Master 1 Biochimie

appliquée

Structure et fonction des

protéines

Biochimie des macromolécules

Responsable du module Dr. BAKLI Mahfoud

E-mail: mahfoud.bakli@gmail.com
1. Les acides aminés : Structure-Propriétés-Classification

Définition: acide aminé

• Les acides aminés sont les constituants fondamentaux des

Ca
peptides et des protéines.
COOH
• Un acide aminé est un acide carboxylique qui possède également
un groupe fonctionnel amine et une chaîne latérale R varié. H C NH2
• Ces deux fonctions sont portés par un même atome de carbone
R
(noté α).

• Ces chaînes latérales diffèrent les unes des autres de différentes

façon: - Taille
- Charge
- Solubilité dans l’eau
• Il existe une centaine d’acides α-aminés, mais 20 d’entre eux sont
quasi uniquement impliqués dans la construction des peptides et
protéines naturels (synthèse des protéines).
Définition: Peptide

• Les peptides: sont des éléments chimiques (synthétiques ou naturels) de la famille des
protéines.

• Un peptide est formé lui-même de plusieurs acides aminés relié entre eux par des
liaisons peptidiques.

• Protéines: nombre d’acides aminés >100

• Polypeptides : 10 < nombre d’acides aminés < 100

• Oligopeptides : nombre d’acides aminés < 10

ex: l’aspartam contenant deux acides aminés (dipeptide)

Les 20 acides aminés

4
 Structure des 20 acides aminés
1. acides aminés hydrophobes

• Tous ces acides aminés sont insoluble dans l’eau.

• Note: la glycine n’est pas optiquement active. Pourquoi?
5
 Structure des 20 acides aminés
1. acides aminés hydrophobes

• Proline est le seul acide aminé à avoir une chaîne

latérale cyclique;
Structure des 20 acides aminés 2.
Acides aminés aromatiques
 Structure des 20 acides aminés 2.
Acides aminés aromatiques
• Tyr, Trp et Phe sont très utiles:
– Leur noyau aromatique absorbe
l’UV à 260-280 nm.

– Constitue la base de la détection

des protéines à 280 nm.

Absorbance
max Molar
(nm) Absorbance
(M-1 cm-1)

Phenylalanine 257.4 197

Tyrosine 274.6 1420

Tryptophan 279.8 5690

Structure des 20 acides aminés
3. acides aminés polaires, non-chargés
 Structure des 20 acides aminés
Cystéine et cystine

En biochimie:
-oxidation: perd H
-Réduction: gagne H

Pont disulfure
Structure des 20 acides aminés Tyr,
Ser, ThrSer
PO4-3
ATP

Protéine Protéine
kinase phosphatase

ADP H2O

O-
- P=O
Phospho-Ser O-
Structure des 20 acides aminés
4. Acides aminés chargés négativement
 Structure des 20 acides aminés
4. Acides aminés chargés négativement
100% D
pH
9.5
pKa2

100% C

pKaR
pKa1 pKaR pKa2 4.1
pKa1
A B C D 2.1
100% B

Quel est le pI du glutamate? 100% A

NaOH
Structure des 20 acides aminés
5. Acides aminés chargés positivement
 Structure des 20 acides aminés
5. Acides aminés chargés positivement:His

pKa2

pKaR
Structure des 20 acides aminés
Valeurs des pKa des acides aminés
 Titrage des acides aminés
scénario le plus simple:

• pI = point isoélectrique= pH
Tampon! où 100% zwitterion

• pI = pKa1 + pKa2
2
Tampon!
• La fraction de groupe COOH
ou NH2 qui est chargé à un
pH donné peut être trouvé
par l’équation d’Henderson-
Hasselbach:

pH = pKa + log A-
HA
17
Propriétés générales des acides aminés

• Notez que le Ca est lié à 4 groupes

différents: il est donc chiral;

• Deux stéréoisomères sont distingués:

– L-acides aminés
– D-acides aminés

• Seuls les acides aminés de la série L

servent à faire les protéines.

 L = le groupe amino est à gauche dans la

représentation de Fisher.
 L et D: convention. N’a rien à voir avec la
direction de rotation de lumière polarisée.
 Propriétés générales des acides aminés

• Chaque acide aminé possède au moins deux groupes ionisables:

– Acide carboxylique (COOH)

– Amine (NH2)

Charge nette: +1 pKa 1 Charge nette: 0 pKa 2 Charge nette: -1

(pH 2-2.5) (pH 9-10.5) pH alcalin
pH acide
Zwitterion
19
Propriétés physiques des acides aminés:
 a. Solubilité :
• Les Acides aminés sont solubles dans l’eau.
• Faiblement solubles dans l’alcool.
• La solubilité dans les solvants apolaires dépend de la chaine latérale.

 b. Pouvoir rotatoire :

• Les acides aminés comprennent tous, 1 ou 2 carbones asymétriques: ce sont des molécules
chirales, à l’exception de la glycine.

• Les acides aminés possèdent une activité optique: C’est la propriété de dévier la lumière
polarisée.

 c. Coloration et absorption de la lumière :

• Les solutions d’acides aminés sont incolorer.

• la plupart des acides aminés absorbent à une longueur d’onde < 230nm
Propriétés chimiques des acides aminés :
A-Propriétés de la fonction carboxylique
 a. Estérification par un alcool: en présence d’un acide fort:

• Réaction utilisée pour séparer les aminoacides en phase gazeuse (et même en phase liquide)
en produisant des dérivés esters butyliques.

 b. Formation d’amide (liaison peptidique):

synthèse peptidique (lier le carboxyle d'un aminoacide avec l'amine du suivant).

Propriétés chimiques :
B-Propriétés liées au groupe NH2

• Formation d’imine « base de Schiff »: réaction avec aldéhyde: Addition de

carbonyle Sauf la proline qui contient une fonction amine secondaire.
2. Les Peptides : Structure-liaison peptidique

Définition de la liaison peptidique:

• Est une liaison amide, formé lorsque le groupe carboxyle d'un acide aminé réagit avec l'amine

d'un autre acide aminé.

• Une molécule d'eau est libérée par liaison formée.

• Permettant la formation d’un dipeptide, tripeptide etc…

 Caractéristique de la liaison peptidique

 Propriétés de la liaison peptidique :

• Crée une barrière à la rotation

• La liaison C-N possède un caractère partiel de double liaison: le motif de la liaison

peptidique est plan.

• rotation autour de la liaison Cα-N impossible, mais elle est possible autour de la liaison

N-Cα et Cα-C.
 Caractéristique de la liaison peptidique

 Configurations cis et Trans :

• Deux configurations possibles : cis et Trans

• L'équilibre favorise Trans: Les plus grands groupes sont les plus éloignés.
Nomenclature des peptides

• le nom du peptide commence toujours par l'extrémité N terminale, chaque acide aminé étant

affecté du suffixe -yl, sauf pour le dernier qui garde son nom complet, sans suffixe.

– Exp: le leucyl- glycyl- alanine (tripeptides).

Propriétés chimiques des peptides:

• Les peptides présentent les réactions chimiques de radicaux portés par les chaines latérales
des résidus d’acides aminés.

• Si le peptide contient un résidu de cystéine il peut former une liaison S-S : pont disulfure.

• Le plus petit peptide donne la même réaction que les acides aminés avec la ninhydrine.

• Le réactif de coloration biuret réagit avec les peptides contenant plus de 4 acides aminés.

• Hydrolyse de la liaison peptidique en présence.

Propriétés physiques des peptides:

• Les peptides sont d’autant plus solubles dans l’eau qu’ils sont plus petits et contiennent d’avantage

d’acide aminé hydrophile.

• Ils sont chargés : ils contiennent un groupement NH3+ (aminoterminale) et un groupement C00-(C-

terminal) et des groupements ionisables sur les chaines latérales des résidus acides aminés.

• Ils se comportent comme un ion dipolaire et peuvent migrer dans un champ électrique.

• Ils absorbent la lumière dans l’ultraviolet (λ: 220 à 230 nm ou à 280 nm s’ils contiennent un acide

aminé aromatique.
Propriétés biologiques des peptides

• La plus part des peptides sont formés comme les protéines par le système de synthèse
protéique.

• Hydrolyse enzymatique des peptides se fait par les peptidases (digestives).

• Les rôles sont nombreux, mais on peut citer :

 Les peptides hormonaux

 Les peptides de structure
 Les peptides antibiotiques

• Beaucoup d’antibiotiques utilisés en thérapeutique sont des peptides synthétisés en

laboratoire.
Mode de représentation d’une séquence peptidique:

• La chaîne qui comprend les liaisons amide est appelée la chaîne principale, alors que les

substituants, R, constituent les chaînes latérales.

• Les peptides ont toujours une extrémité amine libre ou extrémité N-terminale, et une

extrémité carboxyle libre ou extrémité C-terminale.

Méthodes d’étude des Acides aminés (dans les peptides)

• Méthodes basées sur la solubilité

• Chromotographie sur Papier

• Chromotographie sur Couche Mince

• Chromatographie en phase gazeuse

• Méthodes basées sur la charge

• Electrophorèse

• Chromatographie échangeuse d’ion

• HPLC
 Structure des peptides

• Dipeptide
– Carnosine: (constituant du muscle)
– β alanyl histidine

• Tripeptide
– Glutathion:
– γ glutamyl cystéinyl glycocolle
– Liaison avec la fonction γ carboxylique

33
 Peptides

• Hormones hypothaliques: 9 AA
 Structure des peptides

Glucagon: 29 AA. Hormone pancréatique: Chaine monocaténaire.

Structure des peptides

Insuline
 Dans l'enchainement des plans peptidiques, il y a 2 degrés de liberté.
-L'angle de rotation autour de la liaison C-Ca déterminé par y (N, Ca,C, N)
-l'angle de rotation autour de la liaison Ca-N déterminé par f (C,N,Ca,C)

La structure du squelette de la protèine (Cα) est dèterminè par ses 2 angles

pour chaque acide aminè
 En raison de l'encombrement stèrique, tous les angles φ, ne sont pas permis

Le diagramme de Ramachandran est une representation graphique permettant

d'analyser la conformation du squelette polypeptidique des protèines. Pour chaque
acides aminè de la protèine, on porte la valeur de l‘angle dièdrale φ en abscisse et
celle de l'angle dièdral ψ en ordonnèe, pour des valeurs de -180 à +180 degrès.

Diagramme de Ramachandran
I I I

+
+
4
+
ll y des régions autorisées qui correspondent aux:
Feuillet β
Hélice α
..' Feuillet β
60
: ' +
·
ψ Hélice α gauche
0 4 - Très court (pas de structure secondaire)
+

+ +
-60 Ainsi, une protèine va se replier soit en hélices,
Hèlice α
soit en feuillets.
4

-120 -
+
4
+
4
+
4fl I I I

-180 -12 0 -60 0 60 120 180

φ
 Exceptions

La glycine
Ne possède pas de chaine latérale va pouvoir adopter n'importe quelle conformation.

La proline
est un résidu cyclique, impose des contraintes aux angles f,y

Les glycines et les prolines sont souvent absentes des structure secondaire.
Elles servent à rompre les structure secondaire.
 Les hélices α

4 f l a t l l l l l l l . h l .
. .=:. ·.::· ... ·:_. :;è·· .. +
+
+
+

% . « Si les angles dièdres , de la chaine principale sont

.' · d'environ -57° et -69°. La chaine principale adopte une
60
structure pèriodique appelès hèlice 0 .
1jJ
0

-60

Hèlice a

-120

C'est une structure compacte

] f h . 6 h
-180 -120 -60 0

<I>
60 120 180
L'hèlice α tourne à droite

Reprèsentation schèmatique de la chaine principale (Cα ou backbone)

C'est la structure secondaire la plus abondante.

Elle a une longueur de 10 acides amines en moyenne
 Les feuillets et brin β

+
+
+
+

Si les angles dièdres , de la chaine principale sont

d'environ -135° et 135°. La chaine principale adopte une
structure ètendu appelès brin β.
60

. t d
1jJ +++
0

+ +
-60

Hèlice a

-120

] f h . 6 h
-180 -120 -60 0 60 120 180

Reprèsente environ 20-28 % des acides aminès dans les

structure globulaire.
Le brin a une longueur de 6 acides amines en moyenne

Le brin β n'est pas stable par lui-mème. ll a besoin de former des liaisons
hydrogène avec d'autres brins β. Deux topologies sont possibles:
-feuillet parallèle
-feuillet anti parallèle
3. Etude structurale des protéines : Codage informationnel dans les structures

Asp Tyr

Met
Leu

44
On distingue 4 types de structures de complexité croissante pour caractériser une
protéine :
Transcription Traduction
Structure primaire
Structure secondaire

La structure secondaire est caractérisée par des motifs structuraux (hélice a, feuillet  …

dont la propriété principale est de stabiliser la structure de la

protéine par un caractère répétitif de liaisons hydrogènes intramoléculaire

Structure secondaire : Hélice
Hélice a droite
Conformation repliée impliquant des liaisons hydrogènes répétitives entres
atomes de la chaîne principale (NH et CO) des résidus i et i+4
Structure secondaire : Hélice
Hélice a droite
Structure secondaire : Feuillets 

Le module de base est le brin  dont la conformation est très étendue

Cette conformation n’est pas stable si elle est isolée car aucune liaison H.
Elle n’est stable que dans des feuillets , dans lesquels les liaisons H
s’établissent entre les CO et NH deux brins  différents soit parallèles soit
antiparallèles
Structure secondaire : Feuillets 

Feuillets  parallèles
Structure secondaire : Feuillets 

Feuillets  antiparallèles
Structure secondaire : Feuillets 

Feuillet de 4 brins antiparallèles

Feuillet antiparallèle

Feuillet parallèle
Structure secondaire : Coude (ou Tour)

Le coude permet une inversion de direction de la chaîne principale

Structure secondaire : Boucle

 Séquences plus longues que pour les coudes : plus de 4 résidus

 Peuvent alors prendre un plus grand nombre de conformations que les coudes

 Ces boucles connectent généralement des hélices entre elles, ainsi que des

hélices avec des brins , ou encore deux brins  n'appartenant pas au même

feuillet.
Structure tertiaire

La structure tertiaire décrit le repliement dans l’espace des différents motifs

de structures secondaires en une architecture et une topologie particulière

ainsi que l’orientation des différents radicaux d’aa.

Structure tertiaire

La structure tertiaire est stabilisée par :

 des liaisons covalentes : les ponts disulfures
 des liaisons hydrogènes
 des liaisons ioniques
 des liaisons hydrophobes Pont
 des interactions de Van der Waals disulfure

Liaison ionique
Liaison
hydrogène

Forces d’attraction de Van der Waals

entre les atomes (en noir) en contact
Structure tertiaire : Domaines

Domaine

Partie de la séquence d’une chaîne protéique qui se replie en structure

tertiaire compacte, indépendamment du reste de la chaîne .

Quasiment toutes les grosses protéines sont composées de plusieurs

domaines souvent associés à des fonctions précises.
Structure tertiaire : Domaines

Les domaines sont reconnaissables à leur repliement (fold) qui est décrit par
l’architecture et la topologie :

 La disposition des éléments de structures secondaires est unique

(ou très proche) dans une architecture donnée.
Ceci ne signifie pas que les éléments secondaires sont identiques,
ni en séquence, ni en taille, ni en connexion (topologie) entre eux.
Par contre, on reconnaît une architecture déterminée.

 La topologie définit le mode de connexion entre les éléments de structures

secondaires
Structure tertiaire : Domaines

Exemple : le repliement A est différent du repliement B, bien que leur architecture soit
la même
Structure tertiaire : Domaines a

Domaines en faisceau (en fagot)

Hélices a particulièrement grandes et de tailles semblables assemblées de
façon quasi antiparallèle avec des connexions courtes en coude entre chaque
hélice. La stabilisation des interactions entre hélices se fait essentiellement par
des liaisons hydrophobes.
Un des domaines de
l’apolipophorine : 5 hélices a
Un des domaines de la
Sérine-tRNA synthétase : 2 hélices a
Structure tertiaire : Domaines a

Domaines en faisceau (en fagot)

Endotoxine  Bacillus thurigensis

Structure tertiaire : Domaines a

Domaines compacts

1- Une face de chaque hélice est tournée vers l'extérieur, l'autre vers l'intérieur
2- Le compactage se fait autour d'un coeur qui a le diamètre de 2 résidus
3- L‘ empaquetage est compact, avec le même nombre de contacts inter-hélice
pour chaque hélice
4- L'empaquetage est sensiblement sphérique (hélices de taille comparable)
Structure tertiaire : Domaines a

Domaines compacts
3 hélices (angle 20°)
Récepteur de la phéromone
d’appariement sexuel chez les ciliés

3 hélices (angle -50°)

4 hélices
Protéine de segmentation
Domaine OCT1 de POU
des embryons
Structure tertiaire : Domaines a

Domaines compacts

7 hélices
Lysozyme
Structure tertiaire : Domaines 

Hélices de brins 
Les brins  peuvent s'organiser en feuillets qui s'enroulent eux-mêmes en hélices
Elles peuvent contenir deux ou trois brins par tour.
Elles peuvent former des hélices gauche ou droite.
Hélice gauche à 3 brins/tour
Brins en feuillets parallèles
Hélice droite à 2 brins/tour
Brins en feuillets parallèles
Structure tertiaire : Domaines 

Tonneaux 
Chimotrypsine
n=6

Maltose perméase
n=18
Structure tertiaire : Domaines a/

Tonneaux a/
Des brins  parallèles et consécutifs sont rassemblés en tonneaux et sont
connectés par l'intermédiaire d'une hélice a selon un enroulement droit, ce qui
impose que les hélices soient à l'extérieur du tonneau.

8 brins, environ 200 aa

Structure quaternaire

La structure quaternaire décrit les interactions entre plusieurs chaînes

polypeptidiques ayant chacune une structure tertiaire indépendante.
Chaîne polypeptidique : sous-unité appelée monomère
2 chaînes  dimère
3 chaînes  trimère….
Structure quaternaire  Agencement dans l’ espace des monomères entre eux

La structure quaternaire est stabilisée par des liaisons interchaînes :

 des liaisons covalentes : les ponts disulfures

 des liaisons hydrogènes
 des liaisons ioniques
 des liaisons hydrophobes
 des interactions de Van der Waals
Structure quaternaire
4. Stabilité, repliement et dynamique des protéines
2. Repliement des protéines

Définition: Le processus par lequel la chaîne polypeptidique d'une protéine acquière

une structure tridimensionnelle s'appelle le repliement.
Il existe

-Le nombre de conformations d'une chaîne polypeptidique de n acides aminés

(susceptibles d'adopter s structures secondaires) est sn.
- Les polypeptides non repliés se meuvent dans un entonnoir énergétique vers la
structure de la protéine vative

Stabilité de l’état natif, replié

7
Une recherche au hasard de toutes les conformations possibles accessibles à une
protéine 8
 3. Stabilité d’une protéine

a. Les forces qui stabilisent la forme repliée:

· Liaisons hydrogènes intramoléculaires
· Entropie de déshydratation
· Interactions hydrophobes
· Ponts salins
· Interactions dipolaires

b. Les forces qui déstabilisent la forme repliée:

· Liaisons hydrogènes avec l’eau

· Perte d’entropie configurationnelle (voir cours thermodynamique)

9
– Une protéine est repliée : pourquoi ?

● Elle est moins stable dans l'état déplié (dénaturé)...

– Moins de liaisons hydrogène (hélice α, brin en feuillet β ...)
– Des résidus hydrophobes sont en contact avec l'eau
– Les charges ne sont pas positionnées de façon optimum.

● ex : interactions électrostatiques :
+ à coté de + ou - à coté de - : moins favorable que + avec -

État déplié État replié

10
3.1 Energie potentielle associée à une structure

● L'énergie la plus faible est la plus favorable

E =différence d'énergie entre les 2 états

stab
E
par ex : E= Enatif -EDénaturé
Dénaturé
Alors Estab est négatif et correspond à la quantité
Natif
d'énergie libérée quand 100% des protéines se
sont repliées.

11
 Une protéine résout le grand problème d'optimisation globale comme une série de petits problèmes
d'optimisation locale : elle assemble des fragments peptidiques préalablement structurés et aboutit
ainsi de proche en proche à sa structure native.

 Les études de la cinétique du repliement ont montré l'existence de structures intermédiaires

instables. La grande difficulté a toujours résidé dans l'isolement (et donc la caractérisation) de ces
intermédiaires peu peuplés et très labiles (temps de demi-vie trés courts). 14
 3. 2. L'entonnoir des paysages énergétiques ("Folding energy landscape")

Les polypeptides dépliés peuvent se mouvoir par une quantité innombrable de chemins vers la structure
tertiaire correcte. Sur ces chemins se trouvent souvent des intermédiaires stables de repliement (des
minima locaux d’énergie), mais aussi parfois des « pièges » dans laquelle la protéine reste dans un état
incorrectement replié. 15
L'une des conclusions les plus importantes est que les protéines sont caractérisées par
un paysage énergétique en forme d'entonnoir ("funnel-shaped energy landscape").
Les chaînes polypeptidiques adoptent beaucoup d'états de grande énergie et peu de faible
énergie. 17
4. Dynamique des protéines

Les protéines sont des molécules souples qui oscillent en permanence et dont les
mouvements structuraux ont une signification fonctionnelle.

19
 Dynamique à l’échelle de la protéine

Mouvements des Mouvements Changements

Liaisons Hydrogènes Liaisons Hydrogènes
chaines latérales de la protéine conformationnels
Vibration - Ruptures
- Réarrangements
- Rotations

Yao Xu; Martina Havenith; The Journal of Chemical Physics 2015,

20
Les molécules d’eau participent à cette dynamique

Protéine Protéine
inactive active

Rotation Rotation
Translation

Mouvement des molécules d’eau

à la surface des protéines

21
Le concept moderne de la catalyse enzymatique est intimement lié à la
dynamique des protéines et implique une variabilité dans l’état
conformationnel d’une protéine.

 Les échelles de temps attribué à ces redistributions de conformations de

protéines sont variables.
 Milliseconde à la microseconde - réseaux composés d'acides aminés et
reliés dans la protéine

23
Le dichroïsme circulaire: permet de caractériser la structure secondaire d’une protéine

En étudiant l’évolution de ce spectre au cours du temps, on peut donc suivre

directement les changements de conformations moléculaires, et ainsi mieux
comprendre certains mécanismes naturels, tels que la dynamique protéique.
24
5. Approcher la dynamique des protéines

A l’échelle de la protéine A l’échelle de la cellule

25
5.1. Méthodes d’approches à l’échelle de la protéine

Modélisation/Simulation

Diffraction aux Rayon X

Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)

Normal Mode Analysis of Biomolecular Structures: Functional Mechanisms of

Membrane Proteins Ivet Bahar,
Timothy R. Lezon, Ahmet Bakan, and Indira H. Shrivastava Chemical Reviews 2010
110 (3), 1463-1497
Real-Time NMR Characterization of Structure and Dynamics in a Transiently 26
Populated Protein Folding Intermediate. Enrico Rennella et al. †J. Am. Chem. Soc.,
2012,
5.2. Méthodes à l’échelle cellulaire

a. Gènes rapporteurs

b. Photoblanchiment (Photobleaching)

c. Mesure des interactions protéiques

27
 a. L’approche gènes rapporteurs

 Fusion :
 Transcriptionnelle : séquence régulatrice (promoteurs, élément de réponse …)
 Traductionnelle : expression d’une protéine hybride

28
 Suivi de la translocation

Translocation

Cytoplasme Noyau

+ dexamethasone
Cellules HeLa : Nluc (luciférase)
(15 min)
– GR fusion

Engineered luciferase reporter from a deep Sea Shrimp utilizing a novel

imidazopyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 2012, 7, 1848−1857 29
 Flurophores pour l’imagerie : la GFP

238 aa, 27 kDa

 GFP : Green Fluorescent Protein
 Protéine de 27 kDa
 Issue de la méduse Aequora
victoria (1962)
 Premier clonage en 1992
4 nm  Structure : tonneau β (11 feuillets
β/1 hélice α)
 4variants initialement dérivés
Chromophore :
Tyrosine/Glycine/Serine

3 nm

30
31
Les protéines fluorescentes les plus courantes

.
BFP-H2B - GFP-
actin -
RFP-golgi

Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells 32

and Tissues
Dmitriy M. Chudakov et al. Physiological Reviews Published 1 July 2010
Vol. 90 no. 3, 1103-1163
 c. Les interactions protéiques

 Signalisation cellulaire
 Interaction Récepteur ligand
 Assemblage de récepteurs

150 000 à 300 000

interactions
Targeting protein-protein interactions as an
anticancer strategy
Andrei A. Ivanov et Fadlo R. Khuri.
Trends Pharmacol Sci. 2013 Jul; 34(7): 393–400.

36
 Interactions protéiques : les approches

Transfert Complémentation
d’énergie fonctionnelle
. FRET . Luciférase
. BRET . Protéine
fluorescente
37
 FRET : Fluorescence Resonnance Energy Transfer
Transfert d'énergie entre molécules fluorescentes, l’excitation du
donneur provoque un transfert d’énergie vers l’accepteur qui émet
dans ses longueurs d’onde.

CFP : Cyan Fluorescent

Protein
YFP : Yellow Fluorescent
Protein

No FRET FRET

Pas d’interaction Interaction

protéique protéique
> 10 nm < 10 nm 38
 BRET : Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Le BRET, c'est donc du RET (Resonance Energy transfer, comme celle qu'on rencontre
dans le FRET), sauf qu'à la différence du FRET, le donneur n'est pas un composé
fluorescent excité par de la lumière mais une protéine engagée dans une réaction de
bioluminescence.

Substrat :
Ex :
Coelenterazine
RLuc
39
PCA : Protein complementation Assay

Luciférase

Protéine
Fluorescente

Fluorescent and Bioluminescent Protein-Fragment

Complementation Assays in the Study of G Protein-Coupled
Receptor Oligomerization and Signaling
Pierre-Alexandre Vidi and Val J. Watts; Molecular Pharmacology April
2009, 75 (4) 733-739;

40
 Interaction Récepteur ligand

CA200645 NLuc
- BODIPY

 Récepteur β2 adrénergique β2AR tagué

avec une nanoLuciférase (Nluc)
 Ligand CA200645 (antagoniste) –
fluorophore (BODIPY)
 DPCPX : Antagoniste non marqué
Leigh A Stoddart et al. (2015) Application of BRET to monitor ligand binding to 41
GPCRs. Nature Methods 12, 661-3.
Etude de voies de signalisation : BRET

Bioluminescent tools for the analysis of G-protein-coupled receptor

and arrestin interactions
Mitsuru Hattoria and Takeaki Ozawa*a
RSC Adv., 2015,5, 12655-12663 42
 Suivi des changements conformationnels

Open conformation
Closed
conformation Conformation active  Rabin 8 (activité GEF) régule
Autoinhibition (activité GEF)
Rab8 impliqué dans le traffic
intracellulaire

 BRET :
Luciférase : NanoLuc
Fluorophore couplé à un tag :
HaloTag
Kinase ERK2
inactive Kinase  Le passage à la conformation
Kinase ERK2
Dead (KD)
active active (Open) est dépendante
Constituvely de la phosphorylation
Active (CA)
Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jan 6;
112(1): 148–153.. 43
Luciférase pour le suivi en temps réel

Luciférase

 Luciférase de petite taille 19 kDa

 Très brillante > Rluc > Fluc
 Utilisable en complémentation
réversible : Clivable en deux
fragments : 11aa/156aa

 Temps de ½ vie : > 2 h 44

5. Dénaturation réversible et irréversible des protéines
1.Définitions

Dénaturation: tout processus physique ou chimique qui modifie la

structure de la protéine et la rend incapable de remplir sa fonction
biologique normale .

Que la dénaturation soit réversible dépend de la protéine et de

l'ampleur de la dénaturation.

Exemple:

• chauffer les blancs d'œufs (irréversibles)

• ondulation permanente des cheveux (réversible)

2
 Dénaturation : Perte d’activité biologique d'une protéine due à une altération de
sa conformation native.

Agents dénaturants:
Tous les facteurs capables d’entraîner la rupture des liaisons hydrogènes et
hydrophobes.

La dénaturation n’altère pas la structure primaire de la protéine : les liaisons

peptidiques sont conservées.

Si les modifications structurales sont discrètes, la dénaturation peut être réversible.

Si la protéine est incapable de reprendre la conformation native, la dénaturation est irréversible.

3
2. Critères de dénaturation :
 perte d’activité biologique,
 insolubilisation de la protéine due à l’agrégation en amas,
 élévation de la viscositédes solutions protéiques.

3.Conséquences de la dénaturation:
 Perte d'activité enzymatique (mort)
 Destruction des toxines
 Digestibilité améliorée
 Perte de solubilité
 Changements de texture

4
Effet des agents physiques

- élévation de la température : rompt les liaisons hydrogène (cuisson, stérilisation, …)

- radiations UV: photolyse des ponts

disulfures (radiations ionisantes)

- pH extrêmes : rupture de liaisons

électrostatiques et hydrogène (précipitation par les acides)

5
Effet des agents chimiques

- solvants organiques (CCl4)

- réactifs rompant les ponts disulfures

- réversiblement (réducteurs : BME, DTT)
- irréversiblement (oxydants : chlorates)

- urée, chlorure de guanidinium.

petites molécules en solution concentrée
=> dénaturation réversible (formation de liaisons H)

-détergents : dissociation des structures tertiaire et quaternaire

(effet réversible sans précipitation),

6
 4.L’urée:

Par son analogie de structure avec la liaison peptidique, l’urée

interfère avec les liaisons hydrogènes mettant en jeu cette liaison :

- liaisons H intra-protéiques (structure secondaire et tertiaire),

- inter-protéiques.

N.B: dénaturation réversible (par dialyse)

7
5.

8
9
10
6.Les détergents:

11
6.Les détergents:

12
7.Dénaturation reversible , renaturation

13
Exemple de dénaturation reversible: Kératine des cheveux

HSCH2COOH

H2O2

14
Exemple de dénaturation reversible: Agents dénaturants, ex: Urée

15
8.Dénaturation irréversible des protéines

16
 9.Méthodes d’investigation

a. Etude dynamique en présence de dénaturant tel que urée et GuHCl (guanidine hydrochloride)

D.P Hong et al., Biochemistry, 2006

Spectre DC (Dichroïsme circulaire) de la chaîne B de l’ insuline

 la concentration de dénaturant nécessaire à la déstructuration de la protéine

permet d’en estimer la stabilité. Plus la protéine est stable, plus elle est difficile à
dénaturer et plus la concentration en agent dénaturant doit être grande.
 Les spectroscopies d’absorbance et de dichroïsme circulaire sont majoritairement
utilisées du fait de leur relative facilité de mise en oeuvre.

 Lorsque la température augmente et que les structures sont détruites, le signal

17
spectroscopique associé à ces structures tend à disparaître.
 b. Mesure Tm (Calorimétrie différentielle à balayage)

 Chaque protéine est caractérisée par une température, appelée Tm

(« melting temperature ») pour laquelle 50 % des molécules sont dénaturées.

 Plus la température médiane de transition thermique (Tm) est élevé, plus la molécule est stable.

18
6. Repliement des protéines in vivo
 Pourquoi s’intéresser au repliement des protéines?

Si on pouvait comprendre le chemin de repliement des protéines on pourrait:

❖ Prédire la structure 3D d’une protéine à partir de sa séquence primaire.

❖ Créer des protéines plus stables qui se conforment plus facilement.

❖ Identifier les résidus essentiels pour le repliement (qui sont à exclure des
expériences de mutagénèse dirigée).

❖ Comprendre les maladies liées à l’altération de la conformation des protéines

(Creutzfeldt-Jakob et Alzheimer chez l’homme, tremblante du mouton, encéphalopathie
bovine et prion).
2
1. Déterminants du repliement des protéines:

a. Si le hélices α et les feuillets β prédominent dans les protéines, c’est parce qu'ils
occupent bien l’espace.

b. Le repliement des protéine se fait essentiellement sous l’influence des résidus internes.

c. La structure des protéines s’établit selon une hiérarchie.

(sous-unités - domaines - sous domaines - sous sous domaines….)

d. Les structures protéiques sont éminemment adaptables

e. Les structures secondaires des protéines peuvent dépendre du contexte

f. Changement du repliement d’une protéine.

3
 3.3. Repliement des protéines in vivo

Différences entre repliement des protéines in vivo par rapport aux expériences
in vitro ou in silico
Concentration: dans la cellule concentration est estimée à 350 mg/mL. In vitro, on
travaille à 10 mg/mL

chemin de repliement: les protéines sont synthétisées du N-ter vers C-ter. La partie N-
ter naissante peut se replier dans des formes intermédiaires
uniquement accessibles en raison de la taille réduite de la
séquence naissante.

Repliements intermédiaires: des protéines sont déplacées dans les différents

organelles et environnements de la cellule. Font-ils le passage
dans leur forme native?

Repliement assisté: Des cellules mutées, soit défectueuses pour certaines protéines
soit produisant des protéines hétérologues accumulent des
protéines natives mal repliées. Existence de protéines auxiliaires
du repliement dont la fonction est d’aider les polypeptides à se
replier pour prendre leur conformation native 11
 Exemple de repliement des protéines -Barnase

• La petite ribonucléase Barnase bactérienne a 110 AA, aucune liaison disulfure

• Se forme rapidement grâce à une seule voie

12
Benhabilès et al, 2000

13
14
 3.4. Obstacles communs au repliement des protéines

• Agrégation des intermédiaires par des interactions hydrophobes

• Formation de liaisons disulfure incorrectes

• Isomérisation des résidus de proline

15
 4. Les protéines auxiliaires

In vivo, les polypeptides prennent leur conformation native de manière efficace au fur et à mesure

de leur synthèse (processus de quelques minutes) parceque les cellules contiennent trois types de

protéines auxiliaires dont la fonction est d’aider les polypeptides à se replier pour prendre leur

conformation native et d’assurer leur assemblage pour atteindre leur structure quaternaire:

• Former et briser des ponts disulfure

- Les enzymes formant un pont disulfure: Dsb
- protéine disulfure isomérase: PDI

• "Isomérisation" des résidus de proline

- Peptidyl prolyl isomérases

• Chaperones
- Protéines de choc thermique
- GroEL / GroES complexe
- Prévenir ou casser les «interactions indésirables» ...
16
 4.1. Formation des ponts disulfure

Enzymes assistant la formation des ponts disulfure (Dsb) pendant le repliement:

• La formation de liaison disulfure covalente est une modification post-

traductionnelle (oxydation ) qui stabilise la structure 3D de la protéine
- La structure est très fluide et moins compacte que l'état natif.
- Certaines liaisons disulfure peuvent se former très lentement en l'absence
d'enzymes qui aident à la formation de liaisons disulfure (par exemple,
protéine disulfure-isomérase ou PDI).
17
 Comment corriger la forme de disulfures?

 Exemple: L'inhibiteur de la Trypsine pancréatique bovine est déplié avant la formation

des disulfures

 La protéine disulfure isomérase (PDI) catalyse l'échange interne de disulfure

 Pendant le repliement, les premiers disulfures se forment au hasard

 Des disulfures plus stables s'accumulent

18
 Protein disulfide isomerases

- Les PDIases appartiennent à un grand groupe ubiquitaire de protéines possédant le

thiorédoxine fold
- il y a peu de similarité de séquence entre les différentes protéines
- activité enzymatique globale: formation de liaisons disulfure correctes
- formation (I) et réduction (II) des liaisons disulfure (III), (Correction)

forming

breaking

correcting

- tous les membres de cette grande famille ne peuvent pas catalyser l'isomérisation des liaisons
disulfure
- la spécificité du substrat diffère entre différents membres

- LOCALISATION:
- le cytoplasme a un environnement réducteur où les liaisons disulfure ne se produisent pas
• les protéines liées au disulfure se trouvent dans le réticulum endoplasmique chez les
eucaryotes; protéines sécrétées
• espace périplasmique chez les procaryotes 19
 4.2. Isomérisation des prolines
 Les polypeptides se forment habituellement avec la configuration trans de résidus, qui
est environ 1000 fois plus stable.
 Lorsque la proline est le second résidu en séquence, la configuration trans est
seulement ~ 4 fois plus stable que la cis.

~ 7% ~ 93%

Peptidyl prolyl isomérases (PPIases) sont des enzymes

accélerant l’isomérisation des prolines

Cyclophilins

20
4.3. Les protéines chaperonnes
Pendant le processus de repliement des régions externe hydrophobes
Risque d'agrégation des protéines
Chaperons offrent une protection
Sont principalement formés à des températures élevées (si nécessaire)
Protéines de choc thermique: Hsp70, Hsp60 (GroEL), Hsp10 (GroES).

Fonctions:  supervisent l’état de protéines naissantes.

 les maintiennent sur le bon chemin du repliement.
 les éloignes de mauvaises fréquentations qui pourraient mener vers
un mauvais assemblage ou agrégation.

21
 Chaperonin GroES-GroEL
• GroEL : 14 subunits
• GroES : 7 subunits

22
 Evénements sur le repliement
des protéines dans le complexe
GroES-GroEL

unfolded protein

folded protein

23
5. Les maladies conformationnelles

➢ 18 maladies létales associées à l’altération de la structure secondo- tertiaire des

protéines (repliement incorrect des protéines):

Maladie d’Alzheimer, encéphalopathies spongiformes transmissibles (TSE) ou

maladies à prion, amyloïdoses.

➢ Agrégats de protéines normalement solubles (amyloïdes):

-Protéines concernées non apparentées et structures natives différentes.
-Formes amyloïdes présentent des similitudes.
-2 conformations stables: forme native et forme amyloïde.

➢ Prion: 2 conformations PrPc (normale) et PrPsc (altérée)

24
 Exemple: Prions

Les protéines prions se trouvent dans les cerveaux

Fonction inconnue
Deux formes
structure alpha normale
structure bêta nuisible

structure bêta peut s'agréger et former des «plaques»

Bloque certains tissus et fonctions dans le cerveau

Conversion autocatalytique de PrPc en PrPsc

25
26
 Conclusions

➢ 300000 séquences connues, 20000 structures 3D déterminées, 40% des ORF

codent pour des protéines dont la fonction est inconnue.

➢ Conception de protéines sur mesure

➢ Interventions thérapeutiques

Prédiction du repliement et de la structure 3D (In Silico)

27
7. Fonctions des différents types protéiques

- Les protéines sont les produits d'expression des gènes.

- Elles prennent une conformation soit fibrillaire, soit globulaire.
- Elles jouent des rôles essentiels dans les cellules et les organismes. :
• transporteurs d'oxygène (myoglobine, hémoglobine)
• catalyseurs de réactions (enzymes)
• récepteurs ou transporteurs membranaires
• squelette cellulaire (collagène)
• contractions et mobilité (myosine)
• défense contre agressions extérieures (anticorps)
• information (hormones)
•…
Types de protéines

Il existe deux types différents de protéines et leurs formes sont différentes.

La forme d’une molécule protéique est liée à sa fonction.

Protéines globulaires

– Elles sont rondes, compactes et facilement solubles et peuvent donc être transportées dans les

fluides. Les exemples sont l'hémoglobine et les enzymes.

Protéines fibreuses

– Elles sont dures et en forme de corde. On les trouve généralement dans les tissus conjonctifs

tels que les tendons. Le collagène est un exemple de protéine fibreuse.

 PROTEINES FIBRILLAIRES

cytosquelette

collagène actine
MYOGLOBINE

site de fixation de l'oxygène (hème)

 PROTEINES MEMBRANAIRES

membrane d'érythrocyte
 HORMONES
ex. : insuline
 ANTICORPS (1)
immunoglobuline G
 ANTICORPS (2)

réaction antigène - anticorps

anticorps : unité
Fab d'une IgG antigène : lysozyme