Cours Microscopie LST CAE 2020-2021

Royaume du Maroc ‫اﻟﻤﻤﻠﻜﺔ اﻟﻤﻐﺮﺑﯿﺔ‬
Université Hassan 1er ‫ﺟﺎﻣﻌﺔ اﻟﺤﺴﻦ اﻷول‬

‫ﻛﻠﯿﺔ اﻟﻌﻠﻮم و اﻟﺘﻘﻨﯿﺎت‬
Faculté des Sciences et Techniques Settat
‫ﺳﻄﺎت‬
Cours de Microscopie
L’infiniment petit devient visible
AU: 2020/2021
Pr. M. BELBAHLOUL LST-CAE
Définition
La microscopie est le domaine technique de l'utilisation de microscopes pour
visualiser des échantillons et des objets qui ne peuvent pas être vus à l'œil nu,
qui, en raison de leur petitesse, sont en dehors de la plage de résolution de l'œil
normal. Le microscope est l'élément central de la microscopie.
12/02/2021 Pr. M. BELBAHLOUL LST-CAE 2

Microscope
Le tout premier microscope a été créé en 1595, à l’époque du roi Henri IV.
C’est Zacharias Janssen, un fabricant de lunettes hollandais, qui a eu l’idée de superposer
deux verres de lentille (les lunettes de l’époque) dans des tubes coulissants, afin de
grossir de très petites choses.
80 ans plus tard, Antoine van Leeuwenhoek et Robert Hooke y apportent quelques
modifications pour observer des choses qui étaient invisibles à l’œil nu! Ils observèrent
notamment une cellule humaine.
!
Antoni Van Leuwenhoeck (1632-
12/02/2021 1723) invente le microscope!!
Le microscope optique
(photonique)

Le microscope optique est un instrument d'optique composé de plusieurs lentilles
superposées permettant d'augmenter le pouvoir grossissant.
Il permettant l'observation, en donnant une image très agrandie, d'objets, en général
transparent, dont les dimensions sont trop petites pour que l'œil puisse les distinguer
directement.
Illustrations en
microscopie
optique des tricots
obtenus à partir de
monofilaments


Par es Rôles
Oculaire Permet d'observer l'objet et produit un grossissement ini al.
Tube oculaire Supporte l'oculaire.
Potence Supporte le microscope.
Pied Assure la stabilité du microscope.
Tourelle (Revolver porte-

Supporte les objec fs: permet de tourner pour choisir le bon objec f.
objectifs)
Objec fs Perme ent d'agrandir l'image.
Pla ne Soutient la lame.
Valets Maintiennent en place la lame sur la platine.

Lumière (lampe)
Illumine l'objet à observer.
Vis macrométrique
Permet de faire une mise au point grossière de l'objet à observer.
Vis micrométrique
Permet de faire une mise au point fianle de l'objet à observer.
Diaphragme Contrôle la quantité de lumière illuminant l'objet.

L ’objectif
Les objectifs sont les éléments les plus critiques d'un microscope. Ils déterminent sa
qualité optique.

L ’oculaire
• C ’est une lentille convergente de plus grande focale
(quelques cm)
• Il sert de loupe en grossissant l ’image intermédiaire
donnée par l ’objectif
12/02/2021 Pr. M. BELBAHLOUL LST-CAE

1. Principe de fonctionnement :
- placer le microscope près du bord de la table ou de la paillasse, afin de pouvoir observer
aisément ;
- remonter entièrement le tube optique afin d'éloigner au maximum les objectifs de
la platine ;
- allumer et régler la lumière pour obtenir une lumière homogène à travers l'oculaire ;
- tourner la tourelle porte-objectifs et ajuster dans l'axe du tube optique le plus faible des
objectifs ;
- déposer la préparation microscopique (lame mince) au centre de la platine, en la fixant à
l'aide des valets.
- rapprocher l'objectif de la préparation (sans la toucher) à l'aide du bouton
macrométrique, sans regarder dans l'oculaire ;

1. Principe de fonctionnement :
- regarder dans l'oculaire et tourner le bouton macrométrique jusqu'à l'obtention d'une image
- ajuster ensuite la netteté à l'aide du bouton micrométrique ;
- affiner l'éclairage en ouvrant ou en fermant le diaphragme.
- explorer l'ensemble de la préparation et choisir une zone favorable à l'observation ;
- centrer la zone choisie dans le champ d'observation ;
- lorsque le grossissement s'avère insuffisant, passer à un objectif plus fort. Tourner alors
doucement la tourelle porte-objectifs ;
Attention, l'extrémité de l'objectif est très proche de la préparation et risque de briser la
lame mince en cas de manipulation violente ;
- régler finement la netteté de l'image avec le bouton micrométrique ;
- observer et dessiner/……????!
La microscopie optique est utilisée généralement dans beaucoup de champs de recherche
comprenant :
biologie microbiologie neurone
Il est utilisé en microélectronique, en pétrographie pour reconnaître les roches,

en métallurgie pour examiner la structure d'un métal ou d'un alliage.

QUELQUES CONSEILS EN CAS DE DIFFICULTÉ D’UTILISATION DU M.O. :
Si je ne vois rien, je vérifie :

l’éclairage, la lampe est-elle allumée, le microscope est il branché ?
l’emplacement de la lame sur la platine
je recommence les réglages à zéro
Si ce que je vois, ne me satisfait pas ou que je « perds » la zone à observer :
je recommence les réglages à zéro

Préparation d’échantillons
Nous pouvons voir la vraie structure des matériaux uniquement si on examine les échantillons
correctement préparés. Habituellement, il est nécessaire de couper les échantillons puisque le
microscope n’est pas conçu pour travailler avec des gros objets et la préparation des gros
échantillons est extrêmement difficile.
A- matériaux solides
Les échantillons peuvent être préparés par une des méthodes suivantes :
broyage et polissage mécanique, polissage électrolytique, polissage chimique
B- matériaux pulvérulents
Coupe de grains de poudre:

• imprégnation de la résine sous vide
• polissage doux des échantillons pour éviter les arrachements

Des termes différents pour des utilisations différentes
1- Agrandissement (ou grandissement)

L’agrandissement est le rapport entre la taille du dessin d’observation réalisé et la taille
réelle de l’objet. Il est noté sous la forme « × n », avec n la valeur de ce rapport.
Taille du dessin
Agrandissement =
Taille réel
L’échelle est une indication de la correspondance entre
la taille du dessin et la taille réelle de l’objet. L’échelle
est donc une manière différente de noter
l’agrandissement. On peut représenter une échelle de
deux manières :
littérale : « Y cm → Z mm » (avec Y une longueur sur le
dessin, Z la longueur réelle correspondante) ;
graphique : une barre présente sur le dessin indique
une taille précisée.
Une coupe de tige de rayon 3 millimètres est
dessinée sous la forme d’un dessin où cette tige
fait 15 centimètres de rayon.
5 cm → 1 mm ou 10 cm → 2 mm ou 1 cm → 15 cm → 3 mm
5/3 mm, etc. ou une représentation graphique.
Calcul de champs de vision
Ou diamètre du champ oculaire des microscopes utilisés
Une méthode simple consiste au plus faible grossissement à observer

un morceau de papier millimétré
- Dans cet exemple, le diamètre du champ oculaire est de 4 mm et cette observation est
faite à un grossissement x40.
- On peut alors grâce à cette seule observation calculer le diamètre du champ oculaire du
microscope aux différents grossissements qu'ils présentent (voir tableau ci-dessous)

Exemple
un objet qui remplit la moitié du champ d’un microscope à × 400 mesure environ
0,1 mm ; s’il mesure 10 mm sur la représentation, celle ci est donc agrandie X fois.
X = 10/0,1 = ×100

Des termes différents pour des utilisations différentes
2- Grossissement
Le grossissement indique le grossissement de l’appareil optique (microscope ou loupe)
qui a permis de réaliser l’observation et donc le dessin. Il est obtenu en multipliant les
grossissements des éléments de l’appareil optique (objectif, oculaire, etc.). Il est noté
sous la forme « × n », avec n le grossissement utilisé.
Les exemples présentés ci-dessus démontrent bien la

nécessité de ne pas confondre les termes de
grossissement et d’agrandissement (ou d’échelle) :
pour un dessin final identique, on peut parfaitement
faire figurer l’agrandissement (× 50 ici) ou le
grossissement utilisé (× 150).
Le grossissement étant simplement le grossissement

fournit par le microscope, il est obtenu en
multipliant les grossissements individuels des
différents éléments du microscope. Ceux-ci sont
notés sur les éléments optiques.
Exemple 2
450X

La résolution du microscope
Résolution (d) : La résolution d'un microscope désigne sa capacité à séparer des détails très
voisins. C’est la plus petite distance séparant deux objets que l'on peut distinguer à l'aide du
microscope: elle dépend de la qualité des lentilles et de la nature même de la lumière.
d=0,61 λ / n sin θ
Avec:
λ = longueur d’onde
d = distance minimale entre 2 points
n sin θ = Ouverture Numérique (ON)
n = indice de réfraction du milieu entre l’objet et la lentille de l’objectif
θ = ouverture angulaire
Deux objets très proches du

fait de ce phénomène vont
se superposer rendant leur
distinction difficile.
On considérera deux images distinctes si la distance entre les centres est supérieure à la
demi-largeur de la tâche d’Airy.
La résolution d’un microscope est d’autant plus importante que est faible, c’est-à-
dire que l’ouverture numérique ( ) est grande et que la longueur d’onde du faisceau
lumineux est petite .
En microscopie optique classique (n ~ 1,5, sin θ ~ 0,87, λ ~ 600nm), la résolution usuelle est
l'ordre de d ~ 0,28 µm. Comme en pratique l'ouverture numérique ne peut pas être augmentée
au-delà de 1,5 et que la plus petite longueur d'onde visible est proche de λ ~400nm (violet), la
résolution des microscopes optiques ne peut pas descendre en dessous de d ~ 0,16 µm.
Alors Microscopie optique d ~ 0,2 µm

Résumé:
pour obtenir les meilleures résolutions, il est intéressant de travailler dans un milieu objet
d'indice supérieur à 1, comme l'eau (n ≈ 1,33) ou surtout l'huile d'immersion (huile de
cèdre ou huile synthétique, n ≈ 1,52), afin de pouvoir utiliser des ouvertures numériques
supérieures à 1.
Ainsi les objectifs de plus fort grandissement (×100) sont en général des objectifs à
immersion (dans l'huile) dont les ouvertures numériques dépassent couramment 1,25.
Grossissement limite : Le plus grand grossissement que puisse produire un instrument est
limité par la relation suivante:
Pouvoir de résolution de l’œil

Grossissement limite =
Pouvoir de résolution du microscope
Exemple :
pour un microscope optique, avec un pouvoir de résolution d’approximativement 0,25µm,
le grossissement limite est de :
250 µm/0,25µm = 1000X
La valeur de 250µm pour le pouvoir résolutif de l’œil correspond à des conditions de vue
moyenne.

Remarque:
Pour voir un objet de taille « d » il faut un rayonnement dont la longueur d’onde associée
λ est telle que : λ< d
Pour observer la structure de la matière à l’échelle atomique il faut donc un rayonnement

tel que λ≈0,1 nm
•Rayonnement électromagnétique avec λ≈0,1 nm : rayons X
•Problème : on ne sait pas faire de microscope à rayons X

La longue “histoire” de l’atome
Faraday Bohr
Cohen-
Aristote Dalton Tannoudji
Démocrite Lavoisier Thomson Schrödinger
- 400 - 340 1780 1800 1850 1880 1930 1997

1910
Naissance de la Théorie Etude du courant Modèle quantique
théorie atomique moléculaire dans les solutions de l’atome
Abandon de Découverte Technique de

l’atome ; théorie de l’électron refroidissement
des 4 éléments - Mise en évidence du des atomes
noyau (Rutherfod)
(Re)naissance de la - Modèle planétaire
théorie atomique (Niels Bohr)
La découverte de l’électron
1869-1875 : Crookes (anglais 1832-1919) découvre le

rayonnement cathodique. Un tube de verre contenant un
gaz sous très faible pression comporte deux électrodes
entre lesquelles on applique une tension de 50 kV ; on
observe un rayonnement issu de la cathode, responsable
d'une faible lueur verdatre (fluorescence de la paroi
interne du verre).
1896 : Thomson (anglais; 1856-1940) prouve

expérimentalement l'existence des électrons. Il
mesure le rapport e/m en déviant des rayons
cathodiques grâce à des champs électrique ou
magnétique.
En 1923, le Prince Louis-Victor de
Broglie a une idée géniale !
L’idée géniale est la suivante:

• Puisque les ondes électromagnétiques peuvent être considérées
comme des corpuscules qui interagissent avec la matière… Pourquoi
la réciproque ne serait-elle pas vraie !!!
• Louis-Victor de Broglie propose d’associer à toute particule de
matière une onde dont la longueur l est définie par :
• En fait, la particule est associée à l = h / (m v)

un groupe (ou paquet) d’ondes
dont le maximum d’amplitude se
déplace à la vitesse de la particule !
Réf. : Physique tome 3 de A. Van de Vorst p. 33

Schéma du premier microscope électronique de Ruska
Deux physiciens berlinois décidaient de

se lancer dans l'aventure: le 4 juin 1931,
Max Knoll rapporte lors d'une
conférence à l'Ecole Technique de Berlin
les expériences réalisées avec son
étudiant Ernst Ruska, présentant à cette
occasion les premières images obtenues
avec un microscope à deux lentilles
fonctionnant sous une tension de
quelques milliers de volts.

Lorsque les dimensions d’un objet sont trop petites pour qu’il puisse être observé
au microscope optique (MO), l’observation par microscopie électronique à
balayage (MEB) devient nécessaire.
Un MO permet des grossissements jusqu’à × 5 000 alors que les MEB modernes
donnent la possibilité d’imager les surfaces des objets (topographie, contraste
chimique) avec des grossissements pouvant aller jusqu’à × 1 000 000.
La différence fondamentale entre ces deux instruments réside dans la source du

rayonnement émis : lumière naturelle dans le cas du MO, électrons dans le
cas du MEB.

La place du MEB parmi les autres techniques d'observation

La microscopie électronique à balayage

La Microscopie Electronique à Balayage (MEB en français ou SEM en anglais
pour Scanning Electron Microscope) est une technique de microscopie électronique
capable de produire des images en 3 dimensions de très haute résolution de l’ordre
du nanomètre de la surface d’un échantillon en utilisant le principe des interactions
électrons-matière.
Contrairement au microscope optique, l'image n'est pas formée par une lentille objectif.
L'image est formée de manière séquentielle en balayant la surface de l'échantillon par un
faisceau d'électrons. Le MEB fournit des images de la surface en relation avec le mode de
diffusion des électrons par l'échantillon.
Principe :
C’est une technique de microscopie basée sur
le principe des interactions électrons-
matières. Un faisceau d’électron balaie la
surface de l’échantillon à analyser, le faisceau
en touchant la surface de l’échantillon produit
des interactions.
Ces interactions sont :
-Les électrons secondaires S : topographies
Géométriques.
-Les électrons rétrodiffusés R: topographies
chimiques .
-Les Rayons X RX : Analyse qualitative et
quantitative .

Les électrons secondaires
Les électrons secondaires sont émis lorsque
le faisceau primaire qui a perdu une partie
de son énergie excite les atomes de
l’échantillon. Les électrons secondaires
possèdent une énergie faible (autour de 50
eV) suivant un large spectre.
Leur faible énergie est une qualité:
– Il sera possible de les dévier facilement (avec une ddp) comme le montre l’image ci dessus pour en
récupérer un grand nombre sur le détecteur et donc d’obtenir une image avec un bon rapport
signal/bruit.
– Ils ne peuvent parcourir qu’un faible trajet dans l’échantillon car ils sont très vite arrêtés et donc
proviennent d’une zone proche du faisceau ce qui donne des images avec une très bonne résolution.
Les images obtenues grâce à la détection d’électrons secondaires représentent donc essentiellement la
topographie de l’échantillon (peu de contraste de phase).
Exemple

La microscopie électronique à balayage
Image au
MEB
x 200

Les électrons rétrodiffusés
Les électrons rétrodiffusés ou back-scattered
electrons ou BSE sont des électrons du faisceau
primaire qui ont réagi de façon quasi élastique avec
les atomes de l’échantillon. Ils sont renvoyés dans
une direction proche de leur direction d’origine
avec une faible perte d’énergie.
Le détecteur d’électrons rétrodiffusés est généralement placé à la verticale de l’échantillon

dans l’axe du faisceau (afin de récolter le maximum d’électrons rétrodiffusés) et donc la
vision du relief ne sera pas très bonne avec ce détecteur.
Par contre les éléments chimiques possédant un grand numéro atomique produisent
d’avantage d’électrons rétrodiffusés que ceux ayant un numéro atomique faible. Les zones
de l’échantillon avec numéro atomique élevé seront donc plus blanches que celles ayant un
numéro atomique faible. On appelle cela le contraste de phase. Cette particularité est
fortement appréciée pour juger de l’homogénéité chimique d’un échantillon avant par
exemple de l’analyser.
Contraste chimique

Scanning electron microscope (SEM) images of prepared anodic aluminium oxide (AAO) membranes. (A) Membrane prepared in sulfuric
acid at 24 V, pore size 41 nm. ( B) Membrane prepared in oxalic acid at 30 V, pore size 58 nm. ( C ) Membrane prepared in oxalic acid at 60
V, pore size 114 nm. (D) Membrane prepared in phosphoric acid at 130 V, pore size 300 nm.
Leur énergie (jusqu’à 30 KeV) est beaucoup plus grande que celle des électrons secondaires. Les
électrons rétrodiffusés peuvent être libérés à une plus grande profondeur dans l’échantillon. La
résolution atteinte avec les électrons rétrodiffusés sera donc relativement faible (grandissement de
l’ordre de 4000 fois maximum).
Exemple de Revêtement de nitrure de zirconium utilisé comme matériau dur et
réfractaire dans le domaine des outils de coupe pour l’usinage
l’usinage..
Coupe transverse d’un film de nitrure de zirconium (ZrN) sur substrat de silicium

Surface d'un copeau d'alliage cuivre-bérilium

APPLICATIONS
La plupart des matériaux peuvent être étudié au moyen d'un microscope électronique à
balayage.
On peut citer :
les métaux : étude de la structure d'un alliage, mise en évidence de défauts, étude de
faciès de fracture, étude de corrosion, état de surface...
les céramiques : observation et analyse de matériaux...
les textiles , le bois : identification de fibre, de substance..
des échantillons biologiques : insectes, micro-crustacés....
etc...

Microscopie Electronique en Transmission

Principe
Le microscope électronique en transmission (MET ou TEM en anglais) utilise un
faisceau d'électron à haute tension, émis par un canon à électrons.
Des lentilles électromagnétiques sont utilisées pour focaliser le faisceau d'électrons sur
l'échantillon. En traversant l'échantillon et les atomes qui le constituent, le faisceau
d'électrons produit différentes sortes de rayonnements.
En général, seuls les électrons transmis sont alors analysés par le détecteur, qui
traduit le signal en image contrastée.
Les échantillons doivent être préparés selon un protocole précis, qui doit à la fois
conserver sa structure et être conducteur pour laisser passer le faisceau d'électrons. Des
coupes très fines de l'échantillon sont réalisées à l'ultramicrotome (de 60 à
100 nanomètres). Des colorations aux métaux lourds sont également possibles pour
augmenter les contrastes de structures particulières des échantillons, préalablement
placées sur des grilles d'observation.
Si l’échantillon est
suffisamment mince (< 100nm),
des e– peuvent le traverser :
• sans être déviés, sans perdre

d’énergie : e– transmis
• en étant déviés, sans perdre

d’énergie ; e– diffractés
⇒ diffusion élastique
• en étant déviés et en perdant

de l’énergie :
⇒ diffusion inélastique

Schemas et images MET
de dierents nanotubes de
carbone. (a) et (b) : tubes
monoparois. (c) et (d) :
tubes coudes dûs à des
defauts pentagonaux et
heptagonaux.


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12/02/2021 Pr. M. BELBAHLOUL LST-CAE 4

12/02/2021 Pr. M. BELBAHLOUL LST-CAE 5

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Oculaire Permet d'observer l'objet et produit un grossissement ini al.

Tube oculaire Supporte l'oculaire.

Potence Supporte le microscope.

Pied Assure la stabilité du microscope.

Tourelle (Revolver porte-

Objec fs Perme ent d'agrandir l'image.

Pla ne Soutient la lame.

Valets Maintiennent en place la lame sur la platine.

Diaphragme Contrôle la quantité de lumière illuminant l'objet.

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12/02/2021 Pr. M. BELBAHLOUL LST-CAE

- remonter entièrement le tube optique afin d'éloigner au maximum les objectifs de

- déposer la préparation microscopique (lame mince) au centre de la platine, en la fixant à

l'aide des valets.

- rapprocher l'objectif de la préparation (sans la toucher) à l'aide du bouton

macrométrique, sans regarder dans l'oculaire ;

- ajuster ensuite la netteté à l'aide du bouton micrométrique ;

- affiner l'éclairage en ouvrant ou en fermant le diaphragme.

- explorer l'ensemble de la préparation et choisir une zone favorable à l'observation ;

- centrer la zone choisie dans le champ d'observation ;

doucement la tourelle porte-objectifs ;

Attention, l'extrémité de l'objectif est très proche de la préparation et risque de briser la

lame mince en cas de manipulation violente ;

- régler finement la netteté de l'image avec le bouton micrométrique ;

biologie microbiologie neurone

Il est utilisé en microélectronique, en pétrographie pour reconnaître les roches,

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Si je ne vois rien, je vérifie :

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Coupe de grains de poudre:

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1- Agrandissement (ou grandissement)

Une méthode simple consiste au plus faible grossissement à observer

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Les exemples présentés ci-dessus démontrent bien la

Le grossissement étant simplement le grossissement

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Deux objets très proches du

12/02/2021 Pr. M. BELBAHLOUL LST-CAE

Pouvoir de résolution de l’œil

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Pour observer la structure de la matière à l’échelle atomique il faut donc un rayonnement

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- 400 - 340 1780 1800 1850 1880 1930 1997

Abandon de Découverte Technique de

1869-1875 : Crookes (anglais 1832-1919) découvre le

1896 : Thomson (anglais; 1856-1940) prouve

L’idée géniale est la suivante:

• En fait, la particule est associée à l = h / (m v)

Réf. : Physique tome 3 de A. Van de Vorst p. 33

Deux physiciens berlinois décidaient de

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La différence fondamentale entre ces deux instruments réside dans la source du

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