TRAVAUX PRATIQUES

Analyse de contaminants
UE 702

TP 1 : Dosage par LC-MS de principes

actifs médicamenteux dans les eaux
environnementales – Application à
l’ibuprofène

ETSE ELOGE
OUEDRAOGO RACHID
SUZANNE LUCAS M1 CDE
Table des matières
I- Introduction....................................................................................................................................3
II- Conditions opératoire LC-MS..........................................................................................................4
1) Appareillage utilisé.....................................................................................................................4
2) Etude du mode d’ionisation.......................................................................................................5
3) Etude du solvant d’injection.......................................................................................................8
III- Etablissement des droites d’étalonnage.....................................................................................9
IV- Etude du protocole SPE............................................................................................................10
V- Quantification de l’ibuprofène dans un échantillon d’eau inconnu..............................................13
VI- Conclusion................................................................................................................................15
ANNEXES..............................................................................................................................................16

2
 I- Introduction

L’un des anti-inflammatoire non stéroïdien le plus utilisé au monde est l’ibuprofène. Il permet entre
autres de réduire ou supprimer les symptômes liés à un phénomène inflammatoire.

L’ibuprofène représente une source de pollution de l’environnement. Il peut être jeté en temps que
déchet ménager mais également rejeté par les consommateurs naturellement comme dans les
urines. Continuant ainsi sa route dans les eaux usées jusqu’au station d’épuration où il sera
partiellement éliminé.

Malheureusement les molécules d’ibuprofène finissent leur course généralement dans nos cours
d’eau et dans la mer. Heureusement suite à plusieurs études menées par l’ANSES (Agence nationale
de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail), l’ibuprofène a été
catégorisé comme ne présentant pas de risque sanitaire. Mais il faut garder en mémoire qu’il n’est
pas le seul médicament se retrouvant dans l’eau et qu’il peut se combiner avec d’autres molécules
augmentant potentiellement sa dangerosité.

Ce TP à pour but de quantifier la concentration d’ibuprofène présent dans des eaux

environnementales.

3
 II- Conditions opératoire LC-MS

La LC-MS (chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse) est une technique d'analyse
chimique qui combine la séparation des composés présents dans un échantillon par chromatographie
liquide avec la détection et la quantification de ces composés par spectrométrie de masse.

La chromatographie liquide permet de séparer les différents composés présents dans un échantillon
en fonction de leur polarité et de leur affinité pour la phase mobile utilisée. Les composés sont
ensuite injectés dans un instrument de spectrométrie de masse, où ils sont ionisés et analysés en
fonction de leur masse/charge.

La LC-MS est une technique très sensible et spécifique, qui permet de détecter des composés
présents en très faibles concentrations. Elle est largement utilisée dans de nombreux domaines tels
que la pharmacologie, la toxicologie, la médecine, la biologie, la chimie, l'agroalimentaire, et
l'environnement pour identifier et quantifier les composés présents dans les échantillons.

1) Appareillage utilisé

Dans ce TP les appareils utilisés sont les suivants :

Figure 1 Schéma de principe du couplage LC-MS et photographie de l’appareil utilisé dans ce TP

Chromatographie en phase liquide :

Colonne : ZORBAX SB C18 (50 x 2.1 mm ID, 1.8μm)

Température : 30°C

Phase mobile : acétonitrile / eau (+ 0.1% HCOOH) 50/50 v/v

Débit : 0,4 mL/min Volume injecté : 5 µL (boucle pleine)

4
Spectromètre de masse :

Source : Electrospray

Température : 350°C

Polarité : négative

Tension capillaire : -3,0 kV

Pression : 2,4 bars

2) Etude du mode d’ionisation

La molécule d’ibuprofène a pour caractéristique :

Figure 2 molécule et caractéristiques de l'ibuprofène

L’étalon interne quant à lui est l’ibuprofène-d3 (marquage spécifique avec 3 atomes de deutérium,
isotope stable de l’hydrogène de masse 2u).

Le mode d'ionisation ESI (Electrospray Ionization) est un mode d'ionisation utilisé pour produire des
ions à partir d'échantillons liquides en chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse
(LC-MS). Il est basé sur l'application d'une tension électrique à un jet de solution qui a été pulvérisé
en fines gouttelettes à travers une buse à haute pression.

Lorsque la tension électrique est appliquée, les gouttelettes de solution sont chargées
électriquement et se décomposent en gouttelettes encore plus petites, qui peuvent alors être
ionisées. Les composés présents dans la solution sont ionisés en fonction de leur polarité. Les ions
produits par l'ESI sont ensuite injectés dans un instrument de spectrométrie de masse où ils sont
analysés en fonction de leur masse/charge.

On peut utiliser l’ESI en mode positif ou en mode négatif. Dans le premier cas nous aurons des ions
de la forme [M+H]+ et dans le second cas des ions de la forme [M-H]-.

5
 [M+H]+

[2M+K]+

[M+H+CO2]+

[M+K]+(13C)

Figure 3 spectre en mode d'ionisation positif

6
 [M-H]-

Figure 4 spectre en mode d'ionisation négatif

En mode négatif on observe beaucoup moins de pic qu’en mode positif. Nous allons donc utiliser ce
premier pour faciliter l’étude du composé dans nos solutions.

7
 3) Etude du solvant d’injection

En chromatographie liquide, le solvant d'injection est utilisé pour dissoudre les échantillons avant de
les injecter dans le système de chromatographie. Il joue un rôle important dans la rétention et la
séparation des composés présents dans l'échantillon.

Il est utilisé pour dissoudre les échantillons et pour les injecter dans le système de chromatographie,
il est choisi en fonction de la polarité des composés d'intérêt et de la phase mobile utilisée dans le
système de chromatographie. Les solvants non polaires sont souvent utilisés pour dissoudre les
composés non polaires, tandis que les solvants polaires sont utilisés pour dissoudre les composés
polaires.

Figure 5 spectre de l'eau déionisée

Figure 6 spectre de l'acétonitrile

8
Pour l’acétonitrile on observe deux pics alors que pour l’eau déionisée on observe un seul pic. Nous
allons donc utiliser ce dernier comme solvant d’injection.

III- Etablissement des droites d’étalonnage

Pour pouvoir quantifier le produit il est nécessaire d’établir des droites d’étalonnage. Cela se
construit en injectant une gamme d’étalon de solution de concentration croissante.

Ici les résultats obtenus sont contenus dans le tableau suivant :

Tableau 1 gamme étalon

n° étalon C (mg/L) AIR AIR SI AIR RELATIVE

1 0,05 12050 145318 0,082921593
2 0,1 22153 118930 0,186269234
3 0,25 65874 145246 0,453534004
4 0,5 130375 152261 0,856259975
5 1 262882 136853 1,920907835
6 2 584368 157141 3,718749403

Nous pouvons alors tracer les droites d’étalonnage avec et sans étalon interne.

SANS SI
700000

600000
f(x) = 292324.551971326 x − 10393.958781362
500000 R² = 0.997587278870282

400000

300000

200000

100000

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5

Figure 7 droite d'étalonnage sans étalon interne

9
 AVEC SI
4
3.5 f(x) = 1.87475835295707 x − 0.0154859220066736
R² = 0.999127223043534
3
2.5
AIre relative

2
1.5
1
0.5
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Concentration (mg/L)

Figure 8 droite d'étalonnage avec étalon interne

On constate que la droite avec l’étalon interne possède un R² supérieur à la droite sans l’étalon
interne. D’où son utilité, il sert à corriger les erreurs de préparation.

IV- Etude du protocole SPE

L'extraction en phase solide (SPE) est une technique utilisée pour purifier et concentrer des
échantillons organiques ou inorganiques avant une analyse chimique. Elle consiste à extraire des
composés cibles à partir d'un échantillon en utilisant une phase solide comme support d'extraction.
Cette phase solide peut être un matériau comme les fibres de verre, la silice, les polymères ou les
céramiques, qui ont des propriétés physiques et chimiques spécifiques pour adsorber les composés
cibles. L'échantillon est ensuite désorber (ou élué) de la phase solide pour être analysé. L'avantage
de cette technique est qu'elle permet de séparer les composés d'intérêt des contaminants présents
dans l'échantillon, ce qui améliore la sensibilité et la spécificité de l'analyse.

Lors de cette phase nous avons fait varier plusieurs paramètres afin de construire un plan
d’expérience pour déterminer les facteurs à utiliser pour obtenir le meilleur rendement.

Tableau 2 facteur du plan d'expérience

N° du facteur Nom du facteur Niveau - Niveau +

1 pH 3 naturel
2 Volume de chargement 3 mL 30 mL
3 Volume d'élution 1 mL 3 mL

A la suite des analyses on obtient les résultats suivants :

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 Tableau 3 résultats du plan d'expérience

n° Aire Aire Si Aire relative

1 42494 146073 0,29090934
2 43727 125505 0,34840843
3 397515 154334 2,575680019
4 241921 132670 1,82347931
5 22457 125941 0,178313655
6 19868 118211 0,168072345
7 336016 131311 2,55893261
8 169020 199859 0,845696216

On peut ensuite remonter aux concentrations via l’équation de droite obtenue grâce à la droite
d’étalonnage, en ne n’oubliant pas d’appliquer la formule C mère*Vmère = Cfille * Vfille car rappelons le, la
SPE concentre l’échantillon. La concentration mesurée n’est donc pas la réelle concentration de
l’échantillon.

Les résultats sont contenus dans ce tableau :

Tableau 4 rendement du plan d'expérience

Concentration réelle Concentration théorique

n° Concentration (mg/mL) Rendement (%)
(mg/L) (mg/L)
1 0,16344 0,054478583 0,05 109
2 0,19411 0,064701734 0,05 129
3 1,38211 0,046070337 0,05 92
4 0,98089 0,032696453 0,05 65
5 0,10338 0,034459437 0,05 69
6 0,09792 0,032638565 0,05 65
7 1,37318 0,045772573 0,05 92
8 0,45935 0,015311788 0,05 31

On remarque qu’on obtient des rendements supérieurs à 100% ce qui n’est normalement pas
possible, cela peut être du au fait la solution contenant notre échantillon soit mal préparée et que sa
concentration soit supérieure à 0,05 mg/L. On peux quand même conclure que l’expérience n°2 est la
plus rentable.

Grâce à ces résultats nous pouvons construire notre plan d’expérience afin d’étudier l’importance
des paramètres sur le rendement.

11
 Tableau 5 effets du plan d'expérience

N°exp M X1 X2 X3 X12 X13 X23 Y

1 1 -1 -1 -1 1 1 1 109
2 1 1 -1 -1 -1 -1 1 129
3 1 -1 1 -1 -1 1 -1 92
4 1 1 1 -1 1 -1 -1 65
5 1 -1 -1 1 1 -1 -1 69
6 1 1 -1 1 -1 1 -1 65
7 1 -1 1 1 -1 -1 1 92
8 1 1 1 1 1 1 1 31
Effets 81,5 -9 -11,5 -17,25 -13 -7,25 8,75
a0 a1 a2 a3 a12 a13 a23

Les effets des facteurs sont quantifiés dans le graphique suivant pour plus de lisibilité :

20

15

10
Valeur des contrastes

-5

-10

-15

-20
a1 a2 a3 a12 a13 a23

Figure 9 valeur des effets

On peut conclure que le facteur 3 soit le volume d’élution est le facteur le plus important. Il est
négatif, ce qui implique qu’il faut le paramétrer au niveau – soit un volume d’élution de 1mL. Le
facteur 1 et 2 sont également négatifs. On devra donc utiliser un pH de 3 et un volume de
chargement de 3 mL pour obtenir le meilleur rendement.

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 V- Quantification de l’ibuprofène dans un échantillon d’eau
inconnu

Nous allons maintenant quantifier l’ibuprofène dans notre échantillon d’eau. Pour ce faire nous
allons procéder à une SPE de paramètres suivants :

- pH : ~3 ajusté avec de l’acide formique

- Volume de chargement : 10 mL

- Volume d’élution : 2 mL

Puis nous allons l’injecter 3 fois.

Figure 10 spectre de l'eau naturelle à analyser

On obtiens les résultats suivants :

Tableau 6 résultats des injections de l'eau à analyser

Concentration réelle
n° Aire Aire Si Aire relative Concentration (mg/L)
(mg/L)
1 384218 106044 3,623194146 1,94084 0,19408439
2 405630 114520 3,542001397 1,89754 0,189753648
3 458395 150862 3,038505389 1,62898 0,162897663

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Dans l’échantillon d’eau on retrouve en moyenne 0,181 mg/L d’ibuprofène.

On a répété trois fois l’analyse pour estimer la répétabilité. On utilise la formule suivante :

Figure 11 formule de la répétabilité

 (4,30265273* 0,01379457)/√3 = 0,034267609

La concentration mesurée à 95% de chance d’être comprise entre 0,147 et 0,215.

Le volume minimal nécessaire à passer sur une cartouche au moment des différentes étapes du
mode opératoire est appelé volume « lit ». Celui-ci est définit comme étant le triple du volume de
phase de la cartouche. Il faut donc déterminer le volume de phase pour déterminer le volume lit.

Les caractéristiques de la cartouche sont les suivants :

Figure 12 caractéristiques de la cartouche SPE

Vlit = 3 * Vphase

Vlit = 3 *(B*h)/c

Vlit = 3 * (π*r*r*h)/c

Vlit = 3 * (π*0,45*0,45*0,75)/0,7

Vlit = 3 * 0,69

Vlit = 2,07 mL

D’où le volume de 2 mL utilisé pour le conditionnement des cartouches

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 VI- Conclusion

Le but notre travail consistait à déterminer la concentration de l’ibuprofène dans de l’eau naturelle.
Ce TP nous a permis de mettre en pratique notre connaissance théorique en chromatographie en
phase liquide avec la spectrométrie de masse comme détection, nous avons appris à l’issu de ce TP,
les bonnes manières d’injecter les solutions et comment effectuer les différentes techniques de
l’analyse de LC-MS. Au cours de notre travail, nous avons obtenus une concentration d’ibuprofène
Cibuprofène = 0,181 +/- 0,034 mg/L ce qui est fiable sans être négligeable.

15
ANNEXES

Figure 13 spectre de l'étalon à 0,05mg/L

Figure 14 spectre de l'étalon à 0,1 mg/L

16
Figure 15 spectre de l'étalon à 0,25 mg/L

Figure 16 spectre de l'étalon à 0,5 mg/L

17
Figure 17 spectre de l'étalon à 1 mg/L

Figure 18 spectre de l'étalon à 2 mg/L

18
Figure 19 spectre de l'expérience n°1

Figure 20 spectre de l'expérience n°2

19
Figure 21 spectre de l'expérience n°3

Figure 22 spectre de l'expérience n°4

20
Figure 23 spectre de l'expérience n°5

Figure 24 spectre de l'expérience n°6

21
Figure 25 spectre de l'expérience n°7

Figure 26 spectre de l'expérience n°8

22
Figure 27 spectre de l'eau à analyser n°1

Figure 28 spectre de l'eau à analyser n°2

23
Figure 29 spectre de l'eau à analyser n°3

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