INSTITUT SUPERIEUR DES SCIENCES BIOLOGIQUES APPLIQUEES DE TUNIS

Rapport de TP Microbiologie de lenvironnement

Souilem Abir
3me TVR

2013-2014

I.

Echantillonnage partir de lenvironnement :

Type de lchantillon : Sol. Outils de prlvement : tarire agricole, une sonde, une cane, pelle, cuillre ou louche en plastique. Mode opratoire : prlever un chantillon de sol (tarire manuelle) puis mettre dans un sac en plastique striles. Conserver lchantillon dans un bloc rfrigrant en 4C assure leur intgrit. Protger contre la lumire. Transporter au laboratoire dans les plus brefs dlais.

II.

Isolement des microorganismes partir dun chantillon de sol :

Lisolement est ralis partir 3 tapes (Dilution, Etalement, Purification) Principe : Dilution en srie de lchantillon et chacune des dilutions est tale la surface dun milieu glos, pour le dnombrement des colonies aprs lincubation puis la purification. Matriels : Balance analytique, 4 tube de disque, pipette gradue, bec bunsen (matriel de strilisation), boite de ptri, Etaloir, eau distille, eau de javel. Mode opratoire : Peser 1g dchantillon de sol, mettre dans un tube en verre constituant 10ml deau distille, ensuite agiter bien le tube. Dilution : Dboucher le tube 1 et prlever strilement 1ml de liquide avec la pipette. Passer rapidement l'ouverture du tube 1 la flamme avant de le refermer. Ouvrir le tube 2 (contient 10ml deau distille) et dposer la goutte prleve dans le tube 1. Passer l'ouverture du tube 2 la flamme avant de le refermer. Recommencer toutes ces oprations avec les tubes 3 et 4.

Ensemencement des boites de ptrie : Ensuite avec une pipette passe la flamme, on prlve 0,2 0,3 ml dans le tube de culture et on dpose le liquide dans la bote de ptrie. A l'aide de l'taloir pass lui aussi la flamme, on rpand le liquide sur toute la surface de la glose. (Faire tourner la bote). Refermer la bote sans poser l'taloir sur la paillasse. Ne pas le passer la flamme mais le mettre directement dans l'eau de Javel. Recommencer toutes ces oprations avec les autres tubes

Dnombrement :

Aprs lincubation, en choisissant la boite de ptrie qui contient entre 30 et 300 colonies. Purification et conservation des isolats :

Aprs dnombrement, utiliser la technique disolement par strie sur glose coule dans la boute de ptrie pour isoler les bactries du mlange et permettre de les identifier. Les souches pures sont conserves soit 4c (on prend une colonie bien isole pour une priode ne dpasse pas six mois) soit 80C (la dure de conservation dpasse un an)

Rsultat : Observation macroscopique :

On observe des zones transparentes ce qui montre la sensibilisation de la souche.

Recherche des enzymes : Catalase, oxydase, DNase, test glotinase, test urase, test caseinase, test amidon Testes physiologiques : La rsistance de la souche diffrentes tempratures et diffrentes concentration de NaCl.

Caractrisation molculaire :

III.

Extraction dADN gnomique : 1. Dfinition :

Lextraction de lADN est une technique permettant disoler lADN de cellule ou tissus. Lextraction dADN utilis pour le squenage, PCR, clonage. Il existe diffrent protocoles pour extraire lADN : Lyse des cellules Elimination des protines Elimination des autres acides nucliques (ARN.) Concentration de lADN par prcipitation lalcool

2. Extraction dADN gnomique partir dun chantillon de sol :

Peser 1g de sol, mettre dans tube flacon Ajouter 4ml de tampon de lyse avec quelques billes en verre Tampon de lyse : Tris HCl : (Ci=1M ;Cf=50mM ;Vi=1ml) EDTA : (Ci=0,5M ;Cf=20mM ; Vi=0,8ml) SDS : (Ci=10% ; Cf=1 ; Vi=2ml) Eau : (V=16.2ml) Avec Ci.Vi=Cf.Vf Vf=20ml Agiter puis incuber 70C pendant 20min (chaque 5min on fait lagitation) Centrifuger 5000pm pendant 10min Transfre 2ml de surnageant dans un Tube Eppendorf Ajouter 1/10 de volume Actate de potassium (prcipitation des protines) Centrifuger 1200pm pendant 10 min Ajouter volume Isopropanol (prcipitation dADN) Transfrer le surnageant dans un nouveau tube Incuber -20C pendant 15mn Centrifuger 2000pm pendant 10min Laver le culot avec Ethanol 70%( viter linhibition dADN) Scher lADN et faire suspendre dans le Tube Eppendorf

IV.

La technique damplification in vitro PCR : 1. Dfinition : PCR polymrase chain reaction (la raction en chaine par polymrase) est une
technique qui permet damplifier ADN ou ARN in vitro en utilisant la Taq polymrase

2. Principe de la raction PCR :

Connaitre deux fragments qui encadrent le gne ADN Synthse se squence complmentaires (Amorce) ADN commence la synthse des brins complmentaires grce aux amorces (nombres de copie de squence ADN es doubl pour chaque rplication)

 Pour synthtiser le brin complmentaire : Le mlange ractionnel :

Est ralis dans un volume rduit (25l). dans ce mlange, on ajoute lADN matrice (0.2l), un Tampon PCR (2.5 l), MgCl2 (catalyseur)(2.5 l), les desoxyribonuclotides (dNTP)(0.2 l), Oligonuclotides amorces(0.5 l), Taq polymrase(0.5) et leau(17.5l).

Raction PCR dans le thermocycleur :

Les micro-tubes contenant le mlange ractionnel sont mis dans un thermocycleur o ils vont tre soumis plusieurs cycles de tempratures diffrentes permettant de contrler la polymrisation des copies du fragment dADN cible.

Cycles de tempratures :
1Cycle : Dnaturation initial : 95C pendant 4 minutes pour sparer les deux brins. N Cycles : (variable le nombre de cycle) Dnaturation : 95C pendant une minute ADN doubles brin se dnaturent en ADN simple brin car les liaisons dhydrognes ne peuvent pas se maintenir une temprature suprieure 80C Hybridation : la temprature diminue jusquelle atteint 55C, cette temprature va reformer les liaisons dhydrognes et hybrider les bris complmentaires (pendant 45 secondes) Elongation : 72C pendant une minute, la taq polymrase se lie aux ADN monocatnaire amorcs et catalyse la rplication en utilisant dTNA prsent dans le mlange ractionnel, donc double le brin complmentaire. 1cycle : Elongation final : 72C pendant 7minutes, il est recommand de rajouter un cycle final dlongation, notamment lorsque la squence dintrt est de grande taille (suprieure 1 kilobase). Le thermocycleur devient un rfrigrateur 4C pour stabilise les proprits de lADN.

Thermocycleur :
Appareil qui comporte un bloc chauffant o lon dpose les tubes chantillons (contient un mlange ractionnel soumis des cycles de temprature) et dont la quelle la temprature peut varier trs rapidement et prcisment de 0 1000C par leffet Peltier. Permet la programmation de la dure et la succession des cycles de Palier de temprature

Chaque cycle comprend 3 priodes de quelque dizaine de seconde.

V.

LA technique ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analyses): Dfinition de la technique ARDRA :

ARDRA ou lAnalyse des fragments de restriction dADN ribosomique amplifi, cette technique permet danalyser les fragments de restriction dADNr16S amplifi grce aux diffrences de longueur de fragments de restriction qui sont spares par lectrophorse sur gel dagarose. ADN amplifi est digr par enzyme de restriction.

Dfinition dune enzyme de restriction :

Enzyme de restriction est une protine en biologie molculaire qui peut couper un fragment ADN au niveau de squence de nuclotide site de restriction

Proprits des enzymes de restriction :

Ces enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester en deux nuclotides lintrieur de la chaine acide nuclique. Les endonuclass diffrent des exonuclases, puisquelles peuvent cliver les brins dADN de manire interne, alors que les exonuclases nattaquent la molcule dADN quau niveau de ses extrmits.

Protocole de restriction enzymatique :

Pour la raction de digestion enzymatique ARDRA des gnes ADNr16S de volume final 20l on met : eau (13.7l), tampon 10X (1l) et le produit PCR (9l) puis on ajoute lenzyme (0.3l) agiter le tube rapidement et incub 37C pendant une nuit la raction est stoppe -20C

Les rsultats de la digestion sont ensuite visualiss sur gel dagarose.

VI.

Migration dADN sur gel dagarose :

1. Dfinition du gel dagarose :

Gel dagarose utilis pour lanalyse des produits de digestion ARDRA, PCR... Permettant la sparation de fragments dADN de grandes tailles.

2. Prparation du gel dagarose :

Fondre 2% dagarose dans 120 ml de tampon TAE, au four micro-onde (2 3 min.) Attendre la dissolution de lagarose : le gel devient translucide, Laisser refroidir jusqu 50-55 C.

Couler les 120 ml de gel dans le plateau de moulage. Laisser le gel se solidifier 15 min. temprature ambiante Mlanger le colorant de charge et lADN sur un morceau de parafilm et prlever le mlange avec une micropipette rgle sur le volume appropri en changeant de cne chaque prlvement. Remplir les puits en faisant attention de ne pas dchirer le fond du gel avec la pointe de la pipette. Placer le support avec le gel charg dans la cuve d'lectrophorse en positionnant les puits du ct de la cathode (ple noir). Remplir la cuve de tampon TBE (rutilisable plusieurs fois) en versant dlicatement et trs lentement lorsque le gel commence tre recouvert pour viter les fuites dADN vers le tampon. Fermer la cuve, brancher les fils et mettre sous tension. Laisser migrer jusqu ce que le colorant de charge arrive proximit du bord du gel (environ 55 min 100 V pour un gel de 80 mm dans une mini cuve). Couper lalimentation, dbrancher les connections et rcuprer le gel dans son support.

Aprs la migration d'lectrophorse, le gel est clair sous ultraviolet afin d'observer les bandes d'ADN fluorescente. On trouve : des profiles identiques mme souche : de mme bondes. des profiles diffrents souches diffrentes : les bondes diffrentes taille et de nombre diffrents.

des bondes non digrer. Profil illisible : on ne peut pas dterminer les bandes et la souche.