Diversité des bactéries

Pourquoi? / Importance
- Richesse des espèces
- Singularité d’un groupe
- Recherche d’adaptations particulières
- Définition de niches écologiques séparées
- Flux de gènes
- Trajectoires évolutives
- Etc etc
 Diversité dans les sols

Champ cultivé
Prairie
Forêt

Radar illustrant l’abondance et la richesse de plusieurs groupes biologiques de

sols en Bretagnes elon trois types d'utilisation de terrain.
0 correspond aux valeurs minimales et 1 aux valeurs maximales enregistrées
 Identification/classification des bactéries

Avant l'essor de la biologie moléculaire, les espèces

bactériennes pouvaient être classées et donc identifiées en
fonction de leurs caractères phénotypiques :
biochimiques (classification en biotypes ou biovars),
antigéniques (classification en sérotypes ou sérovars),
pathogéniques (classification en pathotypes ou pathovars),
enzymatiques (classification en zymotypes ou zymovars),
de sensibilité aux antibiotiques (classification en antibiotypes),
de sensibilité aux bactériophages (classification en lysotypes
ou lysovars)
D’autres critères utilisés se basaient sur:
 la composition de la paroi, grâce à la coloration des cellules par
application du protocole de Gram (Gram positive ou négative),
la morphologie microscopique (bactéries de type coque, bacille, vibrion ;
isolées, par deux, en chaînettes, en grappes...),
la morphologie macroscopique (taille, forme, couleur... des colonies sur
milieux de culture gélosés),
la mobilité (mobilité ou immobilité à une température donnée),
la capacité à sporuler,
la température de croissance,
les besoins nutritionnels (substances particulières),
le mode respiratoire (aérobiose, anaérobiose stricte, aéro-anaérobiose
facultative, microaérophilie…),
la capacité de photosynthèse,
l’utilisation des différentes sources de carbone ou d’azote ….
Gram+
Staphyloccocus
Gram-

Image microscopique d’un mélange de

cocci Gram-positif (Staphylococcus
aureus ATCC 25923) et bacilles Gram-
négatif (Escherichia coli ATCC 11775).
Grossissement :1000
 Diversité morphologique des spores de mycorhizes

Diversité macroscopique des colonies de bactéries

Critiques : tests imprécis avec variabilité des réponses: d'une souche à
l'autre, pour une même souche, en fonction du temps, selon le milieu de
culture utilisé pour effectuer les tests.
Donc la notion d’espèce bactérienne ne peut pas être déterminée de
manière précise par l’utilisation des critères phénotypiques uniquement.
Etape très importante qui a changé la classification bactérienne : prise en
compte des propriétés génomiques des bactéries exprimées par:
- le rapport entre les bases guanine, cytosine et adénine, thymine, dans la
séquence d’ADN (pourcentage moléculaire en G+C)
- la similarité de séquences d’ADN, obtenue par la technique
d’hybridation ADN-ADN (Oren, 2004).
Espèce génomique bactérienne, définie selon le niveau de similarité des
génomes calculée d’après la méthode d’hybridation ADN-ADN:
Si similarité supérieure ou égale à 70% entre les génomes des isolats
(avec une variation de température de fusion (ΔTm) inférieure à 5°C)
(Wayne, 1987) même espèce génomique
Critiques: coûteuse, longue et laborieuse, comparaisons des souches deux
à deux, ne pouvant donc concerner qu’un nombre restreint d‘isolats.
Depuis la découverte de la PCR, du séquençage et le développement de la
bioinformatique, différentes approches sont utilisées: séquençage de l’ADNr
16S (Woese,1987), de gènes de ménage (atpD, glnII, ...), ou de la totalité du
génome, ou de l’ADN directement extrait de l’environnement
métagénomique (McHardy & Rigoutsos, 2007).
La classification basée sur l'ADNr 16S a changé notre vision du monde
bactérien:
- différente de celle établie sur les critères physiologiques
- elle a induit une refonte de l'arbre phylogénétique des bactéries
cultivables.
La métagénomique a permis d’accéder aux bactéries non cultivables, qui
sont majoritaires dans la plus part des habitats: accès à l’ensemble d’une
communauté microbienne, on peut définir les interactions entre groupes,
diversité des gènes codant pour des fonctions donnés, …
Confirmation que le sol est un réservoir quasi infini de diversité
populationnelle et fonctionnelle (Rappe & Giovannoni, 2003)
Arbre phylogénétique des principaux phylums bactériens.
En noir et en blanc: groupes avec représentants cultivables
En gris: sans représentants cultivables (Rappe & Giovannoni, 2003).
 Diversité phénotypique des
rhizobia
Méthodes classiques:
- caractéristiques culturales: temps de génération,
- utilisation des sources de carbone (Galerie API),
- utilisation de sources d’azote,
- réduction/oxydation de certains substrats
- résistance aux antibiotiques ou métaux lourds
- tolérance aux facteurs physico –chimiques: T°, pH,
salinité…
 Temps de génération des rhizobia nodulant
le pois chiche au Maroc

50
50%
Pourcentage des souches

40 41,7
%
30

20

10 8,3%
0
TG<3H 3H<TG<9H TG>9H
Temps de génération en heure

* Souches à croissance rapide (8,3%)

* Souches à croissance intermédiaire (41,7%)
* Souches à croissance lente (50%)
 Traitement statistique des données: Ex. logiciel Statistica
Même poids pour chaque caractère: positif =1, négatif=0
Calcul du pourcentage de similitude entre les souches

Souches
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Température 15° 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0
Température 20° 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1

Température 25° 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Température 30 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Température 35° 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1
Caractères

Température 40° 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1
Glucose 1 1 1 1
Fructose 1 1 1 1
Maltose 1 1 1 0

Saccharose 1 1 1 1

Pinicilline 100mg 1 1 1 0
Kanamycine 100mg 0 1 1 0
 Niveau de similarité
* ER: Faible
0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 1,00
* TG < 3H
Rch 9869 Groupe III * bonne tolérance:
Rch 9868
Rch 9871 100% salinité, T°, PHs
Rch 9813
Rch 9835 Kalâa
Rch 9832
* ER: Moyenne à bonne
Groupe II
Rch 9865
Rch 9862
Rch 9863
Rch 9861 100% * TG > 9H
Rch 9820
Ben Slimane
* Sensibles aux
Rch 9819
Rch 985
Rch 984
Rch 128 :- T° basses et élevées,
Rch 102
Rch 7
- pHs basiques et acides
Rch 161
Rch 134
Rch 19
Rch 28
Rch 30
Rch 18
Rch 94 * ER: bonne
Rch 60
Rch 126
Rch 125
Groupe I * 3H > TG < 9H
Rch 35
Rch 24
Rch 16 isolats de * Moyenne à assez bonne
Rch 14
différentes
Rch 13
Rch 10 régions tolérance à la salinité
Rch 5
Rch 2
Rch 9816
* Tolèrent la T° de 35°C
Rch 9815
Rch 989
et les pHs basiques
Rch 9822
Rch 9842
Rch 9841
Rch 9840
Rch 9821
Rch 8
Rch 988
Rch 982
Rch 983
Rch 981

Phénogramme représentant la similarité phénotypique entre les

rhizobia du pois chiche isolés des différentes régions du Maroc.
 Classification des rhizobia
* D'après leur vitesse de croissance 2 groupes:

- rhizobia à croissance rapide: G compris entre 2 et 5 H à 30°C.

Colonies gommeuses, plusieurs mm de diamètre après 3 à 5 jours
Généralement producteurs de substances acides.

- rhizobia à croissance lente: G compris entre 12 et 24 H à 30°C.

Colonies peu gommeuses, diamètre < à 1 mm après 7 jours
Bactéries non productrices de substances acides
Pendant longtemps un seul genre Rhizobium, basé sur leur
spécificité d'hôte définition de groupes d'inoculation croisée:

- Rhizobium à croissance rapide:

@ Rhizobium trifolii-trêfle
@ " phaseoli- haricot
@ " leguminosarum- fève, pois, lentille
@ " meliloti- luzerne, melilot
- Rhizobium à croissance lente:
@ Rhizobium lupini- lupin
@ " japonicum- soja
@ " cowpea-Vigna, Arachis
Par la suite taxonomie numérique (Jordan, 1984) basée sur:

- métabolisme des hydrates de carbone

- sensibilité aux antibiotiques
- sérologie
- diverses techniques moléculaires
- vitesse de croissance dans le milieu YEM

deux genres:
Rhizobium, 3 espèces: meliloti, loti et leguminosarum
avec 3 biovars (phaseoli, viceae, trifolii)

Bradyrhizobium, 2 espèces: B japonicum et B.spp

 Critères de classification des rhizobia de 1991
Fixés par le sous-comité international de taxonomie de Rhizobium
et d'Agrobacterium (Graham et al., 1991):
- les performances symbiotiques avec les hôtes végétaux;
- les caractéristiques culturales et morphologiques;
- la sérologie;
- la résistance aux antibiotiques;
- l'analyse de l'ARN ribosomal 16S;
- l'hybridation avec des sondes géniques spécifiques (nif, nod…);
- les RFLPs d’ADN chromosomique ou plasmidique;
- les profils électrophorétiques des protéines solubles totales en
SDS-PAGE
- la mobilité électrophorétique des enzymes du métabolisme
(isoenzymes);
- l'homologie ADN:ADN;
- l'hybridation ARNr:ADN.
Ainsi, progressivement 4 nouveaux genres ont été définis :

- Azorhizobium: souches nodulant les tiges de plantes

telle: Sesbania
- Sinorhizobium: regroupe deux espèces qui figuraient dans le
Rhizobium meliloti, des souches à croissance rapide nodulant le
soja et des isolats nodulant les arbres (Ensifer).

-Mesorhizobium: regroupe 5 espèces parmi elles les souches

nodulant le pois chiche, le soja
- Allorhizobium: souches nodulant Neptunia natans.
En 2013/2017: 13/17 genres, 98/238 espèces et plusieurs biovars ou
symbiovars de bactéries nodulant leur plante hôte étaient validées
Genres Espèces
Rhizobium 30
Mesorhizobium 20
Ensifer (Sinorhizobium) 17
Bradyrhizobium 09
Burkholderia 07
Phyllobacterium 03
Microvirga 03
Azorhizobium 02
Ochrobactrum 02
Methylobacterium 01
Cupriavidus 01
Devosia 01
Shinella 01

http://www.rhizobia.co.nz/taxonomy/rhizobia
Relations phylogénétiques entre les différents genres de rhizobia représentés par
les espèces types y compris les souches de Burkholderia nodulant les
légumineuses. Les lettres α, β, γ, ε et δ représentent les différentes subdivisions
des Proteobacteria. L’arbre est construit en se basant sur les séquences 16S rDNA
en utilisant la méthode neighbour-joining (Moulin et al 2001, Nature).
 Premiers génomes de rhizobium séquencés
Taille du
Rhizobium Replicons laboratoires Achèvement
génome
Mesorhizobium 7.6 Mb 1Chromosome
Kazusa Institut Nov. 2000
loti 2 Plasmids

Sinorhizobium 1Chromosome European,

6.7 Mb March 2001
meliloti 2Megaplasmids Canadian and
(Ensifer meliloti) US groups

Bradyrhizobium
9.1 Mb 1Chromosome Kazusa Institute Nov. 2002
japonicum

1Chromosome
Rhizobium ~7.7 Mb Sanger Institute 2003/2004
6 Plasmids
leguminosarum
bv. viciae

1Chromosome CIFN-UNAM 2006

Rhizobium etli ~7.0 Mb
6 Plasmids