Détections des carbapénèmases chez les

Entérobactéries
 CMI

CASFM 2011

Souches Ertapénème intermédiaires ou résistantes

Tests complémentaires
 CMI

• Techniques :
– E-test® : problèmes des micro-colonies
– Automatisées : variabilité selon inoculum

• Souches exprimant faiblement la carbapénèmase

 Tests complémentaires

 CMI imipénème (et méropénème si à rendre)

 Test avec cloxacilline :

 Milieu MH avec cloxacilline à 250mg/l

 Disques avec cloxacilline + antibiotique

 Synergie avec inhibiteurs en disques:

 EDTA : 750 µg par disque antibiotique

 Acide boronique : 400 à 600 µg par disque antibiotique

 Acide clavulanique : synergie avec disque amox+ac.clavulanique

disque double commercialisés

 Test de Hodge
 Test de Hodge : réalisation

E. coli multisensible (0,5 McF dilué au 1/10)

Disque d’imipénème 10 µg
(ou ertapénème 10 µg)

Stries fines de la bactérie à tester prélevée sur

milieu solide (öse de 1 µL)

Gélose MH 24 heures à 37°C en aérobiose

Test de Hodge : réalisation

Test de Hodge négatif

= souche non productrice de carbapénémase

Culture confluente d’E. coli

Diamètre d’inhibition d’E. coli

Test de Hodge positif

= souche productrice de carbapénémase (?)
 Test de Hodge : réalisation

CQ1 et CQ2 : souches non productrices de carbapénèmases

CQ3 et CQ4 : souches de K.pneumoniae productrices d’OXA-48

 Test de Hodge : réalisation

K.pneumoniae : blaKPC sauvage BLSE + perte de porine

 Sensible (100 %)
 Mais :
 Réalisation et interprétation délicate si non expérimenté
 Problème de spécificité (90%)
Endimiani et al., JCM 2010
 Synergie en disques
carbapénèmes avec et sans inhibiteurs

 Cloxacilline

 EDTA (ou acide dipicolinique)

 chélateur : inhibe les métallo-enzymes

 Acide boronique
 Acide 3-aminophénylboronique (APB)
 Inhibe ± les céphalosporinases chromosomiques

 Inhibe les KPC

 Gélose MH, suspension à 0,5 McF, 18-24 h à 37°C

 Apprécie l’activité des inhibiteurs seuls

 Basée sur la restauration d’activité du pénème

 Synergie en disques
carbapénèmes avec et sans inhibiteurs

EDTA

ATB
Cloxa EDTA + ATB

Cloxa + ATB APB

APB + ATB
 APB : acide boronique
 Cloxa : cloxacilline
 ATB : carbapénème
 EDTA ≥ 5 mm EDTA < 5 mm
Cloxa EDTA + ATB Cloxa EDTA + ATB
< 5 mm < 5 mm
Cloxa + ATB APB Cloxa + ATB APB
< 5 mm ≥ 5 mm
APB + ATB APB + ATB

Métallo-carbapénémase de classe B Carbapénémase de classe A (KPC, …)

< 5 mm EDTA
EDTA
Cloxa EDTA + ATB Cloxa EDTA + ATB
≥ 5 mm < 5 mm

Cloxa + ATB APB Cloxa + Erta APB

≥ 5 mm
< 5 mm
APB + ATB APB + ATB

AmpC + imperméabilité Ni AmpC ni carbapénémase (ou de classe D)

 Synergie E-Tests combinés
carbapénèmes avec et sans inhibiteurs

Présence d’une métallo-ß-lactamase

 CMI Imipénème/CMI IMP+EDTA : rapport ≥ 8

 Zone fantôme

 Déformation
 Test
Chélateur Acide
Mécanisme de Cloxacilline
(EDTA) boronique
Hodge

Carbapénèmase
classe A = KPC + - + -
Carbapénèmase
classe B = VIM, NDM-1 + + - -
Carbapénèmase
classe D = OXA + - - -
Céphalosporinase (AmpC)
+ imperméabilité ? - + +

Ni AmpC, ni KPC, ni MBL - - - -

Rappel : en présence d’une carbapénémase, il n’y a pas lieu de modifier l’interprétation

des carbapénèmes catégorisés comme sensibles (CA-SFM 2011)
 Carbapénèmases Classe D / 2d
Oxacillinase

Tests des disques combinés

EDTA Cloxa AB AB : Ac.boronique 20mg/ml x 20µl

Cloxa : Cloxacilline 25 mg/l x 30 µl

EDTA O,5 M/L : 10µl

ETP
ETP ETP ETP

MEM
MEM MEM MEM

Rien !

IPM IPM IPM IPM

OXA-48
 Imperméabilité et Céphalosporinase hyperproduite
Reste l’imperméabilité
Sans Cloxa Avec Cloxa 250 mg/l

Inhibe la céphalosporinase

MOX
IPM
MOX
IPM

ATM

ERT
AMC ATM
AMC
ERT

FEP
FOX
FEP
FOX
 Carbapénèmases Classe A / 2f
KPC

AB : Ac.boronique 400µg
EDTA Cloxa AB
Cloxa : Cloxacilline 750µg

EDTA O,5 M/L : 10µl

ETP ETP ETP

ETP

Synergie nette avec

Ac.boronique
MEM
MEM MEM
MEM

IPM IPM
IPM IPM
 Carbapénèmase de classe B
MBL ( IMP-13 )

IMP IPM IPM IPM

5 10 15
 EDTA IPM

IPM +EDTA 15l 5

IPM +EDTA 5l

IPM+EDTA

10
IPM +EDTA 10l
EDTA
CMI
15
IPM = 128 mg/L
IPM+EDTA = 16 mg/L

 Hydrolyse significative de l’imipénème, inhibée par EDTA.

 Carbapénèmase de classe A / 2f
IMI-2

AMX AMC TCC TIC AMC AMC

AMC

IPM
IPM
IPM

CF CTX CAZ TZP

FOX MA CRO CXM

ETP

ETP
ETP

AMC AMC AMC

IPM ETP
IPM ETP
EDTA EDTA
 Recettes
 Acide boronique
 20 mg/mL soit 120 mg dans 3 mL de DMSO + 3 mL d’eau
 Dépôt de 20 µL par disque, soit 400 µg par disque
 Ou disques Rosco

 EDTA
 pH = 8, concentration = 0,5 M
 Dépôt de 5 ou 10 µL par disque

 Acide dipicolinique
 Disques Rosco (250 µg)

 Cloxacilline
 1 g d’Orbénine® dans 40 mL d’eau distillée
 Dépôt de 10 µL par disque, soit 250 µg par disque
 La confirmation moléculaire

• Tests phénotypiques parfois délicats d’interprétation

• Confirmation moléculaire indispensable

– apporte une certitude rapide de la présence ou non du gène d’une carbapénémase

• Nombreuses techniques décrites

– PCR classiques
– PCR en temps réel (VIM, KPC…)
 Milieux sélectifs et/ou chromogènes

Milieu Brillance® Oxoid Milieu ‘’maison’’ Drig + Caz 1mg/l

E.coli (NDM-1) et K.pneumoniae (OXA-48 + BLSE)

Mais …

Milieu Brillance® Oxoid Milieu Brillance® Oxoid

K.pneumoniae (BLSE + imperméabilité) C.freundii (AmpC hyperproduite)