Universit Mohammed V Facult des Sciences

Agdal Rabat

SVI S3

Cours de
Microbiologie Gnrale
Prpar par
Pr El Bekkay BERRAHO
Automne 2009
Laboratoire de Microbiologie et Biologie Molculaire, B.P. 1014, Rabat Maroc.
Tl. (212) 37 77 54 61, e--mail: berrahobek@hotmail.com
 Introduction
I. Historique
Dcouverte rattache l'invention du microscope
Le hollandais Antony Van LEEUWENHOEK (1632-1723)
(1632
1. L'poque pasteurienne Louis PASTEUR (1822-1895)
(1822
Chute de la thorie de la gnration spontane
Vapeur

Infusion de foin Couder le col du ballon Strilisation du milieu

frachement prpare Sous leffet de la chaleur Par la chaleur
(milieu de culture)
 Poussire Extrmit ouverte

Aprs un temps trs long

(plusieurs annes)

Refroidissement de linfusion Liquide reste strile

Aprs un temps trs cout

(quelques heures)

Contact entre poussire Dveloppement des

et liquide strile microorganismes

- -organismes existent partout

Conclusions:
- Strilisation / chaleur humide
 Pasteur et les fermentations (1857-1877)
Micro-organisme globuleux
Micro
1857: f. lactique: sucre Acide lactique
plus petit qu'une levure

levures
1860: f. alcoolique: sucre Ethanol, glycrol
+ CO2
Vibrions
1861: f. butyrique: sucre Acide butirique
(-O2 )
anarobiose

1866-1876: Maladies du vin et de la bire pasteurisation

La bactriologie mdicale

Louis Pasteur et Robert KOCH (1843-1910)

(1843

Maladie du charbon Bacillus anthracis

Mise au point des techniques d'isolement et d'identification sur

milieu de culture solide
 La vaccination (1880 1885)
- 1880: cholra des poules,
- 1881: maladie du charbon,
- 1885: la rage (Joseph Meister : 1er tre humain vaccin contre la rage

2. Lpoque actuelle
Il y a longtemps: microbiologie = tude des microbes

Actuellement: microbiologie = tude de tous les micro-organismes

micro
(les algues, les protozoaires, les champignons et les bactries)

Reproduction rapide populations normes et homognes

- tudes gntiques
outil privilgi
- tudes biochimiques

naissance de la gnie gntique et des biotechnologies

II. Place des -organismes
organismes dans le monde vivant
1. Classification contemporaine
les animaux

les vgtaux
- les algues,
- les protozoaires,
les protistes: englobent tous les -organismes
- les champignons,
- les bactries
Selon l'organisation cellulaire, les protistes se subdivisent en:

Protistes suprieurs ou eucaryotes ( cellules volues) :

- les algues (sauf les algues bleu-vert)
bleu ,
- les protozoaires,
- les champignons

Protistes infrieurs ou procaryotes: (cellules de type rudimentaire)

- Les algues bleu-vert
vert ou Cyanophyces
- les bactries


phylogntiquement procaryotiques eucaryotiques

Archbactries Archobactries

les virus: organismes acellulaires parasites obligatoires

2. Comparaison entre cellules eucaryote et procaryote
Comparaison entre les cellules Procaryote et Eucaryote
Proprits Procaryotes Eucaryotes
Algues, champignons, protozoaires
Groupes Bactries, archobactries
plantes, animaux
Taille Diamtre < 2 m 2 m < diamtre < 100 m
Structure nuclaire:
- Membrane nuclaire Absente Prsente
- Nucloles Absents Prsents
- Chromosome Unique Plusieurs
Association DNA-histones Non Oui
- prsence d'autre ADN Plasmidique Mitochondriale et chloroplastique
- Division cellulaire Amitose Mitose
- Recombinaison gntique Partielle Totale
Structure membranaire et cytoplasmique:
- Membrane plasmique Prsente Prsente
- Mitochondries Absentes Prsentes
- Chloroplastes Absentes Prsentes
- Ergastoplasme Absent Prsent
- Appareil de Golgi Absent Prsent
- Ribosomes 70 S 80 S
 Proprits Procaryotes
Prsente
- Paroi
(compose de peptidoglycane)
Systme respiratoire: Membrane cytoplasmique
chromatophores ou chlorosomes
Photosynthse:
(systme membranaire interne)
- pas de mouvement amibode
Mobilit (paroi rigide).
- mouvement flagellaire
Eucaryotes
- Absente
chez animaux et protozoaires;
- Prsente
chez plantes, champignons et algues
(polysaccharides)
Membrane mitochondriale
chloroplastes
- Mouvement amibode
(eucaryotes sans paroi).
- Mouvement flagellaire.
 La cellule bactrienne
I. Morphologie bactrienne
1. Les coques (Cocci):

Selon le plan de division:

diplocoques
1
Streptocoques
Streptococcus

1 Tetrades
2
1 3 Grappes
de
2 raisin

Staphylococcus aureus

Staphylococcus
 2. Les btonnets:
- Btonnets droits =
Bacilles
Rhodospirillum sodomense
Regroupements:

Bacilles isols

Diplobacilles
Bacillus subtilis

Streptobacilles

Lactobacillus delbrueckii
 - Bacilles incurvs:

3. Les formes spirales:

Vibrio cholerae

Treponema pallidum

Spirochaeta zuelzerae
II. Paroi bactrienne

Enveloppe caractristique des procaryotes

Rigide "exosquelette"

Maintient de la forme Division cellulaire

Rsistance la forte P.O.i

Permable l'eau et aux Support de nombreux

petites molcules antignes

Peptidoglycane Gram + Gram -

1. Composition chimique

a- Les osamines (sucres amins)

La N-actylglucosamine  L'acide N-actylmuramique

CH 2 OH CH 2 OH

H O OH H O OH

OH O
HO H HO H

H
H NH C CH 3 NH C CH 3
H3C CH COOH
O O

 La galactosamine:
galactosamine
Existe chez certaines espces seulement et en faible quantit
b- Les acides amins
COOH

H C NH2
COOH COOH CH 2
NH 2 C H H C NH 2 CH2
CH 3 CH 3 COOH

L-Alanine D-Alanine
Alanine Acide D-Glutamique

COOH COOH COOH

NH 2 C H NH 2 C H H C NH 2

CH 2 CH2 CH 2

CH 2 CH2 CH 2
CH 2
ou CH2 CH 2

CH 2 NH 2 CH NH 2 CH

NH 2 COOH COOH
( Meso) (L)

L-Lysine Acide Diamino-Pimlique

Diamino (DAP)
 Glycine Staphylococcus aureus

Acide aspartique Lactobacillus acidophilus

c- Les acides teichoques

uniquement chez les bactries Gram+

localiss l'extrieur de la paroi

peuvent avoir un rle antignique.
 - Polyribitol phosphate
(Staphylococcus aureus) CH 2OH
O
CH2
H O O CH
OH HC OH Ribitol
HO H
HC OH
H NH CH2
CO O
CH3 o= P OH
O
N actyl CH2
Glucosamine
HC OH 2HN
HC OH CH CH3
Ribitol
HC O CO
CH2
D-Alanine
O
O =P OH
O
CH2
H O
O O
OH
H
H NH CO CH3

N-Actylglucosamine
(liaison au peptidoglycane)
b- Polyglycrol-phosphate
(Bacillus subtilis)
O
CH 2 OH
CH 2
H O O CH Glycrol
OH CH 2
HO H
O
H OH O P OH
Glucose O 2 HN
CH 2 CH CH 3
Glycrol HC O CO
CH 2
D-Alanine
O
O P OH
O
CH 2
H O
O O
OH
H

H NH CO CH 3

N-Actylglucosamine
(liaison au peptidoglycane)
 d- Les oses simples
Glucose Galactose Mannose, etc
Certains sont spcifiques (Rhamnose chez les Streptococcus du groupe A)

Leurs nature et type dassociation spcificit des antignes

e- Les lipides
faibles quantit chez les Gram- (10 22%)
presque absents chez les Gram+ (1 2,5%).

f- Les acides mycoliques

prsents chez certaines espces particulires (les mycobactries)
acides gras longues chanes (C=60)
(C= Ex. Acide -mycolique
CH CH OH
O
CH3 (CH2)17 CH CH (CH2)10 CH CH (CH2)17,19 C CH C
OH
H (CH2)23
CH
g- Comparaison de la composition chimique globale de la paroi chez
les bactries Gram + et les bactries Gram -

Gram + Gram -
1. Osamines Abondants Peu

2. Acides amins 24 - 35 % 50 %

Nombre 4 10 16 17

DAP Prsent sans lysine Prsent avec lysine

Acides Teichoques Prsents Absents

Oses 20 60 % 20 60 %

Lipides 1 2,5 % 10 22 %
2. Structure molculaire
- Murine
Le peptidoglycane - Mucocomplexe
- mucopeptide

Lunit structurale du peptidoglycane, un

u glucosaminopeptide
Glycane
La N-actylglucosamine L'acide N-actylmuramique
CH2OH CH 2 OH

O H O OH
H
O O
OH
HO H (1-4)
4) H
H
H NH C CH3 NH C CH 3
CH CH 3
O O
C=O
L-Alanine
Acide D-Glutamique
D
Chanon peptidique
Lysine ou DAP
D-Alanine
L'acide N-actylmuramique joue un rle central dans la polymrisation
des units glycanes

G La N-actylglucosamine

M L'acide N-actylmuramique
Chanon peptidique
Liaison interpeptidique
Structure en rseau du peptidoglycane
Cette structure de polymre en rseau, qui donne la cellule sa
rigidit, est caractrise par:

les (1,4) entre l'acide N-actylmuramique

actylmuramique et la N-ctylglucosamine
N

l'ordre invariable des acides amins qui forment le ttrapeptide

la liaison -glucosidique qui unie chez les Gram+, l'acide

teichoque au rsidu N-actylglucosamine
actylglucosamine

le pontage entre la D-alanine d'un ttrapeptide et la L-lysine ou

le DAP d'un ttrapeptide voisin
Le peptidoglycane peut diffrer selon les cas par des constituants
secondaires, en particulier par:

les acides amins du tetrapeptide

la nature des ponts interpeptidiques

Cette dernre diffrence dtermine un rseau plus ou moins serr (compact):

 Compact pour les forme bacillaires (liaisons interpeptidiques directes).

Pont

L-ala
D-glu
T DAP
D-ala
D
D-ala DAP Escherichia . Coli
D--glu
L--ala
 Lche pour les formes sphriques (liaisons interpeptidiques longues),
Pont

L-ala L-ala
D-glu L-lys-D-glu
L-lys (Gly) D-ala L-lys D-ala L-lys D-glu L-alaD-ala
D-ala 5L-lys D-ala L-lys L-lys
D-glu L-lys-D-glu
L-ala L-ala

Staphylococcus aureus Micrococcus lysodeikticus

 3. Diffrences structurales entres les parois des bactries
Gram + et Gram -

En microscopie lectronique:

Nette diffrence structurale entres les

parois des bactries Gram + et Gram -

Chez Gram + : paroi paisse (15 80 nm),

aspect homogne.

Chez Gram - : paroi fine (6 15 nm),

aspect stratifi et htrogne.
a. Chez les bactries Gram+
Les acides teichoques : deuxime composant essentiel de la paroi des
bactries Gram+ ( 50% du PS de la paroi et 10% du PS de la cellule totale).

Leur localisation exacte au niveau des enveloppes est mal connue.

Acides tchoques

Paroi
Acides lipotchoques

Mem; cyt
Reprsentation des acides tchoques
Chez les Gram+ selon le modle de
Van Driel et al. (1971)
 b. Chez les bactries Gram -
En plus du peptidoglycane, on insiste sur la prsence de 2 autres couches
b.1. Lespace priplasmique ou priplasme
bactries Gram+ : Exoenzymes (Protases) (Pnicillinase)
(Colicines) (Exotoxines)

Bactries Gram- : Priplasme retient les protines labores

dans le cytoplasme:

 Un rle dans la dgradation des molcules venant de l'extrieur

(nuclases, phosphatases, pnicillinases...);
pnicillinases

 Un rle dans le transport de certaines substances nutritives vers

l'intrieur de la cellule (protines de liaisons ou binding proteins);

 certaines protines peuvent tre impliques dans la chimiotaxie

b.2. La membrane externe
b.2.1. des protines majeures:

70% des protines de la membrane externe;

groupes pour former des pores porines
traversent toute la membrane externe et sont fortement lies au
peptidoglycane;
transport des molcules de PM < 600 da; sans spcificit mais de
prfrence les molcules neutres et les cations.

b.2.2. des protines mineures:

transport spcifique de petites molcules incapables de passer

travers les porines (ex. la vitamine B12, les nuclosides ou les
oligosaccharides comme le maltose);
maltose)

servent aussi de rcepteurs pour des bactriophages (ex. Lam B est

spcifique au transport du maltose et la fixation du phage ).
b.2.3. Les lipoprotines

protines lipidiques libres ou fortement lies au peptidoglycane

Ex. lipoprotine de Braun

petite molcule polypeptidique de 58 acides amins, portant son

extrmit N-terminale des constituants lipidiques

Chez E. coli 7.5 105 lipoprotines/cellule dont les 2/3 sont l'tat
libre et le 1/3 sont lies au peptidoglycane.

La partie lipidique est enchsse dans la membrane externe par

des liaisons hydrophobes avec les phospholipides,

La partie protinique est associe au peptidoglycane par des

liaisons covalentes au niveau du DAP du chanon peptidique.
Les lipoprotines assurent une cohsion solide de l'ensemble de la
structure.
b.2.4. Les lipopolysaccharides (LPS)

LPS = Endotoxines

. lipide A:
considr comme le support de la toxicit,

le lipide A est un glycophospholipide c--d

c polymre compos de:

 units disaccharidiques de glucosamine relies entre elles par des ponts

pyrophosphates;

 longues chanes d'acides gras parmi lesquelles on note la prsence

constante de l'acide -hydroxymyristique
hydroxymyristique (un acide gras en C14)
spcifique et caractristique du lipide A.
 . Le polysaccharide du LPS:

core (partie centrale du LPS),

Composition en sucres variable selon les espces. Cependant on y trouve
toujours un sucre particulier en C8, le ctodsoxyoctonate (KDO).
- cinq hexoses,
Ex. chez Salmonella, le core est compos de - deux heptoses
- trois KDO.

Chane latrale du LPS

chaque chane contient les mmes squences rptitives (jusqu 40);
chaque squences est constitue de 3, 4 ou 5 sucres ;
chez les entrobactries, cette chane latrale est appele antigne O;
- Galactose
cet antigne O comprend quatre hexoses: - Glucose
- Rhamnose
- mannose.
 Diffrences structurales entres les parois
des bactries Gram + et Gram -
Acides tchoques Sucre
Heptose
Antigne O
Ctodesoxy
Prot. Majeures Octanate (KDO)
Peptidoglycane (Porines) LPS
Phosphate
Lipoprotine de
Braun N-Actyl
Core Glucosamine

Acides gras
Lipide A
Paroi
Membrane

Espace
priplasmiq

Phospholipides
Protine Protine
intgrale priphriques

Gram + Gram -
c. Autre types de paroi

 Chez les entrobactries, les trois feuillets paritaux sont

intimement souds l'un l'autre.

 Par contre chez les bactries spirales Spirochtes

 Chez les Archobactries, l'lment structural de la paroi est un

pseudopeptidoglycane.

N-actyl D-glucosamine
glucosamine ou N-actyl
N D-galactosamine
-1,3
N-actyl D-Talosaminuronique
Talosaminuronique
Les tetrapeptides associes comprennent l'alanine (L et D),
l'acide glutamique et la lysine.
lysine

 Chez les mycobactries Mycobacterium tuberculosis

les acides mycoliques
 4. Fonctions de la paroi
a. Maintient de la forme et rsistance la POi Lyzosyme
Bacillus subtilis
Gram +

+
Lysozyme
( dtruit les (1-4))
Milieu Milieu isotonique
hypotonique (1 de saccharose)

Gonflement et clatement
de la cellule

Cellule sphrique sans

Paroi = Protoplaste
NB. le protoplaste a perdu ses proprits antigniques,
ne fixe plus les bactriophages et ne se divise plus
Rgnration
 Escherichia coli
 Gram -

+
Lyzosyme
( dtruit les (1
(1-4))
Milieu Milieu isotonique
hypotonique (1 de saccharose)

Gonflement et clatement
de la cellule

Cellule sphrique avec fragments

de paroi = Sphroplaste

NB. le sphroplaste conserve toutes les proprits de la cellule initiale.

 diffrence entre protoplaste et sphroplaste est logique: lysozyme agit au
niveau des (1,4) du peptidoglycane.

 rle de la paroi: forme de la cellule et rsistance la POi

 Le peptidoglycane ne joue aucun rle dans les proprits antigniques, la

division cellulaire et la fixation des bactriophages

b. Proprits antigniques

 Chez les bactries Gram+:

les acides teichoques ou leurs sous-units
sous osidiques constituent les
principaux antignes

Chez les streptocoques, deux catgories d'antignes ont t isols:

b Des antignes de nature polyosidiques: appels antignes C

Classification antignique de LANCE-FIELD

LANCE qui a dfinit plusieurs
groupes srologiques: A, B, C, D, E, ... O

Chaque groupe est caractris par un antigne C compos de un ou de

plusieurs polyosides diffrents.

Exemples:

 le groupe srologique A streptocoques pathognes pour l'homme

Le rhamnose
antigne C
La N-actyl glucosamine

 le groupe srologique G
Le rhamnose
antigne C
La N-actyl galactosamine
b Des antignes de nature protiques: appels antignes M, T, R

La protine M importante sur le plan srologique et physiopathologique.

Elle permet de diffrencier l'intrieur du groupe A, 56 types

srologiques.

Donc

Un groupe srologique = ensemble de bactries ayant le mme antigne C

Un type srologique = ensemble de bactries ayant le mme antigne C

et une protine M identique
 Chez les bactries Gram - :
La plus part des Enterobacteriaceae, les Salmonella en particulier,

un antigne somatique O
Deux principaux antignes:
un antigne flagellaire H

La spcificit antignique dpend de la nature des sucres ainsi que de

leur mode de liaison.

En se basant sur la diversit des facteurs O et H, KAUFFMAN et

WHITE ont pu classer les Salmonella en groupes srologiques puis en
srotypes.
Exemple:

Le groupe srologique D regroupe toutes les souches de diffrentes

espces de Salmonella ayant en commun l'antigne O9.

Ce groupe srologiques se subdivise son tour en srotypes

( selon la diversit de lantigne H)

c. Fixation des bactriophages

Proprit lie la paroi o sont localiss les rcepteurs spcifiques.

Chez les bactries Gram-,, les rcepteurs sont en majorit des

protines mineurs de la membrane externe.

Chez les bactries Gram+, rcepteurs localiss au niveau des acides

teichoques.
Fixation des phages est une proprit utilise pour identifier des
lysotypes.

Un lysotype est groupe de bactries capables de fixer le ou les mmes

phages
1 2 3 4 5 6 7 8 lysotype I = [B1, B3]
B1 + + - + + - + -
lysotype II = [B2]
B2 - - + + + + + +
B3 + + - + + - + - lysotype III = [B4]
B4 - - + + - + + +
lysotype IV = [B5]
B5 + + + + + + + +

d. Coloration de Gram
Gram, mdecin danois (1884) une coloration diffrentielle
 Frottis
A B

Coloration avec violet de Gentiane

( 60 secondes)

Rinage suivi dun traitement

avec le Luguol ( 30 s)

Traitement avec un mlange

dalcool/actone ( 30 s)

Coloration avec la fushine ou

safranine ( 60 s)

Gram + Gram -
III. Membrane cytoplasmique
1. Composition chimique et structure molculaire

Phospholipides intgrales priphriques

30 40 % du PS Protines: 60 70 % du PS

a. Les phospholipides:
- Brucella
 raret des phosphatidyl-cholines
cholines
- Agrobactrium tumefaciens
 phosphatidyl-thanolamine (PE) G-
 phosphatidyl-glycrol (PG) G+
b. Les protines:
Protines extrinsques (priphriques)
Protines intrinsques (intgrales)
c. Les glucides:
faiblement reprsents (2 12%),
12
on y trouve particulirement: glucose et glucosamine.
c. Les enzymes:
- Enzymes de la chane respiratoire c--d
c les dshydrognases
- Coenzymes: cytochromes, les cytochromes oxydases ect

2. Fonctions de la membrane
- Membrane cytoplasmique = support des enzymes de la respiratoire

- Elle est aussi le sige de la phosphorylation oxydative  ATP

 Transport
Protines H+ H+ Lactose

++++++++++

------------- Respiration
Na+ 2e-
NADH 2e- H+
Substrat
2H+
Cytoplasme 2e-
3H2O 3OH- H+
H+ H+ 2e-
ATP
ADP + Pi [H+int] [H+ext]
2e- H+
H2O 2H+ + 1/2 O2
F1
Membrane F0

ATP-synthtase H+ Phosphorylation
2.1. Respiration
 circulation d'lectrons le long d'une chane de transporteurs
 source d'lectrons: substance organique ou inorganique
 rcepteur terminal:
 O2 arobiose
corps organique (fumarate)
 anarobiose
Corps inorganique (nitrate)

 transporteurs d'lectrons sont trs diversifis:

ubiquinones flavoprotines ferroprotines
Mtalloprotines (Cu ou Mo) cytochromes hydrognases

 consquence de cette respiration :

 cration de part et d'autre de la membrane dune ddp
 cration de part et d'autre de la membrane dune de pH

gradient lectrochimique de protons

=
force protomotrice
 force protomotrice
=
Energie lectrique transmembranaire

H - 2,3 RT pH
+ = F

Chez E. coli :

- Le pH est denviron 2 units (l'extrieur tant plus acide).

- Le est lorigine dun champs lectrostatique denviron 70

mV (l'extrieur tant le ct positif).
positif)

2. 2. Phosphorylation oxydative
Au niveau de la membrane, l'ATP est synthtise par une H+-ATPase (ou
ATP-synthtase) utilisant la force protomotrice cre par la chane
respiratoire.

Cette ATP-synthtase est constitue de deux parties distinctes:

 la partie F0: une protine intgrale (intrinsque) qui traverse la
membrane en crant un canal protons.
protons

 la partie F1: une protine priphrique (extrinsque) localise du

ct du cytoplasme,

Ces ATP-synthtases sont aussi appeles F1, F0-ATP-ase et sont toutes

semblables chez les mitochondries, les chloroplastes et les bactries..

Consquence de la respiration et de la phosphorylation oxydative

une nergie chimique : ATP

 une nergie lectrique transmembranaire: H+

2. 3. Transport
 Maltose
Substances Glutamine Mlibiose H+ Proline
liposolubles Glycrol Glucose Na+ Lactose
B.P

II

D~P III Proline

Na+ Mlibiose H+ Lactose
D+Pi
Substances Maltose Glucose-
Glucose
Glycrol Symport Symport
liposolubles Glutamine 6--P Lact/ H+
Mlib/ Na+
Pyruvate
PEP
Transport sensible
Systme PTS:
Au choc osmotique.
Protines membranaires
Transporteur mobile
Protines cytoplasmiques
(Binding protein)

Transport actif primaire Transport actif secondaire

ou chimio-osmotique
osmotique ou osmo-osmotique
Simple Facilit
ATP H+

Transport passif Transport actif

 Pas daccumulation de substrat  Accumulation de substrat
 Pas besoin dnergie  Besoin dnergie
a. Transport passif
 Suit le gradient de concentration avec la tendance d'tablir un quilibre
entre les concentrations intra et extracellulaires d'un substrat donn.

 Ne ncessite aucune nergie et n'entrane aucune accumulation.

Transport simple:
Concerne les substances liposolubles et de petites tailles. Ces
substances traversent la membrane sans l'aide d'aucune protine.

Transport facilit:
Concerne les molcules de taille relativement importante et se fait
travers une protine membranaire( facilitateur).

b. Transport actif
 Se fait contre le gradient de concentration c--d du moins concentr
vers le plus concentr.

 Ncessite une nergie et entrane une forte accumulation du substrat

 Transport actif primaire ou chimio osmotique

 sensible au choc osmotique

 fait intervenir l'ATP comme source d'nergie
et plusieurs protines de transport diffrentes:

au moins une, traverse la membrane pour former un canal

les autres font partie soit de la membrane externe
(porines et protines mineures) soit de l'espace
priplasmique (protines de liaison ou binding protein) ou
encore des protines solubles du cytoplasme.
 Ex.1. transport du maltose chez E. coli

Maltose Lam B extrieur

membrane
externe
Mal E: Binding protein

protines
Mal F & G
space
priplasmique

Mal Tar
membrane
cytoplasqmiqu

Protine Mal K Signal de cytoplasme

chimiotaxie
Hydrolyse et
mtabolisme
 Ex.2. transport des sucres par le systme
PTS (= Systmes Phosphotransfrases)

 Un type de transport actif primaire ( transport par translocation)

 Concerne en particulier les sucres (glucose, mannose, fructose,
mannitol, N-actylglucosamine et quelques -glucosides)

 La caractristique de ce transport cest la phosphorylation du substrat

qui a lieu au niveau de la membrane cytoplasmique

 La source d'nergie chimique = phospho-nol-pyruvate

phospho (PEP)

Chez E. coli, le systme PTS est compos de deux types de protines:

Les protines cytoplasmiques, communes tous les systmes PTS, prot.

I et prot. Hpr, toutes les deux sont solubles dans le cytoplasme.

Les protines membranaires :  la prot. II

 la prot. III
 Transport des sucres par le systme PTS
(= Systmes Phosphotransfrases)

Protines membranaires Protines cytoplasmiques

Mannitol
Mannitol-1- phosphate
Mtabolisme

Prot.III-P hpr Prot.I-P

Pyruvate
Prot.II PEP
(glucose) Prot.III
Hpr -P Prot.I

Glucose6-phosphate
Glucose Glycolyse
Mtabolisme
 Transport actif secondaire ou osmo osmotique

 fait intervenir le (H+) comme source d'nergie,

 plus souvent une seule protine de transport,

 caractris par le fait que la pntration du substrat est couple

celle d'un proton,

H+ Lactose
Ex. Transport du lactose extrieur
Chez E. coli

intrieur

H+ Lactose

les deux lments sont vhiculs par une protine intrinsque (permase lac y),

la synthse de cette permase est induite par la prsence du lactose dans le

milieu extracellulaire ( voir plus loin S6).
 Mthodes d'tude du transport chez les bactries

Bactrie
Quantit de la radioactivit
+ t0 Filtration dans la bactrie
14
Substance X C Q0
[C1]
t1 Filtration Q1
t2 Filtration Q2
. . .
. . .
. . .
. . .
tx Filtration Qx
 Quantit de la radioactivit
dans la bactrie

Q max 1 [C1] Q max 2 [C2]

Temps
Temps

Q max 4 [C4]
Q max 3 [C3]
 Transport actif
[S] intracellulaire
Qx

.
.
Transport passif
. OU
.

Q2

Q1
Q0
Co C1 C2 . . . . Cx
[S] extracellulaire
Comment distinguer entre les diffrents types de transport actif ?

inhibiteurs mtaboliques : Ce sont des substances chimiques action

spcifique permettant d'liminer une source d'nergie cellulaire bien
dtermine.

Les inhibiteurs de la chane respiratoire:

respiratoire cyanure qui inhibe la
cytochrome oxydase.

Les inhibiteurs de l'ATPase membranaire : azoture (1mM) et le DCCD

(Dicyclohexylcarbodiimide) qui ragissent de manire covalente avec
la composante F0 de l'ATPase.

Les inhibiteurs de l'ATP cellulaire:

cellulaire arsniate: analogue du Pi qui puise
l'ATP intracellulaire.
 Les inhibiteurs du gradient lectrochimique (H+) ou de l'une de ses
composantes.
ionophores
substances chimiques qui s'intercalent dans la double couche
lipidique de la membrane, crant des pores travers lesquels
vont passer des ions.

 le 2,4-DNP (2,4-Dinitrophnol)
Dinitrophnol): ionophore protons qui
dcouple la phosphorylation oxydative et inhibe le H+ en
totalit.
 la valinomycine et la monoactine:
monoactine ionophores potassium (K+)
qui permettent ce cation dentrer dans la cellule, ce qui
entrane un quilibre des charges positives sur les deux
faces de la membrane, ce qui affecte spcifiquement le .

 la nigricine: ionophore qui rduit le pH en changeant le K+

contre H+.
IV. Cytoplasme

hydrogel collodal compos de:

une solution de sels minraux et de composs solubles de nature

lipoprotique , de nucloprotines et de lipides

7 < pH < 7.2

Les principaux constituants du cytoplasme sont:

 les ribosomes et les acides ribonucliques qui leur sont associs

 matriel hrditaire,
 les substances de rserve
 certains organites spcialiss
1. Ribosomes
Granulations sphriques qui occupent tout le cytoplasme,

Coefficient de sdimentation est de 70 S, PM = 3.106 daltons

Constitus exclusivement d'ARN (63%) et de protines (37%)

Ces particules peuvent se dissocier en deux sous-units:

 Laa grande sous unit 50 S de PM= 2.106 daltons, constitue d'ARN

23 S et 5 S et de protines L (Large = grande);

 la petite sous-unit
unit 30 S de PM= 106 daltons, constitue d'ARN
16 S et de protine S (Small = petit).

Les deux sous units sont relies entre elles par l'intermdiaire de
liaisons ARN - protine et protine - protine.

Structure en chapelets qu'on appelle polysomes.

2. Granulations et substances de rserve
Amidon et glycogne
Acide poly -hydroxybutirique
hydroxybutirique
Granulations mtachromatiques Corynebacterium diphterieae
- soufre chez les thiobactries
inclusions de - fer chez les sidrobactries
- oxyde de fer (Fe3O4): bactries << magntiques >>.

3. Chromatophores et pigments

Chez les bactries photosynthtiques, chromatophores

Dont l'ultrastructure est diffrente de celle des chloroplastes des

vgtaux suprieurs.

Leurs pigments photosynthtiques = des bactriochlorophylles.

 Halobacterium halobium bactriorhodopsine

 vitamine K2 chez Bacillus subtilis;

 carotnode, protecteur anti-UV,
UV, chez les corynbactries;

 pyocyanine, pigment ayant une activit antibiotique, chez

Chromatobacterium violaceum ;

Certains pigments confrent aux colonies bactriennes une teinte

caractristique:

 Zeaxanthne, pigment jaune chez Staphylococcus aureus;

 Xantophylle, pigment rouge chez Sarcina;

 pyocyanine bleue et pyoverdine bleu-vert

bleu fluorescent chez Pseudomonas
aeruginosa.
V. Matriel hrditaire

1. Chromosome bactrien
 filament unique, continu et circulaire, form d'une double chane d'ADN

 PM 3.109 da, avec environ 5.106 paires de bases

 dans la cellule, la molcules dADN est forme de boucles resserres

et finement entrelaces, donnant une structure compacte mais fragile =
nuclode.
 toute linformation gntique est stocke au niveau de l'ADN sous
forme dun code bien dtermin / la succession des nuclotides,

 Par le processus de la transcription, le message est copi

fidlement sous forme d'un ARN messager puis exprim, par le
processus de la traduction, en squences polypeptidiques qui
formeront les protines de structure et les enzymes.
  l'information gntique au niveau de l'ADN peut changer
spontanment (faible frquence) ou artificiellement par mutagense

Agents chimiques : acide nitreux ou physique : UV

2. Plasmides

 lments gntiques extra-chromosomiques

chromosomiques capables d'autoreproduction

 petite taille (1/100me environ da la taille du chromosome)

 structure torsade (super enroule)

 0.5 106 < PM < 400 106,
 leur nombre varie de 1 100/ cellule
Rles des plasmides:

 Rsistance aux antibiotiques (streptomycine, ttracycline,

chloramphnicol).

 Rsistance aux mtaux lourds comme le Hg, cd, pb

 Intervention dans la dgradation de certains composs aromatiques

 Intervention dans la production des substances rle pathogne.

 Intervention dans la production de bactriocines.

VI. Elments inconstants
1. Capsule

 Couche organique visqueuse labore par certaines bactries

dans certaines conditions de culture,

 Gnralement, elle entoure une cellule bactrienne.

a. Composition chimique

 souvent polyholosidique, quelquefois polypeptidique,

 chez le pneumocoque (Gram-), la capsule est polyholosidique

forme de longues chanes d'acides aldobioniques,
 COOH CH 2 OH

O H O OH
HO
O O
OH
H H (1-4)
4) H
H
H OH OH

Acide uronique Ose

Acide aldobionique

 selon les espces et les souches bactriennes, la nature chimique

de la capsule peut varier au niveau:

- acide galacturonique
 des acides uroniques: - acide glucuronique
-acide
acide cellobiuronique,

- glucose
 des oses: - galactose
-rhamnose,
rhamnose,
La capsule est galement de nature polyholosidique chez de
nombreuses bactries Gram- :

E. Coli Klebsiella pneumoniae Hemophilus influenzae

Chez les Gram+, les constituants capsulaires sont de nature polypeptides,

constitus d'un seul acide amin: l'acide D-glutamique.
D

Bacillus anthracis Bacillus megaterium Bacillus subtilis

b. fonctions

 Support de proprits physiopathologiques et immunologiques,

 vritables facteurs de virulence,

 protge la bactrie contre la phagocytose,

 support dantignicit:

La nature des polyholosides constitutifs de la capsule et de

leur enchanement, dterminent la spcificit srologique.

70 types srologiques sont actuellement reconnus chez les

pneumocoques.

 dans environnement, la capsule protge la bactrie contre:

 la dessiccation.

 le pouvoir agressif des agents chimiques et physiques.

 empche la fixation des bactriophages sur la bactrie.

2. Flagelles ou cils
2 types de mouvement:
Chez les myxobactries: dplacement par glissement,

Chez les eubactries et les spirochtes, mouvement assur

par des organes locomoteurs spcialiss,

Chez les spirochtes, mouvement assur par un filament axial.

Spirochaeta zuelzerae
 Chez les eubactries, la mobilit est assure par des flagelles.

Invisibles en microscopie optique,

optique mais peuvent tre mis en
vidence par des colorations spcifiques.

Proteus mirabilis
En microscopie lectronique, ils apparaissent sous forme d'organites
simples, filamenteux, sinueux, gnralement plus long que la bactrie
elle mme, de l'ordre de 6 20 m.

Methanococcus jannaschii Alcaligenes eutrophus

Le nombre et le mode d'insertion des flagelles sur la bactrie,
constituent un critre de classification.
classification

on distingue deux principaux types d'insertion:

 Insertion polaire:
Monotriche

Amphitriche

Lophotriche

 Insertion pritriche :
Flagelle constitu dune protine, de PM de 30 40 Kda, la
flagelline qui fait partie de la famille des Kratomyosines.

La croissance du flagelle est assure non pas partir de la

base, mais par un prolongement de lextrmit.

En effet les molcules de flagelline formes dans le

cytoplasme, traversent la partie centrale creuse du flagelle et
sadditionnent lextrmit terminale.
terminale

Ce processus de synthse est appel auto-assemblage et

lorsquune fraction de lextrmit est brise, elle est
rgnre.

La destruction de la paroi par des lysozymes aboutit la

formation de protoplaste ou sphroplaste cili.
 Lyzosyme
(dtruit les (1-4))

Bacille cili Protoplaste ou sphroplaste

cili

 Origine du cil est au niveau du cytoplasme et non pas la paroi.

 Microscopie lectronique montre que le flagelle traverse la

paroi et prend racine dans le cytoplasme au niveau dun granule
basal de structure complexe, li lenveloppe bactrienne.

 Ce corps basal comprend deux anneaux protiques, le plus interne

est li la membrane cytoplasmique, le plus externe visible surtout
chez les bactries Gram- , est li aux LPS et au peptidoglycane.
 Le dplacement est assur par rotation du flagelle la manire
d'une hlice.

 L'nergie ncessaire au mouvement provient du gradient

lectrochimique de protons.

 Autres fonctions du flagelle

 Chimiotactisme
sucres et acides amins les attirent chimiotaxie positive
phnols, acides et bases les repoussent chimiotaxie ngative

La rponse cellulaire vis--vis de ces substances serait due un

gradient d'informations transmis de l'extrieur vers l'intrieur de
la cellule par l'intermdiaire de rcepteurs chimiques.

Les rcepteurs par lesquels la bactrie peroit la prsence d'une

substance dans son environnement sont des protines spcifiques
paritales et/ou priplasmiques.
  Proprits antigniques
La spcificit des antignes flagellaires repose sur le nombre et la
squence des acides amins de la flagelline.

Ces diffrences ont t exploites pour la caractrisation

immunologique des types bactriens (Ex. classification des
Salmonella par Kauffman & Withe).
Withe)

3. Pili et fimbriae
 appendices filiformes diffrentes des flagelles,
 frquents chez les Gram-, rares chez les Gram+.

les Pili communs (de type I)

 grand nombre autour de la bactrie (100aine),

 courts, rigides et cassants,

 rle dans l'adhrence des bactries Gram- sur les cellules eucaryotes.
 les Pili sexuels

 Sont plus longs, se terminent par un renflement.

 Leur nombre varie de 1 4 /cellule.

 jouent un rle important dans le transfert du matriel hrditaire
entre deux bactries par le phnomne de conjugaison.
conjugaison
 l'extrmit renfle de ces pili, peuvent se fixer certains phages
et injecter leur matriel gntique par le canal du pili.

En fin, lanalyse chimique de ces pili a montr quils sont constitus

d'une protine appele piline d'un PM 17000 daltons, associant des
sous units.

Ces dernires se dissocient par chauffage ou par traitement acide,

et peuvent reformer froid et pH neutre la structure protique
originale.
La nutrition
bactrienne
Pour vivre et se multiplier

Elments nutritifs de base = Besoins lmentaires

milieu minimum :
 Eau
 Source d'nergie
 Source de carbone
 Source d'azote
 Elments minraux

Cependant, l'apport de nutriments supplmentaires est ncessaire

groupes nutritionnels = types trophiques


Besoins lmentaires
 La source de carbone
Selon la nature de cet lment essentiel pouvant constituer
jusqu' 50 % de la cellule,

 Les autotrophes:
Bactries capables de se dvelopper en milieu purement minral
(milieu minimum source de carbone),
le CO2 tant l'unique source de carbone.

 Les htrotrophes:
Bactries exigeant des composs organiques.
organiques
NB. Parmi les htrotrophes, certaines espces ont des exigences
strictes. Ex. Pseudomonas methanica n'utilise que le mthane ou
le mthanol.
  La source d'nergie

 Les phototrophes ou photosynthtiques

Energie partir des rayons lumineux : espces photosynthtiques
synthse d'ATP partir de l'ADP et du Pi :

- organes photosynthtiques = chromatophores

- pigments = bactriochlorophylles,
- donneur d'lectrons: minral ou organique (sans libration d O2).
Chez les vgtaux, le donneur est H2O (avec libration dO2).

 Les chimiotrophes ou chimiosynthtiques

Source d'Energie = oxydation de composs organiques ou minraux.
  La source dlectrons
 Chez les phototrophes
 Les photolithotrophes: Donneur d'lectrons minral (milieu minral)
Bactries sulfureuses vertes (Chlorobacteriaceae)
et les bactries pourpres (Thiorodaceae).
 Les photoorganotrophes: Donneur d'lectrons organique.
Bactries pourpres non sulfureuses (Athiorodaceae).

 Chez les chimiotrophes

 Les chimiolithotrophes: Donneur d'lectrons minral
Bactries vivant gnralement dans le sol ou l'eau.
Exp. Nitrosomonas : oxydant l'ammoniaque
Nitrobacter : oxydant les nitrites
Les chimioorganotrophes: Donneur d'lectrons organique
La majorit des bactries entrent dans cette catgorie
 La source d'azote
Ncessaire la synthse des protines (10% du poids sec).
L'azote peut tre d'origine:

 minrale :
* NH4+ et NO3- utiliss par la plupart des bactries
* NO2- utilis par les bactries du genre Nitrobacter
* N2 utilis par les bactries fixatrices d'azote libres
(Azotobacter) ou symbiotiques (Rhizobium)

 Organique :
Protines, acides amins (R--NH2).
A partir de ces composs, il y a incorporation des NH4+
librs aprs dsamination ou utilisation du radical NH2 par
transamination.
 Le soufre et le phosphore
Le souffre se retrouve dans les protines, prcisment au niveau
des groupements thiols (-SH)
SH) des AA souffrs (cystine et
cystine).
Il est incorpor sous forme de sulfates ou sous forme organique.

Le phosphore, incorpor sous la forme de phosphate inorganique,

fait partie des acides nucliques, de certains coenzymes et de
l'ATP.

 Autres lments minraux

Macro-lments:
Na, K, Mg, Cl: rle dans lquilibre physicochimique
Fe: pour les Cytochromes Mg: pour la Chlorophylle

Micro-lments:
Co, Cu, Mo, Mn et autres: Cofacteurs ou activateurs d'enzymes.
 Facteurs de croissance
Substances organiques, indispensables la croissance, non synthtises
Microorganismes dits auxotrophes par opposition aux prototrophes.

 Nature des facteurs de croissance :

 Acide amin: synthse des protines,
 Base azote puriques ou pyrimidiques: acides nucliques,
 Vitamine: rle de coenzyme ou de prcurseurs de coenzyme.

 Proprits des facteurs de croissance :

- Action trs faible concentration:
concentration
25 mg/l dans le cas des acides amins.
10 mg/l pour les bases azotes,
1 24 g/ l pour les vitamines,
-Spcificit stricte:
un simple changement de position dun groupement te son rle au facteur
de croissance.
La croissance
bactrienne

Dfinition de la Croissance

Gnralement cest laccroissement de tous les composants d'un

organisme.

Chez les organismes pluricellulaires, il y a augmentation de taille.

Chez les bactries augmentation du nombre de cellules.

Cet accroissement est donc synonyme d'une multiplication bactrienne.

Chez Escherichia coli , toutes les 20 min environ, 1 bactrie donne

naissance 2 bactries identiques
  Mthodes de mesure de la croissance
1- Principe

Dtermination du Nombre
t0 ou de la masse bactrienne N0
Bactrie t1 N1
t2 N2
. . .
. . .
. . .
. . .
tn Nn
Milieu de
culture

N.B. Durant la croissance la TC et laration doivent tre respectes

2-1.
1. Mesure du nombre de cellules
 Nombre de cellules totales
 Cellule de Thomas
 Dispositif lectronique (Compteur Coulter)

 Nombre de cellules viables

 Sur milieu solide
 Sur milieu liquide

2-2. Mesure de la masse

 Mesure du poids sec: (P. frais d'1 bact.= 1,5 10-12 g)
 Dosage de l'azote total (14% du poids sec).
 La turbidimtrie:: consiste mesurer le trouble bactrien.
 La turbidimtrie
Une suspension cellulaire, traverse par un rayon lumineux, disperse la
lumire (absorbe) et la quantit transmise est rduite par rapport la
quantit mise.

Ceci est mesur l'aide d'un spectrophotomtre.

 Cuve
spectrophotomtre

I0 . I

.. ... ...
..
. ... .
.
I < I0
.
.. . ....
.
Source de Toute suspension bactrienne
lumire
obit la Loi de Beer Lambert :

D.O = log I0 / I = l C = K C
Lumire rflchie
(absorbe)
= constante dabsorbance
l = distance traverse par le rayon (1 cm)

et l sont constantes, donc DO proportionnelle C

La longueur d'onde utilise pour la suspension bactrienne est

comprise entre 550 et 660 nm (spectre
( d'absorbance).
 Constantes et expression de la croissance
La croissance d'une bactrie est dfinie par 2 constantes:

 Le temps de gnration

C'est le temps qui spare 2 divisions successives (= temps

ncessaire au doublement de la population).

G = t/n
t = temps de croissance (connu) et n = nombre de divisions

Ex. chez E. coli : G = 20 min

 Le taux de croissance
C'est le nombre de divisions par unit de temps.

= n/t donc = 1/G

est exprim en nombre de divisions/unit de temps
 Expression mathmatique de la croissance
Temps nombre de Bactries
t0 N0 = 1N0 20 N0
t1 N1 = 2N0 21 N0
t2 N2 = 2 x 2 x N0 22 N0
t3 N3 = 2 x 2 x 2 x N0 23 N0
t4 N4 = 2 x 2 x 2 x 2 x N0 24 N0
.
.
.
.
.
.
tn Nn = 2 x 2 x 2 x 2 x .. N0 2n N0
n fois
(n = nombre divisions et N0= nombre de bactries t0)

N = 2n N0 (avec = n/t et n = t) donc N = 2t N0

 Reprsentation graphique de la Courbe de
croissance
La croissance bactrienne est reprsente par un graphe :

N = f(t) ou DO = f(t) ou autres

 Reprsentation arithmtique:
arithmtique N = f (t)

A t0 correspond N0 (ordre 105 106)

A t1 correspond N1= 2N0 (2 105 2 106) avec t1 - t0= G

A t2 correspond N2 = 4N0 (4 105 4 106) avec t2 - t1= G

Courbe:

Nombre levs posent un problme pour une chelle arithmtique

 Expression logarithmique

N = 2n N0 (avec = n/t et n = t) donc N = 2t N0

log N = log 2n N0 (n = t) log N = log 2t N0

log N = log 2t + log N0 log N = t log 2 + log N0

y=ax+b quation dune droite Constante

Pente de la droite: P = a = log 2 = P / log 2

log N - log N0
=
t log 2
  Reprsentation logarithmique
Courbe: log N = f (temps)
Echelle log N
logarithmique
log Nx

.
.

log N1
Echelle
log N0 arithmtique

to t1 t2 . . . . tx
temps

Tracer la courbe sur un papier semi-logarithmique

semi
 Log N

Temps Nombre bactries

en heure ml
(H)
0 1,1 108
5 1,8 108

10 3,1 108
Log 109
15 5,4 108
20 9,2 108
25 1,2 109
30 1,4 109
35 1,55 109
40 1,6 109
50 1,65 109

60 1,65 109

Log 108

Dtermination thorique des paramtres
log N

Pour G, prendre N2 = 2 N1
log N2 = 2 x log N1
on a alors G = t2 - t1

log N1

log N0

t1 t2 temps

log N2 - log N1
Pour calculer : = Ou = 1/G
(t2 - t1) log 2

Eviter de prendre en considration le N0.

La croissance n'est pas toujours exponentielle.

Justification:

E. coli, 37C,
C, G est de 20 min
= 1/G = 1/20 = 0,05 div / min = 3 div / heure
Aprs 48 heures de croissance exponentielle et si on part
au t0 d'une seule bactrie (N0= 1):

Log N = t log 2 + log No Log N = 3 x 48 x 0,301 = 43,344

Le nombre de bactries est: N = 2,2 1043 bactries.

Le poids 1 bactrie = 1,5 10-12

12 g

la masse bactrienne = 3,3 1031g soit 3,3 1025 tonnes

(poids de la terre = 5 1021 tonnes)

  Les phases de croissance
log N
Phase stationnaire

phase de dclin

Phase exponentielle Phase de dcclration

Phase de latence

Phase d'acclration

temps
 La phase de latence

 Pas de croissance, N0 = Constant et donc : =0

Causes:
- L'ge des bactries
- La composition du milieu de culture

 La phase d'acclration
 Dbut de croissance, le nombre bactrien augmente > 0

Causes:
dbut d'adaptation des bactries au milieu
 La phase exponentielle

 C'est la phase physiologique idale pour la croissance

 Le temps de gnration G est minimal

 Le taux de croissance > 0, maximal et constant

 Sur papier semi logarithmique: phase exponentielle = droite

(relation proportionnelle entre le log N et le temps).

Log N = t log 2 + log No

(quation dune droite: Y = ax + b)

 La phase exponentielle dure gnralement quelques heures.

La phase de ralentissement
Taux de croissance diminue
 L'augmentation de N dans le temps est plus faible que
durant la phase exponentielle,
 Le milieu devient moins favorable la croissance.

 La phase stationnaire
 Ill ny a plus de croissance: = 0
 Nombre de cellules viables est constant:
constant
Equilibre entre cellules qui meurent et celles qui apparaissent
ou mme nombre de cellules viables sans division ni disparition.
Causes:
 l'puisement du milieu de culture,
 l'accumulation de mtabolites toxiques,
 l'volution dfavorable des conditions physico-chimiques
physico
 La phase de dclin

 Le taux de croissance est ngatif ( < 0).

 Les bactries ne se divisent plus,

plus beaucoup meurent
et certaines sont lyses

 Cette phase est visible ou pas selon la mthode dtude:

nb bactries viables (toujours) /turbidimtrie (si lyse)
 Variation de pendant les phases de croissance

= f(t)

( = max et Constant)

( > 0) mais en diminution

( > 0)
( = 0)
( = 0) ( < 0)
t
 Cas particuliers de croissance
9.1. Cas de la diauxie
Croissance dans 1 milieu synthtique en prsence de 2 substrats carbones.

Exemple: croissance dE. coli en prsence de glucose et de lactose

log N

lactose

Synthse denzymes
(Opron lactose)

Glucose

temps
 9.2. Croissance synchrone
On peut amener les bactries se diviser au mme moment, ce qui
donnerait une croissance synchrone.

Par choc thermique chez Salmonella typhimurium : les bactries sont

incubes alternativement une temprature de 25C pendant 28 min,
puis 37C pendant 8 min

log N

37C
37C
25C
37C

25C
C
37C

25C
25C

28 8 28 8 28 8 28 8 temps

La courbe montre une srie de paliers successifs

 9.3. Croissance continue

Dans les conditions habituelles de croissance, la phase exponentielle

ne peut durer que quelques heures.

Exprimentalement, on peut maintenir une culture en croissance

exponentielle pendant plusieurs heures voir plusieurs jours.

Pour cela, il faut renouveler constamment le milieu de culture tout

en liminant les produits rsultant du mtabolisme cellulaire.

C'est le principe des fermenteurs industriels.

Fermenteur de laboratoire

Fermenteurs industriels
: taux de croissance maximal et N : population constante

N est choisi en phase exponentielle et est maintenu constant par

renouvellement du milieu

log N

Milieu non renouvel

Turbidostat
ou
Milieu renouvel

temps
NB. rgulation du taux de dilution qui doit tre gal au taux de croissance
10. Facteurs influenant la croissance bactrienne
 Composition du milieu de culture
 Facteurs physico-chimiques:
chimiques: pH, temprature, oxygne

 Agents antimicrobiens: les antibiotiques

10.1. Composition du milieu de culture

Le taux de croissance d'une bactrie dpend du milieu de culture:

Ex. Bacillus subtilis: = 0,3 div/h sur milieu synthtique

= 3 div/h sur bouillon nutritif.
 Cas de leffet de la concentration du substrat carbon

chez E. coli, augmente proportionnellement la quantit de glucose

jusqu' une valeur partir de laquelle il est inutile daugmenter la
concentration du glucose (C optimale).

max

0 C1 C2 C3 C4 C5
[Glucose]

NB: Un substrat fourni en concentration trop leve peut avoir un effet

bactriostatique (arrt de croissance) ou bactricide (mort des bactries).
 Substrat/rendement

En phase stationnaire, la biomasse cellulaire est directement

proportionnelle la concentration de la source de carbone.

Cette biomasse dtermine le rendement:

R = X - X0 x 100
C

avec: X0= P.S. des bact. t0 (en g)

X = P.S. des bact. phase stat.
C = Quantit substrat consomm

A la concentration optimale, le taux de croissance est optimal mais

le rendement peut continuer augmenter
10.2. Facteurs physico-chimiques:
chimiques:

 Effet du pH sur la croissance

La majorit des bactries prolifrent en milieux neutres ou
lgrement alcalins. (tampons /exp:
/exp K2HPO4 et KH2PO4).

Il existe des bactries prsentant des tolrances particulires au pH:

Certaines exigent des pH bas: on parle de bactries acidophiles

cas de Thiobacillus thiooxydans qui a un pH optimal de l'ordre de 2

Inversement, les bactries qui exigent un pH lev sont dites des

basophiles exp: Vibrio a un pH optimal de 9

Les bactries ne se dveloppant qu'au voisinage de la neutralit sont

dites neutrophiles.
  Effet de la temprature sur la croissance
Les limites de temprature entre lesquelles les organismes vivants
peuvent crotre sont:

- 5C
C : point de conglation de l'eau dans les cellules vivantes

+ 80C
C : thermolabilit des protines et des acides nucliques

Selon la temprature optimale de dveloppement, on distingue:

Types T min T opt T max

Psychrophiles -15C + 10C + 20C
Msophiles 5 10C 30 37C 40 43C
Thermophiles 40C 42 55C 60 80C

A 37C: G de E. coli est de 20 mn, A 42C: G devient 50 mn

 Effet de la pression osmotique sur la croissance
La bactrie accumule dans le cytoplasme une concentration leve
en substrats

PO int > PO ext

Si forte augmentation de l'osmolarit du milieu extracellulaire
risque defflux d'eau plasmolyse

inhibition de processus vitaux: biosynthse de macromolcules,

rplication de l'ADN etc : arrt de croissance,

pour viter cela, la bactrie doit ajuster sa pression osmotique

interne une valeur suprieure celle du milieu externe,

Cest losmorgulation: accumulation de K+, dacides amins, sucres etc

 Selon ce pouvoir dosmorgulation, on distingue 4 groupes de bactries

Groupe Exemple [NaCl] tolre

Non Halophiles E. coli 04%

Halophiles Pseudomonas marina 0,2 5 %

Halophiles modrs Pediococcus halophilus 2,3 20,5 %

Halophiles extrmes Halobacterium 5 36 %

10.3. Agents antimicrobiens:

Agents chimiothrapeutiques:

Au sens strict:
Agent antimicrobien, produit par des microorganisme, tue ou inhibe
dautres microorganismes.

Au sens large:
Toute molcule de faible PM dorigine naturelle (les antibiotiques),
synthtique ou hmisynthtique (les sulfamides) pouvant avoir un effet
ltal (bactricide) ou statique ( bactriostatique)
bactriostatique)..

La toxicit est slective

 Bactriostatique
Modalit daction: inhibe la croissance
109

Tmoin
cfu/ml

1 mg / l
105

2 mg / l

Temps (h) 24 h
 Bactricide
tue les bactries

105
Tmoin
cfu/ml

Temps (h) 24 h

Temps - dpendant
1 mg / l
102

2 mg / l
Concentration - dpendant
Mode daction
 Action sur la synthse de la paroi
 Action sur la membrane cytoplasmique
 Action sur la synthse des protiques
 Action sur les acides nucliques
Action sur la synthse de la paroi:

Ex. la Pnicilline = analogue structural du dipeptide D-alanine, il

empche son incorporation dans le chanon peptidique.

Il y a multiplication mais clatement cellulaire par suite de

labsence de la paroi.

Action pendant la phase active de croissance: Effet bactricide

Action sur la membrane cytoplasmique:

Ex. la polymixine = Antibiotique de nature polypeptidique qui
altrent la membrane plasmique en y formant des pores qui
seront lorigine de perturbation des changes membranaires.
membranaires.

Action pendant et en dehors de la croissance. Effet bactricide

Action sur la synthse des protines:
Les antibiotiques agissent sur les ribosomes pour empcher la
lecture du code ou la fausser.

Ex. 1: Lerythromycine se fixe au niveau de lunit 50 S du ribosome

Elle empche la fixation du complexe acides amins-ARNt,

 inhibition de la synthse protique.

protique
Action pendant la phase active de croissance.
croissance Effet bactriostatique

Ex. 2: La streptomycine se fixe au niveau de lunit 30 S du ribosome

Il y a des erreurs de lecture du code gntique et lincorporation

dacides amins ne correspondant pas linformation des ARNm,
Il y a synthse de protines non sens (lthales).
Action pendant la phase active de croissance. Effet bactricide
 Action sur les acides nucliques

Action sur lADN:

Ex. la mitomycine forme des ponts entre les hlices de lADN

Elle empche la rplication par la polymrase et bloque la croissance

Action pendant la phase active de croissance. Effet bactriostatique

Action sur lARN:

Ex. lactinomycine bloque lARN polymrase
Taxonomie bactrienne
Principe

 tout individu appartient une espce,

espce

 les espces proches sont groupes en un genre,

 les genres rapprochs sont runis en une famille,

 les familles prsentant des similitudes forment un ordre,

 les ordres apparents sont rangs en une classe,

 les classes semblables sont runies en une division ou phylum.

 Taxonomie = Systmatique: science qui tudie la diversit des
tres vivants ainsi que les relations qui existent entre eux.

Elle consiste :

 Caractriser les bactries,

 Les classer sur la base de leur similitude, en groupes ou taxons

(genres, espces...),

 Appliquer le code international de la nomenclature bactrienne

pour les nommer (Exp: Escherichia coli),

 Identifier de nouveaux organismes et dterminer leur appartenance

ou non lune des espces connues.
connues
L'unit taxonomique = l'espce
Une espce biologique est un ensemble d'individus qui prsentent
un haut degr de ressemblance phnotypique.
phnotypique

Chez les organismes suprieurs, la notion d'espce est fonde sur

l'interfcondit des individus: patrimoine hrditaire.

Or: bactries = microorganismes haplodes, se reproduisant par

voie asexue, gnralement par division binaire.

Pour dfinir une espce bactrienne les taxonomistes sont

amens fixer une limite arbitraire de diffrences partir de
laquelle deux types doivent tre classs en deux espces
diffrentes .
 LWOFF dfinit un biotype: "un groupe d'individus possdant le
mme patrimoine hrditaire et ont en commun la grande
majorit de leurs caractres"..

Le biotype drive du clone qui reprsente la population

bactrienne issue d'une mme et unique cellule qui s'est
multiplie par divisions binaires.
binaires

Cette population bactrienne issue d'un clone est appele souche

bactrienne. Les individus d'une souche sont en principe
identiques sauf en cas de mutation.
mutation

Une espce regroupe les souches bactriennes prsentant

une grande similitude de caractres.
caractres

La taxonomie classique
 Critres morphologiques et structuraux

Insuffisants mais un premier regroupement simple et pratique,

Cependant, certains caractres sont sujets des variations:
Exp: les Gram+ gs prennent l'aspect des Gram- (Bacillus subtilis)

 Critres biochimiques
Fermentation des glucides /exp la Fermentation du glucose (test
Voges Prauskauer)
 Dgradation des protines /exp
exp Dgradation de la peptone

 Dgradation des lipides

Cas particuliers: catalases (H2O2) et coagulases (plasma)

  Critres immunologiques

L'tablissement de la carte antignique = srotypage.

Chaque srotype tant un groupe de souches prsentant une raction

avec un mme anticorps ou un groupe d'anticorps.

Les souches du mme srotype peuvent appartenir la mme espce

 Critres de lysotypie

La fixation des bactriophages est lie des sites sur la paroi

bactrienne.

Le site de fixation est une protine spcifique d'un phage.

Si phage virulent: lyse bactrienne (cycle lytique).

Deux souches capables de fixer les mmes phages et dveloppant des

cycles lytiques appartiennent au mme lysotype et peuvent
appartenir la mme espce.
 La taxonomie molculaire
Dans la taxonomie classique, l'tude des phnotypes ne donne
qu'une information incomplte
incomplte: les caractres
morphologiques, biochimiques, srologiques etc ne
traduisent qu'une faible proportion du gnome.

C'est pourquoi une approche gntique est ncessaire en

taxonomie bactrienne. Elle concerne la nature physico-
chimique du gnome bactrien.

 Le %GC ou le coefficient de Chargaff

 Lanalyse et squenage des ARN ribosomaux
 L'hybridation ADN / ADN
2.1. Le GC% ou le coefficient de Chargaff

La technique de Chargaff est base sur l'valuation quantitative des

deux groupes de bases azotes (GC et AT) en spectrophotomtrie
UV (260 nm).

Le coefficient GC% = nombre de couples (guanine+cytosine) pour

100 couples de bases dans l'ADN de la bactrie tudie.

Chez les bactries, le GC% varie de 30 75 %

Pour que deux souches soient considres comme appartenant

la mme espce, il faut que la diffrence entre les GC% de
leur ADN soit infrieur 5%.
Mais: si le %GC est une information importante en taxonomie, il
comporte des limites:

Deux bactries peuvent avoir le mme %GC mais ne pas prsenter

les mmes squences nuclotidiques et tre donc gntiquement
trs loignes.

ADN bactrien : GC%

10 30 50 70 90%
Steptococcus
Staphylococcus
 2.2. Lanalyse des ADN ribosomaux

Promoteur Terminaison
IGS IGS

ADNr 16S ADNr 23S 5S 3

5 ADNr

Outil phylogntique rpondant aux critres ncessaires une tude

volutive, en particulier la stabilit

Analyse du gne rDNA-16S

 Amplification et analyse du polymorphisme des fragments

de restriction: PCR/RFLP
 Squenage total ou partiel
 584 pb
530 pb
226 pb
M III
Rch 985
Rch 984
Rch 9865
Rch 9841
Rch 9813
Rch 9868
Rch 24
M.ciceri
R.meliloti
M.mediterraneum

du 16 S amplifi
R.tropici
R.etli
B.japonicum
M III

Electrophorse sur gel polyachrylamide

Rch 981

Rch 984
MspI

Rch 60

Rch 9821

Rch 9865

Rch 9815

Rch 9840

Rch 9819
du 16 S par MspI

100 pb
Gel des profils de restriction

Rch 985
Rch 9816
Rch 982
200 pb
800 pb
2.3. L'hybridation ADN / ADN
 Le chauffage d'un ADN bicatnaire donne deux brins homologues
squences complmentaires: cest la dnaturation.

 Un refroidissement entrane un rappariement des deux brins

d'ADN: c'est la renaturation in vitro.

 Si on mlange deux ADN dnaturs provenant de deux espces

bactriennes, l'ADN monobrin d'une espce peut ventuellement se
rassocier avec le monobrin issu de la deuxime bactrie pour
former un ADN bicatnaire hybride:
hybride c'est l'hybridation.

 Ainsi, plus deux espces sont proches gntiquement, cd plus leur

squences de bases se ressemblent (degr d'homologie important)
plus il est facile de former des ADN hybrides.

 Chez les Enterobacteriaceae, on considre que 2 souches sont de

la mme espce si le taux dhybridation ADN/ADN est de 70
100%.
La taxonomie numrique
 Pour construire une classification l'aide des caractres
phnotypiques et/ou molculaires, le chercheur est amen donner
plus d'importance certains d'entre eux. Cette conception est
arbitraire et donc peu fiable.

 Pour s'y soustraire, Adonson (botaniste) a propos d'affecter

tous les caractres le mme poids.. De ce fait on parle de taxonomie
numrique ou adansonnienne (Adonson
Adonson).

 Principe: Tous les caractres phnotypiques d'un organisme ont la

mme valeur.

 Les distances taxonomiques entre deux organismes sont exprimes

par un coefficient de similitude calcul d'aprs le nombre de
caractres partags par rapport au nombre total de caractres
examins.
Exp programme: UPGMA
 nodosits racinaires
48 souches de rhizobium: 13 rgions du Maroc
nodulant le pois-chiche
tages bioclimatiques

Performance symbiotique (nodulation et fixation dazote)

Croissance sur milieu YEM (taux de croissance)

Tolrance la salinit (NaCl, KCl, CaCl2, Na2SO4, K2SO4, CaSO4)

Tolrance aux pHs (de 4 9,5)

Tolrance la temprature (de 5 45C)
Rsistance intrinsque : antibiotiques, mtaux lourds
Assimilation de 49 carbohydrates
Analyse numrique : UPGMA
 Niveau de similarit
0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 1,00
Rch 9869
Rch 9868
GroupeIII
Rch 9871 100%
Rch 9813 Kala
Rch 9835
Rch 9832
Rch 9865
Rch 9862 Groupe II
Rch 9863
Rch 9861 100%
Rch 9820 Ben Slimane
Rch 9819
Rch 985
Rch 984
Rch 128
Rch 102
Rch 7
Rch 161
Rch 134
Rch 19
Rch 28
Rch 30
Rch 18
Rch 94
Rch 60
Rch 126
Rch 125
Rch 35
Groupe I
Rch 24
Rch 16
isolats de
Rch 14 diffrentes
Rch 13 rgions
Rch 10
Rch 5
Rch 2
Rch 9816
Rch 9815
Rch 989
Rch 9822
Rch 9842
Rch 9841
Rch 9840
Rch 9821
Rch 8
Rch 988
Rch 982
Rch 983
Rch 981

Phnogramme reprsentant la similarit phnotypique entre les

rhizobia du pois chiche de diffrentes rgions du Maroc.
 584 pb
530 pb
226 pb
M III
Rch 985
Rch 984
Rch 9865
Rch 9841
Rch 9813
Rch 9868
Rch 24
M.ciceri
R.meliloti

du 16 S amplifi
M.mediterraneum

Gel polyachrylamide
R.tropici
R.etli
B.japonicum
M III

Rch 981

Rch 984
MspI

Rch 60

Rch 9821

Rch 9865

Rch 9815

Rch 9840

Rch 9819
du 16 S par MspI

100 pb
Gel des profils de restriction

Rch 985
Rch 9816
Rch 982
200 pb
800 pb
 0.006
B. japonicum USDA 110
Agrobacterium sp. 348
R. etli CFN42
R. leguminosarum bv viciae VF 39
R. tropici IIb Ciat 899
S. fredii USDA 205
S. Meliloti GR4
Rch9871
Rch9869
Rch9868 Groupe 4
Rch9813
M. mediterraneum IC60
Rch9865
Rch9863
Rch9862
Rch9861
Rch9835
Rch9832
Rch9820
Groupe 3
Rch9819
Rch985
Rch984
M. loti NZP2213
Rch9842
Rch9841
Rch9840
Rch9822
Rch9821
Rch989
Rch988
Rch983 Groupe 2
Rch982
Rch981
Rch128
Rch102
Rch8
Rch7
M. ciceri IC2091
Rch9816
Rch9815
Rch161
Rch134
Rch126
Dendrogramme, bas sur la PCR/RFLP du gne rDNA Rch125
Rch94

16S, montrant la position phylogntique des rhizobia Rch60

Rch35
Rch30
nodulant le pois chiche au Maroc, par rapport aux Rch28
Rch24
Groupe 1

souches de rfrence. Rch19

Rch18
Rch16
Rch14
Rch13
Rch10
Rch5
 A. caulinodans

Sinorhizobium
100 S. fredii
100 S. xinjiangensis
58 S. saheli
100 S. terangae
100 S. medicae
S. meliloti
Rch9813, Rch9868 G4
88
R. giardinii
100 A. rhizogenes
R. tropici
73 R. etli
98 77 R. leguminosarum
R. hainanense
99 R. gallicum
R. mongolense
100 A. rubi
85
88 A. tumefaciens
A. vitis
100 R. galegae
R. huautlense
M. tianshanense
M. chacoense
61 M. loti
100

Mesorhizobium
100 M. ciceri
Rch2B, Rch10B, Rch19B G1
Rch981 +
96 Rch9816
Rch9815 G2
Rch7B
M. amorphae
97 M. huakuii
68 M. plurifarium
50 M. mediterraneum
100
Rch984, Rch9865
G3
100 B. elkanii
B. japonicum
0.01

Arbre phylogntique bas sur le squenage des rDNA-16

Groupes et souches Espces de rfrence Taux de similitude Nombre de bases diffrentes

M. ciceri 99.8% 2 bases

G 1: Rch 9816, 2, 10, 19
Rch 9815
M. loti 99.6% 4 bases

M. Ciceri 99,8% 2 bases

G 2: Rch 7, 981
4 bases
M. Loti 98.6%

M. Mediterraneum 99.9% 1 base

G 3: Rch 984, Rch 9865

M. tianshanense 99.4% 6 bases

S. Meliloti 99.7% 3 bases

G 4: Rch 9813, Rch9868

Sinorhizobium sp 99.6% 4 bases

% de similitude des squences des ADNr 16S entre les groupes de rhizobia de pois chiche
et les espces des genres Mesorhizobium et Sinorhizobium