Master de biotechnologie et santé

Bioreconnaissance et méthodes de détection

Classifications des biocapteurs

Dr. Ahlem Teniou

Année universitaire 2023-2024

 Les biocapteurs
Dispositif analytique qui transforme une information biologique en
un signal mesurable.
Un élément biologique lié à un transducteur physique.

Sensible

Reproductible biocapteur Stable

Sélectif
 Reconnaissance moléculaire

Processus
Processusdedeliaison
liaisonentre
entreune
unemolécule
moléculeetetsasacible,
cible,autrement
autrementdit:
dit:
récepteur
récepteur-ligand
-ligand

Liaisons H
 Liaison: Interactions
•Spécifique électrostatique
Interactions s
•Forte affinité hydrophobe
•Liaisons non covalentes, s Forces de
Van der
faibles et réversibles Interactions Waals
π–π
 Classifications des Biocapteurs
Bio-récepteurs Transducteurs
Enzyme Optique

Anticorps Electrochimique

Peptide Massique

Polymère à empreinte
Thermométrique
moléculaire

Micro-organisme

Acide nucléique

Aptamère
 Biorécepteur

Catalyse Affinité Hybridation

Transducteur

•Oxydoréductases
•Hydrolases
•Transférase
Les enzymes: Biorécepteurs métaboliques/
catalytiques:

•Catalyser des réactions biologiques dans lesquelles un substrat est

transformé en produit;
•Forte activité à des faibles concentrations.
Reconnaissance enzyme-substrat
Site actif

• Une poche ou sillon formé par le rapprochement d’a.a

initialement éloignés dans la chaîne polypeptidique
•Double role: site de reconnaissance et un site
catalytique
•Liaisons non covalentes: interactions de Van der Waals,
liaisons hydrogènes, hydrophobes ou électrostatiques
• La présence de cofacteurs ou co-enzymes est parfois
indispensable.
Reconnaissance enzyme-substrat
Co-facteurs/Co-enzymes
• Interagir avec l’enzyme pour retrouve son état initial et amorcer un
nouveau cycle catalytique.
•Accepteur et/ou de donneur d’électrons et de protons.
•Cofacteurs: ions métaliques
- Oxydase: Cu2+
- ADN polymerase : Mg2+
•Co-enzymes: organiques
- Facteur de croissance: ATP, NADP……
- Vitamine (tous les vitamine sauf C et A)
 Immobilisation des enzymes
Adsorption Greffage Covalent
NH2, COOH, thiol, hydroxyles

Réticulation Encapsulation
Ex: Glutaraldéhyde et BSA Sol-gel, gel de silice, polymères
(acrylamide), pâte de carbone
 Immobilisation des enzymes
Streptavidine: proteine microbienne caractérisée par sa forte affinité pour la
biotine.

Biotine: vitamine se fixant à la stréptavidine de manière non-covalente mais

avec une forte affinité.
 Immobilisation des enzymes
Ce qu’il faut considérer…

• Préserver la stabilité
• Protéger le site actif des réactifs utilisés
• Le lavage ne détruit pas l’enzyme
Principe des biocapteurs
enzymatiques
• La réaction est contrôlée par la conversion du substrat et la diffusion
du produit.
• La réponse du biocapteur est déterminée soit par la concentration
du produit généré ou bien la quantité su substrat utilisé.
• Il y a aussi des enzymes qui sont utilisé  elles sont inhiber par
certains cible.
Enzymes: Autres applications dans
les biocapteurs
• Marqueurs (Marquage des Acs et génération du
signal)
 Nanozyme
- Métal / un oxyde métallique/ Combinaison.
- Mimant l’activité biologique des enzymes de façon
synergétique.
Les anticorps: biorécepteurs non
enzymatiques
 Propriétés de reconnaissance
• Flexibilité structurale et stabilité
• Complémentarité de formes
• Interactions non covalentes et réversibles
• Affinité
 Affinité Ag-AC
• Force de liaison d’une molécule avec son ligand
• Variable selon les conditions
• Constante d’équilibre KD
• Dépend de deux constantes: Ka et Kd ou Kon et Koff
• Koff/Kon
 Marquage des anticorps

•Isotope radioactif
•Enzymes
•Fluorophores
•Biotine-streptavidine

 Anticorps
secondaire

 Sans marquage
 HRP (peroxidase de Raifort)

Chimiluminescence

hydroquinone benzoquinone

Electrochimie Colorimétrie
Immunodiagnostic: différentes technologies
1. Immunoprécipitation

Centrifuga
Billes- tion
prot
A/G*

2. Les radio-immunoessais
Compétition entre les deux
La cible radio-marquée protéines
Ajouter
l’échantillo
n
 3. Les immunoessais enzymatiques
les essais en sandwich

•AC primaire immobilisé

•AC secondaire marqué
•Signal proportionnel à la
concentration de l’analyte
 3. Les immunoessais enzymatiques
les essais Indirecte

•Ag immobilisé
•L’AC recherché est fixé
•AC secondaire marqué
•Signal proportionnel à la
concentration de l’analyte
 3. Les immunoessais enzymatiques
les essais compétitifs

•AC immobilisé
•Compétition entre Ag libre et
Ag marqué
•Signal inversement
proportionnel à la
concentration de l’analyte
Immunodiagnostic: différentes technolog
3. Les immunoessais enzymatiques
les essais compétitifs

•Essai compétitif indirect

•Ag (fixe) immobilisé
•Compétition entre Ag libre et
Ag immobilisé
•Signal inversement
proportionnel à la
concentration de l’analyte
 Immobilisation des anticorps

Anticorps Protéine inerte

 Immobilisation des anticorps
Nouvelles méthodes de covalence

• Surfaces fonctionnalisées par le diazonium

• SAMs (Self Assembled Monolayers)
• Surface modifiée par des nanomatériaux
Fonctionnaliser la surface de transduction par
des sels de diazonium
• Réduction électrochimique du diazonium sur
le transducteur
• Libération spontanée de l’azote
• Electro-greffage du diazonium
• Formation d’une monocouche uniforme et
stable
Exemple
Exemple: immunocapteur pour la détection de
BNP (B-type natriuretic peptide)
  SAMs
•Formation de
monocouches stables
pour
l’immobilisation de
biomolecules

•Autoassemblage
d’alcanethiols sur les
métaux nobles
Exemple: immunocapteur pour la détection de
E.coli
Les aptamères: Anticorps
synthétiques
Bio-récepteur synthétique;

Séquence d’ADN ou d’ARN;

Haute affinité et spécificité;

Sélection in-vitro SELEX.

 Synthèse des aptamères La technologie du SELEX

Forme

Séquence

Systematic Evolution of Ligands by EXponential

enrichment
 Structure des aptamères
Structure primaire
ADN simple brin
ou de l’ARN
 Structure des aptamères
Structure secondaire-les motifs structurau

Lorsqu’un acide nucléique simple brin se replie sur lui-même,

une structure plus stable est adoptée.
Elle est formé d’une combinaison de motifs structuraux

•La double hélice

•La tige-boucle
•Le pseudo-nœud
•Tétrades de G
Les motifs structuraux La double hélice
 Les motifs structuraux
La tige-boucle ou épingle à
cheveux
•Une tige stabilisée par des
paires Watson-crick, et
interrompue par des boucles.

•La boucle forme une « poche »

dans laquelle la cible s’adapte
partiellement ou complètement.

Épingle à
Tige-boucle
cheveux
 Les motifs structuraux
Le pseudo-noeud

•Les nucléotides de la boucle

s’apparient avec une autre
région du brin à l’extérieur
de la
tige
 Les motifs structuraux
Les tétrades de G

•Des tétrades empilées et

connectées par des boucles
latérales
•4 guanines organisés en
configuration planaire carrée
 Immobilisation des aptamères
 Immobilisation en 5’ ou 3’

SAM-Electrode d’or AuNPs-Electrode d’or

Greffage covalent Biocoating Immobilisation via le cDNA

 Les différentes technologies de diagnos
base d’aptamères
 Essais traditionnels basés sur la simple liaison avec la cible

Non compétitifs

Compétitifs
Les différentes technologies de
diagnostic à base d’aptamères

Association

Configuration
Dissociation

Essais à base
Conformation
d’aptamères
Conductivité
Essais basés sur le changement de
configuration
•cDNA marqué par un quencher
•Aptamère marqué par un
fluorophore
•En présence de la cible,
cDNA-Q est Structure switching aptamer design
libéré
•La fluorescence
augmente
•Aptamère immobilisé sur l’oxyde de
graphène (bloque la fluorescence)
•En présence de la cible, l’aptamère
est désorbé
•La fluorescence augmente
 Essais basés sur le changement de
conformation
•5’-quencher-aptamère-fluorophore-3’

•En présence de la cible, l’aptamère se

replie

•La distance Q-F et le signal diminuent

Essai fluorescent basé sur le changement de
conformation

•Aptamère non replié + AuNPs stables

de couleur rouge

•En présence de la cible, l’aptamère se

replie

•Aggrégation des particules (couleur Essai Colorimétrique basé sur le changement

bleue) de conformation
 Essais basés sur la variation de
conductivité

•Le complexe aptamère cible

bloque le transfert d’électrons

•La résistance est

proportionnelle à
al concentration de la cible
 Les DNAzymes
Des aptamères catalytiques
•Acides nucléiques qui catalysent une réaction chimique

•Les séquences riches en G se lient avec l’hémine avec une forte

affinité et se replient en Tétrades de G.

•Le complexe (Hémine-Tétrades de G) mime l’activité de la peroxidase

HRP en générant un signal colorimétrique
•Porphyrine: molécule
cyclique impliquée dans
le transport de
l’oxygène.
•Ion ferrique (Fe 3+) et
un chlorure
Hémine
 Exemple d’un essai à base d’aptamère et de DNAzyme
 Possibilité de régénération
• Perturber l’interaction aptamère-cible sans
dégrader sa structure
 Température (Eau chaude, aptamère de l’adénosine,
40 utilisations, 90% de l’activité)
 Solution acide ou basique (NaOH, A. acétique…)
 Concentration saline élevée (2M NaCl, aptamère de
la thrombine)
 Agents dénaturants (SDS, urée…)
 Autres type de biorécepteurs
 Les microorganismes ;
 Les acides nucléiques;
 Les polymères à empreinte moléculaire (MIP),
 Les sequences peptidiques.