Génotoxicité de nanomatériaux

de dioxyde de titane et
d’aluminium : résultats et
interrogations issus du projet
ANR SolNanoTox
Valérie FESSARD
 CONTEXTE Qu’est ce qu’un nanomatériau (NM) ?

Nano-objets
Commission européenne 2011 Commission Européenne (2011/696/UE)

« un matériau naturel, formé

1D 2D 3D
accidentellement ou manufacturé contenant
des particules libres, sous forme d’agrégat
ou sous forme d’agglomérat, dont au moins
50 % des particules en nombre, présentent
une ou plusieurs dimensions externes se
situant entre 1 nm et 100 nm. » Nanofeuillets Nanotubes Nanoparticules
CONTEXTE Propriétés intéressantes

500 5 nm
nm
% d’atomes en 45 92
surface % %
réactivité + ++++
meilleure
stabilité thermique
résistance mécanique
propriétés optiques, catalytiques…
 CONTEXTE Dans de nombreux secteurs industriels

Electronique

Textile
Cosmétique
Emballages : conservation et stockage

ALIMENTAIRE
Additif alimentaire : colorant, opacifiant,
Médecine
antiagglomérants…
Automobile
aéronautique
Nanocapsules : vecteur de molécules et
Energie principes actifs
CONTEXTE Source d’inquiétudes
Croissance exponentielle Présence dans de nombreux
produits
NANOFOOD MARKET

Helmut Kaiser Consultancy, 2004

LNE, 2016

Cancérigènes 1 ou 2B (CIRC) Demande sociétale forte

Nanotubes de carbone, fibres de
IDENTIFIER ET CARACTÉRISER LE
carbure de silice…
DANGER POUR UNE MEILLEURE
Etudes par INHALATION ÉVALUATION DU RISQUE

Par voie ORALE ?

CONTEXTE Des facteurs intrinsèques aux NMx

Compositions chimiques multiples: Si, TiO2, Al, Al2O3, Cu, Fe, Ni, Co, Cu,
Pd, Pt…

Multiplicité des
paramètres physico-
chimiques
 CONTEXTE Des facteurs extrinsèques aux NMx

Affinité pour les composants

des matrices et milieux
Biodistribution
biologiques Réponse
CORONA
toxique
Accumulation
CONTEXTE Le TiO2 et l’Al

INSOLUBLE Dioxyde de titane Aluminium

SOLUBLE ?
TiO2 Al

NM103 NM104 Al2O3 Al°

COMPOSITION
HYDROPHOBE HYDROPHILE
CHIMIQUE
CONTEXTE Pourquoi le TiO2 ?
TiO2
Antioxydant, Antimicrobien Cancérigène possible (Classe 2B CIRC) –
inhalation

E171

Promoteur de tumeurs (colon rats)

E171 (colorant blanc)
~ 36 % en nombre
nanométrique
Les NMx ?
Données NOMBREUSES

mais

CONTRADICTOIRES !!

 Peu de données sur la forme cristalline rutile

CONTEXTE Pourquoi l’Aluminium ?

Surtout Al2O3
stabilité chimique et thermique
anti-oxydant
Voie ORALE ?
NMx ?

ex: E173-Al0 - colorant gris

~ 40 % en nombre nanométrique
Données quasi inexistantes pour l’Al0
Données rares pour l’Al2O3

Cibles et effets rapportés pour les NMx d’Al

Ions / NMx ?
proches des sels d’Al (solubles)
 METHODES

PROGÉNITEUR ETAT DIFFERENCIE

Lignée cellulaire
humaine  Différenciation
intestinale Caco-2 j 21
 Fonctions proches des
cellules primaires
bil humaines
Lignée cellulaire j 28  Modèles bien
humaine hépatique Hp
HepaRG caractérisés

Hp : hépatocytes, Bil: cellules biliaires

Sprague Dawley
 METHODES
Test du micronoyau : Dommages chromosomiques

 Ligne directrice OCDE 487 in vitro et 474 in vivo

MORT CELLULAIRE

STRESS OXYDANT

Gènes
GENOTOXICITE

INFLAMMATION
 METHODES
Test des comètes : lésions primaires de l’ADN

 Ligne directrice OCDE 489 in vivo

traitement

MORT CELLULAIRE

Lésions de l’ADN FPG + Lésions oxydatives

STRESS OXYDANT
de l’ADN
CDB, CSB, Alk OH
. O2
.-

GENOTOXICITE électrophorèse

CDB : cassures double brin, CSB:

cassures simple brin, Alk : sites
INFLAMMATION
alcali-labiles,
FPG:Formamidopyrimidine DNA
glycosylase
Dommages à l’ADN
 RESULTATS TiO2
Absorption cellulaire
CTR NM 103

NM 103- HepaRG Nucleus

C
Cytoplasm
Caco-2

Lipid
TiO2

C
HepaRG

444 cm-1
TIO2

1µm
N : Noyau, C: cytoplasme Confirmer par microscopie
Absorption dans le cytoplasme RAMAN
 Caco-2 et HepaRG
 NM103 et NM104

Jalili et al, 2018 14

 RESULTATS Al0 et Al2O3
Caco-2
Absorption cellulaire
Al0
Al2O3

3 - 80

Al0
24 h N
µg/cm2

21 µg/cm2 N
Intestinale Hépatique
Caco-2 HepaRG
N
N
ETAT DIFFERENCIE
Al2O3

Internalisation cellulaire
 Caco-2 et HepaRG 1 µm
39 µg/cm2
 Al0 et Al2O3

Jalili et al, 2018

 RESULTATS TiO2
Génotoxicité : lésions de l’ADN
CDB
FPG + O OH
CDB, CSB, Alk 2 .
H2 H2A .-
Caco-2 P AX X Caco-2 Caco-2
3.0
Fold γH2Ax intensity

NM103 24h 60

Tail intensity (%)

2.5 * *

Tail intensity (%)

NM103
NM104 30
24h 120 24h
2.0 15 NM104 *
80
1.5
10 30
1.0
20
0.5 5 10

 Pour les deux types cellulaires

0.0 0 0
0 2.4 7.4 22.4 33.7 67.4 MMS 0 2.4 7.4 22.4 33.7 67.4 MMS
0

5
10
20
40

ME 0
1.2
2.5

N
8

4
HepaRG  Pour NM103 et NM104
HepaRG HepaRG
Fold γH2Ax intensity

*
 A 3 et 24 h
60

Tail intensity (%)

*
Tail intensity (%)

3 120 30 NM103
15 NM104 *
80
2
10 30
1 20
5
10
0 0
0
0 2.4 7.4 22.4 33.7 67.4 MMS 0 2.4 7.4 22.4 33.7 67.4 MMS
0

5
10
20
40

MM 0
1.2
2.5

S
8

µg/cm 2 µg/cm 2 µg/cm 2

Pas de CDB Pas de CSB, CDB, Alk Pas de lésions oxydatives de

CSB/CDB : cassures simple / double brin, Alk : sites alcali-labiles,
FPG: Formamidopyrimidine DNA glycosylase
l’ADN
Jalili et al, 2018
RESULTATS TiO2
Génotoxicité : dommages
Génotoxicité
chromosomiques

HepaRG : NM 104 – 64 µg/cm2

Acridine orange MGG

Interférence fluorescente et optique Jalili et al, 2018

RESLTATS
RESULTATSB Al0 et
AlAl
et2OAl32O3 toxiques / génotoxiques?
Génotoxicité : lésions de l’ADN

Caco-2 HepaRG

100 *
Al 100
Tail intensity (%)

50 Al2O3 50
* *
40 40

20 * 20

0 0
0
3
9

3
9

0
3
9

3
9
28
40
80

28
40
MM80

28
40
80

28
40
MM80
S

S
µg/cm2 µg/cm2

Al0 ↑ lésions de l’ADN Caco-2/HepaRG

 RESLTATS
RESULTATSB Al0 et
AlAl
et2OAl32O3 toxiques / génotoxiques?
Génotoxicité : lésions de l’ADN
Non
traités
Interférences
60
NMx
50
% Tail intensity

40
30
10
8
6
4
2
0
l9

9
0

40
Pas d’interférences
l4

3
A

l2 O

3
A

l2 O pour Al2O3
A

Al0 capables d’induire des dommages àµg/cm

l’ADN2
indépendamment du traitement
= FAUX POSITIF
RESULTATS Al0 et Al2O3
Génotoxicité : dommages chromosomiques 24h
15
Caco-2

100
% BNMN

10

RI (%)
AlO Al2O3

0
5

0 -100

S
0
3
3
9

3
3
9
28
40
80

28
40
80

M
M
HepaRG Pas d’↑ du nombre de
15
micronoyaux
100
% BNMN

10

RI (%)
AlO Al2O3
0
5

0 -100
0

3
9
28
40
80

3
9
28
40
80

S
M

µg/cm2
M
 RESLTATS
RESULTATSB Al0 et
AlAl
et2OAl32O3 toxiques / génotoxiques?
Génotoxicité : lésions de l’ADN
Caco-2
100
*
Tail intensity (%)

Al2O3

50 *
40
*
20
0

Al2O3 ↑ lésions
0

28

40

80

S
M
M
HepaRG oxydatives de l’ADN
*
100 uniquement Caco-2
Tail intensity (%)

50
40
20
0
0

9
28

40

80

90

S
M
M

21
 RESLTATS
RESULTATSB Al0 et
AlAl
et2OAl32O3 toxiques / génotoxiques?

A Al2O
l0 3
3 jours
3 gavages
28 jours

6, 12,5 et 25 mg/kg/j

Tests
micronoyau
Comètes
GENOTOXICITE FPG -
In vivo ?
Comètes
FPG +
RESLTATS
RESULTATSB Al0 et
AlAl
et2OAl32O3 toxiques / génotoxiques?
3 jours 28 jours

Colon Intestin Foie Colon Intestin Foie

Tests Al0 Al2O3 Al0 Al2O3 Al0 Al2O3 Al0 Al2O3 Al0 Al2O3 Al0 Al2O3

micronoyau - - / / / / - - / / / /
Comètes
FPG - - - - - - - - - - - - -
Comètes
FPG + - - - - - - - - - - - -

Pas de génotoxicité
 Colon, foie, intestin
 Al0 et Al2O3
 RESLTATS
RESULTATSB Al0 et
AlAl
et2OAl32O3 toxiques / génotoxiques?

Al0 Al203 AlCl3

In vitro +
24 h
Génotoxicité ? Lésion oxydatives
Caco-2
-
-
In vivo
Génotoxicité
3 jours (colon, intestin, foie) - - -
28 jours
 CONCLUSION GENERALE
TiO2

 Les 2 formes rutile testées non génotoxiques in vitro

 Pas d’effet de la composition de surface hydrophobe/hydrophile

Mais perturbations et différences entre NM103 et NM104 plus fines

• Internalisation
• Homéostasie du cuivre
• Composition lipidique membranaire
• Enzymes du métabolisme ?
 CONCLUSION GENERALE
Al0 et Al203

 In vivo : pas d’effet génotoxique dans l’intestin, le colon et le foie pour les 2 nanos

 In vitro :
 Al0 problème avec le comète
 Al2O3 semble lié à un stress oxydant

 Pas d’effet des ions AlCl3

Mais effets sur d’autres organes

 CONCLUSION GENERALE

Interférences in vitro

 Interférence différente selon les nanos

• Adapter les tests de génotoxicité Comètes  Isolement des noyaux ?

Micronoyaux
 cytométrie combinée au
cycle cellulaire?
 Remerciements
Unité de Toxicologie des
Contaminants, ANSES Fougères

Projet SolNanoTox (2013-2017)

(ANR-13-IS10-0005-01)

Institut fédéral allemand d'évaluation Plateforme d’imagerie cellulaire

des risques (BFR) (Mric)

Institut des Sciences Chimiques de Institut de physique et de biophysique médicale,

Rennes UMR 6226 université de Leipzig

Thèse Pégah JALILI

Université Rennes 1
4 Avril 2018