Cours de Biotechnologies de La Reproduction

COURS DE BIOTECHNOLOGIES DE LA REPRODUCTION
Plan
Introduction
Chapitre I : L’INSEMINATION ARTIFICIELLE
I- Généralités
II- Les méthodes de collecte et d’analyse du sperme
III- Dilution et conservation de la semence
IV- Insémination dans les voies génitales femelles
Chapitre II : LES AUTRES TECHNOLOGIES APPLIQUEES A LA

REPRODUCTION
TP : Collecte et analyse du sperme
TPE :
1- L’ovulation multiple avec transfert d’embryons (MOET),

2- Le prélèvement d’ovocytes (PO), la maturation in vitro des ovocytes (MIV) et la
fécondation in vitro (FIV),
3- Le transfert nucléaire ou le clonage d’embryons,
4- La sélection du sexe,
5- La transgénèse.
Cours Biotechnologies de la Reproduction, Niveau 5 PAA, Dr TADONDJOU Page 1

Introduction
L’amélioration spectaculaire des productions animales à laquelle on assiste depuis les

cinquante dernières années est le résultat d’une double démarche : d’une part une meilleure
utilisation des techniques traditionnelles d’élevage (alimentation, hygiène, reproduction...), et
d’autre part une application rapide de nouvelles techniques issues de la recherche (sélection
génétique, contrôle de la reproduction, vaccination, alimentation...).
Dans le domaine du contrôle de la reproduction précisément, de nombreuses technologies ont

été mises au point, ou sont en cours d’étude, pour augmenter le potentiel de reproduction des
animaux d’élevage. Ce sont : L'insémination artificielle (IA), L’ovulation multiple avec
transfert d’embryons (MOET), le prélèvement d’ovocytes (PO), la maturation in vitro des
ovocytes (MIV) et la fécondation in vitro (FIV), le transfert nucléaire ou le clonage
d’embryons, la sélection du sexe, la transgénèse.
CHAPITRE I : L’INSEMINATION ARTIFICIELLE (IA)
I- Généralités
L’insémination artificielle est une technique de reproduction assistée consistant à placer du

sperme dans les voies génitales de la femelle sans qu’il y ait de rapport sexuel.
A- Principe
L'insémination artificielle consiste à féconder une femelle avec du sperme prélevé
préalablement sur un male.
Cela suppose plusieurs étapes :
 Récolte du sperme (vagin artificiel, électro-éjaculateur, massage transrectal);
 Examens (spermogramme : volume, aspect, motilité, concentration, anomalies) et
préparation du sperme frais (usage d’un dilueur) ;
 Conservation de la semence à basse température dans un centre d'insémination ;
 Insémination dans le vagin de la femelle en chaleur à l'aide d'une seringue.
B- Avantages
Les avantages de l'insémination artificielle sont considérables :
 La capacité reproductrice d'un mâle est décuplée. Cela permet de diffuser rapidement
les animaux sélectionnés.
 Le contrôle de la paternité est absolu, si les femelles sont surveillées et les autres
mâles castrés.
 L'insémination artificielle est possible à tout moment alors que l'accouplement est
souvent impossible, le reproducteur étant trop loin, ou fatigué par une saillie récente.
 Le sperme congelé conserve ses propriétés plusieurs années. Il faut s'assurer de la
qualité du sperme lors de la récolte de l'éjaculat.

 L'insémination artificielle contribue à l'éradication de nombreuses maladies
sexuellement transmissibles.
C- Limites
L'application d'un programme d'insémination artificielle se heurte à de nombreux obstacles en
régions chaudes :
 Il suppose des infrastructures rurales le plus souvent absentes :
- centre d'insémination (maîtrise de l'énergie, chaine du froid);
- réseau de techniciens d'élevage pour diffuser la technique auprès des paysans ;
- sensibilisation et formation des paysans qui doivent modifier leur mode de conduite des
animaux (séparation des mâles et des femelles) ;
- moyens de communication : routes, téléphone ...
 Il y a risque d'appauvrissement génétique, le nombre de reproducteurs d'un centre
d'insémination étant généralement limité.
 La synchronisation des chaleurs et de l'insémination suppose une technicité élevée de
la part de l'éleveur, pour détecter les chaleurs.
 C’est une technique onéreuse pour l’éleveur : sans compter les divers aménagements,
le coût d'insémination (il en faut généralement 2 pour obtenir la fécondation) est
souvent excessif pour le petit éleveur.
 Elle n'est pas possible en élevage extensif, car on ne peut surveiller les femelles. La
divagation des animaux, en multipliant les risques de saillies incontrôlées, perturbe les
programmes d'insémination artificielle.
Des formes simples de gestion des reproducteurs en milieu éleveur permettent de lever les
contraintes de l'insémination artificielle.
D- La gestion collective des mâles

La gestion de la reproduction et l'amélioration génétique chez les petits éleveurs ne sont pas
faciles. Ils possèdent au mieux un reproducteur, quand ils peuvent en supporter le coût
d'entretien.
La création de centres d'hébergement des géniteurs males à la disposition des éleveurs locaux
peut être une solution :
 Répartie entre tous les éleveurs, la charge d ·entretien des animaux est plus faible à
supporter ;
 Les animaux sont mieux entretenus et donc plus performants qu'en élevage
traditionnel;
 Il est possible de développer des programmes de sélection avec contrôle des
performances, qu'un éleveur seul ne pourrait financer.
Cette formule présente toutefois des inconvénients : éloignement, risques sanitaires. Le
placement sous forme contractuelle d'un géniteur chez un éleveur permet d'alléger le dispositif
et réduit les distances à parcourir.
Depuis le développement de méthodes efficaces de congélation de la semence, l’IA est

devenue la technique la plus répandue en production animale, notamment dans le secteur de

l’élevage bovin. En permettant l'utilisation à grande échelle de quelques reproducteurs d'élite,
l’IA a eu un impact considérable sur l'intensité de la sélection. L’IA a également permis la
mise en œuvre du programme d’évaluation de la descendance, notamment dans les races
bovines laitières. Cette approche a eu un impact majeur sur l'amélioration du cheptel en
renforçant la précision de la sélection malgré l'augmentation de l'intervalle entre générations.
II- Les méthodes de collecte et d’analyse du sperme
A- Les méthodes de collecte du sperme

La collecte du sperme est une opération très importante en insémination artificielle parce
qu’elle permet de disposer de semence pour réaliser les doses d’insémination artificielle. La
technique de collecte du sperme varie d’une espèce à une autre.
Chez les ruminants, la collecte est faite à l’aide d’un vagin artificiel ou d’un électro-
éjaculateur. L’électro-éjaculateur est plus utilisé chez les petits ruminants.
La technique de la collecte la plus utilisée en insémination porcine est celle de la main
gantée. Elle est réalisée sur un mannequin fixe. Le vagin artificiel est également utilisé à la
place de la technique de la main. Dans les pays développés, un système de collecte
automatique (Collectis®, France) a été mis en place depuis les années 2000. Ce système est
utilisé dans les centres de production de sperme gérant de grands effectifs de verrats.
La technique de collecte du sperme chez les oiseaux est celle du massage dorso-abdominal
décrite par Burrows et Quinn (1937) chez le coq. Cette technique provoque l’éjaculation
spontanée chez le mâle et la semence est récoltée au niveau du cloaque dans un tube. Cette
technique est utilisée pour la récolte du sperme chez les dindons, les coqs et le canard.
La collecte du sperme chez les lapins se fait au moyen de vagin artificiel que l’on place sous
le train arrière d’une femelle boute-en-train de telle sorte à faire correspondre l’orifice du
vagin artificiel à celui du vagin réel.
Chez les aulacodes, la collecte se fait par excitation manuelle du pénis. Pour exciter
l’appétit sexuel du mâle, une femelle boute-en-train est introduite dans l’enclos quelques
minutes et ressortie avant l’éjaculation.
Les mâles dont la semence n'a jamais été collectée doivent être entrainés à la collecte.
Cette opération nécessite un certain nombre d'heures de travail et beaucoup de patience. Il est
préférable de la commencer pendant la saison où la motivation sexuelle est à son maximum
(fin de l'été et automne chez les races saisonnées) ou, chez les jeunes animaux, dès qu'ils ont
atteint la puberté. Il est très important que ce soit la personne chargée des futures collectes qui
fasse ce travail.
1- Collecte à l’électro-éjaculateur
1-1- Electrostimulation de l’érection et de l’éjaculation : principe de l’électro-
éjaculation
Le principe de l’électro-éjaculation est de faire passer un courant de façon diffuse dans la
sphère génitale de manière à provoquer l’excitation des différents centres nerveux
responsables de l’érection et de l’éjaculation ; ces derniers étant situés dans la moelle épinière
lombaire et sacrée. Un générateur produit de l’électricité qui est transmise par l’intermédiaire
d’électrodes à l’animal. Les électrodes rectales sont les plus couramment utilisées aujourd’hui

car elles permettent dans une certaine mesure de mieux contrôler le site de la stimulation. La
stimulation de nerfs qui passent à proximité de la zone stimulée, par exemple le nerf sciatique,
peut provoquer des contractions musculaires non souhaitées.
1-2- Description de la méthode collecte à l’électro-éjaculateur
L’électro-éjaculation permet de provoquer l’éjaculation par une stimulation électrique. Un
générateur produit de l’électricité qui est transmise par l’intermédiaire d’électrodes à l’animal.
L’interface tissu/électrodes (résistance interne) joue un rôle non négligeable car la stimulation
électrique doit parvenir jusqu’aux nerfs pour provoquer l’érection et l’éjaculation.
1-2-1- Fonctionnement de l’électro-éjaculateur
 Le générateur
Le développement de la technique d’électro-éjaculation a abouti à la mise au point
d’appareillages compacts et robustes, équipés de transistors et circuits intégrés pour étendre la
gamme des stimulations possibles. Les appareils fonctionnent le plus souvent à partir de
batteries de faible voltage.
 Les électrodes
Les électrodes utilisées aujourd’hui pour l’électro-éjaculation sont rectales afin de limiter la
stimulation des tissus environnants. Elles sont introduites dans le rectum préalablement vidé
des fécès. Elles sont soit fixées à la main de l’opérateur, soit fixées à une sonde rectale. Elles
doivent être en contact avec le plancher du rectum, dans la région des glandes vésiculaires,
crânialement à la prostate. Les premières électrodes équipant les sondes rectales étaient des
électrodes circulaires, utilisées par Laplaud et Cassou en 1945. Les électrodes longitudinales
ont été crées en 1954. Les essais comparatifs entre les deux types d’électrodes sont en faveur
des électrodes longitudinales, qui permettent d’obtenir de meilleurs résultats de collecte.
L’intérêt des électrodes fixées sur la main est de permettre à l’utilisateur de palper les organes
pelviens (prostate, glandes vésiculaires) et de stimuler une zone précise et limitée. Les
contractions musculaires non souhaitées sont ainsi fortement diminuées chez le taureau.
Cependant, des risques de blessures liées soit à l’électricité, soit à la chute de 31 l’animal sont
à craindre pour l’opérateur. C’est pourquoi les électrodes sur sonde rectale sont les plus
utilisées actuellement. Un des modèles vendus aux Etats-Unis et utilisé en Europe est
l’Electrojac®. 3 électrodes longitudinales font saillie sur la sonde, pour permettre le contact
avec la muqueuse rectale.
 Les paramètres de stimulation
Les appareils électriques actuels permettent de faire varier la fréquence, la tension et
l’intensité électrique. Des programmes de stimulation sont enregistrés dans les appareils
récents.
Paramètres électriques :
-La tension : en général, une tension de 20 volts est utilisée quelle que soit l’espèce animale.
La tension maximale utilisable est fonction des réactions de l’animal. La tension nécessaire à
l’obtention d’une éjaculation varie en fonction des individus en raison de différences de
résistance de l’interface tissu/électrodes. L’utilisation d’une forte tension augmente les risques
de contractions musculaires, de brûlures de la muqueuse et d’électrocution.
L’utilisation d’un faible voltage permet de diminuer ces risques mais en contrepartie le temps
et le nombre de stimulations nécessaires sont plus importants.
-L’intensité : elle est liée à la forme et à la surface de l’électrode utilisée

-La résistance interne correspond à la résistance de tout ce qui se trouve entre les électrodes
rectales et les nerfs. Elle varie avec l’humidité (l’humidité diminue la résistance), et avec
l’encombrement du rectum (la présence de fèces augmente la résistance et peut être la source
d’échecs). C’est pourquoi le rectum du taureau doit être préalablement vidé de son contenu et
un gel lubrifiant doit être appliqué sur la sonde pour faciliter son introduction et permettre un
meilleur contact entre les tissus et les électrodes.
Modèle de stimulation :
Les électro-éjaculateurs actuels fonctionnent selon deux modes : automatique ou manuel.
Certains possèdent un commutateur permettant de choisir l’un ou l’autre mode de
fonctionnement. Le modèle que nous avons utilisé dans notre étude, Electrojac5®, permet de
travailler suivant les deux modes. Le mode automatique est conseillé par le fabricant, il
permet d’appliquer des stimulations similaires aux taureaux ; c’est celui qui a été utilisé pour
l’expérimentation. Chaque cycle se compose de 32 stimulations, à voltage croissant de la 1 e à
la 24e impulsion (passage de 6 à 21 volts) et à voltage constant de la 24 e à la 32e impulsion (21
volts). Chaque stimulation dure 2 secondes est suivie par deux secondes de repos.
1-2-2- Déroulement de la collecte de sperme à l’électro-éjaculateur chez le taureau
 Contention
La contention physique de l’animal est réalisée à l’aide d’une cage de contention. Une sangle
pectorale peut être utilisée pour empêcher l’animal de s’affaisser lors des stimulations
électriques. L’utilisation d’une sangle abdominale est proscrite par certains auteurs (Lacroix,
1988), car elle constitue une gêne à l’écoulement des liquides spermatiques et peut provoquer
une contusion de la verge en turgescence. Préparation du taureau La palpation transrectale
permet de vérifier l’intégrité des organes génitaux internes. Le massage des glandes
vésiculaires et ampoules du conduit déférent stimule l’animal et entraîne la sécrétion du fluide
séminal. Les poils du toupillon peuvent être coupés à ras et l’extrémité du fourreau nettoyée à
l’eau (sans antiseptique spermicide), pour éviter une souillure du sperme notamment lors
d’éjaculation à l’intérieur du fourreau.
 Stimulation
La récolte de sperme à l’électro-éjaculateur nécessite 2 voire trois personnes. La position de la
sonde dans le rectum est importante en raison des localisations des centres nerveux. Ainsi,
suivant le degré d’enfoncement, la sonde pourra ou non provoquer l’érection. Une personne
maintient la sonde dans le rectum pour éviter qu’elle ne soit expulsée par les contractions du
taureau. Lorsque l’érection est absente, un opérateur peut éventuellement provoquer
l’extériorisation du pénis en appuyant sur l’inflexion sigmoïde.
 Récolte
La récolte est effectuée par un opérateur placé à côté du taureau en position accroupie ou à
genoux. Un support rigide prolongé d’une barre rigide permet de disposer un entonnoir avec
un tube à son extrémité pour la récolte du sperme. Le système peut être amélioré par l’ajout
d’une poche remplie d’eau chaude autour de l’entonnoir, permettant le maintien du sperme à
37°C.
La stimulation électrique appliquée dans le rectum du taureau provoque d’abord la stimulation
des glandes annexes et l’excrétion de liquide séminal avant de déclencher l’éjaculation.
L’opérateur doit donc attendre que ce liquide spermatique devienne laiteux avant de débuter
la collecte, ceci afin d’obtenir un sperme le plus concentré possible.

1-2-3- Intérêts et limites de la collecte à l’électro-éjaculateur
Les intérêts de la technique de collecte à l’électro-éjaculateur sont les suivants :
- Facilité de récolte : La plupart des électro-éjaculateurs sont dotés d’un mode de
fonctionnement automatique d’utilisation facile. Le matériel nécessaire est facilement
transportable, en général contenu dans une mallette.
- Observation de la verge : Quand l’érection a lieu, elle permet un examen attentif de la verge,
ce qui est plus difficile avec un vagin artificiel.
- Possibilité de collecter les taureaux qui ne sont pas capables de donner le coup de rein
concomitant de l’éjaculation et nécessaire à la collecte au vagin artificiel. Certains taureaux
peuvent se montrer récalcitrants à la collecte au vagin artificiel pour des raisons variables :
pathologies de l’appareil locomoteur, stress provoqué par la présence humaine, manque de
docilité, faible libido.
Les limites de la collecte à l’électro-éjaculateur sont les suivantes :
- Qualité de la semence : Les effets de la technique de collecte à l’électro-éjaculateur sur les
paramètres de la qualité de la semence des taureaux sont décrits et discutés dans la partie
expérimentale de la thèse. Des études antérieures ont montré que la collecte à l’électro-
éjaculateur entraînait une plus grande dilution de l’éjaculat et une diminution de la qualité de
la semence par rapport à une collecte à l’électro-éjaculateur.
- Inconfort ou douleur du taureau lors des stimulations électriques : La stimulation électrique
diffuse appliquée dans le rectum provoque l’excitation de différents nerfs (en particulier le
nerf sciatique), ce qui entraîne des contractions musculaires involontaires de l’animal.
Certains taureaux, en particulier les animaux de moins de deux ans, manifestent un inconfort
important lors de l’application des stimulations : ils meuglent, se crispent et certains tombent.
2- Collecte au vagin artificiel

2-1- Entraînement des mâles
Deux cas de situation sont à envisager : Mâles dont la semence n'a jamais été collectée et
Mâles dont la semence a déjà été collectée auparavant.
 Mâles dont la semence n'a jamais été collectée :
L'entraînement pour la collecte au vagin artificiel doit également être réalisé au même endroit
où les animaux seront collectés ultérieurement. Dans l'espèce ovine, les mâles sont disposés
dans une salle d'attente d'une surface d'environ 1 m par mâle. Ils sont ensuite introduits
calmement, un par un ou deux par deux, dans la salle de collecte et mis en présence des brebis
boute-en-train. Une des brebis est laissée libre et l'autre est immobilisée.
Dans l'espèce caprine, du fait que les mâles sont élevés dans des boxes individuels, ils sont
mis un par un en présence de la femelle immobilisée. Il est très important d'avoir des femelles
manifestant un comportement d'œstrus au moment de la collecte. Des femelles entières
peuvent être utilisées, en œstrus naturel ou induit par traitement hormonal classique. Des
femelles castrées peuvent également être utilisées. Un traitement hormonal artificiel doit donc
être employé pour aboutir à l'obtention d'un comportement d'œstrus:

 Chez la brebis: un prétraitement avec une injection quotidienne de 25 mg de
progestérone pendant cinq jours consécutifs, puis un sixième jour avec seulement 10 mg, ou
bien l'insertion d'une éponge vaginale contenant un progestagène pendant six jours. Ce
prétraitement est suivi 48 heures plus tard d'une injection de 100 µg de benzoate d'œstradiol.
Le comportement d'œstrus apparaît alors 16 à 36 heures après l'injection d'œstradiol. Le
comportement d'œstrus peut être maintenu au moins un deuxième jour après la première
induction par l'injection d'une seconde dose d'œstradiol, mais la réponse ultérieure à une
troisième injection ou à des injections ultérieures est fortement réduite. Un nouveau
prétraitement à la progestérone est alors nécessaire pour resensibiliser les brebis à l'action de
l'œstradiol.
 Chez la chèvre: même traitement, sans le prétraitement à la progestérone. Chez les
femelles de cette espèce, le comportement d'œstrus peut être maintenu par des injections trois,
deux, voire une seule fois par semaine, de 100 µg de benzoate d'œstradiol.
Plusieurs situations peuvent alors se présenter:
i. Si le mâle manifeste un des éléments caractéristiques de la séquence du comportement

sexuel tels que flairage, approches ritualisées ou monte, il est nécessaire que l'opérateur tente
une approche. Celle-ci doit être faite calmement afin d'éviter un réflexe de crainte de l'animal.
Si la motivation sexuelle du mâle est suffisante et que, en dépit de la présence humaine, celui-
ci continue de chevaucher la femelle, le vagin artificiel peut être présenté dès que le mâle est
dans une position adéquate pour l'accouplement. Deux situations peuvent alors survenir:
 Le mâle éjacule immédiatement dans le vagin artificiel. Il acceptera de le faire à

chaque sollicitation.
 Le mâle, même s'il monte la femelle, redescend dès que la main de l'opérateur touche
le prépuce pour dévier le pénis dans le vagin artificiel. Il est très important, à ce stade, que
l'opérateur ne change pas sa position accroupie afin que le mâle ne puisse pas associer les
deux événements. L'animal revient généralement de lui-même pour tenter à nouveau de
monter la femelle. Durant ce second essai, il est possible que le mâle serve le vagin artificiel.
S'il ne le fait pas, c'est que la peur de l'homme devient plus forte que la motivation sexuelle et
la collecte de semence ne sera pas possible. Dans ce cas, il peut être utile que l'opérateur laisse
le mâle effectuer la saillie de la femelle sans tentative de collecte et qu'en même temps, il le
stimule de sa voix. Cette attitude risque toutefois d'inciter le mâle à renouveler ce type de
comportement.
ii. Chez quelques animaux peu motivés, le comportement sexuel se limite à une tentative
d'accouplement. L'opérateur doit alors être prêt à effectuer la collecte à chaque tentative de
l'animal. Il peut aussi recourir à d'autres moyens pour améliorer la situation: détacher la
femelle et la faire passer devant le mâle, changer de femelle, encourager le mâle de la voix ou
tourner la tête de la femelle vers l'arrière. Dans ce cas, une telle sollicitation ne doit pas
excéder 5 à 10 minutes. Il est préférable de répéter les contacts avec la femelle, puisque c'est
en général dans les minutes qui suivent chaque contact que le comportement sexuel est
déclenché.
Dans l'espèce caprine, les mâles présentent généralement un comportement sexuel plus rapide
et plus spectaculaire que les béliers et sont souvent plus faciles à collecter.

iii. Quelques animaux manifestent une inhibition dans leur comportement sexuel, soit à
cause de la présence de l'homme, soit parce qu'ils sont homosexuels ou simplement «non
actifs», soit enfin parce qu'ils ont un problème d'ordre sanitaire.
Inhibition due à la présence de l'homme. Le mouton est un animal craintif et grégaire qui,
lorsqu'il est isolé de ses congénères, manifeste des réactions de crainte. Les mâles réagissant
ainsi requièrent un entraînement spécial, en particulier pour les familiariser avec le son de la
voix de l'opérateur et l'odeur de ses vêtements. Celui-ci doit éviter de porter des vêtements
aux couleurs vives (blouse blanche de laboratoire, par exemple) et préférer des couleurs
sombres (bleu ou noir). Un autre moyen intéressant, qui peut être employé avec succès dans le
cas de mâles présentant un comportement sexuel déficient en dépit de conditions d'élevage
optimales pendant la période prépubère, est de les utiliser en même temps que d'autres mâles
pour détecter l'œstrus des femelles, pendant la saison sexuelle par exemple ou lors d'un œstrus
induit. La manipulation fréquente des mâles ainsi que la présence répétée de femelles en
œstrus sont susceptibles de déclencher l'activité sexuelle.
Chez les caprins, peu d'animaux manifestent une inhibition dans leur comportement sexuel en
présence de l'homme. Lorsque cela arrive, les mêmes méthodes que chez les ovins peuvent
être employées.
Inhibition due à l'homosexualité. Un faible pourcentage de mâles déclenche leur

comportement sexuel en présence d'autres mâles. Cela se produit plus particulièrement
lorsque les mâles sont élevés en groupes sans femelles au cours des 2-3 mois qui précèdent la
puberté. Dans le cas de l'homosexualité, le meilleur moyen de collecter les mâles au vagin
artificiel est d'utiliser un mâle boute-en-train, au lieu d'une femelle.
Béliers «non travailleurs». De tels animaux ne manifesteront aucune libido, même dans le
cas de lutte naturelle dans un troupeau de femelles.
Inhibition due à des problèmes sanitaires. Une infection du prépuce et/ou du pénis est très
douloureuse et peut empêcher la monte. Une inflammation des articulations peut également
empêcher la saillie et toute infection générale est susceptible de diminuer la motivation
sexuelle.
L'importance relative de ces différentes inhibitions varie en fonction de l'espèce et de la race,

mais aussi en fonction de l'origine des mâles. Si des mâles adultes sont récupérés en ferme (à
cause de leur valeur génétique, par exemple) pour être utilisés dans un centre d'IA, ils sont
toujours plus difficiles à collecter que les mâles élevés dans de bonnes conditions au centre
même. Par conséquent, il est préférable de choisir les jeunes mâles le plus tôt possible (au
sevrage, par exemple), afin de leur procurer les conditions d'élevage adéquates (présence de
femelles avant la puberté chez le bélier, isolement chez le bouc, bonnes conditions sanitaires
et alimentaires et manipulation fréquente par l'homme).
Une autre technique susceptible d'être utilisée avec succès chez les jeunes mâles est de placer
la femelle boute-en-train dans le box des mâles, tandis que l'opérateur se tient prêt avec le
vagin artificiel. Cette technique de collecte dans l'environnement habituel des animaux est
efficace si elle est répétée jusqu'à ce qu'un nombre maximum de mâles deviennent actifs.
 Mâles dont la semence a déjà été collectée auparavant.

En général, les mâles déjà habitués ne manifestent pas de problèmes comportementaux, même
après un repos sexuel de plusieurs mois, si la période de collecte de semence redémarre
pendant la période d'activité sexuelle maximale (saison sexuelle annuelle chez les animaux
saisonnés). Toutefois, si ce redémarrage se situe hors saison, une inhibition sexuelle peut se
produire sur un faible nombre de mâles. Celle-ci est due à la saison et non à la peur de
l'homme. Dans cette situation, il est nécessaire et généralement suffisant de stimuler le
comportement sexuel de ces mâles en les mettant en présence de femelles en œstrus. Le
meilleur moyen d'éviter tout problème avec les collectes de semence pendant la contre-saison
est d'entraîner régulièrement les mâles à la collecte à des jours et heures fixes.
2-2- Description de la technique de Collecte de semence sur des mâles entraînés
 Principe
Le principe du vagin artificiel est de reproduire l’ensemble des sensations présentées par les
voies génitales femelles lors du coït (chaleur, pression, lubrification), et de recueillir
rapidement un éjaculat total et non souillé. Le matériel est constitué d’un cylindre de
caoutchouc rigide (manchon extérieur), d’une trentaine de centimètres de long et d’un
diamètre intérieur de 5 cm. Il est doublé à l’intérieur d’une capote amovible et gonflable
(manchon intérieur), également en caoutchouc. La paroi qui le constitue est donc double et
peut être remplie d’eau ou d’air à l’aide d’une valve extérieure. Lors du prélèvement, le vagin
est prolongé d’un cône en silicone (25 cm de long) à l’extrémité duquel est fixé le tube de
collecte. Ce dernier est protégé des chocs mécaniques, thermiques et de la lumière par un
manchon opaque et isolant. L’ensemble du vagin lorsqu’il est prêt à être utilisé est lui-même
isolé thermiquement. Après utilisation, l’ensemble du vagin est entièrement démonté pour être
lavé, séché et désinfecté.
 Espèce ovine
Organisation de la salle de collecte. Les mâles sont conduits à la salle de collecte et attachés
au mur à l'aide d'une chaîne et d'un collier. Il doit y avoir le même nombre de points d'attache
que de mâles à utiliser. Une femelle boute-en-train est alors immobilisée dans l'appareil de
contention et une autre femelle est gardée à proximité dans 'le cas où une stimulation nouvelle
serait nécessaire pour une seconde collecte.
Une solution alternative est de collecter les mâles directement dans leurs boxes. Cette solution
n'est toutefois pas idéale dans la mesure où le lieu de collecte est alors loin du laboratoire.
Préparation des mâles. Une fois attachés, il est nécessaire de nettoyer soigneusement la partie
abdominale des béliers, devant et autour du fourreau. Le lavage de l'intérieur du fourreau avec
une solution saline (0,9 pour cent de NaCl), pour éliminer le maximum de fragments et
d'impuretés qui ont pu s'y accumuler, est recommandé.
Chaque mâle est détaché et laissé en contact avec la femelle boute-en-train. Un temps
d'attente de cinq à six minutes avant l'éjaculation accroît la quantité et la qualité de semence
mais, en pratique, elle est difficile à mettre en œuvre. Il peut être préférable de forcer le mâle
à effectuer des fausses montes en lui permettant de monter sur la femelle et en le forçant à
descendre avant l'éjaculation.

FIGURE Collecte de semence: séquence d'événements (a)matériel (b) femelle boute-en-
train attachée (c)collecte de la semence (d) mouvement descendant du vagin artificiel
après collecte de la semence
Collecte de la semence. L'opérateur, un genou à terre à côté du mâle, dévie légèrement avec la
main le pénis du bélier en le manipulant au niveau du fourreau (figure 41). Simultanément,
avec l'autre main, il avance le vagin artificiel (température 42-45°C) afin d'y faire entrer le
pénis. L'éjaculation se produit alors immédiatement. Il est nécessaire de prendre garde à bien
placer le vagin artificiel dans le prolongement du pénis afin que celui-ci pénètre
complètement dans le vagin artificiel. Immédiatement après l'éjaculation, le mâle redescend et
l'opérateur donne deux ou trois mouvements énergiques au vagin artificiel afin de faire
descendre l'éjaculat à l'extrémité du tube de collecte gradué. Il est particulièrement important
que la semence reste le moins longtemps possible en contact avec le caoutchouc du cône.
Afin de collecter immédiatement un deuxième éjaculat du même mâle dans le même tube de
collecte, il est nécessaire de susciter un réflexe conditionné. Avec des mâles entraînés,
pendant la saison sexuelle, deux éjaculats successifs peuvent être obtenus à un intervalle de
une à deux minutes. Ce délai peut s'accroître chez des mâles non entraînés, en dehors de la
saison sexuelle. Si le second éjaculat n'est pas obtenu au bout de deux à trois minutes, il est
préférable de traiter le premier éjaculat. Le mâle sera alors rattaché et un second éjaculat
pourra être collecté plus tard dans un autre vagin artificiel.
 Espèce caprine
L'organisation de la collecte de semence est assez différente pour les boucs, parce qu'ils sont
conduits en cases individuelles, mais également parce que la semence non diluée apparaît plus
fragile que dans l'espèce ovine.
Chaque bouc est conduit directement de son box jusqu'à la salle de collecte. L'opérateur
s'agenouille à côté du mâle et effectue les mêmes manipulations que pour le bélier. Les
fausses montes ne sont pas nécessaires et aucun effet positif du temps d'attente avant la
collecte n'a été démontré. Les boucs peuvent, par conséquent, être collectés dès qu'ils entrent
dans la salle de collecte. A cause de l'effet néfaste du plasma séminal, dans cette espèce, sur la
survie in vitro des spermatozoïdes, il n'est pas recommandé d'attendre pour collecter un
second éjaculat dans le même vagin artificiel. Immédiatement après la collecte, les mêmes

procédures que pour le bélier doivent être appliquées afin de limiter le temps de contact de la
semence avec le caoutchouc du cône. Une fois que la semence a été collectée, elle doit être
traitée comme indiqué ci-après (échantillonnage pour motilité massale et concentration puis
«lavage» immédiat pour séparation du plasma séminal).
 Espèce bovine
Avant chaque utilisation, les vagins sont maintenus dans une étuve à une température de
45°C. L’eau présente dans la paroi du vagin permet de maintenir une certaine pression et une
température du vagin d’environ 42°C lors de la collecte. Si la température de l’eau est trop
élevée, l’organe copulateur peut être lésé et le taureau peut refuser la collecte. Les vagins sont
sortis de l’étuve au dernier moment, lorsque le préleveur estime que le taureau est
suffisamment préparé. La capote interne du vagin artificiel est plus ou moins gonflée en
fonction des habitudes du taureau. L’intérieur du vagin est lubrifié avec de la vaseline ou un
gel gynécologique.
Le taurellier laisse alors le taureau monter sur le boute en train. Le préleveur s’accole au
taureau, il dévie son pénis en érection dans le vagin artificiel en le saisissant à travers le
fourreau. Ce simple contact suffit en général à déclencher le saut et l’éjaculation qui ne durent
que quelques secondes. L’opérateur retourne ensuite le vagin artificiel et le sperme s’écoule
dans le tube collecteur.
2-3- Intérêts et limites de la collecte au vagin artificiel
Les intérêts de la collecte au vagin artificiel sont les suivants :
-Qualité de la semence : La collecte au vagin artificiel donne un éjaculat naturel, induit par
une libido nécessaire et suffisante, et produit par un comportement physiologiquement proche
du coït. C’est pourquoi elle permet d’obtenir le meilleur sperme possible à un moment donné.
-Observation de la capacité à saillir du taureau : Dans le cadre d’un contrôle de fertilité, la

collecte au vagin artificiel permet d’apprécier l’aptitude à la saillie du taureau, qui est fonction
de la libido du taureau et de ses capacités à sauter et à introduire le pénis dans le vagin
(érection et intromission).
Les limites de la collecte au vagin artificiel sont les suivantes : -La principale limite est
l’incapacité à collecter les taureaux qui refusent de donner le coup de rein concomitant de
l’éjaculation et nécessaire à la collecte au vagin artificiel : certains taureaux peuvent se
montrer récalcitrants à la collecte au vagin artificiel pour des raisons variables : pathologies
de l’appareil locomoteur, stress provoqué par la présence humaine, manque de docilité, faible
libido. Les taureaux des centres de production de semence sont entraînés et habitués à être
collectés au vagin artificiel. Les taureaux en ferme ne sont pas habitués à la monte en main.
C’est pourquoi la collecte au vagin artificiel en ferme ne peut se faire que sur des taureaux
suffisamment dociles. Elle nécessite également la présence de vaches en chaleur au moment
de la collecte, ce qui entraîne la contention et la manipulation d’animaux supplémentaires.
Une alternative à la méthode de collecte classique au vagin artificiel est l’utilisation d’un
vagin artificiel interne. Le dispositif est constitué d’un cylindre de caoutchouc inséré et fixé

dans le vagin d’une vache en chaleur le jour de la collecte. Après la saillie de la vache ainsi
équipée, le vagin artificiel est retiré et la semence est récupérée pour être analysée. Les
inconvénients principaux sont : le coût élevé lié à l’utilisation de femelles boute en train, la
transmission possible de maladies vénériennes et surtout l’incapacité à collecter certains
taureaux pourtant aptes à reproduire mais qui vont refuser le saut le jour de la collecte.
L’efficacité du vagin artificiel interne a été testée lors d’évaluations de la fonction
reproductrice des taureaux et comparée à une récolte de semence par électro-éjaculateur. 50 à
70% des taureaux en production ont pu être récoltés au vagin artificiel interne, alors que la
semence est obtenue systématiquement lors des collectes à l’électro-éjaculateur. L’avantage
principal est que le vagin artificiel interne permet d’observer la capacité à saillir des taureaux
en même temps qu’il permet d’obtenir un échantillon de semence de l’animal. Des études ont
montré que lors d’évaluations classiques de l’aptitude à la reproduction des taureaux, c'est-à-
dire basées sur l’utilisation d’un électro-éjaculateur ; un taureau sur 5 est déclaré satisfaisant
alors qu’il est en réalité incapable de saillir. L’autre avantage est la sécurité de l’opérateur lors
de la collecte, par rapport à une collecte avec un vagin artificiel classique.
3- Collecte à la main gantée

3-1- Principes de la récolte de semence et matériel utilisé chez le verrat
Chez le verrat, le chevauchement d’un simple mannequin suffit à obtenir l’érection alors que,
chez l’étalon et le bouc, il est nécessaire d’utiliser un animal boute-en-train (à savoir une
femelle en chaleurs ou un mâle castré) ; ainsi l’introduction de femelles est interdite dans les
C.I.A. porcins par la législation. Pour la plupart des espèces domestiques, la méthode la plus
couramment utilisée consiste à obtenir l’éjaculation du mâle dans un vagin artificiel ;
toutefois, chez le verrat, la technique de récolte vise à reproduire le blocage de l’extrémité en
tire-bouchon du pénis dans le col utérin spiralé de la truie en exerçant manuellement une
pression sur l’extrémité du pénis. Cette méthode, proposée par NIWA et al. en 1954, est
reconnue comme étant la plus simple dès les années 60 et couramment utilisée depuis. Enfin
Gènes Diffusion utilise depuis un an le système Collectis, qui assure une contention
mécanique du pénis selon le même principe que la technique de la main gantée et qui permet à
une personne de collecter plusieurs verrats à la fois. La récolte de semence est généralement
effectuée dans une salle de récolte, isolée des autres verrats et constituée de deux parties
distinctes séparées par des barreaux. La partie pour le verrat est équipée d’un mannequin fixe
et d’un sol grillagé anti-dérapant ; celle destinée au manipulateur comporte une petite fenêtre
lui permettant d’atteindre le verrat tout en restant hors de portée et protégé des éventuels
coups de dents, ainsi qu’un sas de liaison (chauffé à37°C) avec le laboratoire permettant un
transfert rapide de la semence récoltée sans variation de température. Cependant, il faut savoir
que certains verrats ne se laissent collecter que dans leur case, ce qui oblige le préleveur à
utiliser un mannequin mobile et à entrer dans la case avec le verrat, ce qui est dangereux.
Le matériel nécessaire à la collecte comprend le mannequin fixé au sol ou mobile et une ou
deux paires de gants en latex, ainsi qu’un récipient de récolte unique et stérile d’une
contenance de 250 mL (c’est-à-dire un pot en plastique recouvert d’une gaze fixée par un
élastique), le tout préalablement réchauffé dans une étuve à 37ºC et placé dans une bouteille
thermos lors de la collecte.

3-2- Technique et rythme de collecte de la semence de verrat
La collecte de semence nécessite patience, discipline et habitude. La technique est
sensiblement la même entre les différentes structures spécialisées en I.A. porcine. On décrira
donc la technique préconisée par MARTIN RILLO, à savoir la collecte de la fraction riche de
l’éjaculat, qui peut être décomposée en plusieurs étapes successives :
- introduire le verrat dans la salle de récolte et le laisser faire pendant 2 à 3 minutes jusqu’à ce
qu’il saute le mannequin ;
- une fois le verrat sur le mannequin, vidanger la bourse préputiale et nettoyer le fourreau avec
du papier ;
- une fois la verge bien extériorisée, la saisir fortement par la main au niveau de l’extrémité en
tire-bouchon en évitant soigneusement que la pointe de la verge soit en contact avec le
gant....serrer fortement mais sans tirer jusqu’à l’érection totale ;
- éventuellement couper au ciseau les poils du fourreau afin d’éviter toute irritation ;
- éliminer les premiers jets puis placer le récipient de récolte le plus droit possible sous la
verge, elle-même maintenue la plus haute et la plus droite possible ;
- ne récolter que la fraction riche, repérable par sa couleur blanchâtre et éliminer la fraction
pauvre de couleur plus claire ainsi que le tapioca (à priori filtré par la gaze) ;
- accompagner l’éjaculation jusqu’à son terme afin de ne pas frustrer le verrat.
Il faut savoir que chaque structure et chaque préleveur au sein des structures ont leur
technique de collecte : c’est ainsi que certains ne vidangent pas le prépuce, que certains
accompagnent l’érection par massage du fourreau, que certains collectent à mains nues, et que
d’autres utilisent deux paires de gants, l’une sur l’autre, l’une pour vidanger le prépuce et
accompagner l’érection, qu’ils ôtent avant de saisir la verge, c’est la technique des deux
gants. Ainsi, parmi les facteurs de variation de la qualité de semence, il faut considérer l’effet
préleveur qui influence surtout la qualité microbiologique de la semence: la semence récoltée
est plus ou moins contaminée selon que le préleveur vidange ou non le prépuce, s’il utilise
une ou deux paires de gants...La récolte de la semence est effectuée selon un rythme
hebdomadaire mais des structures se basent sur la quantité de doses produites par un éjaculat
et préconisent un rythme bihebdomadaire si plus de 25 doses sont fabriquées à partir d’un
éjaculat. D’autres encore recommandent un rythme de 3 collectes en deux semaines sur les
verrats adultes.
La récolte dure en moyenne 4 à 10 minutes selon l’âge du verrat et la fréquence des
prélèvements. Dès que la récolte est terminée, le verrat sera reconduit dans sa loge où un
repas l’attend. Ce sera aussi l’occasion pour lui de s’abreuver et de se reposer.
4- Collecte par massage dorso-abdominal

4-1- Description de la technique
La récolte du sperme de coq nécessite le travail de 2 personnes. Le 1 er opérateur tient les
pattes du coq de sa main gauche. Le 2 e opérateur, assis, reçoit le coq sur ses cuisses et de la
main gauche pratique des massages dorsaux et des manipulations de la queue. De la main
droite, il effectue au besoin des gestes doux de traite dans la région abdominale et cloacale du
coq en évitant de faire apparaître du sang. Au moment de l’éjaculation, un des opérateurs
recueille le sperme. Certains coqs éjaculent par jets saccadés ; chez d’autres le sperme
s’écoule lentement. Des appareillages ont été mis au point pour permettre de collecter le
sperme dans un tube collecteur maintenu à 20-25°C, la température optimale pour la survie
des spermatozoïdes. Des récolteurs jetables de 5 ml ou de 10 ml pour semence aviaire ainsi
que des tubes pour récolteur jetable, des tuyaux flexibles et des mélangeurs de semence sont
commercialisés. Il convient d’éviter de mélanger de l’urine, des fèces ou des sécrétions
annexes au sperme, qui normalement est blanc crémeux, homogène et opaque. Le volume
collecté par coq est de 0,5 à 1,5 ml. 80 à 120 coqs entrainés peuvent être récoltés par heure.
4-2- Fréquence de récolte des coqs

La production de spermatozoïdes est continue et ne peut être stockée qu’en quantité limitée
dans les canaux déférents (de Reviers 1975). Pour utiliser au mieux la production spermatique
des coqs, il faut donc connaître la fréquence d’éjaculation qui permet, pour une période
donnée (par exemple une semaine), d’obtenir le plus grand nombre possible de
spermatozoïdes par mâle. Chez le coq Gallus, cette fréquence est d’une récolte par jour, alors
qu’il faut espacer les collectes de sperme de 3 à 4 jours si l’on souhaite récolter le plus
possible de spermatozoïdes par éjaculat. Dans ce dernier cas, le nombre total de
spermatozoïdes récolté par semaine est deux fois moindre que s’il y a, par exemple, 5 récoltes
de sperme par semaine (11,2 vs 20,3 milliards de spermatozoïdes) et l’on ne récupère dans les
éjaculats que 50 % des spermatozoïdes produits au lieu de 87%.
Comme le nombre de spermatozoïdes à inséminer est fixé par ailleurs, il en résulte que le
nombre de coqs à élever et entretenir pour assurer la reproduction d’un troupeau de poules
peut varier du simple au double suivant la fréquence adoptée pour la récolte du sperme.
Le taux de fécondation atteint l’optimum avec 100 à 200 millions de spermatozoïdes par dose
suivant l’âge des poules mais ne reste élevé que e durant la semaine qui suit l’insémination.
4-3- Collecte du sperme de canards : Récolte avec une cane boute-en-train
Pour la récolte du sperme de canards, l’opérateur présente un tube de récolte (11 cm de long,
3 cm de diamètre) ou une ampoule de verre sous le cloaque juste avant l’intromission en
faisant saillir le pénis en pressant légèrement le dessus du cloaque du mâle. L’utilisation d’une
cane boute-en-train est nécessaire pour la collecte du sperme de canard de Barbarie. Le
volume de sperme collecté est de 0,05 à 1,5 ml chez le canard de Barbarie et de 0,2 à 1,2 ml
chez le canard commun, des valeurs légèrement différentes ayant été indiquées pour les
souches utilisées à Taiwan. Les canards mâles doivent être entraînés à la collecte suivant un
protocole défini. Certains canards ne peuvent pas être collectés. A Taiwan, 60 % des jeunes
mâles pouvaient être collectés après 2 semaines d’entraînement. Des récolteurs jetables pour
canard sont aussi commercialisés.
B- ANALYSE DU SPERME RECOLTE
Les analyses réalisées sur la semence sont macroscopiques et microscopiques. L’examen

macroscopique permet d’évaluer l’aspect de la semence, sa couleur, le pH, l’odeur et le
volume. S’agissant de l’examen microscopique, il permet de déterminer la concentration,
la motilité, la mobilité et la morphologie des spermatozoïdes. L’analyse macroscopique
est réalisée par les organes de sens pour ce qui concerne la couleur, l’odeur et l’aspect .
Le volume de la semence est mesuré par tube gradué et son poids est pris à l’aide d’un
peson. Le pH est déterminé par un pH-mètre. L’analyse microscopique se réalise au moyen
d’un microscope simple ou assisté par un ordinateur. Des moyens plus avancés et plus fiables

sont aussi utilisés pour l’analyse de la semence. Il s'agit du CASA (Computer Assisted Sperm
Analysis) pour la détermination de la concentration, de la motilité, de la mobilité et de la
morphologie et les cytomètres de flux pour l’évaluation de la qualité du sperme.
Volume de l'éjaculat
La mesure du volume de l'éjaculat s'effectue par lecture directe à l'aide des graduations du
tube de collecte. La lecture se fait sans tenir compte de la partie mousseuse de l'éjaculat. Le
volume moyen de l'éjaculat est d'environ 1 à 1,5 ml dans les deux espèces mais varie d'un
éjaculat à l'autre.
Concentration de l'éjaculat
L'objectif de cette mesure est de pouvoir déterminer le nombre de spermatozoïdes par

millilitre de semence pure en utilisant le minimum de semence possible. La concentration
spermatique varie généralement de 2 à 10 x 109 spermatozoïdes par millilitre de semence
éjaculée. Plusieurs possibilités existent pour mesurer cette concentration:
 appréciation visuelle directe de la consistance de l'éjaculat

 comptage exact avec un hématimètre
 mesure de la densité optique dans un spectrophotomètre.
L'appréciation visuelle directe de la concentration spermatique est une technique utilisée par
plusieurs centres d'IA. Cette pratique n'est toutefois pas recommandée en raison de son assez
grande imprécision due à l'appréciation subjective et parce que d'autres techniques précises et
d'emploi facile peuvent être utilisées.
Le comptage exact du nombre de spermatozoïdes dans un hématimètre est une technique

précise si elle est effectuée soigneusement. Le principe de la mesure est le comptage du
nombre exact de cellules spermatiques présentes dans un volume déterminé d'une solution de
dilution connue.
La plupart des hématimètres sont composés de deux grilles (A et B). Chacune est divisée en
16 grands carreaux, eux-mêmes divisés en 16 petits carreaux d'une surface de 1/400 mm2
(1/20 x 1/20 mm). La distance entre la lame et la lamelle étant constante (1/10 mm), le
volume est de 1/4 000 mm3 pour un petit carreau. En comptant 10 grands carreaux par grille,
le volume exploré est de 4/100 mm3 (16x10 x 1/4 000). Si la dilution initiale est de 0,01 ml de
semence pure pour 4 ml de sérum physiologique formolé, soit 1/400, la concentration réelle
de l'éjaculat est la suivante:
Les différentes étapes à suivre pour un comptage à l'hématimètre sont les suivantes:
1. Prélever (précisément) 0,01 ml de semence pure et la diluer dans 4 ml (précisément) de

sérum physiologique formolé (0,9 pour cent de chlorure de sodium; 0,1 pour cent de
formaldéhyde dans de l'eau distillée), puis homogénéiser la solution.

2. Préparer l'hématimètre (figure 43) en pressant fortement la lamelle sur les côtés de la grille,
après avoir nettoyé et séché soigneusement les surfaces concernées. Cette manipulation
permet de faire adhérer la lamelle à l'hématimètre.
3. Avec une pipette Pasteur, rincée au préalable avec la solution contenant les spermatozoïdes,
déposer une petite goutte de solution sans bulle d'air, en bordure de la lamelle. La gouttelette,
par capillarité, se répartit alors entre lame et lamelle.
4. Laisser reposer quelques minutes afin que les spermatozoïdes se déposent sur le fond de la
lame.
5. Placer avec soin l'hématimètre (veiller à le maintenir horizontal) sur la platine du

microscope (équipée d'un mécanisme de précision permettant le déplacement dans deux
directions), sous contraste de phase avec un grossissement de 200. Le champ du microscope
couvre généralement la surface d'un grand carreau.
FIGURE 43: Hématimètre pour compter les spermatozoïdes: (a)matériel (b) mise en
place de la lamelle (c) dépôt d'une goutte de semence diluée

Figure: Comptage des spermatozoïdes dans un hématimètre
6. Compter au moins 10 grands carreaux par grille et trois à quatre grilles par éjaculat. Pour le
comptage des spermatozoïdes, les règles suivantes peuvent être adoptées (figure 44): les
spermatozoïdes nos 1,2, 3, 8, et 9 sont comptés dans le carreau; les spermatozoïdes nos 4 et 6
(«entrants») sont comptés, leur tête touche ou croise une ligne extérieure du carreau; les
spermatozoïdes nos 5 et 7 («sortants») ne sont pas comptés, parce que leur tête est en dehors
des lignes extérieures du carreau. Si un comptage diffère de la moyenne par plus de 10 pour
cent, il est nécessaire de recommencer le comptage. Ne pas omettre de faire varier la mise au
point à chaque lecture pour repérer les spermatozoïdes éventuellement restés en suspension ou
collés sous la lamelle.
FIGURE 45 : Exemple de la relation entre la densité optique et la concentration en

spermatozoïdes de l'éjaculat

Cette technique est la plus précise pour la détermination de la concentration spermatique. Elle
requiert toutefois du temps et de la patience et ne peut donc pas être mise en œuvre dans les
conditions de routine d'un centre d'IA.
L'utilisation d'un spectrophotomètre est la technique la plus efficace car elle allie rapidité et
précision. Le principe général est de mesurer la densité optique (à une longueur d'ondes de
550 manomètres) de la solution saline formolée précédente, contenant les spermatozoïdes, et
de la comparer à un blanc (ne contenant pas de spermatozoïdes). Avant d'utiliser cette
technique dans des conditions de routine, il est nécessaire d'obtenir une courbe standard en
utilisant 20 à 50 échantillons de concentrations différentes et connues en spermatozoïdes,
déterminées au préalable à l'aide de l'hématimètre. La corrélation et la pente de la régression
linéaire sont calculées entre la densité optique de l'échantillon (X) et sa concentration en
spermatozoïdes (Y). Le coefficient de corrélation doit être supérieur à 0,9 et la pente proche
de 1. Alors, un diagramme, ou la même formule de calcul pourront être utilisés dans les
conditions de routine. Un exemple est donné à la figure 45. Chaque année une vérification
(comparant les comptages à l'hématimètre et la densité optique) doit être faite pour prévenir
toute dérive de l'instrument de mesure.
TABLEAU 10 : Détermination de la note de motilité massale de la semence
Note Aspects du mouvement

0 Immobilité totale
1 Mouvements individualisés
2 Mouvements très lents
3 Motilité massale générale de faible amplitude
4 Motilité massale rapide, sans tourbillons
5 Motilité massale rapide, avec tourbillons
Motilité massale
C'est une mesure rapide et facile qui nécessite un examen microscopique de la semence, dès
que celle-ci est collectée. Une goutte de sperme pur est déposée sur une lame et placée sur la
platine chauffante du microscope (37-38°C) sous un grossissement de 80. L'observation doit
être faite très rapidement car la motilité massale du sperme pur, à cette température, diminue
rapidement au bout de 15 à 20 secondes.
La mesure est faite en utilisant une échelle qui va de 0 (aucun mouvement) à cinq
(mouvements forts), ainsi que cela est défini au tableau 10. Un entraînement est nécessaire
avant d'aboutir à une mesure fiable de routine.
Cette technique est suffisamment efficace pour détecter les éjaculats où les spermatozoïdes
sont morts ou sont très peu mobiles; elle est toutefois trop imprécise pour différencier les
éjaculats avec différents pourcentages de spermatozoïdes mobiles ou différentes motilités
individuelles. Ce test peut être utilisé pour des mâles non préalablement sélectionnés.
TABLEAU 11 : Détermination de la note de motilité individuelle des spermatozoïdes
Note Motilité individuelle

0 Pas de déplacement des spermatozoïdes
Déplacement très lent ou pas de déplacement, tremblements du
1
spermatozoïde, oscillations de la queue
Déplacement lent, tremblements, mouvements inorganisés, quelques
2
spermatozoïdes se déplacent plus rapidement
Les spermatozoïdes effectuent des déplacements curvilinéaires sans
3
tremblement
Déplacement rapide, quelques cellules avec une trajectoire rectiligne, d'autres
4
avec une trajectoire courbe
5 Déplacement rectiligne et rapide des spermatozoïdes
Pourcentage de spermatozoïdes mobiles
Cette mesure est réalisée en déposant une goutte de semence diluée entre la lame et la lamelle
et en l'examinant au microscope. Le grossissement est d'environ 200 et la platine chauffante
est à 37-38°C. La dilution de la semence pour une observation correcte doit être comprise
entre 60 et 200 x 106 spermatozoïdes/ml. L'observateur décide, après l'examen successif de
cinq champs d'une même préparation, d'une estimation visuelle du pourcentage de
spermatozoïdes mobiles. Pour un observateur entraîné, cette mesure est assez répétable. Pour
l'apprentissage et l'entraînement régulier, il est nécessaire de comparer cette estimation
visuelle du pourcentage de spermatozoïdes mobiles avec le pourcentage exact de
spermatozoïdes vivants donné par le test de coloration différentielle éosine/ nigrosine. Pour un
opérateur entraîné, la corrélation entre ces deux déterminations est généralement élevée
(>0,90).
Motilité individuelle des spermatozoïdes
L'estimation visuelle de la motilité individuelle des spermatozoïdes est réalisée en même

temps que l'estimation précédente du pourcentage de spermatozoïdes mobiles. Par
conséquent, elle est effectuée dans les mêmes conditions de température et de grossissement.
La mesure est réalisée en utilisant une échelle allant de 0 (aucun mouvement des
spermatozoïdes) à 5 (spermatozoïdes «fléchants» avec un mouvement rectiligne). Cette
estimation doit tenir compte de la vitesse de déplacement des spermatozoïdes, de la rectitude
de celui-ci et de ses mouvements latéraux, comme il est indiqué au tableau 11. Un
entraînement est également nécessaire mais, pour le moment, aucune méthode objective ne
permet d'apporter des corrections. L'entraînement peut se faire en observant, dans différents
échantillons, la diminution de la motilité au cours de tests de thermorésistance.
Les deux tests précédents sont suffisamment précis pour juger ou non si les éjaculats doivent
être écartés sur la base de faibles pourcentages de spermatozoïdes mobiles ou de faible
motilité. Ils sont généralement utilisés pour apprécier la qualité de la semence après
congélation et dégel. Toutefois, même s'ils sont liés à la fertilité de la semence, ils sont
incapables de la prédire avec précision; d'autres tests sont donc nécessaires.
Mesure du pourcentage de spermatozoïdes vivants et des anomalies spermatiques
Ce test, qui utilise un colorant éosine/nigrosine, est efficace pour déterminer le pourcentage
exact de spermatozoïdes morts et celui de spermatozoïdes anormaux. Ainsi que nous l'avons

vu précédemment, le pourcentage de spermatozoïdes anormaux peut changer avec la saison
(ou la photopériode) chez le bélier, et avec les températures ambiantes élevées chez le bélier
et le bouc. Par conséquent, si aucun effet néfaste des températures élevées n'est soupçonné
(dans les climats tempérés par exemple), cette mesure est d'un intérêt limité chez le bouc,
puisque aucune apparition de spermatozoïdes anormaux due à la photopériode n'existe dans
cette espèce.
Chez le bélier, cette période de collecte fréquente de semence peut coïncider avec la
fréquence maximale d'anomalies spermatiques (printemps pour les races saisonnées). Pour
une bonne connaissance de la qualité de la semence, il est utile de déterminer le pourcentage
de spermatozoïdes anormaux dans des échantillons de semence à deux semaines d'intervalle.
La semence des reproducteurs potentiels ne doit pas contenir plus de 20 à 30 pour cent de
spermatozoïdes morts (colorés) et pas plus de 15 à 20 pour cent de spermatozoïdes anormaux,
dans le premier éjaculat d'une série. Ces valeurs diminuent généralement avec le nombre de
collectes:
Eosine (soluble dans

1 g
l'eau)
Nigrosine (soluble dans
2 g
l'eau)
Tri-Citrate de sodium,
3,57 g
5,5 H2O
Eau distillée 100 ml
Préparation du colorant. Le colorant est composé de la manière suivante: après l'obtention

d'une solution homogène, laisser reposer 24 heures, puis filtrer. Mesurer le pH de la solution
et ajuster à environ 6,7-6,8, si nécessaire avec une solution d'acide citrique concentrée. La
pression osmotique de la solution est d'environ 310 milliosmoles. La solution peut être
conservée à+4°C, le. pH étant contrôlé mensuellement.
Coloration de la semence et préparation des lames
 Utiliser une lame correctement nettoyée et séchée sur une platine chauffante à +30°C.
 Sur la partie gauche de la lame, déposer trois gouttes de 10 µ1 de colorant.
 Ajouter une goutte de semence diluée (dilution 1 volume semence + 4 volumes
dilueur; voir ci-après pour la composition des dilueurs) et mélanger avec le colorant
pendant 10 secondes.
 Laisser reposer le mélange pendant 50 secondes.
 Etaler alors le mélange colorant + semence à l'aide d'une lamelle en un film aussi fin et
régulier que possible (figure 46).
 Identifier la lame avec le numéro du mâle et de l'éjaculat.
 Conserver la préparation à sec dans une enceinte sèche (étuve à 30°C) ou dans une
boîte à lame en plastique fermée et étanche, elle-même placée dans un sac en plastique
scellé. Dans ces conditions, la prépa ration peut être conservée durant plusieurs mois
sans altération.
Méthode de comptage des différentes classes de spermatozoïdes. Placer la lame sur la platine
chauffante du microscope (37-38°C pour éviter l'hydratation) et examiner, à la lumière
directe, différents champs de la même préparation, jusqu'à un total d'au moins 150

spermatozoïdes. Cette procédure doit être répétée au moins une fois pour obtenir une mesure
précise. Il est nécessaire de distinguer:
 Les spermatozoïdes colorés: tout spermatozoïde coloré, en totalité ou en partie, en rose

ou en rouge, est considéré comme mort au moment de la coloration. Ce nombre est
utilisé pour le calcul du pourcentage de spermatozoïdes morts/vivants.
FIGURE 46 : Préparation des frottis de semence colorés: (a)mélange des gouttes (b)
étalement du mélange (début) (c)étalement du mélange (fin)

FIGURE 47 Classification des différentes anomalies spermatiques
 Les spermatozoïdes anormaux qui peuvent être répartis en différentes classes (figure
47):
- spermatozoïdes sans queue

spermatozoïdes avec une anomalie au niveau de la tête (acrosome anormal, tête petite ou
-
étroite, tête élargie en forme de poire, etc.)
- spermatozoïdes avec une anomalie au niveau du flagelle
- spermatozoïdes avec une gouttelette cytoplasmique proximale
- spermatozoïdes avec une gouttelette cytoplasmique distale.
Le calcul de ces différents pourcentages permet de classer les animaux et de décider lesquels
seront utilisés pour l'1A. Un examen régulier de la semence de chaque mâle permet la
détection d'anomalies inattendues ou de découvrir qu'un reproducteur a subi des dommages
spermatiques. En effet, les spermatozoïdes subissent très rapidement des altérations en cas
d'infections même très localisées.
Tests de thermorésistance
Les spermatozoïdes ont besoin de plusieurs heures après l'éjaculation ou après l'IA pour
atteindre le lieu de fécondation chez la femelle. Leur pouvoir fécondant est, par conséquent,

en partie lié à leur aptitude à survivre dans le tractus génital femelle. Cette observation a
conduit à l'utilisation de tests de thermorésistance (à la température corporelle de la femelle),
in vitro, pour apprécier la survie des spermatozoïdes. Les conditions d'incubation varient avec
les espèces et avec le type de semence à tester (fraîche, congelée), mais dans les deux espèces,
la semence est généralement rediluée (dans le milieu utilisé pour la dilution finale de la
semence) à une concentration comprise entre 80 et 300 x 106 spermatozoïdes par millilitre, et
placée dans un bain-marie à 37-38°C. Le taux de pourcentage de cellules vivantes et de la
motilité peut être calculé au début du test et deux ou trois heures après, voire plus longtemps.
Pour l'IA avec la semence congelée chez la brebis, celle-ci peut être rediluée dans une
solution hypotonique (250 milliosmoles) de tri-citrate de sodium à pH 8,5 (pH proche de celui
du mucus utérin) et laissée à incuber à 37-38°C pendant trois heures. Les observations sont
alors faites aux temps 0 et +3 heures.
FIGURE 48 : Relation entre le pourcentage de spermatozoïdes anormaux et la fertilité

des brebis inséminées avec de la semence liquide
Dans l'espèce caprine, chez laquelle la semence congelée est généralement utilisée, le test
d'incubation est réalisé sur une partie de l'éjaculat après dégel. Les résultats peuvent être
utilisés pour détecter les éjaculats n'ayant pas supporté correctement la congélation. Après
dégel, la semence est rediluée dans le milieu utilisé pour la congélation (contenant 7 pour cent
de glycérol) et l'incubation réalisée à +37°C pendant deux heures.
Autres tests de qualité de la semence
Beaucoup d'autres tests différents pour apprécier la qualité de la semence ont été décrits dans
la littérature; intégrité de l'acrosome, test GOT (glutamic oxaloacétic transaminase), aptitude
des spermatozoïdes à se déplacer dans différents milieux y compris le mucus cervical. Des
appareils très sophistiqués de mesure de la motilité de la semence ou du pourcentage de
spermatozoïdes vivants, ou encore de paramètres composites de ces, caractéristiques, ont été
décrits dans la littérature. Toutefois, aucun de ces tests n'est utilisé en routine dans une
application commerciale et nous n'en ferons donc pas état ici.

III- DILUTION ET CONSERVATION DE LA SEMENCE
A- DILUTION DU SPERME
1- Chez les ruminants
Chez les ruminants, l’étape préliminaire visant à séparer la fraction spermatique proprement
dite de la fraction constituée des sécrétions des glandes annexes, n’est pas indispensable étant
donné que la semence est constituée pour l’essentiel des sécrétions testiculaires. Le
conditionnement du sperme requiert quelques précautions telles que l’utilisation de récipients
stériles, de produits chimiquement purs, d’eau distillée, l’absence de chocs thermiques et la
mise du sperme à l’abri de l’air et de la lumière.
1-1- Les milieux de dilution
La dilution du sperme a pour but d’accroître le volume total de la masse spermatique,
d’assurer un milieu favorable à la survie des spermatozoïdes in vitro et de réaliser à partir
d’un seul éjaculat l’insémination d’un grand nombre de femelles.
1-1-1- Qualités des milieux de dilution
Les milieux de dilution doivent répondre à un certain nombre de conditions : Leur pression
osmotique doit être isotonique avec le sperme pour l’espèce en cause et être capable de la
maintenir pendant la durée de stockage. Ils doivent renfermer des substances colloïdales
(jaune d’œuf, lipoprotéines, lécithines) susceptibles de protéger les spermatozoïdes. Les
substances tampons permettent de maintenir un pH favorable aux spermatozoïdes (6.2 à 6.8).
Leur présence est plus importante pour le sperme de taureau et de bélier que celui d’étalon et
de verrat étant donné la concentration élevée en spermatozoïdes et donc la glycogénolyse
élevée du sperme de ces deux espèces qui est responsable d’une diminution rapide du pH. Les
substances nutritives sont sensées favoriser le métabolisme, la vitalité et la longévité des
spermatozoïdes. Le milieu de dilution doit être dépourvu d’agents infectieux car ils sont
préjudiciables à la survie des spermatozoïdes, à la fertilisation et au développement de
l’embryon. Ce faisant, les spermatozoïdes se trouveront dans les meilleures conditions pour
remplir leurs 4 fonctions préalables à la fécondation : a. activité métabolique productrice
d’énergie, b. mobilité pour progresser dans les voies génitales femelles, c. enzymes de
protection sur l’acrosome pour en faciliter la pénétration dans l’ovocyte, d. présence de
protéines sur la membrane plasmatique pour assurer leur survie optimale dans le tractus
génital femelle et leur fixation sur la pellucide de l’ovocyte.
1-1-2- Nature des milieux de dilution

Il existe, quelque soit l’espèce animale une grande variété de dilueurs. Ils se différencient par
la nature voire la concentration d’utilisation de leurs composants. On peut ainsi distinguer les
dilueurs à base de jaune d’œuf phosphaté (Milieu de Lardy et Philips) ou citrate (Milieu de
Salisbury), à bases de sucres (glucose, fructose : milieux de Kampschmidt, de Chominat, de
Dimitropoulos, de Foote), à base de glycocolle et de glycérol (milieu de Roy), de CO2 (milieu
de Van Demark ou IVT : Illinois Variable Temperature) ou et plus classiquement maintenant
à base de lait dont certains sont commercialisés (Laiciphos IMT).
Le lait peut être considéré comme un constituant de base apportant aux spermatozoïdes
phosphates, citrates et sucres. Son pH est voisin de celui du sperme. Il est simple à préparer et

peu cher. Le plus utilisé est préparé à partir de poudre de lait écrémé de vache additionné de
cholestérol ou de lécithine, de sels, de glucose, d’acides aminés (glycocolle, tryptophane,
tyrosine) et d’antibiotiques (Laiciphos : IMV).
Le jaune d’œuf est habituellement utilisé à des concentrations comprises chez le taureau
entre 5 et 15 %. Il protège le sperme grâce aux lécithines qu’il renferme de l’effet néfaste des
brusques variations de température. Source de nutriments, il agit aussi favorablement vis à vis
des variations de pH et de pression osmotique. Les antibiotiques s’opposent au
développement des micro-organismes. Classiquement, la pénicilline et la streptomycine sont
employées à la dose respectivement de 1000 UI et d’un mg par ml de dilueur. On se
souviendra que certains antibiotiques peuvent être toxiques pour le spermatozoïde. Ainsi en
est-il de l’oxytetracycline à la dose de 500 mcg/ml, de la chlorotétracycline à la dose de 50
mcg/ml. Dans l’espèce équine, la ticarcilline, l’amikacine la polymixine et la gentamycine ont
également été recommandées. L’emploi du glycérol (agent cryoprotecteur) n’est requis que si
le sperme est destiné à être congelé. Le glycérol fixe une partie de l’eau du dilueur et ce
faisant abaisse le point de congélation du milieu, diminue la quantité de glace à la congélation
et à la décongélation et diminue la taille des cristaux. Il exerce par ailleurs un effet protecteur
sur les membranes cellulaires et limite l’augmentation de la pression osmotique en réduisant
la quantité d’eau qui se transforme en glace.
1-2- Le taux de dilution

Pour le taureau, son calcul est basé sur l’obtention de doses d’insémination renfermant une
concentration en spermatozoïdes zootechniquement acceptable soit 10 à 12 millions de
spermatozoïdes par paillette. Estimant à 40 % les pertes imputables aux processus de
congélation-décongélation, il faut donc obtenir au terme de la dilution une concentration
moyenne de 20 millions de spermatozoïdes par paillette de 0.25 ml. Cette valeur peut être
revue à la baisse ou à la hausse en fonction de la qualité du sperme récolté. Soit la récolte de
10 ml de sperme renfermant 1 milliard de spermatozoïdes par ml. L’objectif étant d’avoir 20
millions de spermatozoïdes par paillette (0.25 ml, 2 mm de diamètre) soit 80 millions de
spermatozoïdes par ml, le coefficient de dilution sera de 1 milliard / 80 millions soit 12.5.
Pour 10 ml de sperme, le volume final sera donc de 125 ml soit l’utilisation de 115 ml de
dilueur. Le nombre de spermatozoïdes par insémination est compris selon les pays entre 10 et
35 millions de spermatozoïdes.
2- Chez les volailles
Chez la poule, le sperme frais se conserve peu de temps à température ordinaire ou à 10-
15°C : 30-45 min pur après la récolte. Il faut donc le diluer très vite si on ne l’utilise pas très
rapidement. Les taux de dilution sont par exemple : 2/3 de sperme, 1/3 de dilueur ou ½
sperme et ½ dilueur (cas du dindon) (Morin, 1976). Le sperme est récolté dans une bouteille
thermos maintenue à 10-15°C (Hafez, 1987). Le temps de conservation peut être un peu
augmenté en diluant et en refroidissant le sperme, souvent entre 2 et 10-15°C (Blesbois,
Seigneurin, 1997). Chez les volailles, le sperme non dilué donne de meilleurs résultats que le
sperme dilué. Exemples de dilueurs :
- le lait entier pasteurisé préconisé par l’Université de Massachussets,

- un liquide de Ringer modifié préconisé par Bonnier et Trulsson à raison de 9 ml pour 1 ml
de sperme : NaCl 68 g KCl 17,33 g CaCl2 2,50 g NaCO3 24,5 g Eau 10 litres (Derivaux,
1958),
- une solution physiologique à 1,025 % tamponnée à pH 7 à 8.
De Reviers (1988) donne la composition de 3 autres dilueurs : ceux de Van Wambeke, 1972,
(avec blanc d’œuf et lait écrémé) de Sexton, 1977 et de Lake et Ravie, 1981. Un milieu de
conservation avicole en ampoules de 4 ml est commercialisé (IMV, s.d. a). Pendant la
conservation du sperme, après la collecte, les pourcentages de spz mobiles et normaux
diminuent alors que la teneur en lipides et la proportion de phospholipides dans les spz
diminuent, indiquant une lyse des lipides. Le nombre de spz par dose de semence fraîche
minimal est de 60 à 100 millions chez la poule. En pratique, Il est de 100 à 150 millions ou
plus. Les doses de semence sont ajustées en général à 100 millions de spz par ml pour les
poules jeunes et 200 voire 300 millions de spz par ml pour les poules âgées, de 45-65
semaines d’âge, souvent à 250 millions de spz par ml.
B- CONSERVATION DU SPERME
1- Conservation à court terme

L’utilisation directe du sperme dilué de taureau suppose une conservation à une température
voisine de 5°C. Celle-ci doit cependant pour éviter les chocs thermiques, être atteinte
progressivement au rythme moyen de refroidissement de 0,5°C par minute entre 37 et 22°C et
de 1°C par minute entre 22 et 5°C. Bien diluée et convenablement refroidie, la semence peut
conserver son pouvoir de fécondation pendant 2 à 3 jours.
2- Conservation à long terme: la congélation du sperme de taureau

La congélation requiert l’utilisation d’agents cryoprotecteurs. Classiquement, le glycérol est
utilisé pour congeler le sperme. Il n’est pas inutile de préciser qu’étant donné les effets
délétères potentiels des agents cryoprotecteurs sur le spermatozoïde, ils doivent être utilisés à
une dilution optimale. Ainsi, à la concentration de 4%, le glycérol offre la plus grande
mobilité massale des spermatozoïdes du verrat mais c’est après congélation dans une solution
à 1 % que les lésions de leurs acrosomes sont les moins nombreuses.
Deux solutions de dilueurs (Laiciphos 10 %, jaune d’œuf 10 %, eau distillée) sont requises.
Elles se distinguent par le fait que la seconde renferme du glycérol à une concentration de 14
%. Le dilueur A est maintenu à 32°C et le dilueur B à 4°C.
2-1- Phase de refroidissement

Le sperme est ajouté à la fraction A en deux temps. Dans un premier temps on mélange une
quantité égale de sperme et de dilueur A. Ce mélange est après 2 à 3 minutes ajouté au reste
du dilueur A. Ce milieu predilué est alors amené progressivement à la température de 4°C
(voir supra). Une fois cette température atteinte, le dilueur B est ajouté au dilueur A en 4
étapes de 15 minutes. Il est important en effet de laisser au glycérol le temps de pénétrer dans
les spermatozoïdes, ce processus étant d’autant plus long qu’il s’effectue à basse température.
L’équilibration prend donc deux heures environ et la dilution finale de glycérol sera de 7 %.

2-2- Conditionnement
Une fois refroidi, le sperme sera conditionné le plus souvent en paillettes voire en ampoules
de verre ou de plastique ou en pellets. Classiquement trois types de paillette sont utilisés. Elles
ont toutes une longueur de 133 mm. La paillette grosse a un diamètre compris entre 3.8 et 4.2
mm et un volume de 1.2 ml. La paillette moyenne a un diamètre compris entre 2.5 et 2.8 mm
et un volume de 0.5 ml. La paillette fine (la plus utilisée) a un diamètre compris entre 1.7 et
2.2 mm et un volume utile de 0.25 ml. Ces paillettes sont constituées d’un cylindre de
chlorure de polyvinyle dont une extrémité est obturée au moyen de deux étoupes de gaze
entourant un bouchon de matière pulvérulente : l’alcool polyvinylique. Ce dispositif servira de
piston lors de l’insémination. L’autre bout est libre et servira au remplissage de la paillette.
Les paillettes sont de couleurs différentes pour en faciliter l’identification. Celle-ci se trouve
complétée par l’impression sur le corps de la paillette du nom du taureau, de son numéro
d’identification, de la date de récolte et de l’identification du centre d’insémination.
Pour leur remplissage, une vingtaine de paillettes sont fixées à un peigne relié à une pompe
d’aspiration. Une fois remplies, une légère agitation des paillettes permettra de ménager une
place pour l’obturation et la bulle d’air nécessaire pour permettre la dilution du sperme lors de
la congélation. Le bouchage s’effectue manuellement ou est plus souvent actuellement
automatisée. Il est réalisé au moyen de poudre d’alcool polyvinylique qui une fois humide se
transforme en gel ou par sertissage.
Une fois le sperme conditionné, les paillettes sont plongées dans de l’eau à 4°C pour
permettre l’action du glycérol (phase de glycerolisation) et des autres constituants du dilueur.
Cette phase contribue également à rendre plus hermétique l’obturation de la paillette.
Les paillettes sont alors disposées sur une rampe de refroidissement en vue de leur
congélation. Elles sont dans un premier temps disposées dans les vapeurs d’azote à quelques
cm au-dessus du niveau d’azote liquide de la cuve. Le refroidissement est obtenu selon une
courbe classique à savoir entre 4°C et -10°C un refroidissement de 4°C par minute et entre -
10°C et -130°C un refroidissement de 40°C par minute. Biologiquement, la phase critique est
celle comprise entre -10°C et -50°C. C’est entre ces températures en effet que se produisent
les phénomènes de cristallisation extra puis intracellulaire et les mouvements d’ions qui en
résultent.
Au bout de 7 à 9 minutes, la congélation est obtenue et les paillettes sont plongées dans
l’azote liquide à -196°C. Il est intéressant de noter que ce type de congélation n’altère en rien
le caractère pathogène de germes tels que Brucella abortus, Campylobacter foetus,
Actinomyces pyogenes ou Listeria monocytogenes.
Les paillettes sont stockées dans des visotubes, cylindres hexagonaux de couleur variable pour
en faciliter le repérage, eux-mêmes placés dans des gobelets plus gros appelés canisters
rangés dans des tanks pouvant contenir plusieurs centaines de litres.
Le transport des paillettes se fera dans des containers cryogéniques ou cuves d’azote dont il
existe différents modèles de capacité et de propriétés thermiques différentes. Une vérification
régulière du niveau d’azote de ces cuves s’impose. Par ailleurs, la température doit toujours y
être inférieure à -120°C. Il est indispensable pour ce faire d’y maintenir un niveau minimal de
5 cm d’azote liquide. L’évaporation sera fonction de la fréquence d’ouverture de la cuve et du
temps nécessaire au choix d’une paillette (5 à 8 secondes).

Chez la poule, la congélation du sperme est souvent préparée à 4°C, après dilution moitié
moitié puis addition d’un cyoprotecteur : glycérol (11 %), bien qu’il soit contraceptif chez la
poule, DMSO (4 %), voire diméthylacétamide. La congélation se fait dans les vapeurs
d’azote, après conditionnement dans des paillettes (refroidissement 40°C par minute), des
ampoules ou en pellets. Le stockage se fait dans l’azote liquide (à – 196°C). Le glycérol était
le meilleur agent protecteur, mais il faut l’enlever avant l’insémination par centrifugation ou
dialyse.
IV- TECHNIQUE DE L’INSEMINATION ARTIFICIELLE
A- LA DECONGELATION
Le réchauffement du sperme de taureau doit être aussi rapide que possible. Classiquement, la
paillette sera tout d’abord secouée pour en faire tomber le reste d’azote liquide puis plongée et
agitée dans de l’eau à 34-37°C (décongélation in vitro). La décongélation s’observe au bout
d’une trentaine de secondes. Pendant ce temps, il est conseillé de frotter le pistolet
d’insémination pour le réchauffer. Cependant, si la température ambiante est inférieure à
20°C, il est préférable de maintenir la paillette dans l’eau de réchauffement jusqu'à son
utilisation pour éviter tout choc thermique au sperme. L’intervalle décongélation-insémination
peut être prolongé jusque 60 minutes, si la paillette peut être maintenue à une température de
35°C. Certains auteurs ont préconisé la décongélation dite in vivo c’est à dire dans le col
utérin lors de l’insémination. Il semble bien en fait qu’en raison des 60 secondes en moyenne
qui s’écoulent entre la charge de la paillette et l’insémination proprement dite, la
décongélation s’opère en fait à la température du pistolet. En l’absence d’eau tiède, on peut
également décongeler la paillette à la bouche. Une fois décongelée secouée et essuyée
(l’exposition du sperme à une goutte d’eau peut induire des lésions cellulaires irréversibles),
la paillette est introduite dans le pistolet d’insémination par son extrémité comportant le
double bouchon (rôle de piston). L’autre extrémité sera coupée perpendiculairement pour
assurer un maximum d’étanchéité avec le bouchon de la gaine d’insémination. Idéalement,
l’insémination de l’animal doit être réalisée dans les 15 minutes suivant la sortie de la paillette
de l’azote liquide. Le pistolet et la gaine d’insémination seront éventuellement recouverts
d’une gaine protectrice en plastique qui sera perforée lors de l’introduction du pistolet dans le
col utérin.
B- L’INSEMINATION PROPREMENT DITE
1- Espèce bovine
Le matériel se compose d’un pistolet d’insémination d’une longueur de 40 à 45 cm et d’un
diamètre de 5 à 6mm comportant un corps externe et un mandrin interne. Il se complète d’une
gaine en matière plastique externe fixée au pistolet d’insémination au moyen d’une petite
rondelle.
Deux méthodes d’insémination peuvent être utilisées chez les bovins.
 La première ou voie vaginale repose sur l’emploi d’un spéculum et d’une source
lumineuse permettant le dépôt du sperme dans la partie postérieure du canal cervical.
Elle est pratiquement abandonnée voire réservée à des cas individuels.

 La seconde ou voie rectale est classiquement utilisée parce que plus rapide et plus
hygiénique mais aussi parce qu’elle offre la possibilité d’un examen préalable du tractus
génital visant à confirmer l’état oestral de l’animal (présence de follicule, tonicité des
cornes...) mais aussi favorable à la libération d’ocytocine et donc à la remontée des
spermatozoïdes à la jonction utéro-tubaire. Le col est saisi manuellement au travers de la paroi
rectale. Sa tension vers l’avant permet d’éviter la formation de replis vaginaux, susceptibles
d’entraver la progression du pistolet d’insémination dans la cavité vaginale. L’introduction de
l’extrémité du pistolet d’insémination dans le col peut être facilitée en plaçant le pouce dans
l’ouverture postérieure du col tout en maintenant ce dernier au moyen de l’index et du majeur.
La traversée du col sera facilitée en imprimant à ce dernier des mouvements latéraux et
verticaux. Une fois le col franchi, le pistolet sera aisément le cas échéant guidé vers l’une ou
l’autre corne. Classiquement, le dépôt de la semence se fait au niveau du corps utérin. Les
auteurs ne sont pas unanimes pour reconnaître le bénéfice d’une insémination dans une voire
les deux cornes utérines. Quelque soit l’endroit anatomique d’insémination, il en résulte un
reflux de sperme vers la cavité vaginale, celui-ci étant moindre si l’insémination a été réalisée
au niveau du corps ou des cornes utérines que si elle a été faite au niveau du col.
Classiquement dans l’espèce bovine, l’insémination artificielle est réalisée 12 heures environ
après le début des chaleurs. Elle obéit ce faisant à la règle classique AM/PM, PM/AM :
chaleurs le matin, insémination le soir, chaleurs le soir, insémination le matin. Des modalités
plus spécifiques peuvent être adoptées si l’insémination fait suite à un traitement hormonal.
En Belgique, l’insémination artificielle est régie par un arrêté ministériel (Art.50 du 7
novembre 1986). Il précise les conditions de l’insémination artificielle privée à savoir que le
détenteur de bétail bovin peut détenir dans son exploitation du sperme acheté en vue de le
mettre en oeuvre lui-même sur son cheptel, ou de la faire mettre en œuvre par un inséminateur
de l’association provinciale d’éleveurs de bétail bovin compétente, aux conditions suivantes :
1. le sperme est fourni par l’association provinciale d’éleveurs de bétail compétente
2. Le détenteur de bétail bovin prend toutes les mesures en vue de la bonne conservation du
sperme.
3. Le sperme ne peut même gratuitement être cédé à des tiers.
4. L’emploi de sperme acheté doit pouvoir être justifié par la tenue d’un relevé journalier des
doses utilisées, le numéro de herd-book du taureau et l’identité de la vache inséminée. Une
copie de ce relevé est transmise mensuellement à l’association provinciale d’éleveur de bétail
bovin compétente.
5. Le contrôle du contenu du conteneur par un fonctionnaire habilité à cette fin doit être
accepté.
2- Espèces ovine et caprine

En Europe, l'insémination artificielle ovine et caprine est essentiellement développée en
France pays où elle a subi une progression constante depuis 1971. En 1995, 773.000 brebis
(10 % de la population) et 57.000 chèvres (6 % de la population) ont été inséminées à partir
de doses produites dans respectivement 16 et 2 centres. Cette méthode de reproduction a
notamment permis d'augmenter la production laitière moyenne des troupeaux caprins de 80
kgs de lait par an (800 kgs vs 720 kgs).

2-1- Particularités anatomiques et physiologiques
L'insémination artificielle présente chez les petits ruminants quelques particularités
anatomiques. Chez la brebis, l'endocol dessine de nombreux replis qui rendent le canal
cervical très sinueux et empêche comme chez les bovins une insémination intra-utérine. Chez
la chèvre par contre, le col s'entrouvrant légèrement pendant les chaleurs, il est possible de le
franchir dans 10 à 30 % des cas. L'insémination par laparoscopie constitue une méthode
alternative mais elle est peu employée. Les espèces caprine et ovine sont essentiellement des
espèces à activité sexuelle saisonnière le plus souvent élevées en troupeaux de grande taille et
donc réparties en lots. L'insémination artificielle ne s'y pratique qu'une fois induites et
synchronisées les chaleurs au moyen d'un progestagène (l'acétate de fluorogestone employé
chez la chèvre et la brebis), d'une prostaglandine (employée uniquement chez la chèvre) et
d'une gonadotrophine, la PMSG (le lecteur consultera avec profit le chapitre relatif à
l'anoestrus chez les petits ruminants).
2-2- Réalisation pratique de l'insémination

L'insémination suppose un minimum de contention individuelle manuelle ou au moyen de
cornadis ou d'une salle de traite. Tout stress sera évité aux animaux. Un local d'attente sera
prévu. La contention en position verticale de l'animal est de nature à faciliter l'intervention.
Dans l'espèce caprine, un examen échographique préalable a été conseillé de manière à écarter
les animaux présentant une pseudo-gestation.
Chez la brebis, la semence est conservée non congelée et conditionnée en paillettes de 0.2 ml
renfermant 400 millions de spermatozoïdes. La durée de conservation à + 15°C n'excède
jamais 10 heures. L'insémination est réalisée en une seule intervention 55 heures après le
retrait de l'éponge pour les adultes et 52 heures après pour les agnelles. Chez la chèvre, les
semences sont également conditionnées en paillettes de 0.2 ml contenant 100 millions de
spermatozoïdes. Une seule insémination est réalisée 43 heures environ après le retrait de
l'éponge pour les chèvres alpines et 45 heures plus tard pour les chèvres Saanen. Plus
rarement, l'insémination est effectuée sur œstrus observé 24 heures après son début.
Une fois sortie du réservoir d'azote liquide, la paillette congelée est plongée dans de l'eau à
37°C pendant 15 secondes puis essuyée et introduite dans le pistolet d'insémination
préalablement réchauffé. L'extrémité de la paillette est coupée et recouverte d'une gaine
protectrice puis bloquée avec un anneau. La paillette de semence fraîche est plongée dans de
l'eau à 4°C (chèvre) ou à 15°C (brebis).
L'arrière-train de l'animal est soulevé et la vulve au besoin nettoyée. Le spéculum est introduit
et le col de couleur rose ou rouge repéré sur le plancher du vagin. L'extrémité du pistolet est
guidée vers le col dans lequel il est introduit le plus loin possible par des mouvements de
rotation. Le sperme est expulsé et le pistolet retiré. Le spéculum est désinfecté entre les
animaux. La réussite de l'insémination tient davantage au choix du moment par rapport à
l'ovulation qu'à une manipulation particulière du col.
L'insémination intra-utérine par endoscopie est surtout utilisée chez les ovins. Elle offre le
double avantage d'augmenter la fertilité lors d'utilisation de sperme congelé et d'utiliser
beaucoup moins de spermatozoïdes (environ 10 fois moins que pour une insémination
exocervicale). Pour ce faire, une mise à jeun préalable de 12 heures est nécessaire. L'animal
est placé en décubitus dorsal et ses 4 membres immobilisés. Après anesthésie locale, deux

ouvertures sont pratiquées dans la paroi de l'abdomen au moyen d'un trocard. Le sperme est
déposé (volume d'une demi-paillette) au moyen d'un pistolet spécial appelé transcap au
sommet de chaque corne utérine. La technique est lourde et ne permet d'inséminer moyennant
un entraînement spécial que 25 brebis à l'heure.
2-3- Résultats potentiels de l'insémination et facteurs de variation de la fertilité

Dans l'espèce ovine, la fertilité est meilleure chez les agnelles que chez les animaux adultes
(70 % vs 57 à 64 %°selon la saison et la spéculation). Sans l'espèce caprine, la fertilité
moyenne est de 64 %. Divers facteurs sont de nature à influencer les résultats potentiels. En
semence fraîche, le taux de fertilité est supérieur pour les béliers âgés de deux ans et plus. Il
existe par ailleurs des différences entre inséminateurs. Chez la chèvre Saanen, la fertilité est
régulièrement inférieure à celle observée dans la race alpine. Semblables différences e n'ont
pas été observées dans l'espèce ovine. Chez les petits ruminants, la répétition des traitements
de synchronisation et surtout l'utilisation répétée de PMSG st de nature à provoquer la
formation d'anticorps et d'être à l'origine d'une diminution de la fertilité. Chez de tels
animaux, il a été recommandé de pratiquer l'insémination respectivement 30 (chèvre) et 36
heures (brebis) après le retrait de l'éponge et de n'inséminer que les femelles réellement en
chaleurs âgées de moins de 5 ans. Toute variation importante des apports en énergie et
protéines seront évités pendant la période embryonnaire.
3- L’IA: un facteur de prophylaxie sanitaire ?
L’insémination artificielle constitue un moyen essentiel de réduction du risque de

transmission des maladies dites vénériennes. Les germes susceptibles d’être transmis par le
sperme et donc indirectement par l’insémination artificielle sont répartis en trois catégories ;
La première rassemble ceux dont le risque est majeur et largement reconnu. La seconde ceux
pour lesquels dans l’état des connaissances on peut dire que le risque est faible. La troisième
comprend les germes ceux pour lesquels on ne dispose que d’informations parcellaires, non
unanimement rapportées en ce qui concerne la possibilité d’un risque et l’autre pour lesquels
on ne dispose d’aucune information circonstanciée. Nous nous limiterons à développer 6
facteurs infectieux parmi les principaux : l’IBR/IPV, le BVD, la brucellose, la
leptospirose, la campylobactériose et la trichomoniase.
Le Bovine herpesvirus-12 (BHV-1) est un pathogène fréquemment rencontré dans le
sperme. Responsable d’infections génitales, d’avortements chez la femelle, il induit chez le
mâle une balanoposthite. Le virus se multiplie chez les animaux infectés ou en phase
d’infection latente au niveau de la muqueuse pénienne et préputiale et contamine le sperme au
cours de l’éjaculation. Cette multiplication et dissémination se rencontre chez des animaux
séropositifs et n’est pas empêchée par la vaccination. Parmi d’autres mesures à prendre, il
conviendrait de n’utiliser dans les centres que des taureaux seronégatifs (double prélèvement
de sang à 21 jours d’intervalle). En cas de séropositivité confirmée par séroneutralisation ou
test Elisa), ou de statut sérologique inconnu, une recherche de virus (cultures cellulaires ou
Polymerase Chain Reaction test) sera entreprise sur deux paillettes au moins provenant d’un
éjaculat. Plus lourd d’application le « Cornell sperm Test » implique la détection d’anticorps
sur des veaux ou des brebis injectés au moyen de pool d’éjaculats.

Le virus de la maladie des muqueuses comporte une souche cytopathogène et une souche
non cytopathogène indifférenciables sérologiquement. La souche non cytopathogène peut
infecter le fœtus et induire la formation de veaux infectés permanents. L’infection d’un
animal par une souche non cytopathogène peut induire des signes cliniques (maladie des
muqueuses) mais augmente le plus souvent sa sensibilité à d’autres infections comme l’IBR,
la Pasteurellose ou la Salmonellose., effet imputé à l’effet immunosuppressif du virus. Le
virus du BVD est excrété dans le sperme lors de maladies. Il est également présent dans le
sperme chez les infectés permanents. Il peut être transmis lors de saillies naturelles ou par
insémination artificielle. De nombreux tests sérologiques (fixation du complément, Elisa, tests
de séroneutralisation) ou d’identification du virus ont été décrits. Un double prélèvement de
sang à 30 jours d’intervalle (recherche du virus) permet d’identifier les taureaux infectés
permanents.
La brucellose se traduit le plus souvent par des avortements. Cette zoonose concernerait
encore 5 % du cheptel bovin mondial. L’identification de la structure lipopolysaccharidique
de la paroi de Brucella abortus a rendu possible la mise au point d’un test Elisa permettant de
distinguer les animaux vaccinés des animaux infectés. Divers tests anciens (séroneutralisation,
agglutination) ou plus récents (PCR, amplification du DNA) sont d’application. Une
confirmation supplémentaire peut être apportée par la recherche de l’organisme dans le
sperme ou d’agglutinines dans le plasma séminal.
La leptospirose est provoquée par un spirochète (L.interrogans) dont on connaît plus de 200
sérovars dont le plus connu est hardjo. Elle se traduit par des signes aigus (septicémie,
hépatite, néphrite) subaigus (néphrite, agalactie) ou chroniques (avortements, infertilité). Le
sérovar hardjo se retrouve dans les vésicules séminales, les testicules et donc le sperme des
taureaux infectés. L’agglutination microscopique est le test sérologique de référence (mise en
contact du serum avec une culture de leptospires et identification de l’agglutination sur fond
noir. C’est une technique délicate. La réaction est considérée comme positive si plus de 50 %
des leptospires sont agglutinés. L’ENV Nantes dispose de l’expérience nécessaire). Il n’est
cependant pas possible à l’heure actuelle de distinguer les animaux infectés des vaccinés. La
vaccination des taureaux de centre n’est donc pas envisageable. Par ailleurs, l’isolement de
leptospires dans le sperme est extrêmement difficile. La méthode PCR a permis d’identifier
dans l’urine des concentrations extrêmement basses en Leptospire (5 à 10 leptospires / ml).
Les leptospires survivent dans le sperme réfrigéré renfermant ou non des antibiotiques ou
congelé sans antibiotique.
La campylobactériose ou vibriose est imputable à Campylobacter fetus venerealis. Cette
bactérie est surtout présente chez les taureaux de plus de 5 ans dont les cryptes épithéliales du
prépuce ou du pénis sont plus profondes et permettent au germe d’y survivre plus aisément.
La maladie se transmet par l’insémination artificielle mais surtout naturelle ; Elle se traduit
par des infections du tractus génital. La persistance de l’infection serait due à des
réarrangements du génôme. L’identification du germe est difficile compte tenu des conditions
microaérobiques de son développement. Elle requiert par ailleurs un milieu de transport
spécifique. La méthode PCR est très sensible et permet d'identifier dans le sperme aussi peu
que 3 Campylobacter par ml. Les taureaux mis en quarantaine seront dans les régions à risque
testés à trois reprises ; Par la suite, une évaluation bisannuelle est conseillée. Le traitement

local et général au moyen de DHS (si encore possible) des animaux infectés ou la vaccination
ont été proposées comme méthodes d’éradication.
La trichomoniase est provoquée par un protozoaire, Tritrichomonas fœtus. L’infertilité,
l’avortement et le pyomètre caractérisent la femelle infectée. Le mâle est un porteur
asymptomatique. Le germe est identifié sur le pénis et les replis preputiaux. Sa prévalence
serait encore élevée en Amérique du Nord dans les troupeaux extensifs. Le germe résiste à la
congélation. Sa transmission par l’insémination artificielle n’a pas été rapportée.
L’identification du germe dans le liquide de lavage du prépuce ou de curetage de la muqueuse
est déterminante. Certains kits renferment un milieu de culture et de transport. L’échantillon
sera examiné à plusieurs reprises pendant trois semaines. Des tests de sonde à DNA ou de
PCR peuvent également être utilisés pour identifier le germe. Les tests ELISA peuvent
identifier les anticorps dans le plasma séminal ou le liquide de lavage préputial. Les taureaux
dans les zones à risque feront l’objet de trois prélèvements pour identifier le germe par culture
et examen direct. Des tests bisannuels seront d’application par la suite. Le germe résiste dans
le sperme frais ou congelé même s’il renferme des antibiotiques.

Chapitre II
LES BIOTECHNOLOGIES DE L’EMBRYON
On appelle biotechnologies de l'embryon l'ensemble des techniques mises au point à partir

des connaissances de base acquises sur le développement de l'embryon. Leur essor est récent
et encore à bien des égards modeste. Elles se sont développées chez les mammifères
domestiques à partir des années 80, d'abord dans l'espèce bovine où la reproduction des
animaux était, depuis déjà trente ans, largement organisée autour de l'insémination artificielle.
Aujourd’hui elles sont également de plus en plus largement appliquées dans d’autres espèces
telles la brebis, la chèvre et la jument.
Il est classique de distinguer trois générations de biotechnologies de l’embryon :
- La première génération a permis de produire des embryons in utero après
stimulation hormonale des femelles donneuses (superovulation). Ce mode de production a
permis le développement de la technologie du transfert d'embryons associée à leur
congélation. Deux facteurs en limitent cependant l’application : le nombre relativement faible
d'embryons que l'on obtient après un traitement hormonal de superovulation et la variabilité
de production entre femelles traitées. En effet, aucun progrès décisif n'a été réalisé depuis plus
de vingt ans dans ce domaine. Une femelle donneuse donne en moyenne 7 à 8 embryons par
traitement, mais seulement 5 à 6 d'entre eux (embryons de qualité 1 et 2) ont de réelles
chances de se développer à terme après transfert. En outre, 20 à 30 % des femelles traitées ne
donnent pas d'embryons transférables, alors que 25 % produisent plus de 6 embryons ce qui
limite les possibilités de planification rigoureuse du nombre de femelles receveuses. Il en
résulte un coût technique environ 2 fois plus élevé que celui de l'insémination artificielle. En
effet en supposant la récolte de 5 embryons par traitement de superovulation, les frais
inhérents à la technique seraient de 2500 F pour le traitement, 1000 F pour l’insémination,
5500 F pour la récolte, 2500 F par embryon supplémentaire (> 5 ) obtenu et 3000 F pour la
congélation des embryons soit un total de 14500 F c’est à-dire 2500 F par embryon produit.
- Plus récemment, une deuxième génération de technologies est apparue qui
s'appuie sur la production d'embryons en culture, après maturation et fécondation in
vitro d'ovocytes prélevés sur l'animal vivant ou après abattage (FIVETE : Fécondation
in vitro et transfert d’embryons, OPU : Ovum Pick Up).
- Les progrès de nos connaissances sur la physiologie de l’embryon de mammifère
permettent maintenant l'émergence d'une troisième génération de techniques. Celles-ci
tirent parti de l'extraordinaire plasticité des premiers stades de l’embryogenèse et visent à
modifier encore plus en avant les caractéristiques de l'embryon: le transfert nucléaire qui
aboutit à la production de clones, et la transgénèse qui consiste à introduire un gène
étranger dans les cellules de l'embryon en sont les illustrations. A ces techniques viennent
s’ajouter le sexage de l’embryon, sa congélation ou encore l’ICSI (Intra Cytoplasmic
Spermatozoa Injection).

I- LA PREMIERE GENERATION : TRANSPLANTATION D’EMBRYONS
(TE) OU L’OVULATION MULTIPLE AVEC TRANSFERT D’EMBRYONS
(MOET)
Le transfert d'embryons est utilisé en pratique dans les élevages depuis le début des années 80.
Cette technologie a pu voir le jour grâce aux connaissances accumulées sur la physiologie de
la reproduction des mammifères domestiques, notamment à partir des progrès décisifs obtenus
avec le contrôle hormonal de la croissance folliculaire et celui du moment de l'ovulation. Le
transfert d'embryons, qui s'est d'abord développé par transposition des méthodes chirurgicales
proposées par la recherche vétérinaire, n'est véritablement devenu une pratique d'élevage
qu'avec la mise au point d'une méthode de transplantation adaptée de l'insémination
artificielle, consistant à déposer l'embryon au-delà du col de l'utérus, par voie vaginale. Le
nombre de transplantations d'embryons connaît ces dernières années une progression régulière
en Europe et en France mais ce nombre reste très faible par rapport à celui des inséminations
artificielles. En 1998, à l'échelle mondiale, 440 000 transplantations d'embryons ont été
enregistrées pour les bovins, 17 000 pour les moutons, 1 200 pour les chèvres et 2 500 pour
les chevaux. Quatre-vingt pour cent environ des taureaux utilisés pour l'insémination
artificielle sont obtenus grâce à la transplantation d'embryons. Toutefois, ce n'est pas tant le
nombre de transplantations effectuées qui donne aujourd'hui son importance que la place
qu'elle occupe désormais dans la filière de la sélection bovine: près de 95 % des taureaux
laitiers actuellement mis en testage sont en effet issus d'embryons transplantés (le plus
souvent congelés). Ce chiffre illustre bien l'impact de cette biotechnologie dans la conduite
des programmes de sélection.
La transplantation d'embryons est maintenant étroitement associée à la congélation, le plus
souvent au stade blastocyste, par des méthodes compatibles avec une décongélation réalisée
juste avant la transplantation. La congélation a permis une réduction du coût des interventions
puisque le nombre de femelles receveuses qu'il faut préparer peut être ajusté au nombre
d'embryons collectés. Elle a ouvert la voie aux échanges d'embryons entre élevages (de tous
pays) et commence à être utilisée en complément du maintien d'animaux vivants pour
conserver la diversité génétique des races domestiques.
Le typage génétique des embryons avant leur transplantation peut également être réalisé en
prélevant par micromanipulation 1 à 4 cellules sur des embryons au stade morula ou jeune
blastocyste (J6 et J7). Le diagnostic du sexe peut être posé pour 95 % des embryons biopsiés
et son exactitude est voisine de 100 %. Cependant, malgré l'engouement qu'a suscité en
France le diagnostic de sexe appliqué ces dernières années à plus de 3 000 embryons bovins,
son intérêt économique reste très marginal.
A- La superovulation
La méthode dite MOET (Multiple Ovulation and Embryo Transfer) implique le traitement
des animaux avec des hormones gonadotrophiques (PMSG, FSH). Ces traitements de
superovulation ont ainsi permis d’augmenter de 1 à 10 le nombre d’ovules libérés par cycle.
Répétable en moyenne cinq fois par an et par vache, cette procédure n’est cependant pas

exempte d’inconvénients puisqu’en effet, elle allonge de deux mois environ le délai
nécessaire à l’obtention d’une gestation et peut s’accompagner, surtout si elle est répétée chez
le même animal, de réactions iatrogènes ou de kystes ovariens voire d’infections utérines.
1- Critères de choix de la donneuse

Habituellement, l’éleveur choisit une génisse ou une vache de haute production laitière ou de
bonne conformation viandeuse. Il convient d’en analyser les performances de fertilité et de
fécondité. De même, il s’avère indispensable d’identifier la présence éventuelle de lésions du
tractus génital. L’animal superovulé aura autant que faire se peut accoucher normalement,
n’aura pas présenté de complications puerpérales ou du post-partum telles qu’une rétention
placentaire, une infection utérine, une fièvre vitulaire ou de l’acétonémie. Il aura accouché
depuis 60 voire 90 jours au moins et sera en phase de bilan énergétique positif. Il aura
manifesté deux ou trois chaleurs à intervalles réguliers. A l’exploration manuelle, le col et les
cornes utérines seront de diamètre normal (< 5 cm). Un corps jaune sera présent sur l’ovaire.
L’examen vaginal au moyen d’un spéculum éliminera la possibilité d’une infection utérine ou
d’un urovagin. Certains examens complémentaires (tests de perméabilité tubaire, examen
échographique) seront le cas échéant effectués. Les traitements antiparasitaires et vaccinations
auront été effectués 30 jours au moins avant le traitement de superovulation.
2- Les traitements de superovulation

2.1- Nature des traitements hormonaux
2.1.1 La gonadolibérine (GnRH)
La GnRH s’est révélée inefficace pour provoquer une superovulation. Cependant, elle peut
être utilisée en association à d’autres schémas de superovulation. En effet, certains échecs
d'ovulation et de fécondation chez les animaux donneurs d'embryons ont été imputés à une
absence de libération ou à une libération anormale de l'hormone LH lors de l'œstrus
suivant un traitement de superovulation à base de PMSG. Cette situation est de nature à
entraîner une plus grande disparité dans les ovulations observées lors de superovulation
respectivement dans 45 et 91 % des cas au cours des 24 et 48 heures suivant le début de
l'œstrus. Aussi, le recours à des traitements de synchronisation des ovulations tels que
l'hormone LH, l'hCG ou la GnRH a-t-il été envisagé pour pallier à certains échecs de
traitements de superovulation. Les résultats obtenus après injection de la GnRH en phase
œstrale ou 48 à 52 heures après l'injection d'une prostaglandine sont contradictoires. Alors que
certains auteurs observent l'effet bénéfique de son injection après un traitement de
superovulation à base de PMSG ou de FSHp, d'autres au contraire remettent en question
l'opportunité d'un tel traitement, constatant même dans certains cas un effet négatif de la
GnRH sur le pourcentage d'ovocytes fécondés et d'embryons transférables.
Les échecs observés ont été imputés à un manque de sensibilité de l'hypophyse chez certains
animaux traités à la PMSG. Le cortisol, la prolactine et la PMSG n'en seraient pas
responsables. L'hypothèse du rôle d'un facteur inhibiteur de la libération de l'hormone LH a
été proposée chez la truie.
a- La Pregnant Mare Serum Gonadotrophin
La PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotrophin) extraite du sérum de jument gravide entre
le 42ème et le 100ème jour de gestation possède une activité biologique correspondant

classiquement à un mélange de 2/3 de FSH et de 1/3 de LH. Ce rapport dépend du stade de
gestation de la jument. La concentration de la PMSG est maximale dans l’organisme 15 à 32
heures après son injection. La PMSG est douée d’une double activité à la fois de type FSH et
LH avec un rapport constant FSH/LH égal à 0.2. Elle est injectée par voie IM à une dose
comprise entre 2.000 et 3.000 UI. La réponse au traitement augmente avec la dose injectée.
De même, on observe une augmentation du risque d’anovulations et d’embryons de moins
bonne qualité avec la dose administrée. La race Jersey est plus sensible que la Charolaise qui
l’est davantage que la Pie-Noire.
La PMSG a une demi-vie particulièrement longue (120 heures) imputable à sa richesse en
acide sialique (13 %) qui la protège de la dégradation hépatique et rénale. Aussi est-il
indispensable de lui adjoindre l’injection de 1800 UI d’anticorps anti-PMSG (obtenus sur
moutons) au moment des chaleurs. Ces anticorps ont pour objet d’inhiber l’action de la PMSG
et ce faisant le développement d’une seconde vague de croissance folliculaire et d’éviter la
formation de follicules kystiques. La répétition des injections de PMSG à 1 voire deux mois
d’intervalle est susceptible de réduire l’efficacité du traitement étant donné la réaction
antigénique possible.
b- La Human Menopausal Gonadotrophin
L’hMG (Human Menopausal Gonadotrophin) fournit des résultats comparables à ceux de la
PMSG mais son coût est plus élevé.
c- Les extraits hypophysaires
Les extraits hypophysaires (d’origine porcine le plus souvent, pFSH, mais aussi bovine,
bFSH, ou ovine : la FSH bovine est moins active que la FSH porcine) sont de plus en plus
largement utilisés. Possédant une demi-vie plus courte (5 à 6 heures) que la PMSG, étant
donné leur moindre richesse en acide sialique (5 %) ils doivent faire l’objet d’injections
répétées. Leur concentration atteint une valeur maximale 3 heures après leur injection et ne
sont plus décelables 12 heures après l’injection. Leur utilisation répétée n’entraîne pas la
formation d’anticorps contrairement à la PMSG. La société Mérial (Bd Sylvain Dupuis 143
1070 Bruxelles) commercialise le Stimufol. Ce produit contient 500 mcg de FSH porcine et
100 mcg de LH porcine. Il est fabriqué par le laboratoire de Physiologie de la Reproduction
de la Faculté de Médecine Vétérinaire. Les doses sont comprises entre 32 et 50 UA (Unité
Armour) administrées de manière fractionnée et décroissante en doses bijournalières (matin et
soir) pendant 4 jours, la dose de 32 UA (6 UA, 5 UA, 3 UA, 2 UA) étant le plus souvent
recommandée chez la vache laitière et celle de 40 UA chez la vache viandeuse. Les doses de
FSH sont exprimées en mcg Armour : une unité Armour est équivalente à 10 mcg de FSH
pure. Les FSH sont présentées sous forme lyophilisées et reconditionnées avant l’emploi au
moyen de sérum physiologique. Une fois les dilutions réalisées, les flacons préparés sont
congelés. La FSH décongelée se conserve sans dommage au réfrigérateur (4°C) pendant le
traitement. Une fois décongelée, la solution ne peut être recongelée. Comme la BST, la FSH
compte tenu de sa dégradation rapide dans l’intestin de l’homme ne présente aucun risque
pour la santé humaine. La FDA américaine ne préconise aucun délai de retrait de lait ou
d’abattage des animaux ainsi traités.
2.1.2. Schéma des traitements inducteurs

 Chaleur de référence

Un traitement de superovulation peut être mis en place lors du pro œstrus c’est-à-dire vers le
16ème voire 17ème jour du cycle. Cependant étant donné la difficulté de prévoir le moment
exact de retour en chaleurs de l’animal, il est plus aisé de mettre en place le traitement de
superovulation 9 à 15 jours après une chaleur dite de référence, que celle-ci ait été observée
par l’éleveur ou induite par un traitement dit de pré-synchronisation au moyen d'une ou mieux
de deux prostaglandines à 14 jours d’intervalle. Une solution alternative consiste chez les
femelles non cyclées à réaliser un traitement de superovulation au cours de la phase
d’induction d’une chaleur au moyen d’un progestagène (spirale ou implant). Le recours à ce
traitement de pré-synchronisation au moyen de prostaglandines serait davantage appliqué
chez les animaux de race à viande que laitière. Par ailleurs, le nombre d’embryons totaux et
transférables obtenus est comparable après une chaleur de référence dite naturelle ou induite
(9.9 vs 10.4 et 5.1 vs 5.2).
 Chaleur de « superovulation »
Celle-ci sera le plus souvent obtenue par l’injection unique ou répétée (2 voire 3 injections)
d’une prostaglandine naturelle ou synthétique 48 heures en général après le début du
traitement au moyen de PMSG ou de pFSH. En général, les doses de prostaglandines sont
doublées par rapport aux doses recommandées par le fabricant. En terme de résultats, il ne
semble pas y avoir de différences entre les prostaglandines naturelles et de synthèse. La voie
IM est la voie la plus couramment utilisée. Seule le fenprostalène est utilisée en injection
sous-cutanée. La voie IV permet l’obtention de résultats équivalents à la voie IM. La voie
intravulvaire en sous-muqueux n’a pas été évaluée dans le cadre de la superovulation. Des
injections répétées ont été préconisées pour compenser la demi-vie courte de certains
analogues et optimiser la chute de la progestéronémie et donc secondairement la croissance
folliculaire. Ainsi des injections répétées (2 voire 3) ont-elles été conseillées en ce qui
concerne le dinoprost. Une chaleur de superovulation peut également être obtenue par le
retrait d’un corps jaune artificiel (implants ou spirales vaginales. Ces traitements sont
généralement associés à une voire deux injections de prostaglandines pour permettre la lyse
du corps jaune naturel éventuellement en place ou en développement lors du traitement au
moyen du progestagène. Selon ce schéma, l’implant ou la spirale peuvent être mis en place
quelque soit le moment du cycle éventuellement présent. Il n’est donc pas nécessaire dans ce
cas de tenir compte d’une chaleur dite de « référence ». L’implant de norgestomet est laissé en
place pendant 9 à 10 jours et la spirale pendant 7 à 12 jours. Le traitement de superovulation
débute entre le 4ème et le 7ème jour suivant le début du traitement par un progestagène. En
cas de recours à la PMSG, l’injection de PGF2a est réalisée en même temps que l’injection de
PMSG soit 48 heures avant le retrait du progestagène. Si le traitement de superovulation
utilise de la FSH, l’injection de PGF2a est réalisée à la troisième injection ou plus souvent à la
5ème injection de FSH soit 12 à 48 heures avant l’arrêt du traitement par le progestagène. En
cas d’injection répétée de PGF2a, les injections sont réalisées simultanément à la 5ème et
6ème injection ou à la 7ème et 8ème injection de FSH (Références In Ponsard et Humblot In
Livre des prostaglandines 2002). Les doses totales de PGF2a injectées sont respectivement de
0.5 mg à 1 mg de cloprostenol, de 22.5 mg de dinoprost ou de 15 mg de luprostiol. Une autre
alternative a été plus récemment décrite. Elle consiste en un traitement dit court mis en place
entre le 7ème et le 11ème jour suivant la chaleur de « référence », et laissé pendant 5 jours. Le
traitement de superovulation débuterait 1 à 3 jours après le début du traitement au moyen du

progestagène de manière à arrêter le traitement du progestagène à la 6ème voire 7ème
injection de FSH. Il semblerait que l’efficacité des traitements inducteurs à base de
progestagènes soit plus grande quand le cas échéant, ils sont initiés entre le 6ème et le 9ème
jour du cycle qu’entre le 1er et le 3ème ou entre le 14ème et le 16ème jour du cycle.
L’augmentation du nombre d’injection de PGF2a ou de leur dose totale ne semblerait pas
exercer un effet déterminant sur la qualité des résultats. En ce qui concerne le timing de
l’insémination, une double insémination doit être réalisée respectivement 12 et 24 heures
après le début de l’oestrus. Si elles sont pratiquées de manière systématique, on
recommandera d’inséminer 36 et 48 heures après le retrait du progestagène si la PGF2 est
injectée 48 heures avant le retrait et 48 et 60 heures ou 56 et 72 heures après le retrait si
l’intervalle entre le PGF2 et le retrait est de 12 heures.
 Chaleur de «récolte »
Après une récolte d’embryons, il est indispensable de s’assurer de la lyse des corps jaunes
induits pour éviter une gestation gémellaire et induire aussi rapidement que possible le retour
à une cyclicité normale. En l’absence d’injection d’une prostaglandine et de gestation, le cycle
suivant a une durée comprise entre 22 et plus de 30 jours. Ce délai dépend du nombre de
corps jaunes présents et donc indirectement de l’importance du rétrocontrôle négatif exercé
sur l’hormone LH par la progestérone endogène. Deux stratégies sont possibles. La première
consiste à injecter une PGF2a le jour de la récolte. La seconde est de différer cette injection
d’une semaine ou deux. Dans l’un et l’autre cas on observe une augmentation de l’intervalle
entre l’injection et l’oestrus (4,3 à 8,8 jours et parfois plus de 11 jours). Ce retard est
imputable à un nombre de petits follicules (< 5 mm) plus réduits lors de l’injection,
phénomène résultant d’une progestéronémie élevée. Ni la dose injectée ni le nombre
d’injections ne semblent influencer les résultats. Le cycle faisant suite à cette chaleur de «
récolte » ayant une durée normale, il peut être utilisé pour induire un nouveau traitement de
superovulation.
2.2. Conséquences d’un traitement de superovulation

2.2.1. Nombre d’embryons produits
L'objectif d'une stimulation ovarienne est d'obtenir un maximum d'embryons transférables. On
estime d’une manière générale que 85 % des donneuses répondent à un traitement de
superovulation c’est-àdire présentent plus de deux corps jaunes. 75 % présentent plus de 4
corps jaunes et 65 % en ont plus de 5. Le nombre de corps jaunes peut aisément être estimé
après abattage de l’animal. Par endoscopie, la corrélation est de 0.89 et de 0.6 quand le
diagnostic est réalisé par palpation manuelle des ovaires. On estime à 7.8 le nombre total
moyen d’embryons produits après superovulation. Le nombre moyen d’embryons
transférables est de 5.6 soit 72 %, 71 % étant de qualité 1 et 29 % de qualité 2.
Parmi d'autres, la réponse variable (0 à 40 ovulations) et peu prédictible des animaux à un
traitement de superovulation constitue encore à l'heure actuelle un des facteurs limitants de la
méthode. Une récolte sur 3 ne produit aucun embryon transférable et 70 % des embryons
transférés proviennent de 30 % des récoltes réalisées. Semblables résultats ont été observés
chez la vache laitière. Selon certains auteurs, 70 % de la variation des réponses observées
peuvent être imputées à des facteurs intrinsèques liés au statut ovarien de l'animal ou à la
nature et au rythme d'injection des substances utilisées. Les causes peuvent en être trouvées

d'une part dans les effets du traitement de superovulation sur la croissance folliculaire ou
d'autre part, dans le manque de synchronisme entre le début du traitement de superovulation
et le statut ovarien susceptible d'interférer avec un recrutement folliculaire optimal.
2.2.2. Caractéristiques morphologiques et hormonales du follicule

L'effet des traitements de superovulation sur la morphologie et la physiologie hormonale des
follicules a fait l'objet de plusieurs recherches dans l'espèce ovine. Ainsi, chez certaines races
de brebis connues pour leur prolificité (Booroola, Romanov et Finn), l'augmentation du taux
d'ovulation est habituellement associée à des altérations morphologiques et fonctionnelles des
follicules ovulatoires: la taille des follicules est diminuée de 20 à 50 %, le nombre de cellules
de la granuleuse est réduit de 30 %, la concentration en oestrogènes et en inhibine des
follicules est réduite respectivement de 30 et 50 %. De même, l'administration de PMSG ou
de pFSH induit une réduction de la taille des follicules ovulatoires.
B- La récolte des embryons

1- Matériel
Il se composera des éléments suivants :
Sondes dilatatrice : d’une longueur de 60° cm, possédant une extrémité conique de 4 mm au
sommet et de 7 mm à la base, elle permet de préparer le cas échéant le col à la pénétration de
la sonde de récolte.
Sonde de récolte : deux types sont disponibles. La première à trois voies est la sonde IMV
(Cassou). Elle assure un circuit continu du milieu de collecte. Une voie permet de gonfler le
ballonnet. Une autre permet d’injecter le liquide de récolte et la troisième assure la
récupération du liquide injecté dans la corne. Cette sonde se compose d’un corps rigide de 56
cm de long et de 6 mm de diamètre. Il est muni d’un bouchon d’étanchéité postérieur et d’un
ballonnet en caoutchouc à son extrémité antérieure. Le tuyau de récupération a une longueur
de 160 cm et un diamètre de 3 mm. Il est muni à son extrémité d’une bille métallique destinée
à en faciliter la progression dans la corne utérine. Il présente à son extrémité proximale des
graduations qui permettent de juger du degré de pénétration dans la corne utérine. Il est percé
dans sa partie terminale d’orifices. La seconde sonde est à deux voies (sonde de Han ; modèle
allemand). Une voie permet de gonfler le ballonnet, tandis que la seconde permet d’injecter et
de récupérer en alternance le liquide de récolte des embryons. La sonde a une longueur de 70
cm et un diamètre de 6 à 7 mm. Elle est munie d’un mandrin interne pour la rendre plus rigide
et faciliter ainsi sa mise en place dans l’utérus.
- Seringues : l’une de 20 ml pour gonfler le ballonnet et l’autre de 50 ml pour injecter le
liquide de récolte.
- Liquides de récolte : Il faut prévoir par récolte 1 litre environ (250 à 500 ml par corne
utérine) de PBS (Phosphate Buffered Saline). Certains auteurs utilisent une solution de
Bovine Serum Albumine (BSA) à 0.4 % ou du PBS additionné de sérum de veau fœtal (FCS)
à 2%. Ces liquides seront placés dans un flacon stérile et maintenu à température de 37 °C.
2- Méthodologie
2.1- Méthode chirurgicale

Initialement, la récolte des embryons se faisait par voie chirurgicale sous anesthésie générale
le plus souvent au niveau de la ligne blanche en avant du pis. Une fois l’utérus extériorisé, une
incision d’un cm de long était pratiquée à la base de la corne utérine pour permettre
l’introduction d’un cathéter à deux voies (sonde de Folley). Le ballonnet était ensuite gonflé.
Le liquide de récolte était injecté au moyen d’une seringue et d’une aiguille à bout mousse au
sommet de la corne utérine et récupéré par l’orifice situé à la base du ballonnet. Après récolte,
le ballonnet était dégonflé, l’utérus suturé et on procédait de la même manière pour l’autre
corne utérine. Cette technique offrait l’avantage d’un taux de récupération élevé des embryons
(70 à 80 %), de pouvoir juger de la réponse ovarienne au traitement de superovulation. Elle
fut pratiquement abandonnée étant donné l’infrastructure de mise en place requise mais aussi
la difficulté de répéter souvent l’intervention sur le même animal.
2.2- Méthode non chirurgicale ou collecte transcervicale

2.2.1- Principes de base (sonde de Cassou à trois voies)
- L’animal placé dans un travail de contention pour en limiter les déplacements est
éventuellement prémédité au moyen d’un tranquillisant (animaux rétifs mais risque de
décubitus), d’une épidurale (3ml de xylocaïne à 2 % : manipulation plus aisée du tractus
génital mais risque accru de pneumo-rectum, à éviter si l’utérus est abdominal) et d’un
spasmolytique (Buscopan 20 mg en IV). - Le rectum est débarrassé des matières fécales et la
région vulvaire convenablement lavée et désinfectée.
- La dilatation mécanique préalable du col ne s’avère habituellement nécessaire que chez la
génisse. Il convient dans un premier temps d’insérer le dilatateur dans un anneau cervical et
de maintenir une pression constante mais contrôlée. Le plus souvent, la résistance s’efface
brutalement une fois le 3ème anneau franchi. - Le flacon de récupération sera placé en
contrebas de l’utérus pour favoriser la récolte du liquide de perfusion.
- La sonde de récolte sera préalablement rincée au moyen de sérum physiologique.
Recouverte d’une chemise sanitaire, elle est introduite dans le vagin en en longeant le plafond
pour éviter le méat urinaire. Une fois arrivée au col, la chemise sanitaire sera rompue. Le col
est alors manuellement ramené vers l’arrière et vient coiffer l’extrémité de la sonde. La
progression de la sonde dans le col est assurée en prenant le col en avant de la sonde et en le
manipulant de bas en haut et de gauche à droite. Une fois le col franchi, la sonde est alors
introduite dans l’une ou l’autre corne (respecter autant que faire se peut le même choix pour
éviter de perfuser deux fois la même corne ...). La corne est alignée sur la sonde en la prenant
par en-dessous et en la faisant progressivement glisser sur la sonde.
- Le ballonnet sera placé trois travers de doigts environ en avant de la bifurcation des cornes.
Parce qu’elle réduit le volume mort de liquide dans la corne, une position plus antérieure du
ballonnet est de nature à améliorer la qualité de la récolte. Le gonflement du ballonnet a pour
but de fixer la sonde dans la lumière de la corne et d’éviter que le liquide de perfusion ne
reflue vers l’arrière. Un ballonnet trop gonflé risque d’endommager la muqueuse utérine et
d’entraîner la présence de sang dans le liquide de récolte. Le volume d’aire nécessaire sera de
10 à 12 cm3 pour une génisse et de 14 à 18 cm3 pour une vache.
- Une fois le ballonnet en place, il convient de dévisser le bouchon étanche en arrière du corps
de sonde pour permettre la progression du flexible. En général, la corne utérine forme un
coude juste en avant du ballonnet. Il conviendra donc de la relever légèrement pour y faciliter

la progression du flexible. Celui-ci sera introduit jusqu'à l’obtention d’une résistance signant
la position de la bille terminale au niveau de la région utéro-tubaire soit après 30 à 40 cm chez
une génisse et 40 à 50 cm chez une vache. Une fois le flexible positionné, le bouchon
proximal sera revissé.
- 20 à 30 ml de liquide de perfusion seront injectés avant d’ouvrir la voie de retour.
Normalement, le liquide commence à s’écouler instantanément. L’aide ajustera le débit
d’injection de manière à maintenir en permanence 30 à 50 ml de liquide dans la corne. Une
surpression risque de faire reculer le ballonnet ou de créer une lésion de l’oviducte.
Inversement, si l’injection est trop lente, la corne risque de se vider et d’aspirer la muqueuse
utérine contre les orifices du flexible. L’arrêt du retour est souvent observé lors du
changement de seringue. Pendant la perfusion (200 ml par corne), l’opérateur agite et déplie
la corne utérine tout en évitant de la manipuler pendant les phases de contractions du rectum.
- Une fois la corne perfusée, on injectera dans la sonde un volume d’air suffisant pour en
chasser le liquide et être ce faisant sur de récupérer l’entièreté des embryons. Il faut ensuite
dévisser le bouchon d’étanchéité et ramener le flexible tout en continuant de récupérer le
liquide. Une fois le flexible retiré, on obture la voie de retour et on dégonfle le ballonnet. Le
corps de sonde est retiré de manière à éviter e voile intercornual avant d’introduire la sonde
dans l’autre corne.
- L’intervention sera complétée par l’instillation d’une solution d’antibiotiques dans l’utérus
et l’injection d’une prostaglandine pour éviter le développement d’une gestation multiple qui
s’accompagne fréquemment d’avortement.
2.2.2- Quelques difficultés pratiques

- Si l’utérus est trop plongeant, la surélévation du train antérieur de l’animal est de nature à
faciliter la manipulation des cornes. Le cas échéant la traction sur un fil passé au moyen d’une
aiguille courbe dans l’exocol permet de maintenir l’utérus en position plus postérieure.
- Si le flexible ne sort pas du corps de sonde, c’est que la corne est peut-être insuffisamment
relevée. S’il bute après 10 à 20 cm, c’est que l’extrémité de la corne n’est pas assez dépliée.
- L’absence du retour de liquide ou un retour en goutte à goutte peut être imputé à une
position trop antérieure du flexible, à son enroulement dans la corne ou à l’obturation de ses
orifices par de la fibrine ou du mucus. Le cas échéant, il sera débouché en injectant du liquide
sous pression. Si le ballonnet est trop postérieur, du liquide risque de refluer dans la corne
contra latérale. Parfois l’absence du retour est dû à l’éclatement du ballonnet.
2.2.3- Particularités de la sonde à deux voies (sonde de Han)

Plus que pour la sonde à trois voies, la mise en place de cette sonde est essentielle : il faut en
effet la faire progresser le plus loin possible tout en retirant le mandrin. Une fois le ballonnet
gonflé, le mandrin est complètement retiré et les voies d’injection et de récupération
branchées. L’injection peut se faire par simple pesanteur ou par injection de 50 ml. Les voies
d’injection et de sortie seront clampées et ouvertes en alternance jusqu’au passage dans
chaque corne de 350 à 400 ml. Le mandrin ne pouvant être réintroduit dans la sonde, une
seconde est nécessaire pour la perfusion de l’autre corne. Il persiste au niveau du tuyau un
volume mort dans lequel les embryons peuvent être aspirés et refoulés. Ceci explique peut-
être la diminution relative du nombre d’embryons récupérés au moyen de cette sonde.

C- Détermination de la qualité des embryons
1- Rappels des premiers stades du développement de l’embryon
L’ovulation survient chez la vache une trentaine d’heures environ après le début de l’œstrus.
Il en résulte l’émission d’un ovocyte qui entre-temps a expulsé son premier globule polaire et
se trouve bloqué au stade métaphase 2. La rapidité d’expulsion (dans les 16 à 20 heures) de ce
premier globule polaire sous l’effet de la LH semble, selon certains auteurs, déterminante
pour le développement futur de l’embryon. Cette phase de maturation ovocytaire est atteinte
in vitro par 85 % des ovocytes mis en culture.
1.1- Premières divisions cellulaires

L’ovocyte est pénétré par le spermatozoïde dans les deux heures suivant l’ovulation. Cette
pénétration déclenche l’expulsion du second globule polaire, la reprise de la division
cellulaire et la formation de deux blastomères 24 à 48 heures environ après la fécondation. In
vitro, cette reprise du développement est quelque peu retardée, la première division cellulaire
s’observant 44 heures en moyenne après la mise en contact des ovocytes avec des
spermatozoïdes capacités. Cette reprise de la division cellulaire est considérée comme critique
pour le développement ultérieur de l’embryon. Ainsi, les embryons qui atteignent le stade 2
cellules 36 heures après la fécondation voire le stade 4 cellules 48 heures après la fécondation
ont davantage que les autres la possibilité d’atteindre le stade blastocyste. Au stade
unicellulaire, l’embryon de mammifère est une cellule relativement grosse dont la taille est
comprise entre 70 et 140 microns. Il est entouré d’une zone pellucide. Celle-ci non seulement
maintient les blastomères ensemble mais leur assure un milieu périvitellin adéquat. Les
divisions cellulaires ultérieures présentent deux caractéristiques: non seulement elles sont
asynchrones, certaines apparaissant plus précocement que d’autres, mais elles aboutissent à la
formation de deux populations cellulaires, l’une de petite taille et l’autre de grande taille. Les
premières, résultant d’une division plus précoce, donnent naissance au bouton embryonnaire
(ICM : Inner Cell Mass) et les secondes au trophectoderme, futur placenta. Il est intéressant
de noter le caractère totipotent et donc non différentié que présentent les cellules jusqu’au
stade 8.
Au 4ème jour suivant l'insémination d'animaux super ovulés, 72 % des embryons normaux
récoltés après abattage sont au stade de 8 cellules. Au 5ème et 6ème jour de gestation 78 et 81
% d'entre eux sont respectivement au stade 16 et plus de 16 cellules. En général, l'embryon
passe dans l'utérus vers le 5ème jour de gestation. Des récoltes séquencées réalisées après
abattage de vaches super ovulées ont permis de préciser que 4, 5 et 6 jours après
l'insémination, respectivement 60 % des embryons sont dans l'oviducte et 80 et 91 % dans
l'extrémité de la corne utérine.
Ces divisions cellulaires aboutissent à la formation d’une morula (32-64 cellules) qui va être
l’objet du phénomène de la compaction. La compaction consiste en la formation de zones de
contact entre les blastomères aboutissant à la formation d’une cavité blastocoelique et à
l’expansion du blastocyste. Celle-ci résulte de la présence d’un gradient ionique différent
entre les parties internes et externes du blastocyste ce qui a pour résultat d’induire par osmose
une accumulation de liquides dans la morula. Sa formation indique que l’embryon a franchi
avec succès la phase de blocage observé in vitro au stade 8- 16 cellules (4ème division

cellulaire) chez la plupart des embryons de mammifères à l’exception des primates et de la
lapine. Ce blocage implique que soient davantage maîtrisés in vitro les facteurs qui en seraient
responsables et qui encore à ce jour imparfaitement connus.
C’est également au cours des premières divisions cellulaires (stade 2 dans l’espèce caprine,
stade 4 dans les espèces porcine et humaine, stade 8 dans l’espèce bovine et stade 16 dans
l’espèce ovine) que le contrôle du développement embryonnaire passe du génome maternel au
génome de l’embryon lui-même.
1.2- Sortie de pellucide et phase d’élongation.

Le jeune blastocyste comprend environ une centaine de cellules. Son diamètre est de 160
microns et l’épaisseur de sa zone pellucide de 12 microns. L’accumulation de liquides dans le
blastocyste est responsable de l’expansion du blastocyste. Celle-ci se traduit par une
augmentation de 60 % de son diamètre qui passe abstraction faite de l’épaisseur de la zone
pellucide, d’un diamètre de 400 à 700 microns. Il en résulte également un amincissement de la
pellucide ce qui explique que sa rupture peut se produire à n’importe quel endroit. L’éclosion
c’est-à-dire la sortie du blastocyste hors de sa pellucide (hatching) vers le 9ème -10ème jour
suivant la fécondation ne résulte pas d’une lyse enzymatique, des membranes pellucides
intactes peuvent être retrouvées dans l’utérus, mais de la formation d’un point de perforation.
Ce processus a une durée moyenne de 12 heures. Diverses modalités en ont été décrites : la
phase d’expansion est continue et suivie de l’éclosion ; elle peut-être discontinue et être
entrecoupée de quelques phases de contraction se terminant ou non par une éclosion normale.
Cette phase d’extrusion blastocytaire au travers d’une zone pellucide incomplètement
perforée pourrait expliquer la formation de vrais jumeaux.
Vers les 11 ème -12 ème jours de gestation, le blastocyste se compose de 1000 cellules
environ 25 % d’entre elles seulement constituant le bouton embryonnaire recouvert jusqu'à ce
moment par le trophectoderme.
De sphérique, le blastocyste prend progressivement un aspect ovoïde avant d’entamer vers le
12ème - 14ème jour sa phase d’élongation. Le début de cette phase varie entre espèces et
entre individus, le cas le plus extrême étant celui de la diapause présentée par le chevreuil.
Elle peut également être très rapide puisque dans l’espèce porcine, le blastocyste s’allonge de
30 à 45 mm par heure entre le 12ème et le 14ème jour de gestation. Le trophoblaste
différencié vers le 5ème - 6 ème jour de gestation est un tissu dont la croissance est très
rapide. Constitué de l’endoderme et du trophectoderme, il forme le chorion et est à l’origine
des cotylédons. Il débute à ce moment sa phase d’élongation jusqu’à atteindre une longueur
de 2.5 cm en moyenne au 16ème jour de gestation. D’importantes variations individuelles ont
été décrites à ce stade de gestation. L’ectoderme, l’endoderme et le mésoderme sont à ce
moment bien différenciés et le trophoblaste est environ 50 fois plus long que le disque
embryonnaire proprement dit.
1.3- L’implantation
Le trophoblaste différencié vers le 5ème - 6 ème jour de gestation est un tissu dont la
croissance est très rapide. Constitué de l’endoderme et du trophectoderme, il forme le chorion
et est à l’origine des cotylédons. Il débute à ce moment sa phase d’élongation jusqu’à
atteindre une longueur de 2.5 cm en moyenne au 16ème jour de gestation. D’importantes

variations individuelles ont été décrites à ce stade de gestation. L’ectoderme, l’endoderme et
le mésoderme sont à ce moment bien différenciés et le trophoblaste est environ 50 fois plus
long que le disque embryonnaire proprement dit.
Les premiers contacts tissulaires entre le trophoblaste et la surface utérine s’observeraient
selon les auteurs entre le 11ème jour de gestation et le 90ème jour. Des études plus
spécifiques ont confirmé qu’en fait, c’est vers les 20 ème -30 ème jours de gestation qu’un
processus d’adhésion entre les structures maternelles et embryonnaires se mettrait en place.
2- Critères d’identification de la qualité des embryons

Les embryons récoltés après superovulation ou fécondation in vitro se présentant sous des
aspects morphologiques divers, il est important d’en apprécier la qualité avant leur transfert
ou autres manipulations biotechnologiques éventuelles. Divers critères ont été proposés. Les
uns évaluent les caractéristiques morphologiques de la pellucide et des blastomères et
vérifient si elles sont en accord avec le stade de gestation. Des valeurs de diamètre externe de
l’embryon et de l’épaisseur de la pellucide ont dans ce but été déterminées. D’autres moins
couramment utilisés se basent sur le nombre de cellules identifiées à un stade de
développement donné, l’activité enzymatique (test à la FDA : Fluorescéine Diacétate
transformé sous l’action d’estérases présentes dans les cellules vivantes en un composé non
fluorescent) ou métabolique (consommation de glucose en culture, synthèse de lactate
deshydrogénase) ou encore sur le délai voire les modalités d’éclosion du blastocyste une fois
sa phase d’expansion réalisée.
Une fois récoltés, les embryons seront placés dans 2 à 3 ml de milieu de récolte propre et
examinés aux grossissements 10-40 pour en préciser les éléments morphologiques généraux.
Les blastocystes dits normaux seront isolés des autres. Les blastocystes jugés anormaux seront
ensuite examinés au grossissement 120 pour en préciser les caractéristiques cellulaires. Ils
seront à nouveau examinés après 4 à 6 heures.
L’évaluation morphologique fait classiquement référence à celle proposée par Eldsen en
1978. En pratique, 8 éléments d’observation peuvent être retenus. Ils concernent la membrane
pellucide (1. sphéricité, 2. épaisseur, 3. aspect fissuré ou non), le blastocyste en général (4.
régularité de son aspect général, 5. degré d’identification de ses différentes structures à savoir
le trophoblaste, le bouton embryonnaire et la cavité blastocoelique) et les cellules
blastocytaires (6. aspect des contours cellulaires et degré de variation de taille entre les
cellules, 7. présence de cellules détachées dans l’espace vitellin, 8. présence de vacuoles dans
les cellules ou de granulations à leur surface).
Morphologiquement, il est possible de distinguer les divers stades de développement de
l’embryon sur base des critères suivants (Lonergan 1992). Au stade morula, il est difficile de
bien distinguer les différents blastomères. Le tissu embryonnaire occupe la majorité de
l’espace périvitellin. Dans le cas d’une morula dite compacte, l’embryon occupe 60 à 70 % de
l’espace périvitellin. Le jeune blastocyste est un embryon présentant un début de cavité
(blastocoele) : il a un aspect de chevalière. L’embryon occupe 70 à 80 % de l’espace
périvitellin. A ce stade, il est possible de distinguer la masse embryonnaire et le trophoblaste.
Au stade blastocyste, il devient très aisé de distinguer la masse des cellules embryonnaires et
le trophoblaste. La cavité blastocoelique est nettement identifiable. L’embryon occupe
pratiquement tout l’espace périvitellin. Au stade de blastocyste expansé, le diamètre de

l’embryon a brutalement augmenté (x 1.2 à 1.5) tandis que l’épaisseur de la pellucide s’est
réduite de 2/3.
Il faut néanmoins tenir compte de certaines remarques : pour un jour de récolte donné,
plusieurs blastocystes au demeurant normaux peuvent se trouver à des stades de
développement plus ou moins avancés. De même, il n’est pas rare de récolter des ovocytes
non fécondés. Leur zone pellucide sera sphérique ou oblongue. Ils ne présentent pas de
contours cellulaires bien visibles. Le matériel cellulaire est dispersé dans l’espace vitellin
(aspect pycnotique).
Quatre (Eldsen 1978) voire cinq (Kennedy et al. 1983) classes d’embryons sont distinguées:
 Classe 1 (excellent) : Embryon au stade normal de développement au moment de
l’observation : aspect symétrique, blastomères polygonaux formant une masse compacte au
stade morula
 Classe 2 (bon) : Aspect semblable aux embryons de classe 1 mais de forme asymétrique
pouvant contenir des blastomères séparés de l’amas compact des cellules formant la morula.
Ils peuvent également présentés un retard de développement par rapport aux autres embryons
récoltés sur la même donneuse.
 Classe 3 (Moyen) : Embryons en retard de développement de 1 à 2 jours. Les blastomères
sont sphériques et de taille variable au stade morula. On constate la présence de vésicules
dans les blastomères. L’aspect de l’embryon est plus sombre ou plus clair que la normale.
 Classe 4 (mauvais) : Embryon en retard de développement de 2 jours. Les limites cellulaires
sont indistinctes.
 Classe 5 (dégénérés) : La dégénérescence peut parfois être, à ce point évidente, qu’il n’est
plus possible de reconnaître le stade de développement. L’embryon prend parfois une
configuration anormale.
D- Le transfert d’embryons
1- Synchronisation de la donneuse et des receveuses
Une synchronisation aussi parfaite que possible entre l’âge de l’embryon et donc la donneuse
et l’état physiologique de l’utérus de la receveuse constitue l’élément essentiel de la réussite
du transfert d’un embryon. Une étude menée en 1994 a précisé les pourcentages de gestation
observées après transfert de 2478 embryons sur des receveuses qui étaient venues en chaleurs
respectivement 48 h, 24 h avant la donneuse, en même temps et 24h et 48 h après la donneuse.
Les pourcentages de gestation ont été respectivement de 24, 52, 58, 50 et 44 %. Un écart de
24 heures maximum entre le jour des chaleurs de la donneuse et de la receveuse sera donc
accepté. Il est vrai qu’in vitro le développement des blastocystes peut être retardé. Il est connu
cependant que ceux qui atteignent le stade blastocytaire au 7ème jour de développement sont
de meilleure qualité que les autres. Aussi n’est-il pas recommandé d’adopter une stratégie
différente de synchronisation et donc de transfert des embryons obtenus in vivo et in vitro.
Les traitements hormonaux de synchronisation de la donneuse et des receveuses sont de
nature diverse. Ils peuvent être utilisés seuls ou en association. Leur employabilité dépend
d'une part du degré de synchronisation qu'ils permettent et d'autre part de la possibilité qu'ils
offrent de ne pas nécessairement détecter l'oestrus. On insistera néanmoins sur le fait qu'une
détection de qualité autorise un transfert au meilleur moment. Par ailleurs, le résultat du
transfert va également dépendre du degré d'exactitude du corps jaune éventuellement présent
au moment du transfert. Ce degré d'exactitude tiendra compte du fait qu'en moyenne 25 à 35
% des receveuses sont éliminées. Les traitements potentiels ont fait l’objet d’une description
détaillée dans le chapitre relatif à l’anoestrus. Nous nous limiterons ici à rappeler des essais
plus spécifiques réalisés dans le cadre du transfert d'embryons.
Injection unique au 2ème jour du traitement de superovulation de la donneuse (4ème injection
de FSH/LH) d’une prostaglandine F2alpha naturelle ou de synthèse en IM après avoir
confirmé manuellement ou par échographie la présence d’un corps jaune de diamètre
supérieur à 2 cm. double injection d’une prostaglandine F2alpha naturelle ou de synthèse à 11
(génisses) ou 14 jours (vaches) d’intervalle, la deuxième injection ayant lieu au 2ème jour du
traitement de superovulation de la donneuse (4ème injection de FSH/LH) : ce traitement offre
l’avantage d’assurer un plus grand degré de synchronisation des receveuses. retrait au 2ème
jour du traitement de superovulation de la donneuse (4ème injection de FSH/LH) d’un
implant de norgestomet ou d’une spirale de progestérone après respectivement 9 et 12 jours
de mise en place retrait au 2ème jour du traitement de superovulation de la donneuse (4ème
injection de FSH/LH) d’un implant de norgestomet ou d’une spirale de progestérone et
injection simultanée d’une prostaglandine F2alpha naturelle ou de synthèse après
respectivement 7 et 9 jours de mise en place Le protocole Ovsynch : On a comparé les
pourcentages de gestation obtenus après transfert d'embryons congelés sur des vaches
synchronisées au moyen de PGF2alpha ou du protocole Ovsynch. Le transfert était réalisé 7
jours après la détection de l'oestrus ou la seconde injection de GnRH pour autant qu'un corps
jaune de diamètre supérieur à 10 mm ait été détecté par palpation manuelle ou par
échographie. Cette comparaison démontra un effet favorable du protocole Ovsynch (39,1 % et
31,3 % de gestation sur respectivement 266 et 310 receveuses). D'autres études sont venues
confirmer la possibilité de réaliser un transfert d'embryons sur des vaches ou génisses sans
qu'au préalable elles aient été vues en chaleurs. Ainsi un taux de gestation de 59,9 % a été
obtenu après synchronisation de 1637 receveuses au moyen d'un protocole de type Ovsynch
joint à la mise en place pendant 7 jours d'un implant ou d'un CIDR.
2- Le transfert d’embryons: matériel et technique

Au début, les transferts d’embryons furent réalisés par voie chirurgicale au niveau du flanc
ipsilatéral à l’ovaire porteur du corps jaune. La peau et la tunique abdominale sont incisées au
moyen d’un bistouri et les couches musculaires dilacérées sur une longueur de 10 cm environ
au moyen des doigts. Le péritoine est ponctionné au moyen de l’index. L’extrémité de la
corne est amenée au niveau du site opératoire et l’embryon mis en place dans son tiers
supérieur après ponction de la corne au moyen d’une aiguille mousse.
Plus classiquement, le transfert d’embryon est réalisé à l’heure actuelle par voie transcervicale
au moyen de pistolet de transfert (« inovulateur de Cassou ») de diamètre de 3 mm pour les
génisses ou de 4 mm plus rigide pour les vaches.
E- La conservation des embryons

La conservation des embryons récoltés sur un animal donneur ou obtenus par fécondation in
vitro constitue une étape essentielle du transfert d’embryons. Cette conservation peut
s’envisager à court ou long terme.

L’embryon récolté peut être stocké temporairement avant son transfert. Il a été démontré que
les milieux de Ham’s F-10 ou du PBS additionné de 20 % de sérum fœtal de veau (FCS) ou
de BSA (Bovine Serum Albumine) convenaient parfaitement pour maintenir les embryons
envie pendant un délai d’une douzaine d’heures à température ambiante. Pour une
conservation plus longue (> 12 heures) il semble nécessaire de remplacer régulièrement le
milieu. Il est également possible de stocker les embryons au réfrigérateur (4°C) pour une
période de 12 à 24 heures. D’une manière générale cependant, les résultats obtenus seront
d’autant meilleurs que l’embryon est rapidement transféré à l’animal receveur (< 3 heures).
Une remarque s’impose. Les embryons obtenus in vitro présentent des caractéristiques
cellulaires différentes de ceux obtenus in vivo. Leur conservation à court terme ne peut
s’envisager que pendant 24 heures à une température de 20°C. Pour une conservation à plus
long terme, une congélation de l’embryon sera requise. Mise au point sur des embryons de
souris, la méthode aboutit en 1973 à la naissance du premier veau né après congélation de
l’embryon.
La méthode s’est rapidement intégrée aux programmes de superovulation étant donné les
nombreux avantages présentés tant du point de vue zootechnique (inutilité de synchronisation
des donneuses), que commercial (exportation plus aisée) ou génétique (banque d’embryons
d’animaux d’élite, conservation d’espèces en voie de disparition) voire scientifique (études
biochimiques et cryobiologiques fondamentales). Elle a ce faisant permis de dissocier dans
l’espace et dans le temps la production et le transfert des embryons. Elle a néanmoins
nécessité de nombreuses étapes visant à déterminer les critères de choix de l’agent
cryoprotecteur ainsi que les méthodes de congélation et de décongélation. En une vingtaine
d’années, elle a été appliquée dans la plupart des espèces animales.
1- Nature des agents cryoprotecteurs

En l’absence d’agent cryoprotecteur, les cellules de mammifères ne survivent pas à une
température inférieure à -20°C. Ayant la propriété de fixer les molécules d’eau, les agents
cryoprotecteurs abaissent le point de cristallisation des cellules. Par ailleurs, ils réduisent la
quantité de glace qui se forme au cours de la congélation mais contribuent également à en
modifier la forme de ses cristaux. Ils ne sont cependant pas dépourvus d’effets délétères
d’ordre biochimique, osmotique ou cellulaire (lésions de l’acrosome dans le cas des
spermatozoïdes).
Il en est de trois types. Au premier groupe appartiennent ceux qui pénètrent dans la cellule
(diméthylsulfoxide c’est-à-dire DMSO, glycérol, propanediol, méthanol, éthylène glycol, ce
dernier étant de plus en plus couramment utilisé et semblerait garantir de meilleurs résultats.
La cause pourrait en être trouvée dans son poids moléculaire plus faible et par conséquent sa
perméabilité plus élevée) : ils agissent essentiellement en la déshydratant et en réduisant la
taille des cristaux lors du refroidissement. Au second groupe appartient le sucrose
(saccharose), galactose ou encore saccharose. Non perméables, ils augmentent la pression
osmotique extracellulaire et ce faisant déshydratent la cellule sans y pénétrer. Le troisième
groupe enfin comporte des substances de poids moléculaire plus élevé (polyvinylpirrolidone,
dextran, serum, serum albumine, lipoprotéines présentes dans le jaune d’œuf) qui ne pénètrent
pas dans la cellule : ils agissent essentiellement au niveau membranaire (protection et
réparation). La congélation des embryons fait essentiellement appel aux cryoprotecteurs de

type pénétrant. Le degré de pénétration de l’agent cryoprotecteur dépend de divers facteurs
dont le coefficient de perméabilité de l’embryon (celui-ci dépend du stade de développement
de l’embryon : les morulas résistent davantage à la congélation que les jeunes blastocystes ou
les blastocystes expansés, et de l’espèce) au cryoprotecteur, le gradient existant entre les
concentrations intracellulaires et extracellulaires de l’agent cryoprotecteur et la température
de surface de l’embryon. Leur addition en plusieurs ou une seule étapes pendant ce qu’il est
convenu d’appeler le temps d équilibration semble donner les mêmes résultats.
2- La congélation proprement dite

La congélation comprend une série d’étapes relativement classiques mais aussi parfois
spécifiques des laboratoires qui les utilisent. De même, l’appareillage qu’elle nécessite est-il
de nature fort diverse, certains fonctionnant à l’éthanol pur ou à l’azote liquide.
 Etapes classiques
La première étape de la congélation consiste à équilibrer l’embryon dans sa solution de PBS
(renfermant 10 % de sérum fœtal bovin) avec une solution de glycérol 1.4 M soit 10 %
pendant 20 minutes à la température ambiante (20°C). La seconde étape visera à conditionner
la solution PBS-glycérol renfermant l’embryon dans une paillette de 0.25 ml. Pour ce faire la
solution est aspirée tout en séparant la partie renfermant l’embryon par deux bulles d’air. Lors
d’une troisième étape, l’a paillette est transférée dans l’appareil à congélation et refroidie
jusque –7°C à la vitesse de 1 à 3°C par minute. La paillette est alors maintenue pendant 5 à 7
minutes à cette température pour la stabiliser. La quatrième étape consistera à provoquer la
cristallisation par seeding. Pour ce faire on heurtera la ou les paillettes ou le liquide de
refroidissement au moyen d’une pince par exemple. Lors de la cinquième étape, la paillette
est refroidie de –7°C à –35°C à raison de 0,3 à 0,6°C par minute. Cette température semble
être optimale pour obtenir un compromis entre déshydratation et formation de glace
intracellulaire. Lors de la sixième étape, la paillette est plongée dans l’azote liquide à –196°C.
 La vitrification
La vitrification constitue une méthode alternative intéressante. Elle se base sur la concept de
solidification directe. L’élévation extrême de la viscosité du milieu permet de créer un état
amorphe ou vitreux sans formation de glace intra ou extra cellulaire. La solution de
vitrification renferme de très fortes concentrations d’un ou de plusieurs agents cryoprotecteurs
de type pénétrant (25 % de glycérol et 25 % de propanediol). La vitesse de congélation est
extrêmement élevée et obtenue par immersion directe dans de l’azote liquide (250°C par
minute). Compte tenu de la toxicité pour l’embryon des agents cryoprotecteurs utilisés à ces
concentrations, l’équilibration constitue une étape critique de la méthode. Enfin, l’état vitreux
étant instable à des températures supérieures à -100°C, la vitesse de décongélation doit être
très rapide (250°C /min) pour minimiser les risques de lésions cellulaires due à la réformation
de cristaux lors de la décongélation.
Récemment, une nouvelle méthode de vitrification appelée OPS (Open Pulled Straw) a été
proposée. Les minipaillettes de 0.25 ml sont traitées à la chaleur pour en réduire de moitié le
diamètre externe (0.8 mm vs 1.7 mm) et l’épaisseur de leur paroi (0.07 vs 0.15 mm). Les
embryons sont incubés successivement dans deux solutions de concentrations croissantes
d’éthylène glycol et de DMSO et de sucrose 0.5M, puis aspirés (1 à 2 microlitres) dans la
paillette par simple capillarité. Une fois conditionnées, les paillettes sont plongées dans l'azote

liquide. Leur décongélation s’opère en plongeant les paillettes dans un milieu à 37°C. Ce
système s’avère applicable pour congeler des ovocytes ou des embryons de J3 à J7 mais pas
aux embryons de J1 ou J2.
 La congélation ultrarapide
A la différence de la vitrification, ce type de congélation induit la formation de glace intra et
extracellulaire. Elle implique le recours à un cryoprotecteur de type pénétrant (glycérol) et
d'un cryoprotecteur non pénétrant (sucrose). Morula et blastocyste sont refroidis jusque –
30°C à la vitesse de 12°C par minute puis plongés dans l’azote liquide. Cette méthode n’a été
à ce jour appliquée qu’aux embryons de souris, rates et lapines.
3- La décongélation
Il en existe de deux types qualifiés de décongélation lente et de décongélation rapide. Dans
l’un et l’autre cas l’objectif est de soustraire l’embryon à l’action de l’agent cryoprotecteur
utilisé pour la congélation et de le réhydrater. Dans la décongélation lente (or multistep
thawing) le contenu de la paillette est passé dans trois bains (5 minutes par bain) renfermant
des concentrations décroissantes de glycérol (6.6 %, 3.3 % et 0 %) et constantes de sucrose
(0.3 M), le quatrième bain ne renfermant que du PBS et assure la réhydratation de l’embryon.
Cette méthode requiert du temps (1 à 2 heures) et un minimum d’équipement de laboratoire.
Elle peut requérir également un microscope pour observer la qualité de l’embryon décongelé.
Dans la décongélation rapide (or one-step thawing) la paillette est décongelée à la température
ambiante (20°C). Cette décongélation rapide implique cependant l’utilisation lors du montage
de la paillette et donc de sa congélation l’utilisation de sucrose. Pour ce faire, l’embryon est
équilibré pendant une vingtaine de minutes dans une solution de glycérol 1.36 M et de sucrose
0.25 M. Lors du montage de la paillette, on aspire successivement le sucrose 0.5M (4 cm),
une bulle d’air, le mélange glycérol 1.36M et sucrose 0.25M renfermant l’embryon (1 cm),
une bulle d’air et le sucrose 0.5M (6cm). La décongélation de la paillette assure le mélange
des solutions et donc soustrait l’embryon au glycérol, la réhydratation de l’embryon étant
assuré lors de sa mise en place dans l’utérus. Cette méthode offre de réels avantages sur le
terrain puisqu’elle dispense le praticien d’avoir du matériel de laboratoire, le transfert
ressemblant dans ce cas à une insémination classique.
II- DEUXIEME GENERATION : LE PRELEVEMENT D’OVOCYTES (PO), LA

MATURATION IN VITRO DES OVOCYTES (MIV) ET LA FECONDATION IN
VITRO (FIV)
Tandis que le nombre d'embryons pouvant être obtenu d'une vache sur une année, en utilisant
la MOET, est en moyenne limité à une vingtaine au plus, la mise au point du PO associé à la
MIV et à la FIV a permis de multiplier ce nombre au moins par 5. De plus, le PO peut être
appliqué aux animaux gravides ou pré-pubères. L'impact de ces méthodologies sur la réponse
génétique passe par les mêmes voies que la MOET, c’est-à-dire l'accroissement de l'intensité
de la sélection des femelles et l’augmentation de la précision de sélection des mâles et des
femelles. Le premier veau né après maturation in vitro (MIV), fécondation in vitro (FIV) et
transfert non chirurgical de l’embryon a été obtenu en 1981. C’est cependant au cours des
années suivantes que se développe la fécondation in vitro d’ovocytes prélevés sur des ovaires
obtenus après abattage des animaux, les ovocytes étant récupérés soit par aspiration du liquide
folliculaire, par section de l’ovaire en tranches ou par dissection.
A- Prélèvement in vitro des ovocytes

Le prélèvement in vitro des ovocytes est effectué après prélèvement des ovaires à l’abattoir. Il
importe de réduire autant que faire se peut le temps de stockage des ovaires et de veiller à
respecter des conditions de température optimales. Les ovaires doivent être prélevés dans les
deux heures suivant l’abattage de l’animal. Ils seront stockés à une température comprise
entre 24 et 30°C. Le prélèvement des ovocytes sera effectué dans les 4 heures suivant le
prélèvement des ovaires. Le prélèvement des ovocytes par aspiration (trompe à eau : 1 à 2 cm
de Hg) du liquide folliculaire au moyen d’une aiguille (19G à biseau court) est une des
méthodes les plus anciennes. Elle permet en moyenne de récupérer 9 à 16 ovocytes par ovaire
soit 30 à 60 % des follicules ponctionnées. La dissection préalable des follicules permet
l’obtention de 16 à 17 follicules par ovaire. Cette seconde méthode offre l’avantage
d’augmenter le pourcentage d’ovocytes morphologiquement normaux (60 à 63 % vs 31 à 80
%), conséquence possible du fait que la dissection permet de mieux identifier les follicules
non atrétiques. Elle est cependant plus lente que la première. La découpe de l’ovaire en
tranches (slicing ovary) offre pour avantage d’augmenter le nombre d’ovocytes récupérés (20
à 55 par ovaire). D’autres méthodes ont également été envisagées comme celle impliquant la
digestion préalable de l’ovaire au moyen de la trypsine (221 ovocytes par ovaire). Le
caractère irréversible du prélèvement in vitro et son intérêt génétique limité ont conduit à la
mise au point de méthodes laparoscopiques ou échographiques offrant la possibilité d’un
prélèvement d’ovocytes in vivo. La laparoscopie ventrale, paralombaire ou transvaginale a été
expérimentée dans l’espèce bovine. Elle est applicable de manière répétée sur le même
individu et n’entraîne qu’occasionnellement des complications péritonéales telles que des
adhérences. Son utilisation hebdomadaire voire bihebdomadaire ne peut selon certains auteurs
être prolongée plus de 5 semaines. Bien qu’elle permette chez la vache d’obtenir un
pourcentage de récupération des ovocytes compris entre 50 et 84 %, elle a pour des raisons
pratiques telles que la mise à jeun de l’animal, la nécessité d’induire une distension
abdominale, l’allongement de l’intervalle entre deux ponctions...), été progressivement
remplacée par des méthodes de ponction ayant recours à l’échographie. D’abord utilisée par
voie transcutanée au niveau de la région sacroischiatique, la ponction échoguidée des
follicules ovariens (OPU: Ovum Pick-Up) est communément utilisée à l’heure actuelle par
voie transvaginale chez la vache.
B- La maturation in vitro (MIV)

Diverses méthodes ont été proposées. Une première possibilité est de réaliser cette maturation
ovocytaire en plaçant les follicules disséqués dans un milieu de culture. Cette méthode
réservée aux follicules de petit diamètre (1 à 2 mm) requiert une expérience certaine. Dans
l’espèce équine certains auteurs ont avec succès réussi le transfert d’ovocytes sur des
follicules préovulatoires de juments, celles-ci étant ensuite récoltées après insémination.
Habituellement cependant, les ovocytes sont placés en maturation par groupe de 10 à 20 dans
des micropuits renfermant de 50 à 100 microlitres de milieu. Il est bien démontré que la
température de maturation ovocytaire comme celle assurant une pénétration optimale des

spermatozoïdes lors de la fécondation est de 39°C. La maturation in vitro des ovocytes est
soumise à l’influence de nombreux facteurs dont la plupart restent à préciser. En effet, alors
qu’en moyenne 60 à 85 % des ovocytes maturés in vitro sont fécondés et se divisent, seuls 25
à 30 % atteignent le stade blastocyste. La réussite de la MIV dépend de nombreux facteurs
dont un des plus importants est la technique de maturation et en particulier la composition du
milieu de culture utilisé.
C- Méthodologie de la FIV
 Sélection des spermatozoïdes mobiles
La première étape consiste après décongélation d’une paillette (1 minute à 35°C) à séparer les
spermatozoïdes du plasma séminal (et du milieu de congélation) en les lavant à deux ou trois
reprises par centrifugation dans un tampon ou un milieu de culture. Etant donné la présence
de glycérol, il n’est pas possible d’évaluer la viabilité des spermatozoïdes au moyen d’une
coloration vitale après leur décongélation. Le lavage est dans l’espèce bovine souvent
remplacée par la sélection des spermatozoïdes mobiles par centrifugation sur un gradient de
percoll (milieu PBS concentré dix fois et percoll) ou plus souvent par swim-up (nage
ascendante). Dans le premier cas, les spermatozoïdes sont déposés sur une double solution de
concentration différente de percoll puis centrifugés pendant 15 minutes à 500 G ; Ce faisant
les spermatozoïdes vivants se retrouvent au fond du tube et les morts à l’interface des deux
solutions. Dans le second cas, on dépose un milieu tampon (TALP calcium free
Tyrode/albumine/sodium lactate/sodium pyruvate) ou de culture sur un culot de
spermatozoïdes et après incubation (1 heure à 39°C) on récupère la phase supérieure
renfermant les spermatozoïdes mobiles, les spermatozoïdes morts demeurant dans le fond. Le
culot des spermatozoïdes vivants est remis en suspension dans du milieu pour le débarrasser
le plus complètement possible de son milieu de congélation (glycérol). Le culot des
spermatozoïdes est Production d’embryons in vitro \18 récupéré (100 microlitres) par
centrifugation. Leur concentration est ensuite déterminée et ajustée de manière à avoir une
concentration égale à 2.000.000 de spermatozoïdes par ml. Ainsi préparé et conservé à 25°C,
le sperme peut encore être utilisé au bout de 4 à 8 heures. Ces manipulations seront réalisées
dans une hotte à flux laminaire.
 Induction de la capacitation
Bien que diverses méthodes aient été employées pour induire artificiellement la capacitation,
il semble bien que la méthode utilisant l’héparine soit la plus appropriée pour le sperme bovin
(milieu tampon ou de culture renfermant 10 à 20 mcg/ml d’héparine). Le sperme y est ajouté
de manière à avoir une concentration de 2.000.000 spermatozoïdes par ml. Le recours à
l’héparine ne semble pas pouvoir être appliquée dans les espèces ovine, caprine et porcine.
Dans l’espèce équine, il semble que le recours à un agent ionophore (A23187) doive être
préféré.
 Induction et entretien de la mobilité
Une première sélection des spermatozoïdes mobiles a déjà été opérée par le swim-up.
Diverses substances sont connues pour augmenter la mobilité du sperme. La caféine comme
la théophylline agissent en inhibant la phosphodiestérase, ce qui contribue à augmenter
l’AMPc intracellulaire. L’addition d’un mélange penicillamine, hypotaurine et épinephrine

(PHE) est connue également pour augmenter la mobilité du sperme et la pénétration de
l’ovocyte.
 Fécondation proprement dite
La fécondation est réalisée dans une goutte de 50 à 100 microlitres de milieu sous huile de
paraffine ou minérale pour éviter toute évaporation. Chaque goutte renferme une vingtaine
d’ovocytes et environ 100.000 spermatozoïdes (2 millions par ml). L’incubation dure 18
heures à 39°C dans une atmosphère d’air renfermant 5% de CO2. L’atmosphère sera
également saturée d’humidité pour éviter toute évaporation du milieu. Une augmentation du
temps de l’incubation est un facteur de risque de polyspermie. Il est important par ailleurs que
le laboratoire soit maintenu autant que faire se peut à une température comprise entre 25 et
30°C. Diverses méthodes de préparation des ovocytes maturés ont été proposées pour
augmenter les chances de leur pénétration par les spermatozoïdes. Les cellules restantes du
cumulus peuvent être enlevées mécaniquement par vortexage ou chimiquement par l’addition
d’enzymes tels que l’hyaluronidase ou d’agents chimiques comme le citrate de sodium (3%
pendant 5 minutes). Il semble bien que ces méthodes ne doivent être utilisées que dans les cas
de manipulation plus spécialisées des gamètes (transfert de noyau, micro-injection de
spermatozoïde...). Habituellement donc, les ovocytes sont lavés au moyen d’une solution
tampon. Signalons enfin que des essais de « gamete intrafallopian transfer » (GIFT) ont été
pratiqués chez la vache. L’intervention consiste à prélever les ovocytes d’une vache donneuse
et à les injecter par laparoscopie dans l’oviducte d’un animal receveur inséminé.
III- Transfert nucléaire ou clonage d’embryons et la transgénèse
A- Transfert nucléaire
Les recherches sur le clonage par transfert de noyau participent à l'émergence d'une nouvelle
méthode de reproduction des animaux de rente. Celle-ci élargit la panoplie des
biotechnologies de la reproduction mises en œuvre depuis le milieu du siècle dernier dans les
élevages, d'abord avec l'insémination artificielle chez l'espèce bovine, puis avec la maîtrise
des cycles ovariens, la transplantation embryonnaire et la production d'embryons in vitro.
Le clonage animal permet de reconstituer des embryons à partir de cellules différenciées
issues d'un animal adulte. Les embryons ainsi reconstitués peuvent ensuite être transplantés
dans des femelles receveuses pour assurer le développement à terme et obtenir la naissance
d'un ou plusieurs individus qui portent le même génome nucléaire que le donneur de cellules.
La méthode utilisée chez la plupart des espèces est la fusion de la cellule donneuse de noyau
avec un ovocyte maturé et préalablement énucléé par micromanipulation. La cellule peut
provenir de différents tissus d'un animal adulte (fibroblaste de la peau, cellule du cumulus
ovarien...). Les ovocytes utilisés lors des séries de reconstitutions d'embryons proviennent de
ponctions ovariennes de femelles dites «donneuses d'ovocytes», ce qui implique que les
clones obtenus auront généralement un génome mitochondrial différent, et que seuls leurs
gènes nucléaires seront identiques. L'efficacité globale du clonage est très variable mais reste
en général faible, moins de 5%des embryons transférés aboutissant à un jeune viable dans
toutes les espèces. L'impact de cette technologie sur l'élevage est donc encore très modeste en
comparaison des autres biotechnologies de la reproduction. Cependant, parallèlement aux
progrès techniques constants dans les différentes étapes du clonage, les recherches sur le

transfert de noyaux ont permis d'apporter de nouveaux outils d’exploration pour comprendre
les mécanismes qui concourent à la mise en place des premières différenciations cellulaires
d’un organisme vivant.
Le transfert de noyaux totipotents dans des ovocytes énucléés permet théoriquement de
produire un grand nombre de jumeaux identiques ou “ clones ”.
Compte tenu du petit nombre de cellules disponibles quand un jeune embryon est utilisé
comme source de noyaux (une morula compte environ une trentaine de cellules seulement) les
travaux de recherche ont rapidement permis de développer des sources alternatives de cellules
donneuses, notamment des cellules somatiques différenciées d’origine fœtale.
Principe
Les ovocytes receveurs sont énucléés après leur maturation jusqu’au stade métaphase II. Les
cellules de l’animal donneur sont généralement issues d’un prélèvement de tissu mis en
culture pour en dériver des cellules qui peuvent être multipliées et conservées dans l’azote
liquide avant leur utilisation pour le clonage. Au moment du clonage, chaque cellule donneuse
est insérée sous la zone pellucide d’un ovocyte énucléé, et accolée au cytoplasme. Une
décharge électrique permet de fusionner la cellule entière avec le cytoplasme, un embryon est
ainsi reconstitué avec le noyau somatique, puis activé pour commencer son développement in
vitro. Après une période de culture in vitro, l’embryon est transplanté, généralement au stade
blastocyste, dans une mère porteuse synchronisée pour recevoir des embryons de ce stade. Les
clones sont souvent délivrés au terme par césarienne.
Cette voie permet d’agir sur la réponse génétique par différentes approches dont l'intensité et
la précision de la sélection, et l’intervalle entre générations. Initialement, les noyaux
totipotents étaient obtenus à partir de blastomères. Malgré l'emploi potentiel de blastocytes de
première génération et de générations ultérieures comme donneurs de noyaux, la taille des
clones est restée très limitée. La production récente de cellules souches embryonnaires
totipotentes (de type “ES”) chez des ovins, qui sera vraisemblablement suivie de
développements similaires dans d’autres espèces, pourrait conduire à un accroissement
considérable de l'efficacité du clonage des embryons.
B- Transgénèse
La transgenèse consiste à ajouter un gène étranger au génome d’un organisme vivant ou au
contraire à remplacer très précisément un gène endogène par un autre gène. Cette dernière
opération, qui implique la mise en œuvre d’un processus de recombinaison homologue, peut
conduire en pratique à l’inactivation ou à la mutation d’un gène chez l’animal. Elle permet
tout aussi bien de remplacer un gène donné par un tout autre gène. Dans tous les cas, le succès
de ces opérations est très intimement lié aux techniques de la reproduction.
1- L’addition de gènes
Les spermatozoïdes mis au contact d’une solution d’ADN puis utilisés pour réaliser des
fécondations peuvent véhiculer les gènes jusqu’au futur embryon et permettre l’obtention
d’animaux transgéniques. Cette approche s’est avérée possible chez le poulet, le poisson zèbre
ainsi que chez la vache et le porc. Les taux d’animaux transgéniques obtenus étaient toutefois
faibles voire très faibles et les transgènes étaient dans la majorité des cas profondément

remaniés (Schellander et Brem 1997, Squires et Drake 1997). Contre toute attente, les
spermatozoïdes de mouton mis au contact d’une solution d’ADN ont permis d’obtenir des
embryons transgéniques avec un rendement relativement élevé et sans remaniement apparent
des transgènes (Sanchez-Putida et al, résultats non publiés). Cette approche très simple mérite
d’être examinée de manière plus approfondie. Plusieurs expériences récentes suggèrent
fortement que les spermatozoïdes et leurs précurseurs peuvent également être utilisés d’une
autre manière pour transférer des gènes. Il a été récemment montré que des cellules
précurseurs des spermatozoïdes, isolées à partir de testicules de souris et même de rat,
pouvaient achever leur maturation dans des testicules adoptifs de souris jusqu’à devenir
parfaitement fonctionnels (Clouthier et al 1996). Il est par ailleurs possible de procéder avec
succès à des fécondations in vitro en injectant les cellules précurseurs des spermatozoïdes, les
spermatocytes, dans le cytoplasme d’ovocytes. Il est parfaitement concevable de transférer
des gènes, y compris par recombinaison homologue, pendant la culture des cellules
précurseurs des spermatozoïdes. Ceci nécessite toutefois au minimum que ces cultures soient
bien maîtrisées ce qui n’est pas le cas actuellement. La technique de transfert de gènes la plus
utilisée est la microinjection directe du gène étranger dans les pronoyaux des embryons au
stade une cellule lorsque cela est possible (comme cela est le cas chez les mammifères) ou
dans le cytoplasme (chez les vertébrés inférieurs et les invertébrés). La microinjection directe
de gène reste peu efficace et donc très onéreuse chez les gros animaux. Il est maintenant
devenu possible chez la vache, le mouton et la chèvre de produire à un coût réduit des
embryons au stade une cellule totalement in vitro, à partir d’ovocytes isolés d’ovaires
collectés dans les abattoirs (Crozet 1997). Les embryons peuvent alors subir la microinjection
de gène, puis être cultivés in vitro jusqu’au stade blastocyste, pour être ensuite transférés dans
des femelles adoptives (figure 2). La maîtrise de ces techniques contribue à améliorer la
reproduction des animaux et à rendre plus aisée la transgenèse. Des travaux récents autorisent
à penser que l’ensemble de ces techniques peuvent maintenant être également appliquées au
porc.
2- Le remplacement de gène
Lorsqu’un fragment d’ADN est introduit dans une cellule il peut se recombiner très
précisément avec un gène de l’hôte à condition que de longs segments du gène étranger et du
gène ciblé aient une séquence identique. Ce processus de recombinaison homologue qui
conduit en pratique au remplacement d’un gène cellulaire par un gène étranger est rare dans
les cellules de mammifères (au maximum dans 0,1 % des cas). Il fait appel à un processus
naturel de réparation de l’ADN et il ne peut se produire que si l’ADN cellulaire se réplique et
donc seulement dans des cellules en division. Le remplacement de gène par un gène étranger
au niveau d’un animal entier n’est par ailleurs possible que si les cellules qui ont subi le
processus de recombinaison homologue peuvent être utilisées pour engendrer un organisme
entier et donc donner naissance à un animal dans des conditions normales. Deux approches
pour procéder à un remplacement de gène sont actuellement possibles.
2.1- Utilisation de cellules totipotentes pour engendrer des animaux chimères

L’une de ces approches consiste à utiliser des cellules totipotentes qui, après avoir été
introduites dans un embryon précoce, peuvent participer à son développement complet.

L’animal obtenu est alors une chimère puisqu’il est formé à partir des cellules provenant de
deux animaux différents. Dans le meilleur des cas, les cellules ajoutées à l’embryon et ayant
subi au préalable la modification génétique, participent à la formation des gamètes. La
modification génétique est alors transmise à la descendance qui est homogène pour la
mutation. Des lignées de cellules totipotentes peuvent être obtenues à partir des embryons
précoces. On les appelle alors des cellules ES (embryonnaires souches). D’autres lignées
ayant des caractéristiques à peu près semblables peuvent être obtenues à partir des cellules
primordiales germinales (PGC). Ces cellules sont alors appelées EG (embryonnaires
germinales). Chez la souris, plusieurs lignées de cellules ES ont été établies. Jusqu’à ce jour
l’utilisation de cellules ES, et donc le remplacement d’un gène, n’est possible que chez la
souris. Pour des raisons inconnues, en effet, chez les autres espèces, les cellules
embryonnaires cultivées se différencient rapidement et deviennent incapables de participer à
la formation de chimères germinales. Chez les oiseaux, il a été possible d’obtenir des
chimères porteuses de gènes étrangers à partir de cellules embryonnaires. Des expériences
récentes montrent également que des lignées de cellules totipotentes fonctionnelles ont pu être
utilisées avec succès chez le poulet. Plusieurs publications ont montré que les cellules
germinales primordiales (PGC) pouvaient être cultivées sous forme de lignées et participer,
comme les cellules ES, au développement d’animaux chimères. La manipulation de ces
cellules ne paraît pas aisée et elle reste possible essentiellement chez la souris. Des cellules
ES ainsi que des cellules EG (lignées totipotentes dérivées des cellules germinales
primordiales) ont toutefois été obtenues récemment chez le porc. Ces cellules ont donné
naissance à des animaux chimères. La transmission germinale du nouveau génome ainsi
acquis n’a pas été démontrée à ce jour.
2.2- Utilisation de cellules multipotentes ou somatiques pour engendrer des animaux

clonés
Chez la plupart des espèces, les cellules embryonnaires cultivées pendant plusieurs semaines
ont perdu leur totipotence. Elles sont partiellement différenciées et qualifiées de
multipotentes. Ces cellules sont devenues progressivement incapables de participer au
développement d’embryons chimères. La technique de clonage des animaux dans sa version
classique consiste à introduire un noyau de cellule embryonnaire non cultivée dans le
cytoplasme d’un ovocyte énucléé. Il est généralement admis que les cellules embryonnaires
cultivées et devenues multipotentes et, a fortiori, les cellules somatiques différenciées ne
peuvent assurer le développement complet d’un embryon reconstitué par transfert de noyau.
Une étude systématique a démontré que des cellules multipotentes de mouton maintenues à
l’état de quiescence en retirant le sérum de leur milieu de culture sont capables de donner
naissance à des agneaux après transfert dans le cytoplasme d’ovocytes énuclées. La même
approche expérimentale a également démontré que des cellules fœtales ainsi que des cellules
somatiques prélevées chez des animaux adultes peuvent donner naissance à des agneaux. Le
laboratoire d’Edimbourg qui a mis au point ces techniques a récemment démontré que des
fibroblastes fœtaux de moutons ayant reçu in vitro un gène étranger par les techniques
classiques de transfection peuvent donner ainsi naissance à des agneaux transgéniques. Le
rendement de la technique de clonage utilisé est relativement faible. Il apparaît toutefois
d’ores et déjà que l’addition de gène est plus facile par ce procédé que par la technique

classique de microinjection dans les pronuclei des embryons. Cet ensemble de techniques doit
pouvoir être étendu rapidement aux autres ruminants domestiques ainsi qu’au lapin et au porc.
Le remplacement de gène par recombinaison homologue peut avoir lieu en principe dans
n’importe quel type de cellules cultivées. Le transfert du noyau de ces cellules doit donc
permettre de remplacer des gènes très spécifiquement chez toutes les espèces chez lesquelles
le clonage à partir de cellules somatiques est possible.
3- La sélection du sexe
Les progrès récents du tri par flux cytométrique permettent actuellement de séparer
efficacement les spermatozoïdes viables porteurs d’un chromosome X ou Y. Si le nombre de
cellules récupéré est incompatible avec les méthodes classiques d’IA, il devient suffisant
lorsqu’on y associe les techniques de FIV. Cette approche pourrait devenir la méthode de
choix pour produire des embryons du sexe désiré. Le sexage des embryons peut aussi être
réalisé par microbiopsie et détermination du sexe en utilisant des séquences Y spécifiques
amplifiées par la technique d'amplification en chaîne par polymerase (PCR). Cette approche
n’est, cependant, que très exceptionnellement justifiée sur le plan économique.
4- La cryopréservation des gamètes et des embryons
La plupart des méthodes décrites ne sont efficaces que si elles sont employées en association
avec des techniques de congélation des gamètes et des embryons. La cryopréservation joue
aussi un rôle crucial dans les programmes visant à protéger et maintenir la diversité génétique.
Bibliographe :
L.-M. HOUDEBINE. La transgenèse animale et ses applications. INRA Prod. Anim., 1998,
11 (1), 81-94
X.VIGNON, Y. HEYMAN, P. CHAVATTE-PALMER, J.-P. RENARD. Biotechnologies de
la reproduction : le clonage des animaux d’élevage. INRA Prod. Anim., 2008, 21 (1), 33-44
Jean-Paul RENARD. Le clonage chez les mammifères : aspects scientifiques et techniques.
Les Cahiers du MURS n° 36 - décembre 1998, 13p.
Code sanitaire pour les animaux terrestres - 5/09/2019. CHAPITRE 4.12. TRANSFERT
NUCLÉAIRE DE CELLULES SOMATIQUES CHEZ LE BÉTAIL ET LES CHEVAUX
D’ÉLEVAGE, 8p.
Prof. Ch. Hanzen. (2016) La production d’embryons in vivo dans l’espèce bovine, Cours
Faculté de Médecine Vétérinaire, Université de Liège, 28p.


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 Le mâle éjacule immédiatement dans le vagin artificiel. Il acceptera de le faire à

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Inhibition due à l'homosexualité. Un faible pourcentage de mâles déclenche leur

L'importance relative de ces différentes inhibitions varie en fonction de l'espèce et de la race,

 Mâles dont la semence a déjà été collectée auparavant.

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2-2- Description de la technique de Collecte de semence sur des mâles entraînés

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2-3- Intérêts et limites de la collecte au vagin artificiel

Les intérêts de la collecte au vagin artificiel sont les suivants :

-Observation de la capacité à saillir du taureau : Dans le cadre d’un contrôle de fertilité, la

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3- Collecte à la main gantée

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4- Collecte par massage dorso-abdominal

4-2- Fréquence de récolte des coqs

B- ANALYSE DU SPERME RECOLTE

Les analyses réalisées sur la semence sont macroscopiques et microscopiques. L’examen

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L'objectif de cette mesure est de pouvoir déterminer le nombre de spermatozoïdes par

 appréciation visuelle directe de la consistance de l'éjaculat

Le comptage exact du nombre de spermatozoïdes dans un hématimètre est une technique

1. Prélever (précisément) 0,01 ml de semence pure et la diluer dans 4 ml (précisément) de

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5. Placer avec soin l'hématimètre (veiller à le maintenir horizontal) sur la platine du

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FIGURE 45 : Exemple de la relation entre la densité optique et la concentration en

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TABLEAU 10 : Détermination de la note de motilité massale de la semence

Note Aspects du mouvement

TABLEAU 11 : Détermination de la note de motilité individuelle des spermatozoïdes

Note Motilité individuelle

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Pourcentage de spermatozoïdes mobiles

Motilité individuelle des spermatozoïdes

L'estimation visuelle de la motilité individuelle des spermatozoïdes est réalisée en même

Mesure du pourcentage de spermatozoïdes vivants et des anomalies spermatiques

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Eosine (soluble dans