Chapitre 4

La RMN à deux dimensions

Alexandre ARNOLD

Département de chimie – UQAM

Hiver 2020
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Plan
 Plan du chapitre
▪ Principes de base
 Corrélations homonucléaires
 Spectroscopie de corrélation
 Corrélations totales
▪ Corrélations homononucléaires
▪ Corrélations hétéronucléaires
▪ Corrélations spatiales
▪ Au delà de la deuxième dimension
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Références
 Bibliographie
▪ Livres:
 Pochapsky & Pochapsky (2007) NMR for Physical and Biological Scientists, New York, Taylor &
Francis, 372 pages.
 Serdyuk, Zacai & Zacai (2007) Methods in Molecular Biophysics: Structure, Dynamics and Function,
Cambridge University Press, 1120 pages.
 Berger & Braun (2004) 200 and more NMR experiments, Weinheim, Wiley-VCH, 838 pages.
 Sanders & Hunter (1993) Modern NMR Spectroscopy: a Guide for Chemists, 2è éd., Oxford
University Press, 313 pages.
 Derome (1987) Modern NMR Techniques for Chemistry Research, Oxford, Pergamon Press, 280
pages.
 Wüthrich (1986) NMR of Proteins and Nucleic Acids, New York, John Wiley & Sons, 292 pages.
 T.D.W. Claridge (2009) High-resolution NMR Techniques in Orgnaic Chemistry, 2è éd., Oxford,
Elsevier, 383 pages.

▪ Articles:
 Hiller, Wasmer, Wider & Wüthrich (2007) Sequence-Specific Resonance Assignment of Soluble
Nonglobular Proteins by 7D APSY-NMR Spectroscopy, JACS 129, 10823.
 Güntert (1998) Structure Calculation of Biological Macromolecules from NMR data, Q. Rev. Biophys.
31, 145.
 King & Williams (1990) The Fourier Transform in Chemistry - NMR. Part 4. Two-Dimensional
Methods, J. Chem. Edu. 67, A125.
 Bothner-By, Stephens & Lee (1984) Structure Determination of a Tetrasaccharide:Transient Nuclear
Overhauser Effects in the Rotating Frame, JACS 106, 811.
 Brar & Kaur (2005) Eur. Polym. J. 41, 2278.
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Principe
 La RMN bidimensionnelle permet d’extraire l’information que portent les
noyaux, i.e. de connaître les connectivités entre les noyaux:
 Scalaires (à travers les liaisons)
 Dipolaires (à travers l’espace)
 Pour extraire l’information structurale, les expériences 2D incluent un délai
pendant lequel les noyaux évoluent, par exemple en fonction de leur
environnement (déplacement chimique) et de leur(s) couplage(s)
 Une bonne raison de faire de la RMN 2D:
 Spectre RMN-1H d’une protéine
(Vam7p)

Spectre: http://www.lipidprism.org/files/lipidprism/prodFig2.gif
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Principe – RMN 1D vs 2D
 Spectre 1D
▪ Chaque pic a une intensité et une fréquence

 Spectre 2D
▪ Chaque pic a 2 coordonnées en fréquence
 f1 et f2 ou 1 et 2
 Ces coordonnées montrent une corrélation entre ces
fréquences
❑ Déplacement chimique d’un spin couplé à celui d’un autre
par exemple
▪ Amplitude montrée par des lignes de contour
 Relié à l’intensité de cette corrélation

J. Keeler,Two-dimensional NMR (I) in "Understanding NMR spectroscopy“, https://www.youtube.com/watch?v=AqbLvmFHs28

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Principe – séquence
 Les spectres sont obtenus en enregistrant une série de spectres 1D qui
diffèrent seulement par un incrément de temps t1 dans la séquence
▪ Séquence d’impulsions la plus simple en RMN 2D:
Préparation Évolution Mélange Détection
90 90

t1 variable

t2

▪ La préparation (impulsion de 90o) excite les spins

 Elle crée une cohérence entre les spins
▪ Pendant la période d’évolution (t1) → les spins ressentent les effets des noyaux
voisins
 Ils « évoluent » selon le déplacement chimique et les couplages, i.e. selon leur
environnement et les atomes voisins!
 On ne fait pas de mesure pendant cette période
▪ Une 2ième impulsion de 90o (mélange) permet de transférer l’effet de l’évolution en
un signal détectable
▪ Détection → La magnétisation (signal) est détectée en fonction du temps t2
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Principe
 Une impulsion de préparation de 90ox fait basculer la magnétisation dans le
plan xy
 Après un temps t1, l’angle de rotation de la magnétisation est de 2t1
 La composante sur l'axe des y a une valeur de Mcos(2t1)
 La composante sur l'axe des x a une valeur de Msin(2t1)
 Une 2ième impulsion de 90°x fait basculer la composante sur y vers l'axe -z
 Le signal résultant est de Msin(2t1)
 On mesure la longueur du vecteur de magnétisation qui varie en fonction de t1
 L’incrémentation du délai t1 conduit donc à un signal qui oscille de façon
sinusoïdale à une fréquence :
 Signal en fonction de la valeur de t1:
Préparation Évolution Mélange Détection
90 90

t1 variable

t2
Oscillation du pic à 2
en fonction de t1
Balayage en fréquences
Spectre 1D normal
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Principe – illustration
 On répète l’expérience pour chaque valeur de t1
t2
t1=0 préparation mélange

t2
préparation 1 mélange

t2
préparation 21 mélange

t2
préparation 31 mélange

▪ Chaque FID digitalisé est enregistré

▪ t1 est incrémenté par une quantité fixe 1
▪ Chaque valeur de t1 demande une expérience séparée
 Une expérience 2D peut donc être assez longue à réaliser
 Il faut donc optimiser le nombre d’incréments à enregistrer
J. Keeler,Two-dimensional NMR (I) in "Understanding NMR spectroscopy“, https://www.youtube.com/watch?v=AqbLvmFHs28
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RMN 2D – principe
(A) On obtient une matrice S(t1,t2) qui donne l’amplitude du signal en fonction
du temps
(B) On fait la TF de chacune des rangées
(C) Puis celle de chacune des colonnes pour obtenir l’amplitude du signal en
fonction de la fréquence S(1, 2)
(A) (B)

(C)

J. Keeler,Two-dimensional NMR (I) in "Understanding NMR spectroscopy“, https://www.youtube.com/watch?v=AqbLvmFHs28

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RMN 2D – principe
 Illustration des données pour chaque domaine temps*
▪ On a une variation d’amplitude en fonction du temps dans chaque
dimension et pour chaque rangée et colonne
 Flèche 1: oscillation du signal en fonction de t2
 Flèche 2: oscillation du signal en fonction de t1
▪ On fait la TF dans la dimension directe t2
 Flèche 3: pic (amplitude en fonction de la fréquence) obtenu pour cette rangée
suite à la TF
• Flèche 4: oscillation de
l’amplitude du pic en fonction t1 et t2 = 0
du temps t1 car la TF n’a pas intensité maximale
été réalisée dans cette
dimension
▪ On fait la TF dans la
dimension indirecte t1
• On obtient un pic suivant les
flèches 5 ou 6

*J. Keeler,Two-dimensional NMR (I) in "Understanding NMR spectroscopy“, https://www.youtube.com/watch?v=AqbLvmFHs28

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RMN 2D – principe
 La dimension « directe » (F2) fait référence aux spectres 1D enregistrés
 La dimension « indirecte » (F1) est constituée à partir des variations qu’on
observe en incrémentant t1
 Il est plus juste de présenter les spectres ainsi:
F1

F2

 Des noyaux (couplés) qui se sont influencés pendant le délai t1 seront

corrélés sur le spectre 2D
 Pics croisés

 Un noyau donné est forcément corrélé avec lui-même sur un spectre

homonucléaire
 Pics diagonaux
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RMN 2D – principe
 Le principe de la RMN 2D est flexible et peut être appliqué à toutes sortes
d’échantillons et aux différents paramètres à étudier
 Solution, solide, organique, inorganique, …
 Structure, orientation, …
 Même des études de dynamique

 En RMN structurale on distingue:

 Expériences identifiant les connectivités (scalaires) spin-spin à travers les liaisons
 Ex.: COSY, TOCSY…
 Expériences identifiant les connectivités (dipolaires) spin-spin à travers l’espace
 Ex.: NOESY
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Corrélations homonuclaires – COSY
 On peut déterminer la séquence des liens chimiques dans une molécule au
moyen de la spectroscopie de corrélation
 COrrelation SpectroscopY (COSY)
 Elle permet de déterminer le couplage scalaire à travers les liaisons, pour des
noyaux voisins

 De toutes les expériences bidimensionnelles, la COSY est la plus simple

 Elle fut la première expérience 2D à être décrite

 Jean Jeener, Ampere International Summer School, Basko Polje, Yougoslavie,1971
 14
COSY – séquence
 Séquence:

 L’impulsion de préparation bascule la magnétisation sur -y

 t1 est successivement incrémenté
 Les spins précessent sous l’influence du déplacement chimique et des couplages mutuels
spin-spin
 S’il y a couplage entre 2 spins, la seconde impulsion a pour rôle de redistribuer
(transférer) la magnétisation provenant d’une transition pendant t1, parmi toutes
les autres avec lesquelles elle est associée
 Cela signifie qu’un pic détecté en t2 (acquisition du FID) peut voir son amplitude modulée
par la fréquence d’un autre pic pendant t1
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COSY – types de pics
 S’il n’y a aucun transfert d'aimantation durant la
période d'évolution
 Il n’y a pas de couplage
 On observe les mêmes déplacements chimiques durant t1
et t2
 Pics diagonaux

 S’il y a transfert d'aimantation durant la période

d'évolution
 Il y a couplage
 Alors les déplacements chimiques sont différents durant t1
et t2 dû à la modulation de la magnétisation par le
déplacement chimique d’un noyau pendant le délai t1
 Pics non-diagonaux (croisés)
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COSY – le spectre
Apparence du spectre COSY
 Le déplacement chimique du 1H est représenté sur
les deux axes, alors le spectre est symétrique par
rapport à la diagonale
 Les coordonnées des pics diagonaux sont les mêmes
dans les 2 dimensions, à la fréquence de Larmor des
1H dans l’échantillon

 La diagonale n’apporte pas d’information structurale Exemple hypothétique d’un

spectre COSY pour un système
 C’est le spectre 1D à 2 spins couplés A et X, où A
et X sont homonucléaires.

 La projection sur chaque axe correspond au spectre 1D

 Les coordonnées des pics croisés correspondent aux déplacements
chimiques des noyaux couplés
 Information structurale utile
 Le long de chaque dimension, les couplages séparent les pics en multiplets
 En principe, on peut mesurer la constante de couplage à partir du spectre COSY
obtenu
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COSY – exemple
 Exemple
 Spectre 1H COSY de la méthyléthylcétone

CH3
CH2
C O
H3C
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COSY – exemple
 Exemple de spectre COSY plus compliqué

Spectre 1D en deux sections:

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COSY – exemple
 Exemple de spectre COSY plus compliqué

Spectre complet et agrandissement::

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COSY – méthode RSH
 Pour effectuer une détection en quadrature, il faut enregistrer 2 scans pour
une même valeur de t1
 Le premier scan pour la partie réelle
 Le second scan en introduisant un déphasage pour obtenir la forme imaginaire
 C’est la méthode Ruben, States & Habekorn (RSH)
 Pour ce faire, on peut déphaser la seconde impulsion de 90 o, ou, de façon équivalente, déphaser
le premier pulse et le détecteur de 90o
 La séquence COSY est généralement accompagnée d’un cyclage de phase dont
l’addition des termes en sinus et cosinus du même FID peut conduire à des pics
tordus (skewed lineshape)
 Il est alors difficile de mesurer la constante de couplage
 Ce cyclage de phase augmente la durée de l’expérience
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COSY – phase-sensitive
 On a proposé une alternative: le TPPI
 Time-Proportional Phase Increment
 Consiste à incrémenter la phase du premier pulse de 90o tout en incrémentant t1
 Cette méthode conduit à la phase-sensitive COSY
 On doit enregistrer 2 fois plus de FID vs COSY standard
 Les pics diagonaux sont dispersifs (-) et
les pics croisés sont antiphase absorptifs
(+)
 Il est plus facile de mesurer la constante
de couplage
Pics croisé
 Il est difficile d’analyser les pics croisés antiphase X
près de pics dispersifs de la diagonale en 1 et 2

Pic diagonal
dispersif en 1
et 2
Coupe
transverse à
1 = X
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COSY – DQF-COSY
 La Double-Quantum Filtered COSY* a permis de simplifier et d’améliorer les
spectres obtenus par COSY ou phase-sensitive COSY
 Convertit les signaux dispersifs de la diagonale en pics d’absorption
 comme les pics croisés
 Séquence
 On ajoute une impulsion de 90o avant la détection
 Permet de convertir les cohérences de double quantum en cohérences de
simple quantum observables
 Comme les cohérences de double quantum n’existent que pour des spins
couplés, les singulets (pics non couplés) sont éliminés



90 90 90x Double quantum 


t1  Zero quantum


*Rance, Sørensen, Bodenhausen, Wagner, Ernst & Wüthrich (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 117, 479.
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COSY – DQF-COSY
 La DQF-COSY demande un minimum de 8 scans pour le cyclage de phase
 Il permet d’annuler la magnétisation qui ne provient pas du bon pathway

 Les spectres montrent des pics en absorption sur la diagonale, ce qui

facilite le phasage et évite le tailing associé aux pics en dispersion

phase-sensitive COSY DQF-COSY

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COSY – DQF-COSY
 Exemple: le sucrose*

Spectre entier

zoom
*http://triton.iqfr.csic.es/guide/tutorials/specdata/spectra/suc_cosytppi.html
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COSY – g-COSY
 g-COSY
 Au lieu du cyclage de phase, il est possible d’utiliser des gradients de pulses qui
permettent d’annuler les signaux indésirables en un seul scan
 Séquence:
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Corrélations homonucléaires – TOCSY
 Des expériences de RMN 2D ont été mises au point afin d’explorer le
couplage scalaire sur de plus longues distances

 La TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY) permet de

trouver, en principe, tous les voisins homonucléaires
 Aussi connue sous le nom de HOHAHA (HOmonuclear
HArtmann-Hahn)

 Principe:
 Transfert de polarisation entre des spins J-couplés qui subissent le même champ
magnétique effectif Beff
 Ce transfert de polarisation se produit par étape (stepwise transfer) d’un spin à
l’autre grâce à un verrouillage de spins (spin lock)
 27
TOCSY – exemple
 Technique utile pour les protéines et peptides car chaque acide aminé représente un
système de spins distinct

 Exemple*:
▪ 1H TOCSY du linker L622-K638 du canal
potassique hERG dans 10% D2O à 20°C

*Gravel, Arnold, Dufourc & Marcotte (2013) Biochim. Biophys. Acta 1828, 1494.
 28
TOCSY – séquence
 Séquence:

 Après la période d’évolution t1, on « verrouille » les spins

 Le spin lock consiste à appliquer un champ de RF qui verrouille la magnétisation dans le
plan xy
 Pulse continu de faible puissance et de phase constante
 Cela permet le transfert de magnétisation entre tous les noyaux couplés directement
ou non dans le même système
 Pendant ce verrouillage, les spins ne perçoivent que le champ de spin-lock B1
 Les différences de déplacement chimique deviennent négligeables et c’est le couplage qui
compte
 La force du champ de spin lock est exprimée en Hz
 C’est le nombre de fois que les spins verrouillés précessent autour de B1 par seconde
 Elle correspond à l’inverse d’une longueur de pulse de 2 à ce champ de RF
 Typiquement si J est compris entre 2 et 10 Hz, un champ de spin-lock de 7500 Hz est requis à
11.7 T
1
= 7500 𝐻𝑧 donc pulse de 90o= 67 s
2
 29
TOCSY – séquence
 Le spin lock a donc pour effet de garder les spins dans
l’axe de B1, ce qui les verrouille dans le référentiel
tournant
 Cela enlève les différences de déplacement chimique
mais les couplages restent actifs
 Le spin lock fait donc perdre leur « identité » aux 1H,
mais leur procure le mécanisme par lequel la
cohérence peut être partagée parmi tous les spins au
sein d’un même système de spins
 Il y a transfert de A à X après un temps ½JAX et de X à A après (1/J) s
 La magnétisation se propage parmi les spins couplés
 Pendant un m court (20 ms), les spectres ressemblent à un COSY
 Pendant un m long, on voit plus loin!
 30
TOCSY – séquence
 Pour que tous les spins ressentent le même B1, on fait une excitation à
large bande (broadband excitation) pendant le verrouillage
 Pour couvrir une grande gamme de spins en fréquence (déplacement chimique), il faut
un B1 élevé
 Pas réalisable techniquement avec un découplage continu
 Typiquement, on utilise une série de pulses (hard pulses) avec cyclage de phase
 Ces pulses courts permettent d’homogénéiser l’excitation de spins sur la
largeur spectrale d’intérêt
 Le schéma d’impulsions MLEV-17 est le plus populaire (voir annexe 1)
 Ce découplage est effectué grâce à des pulses composites
 Il permet de faire subir une « gymnastique de spins » dont la conséquence est
un Beff net nul pendant la séquence qui favorise le transfert de polarisation
 On doit ajuster la période de verrouillage:
 Temps de mélange courts (20-50 ms): protons fortement couplés;
 Temps de mélange longs (100-300 ms): protons de systèmes de spins plus éloignés
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TOCSY – vs COSY
 Comparaison des spectres COSY
et TOCSY obtenu pour le
dipeptide Leu-Tyr:

COSY TOCSY

Images tirées de www.agorabcm.com_faq_faq.php_ID=341

 32
TOCSY – exemple
Spectre RMN-1H du copolymère (FA=0.36) dans CDCl3
 Attribution des pics en de 1H

copolymères acétonitrile-
méthylacrylate (A-M)
 Compliquée en RMN 1D
 Chevauchement de pics

Spectre 2D TOCSY du copolymère (FA=0.36) dans CDCl3

 Aidée par la résolution en

RMN 2D
 Spectre TOCSY

Tiré de Brar & Kaur (2005) Eur. Polym. J. 41, 2278.

 33
TOCSY – exemple (suite)
 Interactions observées dans le polymère grâce au TOCSY
 Identification de connectivités dans des triades

AAA
MMA

AAM

MMM

AAM

Les numéros de flèches correspondent aux pics identifiés sur la 2D

 34
Corrélations homonucléaires – X/X
Couplages entre des noyaux
 La RMN 2D n’est pas réservée aux 1H et aux spins ½ d'un isotope abondant

 Il existe 2 types de corrélations homononucléaires

entre des noyaux X:
 Couplages entre des noyaux d’un isotope abondant
 Ces couplages sont très probables et le spectre de
corrélation donne des pics croisés intenses
 31P, 19F Couplages très probables
Pics croisés intenses
 Limitation pour certains noyaux
Couplages entre des noyaux
 Requièrent de larges fenêtres spectrales qui génèrent de gros d'un isotope de faible
fichiers de données abondance naturelle
 Couplages entre des noyaux d’un isotope de faible
abondance naturelle
 Ces couplages sont peu probables et les pics croisés sont
peu intenses

Couplages peu probables

Pics croisés peu intenses
 35
Corrélations homonucléaires – INADEQUATE
 Problème des spins ½ peu abondants: le populaire 13C!
 Abondance naturelle de ~ 1%
 La probabilité qu’une molécule ait un couplage 13C - 13C est de 0.01%
 Cela correspond à 1% de l’'intensité d'un spectre 1D de 13C
 Pour étudier les noyaux de faible abondance naturelle: INADEQUATE
 Incredible Natural Abundance DoublE QUAntum Transfer Experiment*
 Permet de détecter des pics croisés peu intenses dus aux couplages 13C - 13C
entre des pics directement liés
 Permet de mesurer leurs constantes de couplage 13C - 13C
 Expérience 2D utile pour obtenir de l’information sur le squelette de
molécules organiques
 Désavantage: manque de sensibilité
 Par expérience, la règle dit que si un spectre 1D en 13C obtenu en 1 scan a un
rapport S/B > 30:1, on peut investir son temps à faire une INADEQUATE
 Demande des échantillons concentrés

Bax, Freeman, Kempsell (1980) J. Am. Chem. Soc. 102, 4849.

 36
INADEQUATE – séquence
 Séquence
 Elle prend avantage du couplage fort 1JCC (~40 Hz) entre des 13C liés de façon
covalente afin de générer et de détecter une cohérence de double quantum
entre des spins 13C couplés
Niveaux d’énergie d’une
paire de spins couplés
1H découplage

90° 180° 90° 90° t 

2
DQ
  t1 
13C
 ZQ

Fréquence 1 + 2 Fréquence 2
durant t1 durant t2

 Le 1er pulse crée une magnétisation transverse (dans le plan xy)

1
 Le couplage se développe pendant les délais  = J CC
4
 Le pulse de 180o permet une refocalisation des fréquences
 La 3e impulsion génère une transition de double quantum
 Pendant le délai t1, il y a évolution en fréquence entre les spins couplés qui conduit aux
fréquences de double quantum
 Équivaut à dire que la fréquence de DQ est la somme des fréquences des noyaux couplés
 Le dernier pulse transforme la magnétisation de DQ en SQ détectable
 37
INADEQUATE – spectre
 Les spectres 2D obtenus donnent la corrélation entre 2 C1-C2-C3-C4
et (1+2)
 On appelle F1 fréquence de double quantum

1 + 2
 Exemple: spectre INADEQUATE du n-butanol

C1 C2 C3 C4

2
 38
INADEQUATE – pour et contre
 Avantages de l’INADEQUATE:
 Absence de pics diagonaux qui masquent parfois de l’information pour les pics
croisés à proximité de la diagonale
 Plus grande dispersion dans la dimension DQ
 Permet de tracer le squelette de la molécule
 en l’absence d'hétéroatomes C-X-C

 Désavantages:
 Manque de sensibilité
 « Inadéquat » pour les petites molécules pour lesquelles les variantes de COSY
sont plus appropriées
 Choix du temps  optimum
 Difficile de trouver un délai qui convient à tous les types d’arrangements de spins et de
couplages
 Ex.: C aromatiques vs C aliphatiques

 Consulter Derome p.239 ou Berger& Braun p.441 pour plus de détails techniques sur
cette expérience
 39
Corrélations hétéronucléaires – HETCOR
 L’expérience de HETCOR permet de mettre en évidence l'existence le
couplage scalaire entre un 1H et un noyau X (comme 13C )
 HETeronuclear CORrelation* H

 Sur 1 liaison C

 Cette expérience est semblable à l’INEPT et exploite le transfert de

polarisation 1H→13C

Grzesiek & Bax (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 12593.

 40
HETCOR – séquence
évolution

90° 90°
1H d1 découplage

180° 90°
13C t1/2 t1/2 d2 d3

 Pendant la période d’évolution, la magnétisation du 13C est modulée par le déplacement

chimique en 1H auquel il est couplé
 L’impulsion de 180o élimine le couplage scalaire hétéronucléaire
 Le délai (d2=1/(2J)) permet de préparer le transfert de polarisation (comme en RINEPT)
 Les impulsions de 90o simultanées en fin de séquence induisent un transfert de
polarisation du 1H au 13C
 La magnétisation est refocalisée lors du dernier délai d3
 Le découplage pendant l’acquisition permet de retirer les couplages de la dimension F2
 Celle du 13C
 Réglage des délais:
 d2 = 1/(2JC,H) = 3,45 ms calculé à partir de 1JC,H = 145 Hz
 d3 est choisi pour obtenir le maximum de signal pour toutes les multiplicités
 Typiquement, d3 = 1/(3JC,H) = 2,29 ms calculé à partir de 1JC,H = 145 Hz
 On fait une double transformée de Fourier pour obtenir un spectre où 1 est le
déplacement chimique du 1H et 2 celui du 13C
 41
HETCOR – exemple
 Exemple de spectre HETCOR:
 Un pic croisé apparaît à l’intersection des déplacements chimiques de paires 1H-13C
directement couplés
 On voit bien les multiplicités en F1 et non en F2 du au découplage pendant
l’acquisition
 Il n’y a pas de pics diagonaux en RMN 2D hétéronucléaire
découplés ici

pas découplés ici

Figure: www.lasalle.edu/.../DEPT%20and%20COSY%20Spec..
 42
Corrélations hétéronucléaires – HSQC
 Problème du HETCOR:
 On détecte, dans la dimension directe (F2), un noyau de  faible
 Donc faible sensibilité de l’expérience

 Solution:
 Détecter des protons au moyen de la « détection inverse »
►HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)* ou Double INEPT

 La séquence d’impulsions utilise 2 transferts de magnétisation de type

INEPT
𝑛 𝑛
𝐽𝑋𝐻 𝑋 𝐽𝑋𝐻
𝐼𝑁𝐸𝑃𝑇 𝑡1 𝐼𝑁𝐸𝑃𝑇
1H X X 1H

*Bodenhausen & Ruben (1980) J. Chem. Phys. Lett. 69, 185.

 43
HSQC – séquence
 Séquence d’impulsions 1H

13C

 En résumé
 Il y a un INEPT du 1H au noyau X
 Transfert de magnétisation des 1H vers les noyaux insensibles auxquels ils sont
scalairement couplés
 Puis une période d’évolution (t1) en déplacement chimique des 13C pendant laquelle
l’impulsion en 1H élimine les couplages 13C-1H
 Pendant ce délai, seule la magnétisation transverse (simple quantum) du spin X évolue
 Le pulse de 180o en 1H au milieu du t1 a pour effet de découpler l’interaction 1H-13C
 Les couplages 1H-13C ne sont donc pas visibles dans la dimension F1
 Un transfert INEPT transfère la magnétisation des 13C aux 1H
 On détecte les 1H qui évoluent selon leur fréquence de Larmor
 La TF des données dans t1 nous donne les déplacements chimiques des 13C
auxquels ces 1H sont attachés
 On effectue donc une double transformée de Fourier pour obtenir un spectre où
1 est le déplacement chimique du 13C et 2 celui du 1H
 44
HSQC – exemple
 Exemple d’un spectre HSQC:

Pas de couplage
 45
HSQC – pour
 Avantages de l’HSQC
 L’augmentation de la sensibilité est beaucoup plus importante que lors de
l'utilisation de l'effet NOE dans une expérience hétéronucléaire

 Gain en S/N d’une HSQC vs une INEPT est de (H/X)3/2

 Meilleure résolution dans la dimension 2, i.e. qu’on peut enregistrer plus de
points

 Cette méthode est préférable à la HMQC lorsque les spectres sont encombrés,
par contre l’utilisation de 10 impulsions dans la séquence la rend plus sensible
aux erreurs expérimentales

 Cette séquence est de première importance lorsqu’on cherche des corrélations

1H-15N en détermination de structure de protéines

 Souvent composante d’expériences 3D et 4D

 46
HSQC – exemple
 Exemple de HSQC 1H-13C en détermination de structure:
 Spectre du cholestérol dans a)CDCl3 vs b)DMPC-d54

Tiré de Soubias, Jolibois, Milon & Réat (2006) C.R. Chimie 9, 393.
 47
HSQC – exemple
 Exemple de HSQC en détermination d’interface de liaison*
▪ Cartographie de la liaison de trimannosides à des mutants de cyanovirin-N
 Protéine inactivante du HIV de 11kDa

CV-NmutDA sans (noir) et avec (rouge) le

2’-deoxy dimannoside

 Présentation d’article:

*Sandström et al. (2008) Biochemistry 47, 3625.

 48
Corrélations hétéronucléaires – HMQC
 La HMQC est la forme la plus simple de corrélation inverse 1H-X
 Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
 Elle ne contient que 4 pulses

 Les 1H sont observés (F2) et les noyaux X se retrouvent dans la dimension

indirecte, comme en HSQC
 Le plus souvent, le 13C

 Les spectres obtenus sont similaires à ceux de la HSQC

 Cependant la largeur des pics dans la seconde dimension (F1) est déterminée
par la relaxation de DQ plutôt que par des effets de SQ
 En conséquence les pics tendent à être plus larges qu’en HSQC pour les grosses
macromolécules

 La HMQC est souvent utilisée comme building block dans des expériences
3D
 90° 180° 49
HMQC – séquence 1H d1  t1/2 

 Séquence: 90° 90°

13C
t1

 Les 1H sont excités puis leur magnétisation évolue sous l’influence du couplage
scalaire direct (un lien) 1H-13C
 Les délais  permettent la défocalisation et la refocalisation du couplage scalaire
hétéronucléaire
  est réglé à ½JCH
 Valeur typique de couplage de 150 Hz, alors  est réglé autour de 3,3 ms
 Le pulse de 90o sur le 13C permet des échanges de polarisation de double et zéro
quanta
 Le signal en 1H est modulé par le déplacement chimique en 13C pendant la période
d’évolution t1
 Le 1H et le 13C évoluent de façon cohérente, mais le 13C n’est pas directement observé
 Le pulse de 180o (écho) enlève les effets de déplacement chimique du 1H pour ne
garder que celui du 13C
 Permet d’identifier les liens C-H
 Le dernier pulse en 13C transforme les cohérences de multiples quanta en
magnétisation de simple quantum en 1H observable
 50
HMQC – exemple
 Spectre HMQC du menthol

10

5
3 1

7
8 9

Pas de couplage
 51
Corrélations spatiales – NOESY
 Les noyaux peuvent être reliés via les liaisons, mais également interagir
spatialement par couplage dipolaire
 Cette interaction est le principal mécanisme de relaxation des noyaux de
spin ½
 En particulier via l’effet NOE pour lequel il y a transfert de polarisation d’un spin
à l’autre (Chap. 3)
 Le NOE est un donc moyen de transférer l’information de déplacement
chimique d’un noyau à un autre
 L’expérience NOESY est l’équivalent 2D de l’expérience de NOE de
différence
 Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY
 Elle montre les pics de corrélation causés par la relaxation dipolaire entre
des noyaux (1H) proches dans l’espace
 L’avantage de NOESY est d’observer toutes les corrélations spatiales
simultanément
 Contrairement au NOE 1D qui fonctionne en irradiant sélectivement la
résonance d’un 1H et en observant le changement d’intensité des autres pics
 Méthode longue
 52
NOESY – spectre
 L’intensité d’un NOE (volume V ou intégrale) du pic croisé entre 2 noyaux
couplés dépend de la distance r entre ces spins
1
𝑁𝑂𝐸 𝑓(𝑐)
𝑟6

 On calibre le volume à l’aide d’une distance connue et fixe, comme la distance

entre deux 1H sur un cycle aromatique
 Ex.: distance entre deux 1H sur le cycle de la tyrosine est de 2.48 Å

 La NOESY permet d’observer des NOE sur une distance de 5 Ǻ

 Expérience très importante pour la détermination de structure de molécules
 53
NOESY – séquence
 Séquence:
préparation évolution mélange détection
90° 90° 90°
d1 t1 m

 Après le 1er pulse d’excitation, on laisse un délai t1 variable qui permet de

donner l’information de déplacement chimique dans la dimension indirecte (F1)
▪ Les spins ressentent les effets des noyaux voisins pendant cette période
▪ Ils évoluent selon le déplacement chimique et les couplages
 La seconde impulsion envoie la magnétisation selon –z
 Cela génère l’inversion de population nécessaire pour que l’effet NOE se développe
pendant la période de mélange m
 Il y a « relaxation croisée » (via transitions de zéro et double quanta) entre les spins couplés
spatialement, corrélant ainsi leurs déplacements chimiques
 La troisième impulsion permet un retour de la magnétisation dans le plan xy
pour la détection
 Le spectre obtenu montre les corrélations 1H-1H à travers l’espace
 54
NOESY – NOE maximum
 Il est important de bien choisir le temps de mélange m de façon à ce qu’un
maximum d’échange se produise
 i.e. que le NOE soit maximum

 Le NOE maximum est donné par 0.5(S/I), dans la partie linéaire positive
(>0) de la courbe

NOE maximum en fonction de c pour 1H, 13C,

15N et 31P interagissant avec 1H. B de 11.74 T.
0
 55
NOESY – vs temps de corrélation
 L’intensité du NOE dépend aussi du temps de corrélation c de la molécule

 Pour des particules sphériques de rayon a dans un solvant de viscosité , le

temps de corrélation peut être calculé ainsi: 4𝑎3
𝑐 =
3𝑘𝑇
 Il existe un temps de corrélation – où une fréquence – à laquelle le NOE
ne peut s’établir pour un B0 donné
 0c  1
 On doit parfois changer de spectromètre!
 Certaines molécules ne montrent aucun pic
Homonuclear NOE build-up curve
en NOESY
rapides
▪ Il faut utiliser la ROESY
01/c

lents
 56
NOESY – vs taille des molécules
 Pour les petites molécules en solution, le temps de corrélation est petit
comparativement à la fréquence de Larmor (𝑐 ≪ 1/0)
 Alors la gamme de fréquences couvertes par les mouvements de réorientation
de la molécule permettent les transitions de ZQ et DQ entre les différents états
de spins, donc l’effet NOE
 Aspect du spectre:
▪ Les pics croisés et les pics diagonaux sont de signes opposés
▪ Les pics croisés provenant d’échange chimique sont de même signe que les pics
diagonaux
 Les grosses molécules ont un temps de corrélation plus long et des NOEs
négatifs (𝑐 ≪ 1/0)
▪ Les pics croisés sont du même signe que les pics diagonaux
▪ Le NOE est plus fort et des m plus petits sont utilisés
▪ On ne peut distinguer les pics provenant d’échange chimique
 57
NOESY – exemple
 Allure du spectre – signe des pics
 58
NOESY – exemple
 Détermination conformation d’une petite molécule

Pics croisés importants pour la

détermination de la structure

3
2
5

6
4
1
7

8
9

*Huggins & Billimoria (2007) J. Chem. Educ. 84, 471.

 59
NOESY – exemple
 Détermination de la structure de la met-enképhaline dans bicelles*
 NOEs intra- et inter-résidus
 NOEs peptide-lipide (a)

OH
CH3
S
O O
NH NH O-
H3N+ NH NH
O O O

(a) NOESY de Menk dans des bicelles (zone des 1H

amides et aromatiques).
(b) 80 structures de faible énergie sur 200 calculées.
Marcotte et al. (2004)Biophys. J. 86, 1587-1600.

(b)

*Marcotte et al. (2004) Biophys. J. 86, 1587.

 60
Corrélations spatiales – ROESY
 Pour certaines molécules étudiées par NOESY, les pics croisés sont absents
 car 0c ≈ 1 et aucun NOE ne se produit
 typiquement de masse 1000-3000

 Solution: la ROESY (Rotating frame Overhauser Effect SpectroscopY)*

 L’effet NOE est toujours positif dans le référentiel tournant pendant le
verrouillage des spins

 Aussi connue sous le nom de CAMELSPIN

 Cross-relaxation Appropriate for Minimolecules Emulated by Lock SPINs

 Expérience semblable à la TOCSY

*Bothner-By et al. (1984) J. Am. Chem. Soc. 106, 811–813.

 61
ROESY – séquence
90° (p2 p3)n

d1 t1

 On remplace le temps de mélange de la NOESY par un verrouillage de spin

 Champ de spin-lock de fréquence plus faible que celle de TOCSY
 La relaxation croisée s’effectue dans le plan xy plutôt que le long de l’axe -z

 Après la première impulsion et l’évolution des déplacements chimiques pendant

t1, les spins sont verrouillés dans le plan x’-y’ (celui du référentiel tournant) par
le champ de spin-lock B1
 Comme le champ effectif B1 est plus faible que le B0, la limite des mouvements
rapides (1c << 1) devient accessible à une plus grande gamme de c donc une
plus grande étendue de tailles moléculaires
 62
ROESY – suite
 Désavantage: Homonuclear ROE build-up curve
 Montre, parfois, des corrélations de TOCSY

 Aspect du spectre ROESY

 Les pics croisés sont toujours positifs et les
pics diagonaux, négatifs
▪ Peu importe la taille de la molécule

Carbopeptoïde tétramérique et son spectre ROESY

 63
Corrélations spatiales – EXSY
 L’EXSY permet d’étudier des échanges chimiques dans les molécules
 Exchange SpectroscopY
 Le spectre obtenu montre des pics croisés positifs entre tous les sites d’échange

 La séquence d’impulsions est identique à la séquence NOESY

 NOESY = échange de relaxation pendant le temps de mélange
 EXSY = échange chimique pendant m

90° 90° 90°

d1 t1 m

 On peut extraire la constante d’échange en effectuant plusieurs

expériences EXSY à différents temps de mélange et en évaluant l’intégrale
des pics croisés
 Longueur du m dépend du phénomène étudié et est limitée par le temps de
relaxation T1
 64
EXSY – exemple
 EXSY de la diméthylformamide qui
montre le changement de
conformation pendant m
 ici m = 1 s
 Les CH3 ont une certaine fréquence
pendant t1
 Pendant le temps m, ils changent de
conformation
 On les détecte en t2 à une autre
fréquence
 65
Considérations expérimentales – RMN-2D
 En RMN 2D, le nombre de points correspond au nombre de spectres
enregistrés à différentes valeurs de t1
 Les paramètres expérimentaux (comme le temps d’acquisition et la largeur
spectrale) dans la dimension indirecte (F1) peuvent être traités de la même
façon qu’un FID normal
 Même chose pour le traitement de données tel que le zero filling et
l’apodisation

►Cas d’un spectre en 1H obtenu avec un spectromètre RMN 300 MHz pour
illustrer l’importance du réglage des paramètres
Temps d’échantillonnage (dwell time)
 Les déplacements chimiques couvrant 10 ppm, la largeur spectrale (SW) doit
donc être de 3000 Hz 10 ppm = (106)/300106

 L’évolution doit être échantillonnée au moins 2 fois par cycle (Nyquist)

1
 Donc 𝐷𝑊 =
2𝑆𝑊
 DW=167 s, i.e. qu’il doit y avoir au moins 6000 échantillonnages par seconde
 Donc l’incrément en t1 doit être minimalement de 167 s
 66
Considérations expérimentales – RMN-2D
Nombre de points et résolution
 Typiquement, on accumule N = 16K (16384) points
𝑇𝐷
 Le temps total d’acquisition est de: 𝐴𝑄 = = 2.7 𝑠
2𝑆𝑊
 Résolution digitale (DR), i.e. la séparation en Hz entre chaque point du FID, est donnée
1
par 𝐷𝑅 = = 0.4 𝐻𝑧/𝑝𝑜𝑖𝑛𝑡
𝐴𝑄

 Afin d'obtenir la même résolution dans les deux dimensions d'un spectre 2D, il
faut prendre autant de points (i.e. autant d’incréments) dans la dimension
indirecte:
 On prend 16 384 spectres avec 2.7 s/spectre
 Il faut donc 12.3 h/scan, donc plus de 2 jours pour 4 scans!
 Il faut donc faire un compromis sur le nombre de points et utiliser le zero filling
pour améliorer la résolution
 Typiquement, on enregistre 512 points (TD) qui sont répartis sur 3000 Hz (SW) pour
un t1 final (AQ) de 85 ms
→ temps total de l’expérience = 44 s/scan, donc 3 min/4 scans!
→ DR = 12 Hz
 Un ZF (double le nombre de points) fera passer la résolution à 6 Hz
 67
Considérations expérimentales – RMN-2D
 En RMN 2D, il est inutile d’enregistrer plus de points que la largeur du
spectre
 Par exemple, si les raies sont larges, le déclin du FID sera rapide
 S’il n’y a plus de signal après 32 incréments, il est inutile d’enregistrer encore 32
autres incréments car la résolution ne sera pas améliorée
 Doubler le nombre de points dans une dimension double le temps d’acquisition

Peak folding
 Si certains pics ont des fréquences en dehors de l’intervalle déterminé par le
temps d’échantillonnage, il se produit un repliement des pics (peak folding)
 La possibilité de peak folding est réelle compte tenu du compromis effectué en
nombre de points afin de réduire le temps total de l’expérience
 Ces pics apparaissent à la mauvaise position sur la diagonale
 Ils n’ont pas de symétrie
 68
Considérations expérimentales – RMN-2D
 Les spectres 2D peuvent présenter du bruit de type aléatoire (random
noise) provenant de bruit thermique dans la sonde et dans le récepteur

 Le t1 noise provient des instabilités instrumentales qui peuvent survenir

lors de l’acquisition d’interférogrammes dans la dimension t1 au cours
d’une longue expérience, introduisant de fausses modulations du signal

 Origines du t1 noise:
 Variation de longueur et d’intensité des
impulsions
 Variation du champ magnétique due à
l’instabilité du lock ou à des perturbations
externes
 69
Considérations expérimentales – RMN-2D
 Le t1 noise apparaît donc seulement dans la dimension indirecte (F1)

 Puisque les instabilités doivent moduler un signal pour apparaître sous

forme de bruit:
 Ce bruit n’est visible que le long de sections où on retrouve des pics croisés
 Il est proportionnel à l’amplitude du signal affecté
 Donc les pics intenses sur la diagonale, tels que ceux des CH3 ou du solvant (ex.: eau),
sont accompagnés de rainures le long de la dimension F1

 Certaines sources de t1 noise sont intrinsèques à la conception du

spectromètre, par contre certaines précautions peuvent être prises pour
limiter ce bruit:
 Bon contrôle de l’environnement
 Bon signal de lock
 70
Considérations expérimentales – RMN-2D
Symétrisation
 On peut se débarrasser du t1 noise par symétrisation
 Basée sur le fait qu’en COSY (ou d’autres expériences 2D) les pics réels
sont symétriques par rapport à la diagonale
 Les artéfacts tels que le t1 noise ne possédant pas cette symétrie seront
éliminés
 Par contre, cette méthode est déconseillée si la résolution est différente
dans les 2 dimensions, et si des pics sont antiphase

symétrisation
 71
Au-delà de la 2ième dimension
 Les concepts à la base de la RMN 3D sont les mêmes que ceux de la 2D

 La séquence inclut cependant un troisième domaine temps:

 Les délais t1 et t2 sont successivement incrémentés
▪ Dimensions indirectes
 Le FID est enregistré pendant le délai t3
▪ Dimension directe

 L’analyse des données demande 3 TF successives qui produisent un spectre

contenant 3 domaines de fréquences perpendiculaires

 On peut considérer une séquence 3D typique comme étant deux

séquences 2D en chaîne
 72
MultiD – exemple
 Voici l’exemple d’une séquence de RMN 3D 1H-15N combinant TOCSY et
HMQC
 La TOCSY permet d’identifier les 1H couplés
 La HMQC corrèle les 1H aux noyaux 15N
 73
MultiD – exemple
 Voici un exemple de spectre RMN 3D 1H-15N combinant NOESY et
HMQC
 McIntosh et al. (1990)Biochemistry 29, 6341.

15N

2

1H 1

3

Spectre 3D 1H-15N NOESY-HMQC de 4mM

de lysozyme T4 dans l’eau.
 74
MultiD – considérations
 Le temps requis pour effectuer une expérience 3D est très long (plusieurs
jours) car une série complète de t1 doit être obtenue pour chaque
incrément de t2
 Les séquences multidimensionnelles requièrent des molécules marquées au
15N ou au 13C

 En général, on utilise la détection indirecte, i.e. la détection des 1H car il

sont plus sensibles
 Il est possible d’utiliser des stratégies afin de réduire le temps de
l’expérience
 Par exemple, dans le cas de l’étude des protéines, on peut effectuer une
expérience 3D qui permettra d’étudier la région 1H-15N amide, puis une autre
expérience 3D qui donnera de l’information sur la région des carbones alpha et
beta
▪ Cela permet de diminuer la région spectrale observée, donc le temps d’analyse, en plus
de faciliter l’interprétation des spectres.
 Il est également possible de combiner plusieurs expériences 2D de façon à
réaliser des expériences 4D et même plus!
 75
MultiD – exemple
 RMN 7D pour attribuer les résonances d’une protéine non globulaire
soluble de 148 acides aminés:
 7D APSY-HNCO(CA)CBCANH de la OmpX dénaturée marquée au 13C et 15N
▪ APSY = Automated Projection SpectroscopY
 50 h pour compléter l’expérience

(a) Séquence 7D publiée par Hiller et al. (2007) et (b) voies de transfert de magnétisation.
(b)
(a)
 76
MultiD – exemple
 Un peu de 4D:
 Étude de la E. coli malate synthétase G (723 a.a.; 81.4 kDa)

À gauche: 15N-1HN obtenue d’une

séquence HNCACB

À droite: plans 13C/13CO et des

spectres 4D.

i) connectivités établies grâce à

leur RMN 4D
 77
Annexe 1 - MLEV
 Le schéma d’impulsions MLEV consiste en une séquence de pulses
composites recommandée pour le découplage à large bande (broadband) et
pour les expériences de TOCSY
 Voici les éléments de base et les éléments inversés du MLEV:
Éléments de base Éléments inversés:
R = 90x-180y-90x r = 90-x-180-y-90-x

 MLEV-16 est la plus utilisée

 Elle répète un cycle à 16 étapes RRrr rRRr rrRR RrrR indéfiniment:

 Le schéma MLEV est normalement utilisé dans les expériences de TOCSY sous
forme de MLEV-17 dont la séquence consiste en un MLEV-16 auquel on a ajouté
une impulsion de 60ºx à la fin de façon à inverser toute erreur de phase
 Référence: http://rmn.iqfr.csic.es/guide/eNMR/eNMRcomp/mlev.html