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Les outils du gnie gntique


I) Les enzymes Ils permettent de travailler sur les acides nucliques, de le modifier, de le couper, de le recoller les morceaux etc... 1) Les polymrases Toutes les polymrases synthtisent de 5' vers 3' en utilisant des nuclotides triphosphates. Lnergie est donne par les nuclotides triphosphates. En cas d'erreur il y a excision du dernier nuclotide incorpor librant un 3' OH. La synthse peut continuer avec lajout dun nouveau nuclotide. Si la synthse se faisait dans l'autre sens de 3 vers 5, lanergie de la raction serait fournie par lextrmit 5 triphosphate de la chane en cours de polymrisation. En en cas d'erreur, il y aurait excision du dernier nuclotide et on obtiendrait une nouvelle extrmit 5' monophosphate. On aurait donc besoin dnergie pour repartir dans la synthse. a) Les DNA polymrases On distingue les DNA polymrases DNA dpendantes (ou DNA polymrases), des DNA polymrases RNA dpendantes (ou rverse transcriptases) des DNA polymrases nayant pas besoin de matrice (les terminal transfrases) ) DNA polymrase DNA dpendante ou DNA polymrase Elles fabriquent de l'ADN en prenant comme matrice de l'ADN. Les DNA polymrases ont besoin d'une base dj hybride ou amorce. Le plus souvent l'amorce est un oligonucleotide, simple brin qu'on est capable de synthtiser chimiquement. Homonymes : primer ou par extension oligonuclotide, DNA polymrase I de E. coli : c'est une enzyme de 100 kDa qui a une activit 5'- 3' polymrase, cette activit il y a 3'5' exonuclase (activit de correction) et une activit 5'3'exonuclase. Cette activit 5'3' exonuclase de la DNA polymrase I est souvent gnante. En 1970, Klenow et Henningsen ont enlev cette activit par protolyse avec la subtilisine. Le grand fragment obtenu (76 kDa) est dpourvue d'activit exonuclase 5'3' mais garde l'activit polymrase et l'activit 3'5'exonulase. Depuis le grand fragment est obtenu par expression d'un gne tronqu. C'est le fragment klenow de la DNA polymrase I. T4 et T7 DNA polymrase : elles proviennent des phages T4 et T7 et ont la mme activit que la klenow (5-3 polymrase et 35 exonuclase). L'activit 3'5' exonuclase peut tre retire chimiquement pour amliorer leurs performances lorsque la correction n'a pas beaucoup d'importance, lorsqu'on ne clone pas ensuite l'ADN. Ces polymrases modifies sont utilises par exemple dans les ractions de squence. Les DNA polymrases thermostable : Elles proviennent de bactries thermophiles. Leur avantage est donc d'tre thermostable. Une des plus utilise est la Taq DNA polymrase qui prsente les activits polymrase (5'3') et 5'3' exonuclase.

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Utilisation : - marquage : par nick translation. En effet l'enzyme est capable de digr de 5' vers 3' digestion mnge par la DNAse I pour crer des nicks puis utilisation de la polymrase I on a besoin ici de l'activit 3'5' exonuclase et de l'activit 5'3' polymrase (l'activit 3'-5' exonuclease n'est pas utile) - marquage par random priming - remplisage des extrmits non franches - marquage de l'extmit 3' rentrante - synthse du deuxime brin ( cDNA, mutagense) - squence Un cas particulier est lutilisation des polymrases thermostables. Elles permettent la polymrisation en chane (PCR, Polymerase Chain Reaction)

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On ajoute dans un tube de l'ADN, deux oligonuclotides hybridant sur chacun des deux brins de l'ADN, une polymrase thermostable et les 4 nuclotides triphosphates. On chauffe le tube 95C, les deux brins d'ADN se sparent. On abaisse la temprature en dessous du Tm des deux oligonucleotides, il s'hybrident l'ADN. L'hybridation est concentration dpendante, comme la concentration des deux oligonucleotides est beaucoup plus 1er cycle leve que la concentration de l'ADN, l'hybridation des oligonuclotides aura lieu alors que l'hybridation de l'ADN n'aura pas le temps de se faire. On lve ensuite la temprature 72C, temprature de fonctionnement de la 2eme cycle DNA polymrase, il y a synthse, incorporation des nuclotides. Et donc synthse d'un brin d'ADN. Cet ADN noform peut servir de matrice pour un nouveau cycle, si on rpte cette 3eme cycle alternance de temprature un quarantaine de fois, la rgion situe entre les deux oligonulotides prsente en une seule copie au dbut de l'exprience se retrouvera en 240 soit 1012 copies la fin 4eme cycle de l'exprience. Comme la polymrisation est toujours de 5' vers 3', les brins matrices issus de la polymrisation sont born en 5' et en 3' par les oligonuclotides (en 3') ou leurs squences complmentaires (en 5'). On 5eme cycle obtiendra donc un fragment d'ADN de longeur gale leur distance sur l'ADN utilis au dpart. Les fragment non 1 4 22 4 1 borns, provenant de la polymrisation sur l'ADN de dpart n'a pas une croissance logarithmique, (2 x 40) et sera rapidement ngligable au cours des cycles successifs.

) DNA polymrase RNA dpendante : reverse transcriptase

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Cette enzyme a la mme acitivit que la DNA polymrase DNA dpendante, mais elle fabrique unADN partir dun ARN ARN. Elle a donc une activit 53 5 AAAAAAAA3 n DNA polymrase la suite d'une amorce hybride sur un ARN. + oligodT De plus elle a souvent une activit associe, une activit RNAse H 5 AAAAAAAA3 (voir plus loin). TTTTTTT Lutilisation principale de cette + reverse transcriptase enzyme est la synthse dADN + dNTP complmentaire (cDNA) partir ARN 5 AAAAAAAA3 des ARN messagers de cellules TTTTTTTTT eucaryote. ADN On peut utiliser trois sortes damorces : - soit un oligo dT dans ce cas on obtient un population de cDNA partir des ARN d'une cellule eucaryote. - soit une amorce au hasard, on obtient alors une population de cDNA dont lextrmit 3 est variable - soit une amorce spcifique une squence prsente sur un ARN, on obtient alors des cDNA dune seule squence, dun seul gne

Ces squences pouront tre amplifies par PCR, lassociation succsive des deux techniques a pris le nom de RT-PCR. La Reverse transcriptase manque d'activit 3'5' exonuclase si bien qu'il n'y pas de correction d'erreur. (1 base sur 500 est mal incorpore en presence de Mn+ et en forte concentration de dNTP) ) Terminal transfrase: cette polymrase n'a pas besoin de matrice comme les autres polymrases, elle ajoute des nuclotides en 3' l'extrmit du brin d'ADN. Cest une enzyme rare (on n'en parle pas dans les mcanismes gnraux de la cellule), elle ajoute des nuclotides en 3'en prsence de dNTP. Si on veut en ajouter qu'un seul : on ajoute un ddNTP. utilisation : Fabrication d'une queue homopolymre pour les clonages Fabrication d'une extremit cohsive en 3' 2) Les RNA polymrase DNA dpendantes La RNA polymrase reconnat un promoteur et synthtise un ARN complmentaire au brin en aval de ce promoteur. La synthse s'effectue dans le sens 5'-3' en prsence de ribonuclotides. Le gne qui nous intresse doit donc tre clon derrire un promoteur spcifique pour la RNA polymrase que l'on veut utiliser. On utilise trois principales RNA polymrases, la T7 RNA polymrase, la T3 RNA polymrase et la SP6 RNA polymrase. Ces trois polymrases sont

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issues des phages T7, T3 ou SP6 et reconnaissent chacune un promoteur spcifique, ainsi la T7 RNA polymrase reconnat le promoteur T7 mais pas les promoteur T3 ou SP6.

2) les nuclases (DNAses et RNAses) a) Les DNAses Toutes les DNAses ont besoin d'ions divalent. Pour les inhiber on peut donc utiliser un chelateur d'ion divalent tel que l'EDTA. Une solution dADN comportant de lEDTA sera donc stable. Leur fonction est de couper lADN au niveau du phosphate, le produit de la raction est deux fragments un se termine par un 3OH et lautre par un 5 phosphate. On distingue les exonuclases qui digre l'ADN en retirant les nuclotides partir de l'extrmit des endonuclases qui coupent un des deux brins au milieu du polymre. ) Les exonuclases Lexonuclease III est une 3' exonuclease, elle retire les nuclotides d'une manire squentielle partir de l'extrmit 3' ( la condition qu'elle ne soit pas sortante). Bal 31 est aussi une exonuclase dont lactivit principale est une 3' exonuclase. Elle a en plus une activit secondaire dendonuclases sur le simple brin gnr par l'exonuclase utilisation : permet de tronquer des fragments d'ADN. b) Les endonuclases Les endonuclases ont diverses spcificit de substrat, certaines coupent l'ADN double brin d'autre l'ADN simple brin enfin certaines reconnaissent et coupent des squences caractristiques. DNAse I : endonuclease qui coupe le DNA double ou simple brin. On lemploie par exemple lorsquon veut liminer lADN dune solution ou pour faire des nicks sur lADN comme dans la technique de marquage par dplacement de coupure (nick translation). Dand ce dernier cas on effectue une digestion mnage.
5 3 3 5

Nuclease S1 : dgrade principalement le DNA simple brin et lARN. On lemploi par exemple lorsquon veut rduire un fragment dADN en lattaquant par ses extrmits. Dans ce cas on fait agir lexonuclase III qui grignote lextrmit 3, on obtient une extrmit 5 simple brin sortante puis on fait agir la nuclase S1 pour digrer cette extrmit. Un deuxime exemple

exonuclase III (digestion mnage) 5 3

3 5

nuclase S1

5 3

3 5

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dapplication est la cartographie de la structure dun gne, de sa composition en intron et exon. On ajoute dans un tube deux clones, un provenant du gnome (clone gnomique) et un provenant de lARN (clone cDNA), aprs dnaturation et hybridation on obtient trois sortes de molcules double brins, deux homoduplex correspondant aux rassociations des clones gnomiques et cDNA et un htroduplex correspondant lhybride. Dans lhtroduplex, les introns prsents dans le clone gnomique se retrouvent simple et sont donc sensibles lattaque par la nuclase S1. Une analyse sur gel dlectrophorse permettra de connatre le nombre dintrons, le nombre et la taille des exons.
clone cDNA clone Gnomique dnaturation

9,5kb 5kb 4kb 3kb 2kb -

hybridation

0,6kb -

nuclase S1

+ gel dlectrophorse 1re piste: tmoin avant la dnaturation 2me piste: rsultat de lexprience

Les DNAse de restriction (ou enzyme de restriction, restrictase) : endonuclease qui coupent dans une squence particulire ou sa proximit. Il existe trois grandes classes (type I, II et III) seules les enzymes du type II sont utilises en biologie molculaire. Elles reconnaissent une squence et coupe un site fixe appartenant cette squence ou proximit. (les types I et III ne sont pas utilis en biologie molculaire, en effet portent aussi une activit de mthylation et l'activit de coupure est ATP dpendante. De plus les enzymes de type I ne coupent pas au site de reconnaissance et coupe au hasard).

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Les enzymes de restriction donnent des extrmits 5 phosphate et 3 OH et donnent soit des extrmits cohsives soit des extrmits franches Par exemple : - EcoRI reconnat et coupe la squence G/AATTC (5' sortante) - PstI reconnat et coupe la squence CTGCA/G (3'sortante) - Sma I reconnat et coupe la squence CCC/GGG ce qui donne des extrmits franches La reconnaissance n'est pas toujours strictement dfinie ex Nci I CC/ (G ou C) GG et les palindromes peuvent etre intrompus exemple XmnI reconnat la squence suivante : GAANN/NNTTC Fragment de restriction : fragment de DNA gnr par des coupures faites par des endonuclases de restriction

5 ..NNNGAATTCNNNN.. 3 3 ..NNNCTTAAGNNNN.. 5 Digestion par Eco RI 5 ..NNNG 3 ..NNNCTTAA AATTCNNNN.. 3 GNNNN.. 5

5 ..NNNCTGCAGNNNN.. 3 3 ..NNNGACGTCNNNN.. 5 Digestion par Pst I

5 ..NNNCTGCA 3 ..NNNG

GNNNN.. 3 ACGTCNNNN.. 5

5 ..NNNCCCGGGNNNN.. 3 3 ..NNNGGGCCCNNNN.. 5 Digestion par Sma I 5 ..NNNCCC 3 ..NNNGGG GGGNNNN.. 3 CCCNNNN.. 5

Le nom des enzymes de restriction provient de la bactrie dont elles ont t isoles, par exemple Eco RI provient d'Escherichia coli souche R, le I signifie que c'est la premire enzyme qui a t dcouverte. Pour la bactrie, cette enzyme sert digrer le DNA des phages qui pourraient l'infecter. Les enzymes de restriction reconnaissent 4, 6 ou 8 bases. La frquence de reconnaissance sera dautant plus faible que le nombre de bases reconnues est lev. Une enzyme reconnaissant 4 bases coupera en moyenne tous les 44 bases soit tous les 256 nucleotides. De mme, une enzyme reconnaissant 6 bases coupera tous les 4096 nuclotides et une enzyme reconnaissant 8 bases tous les 65536 nuclotides. Il s'agit d'une moyenne, la suite de la coupure d'un ADN gnomique, on obtient une population de molcules dont la moyenne est de 256 bp pour une reconnaissance de 4 bases. Par contre sur un ADN petit tel qu'un plasmide on aura des bandes bien individualises aprs sparation sur un gel d'lectrophorse. On appelle isoschizomres des enzymes qui reconnaissent la mme squence et font la mme coupure mais proviennent de deux bactries diffrentes Comment transformer une extrmit cohsives, 5' sortante ou 3' sortante en extrmit franche ? Avec une DNA polymrase en prsence de deoxynuclotides, dans le cas d'une extrmit 5' sortante on aura une polymrisation et dans le cas d'une extrmit 3' sortante on aura une digestion par l'activit 3'5' exonuclase. Si on utilise des nuclotides marqus, dans les deux cas on aura un marquage des fragments d'ADN.

Cette dernire technique permet de marquer un fragment de restriction.

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Si la coupure donne une extrmit 5 sortante qui ADN coup par lenzyme derestriction Eco RI (G/AATTC) peut servir de matrice une ADN polymrase. En prsence dun nuclotide marqu, on aura 5 NNNNNNNNNNG 3 3 NNNNNNNNNNCTTAA 5 incorporation des nuclotides marqus en faisant toutefois attention quils correspondent la DNA polymrase squence de reconnaissance par la DNAse de dATP 32P restriction. 5 NNNNNNNNNNGAA 3 Si la coupure est franche, on utilisera un 3 NNNNNNNNNNCTTAA 5 polymrase ayant une activit 35 exonuclase, on aura alors remplacement du nuclotide situ en 3 Si la coupure est 3 sortante on aura avec la mme enzyme, digestion de lextrmit 3 simple brin et remplacement du dernier nuclotide hybrid en 3. Utilisation des enzymes de restriction. Il y a deux grandes utilisation des enzymes de restriction. La premire est la cartographie dun fragment dADN. On peut en effet identifier un fragment dADN grace sa carte de restriction, cest dire grace la position relative des sites de restriction. La deuxime utilisation est la construction. Un fragment de restriction peut tre recoll (ligu) un autre fragment dADN si les deux extrmit sont compatibles, cest dire prsentes les mmes extrmits cohsives ou des extrmits franches. b) Les RNAses Ces nuclases coupent lARN. Ce sont gnralement des enzymes extrmement stables. Quelques RNAses sont utilises en biologie molculaire : RNAse A : coupe aprs (en 3') les rsidus pyrimidique (C,U) en donnant un 3' phosphate sur l'ARN simple brin. RNAse T1: coupe en 3' de la guanosine donnant un guanosine 3' Phosphate Ces deux enzymes sont utilises pour dgrader lARN, pour squenc directement lARN ou pour couper les fragment dARN non hybrider de lADN. RNAse H: digre l'ARN dans un complexe ARN-ADN. On sen sert pour retirer lARN aprs avoir fabriquer un premier brin de cDNA laide de la reverse transcriptase. 3) Les ligases T4 DNA ligase Elle catalyse la formation d'un pont phosphodiester entre un 3' OH et un 5' phosphate, elle a besoin d'ATP et ions divalents Utilisation : ligation d'extrmits cohsives ou d'extrmits franches de fragments de restriction.

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Si les deux extrmits sont dphosphoryls, la ligation ne peut avoir lieu, par contre si une seule est dphosphoryle, la ligation a lieu sur un des deux brins, l'autre reste avec un nick. Gnralement les extrmits cohsives sont gnr par des coupures par des enzymes de restriction. Gnralement les extrmits seront gnrer par la mme enzyme mais ce nest pas obligatoire. Par exemple les enzymes BamHI (G/GATCC), Bgl II (A/GATCT) et MboI (N/GATCN) donnent des extmits cohsives qui peuvent tre ligatures. Toutefois aprs certaines ligations comme une extrmit BamHI et une extrmit Bgl II on ne pourra pas couper le produit par une des deux enzymes. T4 RNA ligase Catalyse la jonction entre un 5' phosphate d'un RNA ou d'un DNA simple brin avec un 3' OH (ions divalents et ATP) utilisation : - Marquage in vitro de l'extrmit 3' des ARN - Ligation d'un oligonucleotide sur un ADN simple brin 4) Les phosphatases et kinases Phosphatases catalysent le retrait du phosphate en 5'. T4 polynucleotide kinase Transfert le phosphate en de l'ATP sur le 5'OH de l'ADN (DS ou SS) ou sur l'ARN. Utilisation : marquage de l'extrmit 5' de l'ADN, marquage des oligonucleotides 5) Les mthylases Ls enzymes de restriction sont produites par des bactries pour se protger des phages. Pour que le DNA bactrien ne soit pas lui mme digrer, la bactrie produit aussi des mtylases spcifiques qui inhibent la digestion. Ainsi Eco RI ne coupe pas GAm6ATTC. On pourra utiliser ces mthylase pour inhiber la digestion sur un fragment. Les enzymes de restriction reconnaissant la mme squence, ne sont pas sensibles aux mme mthylation. On pourra donc dtecter des zones sur lADN qui sont mthyls en digrant avec deux enzymes, une sensible et lautre non. Les produits seront dposs sur un gel dlectrophorse et la digestion sera analyss aprs un Southern. Si la bande est dtecte uniquement avec lenzyme insensible la mthylation, on peut en dduire que la zone sonde est mthyle.

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II) Les vecteurs Rle d'un vecteur : capable de transporter l'ADN d'intrt (d'o le nom de vecteur), c'est un morceau d'ADN capable d'autoreplication . Il doit tre petit de faon a tre manipul in vitro Pour satisfaire ces deux exigences, on utilise soit des plasmides soit des virus, soit des petits chromosomes.

1) Les plasmides Les plasmides sont de petits morceau d'ADN circulaires, double brin que l'on trouve dans les bactries en dehors du chromosome. Ils se rpliquent grce aux enzymes prsents dans la bactrie. On est capable de les introduire dans une bactrie par des mthodes chimiques (CaCl2 ..) ou des mthodes physiques (lectroporation). C'est la transformation (notion diffrente de la transformation des cellules eucaryotes)

Les parties essentielles :


Sites de restriction (polylinker)

Une origine de rplication importante pour l'initiation de la rplication. Un site de restriction pour pouvoir insrer un fragment d'ADN (ce fragment d'ADN est souvent appell insert).

promoteur -galactosidase

LacZ

origine de rplication

vecteur

gne codant pour une rsistance un antibiotique

Un gne de rsistance aux antibiotiques : permet de slectionner les bactries ayant incorpors le plasmide de celles qui ne l'ont pas incorpor. La transformation est un vnement rare, il n'y a qu'un faible nombre de bactries qui sont transformes, il n'y a donc qu'un plasmide par bactrie. Si on isole cette bactrie et qu'on la fait pousser, on obtient un clone c'est dire un grand nombre de bactries identiques portant le mme plasmide. Par extension, le terme de clone est souvent donn au plasmide lui mme.

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les parties accessoires : Un polylinker ou site de clonage multiple. L'insertion d'un insert dans un plasmide lorsqu'il n' y a qu'un seul site de restriction n'est pas facile. En effet, l'insert n'est pas obligatoirement born par le site de restriction prsent sur le plasmide. De plus, le vecteur peut se recirculariser ( moins qu'on le dphosphoryle), l'insert n'est pas orient. Pour faciliter les clonages, on a ajout une squence prsentant une srie de sites de restriction les uns la suite des autres. A lorigine, pour fabriquer ces polylinker, on ajoutait par ligation une srie de petits oligonuclotides double brin contenant un ou plusieurs sites de restriction. Ces oligonuclotides ayant le nom de linker parce ce quon peut les utiliser pour ajouter de sites de restriction aux extrmits dun fragment dADN, les sites de clonage multiples ont pris le nom de polylinker. Un gne codant pour le peptide de la -galactosidase. Lorsqu'on veut insrer un fragment d'ADN dans un plasmide, on digre le vecteur avec un ou deux enzymes de restriction donnant des insert vecteur extrmits compatibles avec les extrmits de l'insert. Mais cette digestion ligase + ATP n'est jamais totale. On a donc dans la solution des molcules de vecteur non digrs. De plus, lors de la ligation des deux ADN, vecteur et insert, une partie du vecteur se recircularise. Si les deux extrmits sont compatibles et si la exemples de produits de ligation dphosphorylation n'a pas t totale. Aprs la transformation, on a donc des bactries qui ont un vecteur seul et des transforamtion selection par la rsistance lantibiotique bactries qui ont le plasmide recombinant. Pour trier ces bactries, on a insr le site de clonage l'intrieur d'un gne codant pour le peptide de la -galactosidase. Le clonage de l'insert cre une mutation par insertion, inactivant le peptide. Si le plasmide est introduit dans une souche dficiente pour le peptide , le vecteur seul permet la synthse de galactosidase par contre le vecteur plus l'insert ne le permet pas. Les deux colonies peuvent tre facilement tries en utilisant des substrats colors de la -galactosidase. De plus, si on clone un fragment d'ADN codant pour une protine, on a une chance sur trois que la phase de lecture de l'insert sera en concordance avec celle du peptide . Une fois sur six, on aura production d'une protine de fusion comprenant en N-terminal le peptide et ensuite le peptide cod par l'insert. Ce peptide pourra alors tre reconnu par un anticorps. Promoteurs de RNA polymrases.

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De chaque cot du site de clonage, on a souvent rajout les promoteurs de la T3 ou T7 RNA polymrase. On peut donc fabriquer des ARN sur des plasmides ouverts en aval de l'insert en incubant l'ADN avec la RNA polymrase en prsence de ribonuclotides. Ces promoteurs servent donc entre autre faire des sondes ARN ou pour faire des cRNA qui pourront tre traduit in vitro. Plasmide d'expression

2) Les phages Le phage Ce phage est un des modles de laboratoire au mme titre que la souris, la drosophile ou le nmatode Caenorhabditis elegans. Les connaissances accumules sur ce phage ont permis de l'utiliser comme vecteur. C'est un virus ADN double brin, linaire de 50 kb avec ses deux extrmits 12 nuclotides simple brin complmentaires (extrmit cohsives ou cos). Il se fixe sur le rcepteur lamB qui permet l'absorption de maltose par la bactrie, seul l'ADN rentre dans la bactrie. A l'entre dans la bactrie, les extrmits cohsives s'hybrident et l'ADN est lig par une ligase d' E. coli. L, il y a deux possibilits soit un cycle lysognique avec intgration de l'ADN du phage dans le gnome soit un cycle lytique. C'est ce cycle lytique qui est utilis dans les vecteurs. On incube donc une solution de phage avec une solution de bactrie, aprs une quinzaine de minutes, les phages sont rentrs dans les bactries et on tale la solution comportant des bactries dont certaines ont incorpor un phage sur un milieu de culture solide, dans une boite de ptri. Le phage lyse la bactrie, puis attaque les bactries les plus proches par diffusion. Lorsque la culture arrive confluence, en l'absence de rcepteur, les phages ne peuvent plus attaquer les bactries. On obtient un tapis bactrien avec une plage de lyse correspondant la descendance d'un seul phage, un clone. Le phage en tant que vecteur : Dans le phage , la longueur de 50 kb est importante pour l'empaquetage mais 20 kb au milieu ne sont pas importants pour le cycle lytique. Pour l'utiliser en tant que vecteur on retire ces 20 kb et on insre la place le fragment d'ADN d'intrt. On a donc un bras gauche 20 kb et un bras droit 10 kb. Pourquoi peut-on utiliser le phage comme vecteur ? 1) on dispose d'un moyen trs efficace pour faire rentrer l'ADN dans la bactrie en effet un virus rentre toujours plus facilement qu'un ADN dans une cellule. Il faut toutefois faire au pralable un empaquetage in vitro qui consiste rassembler dans un tube l'ADN, la tte et la queue du phage. 2) on peut facilement slectionner les recombinants des vecteurs sauvages, non recombinants, n'ayant pas intgr d'ADN. par plusieurs mthodes: Physique : si on purifie les bras droit et gauche, ils sont trop petits pour tre insrs dans la capside qui n'admet que des faibles variations (40-55kb). La purification des bras s'effectue par centrifugation zonale, les brins d'ADN ont en effet la mme densit mais des masses diffrentes.

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Gntique: on peut toujours avoir les 20 kb d'origine si la purification des bras n'a pas t bien faite. Plusieurs gnes ont t utiliss pour viter cela, visant trier les non recombinant dans un cycle lysognique et les recombinants dans un cycle lytique. Par exemple lors d'un clonage avec un phage contenatn dans sa partie centrale le gne cI, les non recombinants sont lysognes (dans une souche hfl, high frequency of lysogenization) et les recombinants rentrent dans un cycle lytique. Utilisation du phage : principalement pour faire des banques, on profite ainsi des plage de lyse quil est plus facile cribler que des colonies. Le phage M13 C'est un bactriophage de 6.4 kb, ADN simple brin. Il infecte seulement les bactries qui expriment le pilus sexuel cod par le facteur F, il pntre par le pilus, la capside est retire et l'ADN est transfr dans le corps principal de la bactrie. Ce brin d'ADN (appel brin +) est alors converti par les enzymes de la bactrie en double brin circulaire appel RF DNA (forme replicative). A la fin de linfection il y a une rplication par rolling circle qui produit du simple brin (voir plus loin). Tous les gnes sont essentiels mais on peut insrer un fragment d'ADN dans la forme rplicative. Un polylinker a t introduit avec la squence codante pour le peptide de la galactosidase comme pour les plasmides. Utilisation : lorsqu'on a besoin d'ADN simple brin, squence (mthode enzymatique), mutagense, fabrication de sonde sens spcifique... 3) Systmes hybrides Les trois vecteurs vus jusqu' prsent ont chacun leur avantage, les plasmides sont faciles manipuler, le phage M13 permet d'obtenir de l'ADN simple brin et le phage permet une transforamtion efficace des bactries. Plasmide + M13 = phagemide : On peut utiliser introduire une origine de rplication simple brin dans un plasmide, on obtient un phagemide (comme la plupart des plasmides ont maintenant une origine de M13, cette dernire appellation tombe en dsutude) Le phagemide est un plasmide qui contient l'origine de rplication de M13 avec le site de coupure de la protine du gne II. On les cultive comme des plasmides mais si on veut du simple brin on infecte la bactrie avec un M13. Le M13 produit toute les protines pour la rplication en simple brin et l'encapsidation si bien que les deux ADN, du M13 et du plasmide sont encapsids. En purifiant le virus on obtient les deux ADN. Pour obtenir une plus grande quantit de simple brin du plasmide par rapport celui du phage on utilise un phage mut dans la zone de coupure par la protine du gne II. On appelle ces phages Helper.

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Plasmide + phage = cosmide : On ajoute deux extrmits cos un plasmide. Si on clone dans ce plasmide un grand fragment d'ADN (d'environ 45 kb) de telle faon que plasmide et insert font 50 kb, cet ADN pourra tre encapsid in vitro dans le phage . Il pourra donc tre introduit avec une grande efficacit dans la bactrie. Par contre une fois l'intrieur, il se rpliquera comme un plasmide. Les extrmit cos permettent donc de slectionner les recombinant avec de grands inserts (45 kb) et introduire leplasmide dans la bactrie.

Sites de clonage multiple

promoteur -galactosidase

origine de rplication

cosmide

cos cos

LacZ

gne codant pour une rsistance un antibiotique

Plasmide + phage + phage M13 = Zap : On a ici un hybride entre trois vecteurs.

4) Les chromosomes YAC (Yeast Artificial Chromosome) Qu'est ca qui est important dans un chromosome : le centromre pour la sgrgation, une origine de rplication et le tlomre. Si on garde ces trois parties on a un vecteur. Ces vecteurs ont t mis au point chez la levure, organisme eucaryotes pour lesquels on connat des origines de rplication. Ces vecteurs permettent de cloner de trs grands morceaux d'ADN de 200 500 kb. Le systme de slection pour la levure est le plus souvent diffrent de ceux utiliss pour les bactries. On peut utiliser soit des rsistances des drogues soit des complmentations (URA3, LEU2). III) l'hte On utilise gnralement une bactrie (E. coli) parce qu'elle a un temps de gnration court (20 mn. 37C), parce qu'il a t possible d'obtenir des mutants incapables de vivre hors dun laboratoire et parce que les tudes gntiques nous ont permis d'obtenir certains mutants utiles. On utilise plusieurs souches en fonction des besoins Des souches dans lesquelles l'ADN pntre facilement pour faire les banques ou les clonages. Des souches dficientes pour le peptide de la -galactosidase. Des souches qui possdent des pili sexuels, structures extracellulaires grce auquel les phages tels que M13 peuvent entrer. Des souches dficientes en certaines protases lorsque le but est de produire des protines Des souches incorporant de l'uridine la place de la tymidine dans l'ADN. etc.... Il existe plusieurs mthodes pour faire rentrer un ADN dans une bactrie. On peut utiliser un phage.

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On peut faire rentrer lADN directement par des mthodes physiques (choc electrique) ou chimique (traitement au CaCl2). On traite les bactrie de faon les permabiliser. De telles bactries sont dites comptantes.

IV) les oligonuclotides On peut synthtiser des oligonuclotides de squences connues jusqu environ 50 mer. La synthse seffectue de 3 vers 5 ( linverse des synthses enzymatiques) sur un support solide. Lextrmit 5 de la chaine en cours dlongation est dprotge, et est couple avec un nucltotide dont lextrmit 5 est protge. Il y a ainsi addition dune seule base. Le nuclotide est limin, lextrmit 5 de la chaine est dprotge et la chaine est couple avec la base suivante. Dans certains cas on utilise des oligonuclotides de squence variable (par exemple pour faire du marquage par random priming). Dans ce cas on ne les synttise pas, on coupe aux ultrasons de lADN, on chauffe pour le dnaturer et donc sparer les deux brins puis on purifie les produits de la coupure selon leur taille par chromatographie ou lectrophorse.