Lille (IPL) sant environnement durable, Suez environnement, Veolia
environnement, EDF, le prsident de la Commission T 90E de lAfnor, lAssociation gnrale des laboratoires d'analyse de
l'environnement (AGLAE) et des participants au projet europen Emile. Ces organismes ont t slectionns par le GT aprs
en avoir contact pralablement prs de 45 pour valuer la ncessit dune audition.
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Anses
Les travaux dexpertise du groupe de travail ont t soumis rgulirement au CES "valuation des
risques lis aux eaux et aux agents biologiques". Le rapport produit par le groupe de travail tient
compte des observations et lments complmentaires transmis par les membres du CES.
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Anses
Description et spcificits du genre Legionella
1.1
Caractristiques gnrales
Les bactries du genre Legionella appartiennent la famille des Legionellaceae. Actuellement 58

6
espces de Legionella sont identifies , dont la plus frquemment isole chez les patients est
7
Legionella pneumophila. Ces espces peuvent tre divises en srogroupes ; ainsi environ 70
srogroupes de Legionella diffrents sont actuellement connus. Pour lespce L. pneumophila, 16
srogroupes ont t dfinis ce jour. Au sein dun mme srogroupe, des sous groupes ont t
dfinis selon leurs proprits immunologiques et gnomiques (par exemple, une Legionella
8
pneumophila de srogroupe 1 peut tre de sous-type Pontiac, Philadelphie, etc.). La classification
EWGLI (European Working Group for Legionella Infections) tend homogniser la classification
dcrite ici (Luck et al. 2009).
Les bactries du genre Legionella sont des bacilles Gram ngatif arobies, qui mesurent de 0,2
0,9 m de large sur 2
20 m
de long. Elles ne sont ni capsules, ni sporules, et peuvent tre
mobiles grce 1 ou 2 flagelles polaires. Elles sont caractrises par une croissance relativement
2+
3+
lente et ont besoin pour se multiplier de L-cysteine et de Fer (Fe ou Fe ). Il a cependant t observ
sur trois espces isoles de cas cliniques (L. jordanis, L. oakridgensis, L. spiritensis) une perte de la
dpendance vis--vis de la cystine (Orrison et al. 1983).
Dans lenvironnement et le milieu hydrique en particulier, leur survie et leur croissance sont
influences par de nombreux paramtres (Avril et al. 2000; Bhopal et al. 1991; Bollin et al. 1985;
Borella et al. 2004; Ciesielski et al. 1984; Den Boer et al. 2002; Dennis et al. 1984; Fields et al. 2002;
Habicht and Muller 1988; Hoebe and Kool 2000; Keller et al. 1996; Leoni et al. 2001; Pongratz et al.
1994; Rogers et al. 1994; States et al. 1985; Stout et al. 1985; Wadowsky et al. 1985; Zacheus and
Martikainen 1994) :
$ la temprature : croissance optimale 35C, multiplication entre 20 et 45C ; survie entre 6 et
66C ;
$ le pH (tolrance dune large gamme de pH entre 5,5 et 10) ;
$ les concentrations en ions fer et zinc ;
$ les conditions hydrauliques (stagnation ventuelle de leau) ;
$ la prsence dautres microorganismes : les tudes montrent que dans des conditions
environnementales dfavorables (temprature, prsence de dsinfectant, etc.), Legionella spp
se dveloppent beaucoup mieux et plus rapidement lorsquelles sont co-cultives avec des
9
amibes. La prsence de certaines bactries et de biofilms ou de cyanobactries qui agissent
sur la prsence de nutriments dans le milieu, peut galement influer sur la suivie et/ou le
dveloppement de Legionella (Declerck 2010).
1.2
1.2.1
Association de Legionella avec dautres composantes du milieu

Association avec les protozoaires
En dehors des bactries, les eaux douces sont gnralement colonises par de nombreux
protozoaires, parmi lesquels figurent au premier rang les amibes et les cilis (Cavalier-Smith 1993;
Finlay and Esteban 1998).
http://www.dsmz.de/microorganisms/bacterial_nomenclature_info.php?genus=LEGIONELLA
Un srogroupe est thoriquement une subdivision taxonomique d'une espce base sur des caractristiques
immunologiques, savoir la prsence dpitopes antigniques reconnus spcifiquement par un srum, gnralement polyclonal
et produit chez le lapin. Toutefois, eu gard la nature polyclonale de ce srum, une certaine ractivit croise est possible
(par exemple, reconnaissance de bactries appartenant au genre mais pas l'espce concerne).
8
Un sous-type est une subdivision taxonomique base sur lidentit gntique confre par lanalyse de squence ADN dune
souche isole avec celle d'une souche de rfrence dj caractrise (par exemple dans le cas des legionelles, lors d'un
pisode contaminant antrieur, le lieu de contamination : Paris, Corby, Bellingham, Philadelphia, Knoxville, Lens, etc...)
9
Un biofilm est un systme mtastable, rsultant (1) de la multiplication des bactries fixes sur un support et du dpt de
bactries provenant de la phase eau, (2) de lrosion continue, conduisant un relargage constant de microorganismes dans la
phase eau (Ascon-Cabrera 1995; Declerck 2010; Rittman 1989). En dautres termes, la contamination bactrienne de leau dun
rseau est directement lie au biofilm et particulirement la croissance et larrachage des bactries fixes. A linverse, la
dynamique du biofilm est galement influence par la qualit de leau son contact.
7
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Anses
Les amibes sont des protozoaires de taille variant entre 10 m et 1 mm de longueur (200 -500 m en
moyenne). Elles vivent en milieu aqueux, dans lequel elles se dplacent le plus souvent par reptation
laide de pseudopodes. Certaines sont quipes de flagelles pour assurer leur mobilit. Elles se
reproduisent par fission binaire et se nourrissent par phagocytose de microalgues, de protozoaires
plus petits et de bactries (Corsaro et al. 2010). Leur implication dans le dveloppement de nombreux
micro-organismes pathognes est dsormais avre (Berk et al. 1998; Pagnier et al. 2009; Thomas et
al. 2006). Dans leur milieu naturel, les conditions affectant gnralement la croissance des amibes
sont le pH, la temprature, la salinit et la teneur en souffre (acide sulfurique) (Rodriguez-Zaragoza
1994). Les amibes sont capables de se dvelopper des tempratures trs varies, dans des plages
spcifiques chaque espce (Griffin 1972). La temprature idale moyenne de croissance en milieu
liquide pour le genre Acanthamoeba semble se situer entre 30 et 37C. Cependant, il existe des
variantes thermorsistantes susceptibles de crotre des tempratures plus leves (De Jonckheere
1980).
Les cilis sont des protozoaires binucls pouvant atteindre 2 mm de long et caractriss par la
prsence constante ou provisoire de cils vibratiles leur surface. Ils sont prsents dans les eaux
douces, saumtres et marines o ils existent sous diverses formes : formes libres nageuses, formes
fixes pdoncules, formes coloniales, formes parasitaires non pathognes ou formes symbiotiques.
Les cilis sont htrotrophes et se nourrissent de particules organiques, de bactries, d'autres cilis,
de flagells voire d'animaux microscopiques. Leurs structures orales se spcialisent selon leur rgime
alimentaire (Baroin-Tourancheau et al. 1992; Lynn and Corliss 1991).
La relation entre Legionella et protozoaires est connue depuis une trentaine dannes. Elle a
particulirement t tudie pour L. pneumophila (Rowbotham 1983), notamment avec des amibes
des genres Naegleria, Acanthamoeba (Kuiper et al. 2004; Newsome et al. 1985; Newsome et al.
1998; Tyndall and Domingue 1982; Wadowsky et al. 1991) ou des cilis de genre Tetrahymena
(Faulkner et al. 2008; Fields et al. 1984; Garduo et al. 2006). Ces protozoaires sont des htes
naturels de Legionella (Fields et al. 2002) et constitueraient mme, selon certains auteurs, leur
principal rservoir dans lenvironnement (Cirillo et al. 1994; Fields et al. 1989). En effet, les Legionella
sont capables de se multiplier de manire importante en leur sein (Holden et al. 1984; Rowbotham
1983) et il est suppos que les protozoaires, en particulier les amibes, constituent un
microenvironnement propice la multiplication bactrienne dans un milieu extrieur dfavorable (par
exemple, carenc en nutriment). La croissance de Legionella requiert en effet la prsence minimale
de nutriments spcifiques, ainsi quen tmoigne la composition particulire des milieux de culture
utiliss pour leur isolement.
Une fraction des Legionella, appeles viables non cultivables (VBNC), ne se dveloppe pas dans les
conditions de culture usuelles. Or le sjour de L. pneumophila lintrieur des protozoaires, en
particulier les amibes, permettrait de faire passer L. pneumophila dun tat viable non cultivable un
10
tat viable cultivable (Moritz et al. 2010; Oliver 2009). Ceci conduit considrer que certains
lments, ncessaires la croissance des VBNC, comme certains nutriments, ne seraient pas
prsents dans les milieux de culture, alors quils le seraient dans lenvironnement intracellulaire des
protozoaires (Fields et al. 2002).
Le maintien ou la croissance des Legionella dans les protozoaires se produit au sein de vsicules
digestives ayant des devenirs diffrents selon que lhte est une amibe ou un cili :
chez les cilis, les vsicules digestives accumulent les Legionella, lesquelles subissent ensuite
une digestion partielle. Le rsultat de cette digestion est la formation dune pelote contenant
la plupart du temps des Legionella digres et un nombre variable de Legionella intactes
potentiellement infectieuses. La pelote est ensuite relargue dans le milieu extrieur (Garduo et
al. 2006).
chez les amibes, les Legionella ingres subissent un cycle damplification intracellulaire dont le
principe a t dcrit pour L. pneumophila et lhte A. polyphaga par Robowtham. Succinctement,
des Legionella sont phagocytes et forment une vsicule digestive o elles se multiplient en
perdant leur mobilit. La vsicule perd ses capacits digestives et envahit peu peu le
cytoplasme. Elle est susceptible de se rompre, entrainant la lyse de lamibe et la libration de
Legionella redevenues mobiles. Dans certains cas, lamibe libre galement des vsicules
10
Les diffrents tats de viabilit dune bactrie sont dfinis ultrieurement dans le chapitre Signification sanitaire de la
prsence de Legionella viables non cultivables
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encore intactes dont le diamtre se situe majoritairement entre 1 et 5 m (Berk et al. 1998;
Rowbotham 1980; Rowbotham 1983; Rowbotham 1986). Ces petites vsicules sont
souponnes tre des vecteurs particulirement efficaces dinfection par les Legionella (Berk et
al. 1998; Philippe et al. 2006). En effet, leur taille les rend aptes tre inhales profondment
dans larbre bronchique et la membrane amibienne qui les entoure est suspecte favoriser leur
fusion avec la membrane des cellules de lpithlium pulmonaire (Berk et al. 1998). La survie de
ces vsicules dans lenvironnement peut tre extrmement longue (suprieure plusieurs mois),
ce qui en accentue la dangerosit (Bouyer et al. 2007).
Il est gnralement admis que la prolifration de Legionella libres dans le milieu est optimale lorsque
la temprature avoisine les 35C ou a minima lintrieur dune plage stendant de 20 et 45C
(Fields et al. 2002). Le fait que les amibes constituent un important rservoir multiplicatif suggre
fortement que lassociation amibes - Legionella est galement influence par la temprature. Il semble
dsormais tabli que L. pneumophila infecte de manire optimale les formes trophozotes
dAcanthamoeba des tempratures suprieure 25C (Berk et al. 1998; Cirillo et al. 1994;
Rowbotham 1986).
Les observations ci-dessus tendraient montrer que cest galement vers 35C que le relarguage de
vsicules par les trophozotes est optimal. Ces trophozotes amibiens sont toutefois susceptibles de
se transformer en kystes lors de lapparition de conditions dfavorables (carence en nutriments,
exposition certains agents chimiques ou baisse de temprature). Lenkystement induit une digestion
partielle des vsicules intracellulaires et paralllement un relarguage dans lenvironnement dune
fraction des vsicules non ou partiellement digres, lesquelles contiennent donc de nombreuses
Legionella infectieuses (Berk et al. 1998; Ohno et al. 2008; Schuster 1979). Il semble en effet que les
Legionella infectieuses (caractrises par une reprise de mobilit) soient susceptibles de rsister la
digestion par lamibe (Fields 1996).
De la mme manire, les amibes confrent aux Legionella quelles hbergent une protection dans un
environnement dfavorable. Cette protection augmente encore dans lamibe enkyste dont la paroi
est plus rsistante que celle des trophozotes. Elle permet aux Legionella intracellulaires dtre
protges vis--vis des tempratures trs leves, normalement ltales, voire vis--vis de la
chloration (Breiman et al. 1990; Cirillo et al. 1999; Fields et al. 2002; Holden et al. 1984; Kilvington and
Price 1990; Rowbotham 1980; Steinert et al. 2002; Thomas et al. 2004).
Le phnomne denkystement et de relarguage basse temprature (infrieure 20C) a t mis en
vidence pour L. pneumophila hberge par A. castellanii (Ohno et al. 2008). Ceci suggre que si une
hausse de temprature favorise laugmentation de Legionella libres dans le milieu en stimulant leur
croissance, une baisse de temprature favorise galement un accroissement de leur population dans
lenvironnement et potentiellement de dangerosit par un mcanisme non prolifratif, li au relarguage
massif des vsicules amibiennes suite lenkystement. Berk et al. suggrent quun processus
similaire peut tre provoqu par ladjonction de biocides (Berk et al. 1998).
Les protozoaires constituent un rservoir avr de Legionella et contribuent leur protection contre
les stress environnementaux (notamment les traitements de dsinfection), favorisent leur
multiplication et leur revivification, et semblent accrotre leur pathognicit pour lhomme. Compte tenu
de ces lments, la prsence de protozoaires est un facteur prendre en considration lors du suivi
des installations, en particulier la suite dun traitement de dsinfection, et pourrait tre lorigine
dune recontamination plus rapide de linstallation.
1.2.2
Association avec le biofilm
L. pneumophila est capable de survivre dans les biofilms prsents lintrieur de canalisations
(Declerck 2010; Fields et al. 2002; Frre 2009; Kuiper et al. 2004; Moritz et al. 2010). Une tude de
Rogers et al., a montr que la proportion de L. pneumophila cultivables dans le biofilm et dans la
phase planctonique varie avec la temprature (Rogers et al. 1994). Selon cette tude o les
Legionella ont t dnombres par culture dans une installation simulant une canalisation deau
potable 20C, L. pneumophila reprsente une faible proportion de la population bactrienne
cultivable (0,1%), aussi bien dans la phase planctonique que dans le biofilm. A 40C, L. pneumophila
reprsente 12 % des bactries cultivables de la phase planctonique et 50 % du biofilm. A 50C, L.
pneumophila, est encore capable de survivre, mais ne reprsente plus que 0,7 % des bactries
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cultivables de la phase planctonique et 0,1 % du biofilm. A 60C la bactrie est indtectable aussi bien
dans le biofilm que dans la phase planctonique.
Selon certains auteurs L. pneumophila peut se multiplier dans ces biofilms en prsence de
protozoaires comme lamibe Hartmannella vermiformis (Abu Kwaik et al. 1998; Kuiper et al. 2004; Lau
and Ashbolt 2009; Moritz et al. 2010; Murga et al. 2001). Certains auteurs supposent galement que
le complexe nutritif constitu par un biofilm peut permettre une multiplication de Legionella en dehors
dune cellule de protozoaire hte. Cette dernire hypothse reste cependant encore vrifier (Fields
et al. 2002; Rogers and Keevil 1992).
Ainsi L. pneumophila peut avoir t limine de leau libre et persister dans les biofilms des
canalisations, probablement si un protozoaire hte de Legionella y est galement prsent, voire peuttre mme sy multiplier en labsence de protozoaire hte. Lorsquelle est rvle par une analyse par
culture, labsence de L. pneumophila dans un prlvement deau ne signifierait donc pas
ncessairement que L. pneumophila est totalement absente du rseau dans lequel le prlvement a
t effectu. Cette mise en garde, lgitime pour L. pneumophila, peut probablement tre tendue
tout le genre.
Le biofilm constitue un rservoir avr de Legionella et contribue leur survie et leur protection contre
les stress environnementaux, notamment les traitements. De surcrot, il favorise le dveloppement de
nombreux protozoaires. Compte tenu de ces lments, la prsence de biofilm est un facteur prendre
en considration lors du suivi des installations et pourrait galement contribuer la recontamination
plus rapide de linstallation, aprs un traitement de dsinfection.
1.3
Mcanismes conduisant la contraction dune lgionellose
Chez lHomme, la contamination par les bactries du genre Legionella seffectue par linhalation dun
arosol compos de fines gouttelettes deau contamine. Linfectiosit dun arosol est lie
diffrents paramtres : ses caractristiques physiques, dont la taille des gouttelettes, sa concentration
en Legionella et leur capacit de survie dans larosol. Ainsi, il est admis quun arosol ne peut tre
infectieux que si les gouttelettes deau qui le composent sont suffisamment petites pour atteindre les
alvoles pulmonaires (diamtre infrieur ou gal 5 m) (Bollin et al. 1985; Girod et al. 1982) et assez
grandes pour contenir une ou plusieurs bactries (diamtre suprieur 2 m) (Baron and Willeke
1986).
Aprs avoir pntr dans larbre pulmonaire, L. pneumophila tablit un foyer infectieux au sein de
lalvole pulmonaire o la bactrie interagit avec les macrophages et les cellules pithliales (Mody et
al. 1993). Sur les modles exprimentaux animaux, un important accroissement de linoculum
me
me
72
heure aprs linoculation.
bactrien est observ dans le cul de-sac alvolaire, jusqu la 48
Aprs une priode de multiplication des L. pneumophila, la cellule infecte est lyse, causant
dimportantes lsions au niveau de la barrire alvolo-capillaire. Ceci peut expliquer la dissmination
de L. pneumophila dautres zones pulmonaires et la dcompartimentation extrapulmonaire par voie
hmatogne, un mcanisme mis en vidence in vivo (Ader et al. 2008; Brieland et al. 1997).
1.4
Pertinence du dnombrement de Legionella versus dtection
Lattention sest porte sur le genre Legionella en 1976, quand 182 personnes logeant dans un htel
de Philadelphie ont prsent des infections respiratoires provoquant 34 dcs. La plupart des
me
convention de l'American Legion, do le nom "maladie du
malades participaient la 56
lgionnaire".
La dose infectante chez lhomme est inconnue. Seules sont connues les doses infectantes obtenues
sur des modles exprimentaux animaux reproductibles et valids : cobayes, souris consanguines et
primates (Ader et al. 2008; Berendt et al. 1980; Breiman et al. 1990; Brieland et al. 1997).
Dans ces diffrentes tudes, linfection se fait par le biais dun arosol infect ou par instillation intratrachale directe. Dans le cadre de ces tudes, la biomasse bactrienne ncessaire pour induire une
infection in situ au contact de linterface pithliale alvolaire de lanimal expos a pu tre value :
6
$ un inoculum de 10 UFC provoque une lgionellose de type fivre de Pontiac, avec une survie
de 100% des animaux exposs ;
7
$ un inoculum de 10 UFC provoque une lgionellose chez les animaux exposs avec un taux
de mortalit proche de celui observ chez de lHomme soit 10 25% ;
8
$ un inoculum suprieur ou gal 10 UFC est systmatiquement ltal pour lanimal.
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Toutefois, ces observations ne prennent pas en compte certains paramtres tels que :
$ le taux de transfert bactrien air-alvoles ;
$ les modifications anatomo-fonctionnelles induites par les pathologies broncho-pulmonaires
chroniques, dont le tabagisme est le principal promoteur, qui facilitent limplantation
bactrienne.
Les scientifiques saccordent sur les points suivants : le dveloppement et la gravit de la maladie
sont conditionns par le niveau dexposition. Plus larosol vhicule un nombre important de
Legionella viables, plus linoculum atteignant les voies ariennes infrieures serait important et plus
cela aurait un impact sur la morbi-mortalit. Au-del dune valeur critique dexposition reprsentant la
quantit minimale de bactries atteignant lalvole ncessaire linduction dune maladie, il existerait
11
une relation dose-rponse proportionnelle entre exposition et dveloppement de la maladie
traduisant un "effet inoculum". Ainsi, il apparat par exemple que plus la quantit de Legionella rejete
dans les panaches des tours arorfrigrantes est importante et plus le risque infecieux pour les
populations environnantes est lev (Berendt et al. 1980; Breiman et al. 1990; Brieland et al. 1997).
Compte tenu de ces lments, il apparat important de dnombrer les Legionella dans les chantillons
deau et de ne pas se limiter leur dtection.
1.5
Pertinence de la recherche de L. pneumophila versus L. spp
En France, les donnes de lInVS sur 11147 cas confirms de lgionellose entre 1998 et 2008
montrent que 88 % des cas diagnostiqus par lensemble des tests dantignurie, de srologie et de
culture, sont dus Legionella pneumophila srogroupe 1. Pour 18 % de lensemble des cas
12
diagnostiqus, des prlvements pulmonaires ont permis disoler des souches de Legionella
dorigine clinique. Parmi ces souches, lespce Legionella pneumophila est identifie dans 98 % des
cas et le srogroupe 1 dans 93 % des cas (Campese et al. 2010).
En Europe, les donnes sur 10 715 cas dclars de lgionellose en 2007 et 2008 rapports par 34
pays montrent que 79,6% des cas taient dus L. pneumophila srogroupe 1, 15 % un autre
srogroupe de L. pneumophila et 5,4% une autre espce de Legionella. Sur les 1042 isolats
disponibles, 86,0% taient des L. pneumophila srogroupe 1, 7.5% taient des L. pneumophila
srogroupes 2-16, avec une prdominance du srogroupe 3 (3,2%) et du srogroupe 6 (1,2%), et
3,6% taient des L. pneumophila de srogroupe inconnu ou non identifies. Dix neuf isolats taient
identifis comme une espce Legionella non pneumophila: L. anisa (n=2), L. bozemanii (n=4), L.
dumoffii (n=1), L. gormanii (n=1), L. longbeachae (n=9), L. maceachernii (n=1), L. wadsworthii (n=1).
Pour 14 isolats, lespce na pas t identifie (Joseph et al. 2010).
Dans une tude internationale ralise par Yu et al. (Yu et al. 2002) sur 508 cas confirms par culture,
lespce L. pneumophila constituait 91,5% des isolats et le srogroupe 1 tait responsable de 84,2 %
des cas mondiaux.
La prdominance de L. pneumophila srogroupe 1 en pathologie humaine ne semble pas lie une
prdominance environnementale. Une tude franaise montre que ce srogroupe reprsente moins
de 30 % des Legionella identifies dans lenvironnement (Doleans et al. 2004). Elle pourrait tre lie
une plus grande infectiosit de ce srogroupe pour lhomme. Par ailleurs, il est galement dmontr
que la plupart des individus atteints de lgionellose due une espce autre que L. pneumophila
souffrent dune immunodpression prexistante svre (David et al. 2006; Doleans et al. 2004; Harris
et al. 1998; Joly et al. 1986; Lee et al. 2009; Meenhorst et al. 1985; Muder and Yu 2002).
Une tude a t mene sur 217 souches de Legionella pneumophila et 32 Legionella non
13
pneumophila, laide de puces ADN. Elle a montr quun cluster de gnes de biosynthse des
14
lipopolysaccharides (LPS) dterminant le srogroupe 1 tait prsent dans des profils gntiques trs
11
Relation spcifique dune voie entre des niveaux dexposition un agent dangereux et lindice observ dun effet donn.
13
Des gnes appartenant la mme famille peuvent dans certains cas tre groups les uns derrire les autres au niveau d'une
mme rgion chromosomique, ils forment alors un cluster.
14
Composant de la paroi bactrienne des bactries Gram ngatif
12
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diffrents. Cela suggre que le LPS du srogroupe 1 joue un rle dans la haute prvalence de la
lgionellose humaine (Cazalet et al. 2010).
Au total, la littrature rapporte que, dans le monde, une vingtaine despces de Legionella autres que
pneumophila ont t impliques dans au moins un cas de lgionellose. Les plus souvent identifies
chez les patients atteints de lgionellose sont L. longbeachae (3,9 % des cas) et L. bozemanii (2,4 %
des cas). Except en Australie et en Nouvelle-Zlande o L. longbeachae devance L. pneumophila et
est lorigine de plus de cas.
En effet, alors que L. pneumophila est la principale cause de lgionellose en Europe et aux USA, L.
longbeachae est responsable denviron 30 % des cas de lgionellose en Australie, Nouvelle Zlande,
Nouvelle Caldonie (Yu et al. 2002) et denviron 50 % au sud de lAustralie et en Thalande (Phares et
al. 2007). A la diffrence des autres espces de Legionella, dont le rservoir principal est leau
environnementale, L. longbeachae est frquemment isole dans les sols terreux et infecte
principalement des individus exposs ces sols (Fields et al. 2002).
Lensemble des tests de diagnostic disponibles actuellement (culture, srologie, antignurie) favorise
le diagnostic des cas de lgionellose L. pneumophila et notamment du srogroupe 1 (dtection des
antignes urinaires). Ainsi, le dveloppement des mthodes de dtection molculaires (q-PCR) pour
le diagnostic, partir de prlvements pulmonaires, pourrait potentiellement augmenter le nombre de
cas lis Legionella non pneumophila (Diederen et al. 2008; Yang et al. 2010), sans pour autant en
modifier fortement lpidmiologie.
Compte tenu de ces lments, les informations ncessaires pour le dnombrement de Legionella,
dans les diffrents contextes danalyses, sont les suivantes :
-
pour la gestion des risques sanitaires, concernant la population gnrale, le dnombrement de L.

pneumophila peut tre suffisant, compte tenu de la raret des cas de lgionelloses attribus
dautres espces de Legionella. Le dnombrement slectif des L. pneumophila du srogroupe 1
peut apporter une information supplmentaire (ce srogroupe tant responsable de 85 % des cas
de lgionellose), mais ne peut remplacer le dnombrement des L. pneumophila ;
dans la mesure o les individus atteints dune immunodpression svre peuvent tre infects
par L. pneumophila mais galement par dautres espces de Legionella, dans le cas particulier
de ces patients dits haut risque , (au sens de la circulaire DGS 2002 243, du 22 avril
15
2002 ), le dnombrement des L. spp apporte une information supplmentaire, notamment
lorsquelle est associe aux mesures de suivi et de traitement de leau spcifiques ce contexte,
16
dj envisages dans la rglementation en vigueur ;
pour la gestion des installations deau chaude sanitaire et des tours arorfrigrantes, le
dnombrement de L. spp apporte des informations relatives lcosystme des installations de la
mme importance que celles apportes par le dnombrement de L. pneumophila.
1.6
Signification sanitaire de la prsence de Legionella viables non cultivables
En prambule ce chapitre, il est important de poser quelques dfinitions relatives aux diffrents tats
de viabilit des bactries. Le concept de viabilit des bactries est difficile apprhender et de
nombreuses dfinitions sont possibles (Barer et al. 2000; Bogosian and Bourneuf 2001; Joux and
Lebaron 2000; Kell et al. 1998; McDougald et al. 1998; Oliver 2005). Pour le prsent rapport, le
groupe de travail adopte trois dfinitions bases sur celles proposes par (Ducret 2009).
Viabilit :
La viabilit peut tre associe la capacit dune bactrie se multiplier ou exprimer des caractres
physiologiques qui suggrent lexistence dune intgrit membranaire ; dune activit mtabolique
(activit enzymatique intracellulaire, activit respiratoire, etc.).
15
Les patients dits patients haut risque sont les immunodprims svres, et particulirement les immunodprims aprs
transplantation ou greffe d'organe et les immunodprims par corticothrapie prolonge (0,5 mg/kg de prednisone pendant
30 jours ou plus, ou quivalent) ou rcente et haute dose (c'est--dire suprieure 5 mg/kg de prednisone pendant plus de
5 jours)
16
distribution deau chaude sanitaire et Circulaire DGS/SD7A/SD5C/DHOS/E4 n 2002/243 du 22 avril 2002 relative la
prvention du risque li aux lgionelles dans les tablissements de sant
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Cultivabilit :
La cultivabilit est la facult que prsente une bactrie former en un temps donn, et sur un milieu
de culture glos dfini une colonie visible par lobservateur. Cette dfinition intgre des notions de
dveloppement, de temps, de sensibilit, et de qualit du milieu de culture utilis. Dans les cultures en
milieu liquide, la croissance se traduit par une turbidit du milieu.
Viable non cultivable :
Ltat viable mais non cultivable (VBNC) caractrise les bactries qui perdent leur cultivabilit tout en
conservant une certaine forme de viabilit se traduisant par la conservation de lintgrit structurale
et/ou des activits mtaboliques. La prsence de bactries viables non cultivables est gnralement
observe en association avec des conditions environnementales particulires ou lie des stress. La
perte de cultivabilit peut tre une raction adaptative ces conditions ou au contraire un processus
dgnratif ou encore inhrent la mthode de culture utilise. Dans certaines conditions de culture
ou la suite des modifications de lenvironnement les bactries viables non cultivables peuvent
retrouver leur cultivabilit.
Dans le prsent rapport, le groupe de travail prcise que seront appeles non viables ou
mortes , toutes les bactries qui ne sont pas considres comme viables ou viables non cultivables
selon les dfinitions prcites.
Diffrents facteurs chimiques et environnementaux sont souponns de provoquer ltat VBNC dune
bactrie Gram ngatif non sporulante, dont lindisponibilit des nutriments ou les traitements
chimiques et thermiques de leau (Oliver 2000; Oliver 2009). Lexistence dun tat VBNC a t dcrite
de longue date pour L. pneumophila (Hussong et al. 1987; Paszko-Kolvaa et al. 1992). En plus de la
capacit survivre dans les biofilms et au sein des protozoaires, lentre en tat VBNC constitue pour
L. pneumophila une forme de survie dans des conditions environnementales dfavorables. Sa
rsistance relle aux traitements chimiques lorsquelle est sous cette forme nest pas connue, mais
celle-ci serait potentiellement accrue par rapport celle de la forme cultivable. En effet, une
augmentation de la rsistance des substances chimiques telles que des antibiotiques et une
capacit amliore surmonter divers stress thermiques ou acides, ont t dcrits pour de
nombreuses espces bactriennes lorsquelles sont sous forme VBNC (Oliver 2009).
Seules les Legionella viables peuvent tre lorigine dinfections humaines et reprsenter un enjeu
sanitaire. Parmi les Legionella viables, il est difficile de dmontrer linfectiosit des Legionella VBNC,
car il nest actuellement pas possible de dmontrer que 100 % des bactries sont VBNC dans une
culture travaille pour en produire (Delgado-Viscogliosi et al. 2005). Il est toutefois probable que ces
dernires puissent reprsenter un risque sanitaire, car elles peuvent retrouver leur capacit de
multiplication lorsque les conditions sont favorables (Bej et al. 1991; Delgado-Viscogliosi et al. 2009;
Dusserre et al. 2008; Hwang et al. 2006). De plus, Steinert et al. ont dmontr, ds 1997, que les L.
pneumophila VBNC pouvaient retrouver leur cultivabilit au contact damibes de lespce
Acanthamoeba castellanii (Steinert et al. 1997). Garcia et al. ont galement montr que L.
pneumophila pouvait retrouver sa cultivabilit, perdue aprs un traitement de dsinfection au chlore,
par un passage dans lamibe Acanthamoeba polyphaga (Garcia et al. 2007; Oliver 2009).
Lexistence de formes VBNC pourrait expliquer en partie les recontaminations rapides parfois
observes aprs le traitement dun circuit deau chaude sanitaire par choc thermique ou chloration
(Steinert et al. 1998; Thomas et al. 2004), alors que la recherche de Legionella par culture est
ngative. Pour valuer leur rle exact, il est galement ncessaire de prendre en compte une possible
prsence de Legionella (cultivable ou non) dans le biofilm ou dans les amibes (Allegra et al. 2008).
Compte tenu de ces lments, le risque associ la prsence de formes VBNC dans un chantillon
deau doit tre pris en considration dans linterprtation des rsultats.
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Anses
Dfinitions des paramtres de caractrisation et de choix des mthodes

danalyses
2.1
Paramtres de performances
Les mthodes danalyse doivent tre choisies sur la base de leurs caractristiques de performances.
Larrt du 17 septembre 2003 relatif aux mthodes d'analyse des chantillons d'eau et leurs
caractristiques de performances et la circulaire DGS/SD7A n 2003-445 du 17 septembre 2003
concernant les modalits d'application de cet arrt, apportent des prcisions sur ces paramtres de
performances. Une analyse des dfinitions de ces paramtres proposes dans lannexe III de la
directive n98/83, relative la qualit des eaux destines la consommation humaine, ainsi que dans
17
la norme XP T90-210 de dcembre 1999 , y est notamment propose pour la justesse, la fidlit et
les limites de dtection et de quantification.
Depuis, la norme XP T90-210 a t rvise et remplace par la norme NF T90-210 de mai 2009.
Cette norme intgre des dfinitions concernant les paramtres permettant dvaluer les performances
des mthodes danalyse physico-chimiques appliques au domaine de leau pour les paramtres
chimiques, notamment pour les termes : exactitude, fidlit, justesse, cart-type de rptabilit, carttype de fidlit intermdiaire, limite de dtection, limite de quantification. Certains de ces paramtres
sont cits dans les annexes II et V de larrt du 17 septembre 2003. Les paramtres
microbiologiques sont voqus, mais sans prcision sur dventuelles exigences de performance.
Il existe des lignes directrices pour valider une mthode danalyse microbiologique (ISO/TR
13843:2000), mais leur application est limite la validation de mthodes bases sur le comptage
direct de particules microbiennes au microscope ou sur la quantification des cellules capables de se
multiplier sur un milieu de culture. Ces lignes directrices ne sont pas applicables pour la validation de
mthodes bases sur la dtection dune activit de microorganismes par dautres principes que celui
de la culture. Il semble donc dlicat den extraire des paramtres de performance permettant de
caractriser lensemble des mthodes de dtection et de quantification de Legionella dans leau.
Les critres dordre mathmatique, permettant dtablir lquivalence de mthodes analytiques
microbiologiques, sont distinguer des paramtres de performances de ces mmes mthodes. Le
prsent chapitre ne traite pas de ces critres mathmatiques tels que dcrit dans la norme ISO
17994:2004(E). Ces critres sont abords dans le chapitre 8.
Pour chaque paramtre voqu dans ce chapitre, dans un souci de clart, une dfinition a t choisie
par le groupe de travail sur la base de la bibliographie et de son expertise.
2.1.1
Justesse
La justesse, au sens de la norme XP T90-210 correspond lexactitude telle que dfinie dans la
directive 98/83 : "l'erreur systmatique gale la diffrence entre la valeur moyenne d'un grand
nombre de mesures rptes et la valeur exacte".
Elle est exprime en pourcentage de la valeur de rfrence. Elle se dtermine soit par application du
paragraphe "justesse" de la norme XP T90-210 de dcembre 1999 (paragraphe 6.3), soit par
l'utilisation de matriaux de rfrence certifis ou la participation des essais inter-laboratoires.
Le projet de norme exprimentale XP T90-465-1 "Protocole d'estimation de l'incertitude de mesure
associe un rsultat d'analyse pour les mthodes de dnombrement microbiologiques", du 15 fvrier
2010, dfinit la notion de justesse comme "ltroitesse de l'accord entre la valeur moyenne obtenue
partir d'une large srie de rsultats d'essais et une valeur de rfrence accepte."
Selon la norme NF T90-210 de mai 2009, comme dans le projet de norme exprimentale XP T90-4651 du 15 fvrier 2010, lexactitude est "ltroitesse daccord entre des rsultats et la valeur de
rfrence accepte. Le terme exactitude, appliqu un ensemble de rsultats, implique une
combinaison de composantes alatoires (fidlit) et dune erreur systmatique commune ou dun
composant biais (justesse)."
17
Norme XP T90-210 Qualit de l'eau - Protocole d'valuation initiale des performances d'une mthode dans un laboratoire
de dcembre 1999
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Anses
Le protocole Afnor "Protocole de validation dune mthode alternative commerciale par rapport une
mthode de rfrence", dans sa version "Rvision 0", adopte le 28 juillet 2008, introduit galement la
notion dexactitude relative, qui correspond au niveau de correspondance entre la rponse obtenue
avec la mthode de rfrence et la rponse obtenue avec la mthode alternative sur les mmes
chantillons.
La dfinition retenue est : la justesse (ou exactitude) est ltroitesse daccord entre des rsultats et
la valeur vraie. Lexactitude relative est ltroitesse daccord entre des rsultats et la valeur de
rfrence accepte.
2.1.2
Fidlit
La fidlit au sens de la norme XP T90-210 de dcembre 1999 correspond la prcision telle que
dfinie dans la directive 98/83 : "L'erreur alatoire est exprime en gnral comme l'cart-type (
l'intrieur du lot et entre les lots) de l'ventail des rsultats sur la moyenne".
Dans la norme NF T90-210 de mai 2009, comme dans le projet de norme exprimentale XP T90-4651 du 15 fvrier 2010, la fidlit est dfinie par "ltroitesse daccord entre des rsultats dessai
indpendants obtenus sous des conditions stipules. Elle dpend uniquement de la distribution des
erreurs alatoires et na aucune relation avec la valeur vraie ou spcifie". La fidlit est gale deux
fois le coefficient de variation de reproductibilit intra-laboratoire d'un grand nombre de mesures
reproduites sur un chantillon d'eau naturelle prsentant une concentration en analytes gale la
valeur paramtrique. Elle est exprime en pourcentage de la valeur paramtrique.
mthode de rfrence", dans sa version "Rvision 0", adopte le 28 juillet 2008, dfinit :
- la reproductibilit comme "ltroitesse de laccord entre les mesurages successifs de la mme
quantit, effectus dans les conditions de reproductibilit".
- la rptabilit comme "ltroitesse de laccord entre les mesurages successifs de la mme
quantit, effectus dans les mme conditions de mesurage".
Le projet de norme exprimentale XP T90-465-1 du 15 fvrier 2010, reprend la mme dfinition de la
rptabilit, en prcisant que selon les pratiques du laboratoire, plusieurs techniciens peuvent
travailler au sein dune mme srie analytique et quil n y a donc pas lieu de restreindre la notion de
rptabilit lanalyse par un seul technicien.
Ce projet de norme propose par contre une dfinition lgrement diffrente de la reproductibilit :
"ltroitesse de laccord entre les rsultats des mesurages de la mme quantit, effectus dans des
conditions de mesurage variables".
Selon la norme XP T90-210 de dcembre 1999, la reproductibilit intra-laboratoire est apprcie
en rptant des analyses dans un seul laboratoire avec la mme mthode, en faisant intervenir
plusieurs oprateurs ou instruments, et en particulier, en effectuant les mesures des dates
diffrentes.
La norme NF T90-210 de mai 2009 dfinie galement :
- lcart-type de rptabilit comme "lcart-type de nombreuses rptitions obtenues dans un
seul laboratoire par un mme oprateur sur un mme instrument, cest--dire dans des conditions
de rptabilit."
- Lcart-type de fidlit intermdiaire comme "lcart-type de rptitions obtenues dans un
mme laboratoire dans des conditions de fidlit intermdiaire, cest--dire avec des
changements de conditions, parmi lesquelles : oprateur, talonnage, quipements,
environnement, temps coul entre les mesures".
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Anses
Les dfinitions retenues sont :

-
la fidlit (ou prcision) est ltroitesse daccord entre des rsultats dessais indpendants
obtenus sous des conditions stipules. Elle dpend uniquement de la distribution des erreurs
alatoires et na aucune relation avec la valeur vraie ou spcifie ;
la rptabilit est ltroitesse de laccord entre les mesurages successifs de la mme quantit,
effectus dans les mmes conditions de mesurage ;
la reproductibilit est ltroitesse de laccord entre les mesurages successifs de la mme

quantit, effectus dans des conditions de mesurage variables.
2.1.3
Sensibilit
Les deux principaux paramtres qui permettent de mesurer la sensibilit dune mthode analytique
sont ses limites de dtection et le cas chant de quantification.
Les limites de dtection et de quantification des mthodes dpendent en partie du mode de
concentration de lchantillon qui est souvent le mme quelles que soient les techniques de dtection
utilises ensuite (les deux techniques de concentration les plus rpandues en routine sont la filtration
et la centrifugation). Ainsi, pour comparer les limites de dtection et de quantification des mthodes
analytiques, il est important de savoir si les valeurs affiches tiennent compte de ltape de
concentration ou strictement de la mthode de dnombrement elle-mme.
2.1.3.1 Limite de dtection
Selon la directive 98/83/CE, la limite de dtection correspond "3 fois l'cart-type relatif l'intrieur du
lot d'un chantillon naturel contenant une concentration peu leve du paramtre, soit 5 fois l'carttype relatif l'intrieur du lot d'un chantillon vierge".
La dfinition propose dans la circulaire du 13 septembre 2003 est "la plus petite quantit d'un analyte
examiner dans un chantillon, pouvant tre dtecte et considre comme diffrente du blanc (avec
une probabilit d'erreur donne), mais non ncessairement quantifie".
Quasi identique cette dernire, la dfinition propose dans la norme NF-T90-210 de mai 2009 est la
"plus petite quantit ou concentration dun analyte dans lchantillon dessai qui peut tre distingue
de manire fiable du zro".
Selon le protocole Afnor "Protocole de validation pour kits de dtection et de dnombrement de
Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification gnique par q-PCR", dans sa
version "Rvision 0", adopte le 26 septembre 2006, "lestimation de la limite de dtection PCR
consiste connatre le plus petit nombre dunits gnome gnrant un rsultat positif (une
amplification) au seuil de confiance de 90 % selon le mode opratoire du laboratoire".
Selon le protocole Afnor "Protocole de validation dune mthode alternative commerciale par rapport
une mthode de rfrence", dans sa version "Rvision 0", adopte le 28 juillet 2008, qui se rfre au
projet de norme XP T90-465-1, la limite de dtection correspond au "niveau de charge bactrienne le
18
plus faible pour lequel la probabilit dun rsultat positif (observation dau moins un germe) est
suprieur ou gale 95% ou 99%".
La dfinition retenue est : la limite de dtection est la plus petite quantit d'un analyte examiner
dans un chantillon, pouvant tre dtecte et considre comme diffrente du blanc (avec une
probabilit d'erreur donne), mais non ncessairement quantifie. Pour une limite de dtection
donne, il est important de prciser la probabilit dun rsultat positif (observation dau moins un
micro-organisme) dans un chantillon contenant le micro-organisme recherch.
18
Selon une loi de probabilit thorique de type Poisson ou binomiale ngative.
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Anses
2.1.3.2 Limite de quantification
Selon la norme XP T90-210, c'est "la plus petite grandeur d'un analyte examiner dans un chantillon
pouvant tre dtermine quantitativement dans des conditions exprimentales dcrites dans la
mthode avec une variabilit dfinie (coefficient de variation dtermin)".
La circulaire du 13 septembre 2003 prcise quelle correspond "la plus petite valeur partir de
laquelle un rsultat d'analyse peut tre rendu avec une fidlit satisfaisante".
La dfinition propose dans la norme NF-T90-210 de mai 2009 reprend les lments des ces deux
dfinitions : "plus petite grandeur dun analyte examiner dans un chantillon pouvant tre
dtermine quantitativement dans des conditions exprimentales dcrites dans la mthode avec une
exactitude dfinie".
Elle est exprime dans l'unit du paramtre et peut tre value selon le principe de calcul dfini au
paragraphe 5.2. de la norme franaise NF T90-210.
Selon le protocole Afnor "Protocole de validation pour kits de dtection et de dnombrement de
Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification gnique par PCR", dans sa
version "Rvision 0", adopte le 26 septembre 2006, lestimation de la limite de quantification q-PCR
consiste connatre le plus petit nombre dunits gnome gnrant un rsultat quantifiable au seuil de
confiance de 95 % selon le mode opratoire du laboratoire.
La dfinition retenue est : la limite de quantification est la plus petite valeur partir de laquelle un
rsultat d'analyse peut tre rendu avec une fidlit satisfaisante. Pour une limite de quantification
donne, il est important de prciser le seuil de confiance auquel la mthode est capable de produire
un rsultat quantifiable.
2.1.4
Spcificit et slectivit
Aux quatre paramtres de performance dj voqus, particulirement pour les mthodes danalyse
microbiologiques, il est intressant, dajouter la spcificit et/ou la slectivit.
Selon la norme XP T90-210 de dcembre 1999, "la spcificit est la proprit dune mthode
convenir exclusivement la dtermination de la grandeur mesurer, avec la garantie que le signal
mesur provient exclusivement de la grandeur mesurer".
Dans le protocole Afnor "Protocole de validation dune mthode alternative commerciale par rapport
une mthode de rfrence", dans sa version "Rvision 0", adopte le 28 juillet 2008 :
- la slectivit est dfinie comme "une mesure du degr de non-interfrence en prsence
danalytes non cibls. Une mthode est slective si elle peut tre utilise pour dtecter lanalyte
recherch et sil est certain que le signal dtect peut tre gnr uniquement par lanalyte
concern" ;
- la spcificit relative est dfinie comme "la capacit de la mthode alternative ne pas dtecter
lanalyte lorsque la mthode de rfrence ne le dtecte pas".
Une mthode est slective si elle permet de slectionner un vnement parmi dautres. Cest une
mesure de capacit intrinsque.
Une mthode est spcifique si elle donne le mme rsultat que la mthode de rfrence. Cest une
mesure comparative.
Lutilisation de "spcifique" la place de "slective" est de fait un abus de langage courant en biologie.
Il est nanmoins consacr par lusage dans nombres de cas o la spcificit et la slectivit sont des
proprits requises simultanment (on parle danticorps, de sondes, damorces, de marqueur
spcifiques) et confrent la chose dsigne une unicit.
Lorsque le terme sapplique strictement aux caractristiques dune mthode, les dfinitions retenues
sont :
la slectivit est une mesure du degr de non-interfrence en prsence danalytes non cibls ;
la spcificit est la capacit de la mthode ne pas dtecter lanalyte lorsquil nest pas
prsent ;
la spcificit relative est la capacit de la mthode alternative ne pas dtecter lanalyte
lorsque la mthode de rfrence ne le dtecte pas.
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Anses
2.1.5
Rendement
Dans la norme FD ENV ISO 13843, doctobre 2001 : "Qualit de l'eau - Lignes directrices pour la
validation des mthodes microbiologiques", le rendement est le terme gnral dsignant le nombre de
particules estimes dans une prise dessai ou dans un chantillon, sachant quil y a un nombre rel
(mme s'il est inconnu) de particules dont 100 % ou moins est "rcupr" par le dtecteur (FD ENV
ISO 13843).
Selon la circulaire DGS/SD7A n2003-445 du 17 septembre 2003 concernant les modalits
d'application de l'arrt relatif aux mthodes d'analyse d'chantillons d'eau et leurs caractristiques
de performances, "afin d'tre valides, les mthodes utilises devront faire apparatre un rendement
d'extraction compris entre 60 % et 120 %". Il est prcis dans ce texte que des techniques
quantitatives valides permettent de quantifier les molcules recherches avec une justesse et une
fidlit acceptables par rapport aux exigences de l'arrt du 17 novembre 2003.
La dfinition retenue pour le rendement dune mthode analytique est : lexpression en pourcentage
du nombre de particules dtectes dans une prise dessai ou dans un chantillon, rapport au nombre
rel de particules prsentes.
2.1.6
Linarit
mthode de rfrence", dans sa version "Rvision 0", adopte le 28 juillet 2008, introduit, dans le cas
des mthodes quantitatives, la notion de linarit. Celle-ci correspond laptitude de la mthode,
pour une matrice donne, fournir des rsultats proportionnels la quantit danalyte prsente dans
lchantillon, c'est--dire qu une augmentation de lanalyte correspond une augmentation linaire ou
proportionnelle des rsultats.
La dfinition retenue est : la notion de linarit correspond laptitude de la mthode, pour une
matrice donne, fournir des rsultats proportionnels la quantit danalyte prsente dans
lchantillon.
2.2
Autres paramtres de choix dune mthode analytique
Dans le cadre du choix dune mthode analytique, sa performance est dterminante. Cependant,
dautres paramtres peuvent galement savrer dterminants en fonction du contexte. Sans que
cette liste ne soit exhaustive, quelques-uns sont signals dans le prsent chapitre.
Pour complter cette approche, le lecteur pourra galement se rfrer aux normes suivantes :
-
NF ISO 3534-1 : Statistique. Vocabulaire et symboles Partie 1 : probabilit et termes statistiques

gnraux.
PR EN ISO 16140 : Microbiologie des aliments - Protocole pour la validation des mthodes
alternatives - Partie 1: Terminologie pour la validation des mthodes ; Partie 2: Protocole pour la
validation des mthodes propritaires par rapport une mthode de rfrence.
2.2.1
Rapidit
Pour tudier des mthodes analytiques potentiellement utilisables en routine, dans un cadre
rglementaire, la rapidit, semble tre un paramtre de performance important prendre en compte
(FAO 1997).
2.2.2
Champ d'application
Le champ dapplication est la gamme de matrices auxquelles s'appliquent les caractristiques de

performance (FAO 1997).
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Anses
2.2.3
Robustesse
Selon la norme FD ENV ISO 13843, la robustesse est linsensibilit dune mthode danalyse aux
faibles modifications de la mthode. Elle correspond galement la "fiabilit" telle que dfinie par la
FAO dans un rapport de 1997, qui la dfinie comme la "solidit, non-dpendance relative l'gard des
comptences de l'oprateur".
2.2.4
Simplicit
Dans le prsent document, ce paramtre est regroup dans les mmes sous-chapitres que la
robustesse (FAO 1997).
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Anses
Attentes relatives une mthode de dnombrement de Legionella dans

leau
Le premier rflexe pour dcrire une mthode analytique est dexaminer ses performances techniques,
prcdemment voques : slectivit, spcificit, sensibilit, rptabilit intra-laboratoire,
reproductibilit inter-laboratoires, justesse, fidlit ou encore rendement. Il est bien sr souhaitable
que les mthodes soient les plus performantes possibles vis--vis de lensemble de ces paramtres.
Il apparat galement important quune mthode analytique destine au dnombrement de Legionella
19
dans leau ait t value sur le plan du rendement , quelle possde une limite de quantification
basse et le cas chant infrieure aux valeurs cibles rglementaires et quelle soit slective de la cible
qui sera choisie (L. pneumophila, L. spp, bactries cultivables, bactries viables non cultivables,
bactries intracellulaires, etc.).
Le cot est galement un aspect important prendre en compte pour le choix dune mthode
analytique. Cependant il dpend directement du nombre danalyses envisag. Par ailleurs, les
analyses de routine sont souvent ralises par des laboratoires analytiques prestataires, pour le
compte de clients gestionnaires dinstallations. Ainsi, le prix de vente unitaire des analyses est non
seulement fix en fonction de leur cot de revient, mais galement en fonction de la stratgie
commerciale du laboratoire. Dans ces conditions, tant donn les objectifs de ce rapport, il ne semble
pas opportun de retenir le cot unitaire des analyses comme un critre de choix des mthodes.
Dautres critres peuvent tre pris en compte pour valuer la pertinence dune mthode de
dnombrement de Legionella dans leau. Le tableau 1 prsente ces critres et les niveaux
dimportance qui ont t attribus dans le cadre de ce rapport, au regard de la problmatique pose.
Par ailleurs, il est postul que les utilisateurs des mthodes dcrites sont des hommes de mtier, qui
matrisent les pratiques courantes de laboratoire. Le prsent document n'abordera donc pas les
problmes de scurit inhrents lutilisation des mthodes dcrites. Il incombe aux utilisateurs de
mettre en uvre des pratiques appropries en matire d'hygine et de scurit et de s'assurer de la
conformit des procdures et des conditions de manipulation aux rglementations nationales en
vigueur.
Chaque description de mthode est assortie dun tableau prsentant les avantages et les
inconvnients intrinsques thoriques de la mthode. Ils sont dfinis en fonction, des critres lists et
prioriss dans le Tableau 1, de leur pertinence pour le suivi des installations deau chaude sanitaire et
des tours arorfrigrantes, et de leur dcontamination aprs le dnombrement de Legionella des
niveaux suprieurs aux valeurs cibles rglementaires.
19
Fraction de la cible dtecte par rapport la cible prsente dans lchantillon.
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Anses
Tableau 1 : Pertinence, pour le contrle sanitaire et la surveillance, des critres de slection dune mthode de
dnombrement de Legionella dans leau, dans les contextes du suivi des rseaux deau chaude sanitaire (ECS),
des tours arorfrigrantes (TAR) et des dcontaminations.
ECS
TAR
Dconta
mination
++++
+++
++++
+++
++++
+/-
++
++
+/-
++
++
+/-
+/++
+/-
+++
+++
+++
+/-
+/-
+/-
+++
+++
+++
+++
+++
+++
Critres relatifs au contexte pratique de mise en uvre

Rapidit des rsultats (hors crise)
Equipements ncessaires limits
Faibles cots (global)
+++
++
++
++
++
+++
++
++
++
++
+++
++
++
++
++
Critres relatifs linterprtation des rsultats

Interprtation pour le risque sanitaire disponible
++
+++
++
+++
++
+++
Critres relatifs aux champs dapplication

Permet de disposer de souches pour des tudes complmentaires
++
+++
++
++
+++
++
+/+++
++
Critres relatifs aux cibles

srogroupe 1
Distinction et quantification des srogroupes autre que sg1
Quantification de lensemble des Legionella spp
Identification des diffrentes espces de Legionella prsentent
dans lchantillon
Quantification slective des Legionella intra amibiennes ou intra
vsiculaires
Critres relatifs ltat physiologique des Legionella
dtectes
++++ indispensable ; +++ priorit leve ; ++ priorit modre ; +/- peu ou pas pertinent
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Anses
Description des tapes de prparation et de prtraitement des chantillons

pralables un dnombrement de Legionella
Les tapes de prtraitement des chantillons influencent directement les rsultats des
dnombrements de Legionella dans leau exigs par la rglementation. Le prsent chapitre est
consacr la description de leurs principes et objectifs.
Avant cela, il semble important dvoquer limpact que peut avoir lchantillonnage et la mthode de
prlvement sur les rsultats des mthodes de dnombrement mises en uvre.
4.1
Echantillonnage
Il est clair que lchantillonnage et la mthode de prlvement dun chantillon environnemental

influencent le rsultat danalyse obtenu. Diffrents facteurs peuvent entraner des pertes de
rendement du dnombrement des bactries rellement prsentes dans un chantillon deau (Ballard
et al. 2000; Delgado-Viscogliosi et al. 2005) :
$ la survie de la bactrie cible dans les chantillons prlevs (conditions de conservation
appropries la mthode danalyse) ;
$ ltape de concentration (centrifugation ou filtration) ;
$ la dcontamination ventuelle de lchantillon par la chaleur (30 minutes 50C) ou par une
solution acide (5 minutes pH = 2) ;
$ la sonication et le grattage.
La description des mthodes de prlvement ne fait pas lobjet du prsent document. Cependant, il
est important de prciser que la compatibilit de la mthode de prlvement avec la mthode
danalyse choisie doit tre vrifie.
Il existe une norme ISO 19458 (2006), relative lchantillonnage pour les analyses microbiologiques
des eaux. Cette norme gnrale dcrit le nombre dchantillons analyser pour dterminer la
concentration moyenne de bactries prsentes dans leau, avec un niveau de confiance donn.
Plus spcifiquement, pour la recherche de Legionella dans les eaux, il existe un guide de
prlvement, sous la forme dun Fascicule de documentation FD T 90-522 (2006). Il est conu pour
lchantillonnage pralable la recherche de Legionella spp ou de L. pneumophila dans les eaux
chaudes sanitaires, les eaux dagrment ou de baignade et les installations de refroidissement par
dispersion deau dans un flux dair (IRDEFA). Ce guide a t labor de manire tre compatible
avec les deux mthodes de dnombrement de Legionella les plus rpandues : culture (NF T90-431) et
q-PCR (NF T90-471).
Dans les deux cas, les volumes de prlvement prconiss sont variables en fonction des situations
et des mthodes analytiques.
Dans certaines situations, il peut tre intressant que la mthode analytique dans son ensemble ou
tout au moins le prlvement et lchantillonnage mis en uvre, permettent la ralisation dtudes
complmentaires, notamment pidmiologiques.
4.2
Etape de concentration
Trois mthodes de concentration des chantillons ont t rpertories : la filtration, la centrifugation et

la sparation immuno-magntique. Les deux premires ne sont pas slectives, contrairement la
sparation immuno-magntique qui permet thoriquement une concentration slective de la cible de
lanalyse.
4.2.1
Filtration
La filtration peut tre utilise dans le cas dune eau suffisamment peu charge en matires en
suspension ou en collodes pour tre filtrable sans problme de colmatage du filtre. Le principe est de
faire passer un volume du liquide donn sur un filtre qui va retenir notamment les bactries cibles de
lanalyse et laisser passer le liquide ainsi que les particules plus petites que le seuil de coupure du
20
filtre. Le retentt obtenu contient les bactries recherches.
20
Ce qui ne traverse pas la membrane de filtration.
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Anses
Diffrentes normes dcrivent des mthodes de filtration pour la concentration pralable une
recherche de Legionella dans leau.
Selon la norme europenne NF EN ISO 11731-2 (juillet 2008), relative la recherche et au
dnombrement de Legionella - Partie 2 "Mthode par filtration directe sur membrane pour les eaux
faible teneur en bactries", le volume des chantillons prlevs dpend de la nature de l'eau et de la
finalit de l'examen effectu. Il est donc prconis de filtrer 10 mL 1 000 mL de l'chantillon d'eau
sur membrane en nitrate de cellulose de porosit moyenne 0,45 m. Pour rduire au minimum la
croissance des bactries non Legionella, l'chantillon doit tre trait avec un tampon acide
directement dans l'entonnoir du filtre. Il est important de noter que la filtration de volumes importants
d'chantillon peut favoriser la concentration de substances toxiques vis--vis de la croissance sur la
membrane filtrante. Ainsi, une variation du rendement de rcupration des bactries lorsque les
volumes de filtration sont plus importants peut-tre lie la prsence de substances inhibitrices,
ltat physiologique des bactries prsentes et leurs capacits dagrgation. La membrane ainsi
obtenue est directement place sur la bote du milieu de culture (milieu BCYE ou GVPC). La mthode
dcrite dans cette norme, la suite de cette concentration, correspond une analyse de lchantillon
par culture. Une correspondance avec la norme franaise NF T 90-431 est dailleurs mentionne.
Selon la norme NF T90-431 (septembre 2003), relative la recherche et au dnombrement de
Legionella spp et Legionella pneumophila - Mthode par ensemencement direct et aprs
concentration par filtration sur membrane ou centrifugation, 1 L d'eau, ou dans le cas des eaux sales
et/ou non filtrables 500 mL, doit tre filtr sur une ou plusieurs membrane(s) en polycarbonate de
porosit 0,45 m puis la membrane doit tre :
- soit gratte dans 5 mL deau purifie strile ou deau de lchantillon ;
- soit immerge dans 5mL deau purifie strile ou deau de lchantillon au sein dun rcipient
strile plac au milieu dune cuve ultrasons.
Le concentrt ainsi obtenu peut ensuite tre analys par culture.
Selon la norme NF T90-471 (avril 2010), relative la dtection et quantification de Legionella et/ou
Legionella pneumophila par concentration et amplification gnique par raction de polymrisation en
chane en temps rel, lorsque des membranes filtrantes sont utilises, elles doivent tre en
polycarbonate ou tout autre compos ayant une faible capacit dadsorption des protines et de
21
lADN , de porosit nominale infrieure ou gale 0,45 m. Le volume dchantillon filtr doit tre si
possible compris entre 100 mL et 1 L. Ce volume doit tre pris en compte pour lexpression de la
limite de quantification et la limite de dtection. La rduction du volume filtr a un impact important sur
ces valeurs qui augmentent proportionnellement.
Compte tenu de ces lments il apparat que le principe et le mode opratoire de la mthode de
concentration par filtration sont dj prcisment dcrits. Il faut cependant noter que des variantes
apparaissent en fonction du type danalyse que doit subir lchantillon, notamment en termes de
volume dchantillon avant filtration ncessaire et de remise en suspension ou pas de lchantillon
concentr.
4.2.2
Centrifugation
La centrifugation est utilise dans le cas des eaux charges et/ou non filtrables. Le principe est de
soumettre lchantillon une force centrifuge, qui a pour effet dacclrer la sparation des particules
en suspension dans le liquide. Ainsi, les bactries recherches se retrouvent concentres dans le
culot et en thorie absentes du surnageant. Le concentrt analyser est obtenu aprs extraction du
surnageant.
Selon la norme NF T90-431, aprs homognisation, 500 mL de lchantillon sont centrifugs dans 1
ou 2 rcipients striles fond conique 30 000 m.s-2 (3000 g), pendant 30 min, une temprature
comprise entre 15 C et 25 C. Le surnageant est ensuite limin strilement par aspiration en
laissant le culot dans 5 mL du surnageant. Le concentrt ainsi obtenu pourra tre analys par culture
aprs remise en suspension.
La norme exprimentale XP T90-471 (avril 2006), relative la dtection et quantification de Legionella
et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification gnique par raction de
polymrisation en chane en temps rel, mentionnait la possibilit de raliser la concentration par
centrifugation, sous rserve quelle fasse lobjet dune optimisation, teste par la validation du
21
Ne surtout pas utiliser de membrane contenant de la cellulose.
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Anses
rendement. Cependant sa version rvise, la norme NF T90-471, nvoque plus la possibilit dutiliser
une centrifugation comme moyen de concentration.
Ainsi, le principe et le mode opratoire de la mthode de concentration par centrifugation sont
galement dj prcisment dcrits.
4.2.3
Sparation immuno-magntique (IMS)
Le principe de cette mthode repose sur la capture slective des bactries par des anticorps fixs sur
des billes magntiques, partir dun chantillon liquide plus ou moins complexe (eau chaude
sanitaire, eau de tour arorfrigrante, biofilm dissoci, etc.). La mthode permet thoriquement la
capture des cellules prsentant lpitope cibl par lanticorps utilis (Riffard et al. 2001).
La mthode nest pas normalise pour lapplication aux Legionella. Toutefois, lutilisation de cette
technique est dcrite dans la norme NF T90-455 de juillet 2001 "Qualit de l'eau - Recherche et
dnombrement d'oocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia - Mthode de concentration et
de dnombrement".
Sans tenir compte de la prparation de lchantillon, il faut compter au moins 30 minutes dincubation
sous agitation entre le complexe billes magntiques-anticorps et lchantillon liquide et prvoir ensuite
des lavages avant rvlation de la sparation immuno-magntique (IMS) par la technique danalyse
choisie.
Les anticorps utilisables sont ceux prsentant une affinit suffisante pour permettre une capture
slective des Legionella, notamment ceux utiliss par les techniques dimmuno-dtection appliques
aux Legionella.
Dans le contexte Legionella, un kit dimmuno-capture est commercialis avec pour objectif de
simplifier et daugmenter la rapidit dobtention du rsultat de dtection de Legionella spp. dans des
chantillons deau ou des chantillons environnementaux. Ce kit est destin tester plusieurs
espces de Legionella (Legionella pneumophila dont le srogroupe 1, L. bozemanii, L. brunensis, L.
dumoffii, L. micdadei et L. anisa) partir dchantillons deaux environnementales ou artificiellement
contamines, de biofilms ou de suspension complexes. Selon le fabricant, il permet de rcuprer des
Legionella partir dun inoculum deau strile contenant moins de 100 UFC/L.
La limite de dtection de lanalyse dpend de la mthode analytique mise en uvre aprs la
concentration. Les performances de la sparation immuno-magntique peuvent tre values en
calculant un rendement de rcupration, cest dire en comparant le nombre, la quantit ou lintensit
du signal rcupr aprs la technique danalyse choisie seule et aprs combinaison de lIMS avec la
technique danalyse. Pour les 4 tudes publies sur Legionella, les rendements de rcupration
obtenus sur suspensions pures en Legionella ou faiblement contamines sont toujours suprieurs
50%. Le pourcentage de valeurs prdictives ngatives est li la spcificit par rapport la cible de
lanticorps. Ces pourcentages varient extrmement (de 8 % plus de 95 %) en fonction de la
complexit des chantillons : eaux chaudes sanitaires, eaux de tours arorfrigrantes, biofilms
(Fuchslin et al. 2010; Riffard et al. 2001; Sethi et al. 2007; Yanez et al. 2005). Concernant lutilisation
de lIMS en combinaison avec la culture, lefficacit de lIMS est dautant plus forte que lchantillon
est complexe. A titre dexemple, un chantillon rendu non interprtable en culture, cause dune
importante flore interfrente, peut tre rendu quantifiable en ralisant une IMS pralablement la
culture (Riffard et al. 2001).
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Anses
Description des mthodes de dnombrement slectives de Legionella

utilisant un principe unique
Ce chapitre est destin dcrire le plus exhaustivement possible les mthodes de dnombrement de
Legionella dans leau. Certaines mthodes encore trop peu dveloppes et documentes pour
permettre une valuation de leurs avantages et inconvnients sont succinctement dcrites dans les
sous chapitres Evolutions possibles des mthodes .
Rappelons que lobjectif de ce travail est dvaluer laptitude de ces mthodes rpondre aux besoins
du dnombrement de Legionella dans le contexte des eaux chaudes sanitaires et des tours
arorfrigrantes.
La mthode de prlvement utilise doit prendre en compte la compatibilit avec les modes de
prlvement faisant actuellement lobjet de guides techniques ou de norme.
5.1
5.1.1
Mthodes bases sur la croissance.

Culture
La mthode de dnombrement de Legionella, dans leau, par culture, fait lobjet de la norme Afnor
NFT90-431 (septembre 2003). Actuellement, en France, elle est la seule mthode officiellement
reconnue par les autorits sanitaires.
5.1.1.1 Principe
Le principe de la mthode de dnombrement par culture est densemencer un chantillon sur un
milieu de culture, pour compter le nombre de colonies qui se forment aprs une incubation une
temprature donne. La slectivit de la mthode dpend de celle du milieu de culture utilis et de la
temprature dincubation.
La mthode de recherche et de dnombrement de Legionella spp. et de Legionella pneumophila dans
leau telle que dcrite dans la norme Afnor NF T90-431 prvoit une incubation 36C, sur milieux de
culture slectifs (milieu GVPC) durant 8 10 jours et leur examen au moins trois reprises partir de
3 4 jours de culture, jusqu' la fin de la priode d'incubation. Ces examens permettent le reprage
des colonies potentiellement positives.
Les colonies caractristiques de Legionella sont ensuite repiques sur diffrents milieux de culture
pour confirmation. Aprs une priode d'incubation de 2 4 jours, un examen de ces milieux permet le
dnombrement de Legionella. Sont considres comme Legionella toutes les colonies qui se
dveloppent sur le milieu GVPC et sur un milieu BCYE riche en L-cystine, mais ne se dveloppent
pas sur le milieu BCYE sans L-cystine et/ou glose au sang ou glose nutritive, deux milieux non
slectifs. Les exigences nutritives des Legionella sont prcises dans la description des milieux de
culture, prsente dans le sous-chapitre "5.1.1.6. Matriel ncessaire"
Lorsque Legionella est dnombre, un test d'agglutination au latex ou par immunofluorescence directe
est pratiqu afin d'identifier lespce L. pneumophila (NF T90-431). Ces tests permettent galement
didentifier le srogroupe 1 de L. pneumophila bien que cela ne figure pas dans les normes.
La mthode dcrite dans la norme ISO 11731-2 reprend le mme principe gnral. Les bactries, y
compris les Legionella, sont concentres par filtration sur membrane. Aprs filtration, le filtre est trait
avec un tampon acide plac directement sur lentonnoir, pour rduire la croissance des bactries
autres que Legionella. La diffrence essentielle avec la norme NF T90-431, rside dans le fait que le
filtre est ensuite transfr sur une boite de culture et incub 36 C pendant au moins 10 jours (ISO
11731-2). Elle permet une culture de Legionella directement sur filtres mais qui contrairement la NF
T90-431 ne permet danalyser que des eaux faible teneur en bactries, qui sont prcisment
dfinies dans le sous-chapitre "Matrice dapplication". Si une inhibition ou une croissance importante
de microorganismes est suspecte, cette norme prvoit le rexamen de volumes plus faibles ou de
dilutions de lchantillon. Cette mthode nest actuellement pas prconise par la rglementation
franaise.
5.1.1.2 Informations apportes par les rsultats
Les rsultats des mthodes de dnombrement par culture sont exprims en nombre dunits formant
colonies de Legionella spp. et Legionella pneumophila par litre deau (UFC/l) (NF T90-431 ; ISO
11731-2).
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Seules les bactries cultivables sont dnombres. Ainsi, quand les cellules de Legionella perdent leur
caractre cultivable (VBNC), mme si elles restent viables, elles ne sont plus dtectables avec une
mthode par culture. (Byrd et al. 1991; Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Hay et al. 1995; Hussong et al.
1987; Murga et al. 2001; Oliver 2000; Oliver 2009; Yamamoto et al. 1996).
Le dnombrement sur milieu de culture de Legionella contenues dans des protozoaires ou des
vsicules externes de ces protozoaires est peu document. Il existe des incertitudes quant la
capacit de la mthode normalise par culture les dnombrer (Hay et al. 1995).
5.1.1.3 Matrice dapplication
La mthode dcrite dans la norme NF T 90-431 est applicable tous les types deaux propres (eaux
destines la consommation humaine, eaux chaudes sanitaires, eaux minrales naturelles usage
thermal, eaux rcratives, etc.) et deaux sales (industrielles, naturelles, etc.). En pratique, le
dnombrement de Legionella dans des eaux charges non filtrable reste cependant dlicat avec cette
technique. La concentration de lchantillon est ralise par :
$ filtration sur membrane de polycarbonate de 0,45m de porosit pour une eau filtrable, suivie
dune remise en suspension des bactries retenues sur la membrane dans 5 mL deau strile,
par sonication ou grattage (NF T90-431) ;
$ ou par centrifugation pour les chantillons non filtrables, suivie dune remise en suspension du
culot dans 5 mL deau strile (Circulaire DGS 2005/315 ; NFT90-431).
La mthode dcrite dans la norme ISO 11731-2 est applicable uniquement aux eaux usage humain
(eau chaude, froide, lavage), eaux destines la consommation humaine et eaux de baignade
traites (piscines). Une norme ISO 11731-1, en cours de prparation, devrait tre applicable aux
sdiments, dpts et biofilm.
5.1.1.4 Echantillon ncessaire
Selon la norme NF T90-431, le volume de lchantillon est d1 L pour une eau filtrable (peu charge,
comme les eaux de consommation humaine) ou de 0,5 L pour une eau charge (non filtrable)
(Circulaire DGS 2005/315).
Selon la norme NF EN ISO 11731-2, lchantillon est compos de 10 mL 1 L (pour une eau filtrable).
La plupart des auteurs dtudes exprimentales qui mettent en uvre la culture utilisent des
chantillons d1 L. Ce volume permet un compromis entre sensibilit de la mthode et faisabilit de sa
mise en uvre (Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Yaradou et al. 2007).
Dans tous les cas lchantillon doit parvenir au laboratoire dans les 48 heures (stockage 4C)
(NFT90-431 ; NF EN ISO 11731-2).
5.1.1.5
Paramtres de performance
5.1.1.5.1 Justesse
Cette mthode sous estime le nombre de Legionella en prsence dune flore interfrente pouvant se
dvelopper plus rapidement que Legionella sur les milieux de culture non slectif (BCYE). Pour
rsoudre ce problme, la norme NF T90-431 impose lutilisation du milieu slectif GVPC, cens
inhiber la croissance de la flore interfrente. Les faux positifs, la mthode en minimise le nombre, du
fait de la slectivit des milieux utiliss. Cependant, cette inhibition nest pas totale et ce milieu de
culture inhibe galement la croissance de certaines Legionella (Allegra et al. 2008).
Concernant les faux ngatifs, la mthode ne dtecte pas les bactries viables non cultivables. De ce
fait, selon certains auteurs, la concentration en Legionella dans les chantillons environnementaux
serait largement sous-estime (Allegra et al. 2008; Doleans et al. 2004; Fields et al. 2002). Pour la
mthode normalise, lexistence de faux ngatifs a notamment t dmontre pour des chantillons
contenant des amibes. Dans ce cas, elle est interprte comme une dtection ou un dnombrement
erron des Legionella prsentes dans les amibes (Hay et al. 1995).
Concernant la rptabilit, des prcisions, bases sur des donnes danalyse de routine, sont
apportes dans la synthse des auditions menes par le groupe de travail, prsente au point 10.2 de
ce rapport.
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5.1.1.5.2 Fidlit, reproductibilit

Concernant la reproductibilit de la mthode, le coefficient de variation maximum observ serait de
lordre de 10 % (Delgado-Viscogliosi et al. 2005). Sur ce point des prcisions, bases sur des
donnes danalyse de routine, sont apportes dans la synthse des auditions menes par le groupe
de travail, prsente au point 10.2 de ce rapport.
5.1.1.5.3 Sensibilit
Parmi les facteurs qui peuvent entraner des pertes de rendement au cours des diffrentes phases
aboutissant au dnombrement des bactries par culture, la prsence de microorganismes autres que
Legionella, peut jouer un rle majeur en envahissant les milieux nutritifs par un effet bactricide qui
leur est propre (Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
Il na pas t montr si toutes les espces de legionella ont la mme capacit de croissance en
culture sur le milieu GVPC (Luck et al. 2004).
Le rendement peut galement varier en fonction des caractristiques de leau analyse. Pour la
mthode par culture, selon certains auteurs, il est de lordre de :
$ 70 % pour lanalyse dune eau de rseau hospitalier (Wellinghausen et al. 2001) ;
22
$ 10 30 % pour lanalyse deau environnementale (Ballard et al. 2000; Boulanger and
Edelstein 1995)
La limite de dtection est variable en fonction des caractristiques de leau analyse (NFT90-431 ;
Circulaire DGS 2005/315) :
$ 50 UFC/L pour un chantillon deau peu charge filtrable, comme leau du robinet ;
$ 100 UFC/L pour un chantillon deau charge non filtrable, comme leau dun circuit de
refroidissement, et qui ncessite une centrifugation de lchantillon.
La limite de quantification est galement variable en fonction des caractristiques de leau analyse
(NFT90-431 ; Circulaire DGS 2005/315) :
$ 250 UFC/L pour un chantillon d1 L deau peu charge filtrable ;
$ 500 UFC/L pour un chantillon d1 L deau charge non filtrable.
5.1.1.5.4 Spcificit, slectivit
Selon la norme NF T90-431, la mthode de dnombrement par culture est spcifique de L.
pneumophila et de L. spp. Il faut cependant noter ici que les milieux de culture utiliss permettent
parfois la croissance dautres genres que Legionella. Par ailleurs ils sont galement susceptibles de
limiter la croissance de certaines espces du genre.
Le milieu de culture slectif prconis dans la norme est le milieu GVPC. Il permet une relativement
bonne slectivit du genre Legionella, mme sil nexclut pas totalement la croissance dautres
genres. Les tests complmentaires de croissance et immunologiques imposs dans la norme AFNOR
T90-431 permettent de confirmer que les colonies cultives sont bien du genre Legionella et
daugmenter ainsi la spcificit.
5.1.1.5.5 Rapidit
Selon la norme NF T90-431, le temps ncessaire un dnombrement de L. pneumophila par culture
est compris entre 8 et 14 jours ( rception au laboratoire) : 1 jour pour le prtraitement de
lchantillon (filtration ou centrifugation, traitement acide ou thermique et ensemencements), 8 10
jours dincubation et 2 4 jours de confirmation de lidentification.
En pratique, en cas de prsence de Legionella dans leau en grande quantit, la mthode par culture
permet de mettre en vidence un dpassement des valeurs cibles par une pr-lecture aprs 3 5
jours dincubation. Le cas chant, une premire information peut donc tre transmise plus
rapidement au gestionnaire que les 14 jours dfinis par la norme.
5.1.1.6 Matriel ncessaire
Les milieux de culture utiliss dans le cadre dun dnombrement par culture ont une importance
cruciale pour les rsultats danalyse, notamment dans la slectivit de la mthode. Leur description
22
Eau non prpare artificiellement.
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prcise et la bonne comprhension de leurs objectifs respectifs est importante. Les milieux dont
lutilisation est prvue dans la norme NF T90-431 sont les suivants :
$ BCYE (Buffered charcoal yeast extract) avec et sans L-cystine:
Ces deux milieux gloss sont destins la confirmation des colonies obtenues sur glose
GVPC (dfini ci-dessous). Leur composition est normalise (NFT90-431, NF EN ISO 117312). Les gloses BCYE et BCYE sans cystine ne diffrent que par la prsence ou non de
cystine dans le milieu. Lextrait autolytique de levure constitue le substrat nutritif permettant
une croissance bactrienne. Le charbon actif assure la dcomposition du peroxyde
dhydrogne produit par le mtabolisme bactrien, la capture du dioxyde de carbone et
23
modifie la tension superficielle (Feeley et al. 1979). Le tampon ACES /KOH assure le
maintien du pH et permet dincuber les milieux en arobiose (Pasculle et al. 1980). La
cystine, lorsquelle est prsente, et le pyrophosphate ferrique, reprsentent des lments
nutritifs indispensables pour la culture des Legionella (Feeley et al. 1978), alors que lctoglutarate est un activateur de leur croissance (Edelstein 1981).
$
GVPC (Glycine Vancomycine Polymyxine Cycloheximide) :

La glose slective GVPC pour Legionella est destine au dnombrement, lisolement et
la culture des espces de Legionella. Sa composition est dcrite prcisment dans la norme
NF T90-431. Elle est quasi identique la glose BCYE avec cystine, la prsence prs de
glycine, vancomycine, polymyxine B (Wadowsky and Yee 1981) et cycloheximide (Dennis et
24
al. 1984), dont lassociation peut inhiber la prsence dune possible microflore secondaire .
Les colonies de Legionella ont le plus souvent un aspect caractristique la loupe binoculaire
dit en verre fritt.l
Glose au sang
Peu slective, la glose au sang permet cependant d'apprcier le pouvoir hmolytique de
certaines bactries (Afnor NFT90-431). Ce milieu de culture bien que relativement riche, ne
permet pas la culture de Legionella, de mme que le BCYE sans cystine. Ainsi une culture
positive sur BCYE sans cysteine et sur Glose au sang exclus une Legionella.
Glose nutritive
Selon la norme Afnor NFT90-431, La glose nutritive est un milieu de culture non slectif de
composition souvent empirique, dont la formulation apporte les lments nutritifs ncessaires
la croissance dune grande varit de germes non exigeants. Au stade de la confirmation
des colonies caractristiques obtenues sur le milieu slectif, la manifestation de cultures sur la
glose nutritive permet dliminer les germes non-cibles, infirmant ainsi la prsence de
Legionella dont la croissance est dpendante de la prsence de cystine, acide amin absent
de la composition de ce milieu.
Le matriel ncessaire la mise en uvre de cette mthode comprend galement :

$ Les kits de test dagglutination au latex ou les kits de test par immunofluorescence directe
pour caractriser lespce pneumophila et les srogroupes ;
$ Lincubateur 36C ;
$ La loupe binoculaire ;
$ Lunit de filtration et/ou la centrifugeuse ;
$ Les cuves ultrasons ;
$ Le bain-marie 50 +/- 1 C ;
$ Le microscope en fluorescence ;
$ Les consommables voqus dans la norme NF T90-431.
5.1.1.7 Robustesse, comptences ncessaires, simplicit
La mthode par culture est potentiellement matrise par tout laboratoire de microbiologie pour la
recherche et lanalyse de routine en milieu hospitalier, environnemental, etc.)
23
Tampon ACES : acide N2-actamido-2-amino-thane-sulfonique

La vancomycine est une molcule inhibitrice de la synthse du peptidoglycane de la paroi bactrienne. Mais, du fait de son
poids lev, elle ne peut emprunter les porines de la membrane externe des Gram ngatifs. Elle naffecte donc que les
bactries Gram positifs. La concentration leve en glycine inhibe galement fortement la flore secondaire Gram+. La
polymyxine B est un surfactant cationique affectant la structure de la membrane de la cellule bactrienne en interagissant avec
ses phospholipides. Elle possde un effet bactricide sur les bacilles Gram ngatifs. Le cycloheximide est un inhibiteur de la
synthse protique des cellules eucaryotes. Il est utilis ici comme antifongique, car il est inhibiteur de croissance des myctes.
24
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5.1.1.8
Avantages et inconvnients thoriques intrinsques de la mthode par culture
Tableau 2 : avantages et inconvnients de la culture
Critres
de
priorit
leve
Critres
de
priorit
modre
5.1.2
Avantages
Inconvnients
Quantification de Legionella
pneumophila
Quantification Legionella pneumophila
avec distinction du srogroupe 1
Critres dinterprtation pour le risque
sanitaire disponibles
Applicable sur des chantillons deau
traite
Distinction et quantification des
srogroupes Lp autre que sg1
Quantification de lensemble des
Legionella spp
Interprtation technique simple des
rsultats bruts
Permet de disposer de souches pour
des tudes complmentaires
Incertitude sur la prise en compte

des Legionella intra amibiennes ou
intra vsiculaires dans la
quantification
Ne dtecte pas lensemble des
pathognes
Mthode lente
Non
25
valu
Peut ne pas tre applicable

certaines eaux trs charges
(biologiquement, chimiquement ou
physiquement)
Temps technicien important
Direct Viable Count (DVC)
La mthode de dnombrement de Legionella, dans leau, par DVC, ne fait actuellement pas lobjet
dune norme.
5.1.2.1 Principe
La mthode de dnombrement appele DVC (direct viable count) (Kogure 1979 ; Joux 1997 ; Singh
1989 ; Peele 1981; Altug 2010 ; Barcina 1995) permet en un temps rduit destimer la capacit dune
bactrie se diviser et donc par extrapolation, dapprcier son potentiel de gnration dune colonie. Il
est bas sur lutilisation dun cocktail dantibiotiques capables de bloquer la division bactrienne sans
pour autant altrer le mtabolisme bactrien. Dans ces conditions, en prsence de nutriments et
dantibiotiques quantitativement et qualitativement adapts, et dun temps dincubation une
temprature optimale, les bactries viables capables de sallonger sans pouvoir se diviser vont ainsi
sallonger et atteindre une taille plus importante que celle observe avant incubation. Au stade actuel
de dveloppement du DVC, il est encore difficile de fixer une taille de cellule partir de laquelle elles
sont considres comme plus longues que la normale, dautant plus pour les Legionella qui sont
connues pour filamenter dans certaines conditions environnementales stressantes. La dtection des
bactries allonges ou non se fait aprs marquage par des fluorochromes et comptages au
microscope pifluorescence.
En optimisant le choix des antibiotiques, le procd en lui-mme et surtout le milieu de culture, il est
possible destimer le nombre de L. pneumophila viables (capables de se diviser) dans un chantillon,
en 12h. Afin de distinguer slectivement L. pneumophila des autres bactries ou cellules contenues
dans un chantillon environnemental, il est ncessaire dy associer une technique didentification
slective (ex : hybridation in situ FISH).
Les rsultats de cette mthode sont exprims en nombre de cellules bactriennes viables capable de
se diviser par litre deau (cellules/L). La lecture est ralise au microscope.
En utilisant des milieux de culture adapts (BCYE), la mthode DVC permet le dnombrement de
Legionella spp. et L. pneumophila dans les eaux. Cette mthode est cependant soumise des limites
25
Par manque de donnes
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relativement proches de celle de la mthode par culture telle que dcrite dans la norme (NF T90-431),
pour lanalyse des eaux charges (non filtrables).
Selon certains auteurs, cette mthode permet de dtecter slectivement les bactries dune espce
donne dans un mlange ou un chantillon environnemental (Rudi et al. 2005). Cependant les
publications relatives son utilisation sur des chantillons deaux environnementales sont rares.
5.1.2.4 Echantillon ncessaire / le cas chant mthode dchantillonnage prconise
Aucune donne rpertorie.
5.1.2.5
5.1.2.5.1 Justesse
5.1.2.5.5 Rapidit
Le temps ncessaire est de 1 2 jours, dont 12 heures dincubation.
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5.1.2.8
Avantages et inconvnients thoriques intrinsques de la mthode DVC
Tableau 3 : avantages et inconvnients de la DVC
Critres
de
priorit
leve
Avantages
Non
dtection
des
Legionella
mortes
Rapidit
des
rsultats
Critres
de
priorit
modre
5.1.3
Inconvnients
Critres
dinterprtation
pour le risque
sanitaire non
disponibles
26
Non valu
srogroupe 1
Pas de distinction et de quantification des srogroupes Lp
autre que sg1
Applicable aux eaux trs charges
Equipements ncessaires
Permet de disposer de souches pour des tudes
complmentaires
Evolutions possibles des mthodes bases sur la croissance, peu ou pas testes pour
rechercher Legionella dans leau
En sappuyant sur le principe de la mthode de dnombrement de Legionella par culture, telle que
dcrite dans la norme NF T 90-431, il peut tre envisag des variantes, potentiellement plus
performantes ou apportant une information supplmentaire. Diffrents exemples peuvent tre
voqus.
5.1.3.1 Prtraitement des chantillons
Certains prtraitements de lchantillon, pourraient permettre doptimiser les performances de la
mthode de dnombrement utilise. Lutilisation des mthodes de concentration slectives, comme la
sparation immuno-magntique, a dj t voque dans le chapitre "Etapes de concentration". Elle
pourrait permettre de rduire la prsence dinhibiteurs de croissance et ainsi amener une
augmentation de la sensibilit de la mthode par culture.
5.1.3.2 Amlioration des milieux de culture
Lutilisation de milieux de culture plus slectifs ou permettant de meilleurs rendements de culture
pourrait galement tre envisage. Certaines tudes voquent notamment des milieux comme le
27
28
BMPA ou le MWY (Bartie et al. 2003; Edelstein 1981; Wadowsky and Yee 1981).
5.1.3.3 Amlioration de la justesse
Au niveau de la lecture des rsultats, il est envisageable didentifier plus de colonies que ce qui est
actuellement prconis dans la norme.
26

Extrait de Levure (11.5 g/L), Charbon activ (1,5 g/L), Tampon ACES (6,0 g/L), alpha-Cetoglutarate (1,0 g/L), Agar (14,0 g/L),
L-Cysteine HCl (0,4 g/L), Pyrophosphate ferrique (0,25 g/L), Cefomandole (0,004 g/L), Anisomycine (0,01 g/L), Polymixine B
(80 000 IU) pH 6,9 +/- 0,1 25 C
28
Extrait de Levure (10 g/L), Charbon activ (2 g/L), Tampon/KOH 10,0 g/L, alpha-cetoglutarate (1,0 g/L), Agar (14,0 g/L), LCysteine HCl (0,4 g/L), Pyrophosphate ferrique (0,25 g/L), Glycine (3.0 g/L) Polymyxine B (50,000 IU), Anisomycin (80 mg/L),
Vancomycine (1.0 mg/L), Bleu de Bromothymol (10 mg/L), Pourpre de Bromocresol (10 mg/L)
27
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Anses
5.1.3.4
Mthodes complmentaires la culture par examen de lintgrit des cellules bactriennes

ou dtection dune activit mtabolique
Des mthodes complmentaires donnent des informations relatives ltat de viabilit des Legionella
isoles. Elles sont bases sur lexamen de lintgrit via de lactivit enzymatique, du potentiel de
membrane, etc. (Alonso et al. 2002; Hoefel et al. 2003; Joux and Lebaron 2000; Nebe-von-Caron et
al. 2000).
Elles font appel des marqueurs fluorescents, simples ou doubles, spcifiques des cellules
bactriennes viables et, pour certaines mthodes, galement des marqueurs des cellules mortes.
Lobservation et la quantification des cellules fluorescentes peuvent tre ralises laide dun
fluorimtre, dun microscope fluorescence, dun cytomtre en flux ou dun cytomtre en phase
solide. Les caractristiques de ces appareils sont dcrites dans le chapitre "5.3.1.1.3".
A titre dexemple, certaines mthodes ont dj t dveloppes en ce sens pour apporter une
information complmentaire aux mthodes de dnombrement de Legionella :
$ marquage simple slectif des cellules vivantes (TVC pour total viable cell ) - activit
mtabolique :
Classiquement, un prcurseur non fluorescent est mis en contact avec lchantillon tester.
Ce prcurseur peut tre internalis par Legionella et cliv par des enzymes bactriennes en
un produit fluorescent. Les cellules bactriennes dont la membrane est intacte deviennent
fluorescentes et ne laissent pas schapper le fluorochrome dans le milieu de culture. La
fluorescence rvle donc une activit enzymatique et une intgrit membranaire que les
auteurs associent une viabilit (Delgado-Viscogliosi et al. 2005; Dusserre et al. 2008).
$ double marquage slectif des cellules vivantes et mortes - intgrit membranaire :
Deux fluorochromes spcifiques des acides nucliques sont utiliss : un marqueur fluorescent
vert (Syto9) dont les molcules peuvent pntrer dans les cellules en traversant la membrane
plasmique et un marqueur fluorescent rouge (Iodure de propidium (PI)) dont les molcules ne
peuvent pntrer dans les cellules que lorsque leur membrane est endommage. Une
incubation de 5 minutes seulement permet daprs les auteurs de discriminer la proportion de
bactries viables dans leur ensemble (cultivable et VBNC) et non viables (Allegra et al. 2008;
Alonso et al. 2002; Rudi et al. 2005).
Les mthodes bases sur lexamen de lintgrit des cellules sont applicables aux eaux propres
filtrables, mais restent limites pour lanalyse dchantillons environnementaux non filtrables. Ce sont
des outils valables pour analyser, caractriser et dcrire les cellules VBNC dans une matrice matrise
en laboratoire ou pralablement purifie et concentre en Legionella (Allegra et al. 2008; Dusserre et
al. 2008). Dans le cas dun chantillon deau environnementale, il est ncessaire de pratiquer un
double marquage associant une dtection de Legionella par un anticorps spcifique (Tyndall and
Domingue 1982) un marquage de viabilit. Les rsultats obtenus sont exprims en nombre
dvnements par cytomtrie en flux, en nombre de bactries par microscopie ou cytomtrie en phase
solide et en intensit de fluorescence par fluorimtrie.
5.2
5.2.1
Mthodes bases sur l'amplification gnique

Raction de polymrisation en chane quantitative en temps rel (q-PCR)
29
La mthode de dnombrement de Legionella, dans leau, par q-PCR , fait lobjet de la norme Afnor
NF T90-471 "Qualit de l'eau - Dtection et quantification des Legionella et/ou Legionella
pneumophila par concentration et amplification gnique par raction de polymrisation en chane
(PCR)" (avril 2010).
Actuellement, il ny a pas dquivalence officiellement reconnue entre les mthodes par culture (NF
T90-431) et par q-PCR (NF T90-471), cest--dire entre les rsultats exprims en UG/L et ceux
obtenus par la culture exprims en UFC/L.
5.2.1.1 Principe
La Polymerase Chain Reaction (PCR), est une mthode de biologie molculaire base sur
lamplification gnique in vitro. Elle permet de copier en grand nombre une squence d'ADN connue,
partir d'une faible quantit initiale, par lutilisation dune enzyme ADN polymrase et damorces
oligonuclotidiques. La slectivit de la technique vient du fait que les amorces nuclotidiques
29
Egalement appele par certains auteurs RT (Real Time) PCR
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utilises sont spcifiques du gne amplifier. Ces dernires sont constitues d'oligonuclotides de
synthse de taille dtermine (20 25 nuclotides), permettant de dlimiter la squence amplifier
(Bej et al. 1991; Saiki et al. 1988).
30
La PCR en temps rel (q-PCR ou Real-time PCR ) est une volution de la PCR classique qui
consiste mesurer la quantit dADN polymris chaque cycle grce une sonde fluorescente ou
un agent fluorescent intercalant de lADN (Higuchi et al. 1992; Higuchi et al. 1993). Elle permet ainsi
de faire des mesures quantitatives (q-PCR) en comparant les niveaux de fluorescence ceux dun
standard externe compos de solutions de concentration calibre en units gnomes de Legionella
pneumophila amplifies (Bej et al. 1991; Wellinghausen et al. 2001).
La norme NF T 90-471 laisse le choix des amorces, dans la mesure o elles sont spcifiques de
Legionella. Certaines amorces sont dj couramment utilises pour le dnombrement de Legionella
par q-PCR. Par exemple, une amorce spcifique du genre Legionella qui permet lamplification dun
fragment du gne codant pour lARNr 16S ou une amorce spcifique de lespce Legionella
pneumophila qui permet lamplification dun fragment du gne mip (macrophage infectivity
potentiator), un gne codant pour un potentiateur bactrien provoquer une infection intracellulaire de
protozoaires ou de macrophages humains (Wellinghausen et al. 2001). Dautres amorces sont
galement utilises, comme des fragments des gnes codant pour lARNr 5S (Hayden et al. 2001) et
lARNr 23S (Nazarian et al. 2008) ou du gne rpoB codant pour lARN polymerase (Yong et al. 2010).
Des amorces spcifiques de L. pneumophila de srogroupe 1 sont galement en cours de
dveloppement et permettraient dobtenir une information plus prcise sur la prsence dans leau de
ce srogroupe, le plus rencontr en pathologie humaine (Luck et al. 2009; Mrault et al. 2009).
La norme rvise (NF T 90-471) prconise un talonnage chaque changement de lot de ractifs, par
le raccordement de la solution de calibration de travail un talon primaire. Elle dfinit ainsi,
lutilisation dun talon primaire certifi servant amliorer la reproductibilit des rsultats et leur
comparaison entre les diffrents laboratoires. A la demande de la Direction gnrale de la sant
(DGS), cet talon a t mis au point et est distribu depuis octobre 2009 par le Centre national de
rfrence des lgionelles (CNRL).
Les rsultats obtenus par cette mthode sont exprims en nombre dunits gnome de Legionella
spp. et Legionella pneumophila par litre deau (en UG/L). Les bactries dnombres sont celles
contenant de lADN amplifiable, quelles soient intactes ou endommages. Cette mthode ne permet
pas de distinguer les cellules viables des cellules non viables (a priori non infectieuses) ou les cellules
cultivables des non cultivables (Ballard et al. 2000; Behets et al. 2007; Delgado-Viscogliosi et al. 2005;
Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Dusserre et al. 2008; Joly et al. 2006; Wellinghausen et al. 2001;
Yaradou et al. 2007). Elle permettrait en revanche le dnombrement de Legionella contenues dans
des protozoaires ou dans des vsicules externes de ces protozoaires (Hay et al. 1995).
Linterprtation des rsultats dune quantification de Legionella prsentes dans un chantillon donn
par la mthode q-PCR, dpend largement des caractristiques de leau analyse (Joly et al. 2006). Il
existe des diffrences importantes entre les rsultats dune analyse deau chaude sanitaire et deau
de circuit de refroidissement (Behets et al. 2007). La norme q-PCR (NF T90-471) est conue pour tre
applicable sur tout type deau sous rserve de validation pralable de la mthode vis--vis des
caractristiques de leau analyser, notamment de charge en particules. Une tude de rendement
doit ainsi tre ralise sur les diffrents types deau. Jusque-l, la q-PCR a t utilise aussi bien pour
lanalyse deaux chaudes sanitaires que deaux de tours arorfrigrantes, avec parfois des
diffrences de performances selon le type deau.
Selon la norme NF T90-471, lchantillon est concentr en filtrant le volume maximal dchantillon, si
possible compris entre 100 mL et 1 L. Comme prcdemment voqu, cet chantillon peut tre
concentr par filtration. Les chantillons doivent tre stocks 4C (Delgado-Viscogliosi et al. 2009),
voire 20C (Joly et al. 2006).
30
Dans ce rapport la RT-PCR dsigne le reverse transcriptase PCR et non le real-time PCR
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5.2.1.5 Paramtres de performance
Tout laboratoire voulant utiliser la mthode q-PCR selon la norme NF T 90-471 doit caractriser la
mthode :
31
$ connatre ou tudier linclusivit et lexclusivit des sondes et des amorces
$ connatre ou estimer la limite de dtection
$ connatre ou estimer la limite de quantification
$ tudier la fonction dtalonnage de la q-PCR
$ ou estimer le rendement optimal de la mthode
Les utilisateurs de kits commerciaux ne raliseront pas ltude dinclusivit et dexclusivit mais
demanderont les informations au fournisseur du kit. Par contre, ils raliseront toutes les autres tapes
de caractrisation. La certification AFNOR dun kit ne dispense pas de ces tapes.
5.2.1.5.1 Justesse
Concernant les faux positifs, la q-PCR prend en compte aussi bien les bactries viables que non
viables. Ainsi, la surveillance de la prsence de Legionella dans leau par cette mthode pourrait
entraner une surestimation du risque de lgionelloses. En effet il est tabli que lADN de bactries
non viables peut rsister dans lenvironnement, alors que seules les Legionella viables peuvent se
multiplier dans les macrophages pulmonaires et provoquer une pneumonie (Delgado-Viscogliosi et al.
2009; Fields 1996; Fields et al. 2002; Nocker and Camper 2006). LADN bactrien peut tre prsent
dans le milieu aqueux extrieur soit par scrtion active des cellules viables soit par relargage partir
des cellules mortes et il participe la constitution du biofilm (Steinberger and Holden 2005). Une
bonne partie de lADN libr est probablement galement digre par les protozoaires prsents dans
leau, mais lefficacit de ce processus est encore mal tablie (Nielsen et al. 2007). Parce quil est
difficile de distinguer au sein de lADN prsent les molcules pures, celles qui sont encapsules dans
des particules virales ou des ultramicrobactries (<0,2 m) ou encore celles lies aux collodes, le
terme dADN en solution est frquemment utilis pour dsigner ces formes tout autant que lADN libre.
La concentration typique en ADN libre dans leau a t estime entre 1 et 17 UG/L, bien que des
niveaux suprieurs aient dj t retrouvs (Lorenz and Wackernagel 1994; Suida and Gude 1996).
La persistance long terme de fragments dADN dans lenvironnement mime les rsultats obtenus
dans les sols o un signal peut tre obtenu par PCR des semaines aprs que linoculum ait perdu sa
viabilit. La plupart des tudes actuelles concluent que des molcules dADN extracellulaires sont
toujours prsentes bien que la dgradation dun ADN nu introduit se produise gnralement en
quelques heures (Nielsen et al. 2007). Dun autre ct, lanalyse slective de lADN extracellulaire
associe aux sdiments marins montre que ses teneurs sont voisines de celles observes dans leau
(comprises entre 7 et 24 UG/L) mais montre que ce dernier est gnralement dpourvu dADN 16S
amplifiable (Corinaldesi et al. 2005). Cependant, thoriquement, les rsultats de la mthode par qPCR ne sont pas perturbs pas la prsence ventuelle dADN libre dans leau analyse. Celui-ci est
normalement limin par ltape de filtration ou de centrifugation et ne peut donc tre lorigine de
faux positifs.
Concernant les faux ngatifs, la mthode par q-PCR limiterait le nombre de faux ngatifs, notamment
en permettant la dtection des Legionella contenues dans les protozoaires, qui sont difficilement
dtectes par culture (Hay et al. 1995). La procdure de prparation de lchantillon prconise dans
la norme NF T90-471 donne moins de dtail quant lintensit de la centrifugation prconise. Sa
capacit permettre lextraction de lADN des bactries intra amibiennes peut donc se poser.
Toutefois, une publication de Wellinghausen et al., dcrit la mthode permettant dextraire lADN des
bactries intra amibiennes, pour permettre leur dnombrement par q-PCR, qui impliquerait deux
sdimentations par centrifugation 20 000g ( laide dun kit commercial) (Wellinghausen et al. 2001).
Concernant la rptabilit de la mthode, le coefficient de variation de la q-PCR (sans tenir compte de
lextraction des acides nucliques) serait de lordre de 0.02 % (Behets et al. 2007). Sur ce point des
prcisions, bases sur des donnes danalyse de routine, sont apportes dans la synthse des
auditions menes par le groupe de travail, prsente au point 10.2 de ce rapport.
31
Les amorces et sondes utilises doivent donner les rsultats attendus pour une liste des espces et de srogroupes (liste
prciss dans la norme), qui ont tous t isols chez lhomme : rsultat positif pour linclusivit, et rsultat
ngatif pour lexclusivit.
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Concernant la reproductibilit de la mthode, le coefficient de variation de la q-PCR (sans tenir
compte de lextraction des acides nucliques) serait de lordre de 1 % (Behets et al. 2007). Sur ce
point des prcisions, bases sur des donnes danalyse de routine, sont apportes dans la synthse
des auditions menes par le groupe de travail, prsente au point 10.2 de ce rapport.
Pour lanalyse dune eau de rseau hospitalier, le ratio de dtection de Legionella serait de lordre de
99 % (Wellinghausen et al. 2001). Le taux de rcupration moyen dans un chantillon ensemenc
avec une quantit de L. pneumophila connue (Behets et al. 2007) serait de :
$ 93 % dans un chantillon deau du robinet ;
$ 56 % dans un circuit deau de tour arorfrigrante.
La limite de dtection de la mthode est dfinie comme le plus petit nombre dUG par essai ayant
montr un rsultat positif (une amplification) dans au moins 90 % des cas (NF T90-471). Elle est
variable selon les auteurs et les conditions exprimentales utilise :
$ entre 30 250 UG/L avec la sonde correspondant au gne codant pour lARNr 16S
(spcifique de L. spp.) aprs 45 cycles de rplication par q-PCR (Joly et al. 2006) ;
$ entre 250 et 300 UG/L avec la sonde correspondant au gne mip (spcifique de L.
pneumophila) aprs 45 cycles de rplication par q-PCR (Joly et al. 2006) ;
$ 60 UG/L avec lamorce correspondant au gne mip (spcifique de L. pneumophila) aprs 50
cycles de rplication par q-PCR et une efficacit damplification de 98% (Behets et al. 2007) ;
$ 170 UG/L avec une sonde correspondant un gne spcifique de L. pneumophila (Dusserre
et al. 2008) ;
$ 167 UG/L avec une sonde correspondant un gne spcifique de L. pneumophila (Yaradou et
al. 2007).
Par convention, la limite de quantification incompressible compte tenu de la dispersion
dchantillonnage est de 25 UG/puits (NF T90-471). Elle est dfinie comme le plus petit nombre dUG
par essai dont le coefficient de variation des rsultats est infrieur 25% (Joly et al. 2006). En
pratique, elle peut tre variable selon les auteurs et lamorce utilise et le volume filtr :
$ 1000 UG/L avec lamorce correspondant au gne mip (spcifique de L. pneumophila) aprs
50 cycles de rplication par q-PCR dans des conditions exprimentales (Ballard et al. 2000) ;
$ entre 500 et 5000 UG/L avec lamorce correspondant au gne codant pour lARNr 16S
(spcifique de L. spp.) aprs 45 cycles de rplication par q-PCR (Joly et al. 2006) ;
$ entre 1000 et 5000 UG/L avec lamorce correspondant au gne mip (spcifique de L.
pneumophila) aprs 45 cycles de rplication par q-PCR (Joly et al. 2006) ;
$ 833 UG/L avec une amorce correspondant un gne spcifique de L. pneumophila (Yaradou
et al. 2007).
La standardisation diminue la variabilit entre les limites de dtection et de quantification observes.
Celle-ci devrait avoir t rduite depuis la mise au point de ltalon national par le CNRL (octobre
2009). Sur ce point des prcisions, bases sur des donnes danalyse de routine, sont apportes
dans la synthse des auditions menes par le groupe de travail, prsente au chapitre 10.2. de ce
rapport.
Les limites de dtection et de quantification peuvent tre largement affectes par :
$ le volume dchantillonnage : il doit tre pris en compte pour lexpression de la limite de
quantification (LQ) et la limite de dtection (LD). Les valeurs de LQ et LD augmentent
proportionnellement avec la rduction du volume de lchantillon filtr (NF T90-471) ;
$ la prsence dinhibiteurs de la polymrase dans lchantillon : lutilisation dun talon interne,
comme prvu dans la norme NF T90-471, doit, le cas chant, permettre la mise en vidence
de tels inhibiteurs. En cas de prsence dinhibiteurs, il est prconis dans la norme de diluer
lchantillon jusqu ce que les inhibiteurs ne perturbent plus la q-PCR. Cependant cette
pratique a pour effet direct une relve des limites de dtection et de quantification en rapport
avec le facteur de dilution appliqu lchantillon.
Selon la norme NF T90-471, par convention, la limite de quantification incompressible, compte tenu
de la dispersion dchantillonnage (loi de Poisson), est de 25 UG/L +/-0,15 log, soit entre 17.7 et 35.3
UG/L.
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Thoriquement, la q-PCR est slective 100 % vis--vis de 15 srogroupes de L. pneumophila
(Behets et al. 2007). Il est possible de rechercher slectivement une espce, un srogroupe, voire un
gne de virulence. Certains gnes de virulence de L. pneumophila sont dj connus (Fields et al.
2002). Ainsi, des tudes de la dtection slective, dans lenvironnement, de L. pneumophila
srogroupe 1 (Mrault et al. 2009) par q-PCR ont dj t menes. Dautres srogroupes ont
galement t amplifis partir de cultures (Luck et al. 2009). Il devrait tre possible, dans un avenir
proche, de dtecter slectivement les souches appartenant aux grands clones responsables dun
nombre important de cas de lgionellose au niveau international (Cazalet et al. 2010).
5.2.1.5.5 Rapidit
Le temps danalyse global pour une q-PCR, prtraitement compris, est de lordre de 2 4 h. Il est
variable selon le matriel utilis (CSHPF 2005; Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
Le matriel spcifique ncessaire cette mthode est essentiellement compos dun kit dextraction
de lADN, dun thermocycler de q-PCR, de kit damplification dADN et de microplaques de q-PCR. Il
faut y ajouter les amorces spcifiques de Legionella spp. et L. pneumophila et les tampons de lyse
bactrienne. Le reste du matriel ncessaire est classiquement prsent dans un laboratoire
danalyse : bain-marie, centrifugeuse, conglateur -20c, etc. (Behets et al. 2007).
Il est important de prciser que la norme NF T90-471 prconise, dans le cas o il est choisi de ne pas
utiliser de kits de q-PCR commerciaux valids selon le protocole Afnor Protocole de Validation pour
les kits de dtection et de dnombrement de Legionella spp. et Legionella pneumophila par
concentration et amplification gnique par raction en chane de polymrisation (PCR) , la mise en
uvre dexigences supplmentaires pour valider le protocole utilis. Il est notamment prconis de
vrifier linclusivit et lexclusivit des amorces et sondes. Elles doivent donner les rsultats attendus
pour les espces et srogroupes suivants qui ont tous t isols chez lhomme.
$ liste dinclusivit (micro-organismes tests reconnus comme appartenant au genre Legionella)
: L. anisa, L. birminghamsis, L. bozemanii, L. cherrii, L. cincinnatiensis, L. dumofii, L. erythra,
L. feeleii , L. gormanii, L. hackeliae, L. jordanis, L. lansingensis, L. longbeachae, L.
maceachernii, L. micdadei, L. oakridgensis, L. parisiensis, L.. pneumophila 1 15, L.
sainthelensi, L. tucsonensis, L. wadsworthii.
$ liste dinclusivit (micro-organismes tests reconnus comme appartenant lespce L.
pneumophila) : quinze srogroupes de lespce.
$ liste dexclusivit (micro-organismes tests reconnus comme nappartenant pas au genre
Legionella et lespce L. pneumophila.) Ces souches doivent prfrentiellement tre
retrouves dans les mmes niches cologiques que les Legionella et/ou tre
phylogntiquement proches. Au minimum, la liste suivante doit tre teste : Aeromonas
hydrophila, Alcaligenes faecalis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Clostridium,
Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Flavobacterium, Klebsiella oxytoca, Listeria
monocytogenes, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas putida, Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophila,.
Les essais dinclusivit doivent tre raliss sur des extraits dADN de faon obtenir environ 100
UG/puits. Les essais dexclusivit doivent tre raliss sur des extraits dADN de faon obtenir au
minimum un quivalent de 1000 UG / puits estim par mesure de la densit optique de la suspension
620 nm.
Il faut enfin noter que dans le cas dutilisation de kits, lutilisateur ne connat pas la squence des
amorces et sondes utilises, mais le fabricant assure quelles sont sensibles et spcifiques.
Les rsultats de cette mthode semblent variables en fonction (Joly et al. 2006) :
$ des caractristiques des eaux analyser : charge en particules, en molcules chimiques ;
$ des variations dans les pratiques et les quipements des laboratoires. Ce problme a t
partiellement rgl avec lintroduction dun talon interne commun (ltalon national).
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5.2.1.8
Avantages et inconvnients thoriques intrinsques de la mthode q-PCR
Tableau 4 : avantages et inconvnients de la q-PCR
Critres
de
priorit
leve
Critres
de
priorit
modre
5.2.2
Avantages
avec distinction du srogroupe 1 (en
dveloppement)
Prise en compte des Legionella intra
amibiennes ou intra vsiculaires dans la
quantification
pathognes
Quantification de lensemble des Legionella
spp
Equipements ncessaires de cot modr
bruts
Non valu

(biologiquement,
chimiquement ou
physiquement)
Ne permet pas de disposer
de souches pour des tudes
complmentaires (mais
permet de disposer dADN)
Distinction et
quantification
des
srogroupes
Lp autre que
sg1
PCR viable (v-PCR)
La mthode de dnombrement de Legionella, dans leau, par v-PCR, ne fait actuellement pas lobjet
dune norme.
5.2.2.1 Principe
Cette mthode combine la q-PCR et lutilisation dun agent intercalant qui pntre slectivement dans
les cellules prsentant des dommages membranaires, rputes non viables. Les agents intercalants
couramment utiliss sont le monoazide d'thidium (EMA) 33 ou le monoazide de propidium (PMA).
Une photolyse de lEMA produit des nitrnes qui forment des liaisons covalentes avec lADN, tout en
le clivant en petits morceaux (Delgado-Viscogliosi et al. 2005; Hixon et al. 1975; Riedy et al. 1991).
Cette liaison bloque lamplification de lADN des cellules mortes ou endommages et rduit le signal
q-PCR d ces faux positifs.
La membrane intacte des cellules viables interdisant la pntration de lEMA, seul lADN des cellules
intactes, considres comme viables, est amplifi et quantifi. Paralllement, une analyse de
lchantillon est mene en utilisant la mthode par q-PCR simple, de manire pouvoir comparer les
rsultats de la v-PCR (le nombre dUG correspondant aux cellules viables) et de la q-PCR (le nombre
dUG correspondant la totalit des cellules dont lADN est intact) et dterminer ainsi le ratio de
cellules viables (potentiellement infectieuses) et non viables (Chang et al. 2009; Chen and Chang
2010; Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Nocker and Camper 2006; Nocker et al. 2006; Roth et al. 1997;
Rudi et al. 2005; Soejima et al. 2007; Soejima et al. 2008).
Daprs des tudes rcentes, le monoazide de propidium (PMA) est quasi quivalent lEMA pour
ses qualits de pntration dans les cellules endommages et de clivage de lADN gnomique. Son
utilisation dans le cadre dune mthode de type v-PCR peut tre envisage, la place de lEMA, pour
le dnombrement de Legionella (Chang et al. 2009; Chang et al. 2010; Nocker et al. 2006).
A noter que cette mthode est brevete pour son application pour le dnombrement de Legionella.
32

EMA et PMA sont des drivs du Bromure dEthidium, un agent intercalant couramment utilis en biologie molculaire pour
la visualisation des acides nucliques.
33
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32
Inconvnients
Dtecte les Legionella
mortes aux membranes
intgres
Critres dinterprtation pour
le risque sanitaire non
disponibles
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Les rsultats obtenus par cette mthode sont exprims en unit gnome (UG) par litre deau. Le
nombre dUG correspond aux cellules intactes contenant de lADN amplifiable. Elle permet
thoriquement la diffrenciation des cellules de Legionella pneumophila viables et non viables (Chang
et al. 2009; Chang et al. 2010; Chen and Chang 2010; Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Rudi et al.
2005). La v-PCR ne produit pas les mmes informations que la culture, mais apporte plus
dinformations que la q-PCR au regard de la viabilit des Legionella dtectes (Chang et al. 2009;
Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
La mthode a t teste, pour la dtection de Legionella, sur des chantillons deau chaude sanitaire
ou deaux environnementales (Chang et al. 2009; Chang et al. 2010; Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
Selon le GT, dans un systme ferm, les bactries mortes restent dans le circuit deau et peuvent
tre dnombres par la q-PCR sans ltre par la v-PCR. En revanche, dans un systme ouvert avec
renouvellement de leau, les bactries mortes sont vacues. La majorit des bactries restantes
tant supposes vivantes, les rsultats de q-PCR et v-PCR devraient tre beaucoup plus proches.
Cela est susceptible de limiter sensiblement les diffrences de rsultats obtenus entre q-PCR et vPCR.
Selon la norme NF T90-471, lchantillon est concentr en filtrant le volume maximal dchantillon, si
possible compris entre 100 mL et 1 L. Comme prcdemment voqu, cet chantillon peut tre
concentr par filtration ou centrifugation. Les chantillons doivent tre stocks 4C (DelgadoViscogliosi et al. 2009), voire 20C (Joly et al. 2006).
5.2.2.5
5.2.2.5.1 Justesse
Pour valuer la proportion de rsultats faux positifs produits par la v-PCR, certains auteurs ont
compars la q-PCR et la v-PCR en analysant de leau ensemence exprimentalement. Selon eux, la
v-PCR ne dnombre pas 99,9% des L. pneumophila non viables (faux positifs) prises en compte par
la q-PCR (Delgado-Viscogliosi et al. 2009). Nocker et al. suggrent que le signal plus faible mis par
le v-PCR est due une perte dADN gnomique par les cellules mortes pendant lextraction, plus qu
linhibition de lamplification par la liaison des molcules dEMA et de lADN des cellules mortes
(Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Nocker and Camper 2006; Nocker et al. 2006). Cependant, Soejima
et al. ont rcemment report que le traitement direct de lADN avec lEMA, suivi par une irradiation
dans les longueurs donde du visible, entraine une lyse de lADN chromosomique des bactries
mortes (Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Soejima et al. 2007; Soejima et al. 2008). Dans les deux
hypothses, la v-PCR devrait minimiser les faux positifs par rapport la q-PCR.
Le protocole danalyse deau environnementale utilis par Delgado et al. est bas sur celui de la
norme NF T90-471, complt par une tape de sonication des bactries prsentes sur le filtre, aprs
concentration de lchantillon, afin de les remettre en suspension (Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
Cette tape additionnelle est susceptible de tuer des bactries, ce qui peut tre de nature fausser
les carts observs entre les rsultats de v-PCR et de q-PCR. Ainsi, si en systme ferm non filtr
(sans renouvellement ou filtration de leau) labattement du signal est dmontr, en systme ouvert
filtr (avec renouvellement et filtration de leau), il nest pas certain que la diffrence entre les rsultats
de v-PCR et de q-PCR soit aussi importante.
Concernant les faux ngatifs, le signal mis par v-PCR est tre rduit de plus de 99,9 % par rapport
la q-PCR. En utilisant du PMA la place de lEMA, la diminution de plus de 3 log est linaire sur des
3
8
6
concentrations de 10 10 Legionella par filtre. Ainsi, avec 10 Legionella mortes sur le filtre, la vPCR ne quantifiera pas les Legionella car la quantit sera infrieure sa limite de quantification
(Mrault et al. 2009).
Le traitement thermique des chantillons (1h 70C) provoque une nette diminution du signal dtect
en v-PCR, jusqu un signal plancher de lordre de 3,2 log dUG/mL. Cela suggre que des bactries
tues par la chaleur ne sont plus quantifies. Le fait que le mme traitement thermique entraine la
disparition du signal rvlant la prsence de Legionella dans les chantillons analyss avec la
mthode par culture, suggre que le signal dtect par v-PCR correspond des bactries VBNC.
Cependant, selon cette hypothse, il est difficile dinterprter la stabilisation du signal mis par la vFvrier 2011
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Anses
PCR aux environs de 3,2 log dUG/mL, et ce, quelle que soit la dure du traitement thermique (1h, 3h,
ou 5h 70C). En effet, dans ces conditions il semble tonnant de ne pas observer une diminution
progressive du signal de v-PCR au cours du temps, sil correspond effectivement des bactries
viables (Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
La limite de dtection observe en conditions exprimentales (Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Rudi et
al. 2005), elle est de lordre de 200 UG/mL pour un chantillon de 1 mL trait par lEMA.
La slectivit de la mthode par v-PCR est lie celle de ltape de q-PCR quelle intgre (Chang et
al. 2009). Comme cette dernire, la v-PCR est slective 100 % vis--vis de 15 srogroupes de L.
pneumophila (Behets et al. 2007), et permet thoriquement de rechercher slectivement une espce,
un srogroupe, voire un gne de virulence (Fields et al. 2002).
Par ailleurs, contrairement la q-PCR, la v-PCR donne la possibilit de dnombrer les cellules viables
et non viables dune espce particulire de bactrie dans un mlange despces diffrentes (Rudi et
al. 2005). De la mme manire, elle permet de dtecter et dnombrer les L. pneumophila viables dans
un mlange de cellules viables et non viables (Chang et al. 2009; Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
5.2.2.5.5 Rapidit
Le temps danalyse global pour une v-PCR, prtraitement compris, est proche de celui dune q-PCR.
En ltat actuel de dveloppement de la mthode, la v-PCR ncessite en plus une incubation de
lchantillon avec un permabilisant (de lordre d1 heure), et un traitement de lchantillon par
lintercalant (de lordre d1 heure). Au total, la mise en uvre de cette mthode ncessite un peu plus
de 4 heures. Ce temps est galement variable selon le matriel utilis (Chang et al. 2009; CSHPF
2005; Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Rudi et al. 2005).
Lessentiel du matriel ncessaire la mise en uvre dune v-PCR est commun celui ncessaire
la ralisation dune q-PCR (Behets et al. 2007).
Il faut y ajouter les lments ncessaires (Chang et al. 2009; Delgado-Viscogliosi et al. 2005; Rudi et
al. 2005) :
$ au traitement de permabilisation des membranes cellulaires : tolune et alcool isopropylique,
centrifugeuse ;
$ au traitement intercalant : EMA solide commercial, Dimethyl sulfoxide, chambre noire pour
faire le mlange des deux sans lumire, conglateur -20C, micro-tubes de centrifugation
opaques, lampe halogne, centrifugeuse (16000 g).
Thoriquement, cette mthode permet de quantifier les cellules viables et non viables dune espce
bactrienne, directement partir dun chantillon complexe, comme une eau environnementale
(Chang et al. 2009; Rudi et al. 2005).
Diffrents auteurs observent que les rsultats obtenus par v-PCR varient en fonction de la
concentration en EMA (Chang et al. 2009; Chen and Chang 2010).
Les rsultats de cette mthode varient galement en fonction des mmes facteurs que la q-PCR (Joly
et al. 2006) :
$ caractristiques des eaux analyser : charge en particules, en molcules chimiques ;
$ pratiques et quipements des laboratoires. Ce problme a t partiellement rsolu avec
lintroduction dun talon interne commun (ltalon national).
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Anses
5.2.2.8
Avantages et inconvnients thoriques intrinsques de la mthode v-PCR
Tableau 5 : avantages et inconvnients de la v-PCR
Critres
de
priorit
leve
Critres
de
priorit
modre
5.2.3
Avantages
Quantification Legionella pneumophila
Quantification de Legionella pneumophila avec
distinction du srogroupe 1 (en dveloppement)
Prise en compte des Legionella intra amibiennes
ou intra vsiculaires dans la quantification
Legionella viables et potentiellement pathognes
Equipements ncessaires faibles de cot modr
bruts
Non valu
Peut ne pas tre

applicable certaines
eaux trs charges
(biologiquement,
chimiquement ou
physiquement)
Ne permet pas de
disposer de souches
pour des tudes
complmentaires
Distinction et
quantification
des
srogroupes
Lp autre que
sg1
Evolutions possibles des mthodes bases sur lamplification gnique, peu ou pas
testes pour rechercher Legionella dans leau
Sans changer le principe de la mthode de dnombrement de Legionella par q-PCR, telle que dcrite
dans la norme NF T 90-471, il est possible den envisager des variantes, potentiellement plus
performantes ou apportant une information diffrente. Diffrents exemples peuvent tre voqus.
5.2.3.1 Amlioration de lextraction de lADN
Les performances des mthodes de dnombrement de Legionella bases sur lamplification gnique
dpendent fortement de ltape dextraction de lADN. Cette tape et son rendement sont relativement
bien matriss, pour le dnombrement de bactries libres dans leau. En revanche, il subsiste des
incertitudes concernant le rendement de lextraction de lADN des bactries intra amibiennes. Le
dveloppement et la validation dun prtraitement adapt, pour tre sr de les prendre correctement
en compte, semblent une piste damlioration intressante. Certains auteurs voquent par exemple
une extraction base sur une centrifugation laide dun kit spcifique (Wellinghausen et al. 2001).
5.2.3.2 Utilisation de sondes plus slectives
Lutilisation damorces ou de sondes slectives dautres espces que L. pneumophila, ou slectives
de srogroupes ou sous-types particuliers, pourrait permettre de produire des rsultats plus prcis et
plus facilement interprtables dun point de vue sanitaire. Si des souches sont identifies comme plus
pathognes que dautres, il est envisageable thoriquement de les quantifier individuellement.
5.2.3.3 Reverse transcriptase - PCR (RT-PCR)
La RT-PCR est une technique qui associe la transcription inverse (RT) dun brin dARN en ADN
complmentaire (ADNc), suivie dune amplification de lADNc par PCR. Le brin complmentaire
dADNc est gnr partir de lARN bactrien grce ladjonction dADN polymrase ARN
dpendante (Bej et al. 1991; Jones and Foulkes 1989). Cette mthode permet de dtecter et de
quantifier (en UG/l) lARN issu de lexpression de gnes spcifiques dune bactrie, quelle soit dans
un tat viable cultivable ou VBNC (Mahbubani et al. 1991; Oliver 2009).
34
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34
Inconvnients
Critres dinterprtation
pour le risque sanitaire
non disponibles
Anses
En 1991, la limite de dtection de la mthode tait de 1000 UG/mL, cette faible sensibilit tant
probablement due une faible efficacit de lextraction et la grande sensibilit de lARN la
dgradation (Bej et al. 1991). Les recherches bibliographiques nont pas permis de mettre en
vidence de publication plus rcente portant sur lapplication de cette mthode la recherche de
Legionella.
5.2.3.4 Kits de terrain tout en un
Actuellement, lune des contraintes lies au dnombrement de Legionella dans leau par amplification
gnique, est la ncessit de disposer dun laboratoire proche et capable de faire ce type danalyse. Le
dveloppement de kits permettant la ralisation de ces analyses directement sur le terrain pourrait
savrer intressant dans certains contextes.
A titre dexemple, il existe dj des systmes de q-PCR qui permettent une analyse individuelle de
chaque chantillon (avec un thermocycleur par chantillon) et qui ralisent la phase d'extraction et
d'amplification de manire automatise dans une seule cartouche. Ces outils "clef en main" existent
en routine pour le diagnostic rapide de plusieurs pathognes dans les prlvements biologiques mais
ne sont actuellement pas disponibles pour dnombrer les Legionella dans l'environnement.
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Anses
5.3
Mthodes bases sur l'affinit molculaire
5.3.1
Immuno-dtection
La mthode de dnombrement de Legionella, dans leau, par immuno-dtection, ne fait actuellement

pas lobjet dune norme.
5.3.1.1 Principe
Limmuno-dtection regroupe les mthodes permettant de mettre en vidence une ou plusieurs
protines ou pitopes en utilisant des anticorps spcifiques des Legionella. Elle peut tre utilise pour
de la dtection ou le dnombrement en fonction des modalits de sa mise en uvre (Coons et al.
1942).
La spcificit de la mthode est lie lanticorps choisi. Plusieurs anticorps anti-Legionella
pneumophila ou anti-Legionella spp. existent : anticorps polyclonaux ou monoclonaux commercialiss,
publis ou "maison" (Fuchslin et al. 2010; Helbig et al. 1995; Helbig et al. 1997; Riffard et al. 2001;
Sethi et al. 2007; Yanez et al. 2005). Des anticorps spcifiques de L. pneumophila sg1, sg 2-14, ou
des L. pneumophila spp sont galement dcrits. De fortes spcificits peuvent notamment tre
observes avec certains anticorps dirigs contre certains clones de L. pneumophila sg1 ou un
marqueur de virulence (Helbig et al. 1995; Helbig et al. 1997). De fait, la spcificit des anticorps doit
tre teste et prcise.
Limmunofluorescence regroupe les techniques d'immuno-marquage qui permettent de mettre en
vidence une ou plusieurs protines par l'utilisation d'un anticorps spcifique portant un fluorochrome
(Coons et al. 1942).
5.3.1.1.1 Immunofluorescence directe
Un anticorps dirig contre une protine d'intrt (ou l'antigne au sens large) est dit anticorps
primaire. Lorsqu'il est directement coupl au fluorochrome, on parle d'immunofluorescence directe
(Coons et al. 1942).
5.3.1.1.2 Immunofluorescence indirecte
Le plus souvent, l'anticorps primaire ne porte pas le fluorochrome. On utilise alors un deuxime
anticorps (anticorps secondaire), coupl au fluorochrome, spcifique de l'isotype de l'anticorps
primaire. On parle alors d'immunofluorescence indirecte (Dusserre et al. 2008).
5.3.1.1.3 Mthodes de dtection des anticorps fluorescents
Le choix de la mthode de dtection et la quantification des anticorps marqus par le fluorochrome a
un impact sur les performances de la mthode, notamment en termes de rapidit et de robustesse
(Cherry and Thomason 1969) :
$
La microscopie en fluorescence est une technique de microscopie optique qui tire profit du
phnomne de fluorescence pour observer divers composs. Comme toute technique de
microscopie optique, elle est limite par la diffraction de la lumire. Le pouvoir de rsolution
est donc de 200 nm environ. La lecture est manuelle et sa qualit dpend de lentrainement
du technicien.
La cytomtrie est une technique permettant de faire dfiler des particules, molcules ou
cellules grande vitesse devant le faisceau d'un laser. La lumire rmise (par diffusion ou
fluorescence) permet de classer les populations de particules suivant plusieurs critres et de
les trier. Elle permet donc de compter les bactries marques par certains fluorochromes,
dans un chantillon, de manire automatique et rapide. Il existe des cytomtres en flux (FCM)
pour lanalyse dun chantillon fluide (Riedy et al. 1991) et des cytomtres en phase solide
(Dusserre et al. 2008; Mignon-Godefroy et al. 1997) pour lanalyse dun chantillon prsent
sur support solide (filtre). Ces derniers donnent un rsultat en quelques minutes (DelgadoViscogliosi et al. 2005).
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Anses
Ces mthodes permettent de dnombrer des cellules de L. pneumophila ou dautres espces du
genre Legionella, sans distinction entre les cellules viables et non viables (Delgado-Viscogliosi et al.
2005).
De manire gnrale, les mthodes mettant en uvre limmuno-dtection sont applicables aux eaux
peu charges pour tre filtrables, mais restent limites pour lanalyse dchantillons environnementaux
non filtrables (Dusserre et al. 2008). Cependant la nature des matrices analysables par limmunodtection dpend en grande partie de la mthode utilise pour dtecter les cellules marques par
fluorescence. Dans le cas o les cellules dnombrer sont rares et quil est ncessaire de concentrer
lchantillon par filtration, il ne sera pas possible dutiliser la mthode de dtection par cytomtrie en
flux pour laquelle les chantillons analyss doivent tre liquides. Les techniques de dtection par
cytomtrie en phase solide ou par microscopie en fluorescence permettent lanalyse dchantillons
pralablement filtrs. Compte tenu de leurs limites de dtection respectives, seule la mthode par
cytomtrie en phase solide permet de dnombrer les cellules dans un chantillon trs peu concentr
(Aurell et al. 2004; Lemarchand et al. 2001).
Des micro-biocapteurs pour limmuno-dtection en temps rel de Legionella pneumophila dans les
prlvements environnementaux seraient en cours de dveloppement et dvaluation.
Le volume dchantillon ncessaire dpend de la concentration en cellules marques, par rapport aux
cellules non marques (ne portant pas lantigne recherch). Plus la concentration en cellules non
marques est importante et plus il est ncessaire que la concentration en cellules marques soit
importante pour que cette mthode soit applicable.
5.3.1.4.1 Cas dune dtection par microscopie en fluorescence
8
Dans ce cas, titre dexemple, avec une concentration en cellules non marques de 1,36.10 cellules
/ litre, les volumes ncessaires calculs, dans le cadre dune tude, taient de (Lemarchand et al.
2001) :
$
$
$
1 mL pour une concentration en cellules marques suprieure ou gale 10 /L ;

6
10 mL pour une concentration en cellules marques suprieure ou gale 10 /L ;
5
100 mL pour une concentration en cellules marques suprieure ou gale 10 /L.
Daprs cette tude, la mthode est non applicable si la concentration en cellules marques est
5
infrieure 10 /L, valeur en dessous de laquelle la distribution des cellules sur la membrane nest plus
homogne.
5.3.1.4.2 Cas dune dtection par cytomtrie en flux
8
Dans ce cas, titre dexemple, avec une concentration en cellules non marques de 1,36.10
cellules/L, les volumes ncessaires calculs, dans le cadre dune tude, taient de (Lemarchand et al.
2001) :
$
$
100 L pour une concentration en cellules marques suprieures ou gale 10 /L ;

6
1 mL pour une concentration en cellules marques suprieures ou gale 10 /L.
La mthode est non applicable pour un chantillon de moins de 100 L.

Pour garantir un taux de reproductibilit acceptable et parce que lanalyse du volume ncessaire
prendrait trop de temps, la mthode est non applicable si la concentration en cellules marques est
6
infrieure 10 /L, car les volumes analyser seraient trop importants pour le cytomtre en flux.
5.3.1.4.3 Cas dune dtection par cytomtrie en phase solide
Dans ce cas, titre dexemple, dans le cadre dune tude, avec une concentration en cellules non
8
marques de 1,36.10 cellules/L, les volumes ncessaires calculs tait de (Lemarchand et al. 2001) :
$
$
0,1 L pour une concentration en cellules marques suprieures ou gale 10 /L ;
1000 mL pour une concentration en cellules marques suprieures ou gale 1/L.
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Anses
5.3.1.5
5.3.1.5.1 Justesse
Concernant les faux positifs, il est difficile den valuer la proportion, pour lanalyse dchantillons
naturels. Ceci est d dune part au manque de rfrence pour les "vrais positifs", dautre part la
fluorescence endogne. En effet, les mthodes par culture et par immuno-dtection ne mesurant pas
la mme chose, respectivement le nombre de cellules cultivables et le nombre total de cellules, il est
difficile de dterminer le nombre de "vrais positifs" avec exactitude dans un chantillon deau
environnementale (Lemarchand et al. 2001).
Concernant les faux ngatifs, leur proportion est trs faible si leau analyse est propre et si lanticorps
spcifique est bien choisi (Lemarchand et al. 2001). En revanche, si leau est charge il y a un risque
dadsorption de Legionella sur les matires en suspension, ce qui peut rendre les anticorps
inaccessibles.
Concernant la reproductibilit, selon certains auteurs, avec une dtection par cytomtrie en phase
solide, le coefficient de variation est de lordre de quelques pourcents et rarement suprieur 10 %
(Lemarchand et al. 2001).
Dans le cas de limmunofluorescence indirecte la limite de dtection thorique est dune bactrie par
chantillon filtr (Dusserre et al. 2008). En pratique, avec une dtection par microscopie en
6
fluorescence, selon certains auteurs, la limite de quantification est de lordre de 5.10 cellules
marques par litre dchantillon. Cette valeur tant infrieure la limite de dtection de la mthode,
elle semble donc non applicable.
Les cellules marques ne peuvent pas tre dtectes quand elles reprsentent moins de 0,01 % de la
quantit de cellules prsentes dans lchantillon, car leur marquage fluorescent est masqu par les
cellules non marques (Lemarchand et al. 2001).
Si leau nest pas trop charge, dans le cas o les cellules dnombrer dans lchantillon sont rares, il
est possible de les concentrer par filtration. Avec une dtection par cytomtrie en flux, la limite de
dtection avec un marquage de L. pneumophila sg1 serait de lordre de 2000 cellules/mL dchantillon
6
pass en cytomtrie (Fuchslin et al. 2010). La limite de quantification serait de lordre de 10 cellules
marques par litre dchantillon. Avec une dtection par cytomtrie en phase solide (Lemarchand et
al. 2001), la limite de quantification est de une cellule marque par litre dchantillon. Dans le cas o
les cellules dnombrer sont rares cette mthode permet de les concentrer par filtration dun volume
dchantillon important.
Daprs la bibliographie, la spcificit de limmunofluorescence directe serait trs bonne, si des
anticorps monoclonaux spcifiques de L. pneumophila sont utiliss. Elle a t teste sur des
chantillons deau du robinet (Aurell et al. 2004).
La microscopie en fluorescence permet de distinguer visuellement les cellules bactriennes marques
par le fluorochrome des ventuels autres lments fluorescents.
La cytomtrie en flux compte lensemble des lments fluorescents, quils correspondent des
cellules bactriennes ou pas.
5.3.1.5.5 Rapidit
La dtection des anticorps par cytomtrie en phase solide est une mthode relativement rapide qui
permet de mener lanalyse complte dun chantillon par immunofluorescence en moins de 4 heures
(Aurell et al. 2004; Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
Le matriel ddi cette mthode est principalement constitu de lappareil de dtection : cytomtre
en phase solide ou en phase liquide et/ou microscope en fluorescence. Il est galement ncessaire de
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Anses
disposer des fluorochromes adapts et des anticorps spcifiques de Legionella spp. ou Legionella
pneumophila.
Le reste du matriel ncessaire est relativement commun dans un laboratoire danalyse.
Peu de donnes ont t rpertories concernant la robustesse des mthodes bases sur ce principe.
Il faut cependant noter lapparition de kits de terrain bass sur limmuno-dtection. Des kits de ce type,
notamment commercialiss en Grande Bretagne, sont vendus pour la ralisation danalyses semiquantitatives de L. pneumophila sg1 ("Mthode de dtection : Lateral flow immunochromatographic
assay").
5.3.1.8
Avantages et inconvnients thoriques intrinsques de la mthode par immuno-dtection
Tableau 6 : avantages et inconvnients de limmuno-dtection
Critres
de
priorit
leve
Critres
de
priorit
modre
5.3.2
Avantages
Quantification Legionella
pneumophila
pneumophila avec distinction du
srogroupe 1
Dtection notamment de
lensemble des Legionella viables
et potentiellement pathognes
Legionella spp (thoriquement,
mais dvelopper)
Faisabilit, simplicit (modre)
rsultats bruts
35
Inconvnients
Non prise en compte des
Legionella intra amibiennes ou
quantification
Dtecte les Legionella mortes
Critres dinterprtation pour le
risque sanitaire non disponibles
Non valu
Applicable sur
des chantillons
deau traite
Pas applicable certaines eaux

trs charges (biologiquement,
chimiquement ou physiquement)
importants (dpend fortement de
la mthode de dtection adopte)
Permet de
disposer de
souches pour des
tudes
complmentaires
(Thoriquement
possible)
Fluorescence In Situ Hybridation (FISH)
La mthode de dnombrement de Legionella, dans leau, par FISH, ne fait actuellement pas lobjet
dune norme.
5.3.2.1 Principe
La mthode FISH est une technique de biologie molculaire utilisant une sonde nuclique spcifique
de la cible, couple un fluorochrome, qui semble permettre de dtecter et quantifier simultanment
des Legionella spp et des L. pneumophila (Amann et al. 2001; Amann et al. 1995). Aprs traitement
avec une solution contenant des sondes spcifiques de Legionella spp et de certains srogroupes de
L. pneumophila, lchantillon est observ ou scann sous microscope fluorescence. Les Legionella
spp apparaissent dune couleur diffrente des L. pneumophila.
En utilisant des sondes adaptes, cette mthode pourrait permettre le dnombrement de L.
pneumophila (sonde spcifique de lARNr 16S pour L. pneumophila) ou spp viables, avec comme
inconvnient la possibilit de dtecter les bactries mortes intgres, aussi bien cultivables que non
cultivables, dans un chantillon deau (Amann et al. 2001; Amann et al. 1995).
La mthode est thoriquement applicable tout type deau, eau chaude sanitaire comme eaux de
tours arorfrigrantes.
35
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Anses
Les rsultats sont gnralement satisfaisants avec des eaux peu charges, moins en prsence de
particules. Cela rend son application aux biofilms (biofilms mis en suspension) problmatique : en
effet, les L. pneumophila situes au sein damas de matire organique ont une accessibilit la sonde
diminue et / ou voient leur fluorescence masque. Il faut galement tenir compte de la fluorescence
endogne.
Le volume dchantillon filtr doit tre adapt la charge particulaire de la suspension, ce qui diminue
la sensibilit de la dtection, dans le cas de lanalyse dune eau trs charge.
5.3.2.5
5.3.2.5.1 Justesse
La sensibilit de la mthode est dpendante de la technique de lecture utilise. Elle est limite si la
visualisation est ralise laide dun microscope (vnements rares non dtects). Elle peut tre
amliore si la visualisation des rsultats est ralise laide dun scanner automatique.
Il existe plusieurs sondes "Legionella" : LEG226 et LEG705 marquant les Legionella spp., tandis que
LEGPNE1 est spcifique de L. pneumophila srogroupe 1,3,4 et 6 (Grimm et al. 1998). Il a t
dmontr depuis, que cette sonde marque galement les srogroupes 2, 7 et 11 ainsi que certaines L.
pneumophila de srogroupe 9, 10 et 13. Par contre sa spcificit a galement t remise en question
car elle marquerait aussi L. micdadei srogroupe 1 ; L. gormanii srogroupe 1, L. feeleii srogroupe 1,
L. jordanis srogroupe 1, etc. Lune des alternatives serait dutiliser une sonde PNA (peptide nucleic
acid) telle que PLPNE620 (Wilks and Keevil 2006), dans laquelle des liaisons 2-aminoethyl-glycine
remplacent les liaisons phosphodiester. Ces sondes sont plus petites et peuvent donc accder des
zones de lARN 16S qui sont inaccessibles aux sondes classiques, ce qui leur donnerait une meilleure
spcificit
5.3.2.5.5 Rapidit
Le temps de marquage est de lordre de quelques heures et, lecture de chaque lame comprise, les
rsultats peuvent tre obtenus dans la journe. La lecture manuelle des lames est fastidieuse (Wilks
and Keevil 2006).
La mthode ncessite un microscope pifluorescence voire un scanner automatique, quip d'une
camra pour la prise de photos, car la comparaison du mme champ color au diamidino-4',636
phnylindol-2 dichlorhydrate est obligatoire pour viter des faux-positifs, particulirement sur les
lames charges en particules.
Lun des principaux intrts de cette mthode est sa simplicit. Lidentification de Legionella en culture
est rserve du personnel trs qualifi alors quune dtection de fluorescence peut tre
automatise. Cette technique ne ncessite aucune tape de culture.
Dans le cas dune application non automatise, cette technique ncessite un important temps
oprateur.
36
Le diamidino-4',6-phnylindol-2 dichlorhydrate (DAPI) est un colorant fluorescent qui appartient au groupe des colorants
indol. Le DAPI est utilis pour la coloration de lADN, pour la coloration nuclaire, pour la coloration de cellules vivantes et pour
la contre-coloration dans les colorations fluorescentes de matriel botanique et humain et dans la cytomtrie de flux.
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Anses
5.3.2.8
Avantages et inconvnients thoriques intrinsques de la mthode FISH
Tableau 7 : avantages et inconvnients du FISH
Critres
de
priorit
leve
Critres
de
priorit
modre
5.3.3
Avantages
pneumophila
lensemble des Legionella
viables et potentiellement
pathognes
Inconvnients
Dtecte les Legionella
mortes
Critres dinterprtation
pour le risque sanitaire
non disponibles
Quantification de lensemble
des Legionella spp
faibles
Interprtation technique simple
des rsultats bruts
Distinction et de
quantification des
srogroupes Lp autre que
sg1
Temps technicien
important
Ne permet pas de
disposer de souches pour
des tudes
complmentaires
37
Non valu
pneumophila avec distinction
du srogroupe 1
Prise en compte des
Legionella intra amibiennes
ou intra vsiculaires dans la
quantification
Applicable sur des
chantillons deau traite
(Thoriquement oui)
Applicable aux eaux trs
charges (En
dveloppement)
Evolutions possibles des mthodes bases sur laffinit molculaire, peu ou pas
testes pour rechercher Legionella dans leau
Toujours sur le principe de laffinit molculaire, il est possible denvisager le dveloppement de

mthodes plus performantes, ou apportant des informations supplmentaires par rapport celles dj
utilises pour le dnombrement de Legionella dans leau. Diffrents exemples peuvent tre voqus.
5.3.3.1 Mthode base sur laffinit des groupes dhydrates de carbone la surface des cellules
En parallle de la dtection des bactries par immunocapture, une capture base sur laffinit des
groupes dhydrates de carbone (sucres) a t dveloppe rcemment (El-Boubbou et al. 2007). En
effet la premire tape de linfection bactrienne est la fixation de la bactrie sur des groupes
dhydrates de carbone la surface des cellules. El Boubbou a donc eu lide de fixer des sucres sur
des billes magntiques pour capter les bactries. Il a test son modle sur Escherichia coli et Bacillus
4
anthracis. II a montr une sensibilit de 10 bactries par mL. Cette mthode pourra peut-tre
sappliquer aux Legionella.
5.3.3.2 Mthode base sur la dtection de protases spcifiques
Une mthode de dosage dune activit enzymatique spcifique de Legionella pneumophila au moyen
dun substrat slectif fluorencence rprime serait galement en cours de dveloppement. Elle
pourrait permettre leur dnombrement dans leau (brevet non publi ce jour). Aucune publication
nest encore disponible sur le sujet.
5.3.3.3 Mthode mettant en uvre des biocapteurs
Depuis une vingtaine dannes, des systmes de dnombrement de bactries automatisables ont t
tests. De nouveaux systmes dnomms biocapteur, immunocapteur ou nanodetecteur, font leur
apparition. Un biocapteur peut dtecter des composs chimiques et biologiques dans un chantillon
environnemental, ceci provoquant un signal suite la liaison avec un biorcepteur. Ce signal peut tre
quantifi. La reconnaissance de lanalyte cibl peut se faire laide dantignes, danticorps, dacides
nucliques, de cellules entires ou denzymes spcifiques combins ou non un transducteur. Le
signal produit par la liaison de lanalyte et de son biorcepteur peut tre dtect par un systme
37
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Anses
optique, lectrochimique, calorimtrique, acoustique, pizo-lectrique, magntique, etc. (Nayak et al.
2009; Velusamy et al. 2010).
Quelques-uns de ces systmes ont t conus pour la dtection dvnements rares comme la
prsence de Legionella (Cooper et al. 2009; Oh et al. 2003; Yoon et al. 2003).
Parmi les mthodes sensibles, on peut citer les mthodes lectrochimiques : par exemple, MirandaCastro et al proposent un test permettant la dtection de lADN de L. pneumophila dans les
2
chantillons environnementaux partir de 10 gnomes, avec possibilit dobserver une diffrence
3
4
significative avec 10 et 10 gnomes (Miranda-Castro et al. 2009).
Le dveloppement de puces ADN, spcifiquement pour la dtection, voire le dnombrement de
Legionella dans leau, semble galement envisageable (Brevet WO 2008/082290 (A1)).
Wolter et al., proposent quant eux un systme danticorps coupls biotine/streptavidine fix sur un
support original permettant la dtection en 13 minutes de trois pathognes simultanment : S.
typhimurium, L. pneumophila et E. coli O157:H7, avec respectivement une limite de dtection de
6
5
3
3.10 , 10 et 3.10 cellules/mL. Ils prcisent galement que ce systme peut tre combin des
tapes denrichissement par filtration ou sparation immuno-magntiques abaissant la limite de
dtection 1 cellule/100 mL deau (Wolter et al. 2008).
Ces technologies peuvent galement tre associes un montage fluidique (gomtrie,
rhodynamique) permettant une recirculation de lchantillon et optimisant la capture des cellules
rares (projet non publi en cours).
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Anses
Description des mthodes de dnombrement slectif de Legionella utilisant

plusieurs principes
Certaines mthodes encore trop peu dveloppes et documentes pour permettre une valuation de
leurs avantages et inconvnients sont succinctement dcrites dans les sous chapitres Evolutions
possibles des mthodes .
6.1
Double marquage immunologique (IDS)
La mthode de dnombrement de Legionella dans leau, par IDS (Immunological double-staining), ne

fait actuellement pas lobjet dune norme.
6.1.1
Principe
Cette mthode combine la mthode TVC (dcrite dans le chapitre "5.1.3.4. Mthode par examen de
lintgrit des cellules bactriennes ou dtection dune activit mtabolique") pour compter les
cellules vivantes et limmuno-dtection (immunoflorescence directe) pour compter les Legionella
slectivement marques par un autre fluorochrome. La proportion des cellules viables et non viables
est dtermine visuellement, sur un chantillon de 100 cellules, par comptage au microscope optique
(Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
6.1.2
Informations apportes par les rsultats
Cette mthode permet le dnombrement de cellules de Legionella spp. ou de L. pneumophila viables.

6.1.3
Matrice dapplication
Cette mthode a t utilise pour lanalyse deau environnementale. Elle est adapte des eaux peu
charges, pour lesquelles il est envisageable de concentrer les cellules de Legionella par filtration. A
titre dexemple, cette mthode est applicable aux eaux chaudes sanitaires. En revanche, il semble
dlicat danalyser de leau provenant de tours arorfrigrantes avec cette mthode, car leur charge
en particules est susceptible dinterfrer avec lanalyse microscopique (Delgado-Viscogliosi et al.
2005).
6.1.4
Echantillon ncessaire / le cas chant mthode dchantillonnage prconise
Les particules prsentes dans les chantillons deau environnementale peuvent poser problme pour
le comptage et la visualisation des bactries, en augmentant le bruit de fond (des particules autres
que les bactries peuvent tre marques par les fluorochromes). Ainsi, pour chaque chantillon deau
environnementale, un volume (50 100 mL) est filtr en fonction de sa charge en particules. Pour un
chantillon deau environnementale, la filtration de plus de 100 mL nest pas recommande car les
particules prsentes dans leau sont susceptibles de gnrer un bruit de fond trop important
6.1.5
6.1.5.1 Justesse
6.1.5.2 Fidlit, reproductibilit
Concernant la reproductibilit, le coefficient de variation maximum observ serait de lordre de 1 %
6.1.5.3 Sensibilit
La sensibilit de la mthode dpend du volume dchantillon filtr et du nombre de zones
microscopiques examines sur le filtre. Selon Delgado-Viscogliosi, elle est de 176 cellules de
Legionella par litre, pour un chantillon de 100 mL et 100 zones du filtre examines. Elle peut
thoriquement atteindre 1 cellule de Legionella par litre si lensemble de la membrane de filtration est
examin. Des essais comparatifs semblent montrer que la mthode par IDS serait plus sensible que
la mthode par culture (Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
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Anses
6.1.5.4 Spcificit, slectivit
Slectivit et spcificit de la mthode dpendent des caractristiques des anticorps vis--vis de leur
cible. Pour la recherche de L. pneumophila, un anticorps spcifique 100 % est disponible. Pour la
recherche de L.spp, lanticorps disponible serait spcifique 75 % (Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
6.1.5.5 Rapidit
Une analyse complte ralise laide de cette mthode prendrait de lordre de quelques heures
6.1.6
Matriel ncessaire
Le matriel ncessaire pour la mthode IDS est principalement constitu de lappareil de dtection
ncessaire limmuno-dtection (cytomtre en phase solide ou en phase liquide et/ou microscope en
fluorescence), des fluorochromes adapts et des anticorps spcifiques de L. spp. ou L. pneumophila.
A ceci, il faut ajouter le marqueur de viabilit ncessaire la partie TVC de la mthode : prcurseur
non fluorescent, qui une fois internalis par la cellule bactrienne vivante peut tre cliv par des
enzymes bactriennes en un produit fluorescent (Delgado-Viscogliosi et al. 2005). Le reste du
matriel ncessaire est relativement commun dans un laboratoire danalyse.
6.1.7
Robustesse, comptences ncessaires, simplicit
La prsence de particules accumules pendant la phase de concentration des chantillons peut

parfois interfrer avec le comptage des cellules ralis au microscope (Delgado-Viscogliosi et al.
2005).
Lnumration des cellules au microscope ncessite un entrainement du personnel. Les cellules de
Legionella prsentes dans les chantillons deau environnementale sont plus petites que celles
prsentes dans les cultures in vitro. Cette opration peut tre lorigine dune fatigue de loprateur
Lautomatisation de la mthode par lutilisation de la cytomtrie en phase solide est possible, mme si
elle ne permettrait pas un gain de temps important. En effet, il est ncessaire de valider chaque
chantillon positif par dnombrement au microscope pour viter les faux positifs (Delgado-Viscogliosi
et al. 2005).
6.1.8
Avantages et inconvnients thoriques intrinsques de la mthode IDS
Tableau 8 : avantages et inconvnients de lIDS
Critres
de
priorit
leve
Critres
de
priorit
modre
38
Avantages
pneumophila
srogroupe 1
Distinction et de quantification
des srogroupes Lp autre que
sg1
des rsultats bruts
Inconvnients
Critres dinterprtation pour
le risque sanitaire non
disponibles

(biologiquement,
chimiquement ou
physiquement)
important (dpend fortement
de la mthode de dtection)
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38
Non valu
Prise en compte des
Legionella intra
amibiennes ou intra
vsiculaires dans la
quantification
Applicable sur des
chantillons deau traite
Non dtection des
Legionella mortes
Quantification de
lensemble des Legionella
spp (thoriquement, mais
dvelopper)
Permet de disposer de
souches pour des tudes
complmentaires
(Thoriquement possible)
Anses
6.2
Culture-FISH
La mthode de dnombrement de Legionella, dans leau, par culture-FISH, ne fait actuellement pas
lobjet dune norme. Par ailleurs lensemble des lments relatifs cette mthode sont issus dune
seule publication.
6.2.1
Principe
Cette mthode fait appel deux principes distincts : celui de la culture et celui du FISH. Comme le
FISH, elle est base sur lutilisant de sondes nucliques spcifiques permettant de dtecter et
quantifier simultanment Legionella spp et L. pneumophila. Cette dtection est ralise aprs une
tape de culture. Un volume deau est filtr sur membrane de nitrocellulose de porosit 0,45 m.
Aprs traitement acide, les membranes sont dposes sur milieu MWY et incubes 36C pendant 3
jours. Aprs traitement avec une solution contenant des sondes spcifiques des Legionella spp et L.
pneumophila, la membrane est observe ou scanne sous microscope fluorescence. Les Legionella
spp apparaissent dune couleur tandis que les L. pneumophila apparaissent dune autre couleur
(Ditommaso et al. 2010).
6.2.2
Informations apportes par les rsultats
Dans la mesure o la phase de culture dure 3 jours, cette mthode est conue pour la dtection et le
comptage des L. pneumophila cultivables, plus rapidement que par la mthode par culture
conventionnelle.
6.2.3
Matrice dapplication
La mthode est, a priori, applicable tout type deau, avec les mmes limites que la culture (flore
interfrentes, etc.) : eaux de rseaux deau chaude sanitaire, eaux de tours arorfrigrantes.
Cependant, peu de publications faisant lobjet dune application de cette mthode des chantillons
deau chaude sanitaire ou deau de tour arorfrigrante ont t rpertories. Ditommaso a utilis
cette technique en ralisant des analyses en culture classique et en culture-FISH en parallle, sur 79
chantillons deau provenant de 10 hpitaux en Italie (Ditommaso et al. 2010).
6.2.4
Echantillon ncessaire / le cas chant mthode dchantillonnage prconise
Base en partie sur la culture, cette mthode traite a priori des volumes quivalents. Cependant
Ditommaso a utilis cette technique en analysant en parallle des chantillons de 1 L par culture
classique et de 50 mL par culture-FISH (Ditommaso et al. 2010).
6.2.5
6.2.5.1 Justesse
6.2.5.2 Fidlit, reproductibilit
6.2.5.3 Sensibilits
La sensibilit du test est estime 91%, en utilisant la culture comme standard. Il faut cependant
noter que les concentrations trouves sont systmatiquement suprieures avec la technique de
culture par rapport culture-FISH. Cependant les rsultats de cette tude sont prendre avec
prcaution, car les mthodes sont utilises sur des volumes diffrents et les eaux sont filtres sur des
filtres diffrents (Ditommaso et al. 2010).
6.2.5.4 Spcificit, slectivit
La spcificit est de lordre de 82% (Ditommaso et al. 2010). Les limites lies aux sondes sont les
mmes que celles dj voques dans le chapitre relatif la mthode FISH.
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Anses
6.2.5.5 Rapidit
Selon la seule tude rpertorie sur le sujet, lanalyse dun chantillon par cette mthode demande
environ 3 jours (Ditommaso et al. 2010).
6.2.6
Matriel ncessaire
La mthode ncessite : des sondes molculaires spcifiques de Legionella spp et des L.

pneumophila ; du milieu MWY (milieu BCYE supplment de glycine, polymyxine B, anisomycine,
vancomycine), une tuve 36C, un microscope fluorescence voire un scanner automatique.
6.2.7
Robustesse, comptences ncessaires, simplicit
Cette mthode, plus rapide que la culture classique, prsente lintrt dtre relativement simple
mettre en uvre. Elle peut de surcrot tre automatise.
6.2.8
Avantages et inconvnients thoriques intrinsques de la mthode Culture FISH
Tableau 9 : avantages et inconvnients de la culture FISH
Critres
de
priorit
leve
Critres
de
priorit
modre
39
Avantages
pneumophila
Applicable sur des chantillons
deau traite

Legionella species
rsultats bruts
Permet de disposer de souches pour
des tudes complmentaires
Inconvnients
Pas de prise en compte des
Legionella intra amibiennes ou
quantification
Ne dtecte pas lensemble des
Legionella viables et
risque sanitaire non disponibles
(biologiquement, chimiquement
ou physiquement)
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39
Non valu
Quantification
de Legionella
pneumophila
avec distinction
du srogroupe 1
Anses
6.3
Evolutions possibles des mthodes utilisant plusieurs principes, peu ou pas

testes pour rechercher et identifier Legionella dans leau
Toujours en combinant plusieurs principes danalyse, le dveloppement dautres mthodes plus

performantes ou apportant des informations supplmentaires est envisageable. Diffrents exemples
sont voqus ci-aprs, cette liste ntant pas exhaustive.
6.3.1
DVC-FISH
6.3.1.1 Principe
Ce procd consiste : mettre l'chantillon en contact avec une source nutritive de cellules et un
inhibiteur de la division cellulaire, cet chantillon est ensuite mis en contact avec au moins une sonde
oligonuclotidique marque par fluorescence, slective de L. pneumophila, dont le signal est
dtectable et amplifiable (Brevet WO2009EP53299 20090320 ; Abrg WO 2009/121727 (A1).
Aucune publication relatant lapplication de cette mthode au dnombrement de Legionella na t
rpertorie.
Cette mthode est conue pour permettre la dtection et le dnombrement de microorganismes
viables dans un chantillon.
6.3.2
Desorption-ionisation laser assiste par matrice (Spectromtrie de masse MALDI-TOF)
6.3.2.1 Principe
La spectromtrie de masse MALDI-TOF, couple ou non une amplification gnique, permet
lidentification et le typage des micro-organismes (bactries, virus, champignons) partir des colonies
ou des prlvements. Lidentification repose sur lanalyse des protines totales ou dune fraction
amplifie de lADN, gnralement un amplicon de lADN 16 S. Cette analyse consiste en lionisation
des molcules avec la technique de dsorption laser assiste par la matrice dinclusion de
lchantillon (MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption Ionization). Le produit identifier (souche ou
prlvement) est inclus dans une matrice et immobilis sous forme de cristaux sur un support inerte.
Le complexe produit-matrice est bombard par un faisceau laser mettant dans la zone dabsorption
de la matrice. Les ions gnrs dans la chambre dionisation sont acclrs dans un champ lectrique
et lanalyseur permet de sparer et de classer les ions acclrs selon leur temps de vol libre (TOF :
Time-Of-Flight). Selon le rapport masse/charge (m/z), les molcules les plus petites sont les
premires arriver au dtecteur. Les molcules qui ont le mme rapport m/z sont spares grce
un miroir lectrostatique. Les spectres sont lus dans la gamme de masse 2000 20000 daltons. La
qualit de lidentification est fonction de la richesse de la banque de spectres enregistrs (Courcol
2009).
Seules 3 publications internationales concernant la spectromtrie de masse applique
40
lidentification des Legionella (Moliner et al. 2010) et le typage (Fujinami et al. 2011) taient
disponibles en mai 2010.
La spectromtrie de masse permet de dtecter de lADN de bactries amplifi par PCR. Cela a t
41
dcrit pour Legionella (Hurt et al. 2010). La mthode permet, aprs avoir dessal les amplicons et
limin les rsidus non amplifis, lidentification de fragments de 40 168 rsidus (Courcol 2009; Hurt
et al. 2010). Cette mthode a t applique aux gnes de lADNr 16 S en y associant des
amliorations pour la lecture de fragments de plus grande taille (Von Wintzingerode et al. 2002). Les
modifications de squence nuclotidique sont dtermines selon les modifications de la masse. Les
signaux de masses obtenus sont compars ceux gnrs par les squences publies de lADNr 16
S. Cette technique permet de caractriser aussi bien les bactries cultives que non cultivables.
40
41
Identification de lADN de bactries amplifies

Purification des amplicons pour liminer les rsidus non amplifis.
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Anses
Dans le cas de lanalyse des protines totales, la mthode ne peut sappliquer un mlange bactrien
complexe. Elle ncessite de disposer dune colonie isole ou dun mlange compos dun faible
nombre despces distinctes. Lclatement du protome de la colonie constitue une signature
spcifique permettant lidentification de la bactrie par comparaison avec une banque de signatures.
Le mlange des signatures rend lanalyse des rsultats dautant plus complexe que les souches en
prsence sont nombreuses.
Cette mthode est robuste pour lidentification de Legionella au niveau de lespce. Elle ne permet
pas de discriminer les Legionella au niveau des srogroupes et notamment les srogroupes de
Legionella pneumophila (Moliner et al. 2010).
Aucune donne rpertorie ne concerne la quantification de bactries par cette approche.
Lidentification de Legionella partir dun chantillon complexe est encore ltude. Trs peu de
donnes sont disponibles concernant lapplication de la spectromtrie de masse aux prlvements
environnementaux. Rcemment, Penannec et al. (2010) ont dcrit un protocole appliqu 2
chantillons deau (TAR) (Pennanec et al. 2010). Les rsultats sont encore trs prliminaires et ne
permettent pas de conclure. Cette technique didentification, trs rapide, pourrait permettre
daugmenter la sensibilit et la slectivit de la mthode par culture (cela est dtaill dans la
pargraphe 5.1.3.3).
6.3.3
La chromatographie liquide haute pression en condition dnaturante (dHPLC) couple

la PCR
6.3.3.1 Principe
La dHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography) est une mthode
chromatographique par couplage dions en phase inverse permettant la dtection rapide de
polymorphismes de lADN. Initialement mise au point pour la recherche des mutations ponctuelles
(Frueh and Noyer-Weidner 2003), cest une mthode danalyse qualitative et semi-quantitative qui fait
normalement suite une raction damplification par PCR et permet de dterminer la teneur en
espce(s) molculaire(s) de lamplicon gnr et ventuellement leur identit par comparaison avec
une banque de signatures molculaires. Lamplicon peut tre simple (espce molculaire unique) ou
complexe (mlange despces). Lamplification par PCR permet la fois de disposer dune quantit
suffisante de matriel, dhomogniser la taille de lADN analys et dintroduire, grce lune des
amorces, une squence GC riche (GC-clamp) afin de crer une zone haute temprature de fusion
(donc plus rsistante la dnaturation) une des extrmits du produit PCR (Wurzburger et al.
2003).
Le systme danalyse se compose dun appareil HPLC, dune cartouche de phase stationnaire
constitue de billes non poreuses de styrne-divinylbenzne alkyl et une phase mobile comprenant
de lactate de trithylammonium (TEAA) et de lactonitrile. La cartouche de phase stationnaire est
place dans un four temprature constante afin dobtenir une dnaturation partielle de lamplicon. La
neutralisation par le TEAA des charges ngatives permet ladsorption de lADN sur la phase
stationnaire. Cette adsorption varie en fonction de la temprature de fusion (TM), laquelle est lie la
composition en base des espces molculaires prsentes dans lchantillon. Llution progressive est
obtenue par un gradient linaire dactonitrile. La teneur en ADN de llut est analyse 260 nm par
un dtecteur UV et retranscrite sous forme dun chromatogramme.
La position des pics obtenus sur le chromatogramme correspond la signature de lespce ou des
espces molculaires reprsente(s) dans lchantillon. Laire des pics reflte leur abondance relative.
Dans le cas dun amplicon simple, cette abondance peut tre prcise en utilisant lors de ltape
initiale une q-PCR, au lieu dune PCR simple, la quantification tant alors en UG/L. Le systme
permet aussi bien de rechercher une espce particulire en utilisant un couple damorces hautement
spcifiques que dvaluer la composition dun mlange en utilisant des amorces gnriques.
Mme si elle a t utilise pour lanalyse dchantillon deau (Barlaan et al. 2005), la mthode na pas
encore t teste sur Legionella. Elle devrait thoriquement tre capable dapporter une rponse
rapide des questions complexes comme la composition de mlanges despces diffrentes de
Legionella dans une installation, en permettant didentifier lesdites espces et leurs proportions
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Anses
relatives dans le mlange sans passer par la culture. Chaque variation de squence se traduisant par
un dplacement de la position du pic dans le chromatogramme.
Les matrices dapplications sont thoriquement les mmes que celles utilisables pour la q-PCR et la vPCR. Les limites sont identiques, en particulier vis--vis des inhibiteurs de la PCR. Cependant, ce
jour, aucune publication rpertorie ne relate lutilisation de cette mthode pour le dnombrement de
Legionella dans leau.
6.3.4
IMS - ATP-mtrie
6.3.4.1 Principe
Cette mthode associe la sparation immuno-magntique, (dcrite dans le chapitre 4.3.1.) pour
concentrer les bactries cibles laide danticorps slectifs, et lvaluation du taux de bactries cibles
vivantes par ATP-mtrie (dcrite dans le chapitre 7.1.2.) (Bushon et al. 2009; Lee et al. 2010).
Cette mthode pourrait thoriquement permettre dvaluer spcifiquement le taux de Legionella spp
ou L. pneumophila dans un chantillon deau. Il nexiste cependant actuellement aucune publication
relatant sa mise en uvre pour la dtection de Legionella vivantes.
Les matrices dapplications sont thoriquement les mmes que celles utilisables avec la sparation
immuno-magntique et lATP-mtrie, leau environnementale en faisant partie. Cependant, ce jour,
aucune publication rpertorie ne relate lutilisation de cette mthode pour le dnombrement de
La combinaison de lIMS et de lATPmtrie ne prsente pas de difficult de mise en uvre majeure et
il pourrait tre envisageable de lutiliser sur le terrain.
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Anses
Analyses susceptibles dapporter une information dcisionnelle

complmentaire.
Les mthodes voques dans le prsent chapitre ne sont pas des mthodes de dnombrement de
Legionella dans leau. A ce titre, elles sortent du champ de la saisine et font lobjet dune description
succincte. Cependant, le groupe de travail a estim important dexaminer les principes et objectifs de
mthodes susceptibles dapporter une information complmentaire aux dnombrements de Legionella
dans leau, notamment dans les contextes particuliers de gestion des installations deaux chaudes
sanitaires et de tours arorfrigrantes.
7.1
7.1.1
Recherche de flore totale

Culture
La flore msophile arobie totale est un indicateur sanitaire qui permet d'valuer le nombre d'UFC
(Unit Formant une Colonie) prsentes dans un chantillon. Ce dnombrement se fait 30C ce qui
permet de dnombrer la flore msophile (entre 20C et 40C) et de la distinguer des flores
thermophile (temprature optimale de croissance suprieure 40-45C) et psychrophile (temprature
optimale de croissance infrieure 20C).
La croissance seffectuant sur glose nutritive standard, la plupart des micro-organismes cultivables
peuvent se dvelopper, lexception de ceux qui sont exigeants (tel que Legionella) et les microorganismes anarobies stricts. Il est donc plutt prfrable de parler de "flore msophile arobie"
30 C que de flore totale .
Dans le contexte des eaux chaudes sanitaires ou des eaux de tours arorfrigrantes, le
dnombrement de la flore msophile arobie 30C peut, dans certaines situations, apporter une
information supplmentaire, interprter en parallle des rsultats de dnombrement de Legionella.
Le dnombrement de la flore msophile arobie est ralisable sur tout type deau.
7.1.2
ATP-mtrie
Le principe est de dtecter un indicateur de lactivit mtabolique des bactries pour prouver la
prsence de bactries vivantes dans lchantillon. Lindicateur dactivit mtabolique recherch est
lATP. LATP-mtrie peut tre applique pour la dtection et la quantification dune activit bactrienne
totale, en laboratoire ou sur le terrain. Elle peut tre intressante dans le cadre de suivi de
dsinfection, pour aider la prise de dcision (Lee and Deininger 2004; Trudil et al. 2000).
Lobjectif est de dtecter et ventuellement quantifier une activit mtabolique dans un chantillon, qui
peut tmoigner dune contamination biologique. A titre dexemple, lATP-mtrie peut tre utilise pour
valuer la biomasse et donc le niveau dencrassement dune tour arorfrigrante (Van der Kooij et al.
2005). Cette mthode peut venir en complment dune autre mthode plus spcifique. Elle permet la
quantification de lATP et la dtection des bactries viables cultivables et non cultivables.
LATP-mtrie est a priori utilisable sur tout type deau.
7.2
Recherche damibes
Le principe le plus rpandu pour la recherche damibes est la culture. En laboratoire, les amibes sont
42
gnralement cultives 25C sur milieu dagar non nutritif ensemenc avec des bactries (e.g. E.
coli) servant de substrat nutritif. La temprature de culture doit cependant tre adapte
spcifiquement chaque espce. Ce milieu permet galement leur isolement (Srikanth and Berk
1993). Le typage des amibes peut se faire sur une base morphologique ou par une approche
molculaire avec lutilisation de la q-PCR (Behets et al. 2006; Pelandakis and Pernin 2002) partir
dADN (Myjak et al. 1997; Pilcher et al. 2007a) ou dARN ribosomique 18S purifi (Pilcher et al.
2007b).
A noter que les recherches damibes sont relativement lourdes mettre en uvre et coteuses
42
Glose qui ne sert que de support
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Anses
Dans le contexte des eaux chaudes sanitaires ou des eaux de tours arorfrigrantes, la recherche
des amibes peut, dans certaines situations, apporter une information supplmentaire, interprter en
parallle de rsultats de dnombrement de Legionella.
7.3
Analyse du biofilm
Lanalyse ncessite laccs aux surfaces des rseaux deau et circuits de refroidissement, suivi dune
rcupration du biofilm. Une fois le biofilm rcupr, la prsence, la quantification de Legionella ou la
quantification de biomasse peuvent tre dtermines par toutes les techniques de dnombrement de
Legionella prcdemment voques, en adaptant les protocoles aux spcificits du biofilm. Les
microorganismes du biofilm nchappent pas aux notions de viabilit, cultivabilit.
Dans le contexte des eaux chaudes sanitaires et des tours arorfrigrantes, lanalyse du biofilm peut
avoir au moins deux objectifs :
$ la recherche de Legionella ;
$ le suivi dune installation.
Dans les deux cas, la difficult repose principalement sur le mode et le lieu du prlvement, si lon
veut quil soit reprsentatif du circuit et reproductible. Cest sans doute ce qui freine aujourdhui son
utilisation. On peut citer quelques points critiques du prlvement, qui peuvent avoir une grande
influence sur les rsultats danalyse obtenus (Ditommaso et al. 2010; Stout and Yu 2010) :
$ couvillonnage direct sur une surface accessible de bassin de TAR, au robinet ou dans la
pomme de douche ;
$ utilisation de manchettes tmoins places sur le circuit, avec rcupration du biofilm par
couvillonnage, ultrasons, dcapage chimique ou autre technique, en vue danalyses
ultrieures
$ utilisation de manchettes tmoins places sur le circuit avec extraction des supports en vue de
mesures directes sans enlvement du biofilm : microscopie, goniomtrie ;
$ mesure directe, capteur de biofilm : capteur thermique, capteur lectrochimique (lectrode
disque tournant) ; ces capteurs ne sont cependant pas spcifique du biofilm, mais dun
encrassement, dans lequel le biofilm a un rle variable.
Les recherches de Legionella dans le biofilm peuvent permettre de confirmer leur prsence latente
dans une installation, alors que les analyses deau prsentent des rsultats ngatifs. Les expriences
de gestion dinstallation ou de prvention du risque li aux Legionella bases sur lanalyse du biofilm
sont rares (Farhat et al. 2010).
7.4
Analyse des arosols
La structure des arosols est de nature complexe. Les gouttelettes le composant comportent aussi
bien des lments viables (cellules ou spores bactriens, fragments de myclium et spores fongiques,
cellules et kystes de protozoaires, etc.) que des virus et des lments non viables (fragments
cellulaires et composants de la paroi, en particulier des endotoxines). Ces lments peuvent se
prsenter sous la forme dlments biologiques individualiss (cellules, spores, kystes) ou
dassemblages complexes dlments biologiques entre eux (agrgats, vsicules, etc.) ou avec des
lments non-biologiques.
La composition des arosols est extrmement variable en fonction de la source dorigine. Elle diffre
galement sensiblement de cette dernire par ltat des lments qui le compose. Ainsi certains
auteurs ont montr, en ralisant des essais comparatifs dappareil de collecte et de mthode de
dnombrement, que L. pneumophila tait affecte par l'arosolisation et le prlvement dair et en
particulier que sa cultivabilit tait fortement diminue en dpit dune composition en bactries viables
et infectieuses quasi inchange (Berthelot et al. 2009; Deloge-Abarkan et al. 2007). Par ailleurs, les
conditions environnementales (temprature, hygromtrie, etc.) impactent fortement sa composition.
La mesure des microorganismes dans les arosols a t envisage dans son aspect rglementaire
pour lvaluation et la surveillance des microorganismes sur les lieux de travail et des rgles
appliquer dans ce domaine sont dfinies depuis 2000 par la norme NF EN 13098. Toutefois, lheure
actuelle, il nexiste pas de valeurs limites dexposition professionnelle (VLEP) pour les bioarosols
microbiens en milieu professionnel, car on ne dispose que de peu dlments sur la relation dose-effet
de ces agents. Il existe seulement des valeurs-guides (encore appeles critres daction) tablies sur
la base des publications existantes (Goyer et al. 2001). Les rares recommandations de valeur limite
existantes concernent les activits qui produisent de grandes quantits de moisissures, comme
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certains postes de salaison et charcuterie. Dune manire gnrale, plus larosol est charg en
micro-organismes, plus son pouvoir pathogne est considr comme lev (Ghin et al. 2009).
Les mthodes de dtection et de quantification des microorganismes dans les arosols sont calques
sur celles utilises pour la dtection et la quantification dans leau (culture, amplification gnique,
mthodes immunologiques hybridation, etc.). Elles prsentent donc exactement les mmes limites et
avantages que celles dcrites dans le prsent document. Mais elles sont de plus trs fortement
impactes par le mode de prlvement des chantillons, lequel dpend de lappareillage de collecte
pour lequel il nexiste ni norme, ni standard. Cet appareillage peut faire appel trois principes
fondamentaux : limpaction (o le flux dair aspir traverse une grille avant de venir impacter une
surface cible servant de support de collecte, gnralement un milieu glos), la filtration (o le flux
dair traverse un mdia filtrant de type capillaire ou poreux retenant les lments en suspension) et
limpingment (une variante de limpaction dans laquelle la collecte se fait par contact entre le flux dair
entrant et un liquide de collecte, le plus souvent de leau ou du srum physiologique) (Duquenne and
Greff-Mirguet 2005).
Certains de ces appareils revendiquent une possibilit de quantification de Legionella. Cependant, la
prise de dcision sur la base de rsultats obtenus avec ces appareils reste complique, notamment
en cas dune dtection un taux lev. En effet, aucune rfrence bibliographique na t rpertorie
concernant les concentrations dans Iair prsentant un risque pour la population. Par ailleurs, le
pouvoir pathogne vhicul par les arosols diminue normalement en fonction de laugmentation de la
distance la source dmission. Mais cette dcroissance ncessite dtre pondre ainsi le paramtre
olien qui modifie fortement le rayon daction potentiel, rend lvaluation de la dangerosit plus
dlicate.
Dans le cas des L. pneumophila, lvaluation du pouvoir infectieux dun arosol ncessite galement
la prise en compte dautres paramtres que la stricte quantit des bactries dnombres. Ainsi la taille
des gouttelettes vhicules a un impact important sur linfectiosit. Un arosol contenant des L.
pneumophila est considr comme possdant un pouvoir infectieux lev si les gouttelettes deau qui
le composent sont comprises entre 2 et 5 m (Baron and Willeke 1986; Bollin et al. 1985; Girod et al.
1982). Ce paramtre essentiel nest que difficilement valuable avec les appareils de collecte actuels.
Plusieurs auteurs ont montr la relation troite existant entre amibes et L. pneumophila, et en
particulier la capacit des amibes gnrer des vsicules charges en L. pneumophila dune taille
compatible avec linhalation (entre 2 et 5 m) (Berk et al. 1998; Rowbotham 1980). La prsence de
ces vsicules ltat libre dans le milieu source pourrait tre facteur de dangerosit supplmentaire
lors de la formation darosols. En effet, ces vsicules sont rsistantes aux dsinfections. Elles
peuvent rester intactes au del de 6 mois sans que les bactries quelles hbergent perdent leur
pouvoir infectieux (Bouyer et al. 2007). Selon certains auteurs, cet assemblage complexe pourrait
rendre les L. pneumophila hberges susceptibles dtre facilement transports lorsque des arosols
sont mis. Lexistence de ces vsicules pourrait expliquer certains paradoxes au regard de la dose
infectieuse, tels que le fait que certaines tours arorfrigrantes avec un relativement faible nombre
de L. pneumophila puissent tre des sources de Lgionellose, ou encore que des tours restent des
sources dinfection 24 heures aprs un traitement par des biocides ou encore que des cas de
lgionelloses ait t identifis des kilomtres dune source, distance laquelle les bactries libres
sont normalement affectes par la dessiccation (Berk et al. 1998). De fait, le cas des arosols
constitue un problme de complexit suprieure celui de leau qui mriterait lui seul un traitement
part.
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Anses
8
8.1
Comparaison des diffrentes mthodes

Critres dquivalence de mthodes de dnombrement de microorganismes
Les critres dordres mathmatiques permettant dtablir une quivalence entre diffrentes mthodes
de dnombrement de microorganismes, doivent tre distingus des paramtres de performances
intrinsques chaque mthode.
En application de la directive 2006/7/CE du Parlement europen et du Conseil, la dcision de la
Commission du 21 janvier 2009 dsigne la norme ISO 17994:2004(E) en tant que norme pour
lquivalence des mthodes microbiologiques (CE 2009). Cette norme dfinit une procdure
dvaluation qui permet de comparer deux mthodes visant dtecter ou quantifier le mme groupe
cible ou la mme espce de micro-organisme. Elle fournit les bases mathmatiques pour valuer les
performances relatives moyennes des deux mthodes par rapport des critres dquivalence
43
dtermins .
Dans son avis de 2008, relatif lquivalence des mthodes alternatives par rapport aux mthodes de
rfrence dans le domaine des eaux destines la consommation humaine (Saisine 2007-SA-0192),
lAfssa (AFSSA 2008), recommande, dans le cadre dune valuation dquivalence de deux mthodes
analytiques, dajouter aux principes de la norme EN ISO 17994 :2004, une tude pralable visant
vrifier ou mme valuer lquivalence de la mthodologie alternative par rapport la mthode de
rfrence. Cette valuation se ferait sur des critres classiques de validation et dans le domaine de
leau de consommation (slectivit, linarit, exactitude relative, rptabilit).
LAfssa pointe galement une ambigut de la norme EN ISO 17994 :2004 dun point de vue
statistique. Contrairement au titre de la norme, le test d'galit par lequel elle se conclue nest pas
rellement un test d'quivalence, car il exclut la notion de tolrance. En effet cest lhypothse nulle
qui est teste, et plus lcart type des diffrences entre les rsultats est lev, plus il est facile de
valider lquivalence, alors quun cart-type faible entre les rsultats de la mthode alternative rend la
validation plus difficile, en comparaison avec la mthode de rfrence. L'un des risques majeurs de
cette pratique est la possibilit de rejeter, sur cette base statistique, les mthodes les plus
performantes selon les critres classiques de caractrisation des mthodes analytiques.
Dans le cadre du prsent rapport, il est soulign deux difficults supplmentaires pour lapplication de
la norme EN ISO 17994 :2004 lvaluation de lquivalence de mthodes de dnombrement de
En premier lieu, lapplication de cette norme implique lexistence dune mthode de rfrence donnant
des rsultats avec une justesse satisfaisante. Dans le cas du dnombrement de Legionella dans leau,
la mthode de rfrence dun point de vue rglementaire (culture - norme NF T90-431), dnombre les
seules bactries cultivables. Comme voqu prcdemment, la question de lintrt sanitaire de
dtecter certaines bactries non cultivables reste pose. Ainsi, la pertinence dutiliser la mthode par
culture comme rfrence dans le cadre dune ventuelle tude dquivalence peut tre discute. Dans
le cas o la mthode par culture ne serait pas retenue comme mthode de rfrence pour une telle
tude, le choix dune autre mthode de rfrence semble problmatique.
En second lieu, selon la norme EN ISO 17994 :2004, celle-ci est applicable "deux mthodes
quelconques de dnombrement fondes sur des comptages (de colonies ou de tubes positifs) ou
deux mthodes quelconques de dtection (mthodes prsence/absence) visant au mme objectif".
43
Pour valuer le rsultat de la comparaison, "l'intervalle de confiance" de l'incertitude largie autour de la moyenne se calcule
en valuant :
la limite infrieure : L = m-U
la limite suprieure : H = m+U
ou m = moyenne arithmtique de la diffrence relative en %.
et U = incertitude largie, calcule partir de l'incertitude-type de la moyenne des diffrences relatives (issue de l'carttype de la diffrence relative), avec un facteur d'largissement = 2
U = 2x(cart-type)/racine(nombre d'chantillons)
Un cart maximal admissible est choisi en fonction du contexte et des objectifs fixs (par exemple D=10%).
Deux mthodes sont dites "sans diffrence" lorsque : -D < L < 0 et 0 < H < D
Cette procdure permet de comparer deux mthodes visant au mme objectif.
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En dautres termes, cette norme est applicable des mthodes de dnombrement microbiologique
donnant des rsultats partir de boites ou de tubes de culture, dans les mmes units. Elle ne prvoit
pas dapplication la comparaison de mthode donnant des rsultats dans des units diffrentes.
Pour ces diffrentes raisons, lutilisation de la norme EN ISO 17994 :2004 pour tablir une
quivalence entre les diffrentes mthodes de dnombrement de Legionella semble peu pertinente.
Toujours dans le cadre du dnombrement de Legionella dans leau, lapplication du protocole Afnor
"Protocole de validation dune mthode alternative commerciale par rapport une mthode de
rfrence", dans sa version "Rvision 0", adopte le 28 juillet 2008 (Afnor 2008), semble se heurter
aux mmes difficults que celles voques pour la norme EN ISO 17994 :2004, avec la mme
conclusion concernant sa pertinence.
Dans le domaine alimentaire, il semble intressant de signaler la norme NF EN ISO 16140, doctobre
2003. Elle est utilise pour valider des mthodes alternatives, et utilisant des principes de dtection
des microorganismes trs variables (impdancemtrie, PCR, etc..), par rapport des mthodes de
rfrences, gnralement la culture sur botes gloses. Elle peut sappliquer des mthodes
qualitatives ou quantitatives. Ses principes reprennent les paramtres de description et de choix des
mthodes danalyses dj listes dans ce rapport, en y associant des calculs d'exactitude relative et
des biais. Il pourrait tre envisag dutiliser cette norme pour tenter de comparer diffrentes mthodes
de dnombrement de Legionella dans leau. Cependant, aucun exemple de son application des
mthodes danalyse deau na t rpertori. De surcrot, elle naborde pas du tout le problme de la
diversit des units dexpression des rsultats.
Aucune mthode normalise nayant fait ses preuves pour tablir lquivalence entre diffrentes
mthodes de dnombrement microbiologique dans leau na t identifie. De surcrot, les publications
revues par le groupe de travail qui dcrivent des comparaisons de rsultats obtenus partir de
plusieurs mthodes nutilisent pas les normes cites ci-dessus. En consquence, pour la suite de ce
chapitre, la discussion relative la comparabilit des units et des mthodes ne tient pas compte des
normes prcites.
8.2
Comparabilit des units
Les units dans lesquelles les rsultats de dnombrement de Legionella sont exprims sont lies au
type de mthode mise en uvre. Ainsi, les rsultats peuvent tre exprims en UG/L (mthode par
biologie molculaire), UFC/L (mthode par culture) ou cellules/L (cytomtrie ou microscopie), avec
pour consquence des difficults de comparaison.
Pour rappel, lunit des rsultats obtenus par culture est lUFC (Unit formant colonie), qui correspond
une colonie observe sur un milieu de culture lors du dnombrement, et lunit des rsultats obtenus
par q-PCR ou v-PCR est lUG (Unit gnome), qui correspond chez les bactries un rplicon 44
Le fait que la concentration bactrienne dun mme chantillon value par amplification gnique (en
UG/L) soit sensiblement suprieure la concentration de ce mme chantillon valu par culture (en
UFC/L), peut avoir diffrentes explications :
-
une part importante des Legionella de lchantillon peut tre compose de cellules mortes mais
contenant encore leur ADN ;
de la mme manire, lchantillon peut contenir beaucoup de VBNC (Delgado-Viscogliosi et al.

2009; Joly et al. 2006) ;
sagissant de la culture, certaines publications voquent lhypothse selon laquelle plusieurs

cellules de Legionella pourraient tre agrges et ntre lorigine que dune colonie, minimisant
ainsi le rsultat (Delgado-Viscogliosi et al. 2009). La norme ISO 8199:2005 indique cependant
que "Pour des raisons pratiques, chaque colonie est considre comme provenant d'un seul
micro-organisme ou d'un agrgat de micro-organismes...". Aucune rfrence bibliographique
44
Molcule d'ADN ou d'ARN, ou une rgion d'ADN ou d'ARN pouvant se rpliquer partir d'une seule origine de rplication. Le
rplicon est l'unit de rplication de l'ADN bicatnaire.
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permettant de confirmer cette hypothse nayant t trouve, notamment pour Legionella, le
groupe de travail ne peut se positionner sur ce point ;
-
certaines souches de Legionella sont susceptibles de contenir un nombre de copies de la zone

gnomique amplifier plus important que la souche utilise pour tablir la courbe talon servant
la quantification (Joly et al. 2006). Ltalon national maintenant disponible pour le
dnombrement de Legionella par q-PCR prend en compte cette possibilit ;
la croissance de Legionella sur un milieu de culture peut tre inhibe par la prsence dautres
microorganismes, qui ninfluencent pas les rsultats de la q-PCR ou de la v-PCR (DelgadoViscogliosi et al. 2009) ou cause des prtraitements (acide ou thermique) appliqus
lchantillon avant lensemencement (Joly et al. 2006; Yaradou et al. 2007) ;
les mthodes mettant en uvre la q-PCR peuvent tre simplement plus sensibles que les
mthodes par culture (Dusserre et al. 2008), mme si les rsultats des deux mthodes et leurs
units ne sont pas strictement comparables (Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
Pour les mthodes dont les donnes disponibles permettent denvisager une comparaison, il est
constat que les units dans lesquelles sont exprims les rsultats ne sont pas strictement
comparables. Toutefois, il semble intressant de tenter dtablir des corrlations entre les rsultats
exprims dans diffrentes units.
8.3
Comparabilit des limites de dtection et de quantification
La comparaison des limites de dtection et de quantification doit tre module en fonction des cibles
de la mthode et des ajustements que permettent par les prtraitements.
Selon la norme NF T90-431, la limite de dtection thorique de la culture est de 50 UFC/L et sa limite
de quantification est de 250 UFC/L. Ces donnes ne tiennent pas compte du rendement. Toujours
pour la culture, selon la norme ISO 11731-2, la limite de dtection est de 1 UFC/L, pour un rendement
de 100 %.
Joly et al. ont conduit une tude qui amne plus dinformations sur le cas du dnombrement de
Legionella par q-PCR dans les eaux chaudes sanitaires (223 chantillons) ou les tours
arorfrigrantes (37 chantillons). Les cibles choisies taient le gne mip pour le dnombrement des
L. pneumophila (Cloud et al. 2000) et le gne codant pour lARNr 16S pour le dnombrement des L.
spp. (Wellinghausen et al. 2001). Deux laboratoires ont particip ltude. Dans les conditions de
cette tude, les limites de dtection et de quantification de la q-PCR taient comprises entre 250 et
300 UG/L et entre 1000 et 5000 UG/L pour L. pneumophila, et entre 30 et 250 UG/L et 500 et 5000
UG/L pour L.spp, selon le laboratoire. Il est noter que cette tude ne prend pas en compte la
prsence ventuelle de dsinfectants dans les eaux analyses (Joly et al. 2006).
Morio et al., ont men une tude par q-PCR sur des eaux chaudes sanitaires traites et non traites
(68 chantillons issus deau traite au chlore, 6 lacide peractique et 15 filtrs). La cible choisie
pour le dnombrement des L. pneumophila tait le gne mip. Les limites de dtection et de
quantification mesures dans ces conditions taient respectivement de 100 UG/L et 800 UG/L. Ces
valeurs sont du mme ordre de grandeur que celles obtenues par Joly et al. Les auteurs napportent
pas de commentaires concernant linfluence des traitements de leau sur les rsultats des mthodes
par q-PCR et culture testes (Morio et al. 2008).
Selon Dusserre et al. la mthode par q-PCR (limite de dtection : 170 GU/L) est moins sensible que
les mthodes TVC (limite de dtection : 1 cellule par chantillon filtr) et par immuno-dtection avec
lecture par cytomtrie dimage (limite de dtection : 1 cellule par chantillon filtr) (Dusserre et al.
2008). Cette indication reste cependant prendre avec prcaution, dautant plus que
lexprimentation a t ralise sur de leau distille dope en Legionella, ce milieu ntant pas
ncessairement reprsentatif des eaux environnementales.
Selon Lemarchand et al., la limite de quantification des mthodes par immuno-dtection serait
7
comprise entre 10 et 5.10 cellules/L, cependant ltude ralise par cette quipe ne porte par sur le
dnombrement de Legionella mais sur E. coli. Cette limite est peut-tre extrapolable, mais de fait non
avre (Lemarchand et al. 2001).
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Pour envisager la comparaison des limites de dtection et de quantification relatives diffrentes

mthodes il est ncessaire que celles-ci soient prouves et stabilises, par exemple par
lintroduction dune norme. Des mthodes de dnombrement alternatives apparaissent prometteuses,
mais elles nont pas encore t valides par une application sur un grand nombre dchantillons
deau naturelle et par un grand nombre dutilisateurs.
8.4
Comparaison des mthodes en fonction des diffrents types deau
Lvaluation ou la comparaison des mthodes de dnombrement de Legionella peuvent tre ralises

sur diffrents types deaux : eaux ensemences exprimentalement, eaux chaudes sanitaires, eaux
de tours arorfrigrantes. Le prsent chapitre porte sur les principales tudes de comparaison
rpertories dans la littrature.
8.4.1
Eaux ensemences exprimentalement
La plus grande partie des tudes destines comparer des mthodes de dnombrement de
Legionella a t mene avec des eaux ensemences exprimentalement.
Selon plusieurs auteurs, lanalyse dun chantillon deau non traite, ensemenc exprimentalement
6
avec 10 UFC/L de L. pneumophila, donne des rsultats comparables, quelle que soit la mthode
utilise : q-PCR (avec ou sans filtration pralable de lchantillon), TVC, immuno-dtection, ou culture.
6
Les rsultats obtenus sont tous proches de 10 , quils soient exprims en CFU /L, UG/L ou cellules/L
(Delgado-Viscogliosi et al. 2005; Dusserre et al. 2008).
Une tude rcente mettant en jeu dautres mthodes, mene sur une eau du robinet strilise, puis
artificiellement contamine par L. pneumophila sg 1, semble parvenir aux mmes conclusions.
Lobjectif tait de comparer la mthode danalyse par culture (9 chantillons analyss) deux
mthodes de dtection aprs marquage immuno-fluorescent des cibles : dtection par cytomtrie en
flux (6 chantillons analyss) et dtection par microscopie (30 chantillons analyss). Les trois
mthodes semblent corrles. Cependant, le faible nombre dchantillons empche de tirer des
conclusions significatives de cette tude (Fuchslin et al. 2010).
Lanalyse dun chantillon deau traite par des concentrations croissantes de chlore libre, dope en
6
lments organiques (peptones), puis ensemence exprimentalement avec 10 CFU/L de L.
pneumophila (incubation de 24h), abouti des rsultats trs diffrents en fonction de la mthode
utilise (Dusserre et al. 2008) :
-
la mthode par culture, que ce soit sur milieu BCYE ou GVPC, ne permet plus de dtecter la
prsence de L. pneumophila ds 0,5 mg/L de chlore, indiquant que la croissance de L.
pneumophila est inhibe ;
la mthode TVC dtecte de moins en moins de cellules de L. pneumophila partir de 0,5 mg/L
de chlore jusqu une dtection nulle 30 mg/L ;
la mthode par immuno-dtection dtecte une quantit identique de cellules jusqu 3 mg/L puis
nen dtecte plus 30 mg/L ;
la mthode par q-PCR dtecte la mme quantit de cellules jusqu 1 mg/L et nen dtecte plus
3 mg/L.
Par ailleurs, daprs Delgado-Viscogliosi et al. (2009), les signaux mis par culture et par v-PCR
diminuent ds 0,4 mg/L de chlore libre, alors que celui mis par la q-PCR ne diminue qu partir de
0,6 mg/L de chlore libre (Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
Daprs Dusserre et al. (Dusserre et al. 2008) :
-
le chlore affecte la viabilit (mesure par TVC ou v-PCR) et la cultivabilit (mesure par culture)
de L. pneumophila, des concentrations moindres que celles qui affectent lADN bactrien
(mesur par q-PCR) et les protines cibles de limmuno-dtection ;
dans un chantillon deau traite par le chlore, la mthode par culture se rvle tre la moins
sensible pour la dtection de la prsence de L. pneumophila ;
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-
les mthodes par q-PCR et par immuno-dtection dtectent la fois les L. pneumophila viables
(cultivables ou non cultivables) et non viables, alors que les mthodes par culture et TVC
mesurent respectivement les bactries cultivables et viables ;
un petit nombre de bactries, incluant probablement quelques cellules viables, sont prsentes
dans certains chantillons traits avec 3 mg/L de chlore, dans lesquels la q-PCR ne dtecte rien
alors que les mthodes par TVC et par immuno-dtection rvlent un signal.
Ces rsultats confirment ceux dune tude (Bej et al. 1991) mene sur des eaux strilises puis
ensemences exprimentalement, avec les mthodes de dnombrement par q-PCR (cible : gne mip,
selon Mahubani, 1987) et par culture (culture sur milieu BCYE). Ces mthodes sont utilises en
-4
parallle sur des chantillons traits par le chlore (10 mg/L pendant diffrents temps) ou par la
chaleur (70C pendant diffrents temps). Le traitement de leau par la chaleur semble avoir le mme
effet sur les rsultats obtenus avec les deux mthodes : aprs 10 minutes 70C, les L. pneumophila
ne sont plus dtectes. En revanche, il semble que le traitement de leau par le chlore fasse diminuer
le signal obtenu par culture plus vite que celui obtenus pas q-PCR. Aprs 2 minutes de traitement par
le chlore, les rsultats obtenus par culture sont infrieurs la limite de dtection de la mthode, alors
que ceux obtenus par q-PCR rvlent la prsence de Legionella aprs 10 minutes de traitement. Les
auteurs expliquent cela comme le passage de Legionella dans un tat viable mais non cultivable sous
leffet du chlore, en prenant comme hypothse discutable que la q-PCR ne dtecte que les bactries
viables.
Une mthode par immuno-dtection a galement t teste sur ce type deau. Une quipe de
recherche a test des chantillons deaux striles artificiellement contamines, partir de diffrentes
souches de Legionella dj isoles, laide de la cytomtrie en flux, aprs un marquage spcifique
des cellules cibles par deux fluorochromes. Douze souches de Legionella ont t testes : 7 souches
de L. pneumophila sg 1 (Philadelphia, Paris, 044, 066, BAC, MAR et VAR), une souche de L.
pneumophila sg 4, une souche de L. pneumophila sg 6, une souche de L. pneumophila sg 13, une
souche de L. anisa et une souche de L. micdadei). Aprs un choc thermique de 30 minutes 70C, tel
que prconis par les autorits franaises pour la dcontamination des circuits deau des
tablissements de sant (Circulaire DGS du 22 avril 2002), pour 6 de ces souches, 10 25 % des
cellules restent viables (Allegra et al. 2008) ce qui peut paratre inquitant.
Les mthodes de dnombrement de Legionella par q-PCR sont susceptibles de surestimer le nombre
de bactries infectieuses. En effet, la dtection dun gne ou dune protine spcifique dune bactrie
ne renseigne pas sur son tat de viabilit et dinfectiosit (Delgado-Viscogliosi et al. 2005). Selon
Yaradou et al., cela rend les rsultats de dnombrement de Legionella obtenus par q-PCR difficiles
interprter dun point du vue sanitaire (Yaradou et al. 2007).
A contrario, la culture conduirait sous-estimer la concentration de Legionella prsentes dans les
chantillons, dautant plus dans des conditions environnementales susceptibles de stresser les
Legionella, comme les traitements chimiques ou thermiques de leau (Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
Il est tabli que lADN de bactries non viables peut rsister dans lenvironnement (Nocker and
Camper 2006). Cependant, au-del dune certaine concentration de chlore, lintgrit de lADN semble
affecte, au point dempcher toute amplification par PCR, aussi bien par q-PCR que par v-PCR.
Selon Delgado-Viscogliosi et al., cette concentration en chlore est de lordre de 1 mg/L (DelgadoViscogliosi et al. 2009), alors que Dusserre et al., qui utilisent un tampon phosphate, dans le cadre de
leurs analyses, la situent entre 1 et 3 mg/L (Dusserre et al. 2008). Une tude de Chang et al., mene
avec une mthode trs proche, combinant lutilisation de lEMA et la q-PCR, semble confirmer les
rsultats de Dusserre et al (Chang et al. 2009).
Concernant les traitements susceptibles daffecter diffremment les rsultats des diffrentes
mthodes, 3 mthodes danalyse (culture, q-PCR et v-PCR) ont t testes pour valuer leur
pertinence dans le cadre du suivi de lefficacit de traitements deau (eaux domestiques
artificiellement ensemencs).
Traitement thermique :
Daprs une exprimentation mene par Delgado et al., sur un chantillon contenant avant
traitement environ 7,5 log dUG ou UFC/mL de L. pneumophila, aprs 1h 70C (DelgadoViscogliosi et al. 2009) :
o la mthode par q-PCR rvle une concentration en L. pneumophila en UG/L inchange :
environ 7,5 log dUG/mL ;
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Anses
o
la mthode par v-PCR rvle une forte diminution de la concentration en L. pneumophila

en UG/L : une rduction du signal q-PCR proche de plus de 99,9 % (environ 3,2 log
dUG/mL restant) ;
o la mthode par culture (norme Afnor NFT90-431), rvle une absence de L. pneumophila
cultivables (UFC).
Une tude de Chang et al., mene avec une mthode trs proche, combinant lutilisation dEMA
et de la q-PCR, semble confirmer les rsultats de ltude prcdente (Chang et al. 2009).
Traitement par le chlore :

Dans le cadre dune exprimentation mene avec un chantillon deau contenant avant
5
traitement 10 UFC/L de L. pneumophila, les analyses sont ralises aprs 24 h dexposition
aux diffrentes concentrations en chlore testes (Delgado-Viscogliosi et al. 2009) :
o le signal mis par la culture dcrot partir dune concentration en chlore de 0,2 mg/L et
nest plus dtect partir de 0,5 mg/L. Cela signifie qu partir de cette concentration, il
ny a plus de L. pneumophila cultivable.
6
o le signal mis par la mthode q-PCR est de lordre de 10 UG/L de L. pneumophila avant
5
traitement (10 UFC/L mesurs par culture). Ce signal diminue fortement 1 mg/L de
chlore.
6
o le signal mis par la mthode v-PCR est de lordre de 10 UG/L de L. pneumophila en
5
avant traitement (10 UFC/L mesurs par culture). Ce signal commence diminuer
partir 0,5 mg/L de chlore et nest plus dtect 1 mg/L.
Pour expliquer labsence de signal par la mthode par culture ds 0,2 mg/L de chlore alors que
les mthodes par q-PCR et v-PCR ne rvlent pas de diminution des concentrations en UG/L,
deux hypothses sont formules par les auteurs :
o soit la prsence de chlore cette concentration stresse les cellules de Legionella au
point de les rendre non cultivables, mais sans pour autant avoir un effet sur leur intgrit
membranaire,
o soit le chlore, cette concentration, ne permet pas une permabilisation suffisante des
membranes pour laisser pntrer les molcules dEMA dans les cellules, la trop faible
quantit dEMA au contact de lADN ne pouvant pas, dans ce cas, affecter lintensit du
signal v-PCR.
A partir de 0,5 mg/L de chlore, les membranes des cellules commenceraient laisser passer les
molcules dEMA qui se lient avec lADN des cellules endommages, en empchant son
amplification PCR. Ainsi, cette concentration, il semble que le signal de la v-PCR reprsente
les cellules de Legionella viables ou conservant une bonne intgrit membranaire, alors que le
signal q-PCR reprsente lensemble des cellules, viables et non viables (Delgado-Viscogliosi et
al. 2009).
Traitement par le glutaraldehyde :

Daprs une exprimentation mene par Delgado et al., avec un chantillon deau contenant
5,3
avant traitement 10 UFC/L de L. pneumophila (Delgado-Viscogliosi et al. 2009) :
o le signal mis par culture disparat aprs 30 minutes de traitement avec 500 mg/L de
glutaraldhyde. Cela signifie qu partir de ce couple temps/concentration, il ny a plus de
L. pneumophila cultivable.
6
5,3
o le signal mis par la mthode q-PCR, de lordre de 10 UG/L de L. pneumophila (10
UFC/L mesurs par culture), varie peu au cours de lexprimentation.
6
o le signal mis par la mthode v-PCR, de lordre de 10 UG/L de L. pneumophila (pour
5
1.10 UFC/L mesur par culture), diminue fortement (4,5 log) pendant les 30 premires
minutes du traitement, ce qui semble indiquer une forte baisse du nombre de L.
pneumophila viables. La concentration en L. pneumophila viable remonte ensuite
progressivement (de 1 log en 48h).
Sur la base de ces rsultats, Delgado-Viscogliosi et al. estiment le signal de v-PCR plus reprsentatif
du potentiel pathognique dune eau chaude sanitaire contenant des L. pneumophila, que celui
mesur par q-PCR. Des essais doivent encore tre mens pour vrifier que cette mthode est
utilisable dans le contexte des tours arorfrigrantes (Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
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Anses
Daprs les tudes menes sur des eaux prpares en laboratoire, dans des conditions idales de
croissance maitrise et sans stress ajout (dsinfectant, traitement thermique, etc.), certaines
mthodes (culture, q-PCR, TVC, immuno-dtection) apparaissent quivalentes. Tout cart par rapport
ces conditions idales, notamment un traitement thermique de leau ou la prsence de chlore,
affecte les rsultats de faon diffrente selon les mthodes et perturbe leur quivalence.
8.4.2
Eaux environnementales
Aussi intressants que soient les rsultats dtudes menes avec des eaux exprimentales, dans le
cadre dun travail portant sur des mthodes danalyse deaux environnementales en routine, les
tudes qui gnrent le plus dinformations pertinentes sont celles ralises avec des eaux
environnementales.
Lanalyse ralise en systme ferm conscutivement un traitement (thermique, chlore,
glutaraldehyde) semble confirmer que la mthode par culture est susceptible de sous-estimer et la qPCR de surestimer le nombre de bactries viables. Ce dernier lment doit toutefois tre pondr car
il est directement issu de la comparaison entre la q-PCR et la v-PCR dans des conditions diffrentes
de celles appliques aux chantillons rels, les auteurs tant partis du principe que les rsultats de
culture et v-PCR sont trs proches, sans le dmontrer (Delgado-Viscogliosi et al. 2009).
En effet, une partie des rsultats de v-PCR a t gnr en systme ferm. Ces rsultats ne tiennent
pas compte du fait quen conditions relles, le traitement dune installation est gnralement suivi dun
rinage du systme, lequel limine une grande partie des bactries en circulation, notamment les
bactries mortes.
Une grande partie des tudes destines comparer des mthodes de dnombrement de Legionella,
menes avec des eaux environnementales, portaient sur les mthodes par culture et par q-PCR.
Ainsi, Wellinghausen et al. ont tudi le rapport entre les rsultats de dnombrement de Legionella
obtenus par culture et par q-PCR, sur 77 chantillons deaux chaudes sanitaires (46C +/- 9C),
provenant de 3 hpitaux, sans prendre en compte les ventuels produits de traitement rsiduels
prsents dans ces chantillons. Les cibles (L. spp., L. pneumophila et L. pneumophila sg1) ont t
dnombres par culture (milieu GVPC) et par q-PCR (gne codant pour lARNr 16S pour L. spp et mip
pour L. pneumophila). Dans ces conditions, le coefficient de corrlation observ entre les rsultats de
culture et ceux de q-PCR a t de 0,57 (Wellinghausen et al. 2001).
Toujours concernant les mthodes par culture et par q-PCR, Joly et al. ont ralis une tude sur 223
chantillons deaux chaudes sanitaires et 37 chantillons deau de tours arorfrigrantes. L encore,
les ventuels traitements, appliqus ces eaux avant les analyses, nont pas t pris en compte. L.
spp., L. pneumophila et L. pneumophila sg1 ont t dnombres par culture (selon la norme Afnor NF
T90-431) et par q-PCR. Pour les analyses par biologie molculaire, la cible tait le mme gne codant
pour lARNr 16S que celui utilis par Wellinghausen pour L. spp et le gne mip pour L. pneumophila
utilis par Cloud et al.(2000). La prsence dinhibiteur de PCR a t observe dans 2,7% des
chantillons de tours arorfrigrantes et dans 0 et 2,3 % des chantillons deaux chaudes sanitaires
selon les deux laboratoires ayant particips ltude.
Dans cette tude, concernant les eaux de tours arorfrigrantes, aucune corrlation na pu tre mise
en vidence entre les rsultats de q-PCR et de culture, aussi bien pour les dnombrements de L. spp
que de L. pneumophila. Dans ce type deau, il est frquent dobserver aprs lanalyse dun chantillon,
un rsultat de q-PCR trs lev et un rsultat de culture infrieur au seuil de dtection.
Concernant les rsultats danalyse des eaux chaudes sanitaires, les coefficients de corrlation
observs entre les rsultats de culture et ceux de q-PCR pour L. spp et L. pneumophila sont
respectivement :
- de 0,1267 et 0,2369 dans le laboratoire 1 ;
- de 0,5259 et 0,7295 dans le laboratoire 2.
A noter que les eaux chaudes sanitaires analyses par le laboratoire 1 provenaient de multiples
origines, alors que celles analyses dans le laboratoire 2 provenaient dun mme hpital, ce qui peut
expliquer partiellement les diffrences observes (Joly et al. 2006).
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Yaradou et al. (2007) ont raliss une tude portant sur 136 chantillons deaux chaudes sanitaires
(provenant de 55 sites) et 49 chantillons deau de tour arorfrigrantes (provenant de 20 sites). L
encore, les ventuels traitements, appliqus ces eaux avant les analyses, nont pas t pris en
compte. L. pneumophila a t dnombre par q-PCR (selon la norme XP T 90-471) et par culture
(selon la norme Afnor NF T90-431). Les analyses par biologie molculaire ont t ralises avec des
kits commerciaux. Les gnes cibles ntaient donc pas prciss dans la publication. La prsence
dinhibiteur de PCR a t observe dans 6,1 % des chantillons de tours arorfrigrantes et 2,9 %
des chantillons deaux chaudes sanitaires.
Concernant les eaux de tours arorfrigrantes, le coefficient de corrlation observ entre les
rsultats de culture et ceux de q-PCR est de 0,187. Pour ce type deau, la valeur prdictive positive et
la valeur prdictive ngative de la q-PCR sont respectivement de 53,6 % (53,6 % des rsultats positifs
en q-PCR le sont aussi en culture) et 100 % (100 % des rsultats ngatifs en q-PCR le sont aussi en
culture).
Concernant les rsultats danalyse des eaux chaudes sanitaires, le coefficient de corrlation observ
entre les rsultats de culture et ceux de q-PCR est de 0,732. Pour ce type deau, la valeur prdictive
positive et la valeur prdictive ngative de la q-PCR sont respectivement de 57,5 % et de 80 %. Ces
rsultats pourraient sexpliquer par une diffrence de composition des eaux chaudes sanitaires et des
eaux de tours arorfrigrantes (Yaradou et al. 2007).
Toujours concernant les eaux des tours arorfrigrantes, une tude comparative, mene pendant 13
mois, sur 104 chantillons, montre que la corrlation entre les rsultats obtenus par q-PCR et par
culture restent faibles, aussi bien pendant que en dehors des priodes de traitements de
dcontamination de leau raliss avec le biocide HOBr-isothiozalone (Yaradou et al. 2007).
Par ailleurs, quelque soit le type dchantillon, un rsultat de q-PCR non-quantifiable est trs souvent
associ une concentration en Legionella infrieure 250 UFC/L (Joly et al. 2006).
Pour leau des tours arorfrigrantes, il semble ne pas y avoir de corrlation (Joly et al. 2006) ou une
2
corrlation trs faible (r = 0,19) (Yaradou et al. 2007) entre les rsultats obtenus par q-PCR et par
culture.
En revanche, pour certaines eaux chaudes sanitaire, selon diffrents auteurs, mme si le signal mis
par q-PCR (en UG/L) est le plus souvent suprieur celui mis par culture (en UFC/L), il semble
exister une relation linaire entre les rsultats de dnombrement de Legionella en UG/L obtenus par
q-PCR et ceux en UFC/L obtenus par culture (Joly et al. 2006; Wellinghausen et al. 2001; Yaradou et
al. 2007).
Dautres mthodes de dnombrement de Legionella ont galement fait lobjet dtudes de
comparaison, menes avec des eaux environnementales.
La mthode culture-FISH a t rcemment compare la culture classique (NF T90-431), pour
lanalyse deaux chaudes sanitaires. La concordance des deux mthodes est de 82% (pourcentage
des rsultats positifs avec les deux mthodes ou ngatifs avec les deux mthodes). La sensibilit du
test a t estime 91% (Ditommaso et al. 2010).
La mthode IDS a galement t compare la mthode par culture, en analysant plusieurs types
deaux environnementales (Delgado-Viscogliosi et al. 2005). Les rsultats montrent que :
- les chantillons deaux froides du robinet ou deaux souterraines ne rvlent pas la prsence de
Legionella, ni par IDS, ni par culture ;
- certains chantillons deaux environnementales gnrent un signal avec la mthode IDS et une
absence de signal par culture. Linverse nest jamais observ. Pour leur grande majorit, ces
rsultats correspondent des chantillons deau chaude (plus de 45C). Ces rsultats pourraient
tre le fait de la prsence de cellules VBNC dans les chantillons.
Ainsi les rsultats des deux mthodes ne semblent pas pouvoir tre directement compars, lune
mesurant les cellules viables (IDS) et lautre les cellules cultivables (culture). Une analyse plus fine
des rsultats montre que ceux obtenus avec la mthode IDS (en cellules viables/L) prsentent une
relation linaire avec ceux obtenus par culture (en UFC/L) quand la concentration en Legionella est
suprieure ou gale 1000 UFC/L (mesure par culture). En de de cette concentration, il ny a pas
de corrlation entre les rsultats des deux mthodes. Cependant, dans tous les cas les rsultats
obtenus par IDS (en cellules viables/L) sont systmatiquement suprieurs ceux obtenus par culture
(UFC/L), parfois de plus de 2 log. Cela semble montrer que la mthode IDS est plus sensible que la
mthode par culture sur ce type deau.
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De mme, limmuno-dtection a galement t compare la culture. Aurell et al. (2004), ont ralis
une tude sur 26 chantillons deaux chaudes sanitaires. L. spp. et L. pneumophila ont t
45
dnombres par culture (selon la norme ISO 11731 modifie ) et par immunofluorescence, couple
une dtection par cytomtrie en phase solide (cellules/L). Les anticorps utiliss pour les analyses par
immunofluorescence taient : un anticorp polyclonal de lapin anti-Lpsg1 (labor par lquipe laide
de diffrents anticorps conjugus), 1 anticorp polyclonal commercial anti-Lpsg1 FITC, 3 anticorp
monoclonaux commerciaux anti-Lpsg(1-14), 1 anticorp monoclonal anti-Lpsg1, 1 anticorp monoclonal
anti-Lpsg(2-6,8-10,12-15) (Helbig et al. 1997) et 1 anticorp monoclonal anti-Lspp (lp inclus) (Helbig,
1997).
Les rsultats obtenus, par immunofluorescence avec dtection par cytomtrie en phase solide
3
6
(1,4.10 et 4,1.10 cellules/L de L. pneumophila), sont systmatiquement suprieurs ceux obtenus
2
4
2
par culture (1,2.10 et 1,1.10 UFC/L). Cependant, une faible corrlation est mise en vidence (r =
0,46).
Pour certains chantillons, la prsence de Legionella est rvle par immunofluorescence et non par
culture. Les chantillons correspondants ayant t prlevs des tempratures plus leves que la
moyenne (55C), cette diffrence de rsultats pourrait sexpliquer par la prsence dune plus grande
proportion de L. pneumophila sous formes viables non cultivables ou non viables (Aurell et al. 2004).
Concernant les traitements susceptibles daffecter les rsultats des diffrentes mthodes, seul le
traitement au chlore a t test sur des eaux environnementales naturelles.
Actuellement, comme le confirme la circulaire DGS/SD7A n174, du 19 fvrier 2007, il est prconis,
en France, le maintien dune concentration en chlore libre de 0,3 mg/L (ou en bioxyde de chlore de
0,15 mg/L) en sortie des rservoirs et de 0,1 mg/L (ou en bioxyde de chlore de 0,05 mg/L) en tout
point du rseau de distribution deau.
Daprs une exprimentation mene sur 6 chantillons deaux environnementales (douches,
fontaines, eaux chaudes sanitaires, puits) soumises 10 mg/L de chlore, aprs 24h de traitement,
aucune Legionella viable na pu tre mise en vidence, ni par IDS, ni par culture (Delgado-Viscogliosi
et al. 2005). Cela semble indiquer que ce traitement est efficace pour tuer les Legionella dans une eau
environnementale (Kilvington and Price 1990). Delgado et al. estiment par ailleurs que les valeurs
pertinentes prendre en compte, pour valuer le risque li aux Legionella, dun point de vue sanitaire,
doivent se situer entre les valeurs du signal mis par la mthode par culture (normalise) et celles du
signal mit par la mthode IDS (Delgado-Viscogliosi et al. 2005).
Sur des eaux environnementales, dont la qualit est trs variable en termes de charge en particules,
de composs chimiques et de microorganismes, les mthodes de dnombrement de Legionella, qui
ont fait lobjet de comparaisons, apparaissent rarement quivalentes. Nanmoins, les corrlations
observes entre les rsultats des mthodes compares sont sensiblement meilleures lorsque les eaux
sont relativement peu charges, comme celles des rseaux domestiques, par comparaison avec des
eaux charges, comme celles des tours arorfrigrantes.
De manire plus dtaille, concernant la comparaison des mthodes par culture et par q-PCR :
le signal mis par q-PCR (exprim en UG/L) est le plus souvent suprieur celui mis par culture
(exprim en UFC/L) ;
quelque soit le type dchantillon analys, un rsultat non-quantifiable par la mthode q-PCR est
trs souvent associ une concentration en Legionella infrieure 250 UFC/L ;
dans le cas des eaux de tours arorfrigrantes, il napparat pas ou peu de corrlations entre les
rsultats obtenus des deux mthodes ;
en revanche, dans le cas des eaux chaudes sanitaires, des corrlations sont observes entre les
rsultats des deux mthodes ;
les corrlations observes sont meilleures dans le cas de dnombrement de L. pneumophila
compar celui de L. spp.
Concernant la comparaison des mthodes par culture et par v-PCR :
le signal mis par la v-PCR (exprim en UG/L) est le plus souvent compris entre les signaux mis
par culture (exprim en UFC/L) et par q-PCR ;
45
Norme ISO 11731 modifie : 200 L dchantillon ensemenc en direct sur milieu GVPC ; 1 litre filtr 0,2 m, remis en
suspension dans 5 mL et trait par sonication (35 kHz), 100 L ensemenc sur milieu GVPC ; traitement thermique ou acide
appliqu sur un bruit de fond est observ.
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-
des corrlations sont observes entre les rsultats obtenus avec les deux mthodes utilises sur
des eaux chaudes sanitaires ;
Daprs les lments du paragraphe "5.2.2.5.1.", il apparat important de vrifier si les rsultats
prliminaires obtenus par v-PCR sont confirms en conditions relles, en particulier lorsque le
circuit a t purg et que la norme NF T90-471 est utilise sans aucune modification aprs
ltape de concentration.
Concernant la comparaison des mthodes par culture et par la mthode FISH, une corrlation est
observe entre les rsultats des deux mthodes : 82 % (double positifs ou double ngatifs.
Concernant la comparaison des mthodes par culture et par la mthode IDS :
le signal mis par lIDS est systmatiquement plus fort que celui mis par la culture ;
la plupart des eaux dont la temprature est suprieure 45C gnrent un signal avec la
mthode IDS et une absence de signal par culture. Linverse nest jamais observ ;
une corrlation entre les deux mthodes est observe pour les eaux fortement charges en
Legionella, alors quelle nest pas observe pour les concentrations faibles ;
la valeur prdictive ngative de lIDS par rapport la culture est faible.
Concernant la comparaison des mthodes par immuno-dtection et par culture :
le signal mis par immunofluorescence (exprim en cellules/L) est systmatiquement plus fort
que celui mis par culture (en UFC/L) ;
certains chantillons deau prlevs une temprature suprieure 55C gnrent un signal par
immunofluorescence et une absence de signal par culture. Linverse nest jamais observ ;
une faible corrlation est observe entre les rsultats obtenus par les deux mthodes.
Concernant la comparaison des mthodes par culture et par culture-FISH :
des corrlations peuvent tre observes entre les rsultats obtenus sur des eaux chaudes
sanitaires. Les donnes disponibles ne concernent pas les eaux de tours arorfrigrantes.
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Anses
Rflexion sur la signification des rsultats et des valeurs cibles
9.1 Elments prendre en compte dans linterprtation des rsultats des mthodes
de dnombrement de Legionella
9.1.1
Consquence de lexistence de Legionella viables non cultivables et non viables vis-vis des mthodes de dnombrement
Comme indiqu prcdemment, le groupe de travail ne peut carter le risque associ la prsence
de VBNC dans un chantillon deau. Ainsi, linterprtation des rsultats des mthodes de
dnombrement de Legionella qui ne prennent pas en compte les Legionella VBNC est dlicate,
particulirement quand les rsultats de telles mthodes ne mettent pas en vidence la prsence de
bactries cultivables.
Par consquent, pour tre en mesure dapporter une information complte dun point de vue sanitaire,
le groupe de travail estime important quune mthode de dnombrement de Legionella comptabilise
aussi bien les Legionella viables cultivable que VBNC.
Par ailleurs, pour vrifier lefficacit dune dsinfection, linformation intressante est la quantit de
Legionella restant vivantes.
Ainsi, pour vrifier lefficacit dune dsinfection, il peut tre intressant de disposer dune mthode de
dnombrement de Legionella prenant en compte les seules Legionella viables, quelles soient
cultivables ou non.
Il peut tre ncessaire de vrifier dans quelle mesure le renouvellement de leau, affecte le taux des
bactries viables par rapport aux non viables.
Or actuellement, aucune des mthodes utilises sur le plan rglementaire ou pour le suivi
dinstallation ne permet de dnombrer uniquement les Legionella viables. Il existe des mthodes
exprimentales susceptibles de prsenter cette caractristique. Cependant elles nont pas encore t
testes dans les conditions relles, et leur utilit, comme leur applicabilit en analyse nont pas encore
t dmontres.
Il faut noter quil peut tre envisag dutiliser des mthodes de dnombrement de Legionella
diffrentes en fonction de lobjectif de leur mise en uvre et du contexte de leur utilisation.
9.1.2
Consquence de lassociation de Legionella avec les amibes
Comme voqu prcdemment, la corrlation entre les rsultats obtenus par q-PCR et par culture est
souvent faible. Lanalyse de certains chantillons produit des signaux de q-PCR relativement
importants alors que les signaux obtenus par culture partir du mme chantillon sont relativement
faibles (infrieur 1000 UFC/L). Les connaissances actuelles ne permettent pas de savoir si ces
chantillons sont plus infectieux que ceux prsentant des signaux faibles avec les deux mthodes.
Une incertitude persiste quant la signification sanitaire de tels rsultats. Lune des hypothses
avances pour les expliquer est la prsence dans leau damibes contenant de grandes quantits de
Legionella (qui seraient dtectables par q-PCR mais pas par culture) et de faibles quantits de
Legionella sous formes libres dans leau (qui seraient dtectables aussi bien par q-PCR que par
culture). Dans cette hypothse, ces rsultats pourraient rvler un plus grand risque sanitaire quen
cas de signaux similaires obtenus par q-PCR et par culture (Joly et al. 2006). A noter cependant que
les recherches bibliographiques menes par le groupe de travail nont pas permis de mettre en
vidence de rfrence qui confirme ou infirme la capacit des diffrentes mthodes existantes
dnombrer les Legionella contenues dans des amibes.
Certaines tudes remettent en question limportance que la virulence intrinsque de Legionella joue
dans les processus dinfection chez les protozoaires et les humains. Ces tudes voquent par ailleurs
lhypothse dune relation pralable ncessaire entre un protozoaire et une Legionella pour le
dveloppement dune infection chez lhomme (Berk et al. 1998; Fields et al. 2002; Philippe et al.
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2006). Certains pathognes intracellulaires des vertbrs, seraient susceptibles dacqurir leur
virulence en rponse une prdation par des protozoaires, pour faciliter leur survie intracellulaire et
linfection de lhte (Abu Kwaik et al. 1998; Fields 1996; Fields et al. 2002).
Lassociation de L. pneumophila et dAcanthamoeba polyphaga semble par ailleurs leur procurer
toutes deux un avantage en termes de rsistance aux traitements de dsinfection au chlore
(Kilvington and Price 1990). En effet, la concentration en chlore ncessaire pour rendre L.
pneumophila non cultivable est moins importante pour les bactries prsentes dans la phase
planctonique que pour celle en endosymbiose avec A. polyphaga. De la mme manire A. polyphaga
rsiste mieux au chlore en prsence de L. pneumophila (Garcia et al. 2007). L. pneumophila semble
galement plus rsistante des traitements de dsinfection au cuivre ou largent quant la bactrie
est en endosymbiose avec A. polyphaga (Hwang et al. 2006).
Garcia et al. suggrent, pour disposer de rsultats plus facilement interprtables dun point de vue
sanitaire, de rechercher les protozoaires dans les eaux risque en parallle de L. pneumophila. Ils
estiment que pour tre considr efficace pour la lutte contre les Legionella, un traitement doit
galement permettre llimination des protozoaires. Ils suggrent donc de mener cette double
recherche pour vrifier lefficacit des traitements mis en uvre en cas de contamination deau
avre par L. pneumophila (Garcia et al. 2007).
Les diffrentes tudes cites ici mettent en vidence limportance des interactions entre amibes et
Legionella, dans lcologie microbienne de ces dernires. Les amibes sont des rservoirs avrs de
Legionella et les protgeraient des facteurs environnementaux, notamment vis--vis des traitements
de dsinfection. Le groupe de travail souligne donc lintrt de recherches damibes en complment
des dnombrements de Legionella dans leau, particulirement dans certains contextes, comme le
suivi de lefficacit de traitement. Il est cependant important de noter ici la relative complexit de la
mise en uvre, en routine, de mthodes de recherche damibes dans leau et les dveloppements
encore ncessaires pour en amliorer et homogniser les performances.
9.1.3
Consquence de lassociation de Legionella avec le biofilm
Actuellement, dans le cadre du contrle sanitaire, les Legionella sont recherches dans des
prlvements deau planctonique, que ce soit dans les rseaux deau chaude sanitaire ou dans les
tours arorfrigrantes.
Comme prcdemment indiqu L. pneumophila est capable de survivre dans le biofilm des
canalisations (Fields et al. 2002; Frre 2009; Kuiper et al. 2004), de sy multiplier en prsence
damibes comme Hartmannella vermiformis (Abu Kwaik et al. 1998; Kuiper et al. 2004; Murga et al.
2001), voire peut-tre de sy multiplier en dehors de cellules de protozoaires htes (Fields et al. 2002;
Rogers and Keevil 1992).
Ainsi L. pneumophila peut avoir t limine de leau libre et persister dans les biofilms la surface
des canalisations. Labsence de L. pneumophila dans un prlvement deau ne signifierait donc pas
ncessairement que L. pneumophila est totalement absente du rseau dans lequel le prlvement a
t effectu.
Fields et al. suggrent de rechercher les Legionella dans les biofilms des rseaux deaux chaudes,
pour une meilleure efficacit des contrles sanitaires et pour faciliter linterprtation de leurs rsultats
(Fields et al. 2002).
Bien qutant la marge du champ de la prsente saisine, la recherche de Legionella dans le biofilm
apporterait probablement une information intressante aussi bien dun point de vue sanitaire que pour
la gestion des installations. Toutefois, la complexit dun tel dnombrement, particulirement en ce qui
concerne le prlvement, est souligne cause du caractre exprimental des mthodes proposes
jusquici et de la ncessit de mener un important travail de dveloppement de ces mthodes dans
lhypothse o leur mise en uvre grande chelle serait envisage. En ltat actuel des
connaissances, il nest envisageable de les utiliser que dans le cadre de recherches ou dtudes
spcifiques.
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Anses
9.2
Seuils de gestion et mesures prconises par la rglementation en vigueur
Les lments rassembls dans ce chapitre ne concernent que la surveillance de routine des
installations risque, hors cas de lgionellose dclar. Les investigations environnementales menes
pour tenter didentifier lorigine des cas de lgionellose dclars sont ralises au cas par cas.
Certains auteurs (Lee and Joseph 2002) ou groupes dexperts (CSHPF 2005) proposent, des guides
pour mener ces investigations, mais ces derniers ne sont pas dcrits ici.
9.2.1
Cas gnral des eaux chaudes sanitaires
La Direction gnrale de la sant a fix des "prescriptions techniques applicables aux installations
collectives de production, de stockage et de distribution deau chaude sanitaire qui alimentent les
tablissements de sant, les tablissements sociaux et mdico-sociaux, les tablissements
pnitentiaires, les htels et rsidences de tourisme, les campings et les autres tablissements
46
recevant du public qui possdent des points dusage risque " (Arrt du 1er fvrier 2010) :
$
"Les dnombrements en Legionella pneumophila doivent tre infrieurs 1 000 units
formant colonie par litre (UFC/L) au niveau de tous les points dusage risque.
$ Dans les tablissements de sant, les dnombrements en Legionella pneumophila doivent
tre infrieurs au seuil de dtection au niveau de tous les points dusage risque accessibles
des patients identifis par le comit de lutte contre les infections nosocomiales ou toute
organisation charge des mmes attributions comme particulirement vulnrables au risque
de lgionellose.
$ Lorsque ces seuils ne sont pas respects, le responsable des installations prend sans dlai
les mesures correctives ncessaires au rtablissement de la qualit de leau et la protection
des usagers."
9.2.2
Cas des eaux chaudes sanitaires dans les tablissements de sant
La Direction gnrale de la sant, prconise diffrents types d'actions en fonction des concentrations
en Legionella mesures aux points d'usages des installations d'eau chaude des tablissements de
sant (Circulaire DGS 2002/243). Ces prconisations sont adaptes la majeure partie de la
47
population hospitalire. Pour les patients dits " haut risque ", les mesures de prvention particulires
ncessaires sont prcises ma fin de ce chapitre.
L'objectif cible est de maintenir la concentration en Legionella pneumophila un niveau infrieur 10
UFC/L d'eau. Cela suppose un "entretien rgulier des rseaux et des quipements", et une
"surveillance rgulire des paramtres physiques (temprature) et microbiologiques de leau". Des
3
actions sont prconises ds que la concentration en L. pneumophila atteint 10 UFC/L d'eau, en
commenant par une alerte des autorits et la mise en place de mesures pouvant aller jusqu des
restrictions dusages et des actions curatives :
"Mesures de base :
$ s'assurer que l'information est adresse sans dlai l'ensemble des personnels en charge de
la gestion de l'eau, du Centre de coordination de la lutte contre les infections nosocomiales
(CCLIN), de l'quipe oprationnelle d'hygine et des services concerns ;
$ comprendre l'origine des carts avec les rsultats des analyses antrieures et rechercher les
causes de la prolifration ;
$ valuer l'tendue de la contamination du rseau ;
$ mettre en uvre les mesures ncessaires la matrise de la concentration en Legionella
(dtartrage, purge, rglage de la temprature, travaux) ;
$ renforcer la surveillance des paramtres physiques et microbiologiques.
Selon l'importance de la prolifration :
46
47
La Circulaire DGS 2002/243 dfinit les patients dits "patients haut risque" sont les immunodprims svres, et
particulirement les immunodprims aprs transplantation ou greffe d'organe et les immunodprims par corticothrapie
suprieure 5 mg/kg de prednisone pendant plus de 5 jours).
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Anses
$
$
$
$
mettre en uvre les actions curatives ncessaires (nettoyage et dsinfection, purge, monte
en temprature) ;
assurer une information adapte des malades accompagne de conseils ;
en fonction de l'analyse bnfice/risque faite au cas par cas, supprimer les usages risque
(bains bouillonnants, douches) et mettre en uvre des moyens permettant de limiter
l'exposition aux arosols (lavage au gant, bain) ;
suivre l'efficacit des mesures mises en uvre."
Les actions doivent tre appliques jusqu' un retour des niveaux de contamination infrieurs
cette valeur (Circulaire DGS 2002/243). La Circulaire DGS 2005/315 prcise que :
3
$ "si le bulletin danalyse porte un rsultat chiffr infrieur ou gal 10 UFC/L de L.
pneumophila ou indique le rsultat "< 250 UFC/L", quelle que soit la mention complmentaire
apporte, le prlvement respecte lobjectif cible de qualit ;
$ si le bulletin danalyse porte la mention "ininterprtable" ou "prsence dune flore interfrente
empchant la dtection des L. pneumophila" ou "prsence de L. pneumophila non
quantifiables en raison de la prsence dune flore interfrente", la conformit du rsultat
danalyse par rapport lobjectif cible ne peut tre estime et un prlvement de contrle doit
tre reprogramm."
Pour les patients " haut risque", la Circulaire DGS 2002/243 indique que "des mesures de prvention
particulires sont prcises. L'eau soutire au niveau des points d'usage risque doit respecter en
permanence une concentration en Legionella pneumophila infrieure au seuil de dtection (50 UFC/L
mesurs par culture). Les points d'usage risque pour les patients haut risque correspondent aux
points d'usage susceptibles d'exposer ces patients un arosol ; il s'agit en particulier des douches.
Chaque tablissement devra dfinir, en liaison avec le CCLIN, des mesures spcifiques pour les
patients haut risque lorsqu'il n'est pas possible d'assurer en permanence une concentration en
Legionella pneumophila infrieure au seuil de dtection dans l'eau du rseau alimentant les points
d'usage risque". La Circulaire DGS 2005/315 prcise que :
$ "si le bulletin danalyse mentionne un rsultat chiffr ou porte la mention "prsence de L.
pneumophila non quantifiables" ou la mention "prsence de L. pneumophila non quantifiables
en raison de la prsence dune flore interfrente", des restrictions dusage et des actions
curatives doivent tre mises en uvre par ltablissement de sant.
$ si le bulletin danalyse porte la mention "ininterprtable" ou "prsence dune flore interfrente
empchant la dtection des L. pneumophila" (quel que soit le rsultat exprim < 25 000
UFC/L ou < 2 500 UFC/L, etc.), la conformit du rsultat danalyse ne peut tre estime et un
prlvement de contrle doit tre reprogramm. Les modalits de gestion du risque devront
tre apprcies au cas par cas en fonction des lments de contexte."
9.2.3
Cas des tours arorfrigrantes et autres installations risque
Actuellement, des rgles dictes par les ministres en charge de lenvironnement et de la sant
existent pour la surveillance et les niveaux dintervention en fonction des concentrations en Legionella
dans les installations risque.
Larrt du 13 dcembre 2004 relatif aux installations de refroidissement par dispersion deau dans un
flux dair soumises autorisation au titre de la rubrique (numro 2921) prcise :
- article 8 (Arrt du 13 dcembre 2004) :
"La frquence des prlvements et analyses de Legionella spp selon la norme NF T90-431 est au
minimum mensuelle pendant la priode de fonctionnement de l'installation.
Si, pendant une priode d'au moins 12 mois continus, les rsultats des analyses mensuelles sont
infrieurs 1 000 units formant colonies par litre d'eau, la frquence des prlvements et analyses
des Legionella spp selon la norme NF T90-431 pourra tre au minimum trimestrielle.
Si un rsultat d'une analyse en lgionelles est suprieur ou gal 1 000 units formant colonies par
litre d'eau, ou si la prsence de flore interfrente rend impossible la quantification de Legionella spp, la
frquence des prlvements et analyses des Legionella spp selon la norme NF T90-431 devra tre de
nouveau au minimum mensuelle"
- article 9 (Arrt du 13 dcembre 2004) :
"1. Les actions mener si la concentration mesure en Legionella spp est suprieure ou gale
100 000 units formant colonies par litre deau selon la norme NF T90-431 :
a) lexploitant arrte, dans les meilleurs dlais, linstallation de refroidissement, (...), et ralise la
vidange, le nettoyage et la dsinfection de linstallation de refroidissement. (...)
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Anses
Ds rception des rsultats selon la norme NF T90-431, lexploitant en informe
immdiatement linspection des installations classes (...)
b) Avant la remise en service de linstallation, il procde une analyse mthodique des risques
de dveloppement des lgionelles dans linstallation, telle que prvue larticle 6.1, ou
lactualisation de lanalyse existante, en prenant notamment en compte la conception de
linstallation, sa conduite, son entretien et son suivi. (...)
Lexploitant met en place les mesures damlioration prvues et dfinit les moyens susceptibles
de rduire le risque. Les modalits de vrification de lefficacit de ces actions avant et aprs
remise en service de linstallation sont dfinies par des indicateurs tels que des mesures
physico-chimiques ou des analyses microbiologiques.
c) Aprs remise en service de linstallation, lexploitant vrifie immdiatement lefficacit du
nettoyage et des autres mesures prises selon les modalits dfinies prcdemment. Quarantehuit heures aprs cette remise en service, lexploitant ralise un prlvement, pour
analyse des lgionelles selon la norme NF T90-431. (...)
d) Les prlvements et les analyses en Legionella spp selon la norme NF T90-431 sont
ensuite effectus tous les quinze jours pendant trois mois. En cas de dpassement de la
concentration de 10 000 units formant colonies par litre deau sur un des prlvements
prescrits ci-dessus, linstallation est nouveau arrte dans les meilleurs dlais et lensemble
des actions prescrites ci-dessus sont renouveles.
e) Dans le cas des installations dont larrt immdiat prsenterait des risques importants pour le
maintien de loutil ou la scurit de linstallation et des installations associes, la mise en uvre
de la procdure darrt sur plusieurs jours pourra tre stoppe, sous rserve quil ny ait pas
dopposition du prfet la poursuite du fonctionnement de linstallation de refroidissement, si le
rsultat selon la norme NF T90-431 dun prlvement effectu pendant la mise en uvre de la
procdure darrt est infrieur 100 000 units formant colonies par litre deau. La remise en
fonctionnement de linstallation de refroidissement ne dispense pas lexploitant de la ralisation
de lanalyse de risques, de la mise en uvre dune procdure de nettoyage et dsinfection, et
du suivi de son efficacit. Les prlvements et les analyses en Legionella spp selon la
norme NF T90-431 sont ensuite effectus tous les huit jours pendant trois mois.
En fonction des rsultats de ces analyses, lexploitant met en uvre les dispositions suivantes :
en cas de dpassement de la concentration de 10 000 units formant colonies par litre
deau, lexploitant ralise ou renouvelle les actions prvues au point 1.b (...);
en cas de dpassement de la concentration de 100 000 units formant colonies par litre
deau, linstallation est arrte dans les meilleurs dlais et lexploitant ralise lensemble des
actions prescrites aux points 1 a 1 c du prsent article.
Le prfet pourra autoriser la poursuite du fonctionnement de linstallation, (...)
2. Actions mener si la concentration mesure en Legionella spp est suprieure ou gale 1
000 units formant colonies par litre deau et infrieure 100 000 units formant colonies par
litre deau.
(...) lexploitant prend des dispositions pour nettoyer et dsinfecter linstallation de faon
sassurer dune concentration en Legionella spp infrieure 1 000 units formant colonies par
litre deau. La vrification de lefficacit du nettoyage et de la dsinfection est ralise par
un prlvement selon la norme NF T90-431 dans les deux semaines conscutives
laction corrective. Le traitement et la vrification de lefficacit du traitement sont
renouvels tant que la concentration mesure en Legionella spp est suprieure ou gale
1 000 units formant colonies par litre deau et infrieure 100 000 units formant colonies
par litre deau.
A partir de trois mesures conscutives indiquant des concentrations suprieures 1 000
units formant colonies par litre deau, lexploitant devra procder lactualisation de lanalyse
mthodique des risques de dveloppement des lgionelles dans linstallation, prvue larticle
6, en prenant notamment en compte la conception de linstallation, sa conduite, son entretien,
son suivi. (...)
3. Actions mener si le rsultat de lanalyse selon la norme NF T90-431 rend impossible la
quantification de Legionella spp en raison de la prsence dune flore interfrente.
(...) lexploitant prend des dispositions pour nettoyer et dsinfecter linstallation de faon sassurer
dune concentration en Legionella spp infrieure 1 000 units formant colonies par litre deau."
- dans son article 9 (Arrt du 13 dcembre 2004) :
"L'eau d'appoint respecte au niveau du piquage les critres microbiologiques et de matires en
suspension suivants
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Anses
Legionella spp < seuil de quantification de la technique normalise utilise.
Numration de germes arobies revivifiables 37 C < 1 000 germes/mL.
Matires en suspension : < 10 mg/L.
Lorsque ces qualits ne sont pas respectes, l'eau d'appoint fera l'objet d'un traitement permettant
l'atteinte des objectifs de qualit ci-dessus. Dans ce cas, le suivi de ces paramtres sera ralis au
moins deux fois par an dont une pendant la priode estivale."
Larrt du 13 dcembre 2004 relatif aux prescriptions gnrales applicables aux installations
classes pour la protection de l'environnement soumises dclaration sous la rubrique n 2921,
prcise dans son annexe I, Titre II, 7. "Actions mener en cas de prolifration de lgionelles" :
"7.1. Actions mener si la concentration mesure en Legionella specie est suprieure ou gale
100 000 units formant colonies par litre d'eau selon la norme NF T90-431
a. Si les rsultats des analyses en lgionelles selon la norme NF T90-431, ralises en
application de lensemble des dispositions qui prcdent, mettent en vidence une
concentration en Legionella specie suprieure ou gale 100 000 units formant colonies par
litre d'eau, l'exploitant arrte dans les meilleurs dlais linstallation de refroidissement, () et
ralise la vidange, le nettoyage et la dsinfection de linstallation de refroidissement. ()
Ds rception des rsultats selon la norme NF T90-431, lexploitant en informe immdiatement
l'inspection des installations classes par tlcopie avec la mention urgent & important tour
arorfrigrante - dpassement du seuil de 100 000 units formant colonies par litre deau .
()
b. Avant la remise en service de linstallation, il procde une analyse mthodique des risques
de dveloppement des lgionelles dans linstallation, () ou lactualisation de lanalyse
existante, en prenant notamment en compte la conception de linstallation, sa conduite, son
entretien, son suivi. Cette analyse des risques doit permettre de dfinir les actions correctives
visant rduire les risques de dveloppement des lgionelles et de planifier la mise en uvre
des moyens susceptibles de rduire ces risques. () Lexploitant met en place les mesures
damlioration prvues et dfinit les moyens susceptibles de rduire le risque. Les modalits de
vrification de lefficacit de ces actions avant et aprs remise en service de linstallation sont
dfinies par des indicateurs tels que des mesures physico-chimiques ou des analyses
microbiologiques.
c. Aprs remise en service de linstallation, lexploitant vrifie immdiatement lefficacit du
nettoyage et des autres mesures prises selon les modalits dfinies prcdemment. Quarante
huit heures aprs cette remise en service, lexploitant ralise un prlvement, pour analyse des
lgionelles selon la norme NF T90-431. Ds rception des rsultats de ce prlvement, un
rapport global sur lincident est transmis linspection des installations classes. ()
d. Les prlvements et les analyses en Legionella specie selon la norme NF T90-431 sont
ensuite effectus tous les 15 jours pendant trois mois. En cas de dpassement de la
concentration de 10 000 units formant colonies par litre deau sur un des prlvements
prescrits ci-dessus, linstallation est nouveau arrte dans les meilleurs dlais et lensemble
des actions prescrites ci-dessus sont renouveles.
e. Dans le cas des installations dont larrt immdiat prsenterait des risques importants pour le
maintien de loutil ou la scurit de linstallation et des installations associes, la mise en uvre
de la procdure darrt sur plusieurs jours pourra tre stoppe, sous rserve quil ny ait pas
dopposition du prfet la poursuite du fonctionnement de linstallation de refroidissement, si le
rsultat selon la norme NF T90-431 dun prlvement effectu pendant la mise en uvre de la
procdure darrt est infrieur 100 000 units formant colonies par litre deau. La remise en
fonctionnement de linstallation de refroidissement ne dispense pas lexploitant de la ralisation
de lanalyse de risques, de la mise en uvre dune procdure de nettoyage et dsinfection, et
du suivi de son efficacit. Les prlvements et les analyses en Legionella specie selon la norme
NF T90-431 sont ensuite effectus tous les 8 jours pendant trois mois. En fonction des rsultats
de ces analyses, lexploitant met en uvre les dispositions suivantes :
- En cas de dpassement de la concentration de 10 000 units formant colonies par litre
deau, lexploitant ralise ou renouvelle les actions prvues au point 7.1.b du prsent titre
() ;
- En cas de dpassement de la concentration de 100 000 units formant colonies par litre
deau, linstallation est arrte dans les meilleurs dlais et lexploitant ralise lensemble des
actions prescrites aux points 7.1.a 7.1.c du prsent titre. Le prfet pourra autoriser la
poursuite du fonctionnement de linstallation, sous rserve que lexploitant mette
immdiatement en uvre des mesures compensatoires ().
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7.2. Actions mener si la concentration mesure en Legionella specie est suprieure ou gale
1 000 units formant colonies par litre d'eau et infrieure 100 000 units formant colonies
par litre deau selon la norme NF T90-431
Si les rsultats d'analyses ralises en application de lensemble des dispositions qui prcdent
mettent en vidence une concentration en Legionella specie selon la norme NF T90-431
suprieure ou gale 1 000 units formant colonies par litre deau et infrieure 100 000 units
formant colonies par litre deau, l'exploitant prend des dispositions pour nettoyer et dsinfecter
linstallation de faon sassurer dune concentration en Legionella specie infrieure 1 000
units formant colonies par litre deau. La vrification de lefficacit du nettoyage et de la
dsinfection est ralise par un prlvement () dans les deux semaines conscutives
l'action corrective. Le traitement et la vrification de lefficacit du traitement sont renouvels
tant que la concentration mesure en Legionella specie est suprieure ou gale 1 000 units
formant colonies par litre d'eau et infrieure 100 000 units formant colonies par litre deau
A partir de trois mesures conscutives indiquant des concentrations suprieures 1 000 units
formant colonies par litre deau, lexploitant devra procder lactualisation de lanalyse
mthodique des risques de dveloppement des lgionelles dans linstallation, (). Lexploitant
tient les rsultats des mesures et des analyses de risques effectues la disposition de
linspection des installations classes.
7.3. Actions mener si le rsultat dfinitif de lanalyse rend impossible la quantification de
Legionella specie en raison de la prsence dune flore interfrente
Sans prjudice des dispositions prvues aux points 7.1 et 7.2, si le rsultat dfinitif de lanalyse
rend impossible la quantification de Legionella specie en raison de la prsence dune flore
interfrente, l'exploitant prend des dispositions pour nettoyer et dsinfecter linstallation de faon
sassurer dune concentration en Legionella specie infrieure 1000 units formant colonies
par litre deau."
9.3
9.3.1
Signification sanitaire des valeurs cibles actuelles

Cas gnral
La plupart des mthodes de dnombrement de Legionella donnent peu dinformation sur le niveau
dinfectiosit des bactries dnombres. Par ailleurs, actuellement les informations sur la dose
infectante et la relation concentration dans leau/concentration dans les arosols restent parcellaires.
Cela rend les rsultats de dnombrement de Legionella difficiles interprter dun point du vue
sanitaire (Yaradou et al. 2007).
Cependant, des Legionella infectieuses prsentes dans un environnement ont une probabilit dautant
plus grande de provoquer une infection, quelles sont prsentes en grand nombre. En effet, plus elles
sont nombreuses, plus leurs chances de rsister aux conditions environnementales sont leves
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9.3.2
Cas des eaux chaudes sanitaires
Pour la population gnrale, les auteurs admettent que Legionella pneumophila prsente un risque
4
5
pour la sant humaine, quand la densit de cellules est suprieure 10 ou 10 UFC par litre
(mesure par culture) deau chaude sanitaire, malgr labsence de dose-rponse connue chez
lhomme. Les donnes pidmiologiques montrent que le risque de survenue de lgionellose est
accru partir de ces concentrations (Bauer et al. 2008; Delgado-Viscogliosi et al. 2009; Meenhorst et
al. 1985; Patterson et al. 1994). Ceci nest pas valable pour les patients dits "haut risque", lesquels
sont plus sensibles aux infections et susceptibles de contracter une lgionellose avec des densits en
Legionella bien infrieures.
Selon les donnes de la littrature, la valeur sanitaire en dessous de laquelle le risque de lgionellose
4
5
est ngligeable ou acceptable pour la population gnrale est comprise entre 10 ou 10 UFC/L en L.
pneumophila, malgr labsence de dose-rponse connue chez lhomme.
Pour la population gnrale, la rglementation franaise actuelle relative aux eaux chaudes
3
sanitaires, est plus exigeante dun facteur 10 et fixe la concentration ne pas dpasser 10 UFC/L
L. pneumophila. Cela permet de conserver une marge de scurit par rapport au risque estim.
Compte tenu des connaissances actuelles, le groupe de travail estime quil nest pas justifi de
proposer une modification des seuils rglementaires actuellement utiliss pour exploiter les rsultats
de dnombrement obtenus par culture (selon la norme NF T90-431).
En revanche, pour les patients "haut risque" (immunodprims), lexamen de la littrature, na pas
permis de mettre en vidence une concentration en Legionella dans une eau chaude sanitaire en
dessous duquel il ne serait plus observ de cas de lgionelloses. De surcrot, contrairement la
population gnrale, les patients "haut risque" sont susceptibles dtre infects par dautres
espces de Legionella que L. pneumophila. Pour ces patients, il est prfrable de conserver une
valeur cible infrieure au seuil de quantification en L. pneumophila (selon la norme NF T90-431) et
danalyser le risque vis--vis de Legionella largie toute espce (Legionella spp.).
9.3.3
Cas des tours arorfrigrantes
La concentration en Legionella (incluant L. pneumophila) dans les tours arorfrigrantes peut varier
considrablement en trs peu de temps. Ces oscillations refltent le caractre dynamique de ces
cosystmes dans lesquels de nombreuses espces de bactries ou de protozoaires adhrent entre
eux pour former des biofilms dans les installations. Comme indiqu prcdemment, cette association
peut contribuer la moindre sensibilit aux biocides utiliss pour le nettoyage et la dsinfection des
installations ou la modification de certaines caractristiques de Legionella, comme leur virulence.
Les fluctuations de densit en Legionella observes peuvent compliquer ltablissement de valeurs
cibles rglementaires et de rgles spcifiant la frquence minimum des mesures ncessaires pour
maintenir les tours arorfrigrantes sous contrle et viter des dispersions importantes de Legionella
dans leur voisinage (Ragull et al. 2007).
A ce jour, aucune pidmie lie une tour arorfrigrante na t attribue une autre espce de
Legionella que L. pneumophila. Pour la population gnrale, le risque tant li L. pneumophila et
non Legionella spp, il semble plus opportun de dnombrer L. pneumophila plutt que L. species, tout
3
5
en conservant les mmes valeurs de seuils daction et darrt (respectivement 10 et 10 UFC/L).
Toutefois, dans le cadre de la gestion des installations, la recherche de L. spp reste un indicateur
pertinent de dysfonctionnement.
9.4
Dtermination de valeurs cibles pour les mthodes alternatives la culture.
Un examen de la littrature a permis de mettre en vidence quelques tentatives destines proposer

des valeurs cibles, pour des mthodes alternatives, qui correspondent aux valeurs cibles utiliss pour
linterprtation des rsultats obtenus par culture (selon la norme Afnor NF T90-431). Lessentiel de
ces tentatives portent sur la q-PCR. Le prsent chapitre a pour but den faire un bilan.
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9.4.1
Cas des eaux chaudes sanitaires
Dans leur tude portant sur 223 chantillons deaux chaudes sanitaires, dj voque dans le
chapitre relatif la comparaison des mthodes de ce rapport, Joly et al., ont mis en vidence des
2
valeurs de corrlations entre les rsultats de culture et ceux de q-PCR (r = 0,1267 et 0,2369
2
respectivement de pour L. spp et L. pneumophila dans le laboratoire 1 de ltude ; r = 0,5259 et
0,7295 respectivement pour L. spp et L. pneumophila dans le laboratoire 2 de ltude). Sur la base de
cette observation, Joly et al., ont tent de dterminer une valeur seuil en q-PCR correspondant des
3
eaux contenant plus de 10 UFC/L Legionella mesures par culture (seuil utilis pour linterprtation
48
des rsultats en culture), laide dune courbe de ROC pour obtenir un maximum de sensibilit et de
spcificit. Il en ressort que (Joly et al. 2006) :
-
pour le dnombrement de L. spp :

4
une valeur cible en q-PCR de 2,9. 10 UG/L permettrait dobtenir 78,9% de correspondance
entre les actions dclenches par q-PCR et par culture (101 chantillons sur 128), dans le
laboratoire 1 ;
3
o une valeur cible en q-PCR de 2,5. 10 UG/L permettrait dobtenir 87% de correspondance entre
les actions dclenches par PCR et par culture (80 chantillons sur 91), dans le laboratoire 2;
pour le dnombrement de L. pneumophila :

4
une valeur cible en q-PCR de 2,6 10 UG/L permettrait dobtenir 86,9% de correspondance
entre les actions dclenches par PCR et par culture (106 chantillons sur 122), dans le
laboratoire 1 ;
3
o une valeur cible en q-PCR de 5,6 10 UG/L permettrait dobtenir 94,5% de correspondance
entre les actions dclenches par q-PCR et par culture (86 chantillons sur 91), dans le
laboratoire 2.
Les valeurs du signal q-PCR sont significativement diffrentes (de lordre de 1 log) dun laboratoire
lautre, malgr lutilisation dune mme mthode dextraction et du mme protocole de q-PCR. Les
auteurs de ltude en concluent une ncessit, pour chaque laboratoire, de dterminer sa propre
valeur cible de signal q-PCR permettant de correspondre 1000 UFC/L (Joly et al. 2006). Toutefois,
les eaux chaudes sanitaires analyses par le laboratoire 1 proviennent de multiples origines, alors que
celles analyses dans le laboratoire 2 proviennent dun mme hpital. Par ailleurs, les laboratoires ne
disposaient pas dun talon commun.
Concernant la dtermination de valeurs cibles pour les mthodes danalyse des eaux chaudes
sanitaires alternatives la culture, une seule tude publie a t rpertorie. Cette tude fait tat de
correspondances non homognes entre les seuils de dclenchement dactions spcifiques de la
culture et ceux de la q-PCR. Ces correspondances apparaissent meilleures pour la cible L.
pneumophila que pour L. spp.
Aucune tude portant sur la dtermination de valeurs cibles na t rpertorie pour les autres
mthodes alternatives, hormis la q-PCR.
9.4.2
Cas des tours arorfrigrantes
Dans leur tude portant sur 37 chantillons deaux de tours arorfrigrantes, Joly et al., nont pas mis
en vidence de corrlations entre les rsultats de culture et ceux de q-PCR. Ils nont donc pas pu
3
dterminer de valeur cible en q-PCR correspondant des eaux contenant plus de 10 UFC/L
Legionella mesures par culture, comme ce quils ont tent de faire pour les eaux chaudes sanitaires
(Joly et al. 2006).
Compte tenu du peu de rsultats publis sur le sujet, il est difficile de conclure sur la base de la
bibliographie.
48
Courbe de ROC (Receiver Operating Characteristics) : outil graphique, destin tracer des valeurs de la sensibilit (Se) en
fonction de 1-Sp (spcificit).
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10 Synthse des lments recueillis

10.1 Synthse sur la base des lments bibliographiques
10.1.1 Elments prendre en compte pour choisir une mthode de dnombrement de
Legionella
La saisine portait sur les mthodes de dtection de Legionella dans leau adaptes aux contextes
des eaux chaudes sanitaires et des tours arorfrigrantes. En prambule, il est important dinsister
sur limportance de dnombrer les Legionella. Linformation fournie par la simple dtection parat
insuffisante dans ces contextes.
Le genre Legionella est compos de multiples espces, elles-mmes subdivises en srogroupes et
sous-types. Il apparat ncessaire de prciser la cible la plus pertinente des dnombrements, en
fonction de lobjectif poursuivi : gestion des risques sanitaires ou gestion des installations.
Pour la population gnrale, compte tenu de la raret des cas de lgionellose attribus dautres
espces de Legionella que L. pneumophila, le dnombrement de cette espce peut suffire fournir
linformation ncessaire la gestion du risque sanitaire. Le dnombrement spcifique des L.
pneumophila du srogroupe 1, principal responsable des cas de lgionellose, peut apporter une
information supplmentaire. Cependant, il ne peut remplacer le dnombrement des L. pneumophila.
Pour les individus atteints dune immunodpression svre, galement dits "patients haut
49
risque" ), qui peuvent tre infects par L. pneumophila comme par dautres espces de Legionella, le
dnombrement des L. spp apporte une information supplmentaire, notamment lorsquil est
associ aux mesures de suivi et de traitement de leau spcifiques ce contexte, dj envisages
50
dans la rglementation en vigueur ;
Pour la gestion des installations deaux chaudes sanitaires et des tours arorfrigrantes, le
dnombrement de L. spp apporte des informations relatives lcosystme des installations de la
mme importance que celles apporte par le dnombrement de L. pneumophila.
Ltat de viabilit des Legionella dnombres est une information complmentaire intressante pour
interprter les rsultats, quel que soit la cadre de leur utilisation. Le risque associ la prsence de
bactries viables non cultivables doit notamment tre pris en considration.
Le biofilm et les protozoaires constituent un rservoir avr de Legionella. Ils contribuent leur
protection contre les stress environnementaux (traitement de dsinfection), favorisent leur
multiplication. Par ailleurs, les protozoaires semblent contribuer la revivification des Legionella et
accrotre leur pathognicit pour lhomme. Compte tenu de ces lments, la prsence de biofilm et
de protozoaires sont des facteurs prendre en considration lors du suivi des installations et
pourraient galement contribuer la recontamination plus rapide de linstallation, aprs un traitement
de dsinfection.
10.1.2 Attentes relatives une mthode de dnombrement de Legionella dans leau
Il apparat important quune mthode analytique destine au dnombrement de Legionella dans leau
51
soit spcifique et slective de la cible choisie, quelle ait t value sur le plan du rendement ,
quelle possde une limite de quantification basse et le cas chant infrieure aux seuils
rglementaires.
Par ailleurs, le groupe de travail a identifi des critres spcifiques lvaluation dune mthode
de dnombrement de Legionella, en routine, dans les eaux chaudes sanitaires et les tours
arorfrigrantes.
49
Les patients dits patients haut risque sont les immunodprims svres, et particulirement les immunodprims aprs
transplantation ou greffe d'organe et les immunodprims par corticothrapie prolonge (0,5 mg/kg de prednisone pendant
30 jours ou plus, ou quivalent) ou rcente et haute dose (c'est--dire suprieure 5 mg/kg de prednisone pendant plus de
5 jours)
50
distribution deau chaude sanitaire et Circulaire DGS/SD7A/SD5C/DHOS/E4 n 2002/243 du 22 avril 2002 relative la
prvention du risque li aux lgionelles dans les tablissements de sant
51
Fraction de la cible dtecte par rapport la cible prsente dans lchantillon.
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Des critres identifis comme de priorit leve :
-
Quantification de Legionella pneumophila ;
Quantification de Legionella pneumophila avec distinction du srogroupe 1 ;
Prise en compte des Legionella intra amibiennes ou intra vsiculaires dans la quantification ;
Non dtection des Legionella mortes ;
Dtection de lensemble des Legionella viables et potentiellement pathognes ;
Rapidit des rsultats ;
Applicable sur des chantillons deau traite ;
Critres dinterprtation pour le risque sanitaire disponibles.
Des critres identifis comme de priorit modre :

-
Distinction et de quantification des srogroupes Lp autre que sg1 ;
Quantification de lensemble des Legionella spp ;
Applicable sur
physiquement) ;
Faisabilit, simplicit ;
Equipements ncessaires faibles ;
Temps technicien faible ;
Interprtation technique simple des rsultats bruts ;
Permet de disposer de souches pour des tudes complmentaires.
des
chantillons
deau
charge
(biologiquement,
chimiquement
ou
Chaque mthode dcrite dans ce rapport a t examine au regard de ces critres. Le rsultat de cet
exercice est prsent dans les chapitres de description des mthodes, et synthtis dans le tableau
10.
Il est important de souligner que le choix dune mthode de dnombrement ne peut reposer
que sur ses avantages et ses inconvnients intrinsques. En effet certains de ces lments
thoriques positifs doivent tre confronts aux ralits du terrain o ils peuvent tre alors pris en
dfaut. Il apparat galement essentiel, pour un tel choix, de prendre en compte les niveaux de
dveloppement des diffrentes mthodes : stabilisation dun protocole prcis, validation des
caractristiques et performances par diffrents laboratoires et sur diffrents types dchantillons
environnementaux, robustesse, existence de standards et dtalons, etc.
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Tableau 10 : Critres identifis pour le choix des mthodes de dnombrement de Legionella
Mthodes
Critres priorit leve
pneumophila
srogroupe 1
Prise en compte des Legionella
intra amibiennes ou intra
Non dtection des Legionella
mortes
risque sanitaire disponibles
deau traite
Critres priorit modre
Legionella spp
deau charge
des rsultats bruts
Permet de disposer de souches
pour des tudes
complmentaires
Culture
DVC
q-PCR
v-PCR
Immunodtection
FISH
IDS
CultureFISH
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
+
?
?
?
?
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
?
+
+
+
+
( +) Avantages ; (-) inconvnients ; ( ?) critres non valus
10.1.3 Tentatives de comparaison des diffrentes mthodes de dnombrement de Legionella

Certaines mthodes de dnombrement de Legionella dans leau, gnralement les plus utilises, ont
fait lobjet de tentatives de comparaison. Les units dans lesquelles sont exprims les rsultats des
mthodes considres ne sont souvent pas strictement comparables. Toutefois, lexistence de
corrlations entre des rsultats de dnombrement exprims dans diffrentes units, semble
intressante pour alimenter la rflexion relative llaboration de rgles dinterprtation pour les
mthodes alternatives la culture.
Pour lanalyse deaux prpares en laboratoire, dans des conditions idales de croissance
matrises et sans stress ajout (dsinfectant, traitement thermique, etc.), certaines mthodes
(culture, q-PCR, TVC, immuno-dtection) produisent des rsultats quivalents. Tout cart par
rapport ces conditions idales affecte diffremment les rsultats de ces mthodes et perturbe leur
quivalence.
Ainsi, sur des eaux environnementales, dont la qualit et la charge en particules, composs
chimiques et microorganismes sont trs variables, les diffrentes mthodes de dnombrement
de Legionella, apparaissent rarement quivalentes. Nanmoins, les corrlations observes entre
les rsultats des mthodes compares sont sensiblement meilleures, pour lanalyse deaux
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relativement peu charges, comme les eaux de rseaux domestiques, que pour lanalyse deaux
charges, comme les eaux de tours arorfrigrantes.
Pour envisager la comparaison des limites de dtection et de quantification relatives diffrentes
mthodes il est ncessaire que celles-ci soient prouves et stabilises, par exemple par lintroduction
dune norme. Ce nest pas le cas pour la majorit des mthodes alternatives rpertories.
10.1.4 Rflexion sur la signification des rsultats et des valeurs cibles
Pour tre en mesure dapporter une information complte dun point de vue sanitaire, il semble
important quune mthode de dnombrement de Legionella comptabilise aussi bien les Legionella
viables cultivables que VBNC.
Dans le cas particulier dun suivi de dsinfection, les mthodes qui semblent tre les plus
adaptes sont celles qui prennent en compte les seules Legionella viables, quelles soient
cultivables ou non. Dans ce contexte, il peut galement tre ncessaire de vrifier dans quelle mesure
le renouvellement de leau, affecte le taux des bactries viables par rapport au taux de bactries non
viables.
Lcologie microbienne des Legionella est largement influence par leurs interactions avec les amibes
et les biofilms. Ces derniers peuvent jouer un rle de rservoirs de Legionella et les protgeraient des
facteurs environnementaux, notamment des traitements de dsinfection. Ainsi, dans certaines
situations, la recherche damibes ou de Legionella dans les biofilms, semble pouvoir apporter
des informations intressantes, en complment du dnombrement de Legionella dans leau. Ces
recherches restent cependant encore complexes mettre en uvre en routine.
En termes de signification sanitaire des valeurs cibles actuelles, il est important de distinguer le cas
des eaux chaudes sanitaire de celui des tours arorfrigrantes.
Concernant les eaux chaudes sanitaires, selon les donnes de la littrature, la valeur sanitaire en
dessous de laquelle le risque de lgionellose est ngligeable ou acceptable pour la population
4
5
gnrale est comprise entre 10 ou 10 UFC/L en L. pneumophila, malgr labsence de dose-rponse
connue chez lhomme. La rglementation actuelle est plus exigeante dun facteur 10. Ainsi, il ne
semble pas opportun de modifier les seuils rglementaires relatifs aux L. pneumophila dans les
eaux chaudes sanitaires, pour linterprtation des rsultats de dnombrement par culture.
En revanche, pour les patients "haut risque" (immunodprims), lexamen de la littrature, na
pas permis de mettre en vidence une concentration en Legionella dans une eau chaude sanitaire en
dessous de laquelle il ne serait plus observ de cas de lgionelloses. Pour ces patients, il est
prfrable de conserver une valeur cible infrieure au seuil de quantification en L.
pneumophila et danalyser le risque vis--vis de Legionella largie toute espce.
Concernant les tours arorfrigrantes, pour la population gnrale, le risque tant li L.
pneumophila et non Legionella spp, il semble plus opportun de dnombrer L. pneumophila plutt
3
5
que L. spp, tout en conservant les mmes valeurs cibles (10 et 10 UFC/L). Toutefois, dans le cadre
de la gestion des installations, la recherche de L. spp reste un indicateur pertinent de
dysfonctionnement.
10.1.5
Dtermination de valeurs cibles pour les mthodes alternatives la culture
Dans le cas des eaux chaudes sanitaires, bien peu de laboratoires se sont risqus dterminer
des valeurs cibles pour les mthodes alternatives en tentant de les faire correspondre aux valeurs
cibles utilises pour linterprtation de la mthode par culture. Une seule tude publie a t
rpertorie sur le sujet. Elle concerne les seules eaux chaudes sanitaires. Elle fait tat de
correspondances entre des seuils de dclenchement dactions spcifiquement tablies pour la
mthode par culture et des valeurs cibles tablies pour la mthode par q-PCR. Ces
correspondances apparaissent meilleures pour la cible L. pneumophila que pour L. spp. Aucune
tentative de dtermination de valeurs cibles impliquant une autre mthode que la q-PCR na t
rpertorie.
Dans le cas des tours arorfrigrantes, compte tenu de labsence de rsultats dtudes
concluantes publis sur le sujet, aucune conclusion ne peut tre faite sur la base de la bibliographie.
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10.2 Synthse sur la base des auditions

Le prsent chapitre est une synthse des informations issues des prsentations et des discussions
menes avec les diffrents acteurs auditionns par le groupe de travail. Ces donnes proviennent
dobservations de terrain ou dtudes en cours mais ne sont pas publies. Elles ne peuvent tre
considres au mme titre que des lments bibliographiques cits prcdemment, dans la mesure
o elles ne sont pas passes au crible dune procdure de validation par les pairs. Leur intrt rside
dans leur comparaison avec les tendances et hypothses dj publies dans la littrature. La liste des
personnalits auditionnes et la mthode utilise pour mener bien ces auditions sont prsentes
page 4, dans le chapitre Auditions . .
La prise en compte et linterprtation des rsultats prsents par les diffrents acteurs ncessitent une
remarque prliminaire, souligne par lun dentre eux. Les essais inter-laboratoires ont montr que
mme sur une technique aussi rode et robuste que la culture, il pouvait exister une grande
disparit des performances analytiques, lie pour partie aux rendements des diffrentes tapes de
lanalyse, ainsi quau matriel utilis (ex : milieu de culture). Les fluctuations pouvaient influencer les
rsultats hauteur de 20%. Il a fallu du temps pour que ces disparits soient mieux matrises. De
fait, il nest pas tonnant de trouver entre les diffrents acteurs des fluctuations des niveaux de fidlit
des mthodes et des avis divergents sur lefficacit de techniques non totalement rodes.
Cette disparit de performance analytique a t identifie et partiellement rduite pour la
culture (actuellement de lordre de 1 log sur la moyenne des rsultats, selon les essais interlaboratoires), elle est en cours de matrise pour la q-PCR, et nest ni connue ni value pour les
autres mthodes. La grande majorit des acteurs centrent leur activit sur la culture, avec parfois
une seconde technique en appui, celle-ci tant la plupart du temps la q-PCR. Les autres techniques
sont peu ou pas utilises, sauf dans le cas deaux trs charges.
Les prises de positions des diffrents acteurs concernant ces techniques doivent tre considres au
regard de lvolution positive tendant diminuer cette disparit au fil du temps. Des travaux anciens,
pour lesquels cette volution des pratiques na pas encore t prise en compte peuvent prsenter des
diffrences marques, alors quelles seront moindres pour des travaux rcents. A titre dexemple, la
reproductibilit et la rptabilit de la q-PCR sont dsormais voisines de celles de la culture. La
mise en place dun talon national pour le dnombrement de Legionella par q-PCR va galement
dans ce sens, dans lhypothse dun raccordement fiable entre talon primaire et talons secondaires.
Lutilisation de la q-PCR qui reste relativement faible, du fait de la non reconnaissance de ses
rsultats dun point de vue rglementaire, fait que le nombre de participants des essais interlaboratoires pour la q-PCR est trs insuffisant (environ 30 en France) par rapport au nombre de
participants pour la culture (environ 300 en France). Sur la base des lments communiqus, on peut
toutefois affirmer que les recherches de Legionella par culture (selon la norme NF T90-431) et par qPCR (selon la norme NF T90-471) restent deux mthodologies distinctes dont la corrlation nest pas
formellement tablie.
Le second facteur considr comme une source de disparits entre les rsultats est lefficacit
de la phase dextraction. Lexistence dune norme devrait contribuer amliorer ce point, mais le
contrle de cette condition ncessite galement un standard de rfrence, encore dvelopper. La
variabilit entre la q-PCR et la culture nest en revanche pas influence par lchantillonnage qui est
identique.
Un autre lment lorigine de disparits est ltat de cultivabilit des bactries. La question
des bactries viables non cultivables (VBNC) na que peu t voque dans les auditions car de lavis
des acteurs leur valuation quantitative directe pose encore un problme.
Les acteurs principaux traitent chacun de lordre de 25 000 chantillons par an. Si la culture est
exploite par tous pour des raisons rglementaires videntes, les autres mthodes peuvent
reprsenter entre 10 % et moins de 1% de lactivit globale danalyse, ce qui incite la prudence lors
des conclusions tires des rsultats produits et des commentaires affrents, en particulier lorsquil
sagit de comparer diffrentes mthodes.
Quelles que soient la ou les mthodes utilises, tous les acteurs font tat dobjectifs diffrents
en fonction des types dinstallation et des types deau quil convient pour eux de distinguer.
Cependant la plupart des acteurs retiennent sensiblement les mmes priorits pour une mthode de
dnombrement des Legionella :
o mthode adapte la matrice analyse ;
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o
o
o
obtention rapide des rsultats : 24 48h ;

suivi des tendances de colonisation des installations par les bactries (volution
chronologique).
si possible, quantification quivalente ou proportionnelle la rglementation.
La plupart admettent explicitement ou non que la culture ne correspond pas totalement la ralit des
besoins industriels et sanitaires puisquils cherchent souvent dvelopper des mthodes alternatives
pour matriser leurs installations.
10.2.1 Concernant les eaux chaudes sanitaires
De lavis de plusieurs des acteurs consults, la problmatique pose par la prsence de Legionella
dans les eaux chaudes sanitaires (ECS) est moins complexe que celle des TAR, dans la mesure o il
sagit gnralement dune eau traite, peu charge biochimiquement et microbiologiquement parlant.
Selon un des acteurs, le taux de contamination des installations par le genre Legionella avoisine les
10% de celles quil surveille, la majorit des contaminations tant dues Legionella spp et plus
rarement L. pneumophila. Les chantillons savrant trop chargs en flore interfrente pour fournir
un rsultat par culture reprsentent seulement 2% des chantillons traits. Par ailleurs, mme si le
traitement de leau est susceptible daffecter certaines mthodes (ex : par prsence de chlore), cette
altration demeure modre. Ce type deau ne comporte que peu dinhibiteurs. De fait, beaucoup
dacteurs observent plutt une bonne corrlation entre les diffrentes mthodes utilises,
3
assortie dune bonne linarit ds que la concentration en Legionella dpasse 10 UFC/L (rsultats de
q-PCR prdictifs des rsultats obtenus pas culture dans plus de 80% des cas). Cette corrlation par
rapport la mthode par culture, est valable pour L. pneumophila comme pour Legionella spp.
Dans le cas des eaux chaudes sanitaires, on peut donc envisager sans trop de risque une mthode
rapide permettant un dnombrement des Legionella avec des performances analytiques adaptes la
matrice. Lutilisation dune telle mthode reprsente aux yeux des acteurs une plus value pour la
gestion des rseaux non encore tudies. La difficult essentielle concerne la dtermination des
valeurs cibles, car certains rsultats prsents font tat dun taux de faux ngatifs qui reste
proccupant (suprieur 11%).
Il est noter que pour certains acteurs, le problme de la prsence de Legionella dans les rseaux
deau chaude sanitaire est principalement li la conception hydraulique des installations et
pourrait tre partiellement rsolu en modifiant leur conception. Sur ce point, le groupe de travail
tient prciser quil considre que lamlioration hydraulique des rseaux permettrait de
limiter le problme, mais que cela ne suffirait pas la rsoudre totalement. Il souligne
galement la complexit de la ralisation de telles amliorations dans les installations
existantes.
Afin de prendre une dcision dans le cadre dune gestion dinstallation, certains acteurs
soulignent limportance de la prise en compte du nombre de points dusage contamins en L.
pneumophila, comme le font les nord-amricains. Ces derniers prnent le dclenchement
systmatique dun traitement de linstallation si plus de 30 % des points dusage sont contamins. En
cas de contamination par Legionella observes sur moins de 30 % des points dusage la mise en
uvre dun traitement nest pas systmatique.
10.2.2 Concernant les tours arorfrigrantes
Le problme pos par les tours arorfrigrantes (TAR) est, de lavis gnral, nettement plus
complexe que celui des eaux chaudes sanitaires. Les Legionella pathognes sont dans ce cas
intgres un cosystme microbien plus complexe, avec des eaux pouvant tre beaucoup plus
charges en particules, en substances chimiques diverses et en microorganismes.
Tous les acteurs soulignent limportance de dnombrer Legionella spp. et L. pneumophila pour la
surveillance et la gestion courante de leurs installations. Les auditions font nanmoins apparatre que
la cible dont le dnombrement apporte le plus dinformations pertinentes et dcisives pour la gestion
des installations est L. pneumophila. Ils saccordent pour reconnatre que les analyses quils ralisent
portent dj prfrentiellement sur cette espce, plutt que sur le genre toute entier, dont le
dnombrement est exig dans la rglementation en vigueur. A cet gard, certains acteurs
prconisent dailleurs que les seuils rglementaires pour les TARs soit fix en L. pneumophila
et non pas en L. spp. En effet, dans un cadre rglementaire (nombre limit de prlvement), les
rsultats des recherches de Legionella spp. peuvent savrer difficilement interprtables car, selon les
espces qui les composent, elles ne reprsentent pas ncessairement un risque sanitaire.
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Un acteur rappelle qu lheure actuelle seule la France recherche Legionella spp., alors mme que
dautres pays estiment que cette recherche a peu dintrt et cartent les cas de Legionella spp. des
tudes comparatives. Toutefois, pour lensemble des acteurs auditionns, la recherche
systmatique et parallle de L. pneumophila et Legionella spp. reste intressante notamment
du fait de lexistence despces non pneumophila pathognes, bien que ces espces soient
marginales dans les TAR.
Pour certains acteurs la colonisation en Legionella spp. peut galement donner une indication sur
lvolution de lcologie microbienne des TAR. Ils notent une positivit des tours en Legionella spp.
suprieure 96% lorsque la recherche est effectue en q-PCR, ce qui confirme que les conditions
environnementales lintrieur des TARs sont particulirement favorables la prolifration de ce type
de bactrie.
La plupart des acteurs nont pu mettre en vidence de corrlation entre les rsultats danalyse
deau de TAR obtenus par culture et par q-PCR. Un acteur auditionn a mme voqu les rsultats
dessais qui montrent une meilleure concordance relative entre les rsultats de dnombrement de
Legionella spp par culture et de L. pneumophila par q-PCR, et entre les rsultats de dnombrement
de L. pneumophila par culture et de L. pneumophila par q-PCR. Cette correspondance nest
cependant que relative. En effet, il ne sagit pas dune correspondance directe entre les rsultats de
culture (en UFC/L) et de q-PCR (en UG/L), mais dune concordance dactions prconises en fonction
des valeurs cibles fixes par les auteurs de ltude pour la q-PCR et des seuils rglementaires pour la
culture. Ce point nest valable que pour les TAR et na pas t confirm par ailleurs. Certains
soulignent que les milieux de cultures ont t initialement dvelopps pour dtecter L.
pneumophila et non L. spp, ce qui pourrait expliquer ce dcalage.
La prise en compte dun indice de Legionella totales (L. spp.) pourrait permettre destimer linstabilit
ou la stabilit dune TAR dans le temps, tout en apportant une information sur les effets des
traitements. Toutefois un acteur fait remarquer que pour interprter correctement un rsultat de
recherche de L. spp., il est ncessaire de connatre ltat dapprovisionnement en eau de linstallation
et de disposer dun suivi rgulier pour connatre lvolution des rsultats.
Au cours de lanalyse des donnes issues des auditions, un membre du groupe de travail a propos
une alternative l'tablissement de valeurs cibles de concentration en Legionella dans leau, qui sont
forcment lis une mthode donne. Il propose de prfrer ltablissement de valeurs cibles,
ltablissement dexigences techniques destines matriser le risque :
- exigence en eau dappoint : teneur en Legionella pneumophila infrieure la limite de
quantification (LQ), quelle que soit la mthode ;
- niveau dalerte ou daction : dpassement d1 log par rapport la LQ ;
- niveau darrt immdiat : dpassement de 2 log par rapport la LQ ;
- la mme mthode devrait tre utilise pour toutes les analyses (de leau dappoint ou du circuit
de linstallation) et la LQ devra tre cohrente.
Il pourrait tre envisageable daccepter des dpassements de LQ en eau dappoint sous rserve de
matrise stricte des paramtres de fonctionnement de la TAR : dbit dentranement vsiculaire,
rendement du dvsiculeur suprieure 0.01%, etc. Un suivi de la biomasse sur le mme principe,
utilis en routine par le gestionnaire, pourrait par ailleurs permettre de remplacer partiellement les
contrles par dnombrements de Legionella et despacer ces derniers.
Selon certains acteurs, la flore totale peut galement tre utilise comme un outil de gestion
des installations, lorsquelle est value par ATP-mtrie. La mthode ne semble toutefois pas
adapte lanalyse des eaux de TAR alimentes par des eaux de surface qui contiennent de
nombreux organismes vivants diffrents, susceptibles de produire de lATP. Son intrt reste
galement contest par dautres acteurs en raison de sa non-spcificit vis--vis du genre Legionella.
Toutefois, les acteurs saccordent globalement sur sa simplicit de mise en uvre sur le terrain, avec
notamment peu de comptences ncessaires.
En outre, un acteur a rapport que la prsence de biofilms dans les TARs semble contribuer
une stabilisation de lcosystme bactrien, en limitant notamment le dveloppement de L.
pneumophila. Cette opinion est base sur lanalyse des rsultats de surveillance de nombreuses
tours qui rvle que par rapport aux installations dans lesquelles le biofilm est stable, les tours
arorfrigrantes conues spcialement pour limiter la prsence de biofilm sont souvent plus difficiles
piloter du point de vue de L. pneumophila. Il est noter que la plupart des acteurs dclarent ne
pas tenir compte de la prsence de biofilm dans leurs installations, bien quil soit probable
quune grande part de la multiplication des Legionella ait lieu justement dans le biofilm. Ils
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soulignent que lanalyse du biofilm nest pas requise dans la rglementation et jugent les rsultats de
recherches des Legionella dans celui-ci, trop complexes interprter. Daprs eux, leur mise au point
ncessite encore des recherches approfondies, peu compatibles avec les objectifs industriels
immdiats.
Dans le cadre dune analyse de routine, lATP-mtrie et/ou les mesures de flore cultivable ne
semblent donc prsenter quun intrt marginal pour certains acteurs qui ne basent leurs
actions de gestion que sur les valeurs obtenues pour L. pneumophila et L. spp. Ils justifient cette
position par la plus grande spcificit et donc plus grande fiabilit des dnombrements de Legionella.
Ils admettent toutefois que le dnombrement de L. spp est une plus-value pour la gestion des
installations.
Dans la plupart des tudes, les Legionella sont recherches dans leau. Dans le cadre de
proccupations sanitaires, la recherche de Legionella dans les arosols a t voque mais les
acteurs ne disposent pas de mthodes et dappareils de prlvement de rfrence
suffisamment fiables. Il est donc dlicat de conclure sur les rsultats danalyse obtenus.
10.2.3 Cas particulier des eaux trs charges
Dans le cas de TAR alimentes en eaux de rivire les acteurs observent une composition biochimique
(inhibiteurs) et microbiologique (flore interfrente) complexe et volutive qui rend les analyses trs
dlicates. La prsence dune flore interfrente en grande quantit (pouvant inhiber jusqu 10%
des mesures, 2% en moyenne), dinhibiteurs organiques ou dlments traces mtalliques
(identifis dans 80% des eaux brutes de rivire et imposant des dilutions dchantillons allant jusqu
2 log) ou de particules auto fluorescentes, limitent le choix des mthodes applicables. Par
ailleurs, tous ces lments interfrent de manire significative sur de nombreux paramtres de la
mthode utilise : sensibilit, justesse, limite de dtection, concordance avec les rsultats par dautres
mthodes, etc.
Ce constat fait, les acteurs confronts ce type deau de manire rgulire estiment que la
mthode par culture ne rpond pas correctement aux besoins analytiques pour la gestion de
leurs installations. Ils estiment galement que la mthode par q-PCR ne prsente pas toutes
les garanties ncessaires. A titre dexemple, il y a thoriquement peu de risque dobtenir des
rsultats faux ngatifs lis la prsence dinhibiteurs. Cependant, de nombreux chantillons ne sont
plus interprtables au regard de la gestion de linstallation, du fait de dilutions importantes qui
repoussent la limite de dtection au-del des seuils de dcision.
Les mthodes faisant appel des techniques dhybridation semblent moins sensibles aux
effets dune eau charge, avec une bonne cohrence globale et ce quelle que soit la qualit deau
(avec et sans biocide). Mais ces mthodes sont encore en cours dvaluation et ncessitent
dtre dveloppes et testes plus avant. Par ailleurs elles conviennent au dnombrement de
Legionella spp., mais restent moins adaptes au dnombrement de L. pneumophila. En outre, ces
mthodes intgrent une pr-tape de culture de 24 heures et ne dtectent donc pas les bactries
viables non-cultivables.
10.2.4 Suivi de traitement et recolonisation
Les dsinfections interviennent par le biais dun traitement choc aprs un pisode de contamination
dpassant le seuil de gestion adopt. Certains acteurs prconisent une dsinfection en cas de
prsence de flore interfrente, avec un traitement choc et des analyses renouveles dans les jours
suivants. Le suivi dinstallation aprs dsinfection est actuellement effectu par la plupart des acteurs
par culture. En effet, lors dessais en discontinu, les rsultats impliquant la mthode par q-PCR ont
montr des variations notables en fonction du biocide utilis, avec une persistance du signal
de q-PCR aprs dsinfection par certains biocides, sans que le niveau de cette persistance ait t
prcis. Dans le cadre du suivi dinstallation, il est donc dlicat de dgager des cls
dinterprtation en fonction des pratiques oprationnelles. En dehors de la q-PCR et de la
culture, aucune autre mthode spcifique na t teste grande chelle par les acteurs dans ce
contexte.
Une autre approche du suivi de traitement pourrait tre obtenue par comparaison q-PCR et v-PCR.
Cette dernire dnombre thoriquement spcifiquement Legionella viables. Il est gnralement
observ in vitro un abattement de 1 3 log de la dtection des bactries mortes, entre les rsultats
obtenus par q-PCR et ceux obtenus par v-PCR. Toutefois, les essais de v-PCR ont t mens sur des
systmes ferms (sans renouvellement de leau du systme), alors que les TAR sont des systmes
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ouverts. Le risque de dtecter des Legionella mortes par q-PCR est minimis dans les TAR par le fort
renouvellement de leau dans ces installations. Les premiers rsultats obtenus par quelques acteurs
lors dessais de v-PCR en conditions relles semblent montrer que les rsultats de dtection sont
assez comparables ceux obtenus par q-PCR. La justesse de la q-PCR na par ailleurs pas t
totalement value.
La v-PCR apparat plusieurs acteurs comme potentiellement utile pour dtecter rapidement
un traitement non signal ou valuer lefficacit immdiate dun traitement. Toutefois elle reste
ce jour quasi-inutilise.
Il est rappel par un acteur que le prtraitement par lEMA et le PMA na pas le mme impact selon le
matriel damplification utilis, ce que confirme une publication (Chang et al. 2010).
Mme si le lien entre la prsence damibes et de Legionella dans leau nest pas toujours
vident, la prsence avre damibes libres dans une TAR semble tre pour plusieurs acteurs
un indicateur fiable dune prsence potentiellement importante de Legionella. Cependant la
mthode de dtection des amibes la plus rpandue est coteuse, demande du temps et
lensemble des laboratoires nest pas en mesure de la mettre en uvre. Il est donc difficile
denvisager de lutiliser en routine. De surcrot, la recherche damibes dans les TAR nest pas
forcment utile si la prsence de L. pneumophila est matrise. (opinion base sur des essais de
recherche damibes et de L. pneumophila en parallle dans environ 200 TARs.). Elle peut en
revanche se rvler intressante en cas de sur-contamination post-traitement.
Certains acteurs notent en effet un regain de viabilit des L. pneumophila 7 10 jours aprs le
traitement dune installation, mettant en doute lintrt sanitaire des traitements choc sur le
long terme. Lhypothse avance pour expliquer ce phnomne est la destruction des Legionella spp.
et/ou des flores interfrentes qui sont susceptibles de limiter le dveloppement de L. pneumophila par
un phnomne de concurrence. La rtention des L. pneumophila dans le biofilm et dans les amibes
o elles sont protges des traitements et lradication de la flore libre permet leur avis une
recolonisation spcifique et accrue par L. pneumophila. Ainsi, la prsence de concentrations
relativement leves en Legionella spp. pourrait permettre de limiter la prolifration de L.
pneumophila et ainsi limiter le risque sanitaire qui y est associ. Il est indiqu que les mthodes
destructives qui comptabilisent de fait galement les Legionella contenues dans les protozoaires
permettent de mieux apprhender ce risque
10.2.5 Comparaison des mthodes (corrlations, prdictivit et seuils de dcision)
La position des acteurs quand la comparabilit des mthodes et des lments que lon peut
tirer de cette comparaison diverge fortement. Certains considrent que la chose nest
simplement pas possible et sen tiennent la mthode rglementaire. Le fait quil nexiste aucun
seuil rglementaire disponible pour les autres mthodes est un frein dclar leur utilisation.
A linverse, les auditions font tat de deux tentatives de comparaison de mthodes cherchant
tre prdictive et fixer des seuils de dcisions. Dans les deux cas, la comparaison ne
concerne que la culture et la PCR. De fait, il sera difficile pour le groupe de travail de formuler
un avis concernant ces points pour les autres mthodes envisageables partir des auditions.
Il apparat clairement tous les acteurs concerns que les UG et les UFC sont deux units
diffrentes, ne correspondant lvidence pas la mme chose. Toutefois, les rsultats de recherche
de L. pneumophila par culture (UFC) et par PCR (UG) peuvent souvent tre lis.
Pour un des acteurs auditionns, une lecture anticipe des rsultats de culture (avant le dlai
dobtention dun rsultat final prconis par la norme NF T90-431, 14 jours aprs
lensemencement) est relativement prdictive des rsultats finaux : le rsultat est identique au
me
me
ou 6
jour et dans 85% des cas entre le 3me et le
rsultat final dans 96 % des cas ds le 5
4me jour. Les rsultats danalyse obtenus par PCR seraient quant eux prdictifs de ceux obtenus
par culture dans tous les cas pour le dnombrement de L. pneumophila. A titre dexemple, pour lun
des acteurs auditionns, des rsultats obtenus par culture en UFC/L plus importants que ceux
obtenus en q-PCR en UG/L ne reprsentent que moins d1% des cas. En outre, il a t rapport que
lorsque le dnombrement de L. pneumophila dpasse 100 000 UFC/L, les rsultats par q-PCR et
culture sont identiques.
Pour deux autres acteurs, les rsultats prsents pour les TAR ne montrent pas une
corrlation directe entre la culture et la q-PCR, mais montrent que la q-PCR est prdictive
97% des rsultats ngatifs obtenus par culture. En revanche la prdictivit positive est plus
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faible. Ceci est interprt par les acteurs comme le fait que les Legionella dtectes par q-PCR dans
les chantillons des TAR sont vivantes mais cultivent difficilement sur les milieux de culture gloss
utiliss dans le cadre de la mthode normalise par culture. Paradoxalement, pour lun des deux
acteurs, ceci est moins vrai pour lECS avec seulement 89 % de valeur prdictive ngative. De
fait, par rapport la culture, la valeur prdictive ngative de la q-PCR semble moindre pour les
ECS, mais la majorit des faux ngatifs mesurs par q-PCR et mis en vidence par culture,
sont en dessous du seuil dalerte de la culture, ce qui de lavis de lacteur, enlve du poids
cet cart. Lauteur dune autre tude rapporte nanmoins que 14 % des chantillons donnent des
rsultats en dessous du seuil dalerte en PCR, alors quils sont au dessus du seuil dalerte en
culture (au dessus du seuil daction en culture pour 2% dentres eux). La concordance troublante
des deux rsultats a t remarque par le groupe de travail. Cela peut tre interprt aussi bien
comme un point de dsaccord entre les mthodes que comme un positionnement erron des seuils
de dcisions actuels. En effet, toutes les tudes reposent sur la culture comme rfrence, alors
mme que la mthode par culture est critiquable dans certains de ses aspects et peut tout au
moins susciter des questions en termes de positionnement des seuils de dcisions.
Selon les rsultats dune tude europenne (tude Emile) prsente au groupe de travail, 10 UG/L
3
(ou 1 log UG/L) seraient environ quivalentes 1 UFC/L. Dans cette tude, les seuils dalerte (10
4
UFC/L) et daction (10 UFC/L) pris en compte pour la culture sont ceux recommands par les
documents guides europens pour les ECS et TAR et ne sont pas ceux de la rglementation
franaise. Cette tude propose la mise en place dun algorithme de dcision. Cette proposition
est considre par le groupe de travail comme relativement novatrice par rapport ce qui a t
vu jusquici.
4
Les auteurs de ltude prconisent pour les TAR un seuil dalerte pour L. pneumophila 10
5
UG/L et un seuil daction 10 UG/L. Concernant Legionella spp. les auteurs prconisent des
6
7
seuils dalerte et daction respectivement de 10 UG/L et 10 UG/L. Pour les ECS, la
correspondance des seuils daction et dalerte des deux mthodes est trs bonne aussi bien en
recherchant Legionella spp (67 %) que L. pneumophila (74 %). Dans les deux cas les seuils
4
5
dalerte et daction proposs sont respectivement pour L. pneumophila de 10 UG/L et 10 UG/L
4
5
et pour Legionella spp. de 5 10 UG/L et 5 10 UG/L. Lalgorithme de dcision prsent navait
52
pas encore t publi au moment de laudition et sa validit ntait pas confirme .
Un autre acteur indique que la correspondance mise en vidence par ltude europenne Emile
voque ne tient pas compte du fait que la mthode par culture nest pas linaire. Le seuil
daction propos dans cette tude serait, daprs lui, justement plac une concentration
correspondant au dcrochement de linarit de la mthode, ce qui en affecterait la validit. Ce
point demande donc tre vrifi.
Les rendements respectifs des mthodes compares semblent galement poser question. Le
rendement minimum exig par la mthode PCR telle que dcrite dans la norme est de 0,6 log
(25%). En pratique, il atteint en moyenne des valeurs proches de 100 % avec des kits commerciaux
certifis par "Afnor validation" et les rsultats minimums ne sont jamais infrieurs 50%. Le
rendement de la culture est de lordre de 10% en cas de filtration de lchantillon et de moins de 1%
en cas de traitement acide (En labsence dautre rfrence, la rfrence prise en compte pour calculer
le rendement est la culture sans filtration, dont le rendement est considr tre de 100%, mme si
cette hypothse nest pas raliste).
Selon lun des acteurs, la culture est linaire entre 250 et 5000 et au dessus de 25000. La qPCR quant elle est linaire au dessus de 1000 Legionella par litre. Avec un rendement de
100% de la q-PCR, compte tenu des linarits des deux mthodes, les rsultats de la q-PCR et
de la culture ne seront comparables quau dessus de 25 000 Legionella par litre. Si le
rendement nest que de 25% pour la q-PCR, q-PCR et culture donnent des rsultats
comparables entre 1000 et 10000 Legionella par litre (concentration initialement mesure pour
la culture).
Les linarits et les rendements respectifs des mthodes permettent de situer des valeurs cibles
quivalentes pour lanalyse par PCR et culture.
52
Il faut signaler ici que les rsultats de ltude Emile ont t publis trs peu de temps avant la publication du prsent rapport
avec des seuils dalerte et daction lgrement diffrents de ceux qui avaient t voqus pendant les auditions. Dans cette
publication, les auteurs proposent un seuil dalerte en L. pneumophila 5.103 UG/L et un seuil daction 5.104 UG/L (Lee et al.
2011). Cette publication a t soumise au groupe de travail Mthode de dnombrement de Lgionelles dans leau , le 24
fvrier 2011. Ce dernier estime quelle ne remet pas en cause le raisonnement conduisant l'tablissement de valeurs cibles
dans le prsent rapport.
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- 1 000 UFC / 2500 UG
- 10 000 UFC / 25 000 UG
- 100 000 UFC et 250 000 UG
A partir de ces donnes, cet acteur prconise les niveaux de dcision suivants pour les
Legionella pneumophila dnombres par q-PCR selon la norme XP T 90-471:
- ECS
o < 2 500 UG/L : Cible
o 2 500 UG/L : Alerte
o 25 000 UG/L : Action
- TAR
o < 2 500 UG/L : Cible
o 2 500 UG/L : Alerte
o 25 000 UG/L : Action
o 250 000 UG/L : Arrt de linstallation
Le groupe de travail estime que lintroduction de ltalon national de q-PCR amnera probablement
cet acteur reconsidrer les valeurs cibles et les niveaux de dcisions prconiss. Selon cet acteur,
la sensibilit de la q-PCR est suprieure celle de la culture (dtection de L. pneumophila dans 20%
des installations versus 5% par culture) et sa valeur prdictive ngative est excellente (98%). En
outre, elle fournit un indicateur de risque prcieux, car une valeur de q-PCR positive correspond un
risque de culture positive dans un cas sur 4. Cet acteur signale que ces valeurs ne sont pas
seulement un modle, mais quelles sont dj appliques de longue date au pilotage dinstallations,
en faisant uniquement appel aux rsultats de q-PCR. Il faut signaler ici que lacteur en question
continue, en parallle, de raliser des dnombrements par culture, selon la prconisation de la
rglementation. Selon lui, ce jour, les installations (TAR ou ECS) gres de cette manire nont
jamais rencontr de problme mis en vidence par les rsultats de dnombrements par
culture, qui naient pas t dtects et grs pralablement grce aux rsultats de q-PCR. Pour
le groupe de travail, cette prcision est susceptible de renforcer la valeur de la proposition de
cet acteur.
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11 Conclusions et recommandations
Lanalyse mene par le groupe de travail dans le cadre de cette expertise, notamment concernant les
valeurs cibles, la amen prendre en compte certains lments du risque sanitaire sans pour autant
raliser une valuation des risques. Ainsi, le groupe de travail sest notamment intress, la
virulence de L. pneumophila versus L. spp, la signification sanitaire de la prsence de Legionella
viables non cultivables ou la signification sanitaire des seuils de gestion rglementaires existants.
De la mme manire, il a galement t pris en considration les procdures de gestion, notamment
de dsinfection, qui peuvent avoir un impact sur les rsultats de dnombrement de Legionella
examines.
11.1 Conclusions et recommandations gnrales court terme

11.1.1 Les mthodes pertinentes pour une utilisation en routine court terme
Indpendamment des caractristiques et performances dune mthode analytique, pour une
application en routine court terme dans un cadre rglementaire, il importe de disposer dune
mthode dont le protocole est prcisment dcrit et valid par de nombreux laboratoires, sur un grand
nombre dchantillons. Actuellement, seules les mthodes normalises offrent cette garantie. Les
deux mthodes de dnombrement de Legionella dans leau normalises ce jour sont la culture (NF
53
T90-431 et NF EN ISO 11731-2 ) et la q-PCR (NF T90-471). Les recommandations en vue dune
mise en uvre court terme dans un cadre rglementaire ne peuvent donc raisonnablement porter
que sur ces deux mthodes.
Cela ne signifie pas que ces deux mthodes sont considres suprieures aux autres en termes de
richesse dinformations apportes ou de performances, mais seulement quelles ne ncessitent pas
dtudes complmentaires pour tre applicables. Dautres mthodes ont t identifies comme
potentiellement intressantes pour le dnombrement de Legionella dans leau, mais demandent tre
dveloppes, stabilises et testes sur de multiples chantillons, avant quil soit possible denvisager
leur application en routine, laquelle ne pourra se faire qu moyen ou long terme.
11.1.2 Choix dune mthode applicable aux eaux chaudes sanitaires et aux eaux des tours
arorfrigrantes
En situation de suivi de routine, dans lequel les dlais de rponse ne constituent pas un critre
prioritaire, il est prconis de laisser la possibilit dutiliser la mthode par culture ou la mthode
par q-PCR. La mthode pourra tre choisie en fonction du contexte local : prsence dinhibiteurs, flore
interfrente, accessibilit aux techniques, etc. Lorsque lanalyse sera ralise par q-PCR, il est
cependant prconis, en cas de dpassement de la valeur cible, une mise en culture dun chantillon
afin de disposer de la souche dnombre, en vue dventuelles analyses complmentaires. Les
souches mises en culture seront conserves pendant les dlais dj prvus par la rglementation en
fonction des diffrents cas de figure.
Si des cas groups ou un cas nosocomial de lgionellose sont avrs, compte tenu de limportance
didentifier le rservoir infectieux le plus rapidement possible, le groupe de travail recommande la
mthode dont la mise disposition des rsultats est la plus rapide. Ainsi, il est prconis de
privilgier, selon le diagnostic biologique, le dnombrement de L. pneumophila ou L. spp par q-PCR,
suivie d'une mise en culture pour une comparaison des souches environnementales et cliniques (si
elles ont t isoles). Dans le cas o la mthode de dnombrement par q-PCR ne serait pas
disponible, il est prconis dutiliser la mthode de dnombrement par culture, en conservant l aussi
les souches dnombres pour dventuelles tudes complmentaires. En cas de lgionellose L.
pneumophila, la recherche dans lenvironnement inclura lidentification du srogroupe correspondant
au cas clinique. En cas de lgionellose due une autre espce que L. pneumophila, la recherche de
Legionella spp sera entreprise.
11.1.3 Choix des critres dinterprtation des rsultats selon les mthodes
Lutilisation dune mthode analytique va de pair avec la dfinition de critres dinterprtation de ses
rsultats. Aussi, avant denvisager lutilisation dune mthode de dnombrement de Legionella, dans
53
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le cadre de la surveillance sanitaire des eaux chaudes sanitaires et des tours arorfrigrantes, il
apparat ncessaire de fixer des valeurs cibles au-del desquelles des actions de gestion pourraient
tre envisages.
$ du peu de publications disponibles sur le sujet et des fortes incertitudes quelles mettent en
vidence ;
$ de la difficult didentification de lorigine environnementale des cas de lgionellose (possible
dans 20% des cas dclars) ;
$ du grand nombre de facteurs autres que la concentration en Legionella pneumophila dans leau
des installations intervenant dans la survenue des lgionelloses (mtorologie, taille des
gouttelettes produites par les installations, tat de viabilit et de virulence des souches de
Legionella prsentes dans leau, etc.).
Aussi, la dtermination des valeurs cibles doit se fonder sur une approche pragmatique, en exploitant
les lments disponibles.
11.1.3.1 Valeurs cibles pour la mthode par culture
En 2001, le Conseil suprieur dhygine publique de France (CSHPF) a propos des valeurs cibles,
sur la base des connaissances scientifiques et des observations de terrain disponibles la date de
cette proposition (Dubrou et al. 2002). Les valeurs cibles proposes ntaient pas fondes sur une
54
dose-rponse chez lhomme.
$

Pour la population gnrale, la rglementation franaise en vigueur, fixe la valeur cible en L.
3
pneumophila 10 UFC/L.
Pour les patients haut risque (immunodprims), la rglementation prconise de ne pas
dpasser le seuil de dtection de la mthode par culture (selon la norme NF T90-431).
Selon les donnes de la littrature, la concentration en L. pneumophila en dessous de laquelle le
risque de lgionellose est ngligeable ou acceptable pour la population gnrale est comprise
4
5
entre 10 ou 10 UFC/L dans les eaux chaudes sanitaires, malgr labsence de dose-rponse
connue chez lhomme.
Lexamen de la bibliographie et les auditions dacteurs du systme de surveillance des Legionella
dans les eaux chaudes sanitaires nont pas mis en vidence dargument justifiant, dun point de
vue sanitaire, une modification de ces valeurs cibles.

La rglementation franaise en vigueur, concernant les tours arorfrigrantes, fixe des
valeurs cibles en Legionella spp. :
- seuil dacceptabilit de leau dappoint : limite de quantification de la mthode normalise
utilise ;
3
5
La littrature et les auditions dacteurs du systme de surveillance des tours arorfrigrantes
mettent en vidence une difficult dinterprtation des rsultats lie au choix de la cible du
dnombrement. En effet, lespce responsable de la plupart des cas de lgionelloses dclars
tant Legionella pneumophila, il est difficile dinterprter un dpassement de seuil en Legionella.
spp. dun point de vue sanitaire. Ces valeurs doivent avant tout tre considres comme des
valeurs de gestion.
11.1.3.2 Valeurs cibles pour la mthode par q-PCR

Le niveau actuel des connaissances ne permet pas dtablir une valeur cible de L. pneumophila la
q-PCR (en UG/L) sur les bases dune dose rponse chez lhomme.
54
Relation spcifique dune voie entre des niveaux dexposition un agent dangereux et lindice observ dun effet donn.
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Cependant, les bnfices sanitaires potentiels de lutilisation de la q-PCR, du simple fait de la rapidit
de sa mise en uvre et de lobtention de rsultats spcifiques de L. pneumophila, incitent mettre en
place les outils permettant lutilisation de cette technique en routine. En effet, dans de nombreux cas,
elle permettrait de dtecter et donc de grer la contamination dune installation beaucoup plus
rapidement quavec la culture. Dans ce contexte, ltablissement de valeurs cibles est primordial.
Les seuls rfrentiels actuels sont les valeurs cibles dj prsentes dans la rglementation pour la
mthode par culture. Les retours dexprience lis leur utilisation pour la surveillance des lgionelles
dans leau ne mettent pas en vidence la ncessit de les modifier. Il apparat donc raisonnable de
dfinir les valeurs cibles applicables la q-PCR de manire ce que le taux de rsultats suprieurs
ces valeurs cibles, obtenus avec une mme srie de prlvements, soit quivalent pour la culture et
pour la q-PCR.
Cependant les units des diffrentes mthodes de dnombrement de Legionella apparaissent
htrognes et difficilement comparables : units gnomes/L (UG/L) pour les mthodes par biologie
molculaire et units formant colonies/L (UFC/L) pour les mthodes par culture. En labsence de
donne publie, les valeurs proposes sont principalement bases sur les rsultats de la surveillance
des lgionelles dans lenvironnement, prsents par deux acteurs auditionns.
$

55
dusage risque dans les tablissements recevant du public, lexclusion de ceux utiliss par
des patients haut risque.
En ce qui concerne les points dusage risque utiliss par des patients haut risque dans les
tablissements de sant, pour assurer une protection sanitaire maximale, il semble raisonnable
de proposer des valeurs cibles gales au seuil de dtection de la mthode.

Cependant, certains essais montrent une bien meilleure concordance relative entre les rsultats
obtenus par culture et par q-PCR pour le dnombrement de L. pneumophila que pour celui de
Legionella. spp. Dun point de vue analytique, il semble donc plus adapt de dterminer une
valeur cible en L. pneumophila pour la q-PCR.
Dun point de vue sanitaire, ltablissement de valeurs cibles en L. pneumophila apparat
galement plus pertinent.
protectrices dun point de vue sanitaire que les mmes valeurs appliques L. pneumophila,
dans la mesure o ces dernires font partie des Legionella spp. On rappellera nanmoins que :
o ce jour, aucune autre espce que L. pneumophila na pu tre identifie chez un patient
atteint de lgionellose, dont lorigine de la contamination ait t attribue une tour
arorfrigrante ;
o la proportion de L. pneumophila parmi les Legionella spp. varie fortement dans le temps
et il nexiste pas doutil fiable permettant de la prvoir.
Aussi, il parat fond de proposer aujourdhui des valeurs cibles en L. pneumophila, pour la
surveillance sanitaire des tours arorfrigrantes, aussi bien pour la mthode par culture que
pour la mthode par q-PCR.
Ce dispositif prsente quatre avantages importants :

$
dun point de vue sanitaire :

o faciliter linterprtation des rsultats de surveillance ;
o ouvrir la possibilit dutiliser la q-PCR pour la surveillance des tours arorfrigrantes,
pour bnficier de la grande ractivit de cette technique, avec la possibilit de dtecter
une contamination beaucoup plus rapidement que ce nest le cas actuellement ;
55
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$
du point de vue de la gestion des installations : le choix de dnombrer L. pneumophila dans les
tours arorfrigrantes la place de Legionella spp. permettrait :
o darrter les installations uniquement pour une raison sanitaire. Le nombre darrts de
fonctionnement des tours arorfrigrantes sans fondement sanitaire sen verrait
significativement rduit ;
o de vrifier plus rapidement lefficacit des actions correctives menes en cas darrt
dune installation.
11.1.4 Propositions de valeurs cibles

Les valeurs cibles proposes ici reposent sur un avis dexpert en ltat actuel des connaissances.
Elles sont proposes dans lobjectif damliorer le niveau de scurit sanitaire.
Les valeurs cibles proposes pour la q-PCR ncessitent dtre consolides durant une priode
probatoire, pendant laquelle une tude mtrologique serait mene afin de comparer les rsultats
danalyse obtenus avec les deux mthodes utilises en parallle sur un nombre suffisant
dchantillons.
Les valeurs proposes ici sont propres chaque mthode. Elles visent cependant atteindre les
mmes objectifs en termes de gestion des risques.
11.1.4.1 Pour les eaux chaudes sanitaires :
"
56
dusage risque dans des tablissements recevant du public, lexclusion de ceux utiliss par
57
des patients haut risque dans les tablissements de sant :
Pour les rsultats danalyses obtenus par culture, aucune des donnes rpertories ne permet de
justifier une modification de la rglementation en vigueur en France concernant lobjectif cible
3
prconis de concentration en L. pneumophila ne pas dpasser, soit 10 UFC /L.
Pour les rsultats obtenus par q-PCR, la concentration seuil en L. pneumophila ne pas dpasser est
3
de 5.10 UG /L. En suivant la logique dcrite dans le chapitre 11.1.3., cette recommandation de valeur
cible pour la q-PCR est base sur les donnes suivantes :
- deux tudes non publies, prcdemment voques au chapitre 10.2., proposent des seuils en L.
3
3
pneumophila de 2,5.10 UG /L et de 10. 10 UG /L dans les eaux chaudes sanitaires ;
- compte tenu des incertitudes de ltape de q-PCR (+/- 0,15 log selon la norme NF T90-471), un
3
3
3
rsultat gal 5.10 UG /L, implique que lchantillon contient entre 3,5.10 et 7.10 UG /L.
- Les limites de quantification des kits commercialiss pour le dnombrement de Legionella par q3
3
PCR sont comprises entre 0,5.10 et 0,9.10 UG /L pour un chantillon de 1 litre deau analyser
3
3
3
et entre10 et 1,8.10 UG /L pour un chantillon de 0,5 litre, ce qui est proche de 3,5.10 UG /L.
Ainsi, compte tenu de lincertitude, de ltape de q-PCR voque ci-dessus, un rsultat infrieur
3
5.10 UG /L nest pas loin de correspondre un chantillon qui peut en ralit contenir une
concentration en L. pneumophila gale ou infrieure la limite de quantification de la mthode.
Compte tenu de ces limites analytiques, en gardant des volumes dchantillon du mme ordre de
grandeur, il semble donc difficilement envisageable dexiger une concentration en L. pneumophila
plus basse.
Ces deux valeurs cibles ne sont pas sensu stricto quivalentes.
En cas de dpassement des valeurs cibles proposes et en fonction de la mthode de dnombrement
choisie, des actions de gestion doivent tre envisages par le responsable de linstallation. Au cas o
58
des rsultats non satisfaisants sont obtenus, il convient de rechercher lorigine de la contamination
en confrontant les rsultats danalyse deau prleve en diffrents points du rseau de distribution
56
57
58
Dpassement des seuils de gestion fixs
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deau chaude. Il importe aussi de vrifier la concentration en L. pneumophila dans leau du rseau
deau froide. Le taux de points conformes et la localisation des points non-conformes peuvent
galement apporter des informations utiles au gestionnaire de linstallation. Les mesures de gestion
de la qualit des eaux incluent outre la dsinfection, des amliorations envisager telles que la
suppression de bras morts, et de points de soutirage non utiliss ou lquilibrage du dbit. Dans tous
les cas, une vrification de lefficacit des mesures de gestion choisies sera indispensable.
La gestion technique des installations deau chaude sanitaire peut permettre de dtecter, voire
danticiper des dysfonctionnements. Elle peut tre ralise par le dnombrement de Legionella spp
comme par des indicateurs beaucoup plus simples, tels quun suivi rigoureux de temprature bas sur
un nombre suffisant de points de mesure.
"
dusage risque utiliss par des patients haut risque dans les tablissements de sant :
Selon la rglementation en vigueur en France, (Arrt du 1er fvrier 2010) lobjectif cible prconis de
concentration en L. pneumophila ne pas dpasser est le seuil de dtection de la mthode par
59
culture . Le groupe de travail prconise de conserver cet objectif pour les rsultats de surveillance
obtenus par culture et recommande dappliquer ce mme objectif de non dpassement du seuil de
60
dtection de la mthode utilise, aux rsultats obtenus par q-PCR .
Concernant les points dusage risque utiliss par des patients haut risque, il convient, en plus de la
surveillance vis--vis de Legionella pneumophila, de procder une analyse de risque tendue au
genre Legionella et toutes autres bactries pathognes. Celle-ci sera ralise, par le Comit de lutte
contre les infections nosocomiales ou toute organisation charge des mmes attributions voques
er
dans larrt du 1 fvrier 2010, relatif la surveillance des lgionelles dans les installations de
production, de stockage et de distribution deau chaude sanitaire.
Aprs une dcontamination chimique ou thermique, il est ncessaire de vrifier son efficacit en
dnombrant L. pneumophila dans un chantillon prlev quelques jours aprs le traitement (circulaire
DGS 2002 / 243 du 22 avril 2002). Le fascicule de documentation FD T90-522, "Guide technique de
prlvement pour la recherche de Legionella dans les eaux" (2006), prconise de raliser le
prlvement au minimum 48 heures aprs un traitement de dcontamination choc. Ce dlai est
notamment prvu pour permettre le renouvellement de leau dans le rseau et llimination des
ventuelles bactries mortes. En termes dimpact sur les rsultats des mthodes, la probabilit de
dnombrer de fortes proportions de bactries mortes, par q-PCR, ou de ne pas dnombrer de fortes
proportions de bactries VBNC par culture sont limits. De surcrot, dans le cas dun traitement de
leau par un dsinfectant chlor, il est ncessaire de traiter l'chantillon d'eau par du thiosulfate de
sodium pour neutraliser le chlore. Dans ce cas, le risque dinhibition par le chlore de la croissance des
bactries sur les milieux de culture et donc le risque de faux ngatifs, sont limits.
Le choix de la mthode la plus approprie (culture ou q-PCR) peut tre laiss la discrtion du
gestionnaire de linstallation. Dans le cas de la culture, comme dans celui de la q-PCR, la
dcontamination peut tre considre suffisante si le rsultat de lanalyse met en vidence un nombre
de L. pneumophila infrieur ou gal la valeur cible prcdemment propose. Dans le cas contraire,
une nouvelle action de gestion doit tre envisage jusqu ce que les analyses fassent tat de
rsultats infrieurs ou gal cette valeur cible.
11.1.4.2 Pour les eaux de tour arorfrigrante :
Actuellement, dans un contexte sanitaire, les seuils relatifs aux tours arorfrigrantes fixs par la
rglementation franaise concernent Legionella spp. Le groupe de travail propose de ne plus
rechercher Legionella spp, mais seulement L. pneumophila. Les valeurs cibles de concentration
en L. pneumophila prconises sont les suivantes :
Rsultats obtenus par culture :
- valeur ne pas dpasser pour leau dappoint : limite de quantification de la mthode (250
UFC/L) ;
59
50 UFC /L
Selon la norme NF T90-471, le seuil de dtection de la mthode par q-PCR est variable en fonction des ventuelles dilutions
appliques lchantillon en prsence dinhibiteurs. Il est important que les dilutions ventuelles nimpactent pas la valeur cible.
60
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-
valeur cible daction pour leau de linstallation : 10 UFC /L ;

5
valeur cible darrt pour leau de linstallation : 10 UFC /L.
Rsultats obtenus par q-PCR :

- valeur ne pas dpasser pour leau dappoint : limite de quantification de la mthode (limite
variable) ;
3
- valeur cible daction pour leau de linstallation : 5.10 UG /L ;
5
- valeur cible darrt pour leau de linstallation : 5.10 UG /L.
En suivant la logique dcrite dans le chapitre 11.1.3., ces recommandations de valeurs cibles pour la
q-PCR sont bases sur les donnes suivantes :
- deux tudes non publies prcdemment voques proposent des valeurs cibles en L.
3
3
pneumophila, dans les tours arorfrigrantes : lune 2,5.10 UG /L pour le seuil daction (10
5
5
4
UFC /L) et 2,5.10 UG/L pour le seuil darrt (10 UFC /L) ; lautre 10 UG /L pour le seuil
3
5
4
dalerte (10 UFC /L) et 10 UG /L pour le seuil daction (10 UFC /L) ;
3
- les incertitudes de la q-PCR qui impliquent quun rsultat gal 5.10 UG /L, signifie que
3
3
5
5
lchantillon contient entre 3,5.10 et 7.10 UG /L et un rsultat gal 5.10 UG /L, entre 3,5.10
5
et 7.10 UG /L ;
3
- le fait quun rsultat infrieur 5.10 UG /L nest pas loin de correspondre un chantillon qui
peut en ralit contenir une concentration en L. pneumophila gale ou infrieure la limite de
quantification de la mthode.
Les valeurs cibles proposes pour la culture et pour la q-PCR ne sont pas sensu stricto
quivalentes.
Par ailleurs, une augmentation relative significative (2 log ou plus) de la teneur en Legionella spp. par
rapport la teneur en Legionella dans leau dappoint pourrait constituer un indicateur de
dysfonctionnement de la tour arorfrigrante. Le mme principe pourrait par ailleurs sappliquer
dautres indicateurs bactriens, tels que lATP-mtrie.
En cas de traitement de dcontamination d'une installation l'arrt, par suite dune contamination
excessive ou dun cas de lgionellose, il est ncessaire de rincer les circuits afin d'vacuer les
bactries prsentes dans leau et le cas chant les rsidus de produits chimiques. Les procdures de
dsinfection spcifient que labsence de rsidus de dsinfection doit tre vrifie aprs le rinage.
Ainsi, le risque de voir un dnombrement perturb par la prsence de dsinfectant (pour la mthode
par culture) ou la prsence de bactries mortes (pour la mthode par q-PCR), est diminu. Il est donc
recommand de laisser la possibilit dutiliser la mthode par culture ou la mthode par q-PCR. Il
convient cependant de mettre les rsultats disposition du gestionnaire le plus rapidement possible
(q-PCR ou culture selon les contextes locaux). Linterprtation des rsultats devra prendre en compte
les performances analytiques et la particularit des mthodes utilises.
Selon la rglementation en vigueur, dans le cadre du suivi de dcontamination, en cas de
dpassement du seuil daction, il est ncessaire de dnombrer L. pneumophila dans un chantillon
prlev au maximum deux semaines aprs le traitement. En cas de dpassement du seuil darrt, la
rglementation demande un prlvement de contrle 48h aprs la remise en service (Arrt du 13
dcembre 2004). La dcontamination est suffisante si le rsultat de lanalyse met en vidence un
nombre de L. pneumophila infrieur aux seuils daction.
En cas de contaminations rcurrentes dun mme site, il convient de raliser des investigations
complmentaires incluant la conception hydraulique des installations, la prsence de biofilms ainsi
que celle de protozoaires.
11.1.5 Besoins dtudes et de recherches
En ce qui concerne la q-PCR et la culture, il est ncessaire de mener une tude comparative sur
diffrentes qualits deaux (Eaux chaudes sanitaires et tours arorfrigrantes), avec un grand
nombre dchantillons, afin de tester et le cas chant daffiner les valeurs cibles proposes dans le
cadre de cette expertise.
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11.2 Conclusions et recommandations moyen et long termes

Des critres de choix des mthodes ont t dfinis, discuts et hirarchiss dans le tableau 1
"Pertinence des critres de slection dune mthode de dnombrement de Legionella dans leau dans
les contextes des ECS, des TAR et des suivis de dcontamination" (page 25).
Cela constitue une base de travail, permettant de faciliter le dveloppement de mthodes alternatives
de dnombrement de Legionella dans leau, adaptes aux contextes particuliers des eaux chaudes
sanitaires et des tours arorfrigrantes.
Les mthodes actuelles ne rpondent pas tous les besoins exprims
Les deux mthodes normalises qui font lobjet des recommandations court terme apportent un
certain nombre dinformations et ont le mrite dtre largement dveloppes et utilises. Cependant
elles prsentent des limites dj largement voques, notamment concernant leurs caractristiques
intrinsques.
La mthode par culture napporte pas de garantie sur sa capacit prendre en compte
correctement des Legionella intra amibiennes ou intra vsiculaires dans la quantification ; elle ne
permet pas de dtecter lensemble des Legionella viables et potentiellement pathognes ; elle est
relativement lente et fastidieuse ; elle ncessite une bonne comptence technique ; elle peut tre
influence par la prsence dune flore autre que Legionella.
La mthode par q-PCR dnombre aussi bien les Legionella mortes que vivantes ; elle ne permet
pas de disposer de souches pour des tudes complmentaires ; elle est sensible la prsence
dinhibiteurs.
Des rponses aux besoins sont potentiellement apportes par certaines mthodes alternatives,
sous rserve de dveloppements et dvaluations in situ
Aucune des mthodes alternatives de dnombrement de Legionella dcrites dans le rapport ne

semble pouvoir satisfaire lensemble des attentes identifies par les experts. Cependant, les
principes et objectifs de certaines mthodes dcrites permettent denvisager de repousser
certaines des limites. Il est donc important dencourager leur dveloppement.
Les mthodes de dnombrement par q-PCR, v-PCR, culture (pour cette dernire sous rserve de
lintroduction dun protocole exprimental permettant la rupture des vsicules amibiennes sans
rupture de la membrane bactrienne), FISH et IDS (sous rserve de lintroduction dun protocole
exprimental permettant que la sonde ou lanticorps puisse pntrer les cellules amibiennes),
semblent pouvoir permettre une prise en compte des Legionella intra amibiennes ou intra
vsiculaires dans la quantification.
Les mthodes de dnombrement par DVC, v-PCR, IDS, DVC-FISH ou culture-FISH semblent
permettre de dtecter uniquement les bactries viables ou de distinguer les bactries viables et
non viables. Lune des pistes galement voques est le marquage spcifique des bactries
viables et non viables laide de fluorochromes marquant les cellules dont la membrane est
intgre, ou linverse celles dont la membrane est permabilise.
Les mthodes de dnombrement par q-PCR, v-PCR, immuno-dtection, FISH, et IDS permettent
thoriquement de dtecter lensemble des Legionella viables et potentiellement pathognes.
Les mthodes de dnombrement par DVC, q-PCR, v-PCR, immuno-dtection, FISH, et IDS
permettent une obtention relativement rapide des rsultats danalyse.
Des amliorations des milieux utiliss pour les mthodes de dnombrement par culture
pourraient galement permettre une rduction du temps dobtention des rsultats de ces
mthodes.
Les mthodes de dnombrement par immuno-dtection, FISH, IDS, q-PCR et culture-FISH

permettent thoriquement damliorer la distinction et la quantification des srogroupes de L.
pneumophila autres que le srogroupe 1.

Les travaux du groupe de travail ont mis en vidence des manques de connaissances qui
pourraient justifier la ralisation dtudes ou dessais exprimentaux. A titre indicatif et sans
revendiquer lexhaustivit, quelques pistes dtudes et de recherches sont proposes.
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Il semble opportun de mener des recherches pour amliorer les connaissances sur les Legionella
pathognes, notamment des diffrents clones de L. pneumophila sg1 dj identifis en pathologie
humaine et leur dtection. Cette approche ncessiterait une tude complmentaire de la composition
des gnomes, et le dveloppement de sondes spcifiques, afin de distinguer les squences les plus
intressantes dans la discrimination des espces et srogroupes pathognes. De mme, des
recherches pourraient tre menes pour amliorer les connaissances sur la notion de dose
infectieuse ainsi que sur la pathognicit des Legionella viables non cultivables.
Echantillonnage
Le prlvement et lchantillonnage constituent un enjeu fort des futurs travaux de dveloppements.
En effet, dans ces deux cas, les mthodes analytiques applicables leau sont utilisables en ltat,
condition darriver disposer dun chantillon reprsentatif. Aussi, il convient dencourager le
dveloppement de mthodes de prlvement et dchantillonnage applicables aux arosols et
biofilms.
Prtraitement des chantillons
Les mthodes de prlvement et dchantillonnage utilises en amont des mthodes de
dnombrement de Legionella dans leau, peuvent avoir une importante influence sur la qualit des
rsultats obtenus.
Le dveloppement et loptimisation des prtraitements des chantillons, pour adapter leurs
caractristiques aux mthodes de dtection dj utilises ou en cours de dveloppement, pourraient
permettre damliorer les rendements globaux des dnombrements de Legionella.
Lanalyse des eaux trs charges, reste problmatique pour lensemble des mthodes utilises. La
capture des bactries par le biais danticorps spcifiques (sparation immuno-magntique, etc.)
est, dans ce domaine, une piste intressante qui demande tre dveloppe. Elle est envisageable
en amont de la quasi-totalit des mthodes de dnombrement voques. Elle peut notamment
permettre de contourner efficacement le problme de la flore interfrente (lequel affecte la culture)
mais galement celui des inhibiteurs (lequel handicape lamplification gnique par PCR). Toutefois,
une capture spcifique ncessite un large panel danticorps recouvrant la gamme des espces et
srogroupes actuellement identifis. Ces anticorps ne sont pas tous encore disponibles ou leur qualit
sur le plan de laffinit est encore perfectible. Les efforts consentis pour le dveloppement de
nouveaux anticorps devraient savrer terme un atout prcieux dans lefficacit de lvaluation du
risque aussi bien que dans la progression de la qualit du diagnostic mdical.
Chaque mthode tudie possde ses points faibles, que les dveloppements ultrieurs devront
sattacher attnuer.
Ainsi, il sagit de sassurer que les milieux slectifs utiliss en culture prsentent une slectivit
quivalente en termes de dnombrement pour les diffrentes espces et sous-types de Legionella.
Par ailleurs, les difficults de la mthode par culture dnombrer les VBNC, alors que ces mmes
bactries semblent pouvoir tre revitalises par les protozoaires indiquent que les milieux
actuellement utiliss pour la caractrisation des Legionella sont encore perfectibles. La mise au point
de nouveaux milieux de cultures plus adapts, en particulier permettant la croissance de la fraction
actuellement non cultivable, est sans nul doute une voie damlioration de la mthode par culture. Il
convient galement dvaluer lefficacit de nouveaux antibiotiques, diffrents de ceux actuellement
utiliss dans le milieu GVPC, afin de rendre plus efficace la discrimination entre Legionella et flore
interfrente.
Comme cela a t voqu, la q-PCR pourrait galement faire lobjet damliorations. Actuellement,
ses performances peuvent notamment tre affectes par la prsence dinhibiteurs. Des
dveloppements visant limiter limpact des inhibiteurs et optimiser ltape dextraction de lADN
semblent une voie damlioration intressante.
Le q-PCR ne donne pas dindication sur ltat de viabilit des bactries. La v-PCR semble fournir une
information sur ltat de viabilit des bactries. Des tudes visant tester cette mthode sur des eaux
environnementales sont cependant encore ncessaires pour vrifier son potentiel.
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Lhybridation molculaire peut galement contribuer rpondre au problme du dnombrement de
Legionella dans des eaux trs charges. Elle est moins sensible aux inhibiteurs que lamplification
gnique car elle ne fait intervenir aucune enzyme et est par ailleurs capable de dtecter aussi bien les
cellules cultivables que les VBNC. La mise en uvre de ce type danalyse pourrait passer par le
dveloppement de biocapteurs (puces ADN, etc.) adapts ce type deau.
Le dveloppement de kits prts lemploi, bass sur les diffrents principes dj voqus semble
galement une voie damlioration prometteuse.
Une demande a t fortement exprime lors des auditions par diffrents acteurs. Elle concerne un
besoin de dveloppement doutils utilisables sur site afin de gnrer le plus rapidement possible,
directement sur les lieux dinstallation, des rponses non ambigus permettant damliorer lefficacit
de la surveillance de la qualit des eaux. Il nexiste, lheure actuelle, aucun systme portable
susceptible de raliser le dnombrement de Legionella. De tels outils pourraient tre dvelopps pour
tre mis disposition des gestionnaires dinstallations et des industriels.
Les cosystmes des lgionelles sont encore mal caractriss. Des tudes complmentaires sur
linfluence des conditions environnementales sur la composition physicochimique de leau, le biofilm,
les traitements biocides et les interactions entre les microorganismes permettrait de faire progresser
les connaissances dans ce domaine.
Bien que leau soit la source principale de contamination, les arosols sont la source principale de
diffusion leur comportement et constitution sont encore trop mconnus. Des tudes supplmentaires
dans ce domaine sont ncessaires.
Le contrle efficace des installations passe par la maitrise des systmes biologiques qui sy trouvent.
Ltat des connaissances des cosystmes microbiens complexes, en particulier des biofilms et de
leur capacit servir de rservoir aux Legionella est lacunaire. Cette lacune devrait tre comble par
des tudes car, actuellement, elle entrave les possibilits de contrle.
Le suivi des protozoaires (amibes et cilis) dans les installations et leur contribution la dangerosit
des installations risque est trop largement nglig. Une maitrise complte du risque ne pourra tre
envisage sur le long terme que si ces deux paramtres sont pris en compte. Un effort sensible de
la recherche dans ces deux domaines est prconis.
Des tudes comparant les stratgies de suivi des installations mettant en uvre les diffrentes
mthodes de dnombrement disponibles, en commenant par la culture et la q-PCR, pourraient tre
proposes, notamment en cas de dcontamination, pour optimiser les dlais entre traitements et
prlvements en fonction des mthodes.
Enfin, il semble important que le dveloppement des futurs rseaux intgre la problmatique des
Legionella et anticipe autant que possible les problmes hydrauliques lorigine de dveloppement
bactrien.
Labsence de critres dinterprtation des rsultats du point de vue sanitaire, quelles que soient les
mthodes alternatives la culture, tient principalement au manque de donnes analytiques obtenues
par ces diffrentes mthodes. A court terme, il convient daffiner les critres dinterprtation des
rsultats retenus pour la q-PCR. A moyen ou long terme, il convient dlaborer des critres pour les
autres mthodes qui atteindront un niveau de dveloppement suffisant.
Sagissant des mthodes non encore rodes, le manque de cohrence des essais comparatifs
mettant en uvre les diffrentes technologies justifie de mettre en uvre des essais grande
chelle. Ces essais permettront daboutir terme une standardisation des protocoles, voire
leur normalisation et de disposer de donnes suffisantes pour pouvoir les comparer.
Il semble probable que lmergence dune solution efficace susceptible de rpondre au problme des
Legionella passera terme par llaboration dune technique composite mettant en uvre plusieurs
des principes dcrits dans le prsent rapport. Pour autant, certaines mthodes se situant encore des
stades trs prliminaires de dveloppement, demandent tre encourages.
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Anses
Annexes
Annexe 1 : Courrier de saisine de lAfsset par la DGS et la DGPR sur les mthodes de
dtection des lgionelles dans leau
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Anses
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Anses
Annexe 2 : Textes rglementaires et lgislatifs relatifs aux Legionella,

en ligne sur le RESE (http://rese.sante.gouv.fr/), le 5 mars 2010.
Code de la sant publique
Articles L. 1335-2-1 L. 1335-2-3
Article R. 1321-23
Dcrets
Dcret n 2004-1331 du 1er dcembre 2004 modifiant la nomenclature des installations classes
(ndlr : cration de la rubrique 2921)
Arrts
Arrt du 1er fvrier 2010 relatif la surveillance des lgionelles dans les installations de production,
de stockage et de distribution d'eau chaude sanitaire
Arrt du 21 janvier 2010 modifiant l'arrt du 11 janvier 2007 relatif au programme de prlvements
et d'analyses du contrle sanitaire pour les eaux fournies par un rseau de distribution, pris en
application des articles R. 1321-10, R. 1321-15 et R. 1321-16 du code de la sant publique
Arrt du 22 juin 2006 modifiant l'arrt du 2 fvrier 1998 relatif aux prlvements et la
consommation d'eau ainsi qu'aux missions de toute nature des installations classes pour la
protection de l'environnement soumises autorisation (ndlr : concerne les TAR)
Arrt du 30 novembre 2005 modifiant l'arrt du 23 juin 1978 relatif aux installations fixes destines
au chauffage et l'alimentation en eau chaude sanitaire des btiments d'habitation, de bureaux ou
locaux recevant du public
Arrt du 13 dcembre 2004 relatif aux prescriptions gnrales applicables aux installations
classes pour la protection de l'environnement soumises dclaration sous la rubrique n 2921
Installations de refroidissement par dispersion d'eau dans un flux d'air
Arrt du 13 dcembre 2004 relatif aux installations de refroidissement par dispersion d'eau dans un
flux d'air soumises autorisation au titre de la rubrique n 2921
Arrt du 19 juin 2000 modifiant l'arrt du 14 octobre 1937 modifi relatif au contrle des sources
d'eaux minrales
Arrt du 28 octobre 1993 modifiant l'arrt du 2 aot 1977 relatif aux rgles techniques et de
scurit applicables aux installations de gaz combustible et d'hydrocarbures liqufis situes
l'intrieur des btiments d'habitation ou de leurs dpendances
Arrt du 23 juin 1978 relatif aux installations fixes destines au chauffage et l'alimentation en
chaude sanitaire des btiments d'habitation, de bureaux ou locaux recevant du public (modifi par
l'arrt du 30 novembre 2005)
Circulaires, notes, ...
Note de service DGS/EA4/2009/281 du 9 septembre 2009 relative aux investigations mener lors
de la survenue d'un ou plusieurs cas de lgionellose proximit de certains centres nuclaires de
production d'lectricit
Note de service DGS/EA4/2009/167 du 19 juin 2009 relative la dsinfection des rseaux d'eau
chaude sanitaire par injection de produits base de peroxyde d'hydrogne et de sels d'argent
Circulaire DGS/EA4/2010/448 du 21 dcembre 2010 relative aux missions des Agences rgionales
de sant dans la mise en uvre de larrt du 1er fvrier 2010 relatif la surveillance des lgionelles
dans les installations de production, de stockage et de distribution deau chaude sanitaire.
Circulaire DGS/EA4/2010/289 du 27 juillet 2010 relative la prvention des risques infectieux et
notamment de la lgionellose dans les bains remous (spas) usage collectif et recevant du public
Circulaire MEDAD/DPPR du 28 juin 2007 relative la vigilance accrue en priode d't
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Anses
Circulaire DGS/DEUS/2007/229 du 11 juin 2007 relative la diffusion du questionnaire dvaluation
de l'utilisation du document "Le risque li aux lgionelles, Guide dinvestigation et daide la gestion",
dans les services dconcentrs (DDASS, CIRE)
Circulaire interministrielle DGS/SD7A/DSC/DGUHC/DGE/DPPR/126 du 3 avril 2007 relative la
mise en uvre de l'arrt du 30 novembre 2005 modifiant l'arrt du 23 juin 1978 relatif aux
installations fixes destines au chauffage et l'alimentation en eau chaude sanitaire des btiments
d'habitation, des locaux de travail ou des locaux recevant du public
Circulaire du 28 septembre 2006 relative aux mesures compensatoires en cas d'impossibilit
technique ou conomique de raliser l'arrt annuel de l'installation pour nettoyage et dsinfection
Circulaire DGS/SD7A/398 du 12 septembre 2006 relative la saisie dans la base de donnes
informatique SISE-Eaux des analyses microbiologiques ralises dans le cadre du contrle sanitaire
des eaux des tablissements thermaux (Version : annexe 3 modifie le 15 septembre 2006)
Circulaire DGS/DPPR/DGSNR/DRT n 2006/213 du 15 mai 2006 relative aux modalits
dorganisation des services de lEtat en cas de survenue de cas groups de lgionellose
Note d'information DGS/SD7A n 2005/1628 du 15 dcembre 2005 relative l'abrogation de la
circulaire DGS n 97/311 du 24 avril 1997 relative la surveillance et la prvention de la lgionellose
et actualisation de ses annexes
Circulaire du 8 dcembre 2005 relative lapplication des arrts ministriels du 13 dcembre 2004
relatifs aux installations de refroidissement par dispersion deau dans un flux dair (rubrique 2921)
Circulaire DGS/SD7A/DHOS/E4/DGAS/SD2/2005/493 du 28 octobre 2005 relative la prvention
du risque li aux lgionelles dans les tablissements sociaux et mdico-sociaux d'hbergement pour
personnes ges
Circulaire DHOS/E4/DGS/SD7A/2005/417 du 9 septembre 2005 relative au guide technique sur
l'eau dans les tablissements de sant
Circulaire DGS/SD5C/SD7A/DESUS/2005/323 du 11 juillet 2005 relative la diffusion du guide
d'investigation et d'aide la gestion d'un ou plusieurs cas de lgionellose
Circulaire DGS/SD7A/DHOS/E4/2005/286 du 20 juin 2005 relative au rfrentiel dinspection des
mesures de prvention des risques lis aux lgionelles dans les tablissements de sant
Note d'information DGS/SD7A n 2005/315 du 3 mars 2005 relative aux volutions en matire de
mthodes d'analyse de lgionelles dans les chantillons d'eau et l'interprtation de leurs rsultats
Circulaire interministrielle DGS/DPPR/2004/413 du 6 aot 2004 relative la prvention du risque
sanitaire li aux lgionelles d aux tours arorfrigrantes humides
Circulaire du 24 fvrier 2004 relative au recensement des tours arorfrigrantes humides dans le
cadre de la prvention du risque sanitaire li aux lgionelles
Circulaire DHOS/E2/DGS/SD5C/2004/21 du 22 janvier 2004 relative au signalement des infections
nosocomiales et linformation des patients dans les tablissements de sant
Circulaire DGS/SD7A n 633 du 30 dcembre 2003 relative lapplication des articles R. 1321-1 et
suivants du code de la sant publique concernant les eaux destines la consommation humaine,
lexclusion des eaux minrales naturelles
Circulaire MEDD du 16 dcembre 2003 relative aux installations classes - vigilance vis--vis du
risque de lgionellose
Circulaire DGS/SD7A - DHOS/E4 - DPPR/SEI n 2003/306 du 26 juin 2003 relative la prvention
du risque li aux lgionelles dans les tours arorfrigrantes des tablissements de sant
Circulaire DGS/SD7A - DHOS/E4 n 03/296 du 24 juin 2003 relative l'enqute visant valuer
l'application par les tablissements de sant des mesures prconises par la circulaire du 22 avril
2002, relative la prvention du risque li aux lgionelles dans les tablissements de sant
Circulaire DPPR du 24 avril 2003 relative aux installations classes - Tours arorfrigrantes Prvention de la lgionellose
Lettre circulaire DGS/SD5B-n 03/58 du 21 fvrier 2003 relative la procdure de gestion des
alertes sanitaires associant les services dconcentrs, les CIRE(s), lInVS et la DGS
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Anses
Circulaire DGS n 2002/273 du 2 mai 2002 relative la diffusion du rapport du Conseil suprieur
d'hygine publique de France relatif la gestion du risque li aux lgionelles
Circulaire DGS/SD7A/SD5C-DHOS/E4 n 2002/243 du 22 avril 2002 relative la prvention du
risque li aux lgionelles dans les tablissements de sant
Circulaire DGS/SD7A/2001/575 du 29 novembre 2001 relative lenqute sur le bilan de la mise en
uvre de larrt du 19 juin 2000 modifiant larrt du 14 octobre 1937 modifi relatif au contrle des
sources deaux minrales
Circulaire DGS/VS4/2000/336 du 19 juin 2000 relative la gestion du risque microbien li l'eau
minrale dans les tablissements thermaux (modifie par circulaire du 29 novembre 2001)
Circulaire DPPR/SEI/BAMET/PG/NA du 23 avril 1999 relative aux installations classes sous la
rubrique 2920, comprenant des tours arorfrigrantes
Circulaire DGS n 98/771 du 31 dcembre 1998 relative la mise en uvre de bonnes pratiques
d'entretien des rseaux d'eau dans les tablissements de sant et aux moyens de prvention du
risque li aux lgionelles dans les tablissements risque et dans celles des btiments recevant du
public (modifie par les circulaires du 22 avril 2002 et du 28 octobre 2005)
Circulaire DGS/VS2 n 97/311 du 24 avril 1997 relative la surveillance et la prvention de la
lgionellose (abroge par la circulaire du 11 juillet 2005)
Guide dinvestigation dun ou plusieurs cas de lgionellose annex la circulaire DGS 97/311 et dit
dans le cadre du BEH 20-22 / 1997
Annexe V : Mesure de lutte et de prvention au niveau des bains remous ou des bains jets
(version corrige) (ndlr : erreur de titre sur le document en ligne sur le site de l'InVS)
Circulaire DGS/PGE/IC n 238 du 28 mars 1989 relative la listriose et la lgionellose (abroge
par circulaire du 24 avril 1997)
Circulaire n 538 TG 3 du 3 juillet 1974 relative la prvention des accidents de brlures par l'eau
chaude sanitaire (abroge par circulaire du 22 avril 2002)
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Anses
Annexe 3 : Normes rfrences dans le rapport

NF T90-431 (septembre 2003) - Qualit de l'eau - Recherche et dnombrement de Legionella spp et
de Legionella pneumophila - Mthode par ensemencement direct et aprs concentration par filtration
sur membrane ou centrifugation
XP T 90-471 (Avril 2006) - Qualit de l'eau - Dtection et quantification des Legionella et/ou
chane en temps rel (RT PCR)
NF T 90-471 (Avril 2010) - Qualit de l'eau - Dtection et quantification des Legionella et/ou
chane en temps rel (RT PCR)
NF T90-210 (juin 2009) - Qualit de l'eau - Protocole d'valuation initiale des performances d'une
mthode dans un laboratoire
XP T90-465-1 (projet de norme exprimentale du 15 fvrier 2010) - Protocole d'estimation de
l'incertitude de mesure associe un rsultat d'analyse pour les mthodes de dnombrement
microbiologiques
XP T90-465-2 (projet de norme exprimentale du 15 fvrier 2010) - Protocole d'estimation de
l'incertitude de mesure associe un rsultat d'analyse pour les mthodes de dnombrement
microbiologiques - Partie 1 : Les techniques numratives
NF ISO 8199 (2005) - Qualit de l'eau -- Lignes directrices gnrales pour le dnombrement des
micro-organismes sur milieu de culture
NF EN ISO 11731-2 (Juillet 2008) - Qualit de l'eau - Recherche et dnombrement des Legionella Partie 2 : Mthode par filtration directe sur membrane pour les eaux faible teneur en bactries
NF EN ISO 16140 (Octobre 2003) - Microbiologie des aliments - Protocole pour la validation des
mthodes alternatives
NF EN ISO 17994 (dcembre 2004) - Qualit de l'eau - Critres pour tablir l'quivalence entre les
mthodes microbiologiques
ISO 19458:2006 (aout 2006) Qualit de leau Echantillonnage pour analyse microbiologique
ISO/TR 13843 : 2000 (juin 2000) - Qualit de l'eau -- Lignes directrices pour la validation des
mthodes microbiologiques
FD ENV ISO 13843 (T90-460) (Octobre 2001) - Qualit de l'eau - Lignes directrices pour la validation
des mthodes microbiologiques
FD T90-522 (fascicule de documentation du Juillet 2006) Qualit de leau Guide technique de
prlvement pour la recherche de Legionella dans les eaux
Version 0 (26 septembre 2006) du Protocole de validation pour les kits de dtection et de
dnombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification gnique
par raction en chane de polymrisation (PCR) - Application l'analyse microbiologique de l'eau
Version 0 (28 juillet 2008) du Protocole de validation d'une mthode alternative commerciale par
rapport une mthode de rfrence - Application l'analyse microbiologique de l'eau
Fvrier 2011
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Anses
Annexe 4 : Rglementation et guides internationaux

Les lments prsents dans cette annexe ont pour but de donner une image reprsentative des
valeurs cibles prconises dans les rglementations et guides internationaux pur la surveillance des
tours arorfrigrantes. Cependant, la liste prsente nest pas ncessairement exhaustive.
Tableau 11 : valeurs cibles de surveillance des tours arorfrigrantes prconises par les rglementations ou
les guides internationaux
Pays
Rglementation/Guide
Allemagne
Guide 6022-3 de 2002 concernant les

exigences en termes dhygine pour les
systmes dair conditionn (section 4.3.10)
Norme intgre dans la rglementation : Airhanding and water systems of buildings,
microbial control, AS/NZS 3666 Australian /
New Zealand standards, Sydney (2000)
Dcret royal 865/2003 du 4 juillet tablit les
critres de sant et dhygine pour la
prvention et le contrle de la lgionellose.
annexe 4
Australie
Espagne
Finlande
Norvge
Pays Bas
Royaume
Uni
Sude
Suisse
USA
Fvrier 2011
Cibles
dnombrement
Legionella
Legionella spp
Legionella ,
sous-entendu
spp (ISO 11731
partie 1, 1998)
Pas de rglementation nationale

Application de lEuropean Guidelines for
Control and Prevention of Travel Associated
Legionnaires Disease (janvier 2005)
Rglementation nationale associ
lapplication de lEuropean Guidelines for
Dcret (11/09/2003) modifiant la
rglementation sur les conditions de travail
(acte 1998, section 5 ; dcret section 4.87)
Guide de rfrence publi par le Health Safety
Executive (HSE) intitul : Approved code of
practice and guidance Legionaires disease,
the control of legionella bacteria in water
system (2004)
Pas de rglementation nationale
Application de lEuropean Guidelines for
Le document Legionella et lgionellose
(2005), de lOffice fdral de la sant publique
(rubrique maladies transmissibles)
Legionella spp
Guide dit par lOccupational Safety & Health

Administration (OSHA, 1999)
L. pneumophila
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Valeurs cibles
Objectif / seuil
daction : 10 UFC/L
Objectif : LD
Seuil daction : 10
6
10 UFC/l
Pas de seuil darrt
Seuil daction 1 :
2
10 UFC/l
Seuil daction 2 :
3
10 UFC/l
4
Seuil darrt : 10
UFC/l
3
Seuil daction : 10
UFC/l
Pas de seuil darrt
3
Legionella spp
Seuil daction : 10
UFC/l
Pas de seuil darrt
Legionella spp
Aussi faible que

possible
L. pneumophila
Objectif : < 10 UFC/l

Seuil daction :
3
10 UFC/l
Legionella spp
Seuil daction : 10
UFC/l
Pas de seuil darrt
Legionella spp
Seuil daction : 10
UFC/l
4
Seuil darrt : 10
UFC/l
5
Seuils daction : 10
6
et 10 UFC/l
Pas de seuil darrt
Anses
Annexe 5 : Exemples de courriers de sollicitation utiliss pour prparer les auditions

menes par le groupe de travail "Dtection des lgionelles dans leau".
Courrier 1
Objet : Sollicitation pour une audition concernant les mthodes de dnombrement des
lgionelles dans leau
Monsieur,
A la demande des Ministres en charge de la sant et de lenvironnement, lAgence franaise de
scurit sanitaire de lenvironnement et du travail (Afsset), tudie actuellement la pertinence de
diffrentes mthodes de dtection des lgionelles dans les eaux chaudes sanitaires et dans les tours
arorfrigrantes.
Vous avez dpos votre candidature pour participer au groupe de travail constitu par lAfsset pour
rpondre cette demande et nous vous en remercions. Bien que vous nayez pas t retenu en tant
que membre de ce groupe de travail, la prise en compte de votre exprience et de vos comptences
nous semble essentielle pour mener bien notre rflexion.
Dans ce contexte, nous vous sollicitons donc pour une audition avec Messieurs . et .. Cette
auditions sera conduite par le groupe de travail Dtection des lgionelles dans leau et se droulera
le : partir de .
Compte tenu dun temps daudition limit, nous souhaiterions nous concentrer plus particulirement
sur les points suivants :
! la liste des mthodes de dtection des lgionelles que vous utilisez ;
! les contextes dans lesquels ces mthodes sont utilises (contextes rglementaires, gestion
technique, types deau, ) ;
! les informations que vous attendez de chacune de ces mthodes ;
! comment vous interprtez leurs rsultats (mthodes, seuils,) ;
! quels types de mesures peuvent dcouler de ces rsultats (mesures de gestion techniques,
sanitaires, ).
Nous vous proposons de prparer une prsentation trs synthtique de 10 15 minutes
spcifiquement sur les points que nous souhaitons aborder, suivie dune discussion de 30 40
minutes.
Nous souhaiterions par ailleurs, une contribution crite de votre part, qui regroupe les diffrents
lments que vous voudrez bien nous communiquer sur les points prcits, en y prcisant autant que
possible des lments sur lesquels nous ne passerons pas ncessairement beaucoup de temps
pendant laudition :
# performances des mthodes que vous voquerez (performances thoriques et surtout
performances observes) :
justesse (faux positifs, faux ngatifs),
fidlit (Reproductibilit : coefficient de variance),
sensibilit (rendement, limites de dtection, limites de quantification en prcisant les volumes
dchantillons),
spcificit (par rapport Legionella et par rapport L. pneumophila),
temps danalyse (prlvement, analyse et mise forme des rsultats),
ventuels autres paramtres de performance que vous utilisez pour caractriser ces
mthodes d'analyse,
# robustesse des mthodes utilises (niveaux de comptence ncessaires leur mise en uvre,
sensibilits aux conditions de mise en uvre, ) ;
# cot par analyse, en fonction du nombre danalyses ralises, en prcisant les lments pris en
compte (matriel, ractifs, personnel) ;
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Anses
# rsultats dventuelles comparaisons ou valuations dquivalence de diffrentes mthodes de
dtection des lgionelles dans leau que vous auriez menes.
Nous nattendons pas ncessairement cette contribution crite avant laudition, mais dans la mesure
du possible, nous souhaiterions en disposer dici ... 2010.
Je vous prie de croire, Monsieur, lexpression de mes salutations distingues.
Courrier 2
Objet : Sollicitation pour une audition concernant les mthodes de dnombrement des
lgionelles dans leau
Monsieur,
A la demande des Ministres en charge de la sant et de lenvironnement, lAgence franaise de
scurit sanitaire de lenvironnement et du travail (Afsset), tudie actuellement la pertinence de
diffrentes mthodes de dtection des lgionelles dans les eaux chaudes sanitaires et dans les tours
arorfrigrantes.
Vous avez dpos votre candidature pour participer au groupe de travail constitu par lAfsset pour
rpondre cette demande et nous vous en remercions. Bien que vous nayez pas t retenu en tant
que membre de ce groupe de travail, la prise en compte de votre exprience et de vos comptences
nous semble essentielle pour mener bien notre rflexion.
Dans ce contexte, nous vous sollicitons donc pour une audition avec Messieurs . et .. Cette
auditions sera conduite par le groupe de travail Dtection des lgionelles dans leau et se droulera
le : partir de .
Compte tenu dun temps daudition limit, nous souhaiterions nous concentrer plus particulirement
sur les points suivants :
! les mthodes de dnombrement des lgionelles sur lesquelles portent les essais de
comparaison inter laboratoire ;
! les contextes dans lesquels ces mthodes sont utilises (contextes rglementaires, gestion
technique, types deau, ) ;
! les rsultats de comparaison inter laboratoire mens sur ces mthodes ;
! linterprtation et la signification de ces rsultats.
Nous vous proposons de prparer une prsentation trs synthtique de 10 15 minutes
spcifiquement sur les points que nous souhaitons aborder, suivie dune discussion de 30 40
minutes.
Nous souhaiterions par ailleurs, une contribution crite de votre part, qui regroupe les diffrents
lments que vous voudrez bien nous communiquer sur les points prcits, en y prcisant autant que
possible des lments sur lesquels nous ne passerons pas ncessairement beaucoup de temps
pendant laudition :
# performances des mthodes que vous voquerez (performances thoriques et surtout
performances observes) :
justesse (faux positifs, faux ngatifs),
fidlit (Reproductibilit : coefficient de variance),
sensibilit (rendement, limites de dtection, limites de quantification en prcisant les volumes
dchantillons),
spcificit (par rapport Legionella et par rapport L. pneumophila),
temps danalyse (prlvement, analyse et mise forme des rsultats),
ventuels autres paramtres de performance que vous utilisez pour caractriser ces
mthodes d'analyse,
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Anses
# robustesse des mthodes utilises (niveaux de comptence ncessaires leur mise en uvre,
sensibilits aux conditions de mise en uvre, ) ;
# cot par analyse, en fonction du nombre danalyses ralises, en prcisant les lments pris en
compte (matriel, ractifs, personnel) ;
# rsultats dventuelles comparaisons ou valuations dquivalence de diffrentes mthodes de
dtection des lgionelles dans leau que vous auriez menes.
Nous nattendons pas ncessairement cette contribution crite avant laudition, mais dans la mesure
du possible, nous souhaiterions en disposer dici ... 2010.
Je vous prie de croire, Monsieur, lexpression de mes salutations distingues.
Fvrier 2011
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Anses
Annexe 6 : Synthse des dclarations publiques dintrts des experts par rapport au
champ de la saisine.
RAPPEL DES RUBRIQUES DE LA DECLARATION PUBLIQUE DINTERETS

IP-A
Interventions ponctuelles : autres
IP-AC
Interventions ponctuelles : activits de conseil
IP-CC
Interventions ponctuelles : confrences, colloques, actions de formation
IP-RE
Interventions ponctuelles : rapports dexpertise
IP-SC
Interventions ponctuelles : travaux scientifiques, essais, etc.
LD
Liens durables ou permanents (Contrat de travail, rmunration rgulire )
PF
Participation financire dans le capital dune entreprise
SR
Autres liens sans rmunration ponctuelle (Parents salaris dans des entreprises
vises prcdemment)
SR-A
Autres liens sans rmunration ponctuelle (Participation conseils dadministration,

scientifiques dune firme, socit ou organisme professionnel)
VB
Activits donnant lieu un versement au budget dun organisme
SYNTHESE DES DECLARATIONS PUBLIQUES DINTERETS DES MEMBRES DU CES EAUX ET

AGENTS BIOLOGIQUES PAR RAPPORT AU CHAMP DE LA SAISINE
NOM
Analyse Anses :
ABSI
Prnom
Rubrique de la DPI
Description de lintrt
en cas de lien dclar
Rafik
Date de dclaration
des intrts*
8 septembre 2010
Aucun lien dclar en rapport avec la saisine.

BALLET
Jean-Jacques (na pas particip aux travaux)
20 juin 2007

BERJEAUD
Analyse Anses :
BOUDENNE
7 juillet 2010
Jean-Marc
VB : Co-directeur de thse sur une bactriocine
anti-lgionelle (bourse CIFRE/Veolia)
Pas de risque de conflit dintrt par rapport la
saisine.
Jean-Luc
7 fvrier 2011

BRUGERE-PICOUX
3 septembre 2010
Jeanne
Fvrier 2011
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Anses
CABILLIC
5 septembre 2010
Pierre-Jean
CAMUS
er
1 septembre 2010
Patrick
CREPPY
10 septembre 2010
Edmond
CUDENNEC
30 aout 2010
Christophe
DAGOT
24 octobre 2010
Christophe
DUKAN
Sam (na pas particip aux travaux)
25 novembre 2009

GEHANNO
13 juin 2010
Jean-Franois
GUT
27 octobre 2009
Jean-Pierre
IP-SC : Evaluation d'une trousse pour le dpistage
de l'infection par le virus de l'hpatite C, pour le
Laboratoire BIORAD, avec une rmunration de
son organisme d'appartenance (CHU Strasbourg),
2003.
Analyse Anses :
HILAIRE
Analyse Anses :
HUMBERT

saisine.
3 septembre 2010
Didier
SR-A : Membre du groupe dcontamination
de lOTAN depuis 1995.
saisine.
Jean-Franois
17 juillet 2010

LAKEL
26 septembre 2010
Abdel
LE BACLE
23 septembre 2010
Colette
MARCHANDISE
10 septembre 2010
Patrick
Fvrier 2011
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Anses
MATHIEU
Analyse Anses :
MOGUEDET
8 janvier 2011
Laurence
VB : Participation au programme de recherche
Caractrisation de lexposition aux arosols de
lgionnelles financ par lAdeme, lAnsest,
Veolia, la DGS et EDF.
saisine.
Grard
er
1 octobre 2007

MOUNEYRAC
24 novembre 2010
Catherine
POURCHER
9 fvrier 2011
Anne-Marie
RAUZY
30 aout 2010
Sylvie
RUNIGO-MAGIS
9 dcembre 2009
Rene
SAUVANT-ROCHAT
6 septembre 2010
Marie-Pierre
TANDEAU DE
MARSAC
9 septembre 2010
Nicole
TREMBLAY
9 fvrier 2011
Michle
TRIBOLLET
27 juillet 2010
Bernard
IP : Participation au groupe de travail Afsset relatif
aux risques sanitaires lis aux prolifrations
de Legionella dans leau (2005 2007)
Analyse Anses :
VILLENA

saisine.
3 septembre 2010
Isabelle
IP : Prsidence CES Microbiologie de lAnses
(2009 2012)
Analyse Anses :
Fvrier 2011

saisine.
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Anses
SYNTHESE DES DECLARATIONS PUBLIQUES DINTERETS DES MEMBRES DU GT PAR RAPPORT AU

CHAMP DE LA SAISINE
NOM
Prnom
Rubrique de la DPI
Description de lintrt
Date de dclaration
des intrts*
Analyse Anses :
ABASQ
11 dcembre 2009
Pierre
ALLEGRA
24 aout 2010
Sverine
CHANTELOUP
27 septembre 2010
Philippe
Aucun lien dclar
HILAIRE
Didier (membre du CES valuation des risques

lis aux eaux et aux agents biologiques )
03 dcembre 2009

JARRAUD
24 fvrier 2011
Sophie
IP-AC : intervention pour lAfssaps en mars 2010.
IP-CC : Organisation du Colloque National
Legionella et lgionelloses, Lyon, les 18 et 19
Octobre 2007, avec la participation de
Genesystems, BIO-RAD, Disruptive Technologies,
OXOID, Sanofi Aventis, AES Chemunex, Applied
Biosystems, BioMerieux, GIRPI, Sanichem, Thetis
environnement, Eurobio, Pall Medical, Trinity
Biotech France, PFIZER, Biololab, ELYO Cylergie,
Euromedex, GATC Biotech, GSK GlaxoSmithKline
France, ROCHE DIAGNOSTICS, Wyett Lederle.
VB :
Responsable dun projet dEvaluation dune
technique de PCR en temps rel pour la dtection
de lgionelles dans lenvironnement (participation
de GeneSystems au financement de lquipe
recherche)
Responsable dun projet de diffrentiation des
Legionella vivantes et mortes par biologie
molculaire
(participation
de
BioRad
au
financement de lquipe recherche)
Participe un projet de recherche financ par
lAnses sur le typage des lgionelles par la
mthode MLVA (novembre 2010 novembre
2012)
Appel recherch Afsset cible Lgionelles 2007 :
Rle des amibes de lenvironnement sur la
colonisation, la prolifration et la virulence des
bactries
du
genre
Legionella
(principal
investigateur : Michel Pelandakis)
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Anses
SR-A :
Dclaration dinvention dans le cadre dun projet
pilot par lInstitut Pasteur concernant le typage
molculaire de Legionella pneumophila et
Legionella longbeachae, avec identification
simultane de lespce et du srogroupe (dpt le
13/10/2010, aucune firme na achet les droits
dexploitation de linvention au 10/02/2011, pas de
rmunration cette date).
Analyse Anses :
LAWRENCE

saisine.
21 fvrier 2011
Christine
IP : Formation de 2h pour Biorad en 2007
VB : Projet de contrat de collaboration de
recherche entre lAPHP et Genesystems (non
sign au 10/02/2011)
Analyse Anses :
LE CANN
SR-A : Dclaration dinvention dans le cadre dun

projet pilot par lInstitut Pasteur concernant le
typage molculaire de Legionella pneumophila et
Legionella longbeachae, avec identification
simultane de lespce et du srogroupe (dpt le
13/10/2010, aucune firme na achet les droits
dexploitation de linvention au 10/02/2011, pas de
rmunration cette date).
saisine.
8 septembre 2010
Pierre
VB : Pilotage dun projet de recherche financ par
lAnses sur le typage des lgionelles par la mthode
MLVA (novembre 2010 novembre 2012)
Analyse Anses :
LECSO

saisine.
14 dcembre 2009
Marylin
SARDE
13 septembre 2010
Claude-Olivier
IP : travaux scientifique dans le cadre du
Programme Europen Marie Curie "Vesicount", en
collaboration avec Ascal
Analyse Anses :
SQUINAZI

saisine.
27 janvier 2010
Fabien
* : chaque dbut de runion, il est demand aux experts sils ont de nouveaux liens dclarer
depuis la dernire mise jour de leur dclaration publique dintrt.
Impression daprs documents fournis
bialec, nancy (France)
Dpt lgal n 76046 - mai 2011
Imprim sur papiers issus de forts gres durablement
Fvrier 2011
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Anses ditions: mai 2011 Couverture: Parimage Crdit photo: Christophe Lepetit
27-31 avenue du gnral Leclerc

94701 Maisons-Alfort Cedex
www.anses.fr
ISBN 978-2-11-128215-5 Dpt lgal: mai 2011
Agence nationale de scurit sanitaire

de lalimentation, de lenvironnement et du travail

Méthodes de Détection Et de Dénombrement de Legionella Dans L - Eau

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Mthodes

Anses Saisine 2009-SA-330

Maisons-Alfort, le 7 avril 2011,

de lAgence nationale de scurit sanitaire de lalimentation,

1. PRESENTATION DE LA QUESTION POSEE

Anses Saisine 2009-SA-330

Anses Saisine 2009-SA-330

Ces problmatiques relvent des comptences du comit dexperts spcialises (CES)

Prlvement des scrtions respiratoires.

Anses Saisine 2009-SA-330

soumises autorisation et dclaration, communment appeles tours arorfrigrantes.

Anses Saisine 2009-SA-330

Le dtail de la description des mthodes figure dans le rapport dexpertise. De lanalyse

Anses Saisine 2009-SA-330

4.6.1.Valeurs cibles pour la mthode par culture

En 2001, le Conseil suprieur dhygine publique de France (CSHPF) a propos des

Dans le cas des eaux chaudes sanitaires

Pour la population gnrale, la rglementation franaise en vigueur, fixe la valeur cible en

Dans le cas des tours arorfrigrantes

La rglementation franaise en vigueur, concernant les tours arorfrigrantes, fixe des

Le niveau de connaissance actuel ne permet pas dtablir une valeur cible de L.

Anses Saisine 2009-SA-330

Dans le cas des eaux chaudes sanitaires

Dans le cas des tours arorfrigrantes

Ltablissement de valeurs cibles en Legionella. spp., adaptes la q-PCR, pourrait tre

Anses Saisine 2009-SA-330

du point de vue de la gestion des installations : le choix de dnombrer L.

Anses Saisine 2009-SA-330

Dans le cas des eaux destines la consommation humaine fournies

Dans le cas des eaux destines la consommation humaine fournies

En situation de surveillance aprs une dcontamination

Anses Saisine 2009-SA-330

Eau dappoint : valeur cible

En situation de surveillance aprs une dcontamination

En cas de dcontamination d'une installation dj l'arrt, suite une contamination

De lanalyse des diffrentes mthodes, il ressort quactuellement, aucune des

Anses Saisine 2009-SA-330

la q-PCR, la v-PCR, la culture, le FISH et lIDS pourraient, sous certaines

Besoins dtudes et de recherches

Anses Saisine 2009-SA-330

Mthodes de dtection et de dnombrement de

Table des matires

Mthodes de dtection et de dnombrement de

Prsentation de la question pose

LAgence franaise de scurit sanitaire de lenvironnement et du travail (Afsset) a t saisie le 29

Modalits de traitement : moyens mis en uvre et organisation

Lexpertise a t mene conformment aux exigences de la norme NF X 50-110 relative la qualit

Les espces de Legionella responsables de lgionelloses

Prlvement des scrtions respiratoires.

Les bases sanitaires et techniques du choix des espces de Legionella

Les critres prendre en compte pour valuer la pertinence dune mthode de

Le GT a dfini les critres de performance attendus dune mthode de dnombrement de Legionella

Critres relatifs au contexte pratique de mise en uvre

Critres relatifs linterprtation des rsultats

Critres relatifs aux champs dapplication

Critres relatifs aux cibles

Les mthodes values

des mthodes de dnombrement spcifique de Legionella utilisant plusieurs principes :

Critres priorit modre

Les mthodes pertinentes pour une utilisation en routine court terme

Comparaison de mthodes recenses dans la bibliographie

Les tudes de comparaison des diffrentes mthodes de dnombrement de Legionella rpertories

Choix des critres dinterprtation des rsultats selon les mthodes