Évaluation & validation des

amorces ITS pour

l ’amélioration du diagnostic
PCR des trypanosomoses
animales africaines
Ludovic Mewono
Plan
Problématique & Objectifs de l ’étude

I. Matériel et Méthodes

II. Résultats & Discussion

Conclusion
 Problématique (1)
L’élevage : occupe 1e place centrale dans le développement
des systèmes de production en AF:
! 15% du PIB au BF, emploie 80% de la pop active, 2e
secteur d’exportation après le coton.

" Participe à la sécurité alimentaire & nutritionnelle des

populations en 1/2 rural(viande & lait = 1eres sources de
protéines)

" 86% de la population rurale y tire entièrement les revenus,

ce secteur participe ainsi à la lutte contre pauvreté.

" Les animaux servent à la traction dans un contexte de

faible mécanisation de l ’agriculture.
Problématique (2)
Ces avantages sont en grande partie grugés par les TAA
transmises par les glossines (tsé-tsé)
 Problématique (3)
Les TAA constituent 1 véritable problème de développement
A l ’échelle du continent, les pertes attribuables aux TAA sont estimées
annuellement à $1338M soit environ 1000 milliards de FCFA.

La maîtrise du péril trypanosomien

-le manque de sensibilité et de spécificité (microscopie et sérologie)
-la cherté (la PCR notamment)

Dans ce contexte, les objectifs poursuivis par ce travail sont:

Objectifs de l ’étude (1)

Objectif général
! Améliorer le diagnostic des TAA

Objectif spécifique:
! Mise au point d ’un test PCR unique simple et peu
coûteux
 Matériel & Méthodes
A-Matériel
Matériel biologique
-Prélèvement sanguin
- Organes du vecteur

2 couples d ’amorces TRYP-A & TRYP-B

Amplifient l’ITS1 de l’ADNr des trypanosomes
Matériel (2)
Séquences et GC% des différentes amorces

TRYP-A
ITS1AF 5’CTC TGC GGG ATT CCT TGC 3’ (GC%=61)

ITS1B-R 5’TTG CTG CGT TCT TCA ACG AA 3’ (GC%=45)

TRYP-B

ITS1C-F 5’ CCG GAA GTT CAC CGA TAT TG 3’ (GC%=50)

ITS1B-R 5’ TTG CTG CGT TCT TCA ACG AA 3’ (GC%=45)

Matériel (3)
Taille des produits d’amplification avec les amorces
TRYP-A & TRYP-B

Espèces de Tailles des produits Taille des produits

Trypanosome avec TRYP-A (pb) avec TRYP-B (pb)
T .viva x 600 230
T. evansi 810 550
T. equiperdum 810 550
T .b. bruc e i 810 550
T.congolense forêt 1070 710
T.congolense kilifi 650
T .c ongole nse 700
savane
T. simiae 400
T. theleiri 710 (faible) Pas d’amplification
Méthodes

* Infection des souris :

*Collecte & traitement des BC

Le sang est centrifugé à 3.000 tr/min/10min dans 1 microtube à

hématocrite.
Le BC est recueilli par section du microtube à 1mm au dessous .

*Traitement au chelex 5%:

Méthodes (2)
Extraction & évaluation de la pureté de l ’ADN
*Filtration des trypanosomes

Extraction de l ’ADN
(kit d’extraction Promega)

Contrôle de la qualité et de la pureté de l’ADN

Dosage des extraits: [ADN]= DO260nm*d*50µg/ml.

Méthodes (3)
Électrophorèse

Gel d’agarose 2%:

Migration électrophorètique
Paramètres d ’amplification

Composition des mélanges réactionnels des programmes 1& 2

MgCl2 dNTP Amorce Taq Pol BSA ADN Vol total

P1 1,5 mM 200 μM 1 μM 0,5 unité - 1µl 10 µl

P2 35mM 490 μM 0,2 μM 0,75 1,5 1µl 24 µl

unité mg/ml

Programmes d’amplification
Préchauffage Dénaturation Hybridation Elongation Cycles

P1 94°/2min 94°C/30 sec 50°C/45 sec 72°C/30 38

sec
P2 95°/5min 94°C/1 min 57°C/1 min 72°C/1,2 35
min
Résultats et Discussion
Produits d ’amplification de l ’ITS par TRYP-B (Pr.1).

200 pb
300 pb
400 pb

500
600 pb
1000 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T- 14

L2 (TCS), 3 (TCK), 5 (TCF), 6 (TB), 7 (TBg), 8 (TBr), 9 (Teq), 10 (TS), 11 (TG), 12 (TV), T-
Produits d’amplification de l’ITS par TRYP-B (Pr.2).
Amplification de tous les ADN T.vivax compris
Le Test est donc:
- sensible
- spécifique (espèces & sous espèces)

200 pb
300 pb
400 pb
500
600 pb

1000 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T- 14

L2 (TCS), 3 (TCK), 5 (TCF), 6 (TB), 7 (TBg), 8 (TBr), 9 (Teq), 10 (TS),

11 (TG), 12 (TV), T-
Amplification des échantillons de terrain par le Programme1
Seuls qlqs échantillons ont été amplifiés lignes 2, 3 (TV); 11(TB)
=> Optimisation des paramètres de la PCR

100 pb
200 pb
300 pb
400 pb
500 pb
600 pb
1000 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 T- 16

L2-6 (TV); 7-11 (TCS); 12-14 (TB);15 (T-); 1,16 MM

 Optimisation des paramètres PCR
Variation de la [] des réactifs & de la durée des cycles
d ’amplification entre autres.

! Programme 2 ! Programme 3

! MgCl2 35µM ! MgCl2 1,5µM

! dNTP 490 µM ! dNTP 200 µM
! Amorces 0,2 µM ! Amorces 0,2 µM
! Taq pol 0,75U ! Taq pol 1U
! BSA 1,5µl ! BSA 0,63µl
! ADN 1µl ! ADN 1µl
! Volume total: 24µl ! Volume total: 10µl
Produits d’amplification des échantillons de terrain par le Programme 3:
Lignes 2-6: TV; lignes 8-12: TCS; lignes 14-17: TBB;
lignes 1,19: MM; T-: contrôle -

100 pb

200 pb

300 pb
400 pb
600 pb
1000 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 T- 19

Ces réultats montrent que notre test est sensible et spécifique sur les
échantillons de terrain. Sensibilité comparable avec la PCR mono
Produits d ’amplification des échantillon de l’insecte vecteur
 Seuil limite de détection sur ADN purs
[TCS]=0,379ng/µl
[TB]=0,364ng/µl
[TV]= 0,043ng/µl

Lignes (2-7):TB; (8-14):TCS; (15-21):TV;(22) Contrôle -; (1,23):SL100

100 pb
200 pb
300 pb
400 pb
600 pb
1000 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 181920212223
Seuil limite de détection sur échantillons de terrain
Détection d ’une infection mixte
Évaluation du coût de la technique
- Ces résultats montrent que le prix d ’une PCR mono permet
d’analyser 2,5 fois plus d’échantillons(hôte) avec la PCR-ITS
- La PCR-ITS des éch. de l ’insecte vecteur permet d ’économiser
3391,104 fcfa
=> La PCR-ITS présente l ’avantage certain de réduire prix de
revient de al technique PCR
1 2
Valence Coût unitaire Nombre de Coût total
(fCFA) PCR (fCFA)

Mono Hôte
1 6 3 3 ,4 5 6 3 1 9 0 0 ,3 6 8
Vecteur
1 6 3 3 ,4 5 6 9 5 7 0 1 ,1 0 4

ITS Hôte
>1 770 1 770
Vecteur
>1 770 3 2310
 Conclusion
Notre travail a permis de développer un test pantrypanosomique:
(i) Spécifique (espèces et sous -espèces)
(ii) Sensible sur les échantillons de terrain
(iii) +accesible que les précédents tests
Animal souffrant de trypanosomose