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THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE PARIS 6

Spcialit

Chimie Analytique
Prsente par

Mr SOLTANI Mohamed
Pour obtenir le grade de

DOCTEUR de l'UNIVERSITE PARIS 6 Sujet de thse:

Distribution lipidique et voies mtaboliques chez quatre bactries Gram-ngatives hydrocarbonoclastes. Variation en fonction de la source de carbone.

soutenue le 18 juin 2004

devant le jury compos de:

M. Jean-Claude BERTRAND M. Pierre DOUMENQ M. Jean GUEZENNEC M. Alain SALIOT M. Claude LARGEAU

Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Directeur de thse

Avant Propos

Les travaux prsents dans ce manuscrit ont t raliss au Laboratoire de Chimie Bioorganique et Organique Physique (UMR 7573) de l'Ecole Nationale Suprieure de Chimie de Paris. Je tiens exprimer ma profonde gratitude Mr Claude Largeau pour m'avoir accueilli dans son laboratoire et d'avoir accept de diriger mon travail de recherche.

Au cours de ces annes de thse j'tais encadr par Monsieur Pierre Metzger, Ingnieur de recherche au CNRS. Qu'il trouve ici l'expression de ma plus vive gratitude pour ses conseils scientifiques, sa disponibilit et pour l'amlioration de la rdaction de ce rapport.

Je remercie vivement Monsieur le Professeur Alain Saliot, Monsieur le Professeur JeanClaude Bertrand, Monsieur le Professeur Pierre Doumenq et Monsieur Jean Guezennec d'avoir accept de juger ce travail.

J'exprime toute ma reconnaissance toutes les personnes qui un moment ou un autre, se sont intresses mes recherches. Parmi celles-ci je cite notamment tout le personnel du Laboratoire de Chimie Bioorganique et Organique Physique l'ENSCP: Batrice Allard, Odile Largeau, Yves Pouet, Jolle Templier et Sylvie Derenne; du Laboratoire d'Ocanographie de Marseille, particulirement Monique Acquaviva qui m'a initi aux cultures des bactries sur hydrocarbures.

Enfin, un grand merci tous mes collgues du Laboratoire de Chimie Bioorganique et Organique physique l'ENSCP pour l'ambiance sympathique qu'ils ont su crer tout au long de ces annes de thse.

toute ma famille Anne-lise tous mes amis

SOMMAIRE
INTRODUCTION GENERALE.11

CHAPITRE I

Rappels bibliographiques
I. POLLUTION DE LENVIRONNEMENT MARIN PAR LES HYDROCARBURES..14 I.1. INTRODUCTION14 I.2. FORMULES CHIMIQUES DES HYDROCARBURES DE DIFFERENTES SOURCES DANS LES ENVIRONNEMENTS MARINS...16 I.2.1. Les composs ptroliers17 I.2.1.1. Les hydrocarbures saturs..17 I.2.1.2. Les hydrocarbures aromatiques..18 I.2.1.3. Les composs polaires.....18 I.2.1.4. Les asphaltnes18 I.2.2. Les hydrocarbures biognes.....20 I.2.2.1. Les hydrocarbures aliphatiques saturs.20 I.2.2.2. Les hydrocarbures aliphatiques insaturs.21 I.2.2.3. Les cycloalcanes et les cycloalcnes..21 I.2.2.4. Les hydrocarbures aromatiques21 I.3. DEVENIR DES HYDROCARBURES EN MILIEU MARIN..22 I.3.1. Facteurs abiotiques dans llimination des hydrocarbures..22 I.3.1.1. Evaporation23 I.3.1.2. Solubilisation..23 I.3.1.3. Emulsification... 23 I.3.1.4. Sdimentation 23 I.3.1.5. Photo-oxydation. 23 I.3.1.6. Biodgradation23 I.3.2. Pntration des hydrocarbures dans la chane alimentaire. 24 II. BIODEGRADATION AEROBIE DES HYDROCARBURES PAR LES MICROORGANISMES..... 25 II.1. INTRODUCTION. 25

II.2. PROCESSUS DOXYDATION DES HYDROCARBURES.. 26 II.2.1. Voies mtaboliques de la dgradation des hydrocarbures aliphatiques.. 27 II.2.1.1. Dgradation des n-alcanes... 27 II.2.1.1.1. Loxydation monoterminale... 27 II.2.1.1.2. Oxydation des n-alcanes par le systme de dioxygnase... 29 II.2.1.1.3. Oxydation des alcanes via alcnes. 30 II.2.1.1.4. Oxydation subterminale. 30 II.2.1.1.5. Oxydation diterminale 31 II.2.1.2. Biodgradation des alcanes ramifis... 32 II.2.1.3. Biodgradation des alcnes.. 36 II.2.2. Voies mtaboliques de dgradation des hydrocarbures saturs cycliques.... 37 II.2.3. Biodgradation des hydrocarbures aromatiques. 40 II.3. FACTEURS PHYSIQUES ET CHIMIQUES AFFECTANT LA BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES. 43 II.3.1. Composition chimique des hydrocarbures... 43 II.3.2. Etat physique et concentration des hydrocarbures ou du ptrole..... 45 II.3.3. Influence de la temprature.. 46 II.3.4. Influence de loxygne.....47 II.3.5. Influences des lments nutritifs.. 48 II.3.6. Effet de la salinit et du pH.... 48 II.3.7. Effet de la pression.. 48 III. BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES DANS LES GISEMENTS DE PETROLE ET VOIES ANAEROBIES..... 50 III.1. BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES DANS LES PUITS DE PETROLE... 50 III.1. VOIES DE DEGRADATION ANAEROBIE.. 52 IV. LES LIPIDES DES BACTERIES GRAM-NEGATIVES. 55 IV.1. LES PHOSPHOLIPIDES.... 57 IV.2. LES LIPOPOLYSACCHARIDES... 58 IV.3. INFLUENCE DES PARAMETRES ENVIRONMENTAUX SUR LA COMPOSITION LIPIDIQUE DES BACTERIES GRAM-NEGATIVES.. 61 IV.3.1. Influence de la temprature sur la composition lipidique. 61 IV.3.2. Influence de la salinit sur la composition lipidique...... 62 IV.3.3. Influence de la source de carbone sur la composition lipidique 63 V. BIOMARQUEURS.... 63 V.1. NOTION DE BIOMARQUEURS. 63 V.2. BIOMARQUEURS BACTERIENS...... 65 V.2.1. Les acides gras. 66

V.2.1.1. Les acides gras saturs normaux... 67 V.2.1.2. Les acides gras insaturs68 V.2.1.3. Les acides gras ramifis. 69 V.2.1.4. Les acides gras cyclopropaniques.. 70 V.2.2. Les hydroxy acides... 71 V.2.3. Autres marqueurs bactriens.. 74 V.3. LES HYDROCARBURES.. 77

CHAPITRE II

Etude exprimentale
I. ORIGINE DES SOUCHES... 80 II. MILIEUX ET CONDITIONS DE CULTURE.. 80 II.1. COMPOSITION CHIMIQUE DES MILIEUX DE CULTURES .80 II.2. CONSEVATION DES SOUCHES. 81 II.3. CULTURE SUR HYDROCARBURES. 81 III. SYNTHESE DES HYDROCARBURES.. 82 IV. EXTRACTION DES LIPIDES DES DIFFERENTES CULTURES. 84 IV.1. ISOLEMENT DES LIPIDES FACILEMENT EXTRACTIBLES. 85 IV.2. EXTRACTION DES LIPIDES EN MILIEU BASIQUE 85 IV.3. EXTRACTION DES ACIDES LABILES EN MILIEU ACIDE.. 86

V. SYNTHESE DU DIAZOMETHANE86
VI. PREPARATION DES DERIVES DIMETHYL DISULFURES (DMDS). 87 VII. DETERMINATION DE LA POSITION DU GROUPEMENT HYDROXYLE DES HYDROXYACIDES ET DES ALCOOLs: PREPARATION DES DERIVES TRIMETHYLSILYLES... 88 VIII. FORMATION DES DERIVES N-ACYL-PYRROLIDIDES.. 88 IX. REDUCTION CATALYTIQUE DES ACIDES GRAS INSATURES.. 88 X. METHODES UTILISEES POUR L'ANALYSE DES LIPIDES..... 89 X.1. CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE.. 89 X.2. CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE PAR IMPACT ELECTRONIQUE. 89

CHAPITRE III

Biodgradation de diffrentes familles d'hydrocarbures par Marinobacter hydrocarbonoclasticus: influence sur la composition lipidique et voies mtaboliques.

I. INTRODUCTION. 92 II. CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DE M. hydrocarbonoclasticus... 93 III. HYDROCARBURES TESTES ET CULTURES 94 IV. PROTOCOLE D'EXTRACTION DES LIPIDES ET RESULTATS QUANTITATIFS. 96 V. IDENTIFICATION ET DISTRIBUTION DES LIPIDES DE M. hydrocarbonoclasticus CULTIVEE SUR ALCANES NORMAUX (C19 ET C21)... 99 V.1. IDENTIFICATION DES LIPIDES EN SPECTROMETRIE DE MASSE. 99 V.1.1. Esters mthyliques d'acides gras normaux saturs... 99 V.1.2. Drivs DMDS des esters mthyliques d'acides gras insaturs... 103 V.1.3. Drivs N-acyl pyrrolidides 105 V.1.4. Drivs TMS des alcools gras saturs et insaturs 107 V.I.5. Drivs TMS des esters mthyliques des -hydroxy acides.. 111 V.1.6. -Mthoxy acides.. 115 V.2. LIPIDES "NON LIES".. 117 V.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE 122 V.4. LIPIDES LABILES EN MILIEU ACIDE. 127 VI. CULTURE DE M. hydrocarbonoclasticus SUR HYDROCARBURES RAMIFIES 130 VI.1. IDENTIFICATION DES LIPIDES. 130 VI.2. LIPIDES "NON LIES" 132 VI.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE.. 140 VI.4. LIPIDES LABILES EN MILIEU ACIDE... 144 VI.5. CONCLUSIONS PARTIELLES SUR L'INFLUENCE DES ALCANES LINEAIRES 147 VI.5.1. Influence de la parit des alcanes sur la composition lipidique. 147 VI.5.2. Influence de la ramification des alcanes sur la composition lipidique.. 149 VI.5.3. Voies de dgradation des alcanes linaires par M. hydrocarbonoclasticus 152 VII. CULTURE DE M. hydrocarbonoclasticus SUR ALCENE: n-NONADEC-1-ENE 158

VII.1. IDENTIFICATION DES LIPIDES. 158 VII.2. LIPIDES "NON LIES".... 160 VII.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE ...164 VII.4. LIPIDES LABILES EN MILIEU ACIDE...... 164 VII.5. CONCLUSIONS PARTIELLES SUR LA DEGRADATION DU NONADEC-1-ENE. 169 VII.5.1. Influence sur la composition lipidique. 169 VII.5.2. Voies mtaboliques du n-nonadc-1-ne.. 169 VIII. CULTURES DE M. hydrocarbonoclasticus SUR CYCLOHEXYLET PHENYL-ALCANES.. 172 VIII.1. IDENTIFICATION DES LIPIDES... 172 VIII.2. LIPIDES "NON LIES".. 177 VIII.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE.... 179 VIII.4. LIPIDES LABILES EN MILIEU ACIDE.... 181 VIII.5. CONCLUSION PARTIELLE SUR LA DEGRADATION DES HYDROCARBURES CYCLIQUES PAR M. hydrocarbonoclasticus.... 188 VIII.5.1. Influence des cyclohexyl- et phnyl-alcanes sur la composition en acides gras de M. hydrocarbonoclasticus..... 188 VIII.5.2. Voies mtaboliques des cyclohexyl- et phnyl-alcanes.. 190 IX. Les hydroxy acides indicateurs de l'activit bactrienne... 180 X. CONCLUSION. 196

CHAPITRE IV Influence de la source de carbone sur la composition lipidique de bactries Gram-ngatives, Marinobacter aquaeolei, Acinetobacter calcoaceticus et Pseudomonas oleovorans. Distribution des -hydroxy acides de la membrane extrieure

I. INTRODUCTION.. 199 II. PRESENTATION DES BACTERIES ETUDIEES... 199 II.1. CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DE Marinobacter

aquaeolei.... 199
II.2. CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES D'Acinetobacter

calcoaceticus.. 200

II.3. CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DE Pseudomonas

Oleovorans.. 201
III. RESULTATS QUANTITATIfs......202 IV. IDENTIFICATION DES LIPIDES... 205 V. DISTRIBUTION DES LIPIDES DE M. AQUAEOLEI EN FONCTION DE LA SOURCE DE CARBONE ET COMPARAISONS AVEC M. hydrocarbonoclasticus. 209 V.1. RESULTATS.... 209 V.1.1. Cultures sur actate d'ammonium.. 210 V.1.1.1. Lipides "non lis"... 210 V.1.1.2. Lipides labiles en milieu basique.217 V.1.1.3. Lipides labiles en milieu acide218 V.1.2. Cultures sur n-nonadcane.. 218 V.1.2.1. Lipides "non lis"218 V.1.2.2. Lipides labiles en milieu basique.... 219 V.1.2.3. Lipides labiles en milieu acide220 V.1.3. Culture sur iso-nonadcane..221 V.1.3.1. Lipides "non lis"221 V.1.3.2. Lipides labiles en milieu basique.. 222 V.1.3.3. Lipides labiles en milieu acide... 222 V.2. DISCUSSION.. 224 V.2.1. Influence de la nature de la source de carbone sur la composition lipidique. 224 V.2.2. Variation de la composition en -hydroxy acides. 225 V.2.3. Mtabolisme des hydrocarbures. 225 VI. DISTRIBUTION DES LIPIDES D'A. calcoaceticus EN FONCTION DE LA SOURCE DE CARBONE ET COMPARAISON AVEC M. hydrocarbonoclasticus.. 226 VI.1. RESULTATS. 226 VI.1.1. Culture sur actate. 226 VI.1.1.1. Lipides "non lis" 226 VI.1.1.2. Lipides labiles en milieu basique. 230 VI.1.1.3. Lipides labiles en milieu acide. 230 VI.1.2. Culture sur n-nonadcane.. 231 VI.1.2.1. Lipides "non lis". 231 VI.1.2.2. Lipides labiles en milieu basique.. 231 VI.1.2.3. Lipides labiles en milieu acide...232 VI.1.3. Culture sur iso-nonadcane... 232 VI.1.3.1. Lipides "non lis". 232

VI.1.3.2. Lipides labiles en milieu basique.. 233 VI.1.3.3. Lipides labiles en milieu acide.. 233 VI.2. DISCUSSION. 233 VI.2.1. Influence de la nature de la source de carbone sur la composition lipidique 233 VI.2.2. Influence de la source de carbone sur la composition en alcools 234 VI.2.3. Variation de la composition en hydroxy acides 234 VI.2.4. Mtabolisme des hydrocarbures 236 VII. INFLUENCE DE LA SOURCE DE CARBONE SUR LA COMPOSITION LIPIDIQUE DE Pseudomonas oleovorans 59.11T. 236 VII.1. RESULTATS 236 VII.1.1. Culture sur actate d'ammonium 237 VII.1.1.1. Lipides "non lis" 237 VII.1.1.2. Lipides labiles en milieu basique 237 VII.1.1.3. Lipides labiles en milieu acide..237 VII.1.2. Culture sur n-octane. 243 VII.1.2.1. Lipides "non lis"... 243 VII.1.2.2. Lipides labiles en milieu basique .243 VII.1.2.3. Lipides labiles en milieu acide 243 VII.1.3. Culture sur 2-mthylheptane... .243 VII.1.3.1. Lipides "non lis"... 244 VII.1.3.2. Lipides labiles en milieu basique 244 VII.1.3.3. Lipides labiles en milieu acide 245 VII.2. DISCUSSION... 245 VII.2.1. Influence de la source de carbone sur la composition lipidique 245 VII.2.2. Variation de la composition en -hydroxy acides... 247 VII.2.3. Mtabolisme des alcanes courts par P. oleovorans. 248 VIII. CONCLUSION 249 CONCLUSION GENERALE.. 252 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 256

Annexes
ANNEXE 1: SYNTHESE DES ALCANES RAMIFIES 279 ANNEXE 2: SPECTRES DE MASSE DES HYDROCARBURES SYNTHETISES. 281

Introduction gnrale

INTRODUCTION GENERALE

L'exploitation humaine des gisements de ptrole n'a cess d'augmenter depuis le dbut du sicle dernier. L'extraction, le transport et l'utilisation de cette source d'nergie entranent des risques de pollution (accidentelle et chronique) pour l'environnement marin pouvant influencer l'quilibre cologique et parfois entrainer la destruction de l'cosystme. L'limination du ptrole de l'environnement marin ncessite l'intervention de diffrents facteurs biotiques et abiotiques. Parmi ces facteurs la biodgradation par les microorganismes et en particulier les bactries est le processus naturel le plus important dans la dpollution de l'environnement marin. En consquence, les mcanismes de dgradation des hydrocarbures ptroliers (alcanes linaires, phnylalcanes, cycloalcanes, hydrocarbures polycycliques et polyaromatiques) par les bactries marines ainsi que les paramtres pouvant influencer la biodgradation ont t largement tudis. Cependant, il apparat que trs peu d'tudes ont t entreprises sur les voies mtaboliques d'oxydation d'hydrocarbures de structures diffrentes par une mme bactrie. Si l'influence des hydrocarbures sur la composition en acides gras des bactries a t bien tudie, par contre celle sur la composition d'autres lipides, tels les hydroxy acides est encore assez mal connue.

Dans le but d'amliorer nos connaissances sur de tels composs, nous avons entrepris une tude complte de la composition lipidique de la bactrie marine Marinobacter hydrocarbonoclasticus en fonction de la nature de l'hydrocarbure (n-alcanes, iso- et antisoalcanes, phnyl- et cyclohexyl-alcanes, alcane ramifi en milieu de chane et 1-alcne) utilis comme source unique de carbone et d'nergie. Dans le but d'avoir une meilleure connaissance des lipides des bactries Gram-ngatives et en particulier de la distribution des -hydroxy acides de la membrane extrieure, la composition lipidique de trois autres espces, Marinobacter aquaeolei, Acinetobacter calcoaceticus et Pseudomonas oleovorans a t galement dtermine en fonction de la source de carbone.

Les principaux objectifs de ce travail de recherche taient donc (i) l'analyse qualitative et quantitative dtailles de la composition lipidique de quatre bactries en fonction de la source de carbone, (ii) la dtermination des voies mtaboliques mises en jeu au cours de la dgradation des hydrocarbures tests, (iii) mieux connatre la composition en -hydroxy

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acides des lipopolysaccharides des bactries Gram-ngatives et (iv) en dfinir les implications gochimiques ventuelles. Ce document comporte quatre chapitres. Le premier chapitre prsente un rappel des principales donnes bibliographiques concernant, d'une part, l'origine des hydrocarbures dans l'environnement et leurs voies mtaboliques chez les bactries, d'autre part, quelques lments relatifs la notion de biomarqueurs. L'ensemble du matriel et des mthodes utiliss pour la culture et l'tude de la composition lipidique des bactries Gram-ngatives est ensuite dcrit dans le deuxime chapitre. Le troisime chapitre est consacr l'tude de l'influence des hydrocarbures sur les lipides de la bactrie marine M. hydrocarbonoclasticus et les voies mtaboliques de dgradation de ces composs. Dans le quatrime et dernier chapitre, nous exposons et discutons l'ensemble des rsultats relatifs aux lipides de trois autres bactries Gram-ngatives, M. aquaeolei, A. calcoaceticus et P. oleovorans en fonction de la source de carbone et nous les comparons ceux de M. hydrocarbonoclasticus afin de dterminer l'influence des hydrocarbures comportant des chanes aliphatiques sur la distribution des hydroxy acides de la membrane extrieure des bactries Gram-ngatives. Une conclusion gnrale et une bibliographie compltent cette rdaction. Enfin, deux annexes, la premire dcrit la procdure de synthse des hydrocarbures ramifis utiliss pour les cultures et la deuxime rassemble les spectres de masse de tous les hydrocarbures synthtiss.

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CHAPITRE I

Rappels bibliographiques

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I. POLLUTION DE LENVIRONNEMENT MARIN PAR LES HYDROCARBURES

I.1. INTRODUCTION Le ptrole, premire source dnergie, a connu une progression ininterrompue de son extraction pendant plus dun sicle. Suite au dveloppement du transport et de lindustrie, la production mondiale na cess daugmenter pour atteindre 11 millions de tonnes par jour (11 Mt/j) en 2000 et on sattend une augmentation de la production de 1,9 % / an dans la dcennie actuelle. Des estimations de la consommation mondiale de ptrole, suggrent une augmentation de lordre de 44,7 millions de barils par jour (soit 6,4 Mt/j) entre 1999 et 2020. La consommation mondiale passera ainsi de 74,9 Mb/j (soit 10,7 Mt/j) en 1999 119,6 Mb/j (soit 17 Mt/j) en 2020. La croissance annuelle est donc estime 2,3 % / an, alors quelle ntait que de 1,6 % / an entre 1970 et 1999 (National Research Council-U.S., 2002). Le ptrole est une source de pollution des environnements marins qui peut largement influencer les quilibres cologiques et par extension les activits conomiques des rgions sinistres. "The National Research Council" a estim dans la revue "Oil in the sea: inputs, fates and effects, 2002", la quantit de ptrole introduite annuellement dans les ocans par les diverses voies 1,3 millions de tonnes / an, sachant quune tonne de ptrole peut couvrir environ une surface de 12 kilomtres carrs. Les mares noires dues des accidents ptroliers, ne reprsentent quune faible proportion du total des hydrocarbures dverss en mer chaque anne, de faon plus insidieuse, invisible mais quotidienne.

Le tableau I.1, montre les catastrophes les plus importantes ainsi que les quantits de ptrole dverses et les zones affectes, depuis 1967 (premier chouage dun ptrolier sur les ctes franaises) nos jours. La plus grande catastrophe fut celle de la tte du puits sous marin dIxtoc one, dans le golfe du Mexique o 350 000 tonnes de ptrole brut se sont dverses dans locan entre juin 1979 et fvrier 1980 (soit 3 Amoco Cadiz). Dautres sources viennent alourdir le bilan, citons lexemple de la premire guerre du Golfe, o la fin du conflit en 1991 a rvl la catastrophe des champs de puits de ptrole en flamme et le naufrage de ptroliers bombards, dversant des quantits importantes de brut. Le bilan total a t estim 800 000 tonnes dverses, 40 millions de tonnes de sols saturs de ptrole et 700 km de ctes pollues.

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Tableau I.1. Accidents ptroliers les plus importants de 1967 2002 (Kennish, 2001 modifi).
Anne 1967 1970 1976 1977 1978 1979 1979 1979 1979 1979 1979 1979 1979 1980 1980 1983 1984 1984 1985 1985 1989 1992 1993 1999 2001 2002 Nom du ptrolier Torrey Canyon Texaco Oklahoma Urquiola Grand Zenith Amoco Cadiz Ixtoc / Platform Andros Patria Betelgeuse Gino Aviles Atlantic Express Burmah Agate Independenta Irenes Serenade Juan A. Lavalleja Castello deBelver Assimi Pericles GC Neptunia Nova Exxon Valdez Aegean Sea Brear Erika Baltic Carrier Prestige Quantit de ptrole (tonne) 117 000 31 500 100 000 32 000 230 000 350 000 60 000 35 000 42 000 25 000 276 000 40 000 94 600 102 000 40 000 255 500 51 400 46 600 60 000 71 100 35 000 79 000 84 000 28 000 30 000 77 000 Zones affectes France U.S. Espagne Canada France Golf du Mexique Espagne Irlande France Mer dArabie Tobago U.S. Turkie Grece Algrie Sud Afrique Oman Qatar Iran Iran Alaska France / Espagne Norvge / Scotland France Mer Baltiqus France / Espagne

Les hydrocarbures ptroliers qui arrivent dans lenvironnement marin peuvent avoir quatre origines majeures: les sources gochimiques, lextraction de ptrole, le transport et la consommation. La part des sources gochimiques dues des fuites naturelles qui apparaissent au fond des ocans slve 47 %. Les 53 % restant se rpartissent ainsi: 38 % proviennent des rejets suite la consommation (exemple: rejets dindustries bases terre et des grandes agglomrations urbaines), 12 % sont dus au transport et 3 % la production ptrolire offshore (Figure I.1).

Il faut enfin signaler quune quantit non ngligeable dhydrocarbures peut provenir de lactivit de nombreux microorganismes et des plantes (Albro, 1976; Bachofen, 1982; Saliot, 1981).

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Production 3% Transport 12 %

Sources Gochimiques 47 % Consommation 38 %

Figure I.1. Les diffrentes sources ptrolires responsables de la pollution de lenvironnement marin (National Research Council, 2002).

Les impacts de la pollution par les hydrocarbures sont multiples. Les aspects les plus vidents sont les grandes catastrophes trs mdiatises comme les mares noires: forte mortalit de la faune aquatique, bords de mer englus,. Il ne faut pas ngliger les consquences conomiques de ces vnements pour les riverains vivant de la pche ou du tourisme ainsi que pour les collectivits territoriales et ltat. Mais les effets court terme comme trs long terme sur les cosystmes terrestres et aquatiques sont mal connus.

I.2.

FORMULES

CHIMIQUES

DES

HYDROCARBURES DE DIFFERENTES

SOURCES DANS LES ENVIRONNEMENTS MARINS

Les hydrocarbures dans lenvironnement marin peuvent avoir trois origines principales: Les rejets industriels et urbains, sources dhydrocarbures ptroliers ou pyrolytiques. Les vgtaux aquatiques (phytoplancton, macrophytes) et organismes

htrotrophiques (zooplancton, bacterioplancton). Les vgtaux suprieurs terrestres via la matire organique dtrique des sols, rsultant du drainage des bassins versants.

Notons que la premire origine est anthropique, alors que les deux dernires sont biogniques, donc issues de la biosynthse rcente.

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I.2.1. Les composs ptroliers

Les ptroles bruts sont constitus de diffrentes familles des composs (Figure I.2.) dont la composition chimique varie normment selon leur origine gographique et gologique (Tissot et Welte, 1984). Les hydrocarbures constituent la fraction la plus importante d'un brut ptrolier, ils reprsentent entre 65 et 95 % de la plupart des ptroles bruts. Les composs ptroliers peuvent tre classs en quatre familles principales qui sont prsentes en proportions variables selon lorigine: les hydrocarbures saturs (30 70 %), les hydrocarbures aromatiques et polyaromatiques (20 40 %), les composs polaires (5 25 %) et les asphaltnes (0 10 %). Les produits ptroliers sont aussi introduits dans lenvironnement marin sous forme de produits raffins: carburants et huiles, leurs compositions dpendent de lorigine du ptrole et des oprations subies au cours du raffinage. On dnombre environ 230 composants pour lessence et de lordre de 2000 pour un fuel lourd.

I.2.1.1. Les hydrocarbures saturs

Parmi lesquels, on distingue * Les alcanes linaires (n-alcanes, CnH2n+2), dont la longueur de chane varie de 7 40 atomes de carbone, constituent une des classes les plus abondantes (10 40 % des hydrocarbures totaux d'un brut ptrolier). * Les alcanes ramifis: les plus abondants sont les iso-alcanes (groupement mthyle en position 2), les autres composs ramifis antiso (groupement mthyle en position 3) ou polyramifis tels que les isoprnodes (exemple: pristane, phytane) sont beaucoup moins nombreux. Ces composs se trouvent dans le ptrole brut dans des proportions sensiblement gales celles des n-alcanes. Par contre le ptrole brut dorigine fossile ne contient en gnral pas dalcnes. * Les cycloalcanes: renferment des composs cycliques ( 5 ou 6 atomes de carbone) saturs et le plus souvent substitus. Quelques drivs polycycliques sont aussi prsents et certains dentre eux tels les stranes et les triterpanes sont caractristiques dun ptrole brut. Cette famille peut reprsenter entre 30 et 50 % des hydrocarbures totaux dun ptrole brut.

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I.2.1.2. Les hydrocarbures aromatiques

Plusieurs familles d'hydrocarbures aromatiques et polyaromatiques dont le nombre de noyaux varie de 2 6 sont prsents dans les ptroles bruts. Ces composs sont domins par des composs mono-, di- et tri-aromatiques (Neff, 1979). En gnral, les hydrocarbures aromatiques sont moins abondants que les alcanes, et ne reprsentent que 10 30 % des hydrocarbures totaux d'un brut ptrolier. Les composs alkyls sont, la plupart du temps, plus abondants que les molcules parentales dont ils drivent. Certains cycles aromatiques peuvent tre associs des noyaux (cycle 5 ou 6 atomes de carbone) saturs (naphtoaromatiques).

I.2.1.3. Les composs polaires

Cette fraction correspond des molcules htrocycliques, telles que: des composs oxygns: phnols, acides carboxyliques, alcools, aldhydes, des composs soufrs: mercaptans, sulfures, disulfures, des composs azots: pyridines, quinolines,

Les drivs soufrs sont dans la plupart des cas plus abondants que les composs oxygns ou azots.

I.2.1.4. Les asphaltnes

Les asphaltnes correspondent une classe de composs de hauts poids molculaires, insolubles dans le pentane ou lhexane. La structure de ces composs est mal connue du fait, dune part de leur composition chimique complexe ( base de cycles aromatiques condenss, de naphto-aromatiques, de ramifications et dhtroatomes (O, N, S), dautre part de mthodes analytiques difficilement utilisables.

Les mtaux sont galement prsents mais ltat de traces. Les plus abondants sont le vanadium et le nickel, mais du fer, du sodium, du cuivre et de luranium ont galement t dtects.

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Aromatiques
n-heptadecane (n-C17) Tetramethyl-2,6,10,14pentadecane (pristane)

n-alcanes Alcanes chaines ramifies

Benzenes

Phenanthrene

Alcnes
Tetramethyl-2,6,10,14hexadecane (phytane)

Naphtalenes

Pyrene

PETROLE BRUT

Cycloalcanes

Chrysene

Fluoranrhene Cyclopentanes

Benzopyrene-3,4

Cyclohexanes

Perylene

Composs azots
N N

Composs oxygns
R - OH Alcools
OH

Composs soufrs
R - SH Mercaptans
S

Asphaltnes
Pyridine
N N

Porphyrines
Quinoline R - CHO Aldehydes Phenol
O

Thiophne
S

Mtaux
Pyrrole Carbazole

R-S-R Sulfures R - COOH Acides

Dibenzothiophne Furanne

R-S-S-R Disulfures

Figure I.2. Composs hydrocarbons et non hydrocarbons prsents dans le ptrole brut.

19

I.2.2. Les hydrocarbures biognes

Les organismes vivants biosynthtisent des hydrocarbures aliphatiques, aromatiques et polyaromatiques condenss. Le dveloppement des techniques analytiques

(chromatographiques et spectroscopiques) a dmontr la complexit de ces composs prsents en faibles quantits dans les colonnes deau et les sdiments. En effet, la biosynthse et les mcanismes de transformations (dissolution, vaporation, photo-oxydation, adsorptiondesorption sur des particules, transformations biologiques, ) conduisent un mlange de composs dont la spcificit dpend des organismes producteurs et des conditions physicochimiques du milieu. Ainsi, la stabilit de ces composs a fait deux des marqueurs biologiques et gochimiques dune trs grande valeur. Plusieurs travaux de recherche se sont intresss la distribution et labondance des hydrocarbures dans les environnements marins, ce qui permet dvaluer les niveaux de pollution, destimer une ventuelle augmentation en concentration suite aux phnomnes de transport et aux activits industrielles et de prdire les effets des hydrocarbures anthropogniques sur les processus physiques, chimiques et biologiques (Saliot, 1981).

I.2.2.1. Les hydrocarbures aliphatiques saturs

* Les alcanes linaires (n-alcanes): Les n-alcanes sont des constituants prdominants dans la distribution des hydrocarbures dans lenvironnement marin. Les espces phytoplanctoniques et les macro-algues synthtisent des n-alcanes dont les longueurs de chanes varient respectivement de n-C14 n-C32 et de n-C20 n-C30 (Saliot, 1981), avec un maximum n-C15 ou n-C17 (Blumer et al. 1971; Gelpi et al., 1970; Clark et Blumer, 1967; Youngblood et al., 1971). Une distribution des n-alcanes sans prdominance paire / impaire a t observe chez les bactries (C13 C31) et les plantes infrieures terrestres (C15 C23) avec un maximum dans la zone de C17 C20 pour les bactries (Han and Calvin, 1969; Oro et al., 1967). Cependant, les plantes suprieures synthtisent des n-alcanes de haut poids molculaire (C23 C33) prdominance impaire. * Les alcanes ramifis: Les hydrocarbures isoprniques sont les plus frquents dans lenvironnement marin et ils prsentent plusieurs origines (Saliot, 1981). Le pristane (2,6,10,1420

tetramthylpentadcane) a t identifi en faible quantit chez les phytoplanctons, chez les macro-algues, les zooplanctons et pourrait tre lhydrocarbure majeur chez certaines bactries anarobies. Han et Clavin (1969), ont identifi le phytane (2,6,10,14-tetramethylhexadecane) en faibles concentrations chez des bactries, qui a t aussi identifi chez des micro-algues (Volkman et al., 1980). On trouve galement dautres composs comme le 7-mthylheptadcane et 8mthylheptadcane, identifis chez les micro-algues. Ces alcanes portant une ramification mthyle sont absents chez les autres organismes et en particulier les bactries. Ces dernires sont caractrises par des hydrocarbures courtes chanes, avec une prdominance marque de composs nombre impair datomes de carbone et surtout ramifis en position iso et antiso (Kolattukudy, 1976). Dautres sources peuvent tre galement lorigine des hydrocarbures ramifis notamment les plantes dont les iso-alcanes pourraient constituer dans certains cas plus de 50 % des hydrocarbures totaux (Eglinton et al., 1962; Saliot, 1981).

I.2.2.2. Les hydrocarbures aliphatiques insaturs Les organismes marins synthtisent un grand nombre dolfines chanes droites, possdant jusqu' six doubles liaisons, o prdominent les composs suivants (Saliot, 1981; Volkman et al., 1980, 1981): n-C17:1, n-C18:1, n-C19:1, n-C21:5 et n-C21:6 chez les micro-algues. n-C17:1, n-C19:5, n-C21:5 et n-C21:6 chez les macro-algues. n-C21:6, n-C14:1, n-C19:1, n-C22:1 et n-C30:1 chez le zooplancton. n-C17:1 et n-C17:2 chez les bactries.

Des polyolfines ramifies telles que le squalne et les carotnes ont t galement identifis.

I.2.2.3. Les cycloalcanes et les cycloalcnes Le plus simple hydrocarbure cyclique est un alkylcyclopropane identifi dans des algues marines (Youngblood et al., 1971) mais la plupart de ces composs sont des terpnodes comme les triterpnodes pentacycliques (Saliot, 1981).

I.2.2.4. Les hydrocarbures aromatiques La biosynthse directe de ces composs par des microorganismes ou des vgtaux est un sujet controvers. En effet, lexception dune faible contribution des algues, des bactries et 21

des plantes, les hydrocarbures aromatiques sont gnralement considrs comme produits de pyrolyse des activits humaines et des phnomnes naturels (incendies de forts, ruptions volcaniques) (Bouchez et al., 1996; Saliot, 1981).

I.3. DEVENIR DES HYDROCARBURES EN MILIEU MARIN I.3.1. Facteurs abiotiques dans llimination des hydrocarbures

Du fait de la trs faible solubilit des hydrocarbures dans leau et de leur densit qui est lgrement infrieure lunit, les hydrocarbures rejets dans les ocans stalent la surface avant de subir une srie de modifications suite laction de facteurs abiotiques et biologiques (Figure I.3). Laction simultane de ces diffrents facteurs aboutira llimination de cette pollution (Bertrand et Mille, 1989; U.S. Congress, Office of Technology Assessement, 1991). Les facteurs environmentaux sont:

Figure I.3. Processus physico-chimiques et biologiques intervenant dans lvolution dune nappe de ptrole en milieu marin (Bertrand et Mille, 1989).

22

I.3.1.1. Evaporation Ce phnomne touche les fractions de faible poids molculaire et dpend des conditions atmosphriques (vent, vagues, temprature,). Les hydrocarbures les plus lgers, ayant de 4 12 atomes de carbone (Teb < 270 C), qui reprsentent gnralement prs de 50 % des hydrocarbures totaux dun brut moyen, sont limins rapidement ds les premiers jours, pouvant conduire une pollution de latmosphre.

I.3.1.2. Solubilisation La solubilit des hydrocarbures dans leau de mer est trs faible. Un hydrocarbure est dautant plus soluble que sa masse molculaire est faible et que sa polarit est leve. Il est important de noter que ces hydrocarbures solubles sont parmi les plus dangereux pour lenvironnement, ils sont difficiles liminer et sont adsorbs par la faune et la flore.

I.3.1.3. Emulsification Deux types dmulsions peuvent se former : eau-dans-huile appele "mousse Chocolat" et huile-dans-eau. Les mulsions eau-dans-huile sont constitues par des hydrocarbures de haut poids molculaires. Ces mulsions difficilement dgradables sont les prcurseurs des rsidus goudronneux retrouvs sur les plages, alors que les mulions huiledans-eau facilitent llimination des hydrocarbures.

I.3.1.4. Sdimentation La sdimentation est le passage du ptrole de la surface vers le fond. Ce phnomne concerne les rsidus goudronneux constitus de la fraction ptrolire la plus lourde et dont la densit est suprieure celle de leau de mer. La sdimentation conduit la constitution dagrgats de haute densit difficilement dgradable par voie naturelle.

I.3.1.5. Photo-oxydation La photo-oxydation est observe au niveau de la surface de leau o lair (oxygne) et la lumire (radiations solaires) sont prsents pour la transformation des hydrocarbures (Payne

23

et Phillips, 1985). Lefficacit de ce phnomne dpend de la nature des hydrocarbures et de la prsence de composs non hydrocarbons (Bertrand et Mille, 1989). Ainsi, la photooxydation touche plus particulirement les composs aromatiques qui sont plus photosensibles que les composs aliphatiques. Parmi ces derniers, les composs ramifis sont plus facilement photo-oxyds que les n-alcanes (Rontani et Giusti, 1987). La photo-oxydation conduit la formation de composs solubles dans leau (acides, alcools, ctones, peroxides et sulfoxides) et certains travaux de recherche ont montr leur toxicit pour les communauts microbiennes (Payne and Phillips, 1985; Larson et al., 1979; Maki et al., 2001) alors que Rontani et al. (1987, 1992), ont montr lexistence dinteractions entre la photo-oxydation et la biodgradation pour llimination des alkylbenznes et de lanthracne. Laction simultane de ces deux phnomnes permet une limination plus rapide de ces deux familles de composs.

I.3.1.6. Biodgradation la biodgradation est le processus naturel le plus important dans la dpollution de lenvironnement marin. Les microorganismes en sont responsables, en particulier les bactries. Limportance de la biodgradation dans llimination du ptrole, les voies mtaboliques doxydation des hydrocarbures par les bactries et les paramtres qui peuvent influencer la biodgradation seront traits dans les paragraphes suivants.

I.3.2. Pntration des hydrocarbures dans la chane alimentaire

Les produits ptroliers rejets dans lenvironnement ont des rpercussions sur les plantes, animaux et tres humains. Les consquences de la contamination dpendent des organismes eux-mmes et de la structure chimique des hydrocarbures. Certaines espces prouvent des changements de comportement peine perceptibles ou des problmes de sant court terme. Certaines dentre elles prouvent des effets toxiques instantans et aigus parfois mortels, tandis que chez dautres espces, les repercussions se manifestent lentement long terme (Agence Franaise de Scurit Sanitaire des Aliments, communique de presse, 6 Janvier 2000). Face ces polluants, les organismes susceptibles dtre contamins doivent tre considrs en fonction de leur capacit de rponse spcifique.

24

Les bactries, nourriture de nombreuses espces aquatiques, peuvent tre des vecteurs de contamination par lesquels les hydrocarbures peuvent entrer dans la chane alimentaire (Bertrand et Mille, 1989 et articles cits). Les connaissances les plus nombreuses portent sur les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) dont la toxicit la plus souvent rapporte correspond leur potentiel carcinogne.

II. BIODEGRADATION AEROBIE DES HYDROCARBURES PAR LES MICROORGANISMES

II.1. INTRODUCTION La biodgradation est lun des premiers mcanismes conduisant llimination des hydrocarbures de lenvironnement. La littrature concernant loxydation des hydrocarbures par les microorganismes indique que la croissance cellulaire dpend des processus de transport des hydrocarbures la surface cellulaire et de passage travers lenveloppe cellulaire jusquau cytoplasme.

Trois modes de transport des hydrocarbures sont gnralement considrs (Hommel, 1994; Goswani et Singh, 1991; Husain et al., 1997):

1- Linteraction des cellules avec les hydrocarbures dissous dans la phase aqueuse par les facteurs de solubilisation extracellulaires. 2- Linteraction des cellules avec les hydrocarbures mulsifis par les agents actifs de surface appels biosurfactants. 3- Le contact direct des cellules avec les hydrocarbures.

La

biodgradation

des

hydrocarbures

par

les

microorganismes

appels

hydrocarbonoclastes a t mise en vidence ds 1946 par ZoBell. Depuis cette date le nombre despces bactriennes identifies possdant cette proprit na cess daugmenter. En se basant sur la frquence disolement, les genres bactriens prdominants sont Pseudomonas, Acinetobacter, Alcalignes, Vibro, Flavobacterium, Achromobacter, Micrococcus,

Corynebacteria, et Nocardia (Leahy et Colwell, 1990; Floodgate, 1995). Ces organismes dgradant les hydrocarbures sont ubiquistes (Atlas, 1995 a, b; Olivera et al., 1997), ils ont

25

mme t rencontrs dans les cosystmes extrmes comme les rgions polaires (Whyte et al., 1995; Aislabie et al., 1998), les dserts (Al-Hadrami et al., 1995) ou les sources chaudes (Zarilla et Perry, 1984).

Lactivit humaine, au travers des multiples sources de pollution et par la mondialisation des dplacements, favorise lapparition de nouvelles souches aptes la dgradation des hydrocarbures (Van der Meer et al., 1992). Ainsi, mme si les conditions de temprature, aration, pH, toxicit ou nutriments sont dfavorables, une dpollution intrinsque reste possible avec une efficacit amoindrie (Leahy et Colwell, 1990; Delille et al., 1998).

La capacit de se dvelopper sur les hydrocarbures ne se limite pas uniquement aux bactries, certains sites contamins contiennent galement de nombreux champignons et levures capables de les dgrader (Klug et Markovetz, 1971; Blasig et al., 1984; Davies et Westlake, 1979; Fedorak et al, 1984; Meulenberg et al., 1997; Yamada-Onodera et al., 2002). Signalons enfin que certaines micro-algues sont capables dattaquer les hydrocarbures, citons lexemple de Protatheca zopfii qui dgrade 40 % du ptrole brut (Walker et al., 1975). Cependant parmi les microorganismes aptes se dvelopper sur les hydrocarbures, les bactries restent qualitativement et quantitativement prpondrantes pour mtaboliser ces substrats (Bertrand et Mille, 1989; MacNaughton et al., 1999). Le rejet des produits ptroliers dans les milieux marins ou terrestres entrane une prolifration des microorganismes aptes se dvelopper sur les hydrocarbures et leurs produits de dgradation. Leur nombre est beaucoup plus important dans les zones pollues de faon chronique et saccrot aprs un apport dhydrocarbures dans les sites dpourvus de contamination (Bartha et Atlas, 1977; Atlas, 1981; Floodgate, 1984).

II.2. PROCESSUS DOXYDATION DES HYDROCARBURES Ltude de loxydation des hydrocarbures se base sur lanalyse des milieux de culture des microorganismes dont la croissance dpend de la nature de lhydrocarbure utilis comme source de carbone ainsi que des capacits mtaboliques des cellules. Les produits dtects peuvent directement provenir du substrat, mais leur accumulation ultrieure peut tre due au fait quils sont faiblement mtaboliss ou non mtaboliss. Dautre part, plusieurs produits doxydation peuvent tre de nature transitoire et napparaissent jamais en quantits dtectables. Les informations obtenues par lanalyse cellulaire et des milieux de cultures 26

permettent dtablir le processus mtabolique de dgradation des hydrocarbures. La confirmation de ces mcanismes ncessite des vrifications enzymologiques. Quand la dgradation suit des chemins alternatifs, ceux-ci doivent tre vrifis par inhibition slective de chacun dentre eux.

II.2.1. Voies mtaboliques de la dgradation des hydrocarbures aliphatiques

II.2.1.1. Dgradation des n-alcanes

Les n-alcanes courtes chanes, tel le n-nonane ne sont pas toujours assimils, mais peuvent tre oxyds. Seulement quelques bactries ont la capacit de crotre sur les alcanes plus courts que le n-octane alors que les n-alcanes dont le nombre de carbone est suprieure 9, sont les hydrocarbures les plus facilement dgradables par une trs grande varit de microorganismes (Ratledge, 1978). Plusieurs modes dattaque des n-alcanes ont t dcrits. Ils font intervenir loxygne molculaire.

II.2.1.1.1. Loxydation monoterminale Loxydation monoterminale est le principal processus utilis par la plupart des bactries, conduisant la formation de lalcool primaire puis de laldhyde et de lacide gras correspondant (Pirnick et al, 1974; Nieder et Shapiro, 1975; Grund et al, 1975). Les acides gras forms peuvent tre oxyds par , ou -oxydation; les composs forms pourront par la suite tre incorpors aux lipides cellulaires. Une longation de la chane carbone est alors possible. Les voies mtaboliques doxydation monoterminale des n-alcanes sont indiques sur la Figure I.4.

27

CH3-(CH2)m-CH2-CH2-CH3

CH3-(CH2)m-CH2-CH2-CH2-OH

CH3-(CH2)m-CH2-CH2-CHO

CH3-(CH2)m-CH2-CH2-COOH

-oxydation CH3-(CH2)m-CH CH-COOH

-oxydation CH3-(CH2)m-CH2-CH-COOH OH

-oxydation OH-CH2-(CH2)m-CH2-CH2-COOH

CH3-(CH2)m-CH-CH2-COOH OH

CH3-(CH2)m-CH2-CHO + CO2

OHC-(CH2)m-CH2-CH2-COOH

CH3-(CH2)m-CH2-COOH CH3-(CH2)m-C-CH2-COOH

HO2C-(CH2)m-CH2-CH2-COOH

Oxydations ultrieures: , ,

Oxydations ultrieures: ,

CH3-(CH2)m-COOH + CH3COOH

Oxydations ultrieures: , ,

Figure I.4. Voie mtabolique de loxydation monoterminale des n-alcanes.

Cette oxydation monoterminale pour donner lalcool primaire est catalyse par un mcanisme complexe dhydroxylase qui peut tre reli un systme de transport dlectrons permettant lincorporation de latome doxygne. Les deux meilleurs systmes dcrits sont: le Cytochrome P450 et le Rubredoxin.

* Cytochrome P450: Ce systme a t dcrit en premier lieu chez les bactries pour lhydroxylation des nalcanes par Corynebacterium sp (Cardini et Jurtshut, 1968, 1970) via lincorporation d'oxygne atmosphrique (Figure I.5).

28

R - CH3

O2

cytochrome P450 rduite (Fe )


2+

ion proteine oxyd

flavoproteine rduite

NADP+

cytochrome P450 H2O


R - CH2OH

oxyde (Fe )

3+

ion proteine rduite

flavoproteine oxyde

NADPH

Figure I.5. Mcanisme de loxydation dun n-alcane en alcool primaire par le systme cytochrome P450 (Cardini et Jurtshuk, 1968, 1970).

* Systme rubredoxin: Ce systme enzymatique a t initialement dcouvert chez Pseudomonas oleovorans (Figure I.6).

R - CH3

O2

rubredoxine rduite (Fe2+)

flavoproteine oxyde

NADH

H2O
R - CH2OH

rubredoxine oxyde (Fe3+)

flavoproteine rduite

NAD+

Figure I.6. Mcanisme de loxydation dun n-alcane en alcool primaire par le systme Rubredoxin (Cardini et Jurtshuk, 1968, 1970).

II.2.1.1.2. Oxydation des n-alcanes par le systme de dioxygnase

Cette voie mtabolique d'oxydation des n-alcanes a t propose pour la premire fois par Finnerty (1977, 1988) pour les bactries du genre Acinetobacter. Les n-alcanes sont oxyds par une dioxygnase conduisant la formation d'un n-alkyl-hydroperoxyde, qui sera son tour oxyd en aldhyde puis en acide. Chez d'autres souches, une tape supplmentaire dans la voie mtabolique d'oxydation des n-alcanes a t dmontre: il s'agit de la formation d'un alcool partir du n-alkyl-hydroperoxyde, qui est ensuite oxyd en aldhyde (Finnerty, 1990 a, b). La figure suivante montre ces deux voies mtaboliques:

R - CH3 + O2

R - CH2 - OOH R - CH2 - OH

R - CHO

R - COOH

29

II.2.1.1.3. Oxydation des alcanes via alcnes

Les tudes de Senez et Azoulay (1961) et Azoulay et al. (1963) sur la bactrie
Pseudomonas aeruginosa, ont montr que les alcnes sont des mtabolites intermdiaires de

la dgradation des alcanes. Les alcnes forms subissent une poxidation suivie dune rduction en alcool primaire, qui son tour sera oxyd en acide. Les rsultats d'Azoulay et al. (1963) et Senez et Azoulay (1961) suggrent que les alcanes et les alcnes sont dgrads suivant la mme voie mtabolique et que les produits doxydation des deux hydrocarbures devraient tre les mmes. Le mcanisme de loxydation via la formation dalcne est prsent la Figure I.7.
CH3 - (CH2)4 - CH2 - CH3
NAD NADH2

CH3 - (CH2)4 - CH = CH2


+ O2 + Fe++

CH3 - (CH2)4 - CH - CH2 O CH3 - (CH2)4 - CH2 - CH2OH

Figure I.7. Oxydation terminale via la formation dalcne par une souche de Pseudomonas
aeruginosa (Azoulay et al., 1963).

II.2.1.1.4. Oxydation subterminale

Dans certains cas, loxydation peut tre subterminale, ce qui conduit la formation dun alcool secondaire puis une ctone. La dgradation ultrieure de la ctone par incorporation dun atome doxygne conduit la formation dun ester (raction de type Bayer-Villiger) qui est hydrolys en alcool et en acide, comme le montre la Figure I.8.

30

CH3-(CH2)m-CH2-CH2-CH3 CH3-(CH2)m-CH2-CH-CH3 OH CH3-(CH2)m-CH2-C-CH3 O CH3-(CH2)m-CH2-O-C-CH3 O CH3-(CH2)m-CH2-OH + HOCO-CH3

CH3-(CH2)m-COOH

Oxydation ultrieure: ,,

Figure I.8. voie mtabolique de loxydation subterminale (Klug et Markovetz, 1971)

II.2.1.1.5. Oxydation diterminale

Aprs formation de lacide gras, une deuxime oxydation peut se produire au niveau du groupement mthyl- pour donner un di-acide. La formation de 1--alcane-diol et de dialdhyde na pas t observe (Rehm et Reiff, 1981). Loxydation subterminale de lacide gras peut galement se produire pour donner le (-1)-hydroxy acide de mme longueur de chane que le n-alcane (Figure I.9).

31

CH3-CH2-(CH2)m-COOH

CH3-CH-(CH2)m-COOH OH acide gras (1)hydroxyl

HO-CH2-CH2-(CH2)m-COOH

acide gras -hydroxyl

OHC-CH2-(CH2)m-COOH oxydations ultrieures

acide gras -aldehydique

HOOC-CH2-(CH2)m-COOH acide gras dicarboxylique

oxydations ultrieures: ,

Figure I.9. Voie mtabolique via loxydation terminale et subterminale des acides (daprs Bertrand et Mille, 1989; Ratledge, 1978).

II.2.1.2. Biodgradation des alcanes ramifis

Les alcanes ramifis sont gnralement moins sensibles la biodgradation, ce qui peut provoquer leur accumulation dans lenvironnement. La prsence dun groupement mthyle en position , va empcher la -oxydation, ce qui ncessite lintervention dun autre mcanisme comme l-oxydation ou une oxydation lautre extrmit. Chez certaines bactries, la voie mtabolique passe alors par la voie dite de "citronelleol"; cest le cas de
Pseudomonas citronellolis capable de dgrader le 2-octene, le 3,6-dimethyloctane et le 2,6-

dimethyldecane (Figure I.10) (Fall et al., 1978), ainsi que chez plusieurs autres espces
Pseudomonas (Cantwell et al., 1978). Laugmentation du nombre de ramifications a pour

effet de diminuer leur biodgradabilit (Davis, 1967; Foster, 1962; McKenna, 1972). Par contre une ramification en nempche pas une -oxidation (Rontani et Giusti, 1986; Schaeffer et al., 1979), cest ce qui explique la biodgradation de composs polyramifis de type isoprenoque tel le pristane (2,6,10,14-ttramthyl pentadecane) (Mckenna et Kallio, 1971; Pirnik et al., 1974; Rontani et al., 1986; Ko et Lebealt, 1999; Alvarez, 2003).

32

Loxydation des alcanes ramifis commence gnralement par le groupement mthyle terminal le plus loign de la ramification et lacide gras form est ensuite incorpor dans les lipides cellulaires. Par -oxydation, la dgradation peut se poursuivre jusqu' la ramification o une -oxydation sera alors ncessaire pour une minralisation complte de lalcane.

2,6-dimethyl-2-octne

3,6-dimthy-octane

2,6-dimthyl-dcane

CH2OH

CH2OH

CH2OH

Voie Citronellol

-oxydation

CH3COSCoA R COSCoA

.
R COSCoA

.
CO2 R

CO2

CH2 CO2H

O R COSCoA

COSCoA Oxydations ultrieures

Avec R:

ou

Figure I.10. Voies mtaboliques de la dgradation des hydrocarbures ramifis par


Pseudomonas citronellolis suivant la voie "Citronellol"

Plusieurs travaux se sont intresss aux mcanismes de dgradation du pristane puisque les hydrocarbures isoprnoques sont des produits naturels ubiquistes et que le pristane est un compos relativement inerte et trs utilis comme marqueur biologique. Les mcanismes de dgradation du pristane souvent rencontrs chez les bactries sont indiqus la Figure I.11.

33

Pristane (ttramthyl-2,6,10,14 pentadcane)

oxydation monoterminale

oxydation en position antiso

OH OH

COOH

O O O

oxydation

CH3
HOOC COOH COOH

OH CH3

HOOC

COOH

Units C2 Units C3

oxydation

oxydation

Units C2 Units C3

HOOC OH HOOC HOOC

Figure I.11. Mcanisme de dgradation du pristane. La prsence de deux groupements mthyles chacun en position des extrmits de la chane hydrocarbone (ramification antiso) bloque la dgradation des alcanes linaires (Schaeffer et al., 1979).

34

Par ailleurs, Rontani et Giusti (1986) ont montr que loxydation directe en position 3 tait possible: une population mixte de bactries marines a en effet oxyd un compos disubstitu aux deux extrmits, le 2,2,4,4,6,8,8-heptamthylnonane.

Berekaa et Steinbchel (2000) ont isol deux souches Mycobacterium : Mycobacterium


fortuitum et Mycobacterium ratisbonense, capables dutiliser lalcane ramifi le squalane

(2,6,10,15,19,23-hexamthyltetracosane) et son hydrocarbure parent insatur le squalne comme source unique de carbone. Une partie du mcanisme de dgradation de ce compos correspond celle du pristane et une autre partie correspond la voie de Citronellol (Figure I.12).
CH3 H3C CH3 CH3 CH3

Squalane

CH3

CH3

CH3

CH3 HOOC

CH3

CH3 COOH CH3 3 x C3 3 x C2 CH3 CH3 CH3

-oxydations successives

CH3

CH3 COOH

HOOC

Mcanisme du "Citronellol"

CH3 HOOC

CH3

O COOH

Dgradation incluant des -oxydations successives

Figure I.12. Voie mtabolique de la dgradation du squalane par Mycobacterium fortuitum et


ratisbonense (Berekaa et Steinbchel, 2000).

35

II.2.1.3. Biodgradation des alcnes

La voie mtabolique la plus importante dans la dgradation des alcnes, correspond loxydation du groupement mthyle terminal pour donner un alcool primaire -insatur, qui son tour sera oxyd en acide (Stewart et al., 1960). Une autre voie mtabolique a t montre par les tudes de Van der Linden (1963) et de Huybregtse et Van der Linden (1964) sur loxydations des alcnes, qui est la formation dun poxyde, dun diol-1,2, dun -hydroxy acide et enfin dun acide satur (laldhyde qui est un mtabolite intermdiaire na pas t dtect). Des tudes ultrieures ont confirm ce deuxime mcanisme (Markovetz et al., 1967; Klug et Markovetz, 1967; Makula et Finnerty, 1968b; Schwartz et McCoy, 1973; Vaz et al., 1998; Small et Ensign, 1997). La Figure I.13, montre ces deux voies mtaboliques dans le cas des alcnes terminaux.
CH3 - (CH2)n - CH CH2

HO - CH2 - (CH2)n - CH

CH2

CH3 - (CH2)n - CH - CH2 O

HO - CH2 - (CH2)n - CH - CH2 O

HOOC - (CH2)n - CH

CH2

CH3 - (CH2)n - CH - CH2 OH OH

CH3 - (CH2)n - CH - COOH OH

CH3 - (CH2)n -COOH + CO2

Figure I.13. Voies mtaboliques de la dgradation des alcnes terminaux (daprs Ratledge, 1978).

36

II.2.2. Voies mtaboliques de dgradation des hydrocarbures saturs cycliques

Le ptrole brut est un mlange complexe contenant notamment des sries homologues de cyclanes alkyls tel que les n-alkyl-cyclohexanes et les n-alkyl-cyclopentanes (Williams et al, 1988; Kissin, 1990; Dong et al., 1993). De nombreux drivs polycycliques sont aussi prsents et certains dentre eux, tels les stranes et les triterpanes sont caractristiques de lorigine du ptrole. Cette famille peut reprsenter entre 30 et 50 % des hydrocarbures dun ptrole brut (Bertrand et Mille, 1989). Laccumulation de ces composs dans lenvironnement, montre leur caractre relativement rfractaire aux attaques microbiennes. Cependant, un grand nombre de microorganismes incluant les champignons, les algues et essentiellement les bactries sont capables de les dgrader (Davis et Raymond, 1961; Beam et Perry, 1974a; Feinberg et al., 1980; Rontani et Bonin, 1992; Dutta et Harayama, 2001; Rios-Hermandez et al., 2003). Les cycloalkanes non substitus peuvent tre oxyds et transforms en lactones hydrolysables, conduisant ultrieurement un diacide (Figure I.14) (Beam et Perry, 1974a; Trudgill, 1978).

(CH2)n

CH2

(CH2)n

CHOH

(CH2)n

COOH Dgradations ultrieures (CH2)n-1 COOH (CH2)n

O C O

Figure I.14. Biodgradation des cycloalcanes non-substitus (Bertrand et Mille, 1989).

Les drivs substitus des cycloalcanes sont plus facilement dgrads que les molcules parentales homologues. La dgradation des cyclohexanes n-alkyl substitus a t largement tudie du fait de leur prsence dans le ptrole brut et leur accumulation dans lenvironnement.

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(CH2)n-CH3 Alkyl-cyclohexane

n pair

n impair

COOH

CH2-COOH

COOH

CH2-COOH

OH

OH

COOH

CH2-COOH

OH

OH

COOH CH2-COOH OH OH ORTHO META Rupture COOH COOH COOH COOH O C-CH2-COOH COOH O OH OH HO CH2-COOH OH

OHC HOOC

OH

CH2-COOH CHO COOH OH

CO2 + Acide pyruvique

Acide succinique + Acetyl - CoA

Acide succinique + Acide pyruvique

Acide furamique + Acide actoactique

Figure I.15. Voies mtaboliques de la dgradation des alkyl-cyclohexanes (Bertrand et Mille, 1989). 38

Gnralement, le groupement mthyle terminal de la chane n-alkyl de ces composs est initialement oxyd en acide carboxylique ; un processus de dgradation par -oxydation conduit ensuite lacide cyclohexylcarboxylique ou lacide cyclohexyl-actique suivant que le nombre datomes de la chane alkyle est impair ou pair (Dutta et Harayama, 2001; Rontani et Bonin, 1992; Trudgill, 1978; Feinberg et al., 1980). Ces derniers mtabolites peuvent tre dgrads par un mcanisme dhydroxylation, aromatisation et une ouverture du cycle selon plusieurs mcanismes dpendant de la parit de la chane alkyle (Trudgill, 1978). Les voies mtaboliques sont rapportes sur la Figure I.15. Rontani et Bonin (1992) ont montr quen prsence dun mcanisme d-oxydation la production de lacide cyclohexylcarboxylique est possible partir dun alkyl-cyclohexane nombre pair datomes de carbone tel que le dodecylcyclohexane. Lacide cyclohexylcarboxylique form est ensuite mtabolis par un mcanisme classique de -oxydation (Guyer et Hegeman, 1969; Blakley et Papish, 1982; Rontani et Bonin, 1992), comme le montre la Figure I.16.

COOH

COOH

COOH

OH

oxydation

COOH COOH O

COOH

Figure I.16. Assimilation de lacide cyclohexyl-carboxylique par Alcaligenes sp. PHY 12 suivant un mcanisme de -oxydation (Rontani et Bonin, 1992).

Nous tenons signaler que les phnomnes de co-oxydation sont trs importants dans la dgradation totale de ce type de composs. En effet, certaines bactries prsentent une complmentarit enzymatique leur permettant la dgradation totale des cycloalcanes et des cyclanes substitus.

39

II.2.3. Biodgradation des hydrocarbures aromatiques

Les hydrocarbures aromatiques sont des polluants ubiquistes dans lenvironnement. Plusieurs sortes dhydrocarbures aromatiques et polycycliques aromatiques existent avec une grande varit de substituants alkyles en certaines positions, dpendant de leurs origines. En plus de leur prsence dans le ptrole (10 30 % des hydrocarbures totaux), les hydrocarbures aromatiques sont produits en quantit importante par lactivit humaine, et notamment dans les processus de pyrolyse et de combustion mis en uvre dans lindustrie, le transport et le chauffage. Ils sont dtects dans des chantillons dair, deau et de sol, ainsi que dans les vgtaux et les aliments. A part le cas particulier des aromatiques monocycliques, les pouvoirs mutagne et cancrogne apparaissent pour les hydrocarbures aromatiques polycycliques partir de quatre cycles et sont particulirement marqus pour les hydrocarbures polycycliques aromatiques cinq et six cycles (Bouchez et al., 1996). Plusieurs travaux de recherche ont fait lobjet de la distribution des hydrocarbures polycycliques aromatiques dans lenvironnement et leurs effets sur la sant humaine: plusieurs de ces composs ont t reconnus cancrignes.

Les hydrocarbures de faible poids molculaire sont trs solubles dans leau et par consquent trs toxiques pour les microorganismes. Ils peuvent interagir avec la membrane cellulaire des microorganismes (Sikkema et al., 1992, 1994; de Smet et al., 1978; Uribe et al. 1985). Ces interactions conduisent des changements structuraux et fonctionnels de la membrane, ce qui par consquent, peut diminuer la croissance et lactivit cellulaire (Uribe et al., 1990; Sikkema et al., 1994) .

La dgradation des hydrocarbures aromatiques par les microorganismes est trs importante pour llimination de ces composs des systmes aquatiques et terrestres. Les procaryotes et les eucaryotes ont des capacits enzymatiques qui leur permettent doxyder les composs aromatiques et polyaromatiques dont la taille peut varier du benzne au benzo(a)pyrne (Cerniglia, 1984). Les bactries oxydent initialement les hydrocarbures aromatiques par lincorporation de deux atomes doxygnes molculaires dans le substrat pour former des dihydrodiols de configuration cis (Gibson et al., 1975). Cette raction est catalyse par une enzyme, la dioxygnase. Loxydation des cis-dihydrodiols conduit la formation de catchols (Gibson et al., 1968). Gnralement, loxydation se poursuit par une rupture ortho (rupture de la liaison entre les deux groupements hydroxyle) ou mta (rupture dune laison entre un 40

carbone portant un groupement hydroxyle et le carbone immdiatement voisin ne portant pas de groupement hydroxyle) du cycle qui est assur par une autre dioxygnase (Dagley, 1971), comme le montre la Figure I.17 correspondant la dgradation du benzne.

Pour les drivs mthyls du benzne tel que le tolune ou le xylne, loxydation dpend du microorganisme. Lattaque enzymatique initiale peut se faire au niveau du groupement mthyle pour donner lacide benzoque, ou sur le cycle aromatique pour former des mthyl-catchols, ou sur les deux la fois (Hopper, 1978; Cerniglia, 1984).

En ce qui concerne les alkyl-benznes qui sont des produits caractristiques du ptrole et dont la prsence est utilise comme indicateur de contamination ptrolire des sdiments et des organismes marins (Bouchez et al., 1996), plusieurs travaux de recherche se sont intresss ltude de leur voies mtaboliques de dgradation par les bactries (Chablain et al., 2001; Wilkes et al., 2000; Budzinski et al., 1998; Amund et Higgins, 1985; Dutta et Harayama, 2001; Sariaslani et al., 1974). Gnralement, il se produit une oxydation du groupement mthyle terminal qui donne lacide phnyl-alcanoque correspondant, qui par une srie de -oxydations peut conduire lacide benzoque ou lacide phenyl-actique en fonction du nombre datomes de la chane alkyle. La dgradation peut sarrter ce stade ou se poursuivre au niveau du cycle aromatique. Dans certains cas la co-oxydation par des populations microbiennes mixtes peut jouer un rle trs important dans la dgradation complte de ces composs (Hopper, 1978). Par ailleurs, Rontani et al. (1987) ont montr que la photo-oxydation des alkylbenznes permettait dacclrer leur dgradation par les bactries.

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Benzne

O2 H OH OH H

cis-1,2-dihydroxy-1,2-dihydrobenzne

OH

Catchol
OH Fission ortho Fission mta CHO COOH COOH Acide cis,cis-muconique COOH OH Semialdehyde 2-hydroxymuconique

COOH O C=O R1COOH COOH COOH OH

COOH O C=O CO2 COOH OH

H
C O COOH COOH

HO2C - CH2 - CH2 - CO2H + Acetyl - CoA HO

CH3

COOH O

H CH2 CHO

CH3

C=O COOH

Figure I.17. Voies mtaboliques de la dgradation du cycle aromatique: cas du benzne.

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II.3. FACTEURS PHYSIQUES ET CHIMIQUES AFFECTANT LA BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES

La biodgradation des hydrocarbures est lun des premiers mcanismes conduisant la transformation de ces polluants en produits moins toxiques. Les travaux de recherche sur loxydation des hydrocarbures par les microorganismes ont montr que ce processus dpend de la structure chimique des hydrocarbures et des conditions environnementales. Les facteurs physico-chimiques influant sur la vitesse de biodgradation microbienne sont: la temprature, loxygne disponible, le pH, la salinit, les lments nutritifs, losmose et la pression hydrostatique (Leahy et Colwell, 1990; Atlas, 1981).

II.3.1. Composition chimique des hydrocarbures

La spcificit des substrats lattaque microbienne a t largement tudie. Atlas (1981) et Leahy et Colwell (1990), ont class les composs du ptrole en quatre familles: les hydrocarbures saturs, les aromatiques, les asphaltnes (phnols, acides gras, ktones, esters et porphyrines) et les rsines (pyridines, quinolines, carbazoles, sulfoxides, et amides). Ces composs diffrents par leur susceptibilit lattaque microbienne. Ainsi la vitesse de biodgradation est plus leve pour les saturs, viennent ensuite les aromatiques lgers, les aromatiques haut poids molculaire, les composs polaires ayant la vitesse de dgradation la plus faible. Les hydrocarbures saturs incluent les n-alcanes, les alcanes ramifis et les cycloalcanes (naphtnes). Les alcanes normaux ou chanes linaires sont les plus abondants (10 40 % des hydrocarbures totaux dans le cas du ptrole lger et peuvent atteindre dans certains cas 60 %) et les plus rapidement dgradables: les n-alcanes nombre de carbone suprieur 44 peuvent tre mtaboliss par les microorganismes mais ceux ayant de 10 24 atomes de carbone (C10-C24) sont gnralement les plus facilement dgradables. Les alcanes ramifis sont plus rcalcitrants la biodgradation que les n-alcanes et plus le nombre de ramifications augmente, moins ces composs sont susceptibles la dgradation microbienne. Les hydrocarbures cycliques constituent une fraction importante des hydrocarbures dans la plupart des bruts ptroliers, ils sont plus difficilement dgradables que les deux sries prcdentes cause de leur toxicit suite linteraction avec la membrane cellulaire des microorganismes (Sikkema et al., 1994, 1995). Les expriences montrent de faon non quivoque que la biodgradation des cycloalkanes est trs limite (Atlas, 1981). La non accumulation des 43

hydrocarbures cycliques dans lenvironnement, implique des phnomnes non conventionnels de dgradation tel que lintervention des phnomnes de co-oxydations impliquant plusieurs souches microbiennes dont lquipement enzymatique est complmentaire (Bertrand et al., 1983; Perry, 1979; Rontani et al., 1985; Leahy et Colwell, 1990). Les hydrocarbures aromatiques constituent gnralement 10 30 % des hydrocarbures totaux dun brut ptrolier (Bertrand et Miller, 1989). Des tudes sur la transformation de ces hydrocarbures par les microorganismes ont montr leur toxicit cellulaire (Sikkema et al., 1995). Les hydrocarbures aromatiques de faible poids molculaires constituent gnralement 2 20 % des hydrocarbures des ptroles lgers et moins de 2 % des hydrocarbures des ptroles lourds (Congress of the United States, Office of Technology Assessment, 1991), tels que les alkyl-benznes lgers qui sont les plus toxiques cause de leur solubilit dans leau, mais peuvent cependant tre mtaboliss par les microorganismes quand ils sont prsents en faibles concentrations. La structure molculaire de ces substrats dtermine la vitesse de leur dgradation: un grand nombre de substituants mthyle empche loxydation initiale (Cooney et Summers, 1976; Atlas et al., 1981). Les polyaromatiques sont moins toxiques pour les microorganismes, mais ils sont rarement mtaboliss et quand ils le sont leur biodgradation est lente: cest ce qui explique leur accumulation dans lenvironnement. Ces hydrocarbures aromatiques lourds constituent 2 10 % des hydrocarbures des ptroles lgers et plus de 35 % des hydrocarbures des ptroles lourds. Les asphaltnes et les rsines constituent une faible partie du ptrole brut, 1 5 % du ptrole lger alors quun ptrole lourd peut contenir plus de 25 % dasphaltnes et 20 % de rsines. Cette dernire classe de composs ptroliers nest pas biodgradable ou trs lentement dgradable La biodgradabilit des ptroles bruts est trs fortement dpendante de leur composition (Atlas, 1975); une temprature dtermine, un ptrole lger est plus susceptible dtre biodgrad quun ptrole lourd.

Par exemple, un brut trs faible teneur en soufre et trs riche en composs saturs (exemple: Louisiane du Sud) (Tableau I.2) sera facilement biodgrad, contrairement un fuel de type "Buncker C", trs haute teneur en soufre et composs aromatiques. Nous signalons galement que les n-alcanes contenus dans un ptrole provenant du Vnzula sont moins bien dgrads que ceux prsents dans un ptrole de type "Lger dArabie", par suite de la prsence de produits plus longue chane.

44

Tableau I.2. Proportions des diffrentes familles de composs dans divers bruts ptroliers (daprs Bertrand et Mille, 1989).
Bruts Ptroliers Saturs Aromatiques Polaires (rsines) Asphaltnes

Louisiane du Sud Koweit Buncker C Lger dArabie Tunisien (Asthart) Vnzulien Prudhoe Bay

69 44 21.1 48 48 46 55

20 28.3 34.2 35 32 21.6 25

10.3 23.2 30.3 9 12 19.3 10

0.3 4.5 14.4 7.5 8 9 10

Ratledge (1978), a rassembl des rgles qui ont une application gnrale lensemble des micro-organismes: 1- Les hydrocarbures aliphatiques sont assimils par une grande varit de microorganismes, les composs aromatiques peuvent tre oxyds mais sont assimils par quelques bactries seulement. 2- Les n-alcanes chanes courtes, tel que le n-nonane ne sont pas toujours assimils, mais peuvent tre oxyds. Seules quelques bactries ont la capacit de crotre sur des alcanes plus courts que le n-octane. Quand la longueur de chane augmente au del de C9, le facteur de production augmente, mais la vitesse doxydation dcrot. 3- Les composs saturs sont plus rapidement dgrads que les insaturs. 4- Les composs ramifis sont moins rapidement dgrads que les composs non substitus.

II.3.2. Etat physique et concentration des hydrocarbures ou du ptrole.

Les hydrocarbures tendent se dissiper dans leau formant ainsi des mares noires. Sous laction du vent et des vagues, le ptrole dans leau et leau dans le ptrole peuvent former des mulsions, ce qui augmente la surface du ptrole et par consquence favorise lattaque microbienne. Par contre les grandes masses ou les nappes de mousse ptrolire de viscosit trs importante et qui ont un rapport surface/volume faible inhibent la croissance.

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La formation d'mulsions par la production et la scrtion de biosurfactants est un processus trs important dans lassimilation des hydrocarbures par les bactries (Kaplan et al., 1987; Hommel, 1994; Goswani et Singh, 1991; Broderick et Cooney, 1982; Pines et Gutnick, 1986, Zhang et Miller, 1992). La dispersion artificielle a t tudie comme moyen daugmentation de la surface de contact entre les hydrocarbures et les membranes cellulaires des microorganismes, cependant, les dispersants sont dans la plupart du temps toxiques et peuvent conduire des dommages dans la faune et la flore, et ils peuvent aussi inhiber le processus microbien (Leahy et Colwell, 1990). Les hydrocarbures faibles poids molculaires sont considrs comme des composs toxiques pour les microorganismes cause de leur grande solubilit et par consquent leur concentration trs leve dans les phases aqueuses. Ratledge (1978) rapporte que les n-alcanes de courtes chanes (< C9) sont trs toxiques pour les mircrooganismes alors que ceux plus longs que le n-nonane, les alcnes > C12, les alkyle-bromides > C10, et les alcanols > C14 ne sont toxiques pour aucun microorganisme. Broderick et Cooney (1982), ont montr que la dgradation des n-alcanes longs ( C12), pour lesquels les solubilits sont infrieures 0,01 mg/l seffectue des vitesses qui dpassent les vitesses de dissolution des hydrocarbures et sont fonction de la surface des hydrocarbures disponibles pour lmulsification et leur fixation par les cellules.

II.3.3. Influence de la temprature

La temprature est un paramtre pouvant influencer la biodgradation du ptrole en modifiant son tat physique, sa composition chimique, lactivit physiologique des microorganismes et par consquence la vitesse de dgradation des hydrocarbures, ainsi que la nature et la concentration des espces microbiennes prsentes (Atlas, 1981; Leahy et Colwell, 1990). A basse temprature, la viscosit du ptrole augmente, la volatilisation des composs toxiques pour les microorganismes tels que les alcanes de faibles poids molculaires est rduite et leur solubilit dans leau augmente par diminution de leur volatilisation, ce qui entrane un ralentissement du mtabolisme des microorganismes (Atlas et Bartha, 1972; Atlas, 1975). Une diminution de la temprature est gnralement accompagne par une diminution de la vitesse de biodgradation qui peut tre explique par une dcroissance de

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lactivit enzymatique. Des tempratures plus leves ont pour effet daugmenter la vitesse de biodgradation (Walworth et al., 2001; Sandvik et al., 1986; Song et al., 1990). Si loxydation des hydrocarbures a t observe des tempratures infrieures 0 C (Rike et al., 2003), ou leves 70-80 C (Annweiler et al, 2000), le maximum de lactivit mtabolique des microorganismes est gnralement observ une temprature comprise entre 30 et 40 C (Bossard et Bartha, 1984). Au del de la temprature optimale de croissance et de biodgradation on assiste une augmentation de la toxicit des hydrocarbures et une diminution de lactivit mtabolique. Rling et al. (2003) mentionnent une inhibition totale de la biodgradation au del de 80-90C malgr lisolement de bactries thermophiles (Thermotoga,
Thermoanaerobacter, Thermodesulfobacterium)

et

dArchae

hyperthermophiles (Thermococcus, Archeaoglobus) dans des puits temprature peut atteindre 100C.

de ptrole o la

II.3.4. Influence de loxygne

Ltape initiale du catabolisme des hydrocarbures aliphatiques, cycliques et aromatiques par les bactries et les champignons inclut loxydation de ces substrats par lintermdiaire dhydroxylases et doxygnases, pour lesquelles loxygne molculaire est indispensable (Leahy et Colwell, 1990; Atlas, 1981; Bertrand et Mille, 1989). Les conditions arobies sont, par suite, ncessaires pour cette voie doxydation microbienne des hydrocarbures dans lenvironnement. Le problme de la limitation de l'oxygne molculaire dans les couches superficielles des colonnes deau est inexistant, en effet la concentration en oxygne est suffisamment leve pour assurer lactivit des microorganismes

hydrocarbonoclastes. Thoriquement, 3,5 g doxygne sont ncessaires pour loxydation complte de 1 g de ptrole; Zobell (1969), a calcul que la quantit doxygne dissoute dans 320 m3 deau de mer est ncessaire pour loxydation de 1 l de ptrole brut. Dans un site trs pollu, on aboutira frquemment un ralentissement de la biodgradation par suite dune carence en oxygne. Marin et al. (1996), en tudiant les facteurs influenant la biodgradation des hydrocarbures par la bactrie Acinetobacter
calcoaceticus, ont constat une augmentation de la dgradation des hydrocarbures totaux et

des n-alcanes de 10 % aprs un apport supplmentaire doxygne par agitation. Les sdiments aquatiques, sont par contre gnralement anoxiques, lexception de la fine couche superficielle (Leahy et Colwell, 1990). Bertrand et al.(1986), ont tudi dans des systmes flux continu, lvolution des diffrents hydrocarbures en fonction de la 47

concentration en oxygne. Ils ont trouv que la dgradation des hydrocarbures a lieu essentiellement dans la partie superficielle des sdiments (0-1 cm), o la concentration en oxygne est de 8 ppm, alors quelle est plus faible en profondeur. Par contre aucune dgradation na t observe dans des conditions anarobies (0,2-0,3 ppm), en dpit dune activit sulfato-rductrice trs leve dans les sdiments. La concentration en oxygne a t identifie comme une variable limitante de la vitesse de la biodgradation du ptrole dans les sols (Hurst et al., 1996, El-Kadi, 2001) et les eaux souterraines (Boyd et al., 2001). La dgradation anarobie des hydrocarbures par les microorganismes peut se produire mais des vitesses ngligeables et son importance cologique est considre comme de moindre importance.

II.3.5. Influences des lments nutritifs

Le rejet des hydrocarbures dans les environnements aquatiques, qui contiennent des lments nutritifs inorganiques en faibles concentrations, conduit gnralement des rapports carbone/azote et carbone/phosphore trs levs, dfavorables pour la croissance microbienne (Leahy et Colwell, 1990). Le ptrole lui-mme contient de tels nutriments en petites quantits, mais ils sont toujours prsents sous forme de composs htrocycliques (exemple: drivs de la pyridine et du pyrrole pour lazote) ou organomtalliques complexes; ils ne sont donc pas utilisables par les microorganismes (Bertrand et Mille, 1989). Les sources dazote et de phosphore sont toujours faibles, surtout pendant les priodes de forte activit des organismes photosynthtiques. Lazote et le phosphore sont aussi des facteurs limitant la biodgradation des hydrocarbures dans les sols (Walworth et al., 2001, 2003; Mohn et Stewart, 2000).

II.3.6. Effet de la salinit et du pH

La salinit moyenne des milieux ocaniques est de lordre de 3,5 % et lintervalle de variation se situe en gnral entre les limites de 3,3% et 3,7%. Ces concentrations en sels sont compatibles avec la croissance des microorganismes hydrocarbonoclastes (Bertrand et Mille, 1989). Quand la concentration en chlorure de sodium dpasse 1 M, llimination du ptrole brut diminue rapidement. Pour ce type de substrat, les fortes salinits constituent donc une barrire naturelle pour la biodgradation (Al Mallah, 1988; Tagger et al., 1976; Bertrand et 48

al., 1990). Bertrand et al. (1993) ont tudi linfluence de la concentration en chlorure de sodium sur la biodgradation des hydrocarbures par deux communauts microbiennes, ils ont trouv que la biodgradation est maximale pour une concentration de 0,4 M et diminue lentement pour des valeurs suprieures et infrieures celle-ci. Ward et Brock (1978) ont montr que la vitesse de la biodgradation des hydrocarbures dcroit lorsque la salinit passe de 3,3 28,4%, et ils ont attribu ces rsultats une rduction gnrale des vitesses mtaboliques des microorganismes. Leffet de la concentration en NaCl sur la biodgradation dpend de la nature du substrat utilis comme source de carbone (Bertrand et al., 1993); Fernandez et al. (1996) ont montr que la souche Marinobacter hydrocarbonoclasticus, bactrie marine halotolrante dgrade leicosane, avec un taux de biodgradation de 90% pour des concentrations en chlorure de sodium comprises entre 0,2 et 2,5 M.

Linfluence du pH a t trs peu tudie, mais il ne semble jouer quun rle relativement mineur en milieu marin. Contrairement la plupart des cosystmes aquatiques, les sols peuvent avoir des valeurs de pH trs variables, allant de 2,5 11,0. Des valeurs extrmes de pH, ce qui est le cas pour quelques types de sols, pourraient avoir une influence ngative sur la capacit des microorganismes dgrader les hydrocarbures. La croissance des bactries htrotrophes et des champignons tant favorise par un pH proche de la neutralit (Leahy et Colwell, 1990). Dibble et Bartha (1979) et Hambrick et al. (1980) ont trouv que la dgradation des hydrocarbures est plus leve dans des conditions lgrement basiques. Quel quil soit, le pH des milieux marins natteint jamais des valeurs suffisamment extrmes pour inhiber la biodgradation.

II.3.7. Effet de la pression

La pression nest considre comme une variable dans la biodgradation des hydrocarbures que dans les profondeurs des ocans (Leahy et Colwell, 1990; Bertrand et Mille, 1989; Atlas, 1981). En effet, le ptrole qui nest pas dgrad dans les eaux de surface va progressivement senfoncer, en subissant une lente transformation, et ce sont les molcules difficilement dgradables qui atteindront le fond des ocans. La profondeur moyenne de ceuxci est de 3800 m (ce qui correspond une pression de 380 bars) et la temprature est infrieure 5 C (Bertrand et Mille, 1989). Schwarz et al. (1974, 1975) ont tudi la croissance et lutilisation des hydrocarbures par les bactries isoles de sdiments marins 49

profonds, en fonction de la pression. Ils ont trouv que la vitesse dutilisation des hydrocarbures est fortement diminue hautes pressions. Sous une pression de 1 bar (pression atmosphrique), ces bactries dgradent 94 % de lhexadcane en 8 semaines alors quil leur faut 40 semaines pour arriver au mme rsultat 500 bars. Il apparat donc, que les hydrocarbures qui parviennent aux grandes profondeurs ocaniques sont trs lentement dgrads par les microorganismes et par consquent peuvent persister pendant de longues priodes.

III. BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES DANS LES gisements DE PETROLE et voies anaerobies

III.1. BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES DANS LES PUITS DE PETROLE

La biodgradation du ptrole conduit une diminution du pourcentage des hydrocarbures facilement biodgradables (n-alcanes, alcanes monocycliques, phnylalcanes) et par consquence une augmentation de sa densit, de sa teneur en soufre, de son acidit et sa viscosit (Connan, 1984; Lal et Khanna, 1996). Ces changements ont des consquences conomiques ngatives sur la production du ptrole et les oprations de son raffinage. Lactivit microbiologique dans les puits de ptrole peut tre le rsultat des activits humaines par introduction de microorganismes et de produits chimiques (nutriments, accepteurs dlectrons) lors de lexploitation des gisements. Ces derniers peuvent stimuler la croissance microbienne et donc induire des modifications dans la composition du ptrole. La biodgradation arobie des hydrocarbures dans les gisements de ptrole a t largement tudie (Evans et al., 1971; Hunt, 1979; Winters et Williams, 1969). Cependant, il a t montr que lapport en oxygne dans ces gisements est insuffisant pour assurer lactivit microbiologique arobie (Horstad et al., 1990, 1992), il a donc t suggr que la biodgradation anarobie est le processus prpondrant dans la dgradation des hydrocarbures dans les roches rservoirs de ptrole (Rling et al., 2003; Zengler et al., 1999; Wilkes et al., 2001; Widdel et Rabus, 2001). En effet, les premires bactries isoles des eaux provenant des champs de ptrole par Bastin (1926) taient anarobies et Connan et ses collaborateurs (Bernard et Connan, 1992; Magot et Connan, 1993; Connan et al., 1996) ont montr la prsence de diffrents organismes anarobies dans les gisements de ptrole. Ils ont avanc l'hypothse que ces organismes sont majoritairement responsables de la dgradation des

50

hydrocarbures en profondeurs. La dtection de mtabolites spcifiques, produits uniquement par voies mtaboliques anarobies a confirm cette hypothse (Rling et al., 2003). Dans les rservoirs, 80 % du volume est occup par le ptrole alors que les 20 % restants (sous forme de pores) le sont par de leau de salinit variable constituant le milieu de croissance des organismes. Les rservoirs de ptrole sont aussi caractriss par des tempratures leves puisque la temprature augmente de 2 3 par 100 mtres de profondeur. Gnralement, une biodgradation significative se produit des tempratures infrieures 80 C (Connan, 1984) correspondant une profondeur maximale de lordre de 4 km, mais cela ne signifie pas que tous les rservoirs basse temprature contiennent du ptrole biodgrad (Wilhelms et al., 2001). Au de l dune temprature de 80-90 C, on assiste une inhibition de la biodgradation (Connan, 1984; Bernard et Connan, 1992; Rling et al., 2003).

Les organismes majeurs responsables de la dgradation des hydrocarbures dans les rservoirs de ptrole sont les bactries et les archaea et la connaissance du degr de dgradation du ptrole est trs importante avant toute exploitation (Larter et al., 2003). Cette dgradation se passe une vitesse trs faible de lordre de 10-6 10-7 kg dhydrocarbures/kg de ptrole/an; ce qui ncessite des millions dannes pour perturber la composition du ptrole dans les roches rservoirs (Larter et al., 2003). Par exemple: 15 millions dannes sont approximativement ncessaires pour liminer les n-alcanes dun ptrole lourd et 5 millions dannes pour un ptrole lger. La vitesse de biodgradation est limite par la diffusion des nalcanes vers la surface de contact entre leau et le ptrole et la disponibilit dlments nutritifs tels que lazote et le phosphore. Les conditions physico-chimiques dans les rservoirs de ptrole telles que le pH, la salinit, la pression, les conditions redox et la temprature, reprsentent des obstacles dans lisolement et ltude des microorganismes prsents. La reproduction des conditions in situ permet gnralement disoler des organismes reprsentatifs (Yanagibayashi et al., 1999). La plupart des informations obtenues ont t recueillies partir dchantillons de ptrole provenant des rservoirs: des bactries thermophiles (Thermotoga, Thermoanaerobacter,
Thermodesulfobactrium) et des archaea hyperthermophiles (Thermococcus, Archeaoglobus)

ont t isoles dchantillons de ptrole provenant dun gisement 1670 mtres de profondeur (Grassia et al., 1996), ces microorganismes peuvent se dvelopper dans des conditions comparables celles in situ (74-171 mM NaCl, 65-70 C et une pression comprise entre 50 et 150 bars). 51

III.1. VOIES DE DEGRADATION ANAEROBIE

De nombreux microorganismes ont dvelopp des capacits mtaboliques leur permettant d'utiliser les hydrocarbures comme donneurs d'lectrons et comme sources de carbone pour la synthse cellulaire. La dgradation des hydrocarbures par les microorganismes dans des conditions arobies est bien connue depuis plus d'un sicle, alors que l'utilisation de ces composs dans des conditions anoxiques (sdiments profonds et rservoirs de ptrole) n'a t tudie que durant la dernire dcennie. En effet, il a t largement admis que pour les bactries dgradant les hydrocarbures en arobiose, la prsence d'oxygne molculaire est indispensable pour l'activation enzymatique initiale des hydrocarbures (Britton, 1984; Gibson et Subramanian, 1984). Cette activation se traduit par l'introduction d'un ou plusieurs groupements hydroxyles dans la molcule apolaire. L'absence de l'oxygne molculaire dans les environnements anoxiques ncessite un nouveau mode d'activation biochimique pour convertir les hydrocarbures apolaires en des composs comportant des groupements fonctionnels: la prsence de groupements fonctionnels (hydroxyle, carbonyle ou carboxyle) dans les composs organiques est indispensable pour toute raction d'oxydation ultrieure (Spormann et Widdel, 2000; Widdel et Rabus, 2001). Diffrentes souches de bactries anarobies capables de dgrader les hydrocarbures ont t isoles de sites contamins. Ces bactries utilisent le nitrate, le fer (III) ou le sulfate comme accepteurs d'lectrons (Figure I.18). Un mcanisme de dgradation par mthanognse peut avoir lieu dans des environnement o l'oxygne, le nitrate, le fer (III) et le sulphate sont totalement absents (Zengler et al., 1999). Le tableau I.3, montre des exemples de bactries anarobies dgradant les hydrocarbures aliphatiques et aromatiques classes en fonction de l'accepteur d'lectrons.

52

Hydrocarbures CnHm

H2O

SO42-

Fe (III)

NO3-

Biomasse

Biomasse

Biomasse

Biomasse

CH4 CO2

H2S CO2

Fe (II) CO2

N2 CO2

Figure I.18. Les diffrentes voies mtaboliques de la dgradation des hydrocarbures en fonction de l'accepteur d'lectrons.

Tableau I.3. Exemples de bactries anarobies dgradant les hydrocarbures aromatiques et aliphatiques.

Espce ou souche bactrienne

HYDROCARBURES METABOLISES

Rfrences

Bactries dnitrifiantes Thauera aromatica T1 Azoarcus tolulyticus Td15 Azoarcus sp. souche EB1 Souche HxN1 Souche HdN1 Tolune Tolune, m-xylne Ethylbenzne Alcanes (C6-C8) Alcanes (C14-C20) Evans et al. (1991) Fries et al. (1994) Ball et al. (1996) Ehrenreich et al. (2000) Ehrenreich et al. (2000)

Bactries rduisant le fer Geobacter metallireducens GS15 Tolune Loveley et Lonergan (1990)

Bactries rduisant le sulfate Desulfobacula toluolica Desulfobacterium cetonicum Souche AK-01 Tolune Tolune Alcanes (C13-C18) Rabus et al. (1993) Harms et al. (1999) So and Young (1999)

53

La dgradation des hydrocarbures aromatiques et en particulier le tolune a t la plus tudie du fait qu'elle assure une croissance rapide des bactries. Des tudes rcentes, ont montr que l'tape initiale dans la dgradation des n-alcanes, du tolune, des xylnes et de l'thylbenzne par les bactries dnitifiantes se traduit par l'introduction d'une molcule de fumarate pour former un substituant succinate (Heider et al., 1999; Spormann et Widdel, 2000; Widdel et Rabus, 2001), comme le montre la Figure I.19.

COO CH3

2 [H]

COO -

COO CO-S-CoA COO -

COO -

COO -

2 [H]

COO -

CO-S-CoA

H 2O

COO CO-S-CoA HS-CoA HO

CO-S-CoA

COO -

CO2
2 [H]

Figure I.19. Mtabolisme de dgradation du tolune par les bactries dnitrifiantes.

La dgradation du propylbenzne par les bactries dnitrifiantes s'effectue par hydroxylation pour donner le 1-phenyl-1-propanol et ensuite la propiophnone (Figure I.20; Rabus et Widdel, 1995).
COOHO H2O O CO2, "Energie" O

2 [H]

2 [H]

HS-CoA, "Energie"

CO2

S-CoA O S-CoA

O CO2

S-CoA
HS-CoA

Figure I.20. Mtabolisme de dgradation du propylbenzne par les bactries dnitrifiantes.

54

La dgradation anarobie du tolune et des alkylbenznes tel que le m-xylne ou l'thylbenzne a t galement tudie pour diffrents accepteurs d'lectrons. L'activation des hydrocarbures saturs s'effectue par l'addition d'un compos carbon plutt que par dsaturation ou hydratation. Enfin, il faut noter que la dgradation des hydrocarbures en anarobiose compte encore des domaines mal connus.

IV. LES LIPIDES DES BACTERIES GRAM-NEGATIVES

Un trs grand nombre de bactries hydrocarbonoclastes sont des bactries Gramngatives (Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Mycobacterium), et incluent les bactries tudies dans nos travaux. Il est donc important de faire le point sur la composition de leurs lipides. Ceux-ci sont essentiellement localiss dans lenveloppe cellulaire constitue essentiellement de trois couches: la membrane cytoplasmique, la couche peptidoglycane et la membrane extrieure:

la membrane cytoplasmique: contient des phospholipides et des protines en quantits quasiment gales et joue un rle dans le transport des lments nutritifs, dans la phosphorylation oxydative et dans la synthse des phospholipides, du peptidoglycane et des lipopolysaccharides.

la couche peptidoglycane: est constitue de chanes linaires contenant alternativement la N-actyl-glucosamine et lacide N-actylmuranique. Dans les bactries Gramngatives, une monocouche de peptidoglycane entoure la membrane cytoplasmique et sa rigidit permet la cellule de supporter la pression osmotique du cytoplasme qui est de lordre de 3,5 bars.

la membrane extrieure: elle a la mme paisseur que la membrane cytoplasmique, qui est de lordre de 7,5 nm. Elle contient 9 12 % des protines cellulaires, alors que les phospholipides et les lipopolysaccharides sont les constituants majeurs. Cette membrane est relie la couche peptidoglycane par des liaisons covalentes via des lipoprotines. Il existe une nette diffrence de composition entre les parois cellulaires des bactries

Gram-ngatives et celles des bactries Gram-positives (Figures I.21 et I.22). La paroi cellulaire des bactries Gram-positives est essentiellement constitue par un peptidoglycane, auquel est attache une fraction lipidique gnralement peu importante, et il ny a pas de membrane externe. En plus du peptidoglycane, on distingue les acides tichoques qui sont

55

des polymres de glycrol ou de ribitol joints par des groupes phosphates. Ils sont chargs ngativement et jouent un rle dans la fixation des ions Mg++.

Figure I.21. Structure de la paroi cellulaire des bactries Gram-ngatives (daprs Lugtenberg et Van Alphen, 1983).

Figure I.22. Structure de la paroi cellulaire chez les bactries Gram-positives.

56

IV.1. LES PHOSPHOLIPIDES

Les phospholipides membranaires constituent entre 3 et 9 % du poids sec des bactries Gram-ngatives (Raetz 1978). Gnralement, la phosphatidylethanolamine est le constituant majeur des phospholipides dans diffrents bactries Gram-ngatives (exemple : E. coli, S.
typhimurium, P. aeruginosa, ), dautres composs tel que le phosphatidylglycrol et le

diphosphatidylglycrol (ou cardiolipine) ont t identifis en quantits importantes (structures indiques dans la Figure I.23) ( Lugtenberg et Van Alphen, 1983; Raetz, 1978; Albelo et Domenech, 1997); ces derniers sont des composs drivs du 1,2-diacyl-sn-glycerol-3phosphate (FigureI.23) (daprs Kates, 1986). Ces phospholipides peuvent se trouver dans des proportions diffrentes dans les deux membranes cellulaires (den Kamp, 1979). La phosphatidylethanolamine peut constituer jusqu' 90 % des phospholipides de la membrane extrieure, alors que les deux autres se trouvent en quantits importantes dans la membrane cytoplasmique (Lugtenberg, 1976, 1981; Lugtenberg et Van Alphen, 1983). Les compositions en acides gras des

phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycrol et cardiolipine sont relativement similaires (Raetz, 1978). Elles sont constitues essentiellement dacides gras saturs et insaturs ainsi que de leur drivs cyclopropanes. Dans le cas d'Escherichia coli, la membrane extrieure est plus riche en acides gras insaturs alors que la membrane cytoplasmique est enrichie en acides gras insaturs et cyclopropaniques (Lugtenberg et Peters, 1976).
O

CH2-O-C-R1
O

R2-C-O-CH

R1 et R2, sont des chanes respectivement satures et insatures. Le groupement R reprsente un amino alcool ou des rsidues polyols.

CH2-O-P-O-R OH
O O

CH2-O-C-R1
O

CH2-O-C-R1
O

CH2-O-C-R1
O

CH2-O-C-R1 HC-O-C-R2
O O

R2-C-O-CH

R2-C-O-CH

R2-C-O-CH OH

CH2-O-P-O-CH2-CH-CH2OH OH

CH2-O-P-O-CH2-CH2-NH2 OH

CH2-O-P-O-CH2-CH-CH2-O-P-O-CH2 OH OH OH

Phosphatidylethanolamine

Phosphatidylglycerol

Cardiolipine

Figure I.23. Structure des phospholipides membranaires les plus importants de E. coli (daprs Raetz, 1978).

57

IV.2. LES LIPOPOLYSACCHARIDES

A partir des bactries Gram-ngatives, il est possible disoler des substances complexes doues de proprits toxiques et antigniques renfermant une partie polysaccharidique et une partie lipidique, ainsi que quelques acides amins. Ces substances sont appeles lipopolysaccharides parce que, la diffrence des glycolipides, elles sont solubles dans leau (en donnant dailleurs des solutions opalescentes) et insolubles dans les solvants organiques usuels (Asselineau, 1962). La Figure I.24 montre la structure chimique dun lipopolysaccharide prsent chez trois entrobactries: Salmonella minnesota,
Escherichia coli et Proteus mirabilis (Seydel et al., 1984).

Les lipopolysaccharides peuvent atteindre des poids molculaires trs levs: environ 1 million pour le lipopolysaccharide isol de Brucella melitensis, et 10 millions pour celui de
Serratia marcescens ou Shigella dysenteria.

Le lipopolysaccharide qui est caractristique des bactries Gram-ngtives, est une molcule amphipatique contenant une partie hydrophobe appele lipide A libre par une hydrolyse partielle et une partie hydrophile constitue dune chane de sucres gnralement ramifie. Les sucres frquemment rencontrs dans les lipopolysaccharides sont: les heptoses (par exemple, D-glycero-D-mannoheptose chez Chromobacterium violaceum), des 3,6didsoxy-sucres (abquose, colitose, tyvelose, paratose), ou des sucres amins (par exemple, N-actyl D-fucosamine chez C. violaceum). Pour une mme espce de bactrie la composition en acides gras est sensiblement diffrente de celle des phospholipides. Les lipopolysaccharides sont particulirement riches en acides hydroxyalcanoques (Bryn and Rietschel, 1978; Seydel et al., 1984; Wilkinson, 1988; Thrisod et al., 2001, 2002; Hussein et al., 2001, Kussak et Weintraub, 2002; Ogawa et al., 2003; Hashimoto et al., 2003) relis par des liaisons esters ou amides au lipopolysaccharide (Tableau I.4.).

58

O
O
-

O HO O
GlcN II

O P

OOH

O O P O

II GlcN

HO O O R1

NH O O R2 O OH

NH O

O R3

14

14

14

14

Lipide A Salmonella. minnesota

R1 14:0 2-OH-14:0

R2 12:0

R3 16:0

Escherichia coli Proteus mirabilis (37 C) Proteus mirabilis (12 C)

14:0 14:0 14:0

12:0 14:0 16:17

H H, 16:0 H, 16:0

Figure I.24. Structure des lipides A lipopolysaccharidiques de quelques entrobactries (daprs Seydel et al., 1984).

59

Tableau I.4. Composition en acides gras du lipide A selon le type de liaison aux chanes polysaccharidiques pour diffrentes bactries Gram-ngatives.

Lipides Organisme Klebsiellan oxytoca Mesorhizobium huakuii

Type de liaison au polysaccharide Ester 12:0, 3-OH-14:0 16:0, i-17:0, 18:0, 20:0 27-OH-28:0 Amide 3-OH-14:0 3-OH-12:0, 3-OH-i-13:0 3-OH-20:0, 3-OH-i-21:0 3-OH-22:0, 3-OH-21:1

Rfrences Ssskind et al., 1998 Choma, 1999

Escherichia coli

14:0, 3-OH-14:0

12:0, 3-OH-14:0

Seydel et al., 1984 Wollenweber et al., 1984

Salmonella minnesota

14:0, 2-OH-14:0 3-OH-14:0

12:0, 16:0, 3-OH-14:0

Seydel et al., 1984 Jiang et al., 2002

Erwinia carotovora Acinetobacter calcoaceticus

12:0, 3-OH-14:0 12:0, 16:1, 16:0, 18:1 3-OH-12:0

12:0, 3-OH-14:0 14 :0, 3-OH-14:0

Fukuoka et al., 2001 Goossens et al., 1989

Shigella flexneri

14:0, 3-OH-14:0

12:0, 3-OH-14:0

Kussak 2002.

et

Weintraub,

Helicobacter mustelae Helicobacter pylori

14:0, 3-OH-14:0 12:0, 14:0, 16:0, 18:0, 3-OH-16:0

14:0, 3-OH-14:0 3-OH-18:0

Thrisord et al., 2001 Moran et al., 1997; Suda et al., 1997

Yersimia pseudotuberculosis Yersimia pestis Yersimia ruckeri Yersimia enterocolitica

16:0, 3-OH-14:0 12:0, 3-OH-14:0 12:0, 3-OH-14:0 12:0, 3-OH-14:0

3-OH-14:0 16:1, 3-OH-14:0 12:0, 3-OH-14:0 3-OH-14:0 3-OH-12:0 Molinaro et al., 1999 Thrisod et al., 2002

Xantomonas hortorum pv. 10:0, 3-OH-10:0 vitians Bacteroides fragilis 3-OH-12:0 Non dtermin

i-15:0, 3-OH-15:0, 3-OH-16:0, 3-OH-i-17:0, 3-OH-17:0

Wollenwober et al., 1984

Pseudomonas aeruginosa

3-OH-10:0

12:0, 2-OH-12:0, 3-OH-12:0

Wollenwober et al., 1984 Drewry et al., 1973 Kulshin et al., 1992 Lyngby et al., 2002

Neisseria meningitidis

3-OH-12:0

12:0, 3-OH-14:0

Nomenclature: Le nombre avant les deux points indique le nombre de carbones de la chane linaire de lacide gras et celui aprs les deux points, le nombre dinsaturations. La dsignation OH, indique la prsence dun groupement hydroxyle sur la chane hydrocarbone et dont la position est indique par le chiffre juste avant. "i" et "a" indiquent respectivement iso et antiso.

60

IV.

3.

INFLUENCE

DES

PARAMETRES

ENVIRONMENTAUX

SUR

LA

COMPOSITION LIPIDIQUE DES BACTERIES GRAM-NEGATIVES

Pour les bactries Gram-ngatives, les lipides sont les constituants membranaires qui jouent un rle trs important dans la structure et le fonctionnement de la membrane cellulaire. Des changement dans les paramtres de lenvironnement (temprature, salinit, pH, pression osmotique, source de carbone, solvants organiques.) sont accompagns par des modifications dans la composition lipidique. Ainsi, plusieurs travaux se sont intresss ltude de la composition lipidique et en particulier les acides gras membranaires dans le but de comprendre le mode de protection des bactries suite des modifications dans la

composition du milieu extrieur ( Intriago et Floodgate, 1991; Pinkart et White, 1997; Ramos et al, 2001; Nichols et al., 2000; Krasikova et al., 1995; Petterson et Baath, 2003; Rabus et al., 2002; Hazel et Williams, 1990; Brown et al., 2000) et ils ont mentionn que les acides gras phospholipidiques sont les plus touchs lors des modifications membranaires suite aux adaptations aux nouvelles conditions de culture.

IV.3.1. Influence de la temprature sur la composition lipidique

La temprature de croissance affecte normment la composition lipidique de la membrane, ces changements tant ncessaires pour maintenir une fluidit membranaire optimale et constante. Des travaux ont montr que les variations de la temprature saccompagnent dune altration de la composition en acides gras lipidiques: des basses tempratures entranent une augmentation en acides gras insaturs (Rabus et al., 2002; Flahaut et al., 2000; Mejia et al., 1999; Carty et al., 1999; Krasikova et al., 1995; MonteoliviaSanchez et al., 1988; Russell, 1984), une augmentation des acides gras de faibles poids molculaires et une activit mtabolique rduite (Rabus et al., 2002). Carty et al., (1999) ont constat lapparition de lacide palmitolique 16:1 dans le lipide A dEscherichia coli cultive 12 C alors qu 30 C, celui-ci est constitu uniquement dacides gras saturs. Pour des valeurs croissantes de la temprature, Dubois-Brissonet et al. (2000) et Nichols et al. (2000) ont trouv que les cellules favorisent la synthse des acides gras saturs au dtriment des acides gras insaturs. Dubois-Brissonet et al. (2000), ont constat aussi une augmentation de labondance de lacide gras de courte chane 12:0 (acide laurique) chez la bactrie marine
Peudomonas aeruginosa quand la temprature diminue.

61

La temprature agit directement sur la fluidit membranaire, la flexibilit des protines et la conformation des acides nucliques (Ramos et al., 2001). Suite des chocs thermiques, les bactries ragissent en modifiant leurs compositions lipidiques membranaires dans le but dassurer leur intgrit cellulaire en ayant une fluidit optimale. Mejia et al. (1999) mesurant la fluidit dEscherichia coli pour des tempratures croissantes, ont trouv que la fluidit dcroit avec la temprature et ils ont attribu ces rsultats aux changements dans la composition lipidique. En effet, la fluidit membranaire dpend directement de la proportion en acides gras insaturs dans la cellule. Les changements dans la composition en acides gras conditionnent lhomoviscosit de la membrane et permettent ainsi de maintenir sa stabilit et davoir une fluidit optimale (Russel et Fukunaga, 1990; Ramos et al., 2001).

IV.3.2. Influence de la salinit sur la composition lipidique

Il existe des environnements o la salinit varie selon les saisons et les activits humaines. Les bactries capables de crotre dans de telles conditions possdent des mcanismes physiologiques pouvant les protger de ces fluctuations. On distingue les bactries halotolrantes pouvant tolrer de hautes concentrations de sel (jusqu la saturation; 5,2 M), mais qui ne sont pas ncessaires leur dveloppement et les bactries halophiles dont la croissance est absente pour des concentrations en NaCl infrieures 0,5 M. Les bactries halotolrantes et halophiles possdent des mcanismes de protection contre les fortes salinits et ce sont ces mcanismes qui dterminent leur abondance et leur distribution par rapport aux autres microorganismes. Il a t suggr que les modifications dans la composition lipidique membranaire induites par une variation de la concentration en NaCl sont trs importantes dans le contrle de la permabilit ionique (Komaratat et Kates, 1975; Ohno et al., 1979; Monteolivia-Sanchez et al., 1988; Russell et Kogut, 1985) et la rgulation de la pression osmotique lintrieur de la cellule (Russell, 1989). Une

augmentation de la salinit saccompagne dune lvation de la proportion des phospholipides anioniques: chez les bactries Gram-ngatives le changement majeur correspond une augmentation de la quantit du phosphatidylglycrol par rapport celle de la phosphatidylethanolamine (Russell, 1989; Sutton et al., 1991). Dans certains cas, le ralentissement de la croissance cause des fortes salinits peut provoquer son tour une augmentation de la proportion du phosphatidylglycrol (Hardwood et Russell, 1984). En effet,

62

une

molcule

de

diphosphatidylglycrol

est

convertie

en

deux

molcules

de

phosphatidylglycrol suite une faible croissance. La composition en acides gras subit des modifications importantes suite un changement de la salinit du milieu de culture. Des travaux ont montr une augmentation de la quantit des acides gras comportant un cyclopropane et une diminution des acides gras monoinsaturs suite laugmentation de la salinit du milieu (Valderrama et al., 1998; Monteolivia-Sanchez et al., 1988; Monteolivia-Sanchez et Ramos-Cormenzana, 1986; McGarrity et Amstrong, 1975). Ce rsultat fait suite lactivation dune enzyme, la cyclopropane synthtase. Ce changement est sans effet sur la fluidit membranaire du fait que ces deux types de composs ont des proprits thermiques similaires. Chez certaines espces bactriennes, le changement majeur dans la composition en acides gras concerne laugmentation de la proportion des acides gras insaturs et cyclopropaniques et donc une augmentation de la fluidit, puisque pour une mme temprature, ces composs sont plus fluides que leurs drivs saturs (Russell, 1989). Chez les bactries Gram-positives, les fortes salinits conduisent une augmentation des lipides anioniques (phosphoglycolipides et glycolipides), gnralement avec une augmentation du phosphatidylglycerol et/ou du diphosphatidylglycrol (Russell, 1989). En ce qui concerne la composition en acides gras, on assiste une augmentation des acides gras ramifis dans le cas des bactries halotolrantes et une diminution dans le cas des halophiles (Russell, 1989; Chihib et al., 2003; Miller, 1985).

IV.3.3. Influence de la source de carbone sur la composition lipidique

Linfluence de la source de carbone et en particulier les hydrocarbures sur la composition lipidique des bactries Gram-ngatives sera discute dans les chapitres suivants.

V. BIOMARQUEURS

V.1. NOTION DE BIOMARQUEURS

Dans lcosystme marin, la plus grande partie de la matire organique est dorigine photosynthtique autochtone (phytoplancton et macrophytes) ou allochtone (issue des vgtaux suprieurs, et apporte par les courants fluviaux et par laction du vent; Durand, 1980). Par consquent, les sdiments marins contiennent un mlange complexe de matire 63

organique dorigine autochtone et allochtone (seule la matire organique rfractaire la dgradation pouvant atteindre les sdiments o elle sera ventuellement prserve, en gnral moins de 1 % en poids) dont lvolution diffre selon les conditions environmentales et les types des matires organiques sdimentes. Les principaux producteurs de la matire organique dans le milieu marin sont les organismes microscopiques unicellulaires phytoplanctoniques (Tissot et Welte, 1978). La productivit est dautant plus importante que les conditions favorables la vie marine sont prsentes: ensoleillement, eaux claires, temprature et apport de nutriments (azote et phosphate). Les bactries qui sont prsentes en grandes quantits dans tous les environnements (notamment dans les zones daccumulation), jouent aussi un rle important quant la production de la matire organique sdimentaire. Toutefois malgr leur abondance, Hartgers et al. (1994) ont montr que la contribution de ces microorganismes la production de la matire organique sdimentaire reste faible. Les biomarqueurs permettent de reconnatre au sein dun mlange complexe de matire organique, des "empreintes molculaires" capables de traduire un signal gochimique spcifique dune origine ou dun processus dvolution physique, chimique ou biologique. La notion de biomarqueur est lie la dcouverte de molcules fossiles dans les sdiments et les ptroles, dont la caractrisation des structures molculaires a permis de prciser non seulement lorigine biologique de la matire organique tudie, mais aussi d'apporter des informations sur les conditions de dpt, denfouissement (diagense), et sur les

transformations dues llvation de la temprature, au cours de la catagense (Peters et Moldowan, 1993).

Cette notion de biomarqueurs sapplique des composs organiques ou des familles de composs organiques, souvent ltat de traces dont la spcificit, la distribution, la stabilit, ou linertie mtabolique autorisent leur suivi, et leur identification, lors de leur volution au sein de lcosystme. Le choix des biomarqueurs dpend de plusieurs facteurs: degrs de spcificit de marqueurs individuels, abondance relative, facilit danalyse prcise dans un mlange complexe (minimum dinterfrence avec les composs co-extraits).

Bon nombre de travaux sur les marqueurs bactriens sont les fruits des recherches entreprises par les gochimistes du sdiment: Volkman et al. (1980), ont compar la 64

distribution des acides gras dun sdiment (sable de diamtre moyen 140 m), de cultures de diatomes (Melosira, Biddulphia, Nitzschia, et Navicula principalement), des bactries de sdiment cultives sur le sdiment lui mme (essentiellement des bactries arobies, htrotrophes (Perry et al., 1979) et des populations alguaires domines par Chlamydomonas sp, cultives par inoculation de sdiment, ce qui leur a permis de proposer quelques structures tmoins de lactivit microbiologique. Tronczynski et al.(1985), ont tudi quelques critres destimation de lactivit bactrienne par lanalyse de certains acides gras saturs, monoinsaturs et ramifis prsents dans les sdiments. Plusieurs tudes consacres la composition de la matire organique dans diffrents sdiments marins (Haddad et Martens, 1987; Mark et al., 1995; Wakeham et Canuel, 1990; Zegouagh et al., 1996, 1998; van Dongen et al., 2000; Camacho-Ibar et al., 2003), ont montr que la principale source de la matire organique correspond un mlange dalgues marines, de plantes vasculaires et de bactries. Il faut prciser que limportance de la contribution relative chacune de ces sources dpend aussi des paramtres environmentaux.

V.2. BIOMARQUEURS BACTERIENS

Les organismes vivants sont constitus des mmes classes principales de composs chimiques: les lipides, les protines et les hydrates de carbone (sucres simples et leurs polymres de formules brutes Cn(H2O)n). Cependant, certaines variations sont observes dans leurs compositions chimiques qui autorisent leur diffrenciation. Les lipides possdent des origines trs diverses (phytoplanctonique, zooplanctonique, bactriennes, archaenne ou terrigne) et sont subdiviss en plusieurs classes dfinies par des fonctions chimiques (alcanes, alcnes, aldhydes, ctones, alcools, esters, thers), ainsi que par la nature de leur squelette carbon (linaire, terpnique, (poly)cyclique, aromatique, etc.). Ces lipides correspondent souvent aux constituants cellulaires majoritaires et peuvent reprsenter jusqu' 20 % du poids sec des micro-organismes. Il assurent au sein de la cellule quatre fonctions principales:
(i) (ii) (iii) (iv)

ils contribuent la structure des membranes cellulaires; ils reprsentent des rserves nergtiques intracellulaires; ce sont des formes de transport des mtabolites nergtiques; ils jouent un rle de protection la surface des paroies bactriennes et de lexosquelette de nombreux organismes vivants.

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Ainsi en raison de leurs spcificits structurales, les lipides ont pu tre utiliss comme biomarqueurs (Saliot et al., 1988). Par consquent leur caractrisation peut fournir des informations gochimiques importantes et certains travaux ont permis de prciser la validit du concept de biomarqueurs. Labondance lipidique est surtout importante dans la partie suprieure des sdiments et des colonnes deau et diminue progressivement avec la profondeur (Gillan et Sandstrom, 1985; Meyers et Eadie, 1993; Camacho-Ibar et al., 2003). Gillan et Sandstrom (1985) ont trouv une abondance lipidique de 6 % du carbone organique total, pour les sdiments 3-4 cm de profondeur, alors quelle ne reprsente que 1 % dans le cas dchantillons profonds. Il faut noter aussi que le nombre de nouveaux marqueurs spcifiques pourrait augmenter par la mise en vidence de nouvelles souches et de nouveaux cosystmes particuliers tels que les sources hydrothermales profondes.

V.2.1. Les acides gras

Les acides gras sont les constituants prdominants dans tous les lipides dorganismes marins, y compris dans les bactries o leur abondance est comprise entre 2 et 8 % de la biomasse sche. Ces acides gras existent ltat libre ou le plus souvent engags dans des liaisons esters et amides aux structures polysaccharidiques membranaires. Certains de ces composs sont caractristiques dun type de microorganismes et parfois mme dun sousgroupe de chacun des rgnes animal et vgtal, on parle alors de marqueurs taxonomiques (Visot et Marty, 1993). Les acides gras les plus communment identifis sont les acides monocarboxyliques chanes linaires ramifis ou non, nombre pair ou impair datomes de carbone, saturs ou insaturs. Des acides gras cyclopropaniques et hydroxyls ont t galement identifis. Les gochimistes ont largement utilis la nature et la distribution de ces acides pour caractriser lorigine et ltat de dgradation de la matire organique au sein des colonne deau et dans les sdiments. Les acides gras constituent dexcellents biomarqueurs pour diffrentes raisons: (1) une grande diversit de ces acides parmi les micro-organismes, (2) un turn-over relativement rapide, faisant de ces molcules des indicateurs de biomasse viable, (3) laccs des informations relatives aux modes de biosynthse, (4) une relative facilit danalyse considrant les progrs en chimie analytique (Guezennec, 1995). Les principaux acides gras dorigine marine considrs comme biomarqueurs ainsi que les messages taxonomiques qui leurs sont associs sont rassembls dans le tableau I.5. 66

V.2.1.1. Les acides gras saturs normaux

En ce qui concerne les acides gras saturs, ils sont prsents dans tous les extraits lors de lidentification des lipides prsents dans les sdiments. Les acides longues chanes (>C20) avec prdominance pair reprsentent la contribution des vgtaux suprieurs (Eglinton et al., 1968; Matsumoto et al., 1981; Meyers, 1997). Pourtant, des travaux ont montr que ces composs peuvent tre synthtiss par les micro-algues (Volkman et al., 1980, 1989; Nichols et al., 1986; Dunstan et al., 1992) et les bactries (Volkman et al., 1988b). Parmi les acides chanes plus courtes (< C20), lacide palmitique n-C16:0 est lacide gras majoritaire (Barouxis et al., 1988; Bigot et al., 1989; Sun et Wakeham, 1994; Wakeham, 1999; Zegouagh et al., 1996; Camacho-Ibar et al., 2003), mais il ne fournit pas dinformations prcises sur lorigine de la matire organique. En effet, il a t identifi comme acide gras majoritaire chez des bactries marines, des cyanobactries, des algues et des vgtaux suprieurs (Parker et al., 1967; Volkman et al., 1980, 1988a; Parrish, 1988; Shaw et Johns, 1986; Scribe et al., 1991; Meyers et Eadie, 1993). Le rapport des acides gras < C20 par rapport ceux >C20 a t utilis pour estimer la contribution autochtone et terrestre (Kawamura et Ishiwatari, 1984). Labondance des acides gras pairs de longueur de chane moyenne, dont le nombre datome de carbone est de 12 20, est considre comme indicateur de la contribution des micro-algues autochtones (Taylor et al., 1984; Venkatesan, 1988; Grimalt et Albaigs, 1990; Sun et Wakaham, 1994; Johns et al., 1994), tandis que la prsence dacides gras normaux saturs de longueur de chane suprieure C20 avec prdominance pair est considre comme indicateur de la contribution terrigne (Saliot et al., 1980, 1991; Shaw et Johns, 1986; Venkatesan et al., 1987; Grimalt et Albaigs, 1990). Il est admis que ces acides longs drivent des plantes suprieures et ils reprsentent gnralement un maximum en C24, C26, C28 ou C30 (Venkatesan et al., 1987; Haddad et al., 1992). Le rapport C16:0/C26:0 est utilis pour indiquer la contribution autochtone par rapport la contribution allochtone dans les sdiments marins rcents (Venkatesan et al., 1987; Venkatesan, 1988; Ogura et al., 1990).

Les acides gras normaux nombre impair datomes de carbone (n-C15, n-C17 et n-C19) sont considrs comme biomarqueurs bactriens (Saliot, 1994, Mendoza et al., 1987a). Tronczynski et al. (1985), ont montr que les acides gras impairs sont 5 10 fois plus importants dans les bactries que dans les diatomes.

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V.2.1.2. Les acides gras insaturs

Les acides gras insaturs sont omniprsents dans la plupart des organismes et sont les plus abondants dans les sdiments marins. Les polyinsaturs sont trs abondants dans le phytoplancton et le zooplancton, tels les C20:5 et C22:6 (Morris and Culkin, 1976 ; Volkman et al., 1989, 1998), alors quils sont gnralement absents chez les bactries. En ce qui concerne les activits microbiologiques, certains acides gras monoinsaturs savrent caractristiques. La position de la double liaison permet souvent de remonter lorigine de lorganisme source : dans le cas des acides gras n-C18:1, la position 7 (lacide vaccnique) est favorise dans les cultures bactriennes par rapport la position 9 (acide olique) qui est caractristique des phytoplanctons (diatomes). Lacide vaccnique a t retrouv comme acide gras prdominant dans plusieurs espces (Williams et al., 1977; Cranwell, 1978; Perry et al., 1979; Gillan et Sandstrom, 1985), mais il reste principalement abondant chez les bactries, raison pour laquelle ce compos est gnralement considr comme marqueur typiquement bactrien. Le rapport n-C18:17/n-C18:19 est de 25 dans le cas des bactries alors quil est de 1 pour les diatomes et de 0,2 pour les algues vertes, ce qui permet de proposer la concentration de n-C18:17 comme critre de lactivit bactrienne sous rserve dune valuation de la contribution planctonique (Tronczynski et al., 1985). En effet, les microalgues peuvent aussi contribuer lacide vaccnique sdimentaire, mais il est alors accompagn de grande quantit dacides gras polyinsaturs (Guezennec et Fiala-Medioni, 1996). Une tude rcente sur la composition lipidique de la bactrie Marinobacter
hydrocarbonoclasticus, a montr une prdominance de lacide olique par rapport lacide

vaccnique (le rapport n-C18:19/n-C18:17 est de 8), ce qui montre que ces marqueurs doivent tre utiliss avec prudence (Lattuati et al., 2002). Certaines bactries telles que les sulfatorductrices peuvent tre des sources significatives dacide palmitolique n-C16:17 (Volkman et al., 1980, 1998) cependant, ce compos est considr comme caractristique des diatomes (Mc Caffrey et al., 1989). Les acides gras insaturs 5 sont prsents dans plusieurs bactries telles Desulforomonas acetoxidans, Desulfobacter AcBa, Desulfobulbus sp., Flavobacter
flexilis, et la pluspart des souches de Methylomonas et Methylococcus (Guezennec et Fiala-

Medioni, 1996). Les acides n-C16:110 (Sire et al., 1988), n-C15:16 et n-C17:18 (Perry et al., 1979) sont aussi considrs comme biomarqueurs bactriens. Un raffinement dans le critre de lactivit bactrienne peut tre obtenu en dterminant lisomrie de la double liaison, sachant que les acides gras monoinsaturs de configuration

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trans nexistent en gnral pas chez les bactries, lexception du C16:113 (Tronczynski et al.,

1985). On signale que les acides gras insaturs sont largement distribus chez les bactries Gram-ngatives et reprsentent des composs minoritaires chez la plupart des bactries Grampositives. Certains gochimistes utilisent le rapport C16 / C18 ( = somme des acides gras saturs et insaturs) pour dterminer lorigine de la matire organique. En effet, de grandes valeurs de ce rapport sont caractristiques des diatomes (Saliot et al., 1991).

V.2.1.3. Les acides gras ramifis

Les acides gras ramifis nombre impair datomes de carbone sont, dune manire gnrale, plus abondants chez les bactries que chez les diatomes et les algues vertes (de lordre de 5 10 fois plus) (Tronczynski et al., 1985). Les acides gras ramifis en position iso et anteiso de C13 C17 saturs ou non sont utiliss comme marqueurs des bactries Grampositives et des bactries anarobies Gram-ngatives telles que les sulfato-rductrices (exemple : Desulfovubrio spp.) (les bactries Gram-ngatives arobies, sont essentiellement riches en acides gras monoinsaturs) (Boon et al., 1977b; Tronczynski et al., 1985; Perry et al., 1979; Volkman et al., 1980, 1998; Saliot et al., 1991; Guezennec et Fiala-Medioni, 1996; Harvey et Macko, 1997; Zelles, 1997). Ils peuvent dans certains cas reprsenter de 40 70 % des acides gras totaux (Gillan et al., 1983) alors quils nexistent quen trs faibles quantits chez les autres groupes dorganismes marins tels que les espces phytoplanctoniques et ne sont pas inclus dans les mtabolismes des animaux et vgtaux suprieurs. Ainsi, pour la bactrie Gram-positive Micrococcus agilis, le pourcentage dacides gras iso et anteiso C15:0 correspond 73 % des acides gras totaux ; et dans le cas de Micrococcus haliobius, les acides gras iso et antiso de C14:0 C17:0 reprsentent pratiquement la totalit des acides gras, lacide gras C17:0 reprsente lui seul 45 % des acides gras totaux (OLeahy et Wilkinson, 1988). Les acides gras ramifis autres que iso et anteiso, tels les acides ramifis en position 10, sont largement observs chez les bactries Gram-positives et seulement chez quelques bactries Gram-ngatives (Zelles, 1997).

Certains acides gras ramifis saturs ou non, sont des marqueurs caractre hautement spcifique ne concernant quun nombre limit de microorganismes. Parmi ceux-l, on peut

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citer les bactries sulfato-rductrices (i-C17:17c, 10-MeC16:0) et les bactries thio-oxydantes (10,11-diMeC18:16) (Guezennec et Fiala-Medioni, 1996; Parkes et al., 1993; Taylor et Parkes, 1983).

Ces composs sont donc considrs comme de trs bons marqueurs de lactivit bactrienne en raison de leurs spcificits.
O HO C O HO C anteiso iso

Figure I.25. Exemple dacides gras iso et anteiso 17 atomes de carbone.

V.2.1.4. Les acides gras cyclopropaniques

Les acides gras cyclopropaniques sont caractristiques des bactries arobies et anarobies (Guckert et al., 1985; Wilkinson, 1988; Fang et Barcelona, 1998; Pancost et al., 2001) bien quils aient t galement identifis chez quelques algues marines (Meyers et Holz, 1966), chez des champignons et des plantes terrestres (Zelles, 1999). Aussi ces composs ont t considrs comme marqueurs bactriens. Perry et al. (1979) ont identifi les acides gras saturs cyclopropaniques C179,10 et C1911,12 dans les sdiments marins, ce dernier tant considr comme biomarqueur typiquement bactrien. Les acides gras cyclopropaniques sont prsents chez la pluspart des bactries Gramngatives (Xu et al., 2000; Zelles, 1997; Wilkinson, 1988). A titre dexemple, deux acides gras cyclopropaniques ont t identifis chez la bactrie Escherichia coli, lacide cis-9,10mthylnehexadcanoque et lacide cis-11,12-mthylneoctadcanoque (Figure I.26). Ces acides gras cyclopropaniques sont accumuls partir du prcurseur mononoque lors du passage de la phase exponentielle la phase stationnaire de croissance (Wilkinson, 1988). Dans le cas des bactries Desulfobacter sp., isoles des sdiment marins, lacide gras cyclopropanique C17 peut constituer jusqu' 30 % des acides gras totaux et il a t considr 70

comme caractristique de ce genre bactrien (Dowling et al., 1986). Zelles (1997) a tudi la composition en acides gras phospholipidiques et lipopolysaccharidiques de diffrents organismes (10 bactries Gram-ngatives, 9 bactries Gram-positives, 10 champignons et 11 plantes) et il a trouv que les acides gras cyclopropaniques existent essentiellement chez les bactries Gram-ngatives ce qui lui a permis de considrer ces composs comme marqueurs spcifiques des bactries Gram-ngatives. Il faut aussi considrer les facteurs environmentaux pouvant influencer la teneur en acides gras cyclopropaniques. En effet, de faibles valeurs de pH et de tension en oxygne, des fortes concentrations de NaCl, dautres sels ou de sucrose, sont des facteurs encourageant la cyclopropanation des acides gras mononoques (Wilkinson, 1988; Lundquist et al., 1999).

CH3-(CH2)5-CH

CH-(CH2)9-COOH CH2

CH3-(CH2)5-CH

CH-(CH2)7-COOH CH2

acide cis-11,12-mthylneoctadcanoique

acide cis-9,10-mthylnehexadcanoique

Figure I.26. Structure de deux acides gras cyclopropaniques rencontrs chez la bactrie Gramngative E. coli.

V.2.2. Les hydroxy acides

Un grand nombre dhydroxy acides (, , , et (-1)) ont t identifis dans les sdiments (Boon et al., 1977a; Eglinton et al., 1968; Cranwell, 1981a; Kawamura et Ishiwatari, 1982; Volkman et al., 1980; Wakeham, 1999), mais ce nest que durant les dernires annes que les gochimistes organiciens ont accord beaucoup dattention la distribution et labondance de ces composs dans les bactries et dans les sdiments. Ces composs peuvent tre spars en plusieurs catgories suivant le nombre et la position des groupements hydroxyles. Les - et les -hydroxy acides aliphatiques ont t identifis dans un grand nombre de micro-organismes (bactries, levures, champignons, prokaryotes photosynthtiques; Ratledge et Wilkinson, 1988) et sont gnralement des produits intermdiaires de la - et de l'-oxydation des acides gras mono-carboxyliques; la oxydation est plus courante que l-oxydation, bien que cette dernire soit rencontre chez les animaux, les plantes et les bactries (Volkman et al., 1998).

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Quelques travaux exhaustifs sur la distribution et labondance des hydroxy acides ont t raliss sur diffrentes bactries marines et il a t montr que les -hydroxy acides de C10 C20 avec un maximum C12, C14 ou C16 sont caractristiques des distributions lipidiques membranaires des bactries Gram-ngatives (Wollenweber, et al., 1984; Goossens et al., 1986, 1989a; Klock et al., 1988; Skerratt et al., 1992; Lattuati et al., 2002; Wakeham et al., 2003), bactries les plus abondantes dans les milieux marins (Giovannoni et Rappe, 2000). Ces hydroxy acides sont chanes normales, nombre pair datomes de carbone et sont engags dans les lipopolysaccharides des paroies internes des bactries Gram-ngatives, o ils sont lis aux groupes amides et hydroxydes de la D-glucosamine disaccharide par respectivement lintermdiaire de liaisons esters et amides (Figure I.24) et ils peuvent suivant lespce atteindre 70 % des acides gras totaux. Cependant, certaines bactries synthtisent des
-hydroxyacides nombre impair datomes de carbone iso et anteiso (voir Tableau I.5). Des -hydroxy acides ont t galement identifis chez des bactries Gram-ngatives; ainsi pour Serratia marcescens, le pourcentage du -hydroxy acide C14:0 et de 61 %, et celui de l-

hydroxy acide C14:0 est de 10 %. Chez la bactrie Pseudomonas paucimobilis lunique acide gras prsent dans les lipopolysaccharides est l-hydroxy acide C14:0 (Wilkinson, 1988). La dtermination des - et -hydroxy acides dans les sols, les sdiments et leau permet davoir des informations sur les communauts microbiennes prsentes (Keinnen et al., 2003). La prsence des -hydroxy acides chanes courtes dans les sdiments (de C10 C16 avec un maximum C12 ou C14) est attribue aux bactries alors que les -hydroxy acides et les -hydroxy acides longues chanes sont assimils des produits doxydation microbiennes et/ou chimiques des acides gras (Gillan et al., 1981; Mendoza et al., 1987b; Fukushima et al., 1992a,b). Cranwell (1981a) a tudi la strochimie des hydroxy acides sdimentaires et il a montr que les -hydroxy acides non lis de C14 C18 sont des produits de la biodgradation des acides gras ayant la configuration S pour le carbone portant lhydroxyle alors que les -hydroxy acides lis constitutifs des membranes, prsentent une configuration R pour le carbone portant lhydroxyle. Goossens et al. (1986), aprs avoir compar la distribution des -hydroxy acides dans diffrentes bactries et trois sdiments, ont propos les -hydroxy acides engags dans les liaisons amides dans les lipopolysaccharides (donc extractibles en milieu acide), comme marqueurs exclusifs des bactries Gram-ngatives et les ont considrs comme biomarqueurs de la prsence bactrienne (Goossens et al., 1986, 1989a, b; Lattuati et al., 2002; Wakeham, 1999, 2003).

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Les bactries contribuent galement avec des quantits significatives de -hydroxy acides ramifis iso et antiso de C12 C18 aux sdiments (Volkman et al., 1998). Mais ces composs sont galement produits par des cyanobactries et en faible quantit par des microalgues (Matsumoto and Nagashima, 1984). Les -hydroxy acides saturs de C16 C28 avec un maximum 16:0 et 24:0 retrouvs dans les sdiments marins (Volkman et al., 1980) ont t attribus une herbe marine (Zostera mulleri) prsentant une distribution en hydroxy acides similaire celle des sdiments. Dautres tudes sur la composition en acides gras de diffrentes herbes marines ont montr des distributions en -hydroxy acides de mme longueur de chane que Zostera mulleri (Gillan et al. 1984; Nichols et Johns, 1985; de Leeuw et al., 1995). Les -hydroxy acides de C16 C26 (C16 prdominant), et les -hydroxy acides de C8 C20, normaux nombre pair datome de carbone sont prsents chez des micro-algues (Rhodophyces et Chlorophyces) (Matsumoto et Nagashima, 1984; Matsumoto et al., 1984). Une revue de Volkman et al.(1998), a montr la prsence des - et -hydroxy acides de C26 C30 (non lis et extractibles en milieu basique) dans diffrentes micro-algues. Les - et (-1)-hydroxy acides peuvent tre obtenus par loxydation terminale des acides gras (Heinz et al., 1969; Miura et Fulco, 1975) par les microorganismes, qui dpendent de la spcificit de lhydroxylation de ces derniers. Les -hydroxy acides sont donc des mtabolites intermdiaires dans loxydation des acides mono-carboxyliques en acides dicarboxyliques. Cest le type de liaison aux structures macromolculaires de la cellule qui permet la diffrenciation entre les hydroxy acides provenant de loxydation et de synthse. La cutine et la subrine des plantes suprieures peuvent contribuer aux -, - et surtout aux -hydroxy acides sdimentaires de C16 C22, ainsi quaux polyhydroxy acides (di- et tri-) C16 et C18 (Cardoso et Eglinton, 1983). En effet les -hydroxy acides qui sont des constituants majeurs de la cutine et de la subrine sont gnralement domins par 16:0, 18:0, 18:19 et 18:2 6,9 (Huang et al., 1996). Les -hydroxy acides longues chanes des C16 C28 ont t identifis chez les herbes marines (Nichols et al., 1982; Nichols et Johns, 1985; Huang et al., 1996) et sont galement retrouvs dans les sdiments (Shaw et Johns, 1986). Une tude rcente de Allard et Templier (2001) montr lexistence d'-hydroxy acides normaux longs, saturs et mono-insaturs nombre pair datomes de carbone, de C28 C36 (maximum C32) chez des micro-algues. Les (-1)-hydroxy acides de C14 C30 ont t identifis dans plusieurs sdiments (Mendoza et al., 1987b; Goossens et al., 1989b; Shaw et Johns, 1985, 1986; Fukushima et al., 1992a, b; Wakeham, 1999) mais la dtermination des organismes sources nest pas vidente. 73

Boon et al. (1977b) et Kawamura et al. (1987) ont suggr que ces composs sont produits par des microorganismes arobies. Cependant, Wakeham (1999) a identifi des (-1)-hydroxy acides de C14 C30 avec prdominance paire (maximun C24, C26 et C28) dans des sdiments anarobies et il les a attribu des sources allochtones (plantes suprieures). Certaines bactries mthanotrophes contiennent en plus des - et -hydroxy acides de C10 C18 prdominance paire, des (-1)-hydroxy acides normaux longs, nombre pair datomes de carbone (C26, C28 et C30) (Nichols et al., 1985; Urakami et Komagata, 1987; Skerratt et al., 1992), ce rsultat a permis lidentification dune ventuelle contribution des bactries aux (1)-hydroxy acides sdimentaires. Fukushima et al. (1992a), ont identifi ces mmes composs dans des sdiments lacustres, mais ils les ont attribu aux plantes suprieures. Huang et al. (1996), ont attribu les (-1)-hydroxy acides C28 et C30 des organismes aquatiques photosynthtiques en raison de labsence de -hydroxy acides, gnralement plus abondants que les (-1)-hydroxy acides chez les bactries mthanotrophes. Le (-1)-hydroxy acide C26 a t aussi retrouv chez deux cyanobactries, Anabaena cylindrica et Aphanizomenon flosaquae (Volkman et al., 1998).

V.2.3. Autres marqueurs bactriens

Les acides gras lis aux phospholipides et aux lipopolysaccharides, ne sont pas les seuls constituants bactriens utilisables en chimiotaxonomie. Il en existe dautres, certes moins utiliss, mais pour certains dune grande spcificit. Parmi ces composs, on peut citer les quinones (benzoquinones et naphtoquinones), les carbohydrates, les acides amins (orthinine, D-alanine et acide glutamique), lacide muramique, lacide diaminopimlique et les hopanes (Guezennec, 1995). Les structures de ces composs sont reprsentes sur la Figure I.26.

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HOCH2 O H3CO CH3


H

O CH3 HO
H

O OH NH2

H3CO O n O n

H3C-C-COOH H

Quinones

Acide muramique

H (CH2 )3

NH2 C COOH

HOOC

C NH2

Acide diaminopimlique

Exemple d'un hopane: 17(H), 21(H)-Homohopane C31H51

Figure I.26. Formules chimiques dautres marqueurs bactriens.

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Tableau I.5. : Principaux acides gras et messages taxonomiques associs.

Acides gras

Messages taxonomiques

Acides normaux saturs - Acides longues chanes (> C20) avec - Vgtaux suprieurs prdominance pair. - Acides nombre pair datomes de carbone - Micro-algues de C12 C20. - Acides nombre impair datomes de - Bactries carbone: C15, C17 et C19. Acides normaux saturs - Polyinsaturs - C18:17, C16:110, C17:18 et C15:16 - C16:17 et C18:19 Acides ramifis - Acides iso et antiso, saturs et insaturs nombre impair datomes de carbone - i-C17:17 et 10-Me-C16:0 - 10,11-diMe-C18:16 Acides cyclopronaniques - C179,11 et C1911,12

- Phytoplancton et zooplancton - Bactries Gram-ngatives - Phytoplancton

- Bactries Gram-positives et anarobies Gram-ngatives - Bactries sulfato-rductrices - Bactreies thio-oxydantes

- Bactries Gram-ngatives

Hydroxy acides - Bactries Gram-ngatives - -hydroxyacides de n-C10 n-C20 avec un maximum C12, C14 ou C16 - -hydroxyacides iso et antiso de C12 C18 - Bactries - Herbes marines - -hydroxyacides de C16 C28 avec un maximum C16 et C24 - -hydroxyacides de C16 C26 avec un C16 - Mico-algues prdominant et les -hydroxyacides de C8 C20, normaux nobre pair datome de carbone - -, - et -hydroxyacides de C16 C22 et les - Plantes suprieures polyhydroxyacides C16 et C18 - Herbes marines - -hydroxyacides de C16 C28 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Nomenclature: la nomenclature simplifie se traduit par une premire valeur indiquant le nombre de carbones constituant lacide, suivie du nombre de doubles liaisons et la position de ces doubles liaisons. Celle-ci est spcifie partir du carbone terminal (). Les prfixes "i" et "a" se rapportent la ramification iso et anteiso, et lisomrie de configuration par "c" (cis) et "t" (trans). La prsence de groupements "mthyle","hydroxy" ou "mthoxy" est notifie par labrviations "Me", "OH" et "MeO", respectivement; prcde par la position de ce groupement partir du carbone carboxylique. Exemple: 10MeC18:17c indique un acide gras linaire 18 atomes de carbone monoinsatur possdant: une double liaison sur le septime carbone compter du carbone terminal, cette double liaison possdant une configuration cis, et une ramification mthyle en position 10 partir du groupement mthyle terminal.

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------76

V.3. LES HYDROCARBURES

Les hydrocarbures, composs ubiquistes dans le milieu naturel, reprsentent une faible proportion de la matire organique sdimentaire rcente. Cependant ces composs facilement analysables et stables reprsentent des biomarqueurs trs utiliss pour lucider les sources de la matire organique (Wakeham, 1990; Zegouagh, 1998). De nombreux travaux ont port sur la caractrisation des hydrocarbures isols des sdiments de surface provenant de divers environnements marins, les composs identifis correspondent un mlange complexe dhydrocarbures normaux saturs et insaturs, ramifis saturs (alcanes iso et anteiso, isoprnodes) et polycycliques saturs et insaturs. Les principaux hydrocarbures dorigine marine, ainsi que les messages taxonomiques qui leur sont associs sont rassembls dans le tableau I.6.

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Tableau I.6. Principaux hydrocarbures marins et les messages taxonomiques associs.

Hydrocarbures n-alcanes:

Message taxonomique

Rfrences

- nombre impair datomes de C de n-C23 n-C33 Plantes suprieures avec un maximum n-C27, n-C29 ou n-C31. - de C13 C19 nombre impair datomes de C: n- Phytoplancton C15, n-C17 et n-C21.

(1)(2)(3)

(4)(5)(6)(7)(8)

- de n-C13 n-C31 avec une prdominance des Bactries (Rodospirillum rubrum, (9)(10)(8) composs nombre pair datomes de C: n-C16, n- Clostridium acidiurici) C18 et n-C20. Alcanes ramifis: - Iso/antiso nombre impair datomes de C: C15 Bactries et C17. Alcanes isoprniques: - Pristane (C19), phytane (C20), squalane (C30) Phytoplancton, bactries et archaea zooplancton, (12)(4)(13) (14)(15)(10) (16)(17) - Alcanes isoprniques fortement ramifis C20, C25 Diatomes et C30. n-alcnes: n-C17:1 et n-C17:2 Alcnes ramifis: Iso/antiso Alcne isoprnique: Squalne Bactries (Rodospirillum rubrum, (10)(17) Clostridium acidiurici) et archaea - Alcnes isoprniques fortement ramifies C20, C25 Diatomes C30 et C35. (11) Bactries (18) Bactries (Vibrio marinus) (9)(10) (11) (11)

(1) Eglinton et al., 1962; (2) Kolattukudy et al., 1976; (3) Simoneit, 1986; (4) Blumer et al., 1971; (5) Douglas, 1981; (6) Payne et al., 1985; (7) Clark et Blumer, 1967; (8) Saliot, 1981; (9) Oro et al., 1967; (10) Han et Calvin, 1969; (11) Nichols et al., 1988; (12) Blumer et al., 1964; (13) Volkman et al., 1980; (14) Lee et al., 1970; (15) Volkman et al., 1992; (16) Goossens et al., 1984; (17) Langworthy, 1985; (18) Albro et Dittmer,1971.

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CHAPITRE II

Etude exprimentale

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I. ORIGINE DES SOUCHES

La bactrie Marinobacter hydrocarbonoclasticus (souche sp 17) utilise dans la prsente tude a t fournie par le Laboratoire d'Ocnographie de Marseille. Les trois autres bactries, Marinobacter aquaeolei, Acinetobacter calcoaceticus et Pseudomonas olovorans ont t procures par l'institut Pasteur de Paris. Elles sont enregistres respectivement sous le numro 106100T, 66.33 et 59.11T.
II. MILIEUX ET CONDITIONS DE CULTURE

II.1. COMPOSITION CHIMIQUE DES MILIEUX DE CULTURES

1) Trois des quatre bactries tudies (Marinobacter hydrocarbonoclasticus, Marinobacter aquaeolei et Acinetobacter calcoaceticus) sont cultives dans des milieux

prpars avec leau de mer synthtique, dont la composition en g.l-1 est la suivante:

- Tris (Hydroxymthyl-aminomthane - NaCl...... - KCl.... - NH4Cl.... - MgSO4.7H2O..... - MgCl2.6H2O.. - CaCl2.2H2O...

2 23 0,75 1 6,16 5,08 1,98

Le pH est ensuite ajust une valeur de 7,5 7,8 avec une solution concentre d'HCl (10 M). Dans le cas o le pH descend une valeur infrieure, il faut viter dutiliser une solution basique pour ne pas modifier la salinit; on utilise alors le Tris pour le faire remonter.

2) Dans le cas de Pseudomonas oleovorans on a utilis un autre milieu de culture dont

la composition est la suivante (Schwartz, 1973):

(NH4)2HPO4.. 10,0 g K2HPO4. 5,0 g Na2SO4.. 1,0 ml CaCl2 (50 g/l) 1,0 ml Sels :. 10,0 ml solution I Micro-lments :... 1,0 ml solution II Eau distille.. 1 litre Le pH est ajust une valeur de 7,5 7,8 par une solution dHCl 10 M. 80

La composition en g.l-1 des solutions I et II est la suivante:

Solution I MgSO4.7H2O 40,0 g FeSO4.7H2O.. 2,0 g MnSO4.7H2O 1,6 g NaCl.. 2,0 g Eau distille... 1 litre Solution II H3BO3... CuSO4.5H2O. Na2MoO4.H2O.. ZnSO4.7H2O. CuCl2.6H2O.. Eau distille..

0,50 g 0,04 g 0,20 g 8,00 g 0,20 g 1 litre

Les hydrocarbures (1 g/l), sont additionns aux milieux de culture avant strilisation 120 C pendant 20 minutes. Dans le cas des trois premires bactries, 2 ml dune solution de sulfate de fer (FeSO4.7H2O, 1 g.l-1) et 4 ml dune solution de phosphate de dipotassium (K2HPO4, 18,6 g.l-1), striliss sparment (120 C pendant 20 minutes), sont ajouts dans le milieu de culture avant utilisation.

II.2. CONSERVATION DES SOUCHES

Les souches sont conserves 4 C sur milieu riche solide, constitu deau de mer synthtique contenant 5 g.l-1 de bactopeptone (bioMrieux), 5 g.l-1 dextrait de levure (bioMrieux) et 20 g.l-1 dagar-agar (bioMrieux). Le repiquage est effectu tous les mois.

II.3. CULTURE SUR HYDROCARBURES

Pour raliser les cultures sur hydrocarbures, on commence par effectuer deux prcultures successives. La premire est ralise avec un substrat soluble comme source de carbone, lactate dammonium (concentration: 4 g.l-1), partir de colonies conserves sur glose nutritive ges de 24 heures. En dbut de phase stationnaire de croissance, cette prculture sert dinoculum pour la seconde: elle est rajoute raison de 5 % en volume un

81

milieu contenant lhydrocarbure. Ces deux prcultures sont effectues dans des erlenmeyers de 500 ml contenant 120 ml de milieu de culture, avec agitation magntique une temprature de 25 C ( 2). Les prcultures sur hydrocarbures servent, lorsqu'elles entrent en phase stationnaire de croissance, d'inocula pour les expriences elles-mmes: elles sont ajoutes, raison de 5 % en volume, des erlenmeyers de 3 l contenant 750 ml de milieu et 1g/l d'hydrocarbure. Toutes les cultures sont ralises avec agitation magntique (400 tpm) une temprature de 25 C ( 2 ). La croissance a t suivie par mesure de la densit optique 450 nm avec un spectrophotomtre UV (Varian DMS 90). Les cultures sont arrtes en fin de phase exponentielle de croissance et les biomasses sont recueillies par centrifugation 10000 tpm 4 C pendant 15 min. Les culots sont lavs avec 30 ml deau de mer synthtique puis lyophiliss.

III. Synthese des hydrocarbures

Certains des hydrocarbures utiliss comme source de carbone dans les cultures des diffrentes souches bactriennes sont disponibles dans le commerce alors que d'autres ont d tre synthtiss. Les hydrocarbures utiliss, leur puret et leur origine sont exposs dans le tableau II.1.

Tableau II.1. Liste des hydrocarbures utiliss comme source de carbone.


Hydrocarbure n-nonadcane n-nonadec-1-ne Hneicosane Phnyldodcane Phnyltridcane Propylbenzne Ethylbenzne 2,2,4,4,6,8,8-heptamthylnonane Pristane ai-nonadcane i-icosane ai-icosane 10-mthylnonadcane i-nonadcane Cyclohexyldodcane Cyclohexyltridcane Origine Fluka Fluka Lancaster Aldrich Aldrich Aldrich Aldrich Aldrich Sigma Puret 99 % 99 % 99 % 96 % 99 % 98 % 99 % 98 % 98 % 98 % 97 % 99 % 97 % 96 % 99 % 99 %

Synthtiss suivant la raction de Wittig. Obtenus par hydrognation catalytique de leur homologues insaturs.

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Dans le cas de la synthse du 10-Me-C19 la procdure est la suivante (Jones and Gilman, 1951; Newman, 1960): Dans un ballon rod, on introduit successivement 11,22 g (31,5 mmoles) de bromure de mthyltriphnylphophonium et 50 ml de THF anhydre. Aprs solubilisation temprature ambiante, on rajoute sans agitation 60 ml dune solution de n-butyl lithium dans le THF anhydre (1,5 M dans lhexane; 32,4 mmol) et le mlange ractionnel est agit pendant 48 heures 67 C. Ensuite, 3 g de nonadcan-10-one (10,5 mmoles) en solution dans 10 ml de THF anhydre sont additionns et le mlange est mis reflux pendant 72 heures. Aprs refroidissement, le mlange ractionnel est centrifug et le surnageant est dilu dans 200 ml de dithyl ther et lav leau (2 200 ml). La phase organique est ensuite sche au sulfate de sodium, filtre sur coton et concentre sous pression rduite. Lolfine produite lors de la raction (10-mthylne-nonadcane) est spare par chromatographie du produit brut sur colonne dalumine (60 g, activit II) et lue avec 660 ml dheptane. Le 10-mthylnonadcane est obtenu par hydrognation du 10-mthylne-nonadcane en solution dans 15 ml dheptane, en prsence de Rhodium sur charbon 5 % comme catalyseur, 70 C, sous une pression de 20 bars d'hydrogne et pendant 24 heures. Le catalyseur est ensuite spar par centrifugation et le 10-mthylnonadcane est purifi par lution sur colonne dalumine (60 g, activit II) avec 660 ml dheptane. Lheptane est vapor sous pression rduite puis au dessiccateur pour liminer les traces restantes. Les alcanes antiso C19 et C20 sont obtenus respectivement par la raction de lthylidne triphenylphosphorane obtenu par raction du bromure d'thyltriphnylphosphonium et du n-butyl lithium, avec respectivement lheptadcan-2-one (Fluka, puret 99 %) et loctadecan-2-one (Fluka, puret 99 %), suivie dune rduction catalytique des olfines. Liso C20 est issu de la raction de loctadecan-2-one avec le mthylidene triphenylphosphane (obtenu par raction du bromure de mthyltriphnylphosphonium avec le n-butyl lithium), suivie d'une rduction de lolfine. Par ailleurs, liso nonadcane est prpar par hydrognation catalytique du cis-2mthyl-octadec-7-ene (Lancaster, puret 98 %) en solution dans 15 ml d'heptane, en prsence de Rhodium sur charbon 5 % comme catalyseur, 60 C, sous une pression de 20 bars d'hydrogne et pendant 24 heures. De mme, le cyclohexyltridcane et le cyclohexyldodcane sont obtenus partir de la rduction catalytique des phnylalcanes correspondants. Les structures des hydrocarbures synthtiss ont t vrifies par CG/SM (spectres de masse en annexe 1 et 2) et leurs degrs de purets ont t dtermins par CG.

83

IV. EXTRACTION DES LIPIDES DES DIFFERENTES CULTURES

Le protocole gnral d'extraction des diffrentes catgories de lipides des bactries Gram-ngatives tudies au cours de ce travail est rapport sur la Figure II.1.

Biomasse bactrienne lyophilise


Extraction CH3Cl3/MeOH
Extrait Rsidu

1) Transestrification 2) Extraction
Extrait

Mthanolyse basique
Rsidu

Lipides "non lis" + hydrocarbures rsiduels

1) Extraction 2) Estrification

Hydrolyse acide

Sparation sur colonne de silice

Lipides labiles en milieu basique


Drivatisation: TMS DMDS N-acylpyrrolidides

Extrait

3) Extraction 4) Estrification

Lipides "non lis"

Rsidu

Drivatisation: TMS DMDS N-acylpyrrolidides

Lipides labiles en milieu acide


GC, GC/MS Drivatisation: TMS DMDS N-acylpyrrolidides

GC, GC/MS

GC, GC/MS

Figure II.1. Protocole gnral dextraction des diffrents groupes de lipides des bactries Gram-ngatives. 84

IV.1. ISOLEMENT DES LIPIDES FACILEMENT EXTRACTIBLES

Les biomasses bactriennes lyophilises (de 0,5 1,5 g), pralablement broyes sous forme de poudre fine sont extraites par 100 ml d'un mlange chloroforme/mthanol (80/20, v/v). Aprs agitation pendant 24 heures, le mlange est filtr au moyen de filtres de porosit 0,5 m, type FH (millipore), et la solution obtenue est concentre sec au rotavapor. Les acides gras prsents sous forme d'esters dans les extraits lipidiques sont drivs en esters mthyliques par transestrification en milieu basique dans le mthanol (Orgambide et al., 1993). L'extrait, dissous dans 70 ml de mthanol 0,1 M en KOH, est agit pendant 2 heures 0C. La raction est arrte par addition de 120 ml d'une solution aqueuse de HCl 5%. Les lipides sont extraits du milieu ractionnel (par aliquote de 50 ml) par 150 ml d'ther, 50 ml d'heptane. La phase organique est lave leau jusqu' pH neutre. La phase organique est rcupre dans un erlenmeyer, et sche par addition de 50 g de sulfate de sodium. Aprs filtration et vaporation du solvant, le produit est repris dans un volume connu d'heptane (de l'ordre de 5 10 ml). Les hydrocarbures utiliss comme source de carbone pour les cultures bactriennes et qui ont t co-extraits avec les lipides "non lis", sont limins par chromatographie sur colonne de silice (12 g de gel de silice, 70 - 230 meshs, Merck). Lextrait brut dpos en tte de colonne en solution dans lheptane est fractionn en deux fractions. Les hydrocarbures sont lus avec 60 ml dheptane et les lipides bactriens sont ensuite rcuprs avec 60 ml dun mlange diethyl ther/mthanol (4/1, v/v). Cette dernire fraction est concentre sous pression rduite et la solution obtenue est prte pour l'analyse en chromatographie en phase gazeuse et en chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse.

IV.2. EXTRACTION DES LIPIDES EN MILIEU BASIQUE

Au rsidu bactrien rcupr aprs la premire extraction, on fait subir une mthanolyse en milieu basique par addition de 20 ml de mthanol/KOH (1M). Le mlange est mis reflux pendant deux heures. La partie insoluble est filtre et rince avec 20 ml de mthanol. Au filtrat on ajoute 120 ml d'HCl 10 % et 120 ml d'eau. Les lipides librs par attaque basique et incluant les esters mthyliques d'acides gras sont ensuite extraits en suivant le mme protocole que celui utilis pour les lipides existant sous forme libre. 85

Pour tre sr que la mthylation soit totale, une raction d'estrification supplmentaire a t effectue avec le diazomthane en solution dans l'ther (2 ml), il s'agit d'une raction instantane qui permet d'estrifier les acides gras libres prsents dans le mlange. Le solvant et l'excs de diazomthane sont vapors, et les lipides labiles en milieu basique sont repris dans un volume connu d'heptane (3 5 ml).

IV.3. EXTRACTION DES ACIDES LABILES EN MILIEU ACIDE

Au rsidu rcupr aprs l'extraction des lipides labiles en milieu basique, on ajoute 12 ml d'une solution aqueuse d' HCl 4 M; le mlange est mis reflux 110C pendant 6 heures. Aprs refroidissement, le mlange est filtr par des filtres de porosit 0,5 m type FH et le rsidu est rinc avec 20 ml d'eau et ensuite avec 20 ml de mthanol. Les lipides librs par attaque acide sont extraits du filtrat en suivant le mme protocole que celui dcrit pour les lipides existant sous forme libre. Une fois le solvant vapor, les acides gras sont estrifis par le diazomthane en solution dans l'ther. Aprs vaporation de l'ther et du diazomthane en excs, l'extrait est reconstitu dans quelques dizaines de microlitres d'heptane. Les composs lipidiques seront ensuite identifis par CG et CG/SM/IE.

V. Synthse du diazomthane

Le diazomthane a t prpar en solution thre par laction dune base sur un nitrosamide, en prsence dalcool (Williams, 1993). Dans notre cas, la base utilise est lhydroxyde de potassium, le nitrosamide choisi est le N-mthyl-N-nitroso-p-tolune sulfonamide (diazald
TM

) et lalcool tant lthanol. La synthse du diazomthane seffectue

selon le schma prsent sur la Figure II.2. A 1,25 g de KOH dissous dans 2 ml deau distille et 2,5 ml dthanol 95 %. On rajoute goutte goutte une solution de diazald 1,25 g dans le dithylther (30 ml). Le diazomthane form et l'ther sont condenss au niveau du compartiment "B", maintenu une temprature de lordre de 20 C grce un mlange de glace et de chlorure de sodium. Le diazomthane est potentiellement explosif, il faut viter en particulier les verreries rodes et la forte lumire. Les solutions de diazomthane dans le dithylther sont stables 86

pour des courtes dures condition qu'elles soient stockes lobscurit et basse temprature.

Diazald / Et2O

KOH / H2O / EtOH Glace / NaCl (2/3, 1/3)

Bain Marie 65 C

Diazomthane / Et2O

Glace

CH3C6H4SO2N(NO)CH3 + ROH

CH2N2 + CH3C6H4SO3R + H20

Figure II.2. Prparation du diazomthane partir du N-mthyl-N-nitroso-p-tolune sulfonamide.

VI. PREPARATION DES DERIVES DIMETHYL DISULFURES (DMDS)

A une partie de lextrait lipidique (2mg) pralablement vapore sec, dissoute dans 100 l dheptane sont ajouts 100 l de DMDS et 1,2 mg diode en solution dans 20 l de dithylther (60 mg dans 1 ml de dithylther) (Scribe et al., 1990). La solution ainsi obtenue est chauffe 50C en tube de Pyrex hermtiquement clos par un bouchon en Tflon, pendant 48 heures, ce qui nous permet dobtenir des rendements quantitatifs. Il est dconseill deffectuer la raction des tempratures suprieures pour diminuer le temps de raction, afin dviter la formation de composs secondaires gnant lanalyse par CG/SM. Ensuite lexcs diode est rduit par addition de 200 l dune solution aqueuse de thiosulfate de sodium (5 %

87

en poids), le mlange ractionnel est extrait deux fois par 200 l dheptane. Les phases organiques rcupres sont rassembles, concentres sous un courant dazote et immdiatement analyses par CG/SM/IE.

VII. DETERMINATION DE LA POSITION DU GROUPEMENT HYDROXYLE DES HYDROXYACIDES ET DES ALCOOLs: PREPARATION DES DERIVES TRIMETHYLSILYLES

A une partie de l'extrait lipidique (1 5 mg) pralablement vapore sec, on rajoute successivement 100 l de pyridine anhydre, 20 l d'hexamethyldisilazane et 10 l de trimthylchlorosilane. La solution ainsi obtenue est agite au vortex pendant une minute temprature ambiante, centrifuge et la phase liquide est rcupre et concentre sous un courant dazote. Le produit est prt pour l'analyse par CG/MS/IE.

VIII. FORMATION DES DERIVES N-ACYL-PYRROLIDIDES

A une partie de lextrait lipidique dont on a limin le solvant, on rajoute: 900 l de pyrrolidine et 100 l dacide actique (Ayanoglu et al, 1982). Le mlange est chauff 100 C pendant une heure dans un tube hermtiquement clos. Les drives N-acyl-pyrrolidides sont extraits lther (20 ml), en milieu acide (20 ml dHCl 10 %). La phase ther est ensuite lave jusqu' pH neutre puis sche au sulfate de sodium. Aprs filtration sur coton, lther est ensuite limin lvaporateur rotatif et le rsidu dissous dans lheptane pour tre analys par CG et CG/SM/IE.

IX. REDUCTION CATALYTIQUE DES ACIDES GRAS INSATURES

Une partie de lextrait lipidique (2 mg) dissoute dans lthanol est rduite sous un bullage dhydrogne en prsence de Paladium sur charbon 5 % utilis comme catalyseur. La raction est effectue temprature ambiante pendant 2 heures avec agitation. Le catalyseur est ensuite limin par centrifugation. Les produits ractionnels prsents dans le surnageant sont concentrs lvaporateur rotatif avant analyse par CG et CG/MS/IE. Cette raction ne touche pas les doubles liaisons carbone-oxygne.

88

X. Mthodes utilises pour l'analyse des lipides

X.1. CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE

Le chromatographe en phase gazeuse utilis est un appareil Hewlet-Packard HP 6890, srie II. Les conditions analytiques sont les suivantes:
* Caractristiques et dimensions de la colonne:

colonne capillaire en silice fondue (JW Scientific DB-5MS) longueur: 30 m. diamtre intrieur: 0.25 mm. paisseur du film: 0.5 m. composition: la phase est peu polaire (95 % polydimthylsiloxane, 5 % phnylsiloxane: 95 % apolaire/5 % polaire).

stabilit du polymre: 300 C. Gaz vecteur: Hlium une pression de 1 bar.


* Type et temprature de linjecteur: injecteur split/splitless utilis en mode splitless

avec un dbit de fuite rgl 50 ml/min et la temprature 280 C. * type et temprature du dtecteur: dtecteur ionisation de flamme (FID) chauff 300 C.

Les chromatogrammes ont t raliss en programmation linaire de temprature, de 100 300 C avec un gradient de 4 C par minute.

X.2. CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE PAR IMPACT ELECTRONIQUE

Dans cette tude nous avons utilis un chromatographe 6890 N dAgilent Technologies coupl un spectromtre de masse 5973N analyseur quadripolaire. La colonne et les conditions chromatographiques sont identiques celles utilises en chromatographie gazeuse.

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Les diffrents paramtres de rglage du spectromtre de masse sont les suivantes :

Temprature de la source dionisation: 220 C Temprature de la canne de transfert : 250 C Temprature du filtre quadripolaire : 100 C Gamme de masse balaye Potentiel dionisation : m/z = 35-600 : 70 eV

90

CHAPITRE III

Biodgradation de diffrentes familles d'hydrocarbures par Marinobacter hydrocarbonoclasticus: influence sur la composition lipidique et voies mtaboliques.
Effects of hydrocarbon structure on FA and -hydroxy acid composition in the hydrocarbon-degrading bacterium Marinobacter hydrocarbonoclasticus Mohamed Soltani, Pierre Metzger and Claude Largeau Lipids 39, 491-505 (2004).

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I. INTRODUCTION

Ce chapitre est consacr l'tude de l'effet de la nature des hydrocarbures, apports dans le milieu de culture comme seule source de carbone, sur la composition lipidique d'une bactrie marine dgradant activement ces composs. Le travail a t ralis sur Marinobacter
hydrocarbonoclastucus cultive sur onze hydrocarbures diffrents pouvant tre classs en

quatre principaux types:


composs linaires non ramifis, saturs, n-C19 et n-C21; les rsultats de travaux rcents sur n-C20 seront galement rappels; composs linaires ramifis, saturs, de type iso et antiso C19 et C20, et un compos ramifi en milieu de chane: 10-Me-C19; composs comportant une partie cyclique: phnyl-alcanes portant une chane normale C12 et C13 et cyclohexyl-alcane portant une chane normale C13; enfin un compos insatur n-C19:1, double liaison terminale.

Six hydrocarbures galement tests n'ont pas pu assurer la croissance de M.


hydrocarbonoclasticus. Il s'agit du cyclohexyldodcane, de l'heptamthyl-2,2,4,4,6,8,8-

nonane, du pristane, du squalane, de l'ethyl-benzene et du propyl-benzene. Les raisons possibles de l'inaptitude de la bactrie mtaboliser ces composs seront discutes ultrieurement. Cette tude a pour but d'identifier les composs lipidiques de cette souche bactrienne ainsi cultive et de mettre en vidence leurs degrs de variabilit en fonction de la source de carbone. Ce chapitre propose tout d'abord une prsentation de la bactrie tudie. L'ensemble des donnes qualitatives et quantitatives recueillies sur les composs lipidiques extraits de la biomasse de M. hydrocarbonoclasticus sont ensuite exposes et discutes. Enfin, une analyse comparative des principaux lipides identifis, en fonction de la source de carbone utilise pour les cultures sera prsente dans la dernire partie de ce chapitre.

92

II. CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DE M. HYDROCARBONOCLASTICUS

Une tude entreprise le long des ctes mditerranennes franaises pour suivre la dgradation des hydrocarbures par les populations de bactries, a conduit lisolement dune nouvelle espce dgradant le ptrole, partir dun chantillon de sdiment collect dans un site pollu (Golfe de Fos 50 km au nord de Marseille) (Al-Mallah et al., 1990). Il sagit dune bactrie en forme de btonnet, Gram-ngative, anarobie facultative et qui semble ubiquiste en milieu marin, appele lorigine Alteromonas sp. 17. Elle est capable de dgrader une grande varit dhydrocarbures liquides et solides (elle peut tre cultive sur un milieu contenant comme source unique de carbone, dune part de lactate dammonium et dautre part des hydrocarbures: alcanes normaux compris entre C10 et C30), et de produire une grande quantit de biomulsifiants non dialysables. Des tudes microbiologiques menes par Gauthier et al. (1992) ont permis dtablir la position taxonomique exacte de cette bactrie marine et de dmontrer son appartenance un genre nouveau. Le nom Marinobacter hydrocarbonoclasticus a t adopt en rfrence son origine marine et son potentiel de dgradation des hydrocarbures.

La croissance de M. hydrocarbonoclasticus peut avoir lieu en anarobiose, en prsence de KNO3 comme accepteur terminal dlectrons, et avec le citrate, lactate ou le succinate (sel de sodium) comme seule source de carbone et dnergie. Par contre la croissance ne peut avoir lieu en anarobiose en prsence de glucose avec ou sans nitrate. Par ailleurs, cette bactrie peut utiliser par exemple les composs suivants: actate, butyrate, fumarate, glycine, lysine, L-mthionine, comme seule source de carbone et dnergie. Elle est aussi capable dutiliser le DL-hydroxybutyrate, mais naccumule pas le polymre correspondant comme produit de rserve, comme le font la plupart des bactries Gram-ngatives. Cette bactrie a une activit hydrocarbonoclastique trs marque. En effet, elle est capable dutiliser le ttradcane, lhexadcane, licosane, lheneicosane comme seule source de carbone et dnergie.

M. hydrocarbonoclasticus est capable de crotre une temprature comprise entre 10

et 45 C avec un optimum de croissance 32 C, et peut tolrer une variation de pH de 6,1 9,5 avec un optimum de 7 7,5 (Gauthier et al., 1992; Linares et al., 1996). 93

Cette bactrie prsente une halotolrance extrme, et elle est aussi halophile faible. En effet, elle est capable de crotre dans un milieu dont la concentration en NaCl est comprise entre 0,08 et 3,5 M, l'optimum de croissance est observ pour une concentration de 0,6 M, qui est proche de celle existante en Mditerrane (Linares et al., 1996). La cellule de M.
hydrocarbonoclasticus a une exigence pour les ions Na+ : aucune croissance nest observe en

milieu synthtique sans addition de Na+. Labsence de ce dernier ne peut tre pallie par laddition de LiCl ou KCl, mais lajout de NaNO3 conduit une croissance immdiate des souches. En effet, les ions Na+ interviennent dans la conservation du volume cytoplasmique. Les travaux de Linares et al. (1996), ont montr que la croissance de M.
hydrocarbonoclasticus sur lactate d'ammonium ou licosane est affecte par la salinit: on

observe une augmentation linaire du temps de gnration et une augmentation de la priode de latence quand la concentration en NaCl augmente (> 0,6 M), bien quil ny ait aucun changement significatif de la biomasse finale sur toute la gamme de salinit. Une augmentation de la salinit de 0,2 2,5 M na aucun effet significatif sur sa capacit biodgrader licosane.

La recherche bibliographique permet de constater un intert croissant pour M.


hydrocarbonoclasticus. Par ailleurs, le genre Marinobacter s'accrot, et d'autres espces

manifestant une activit dgradative vis vis des hydrocarbures ont t rcemment dcouvertes. Il s'agit notamment de M. aquaeolei (Huu et al., 1999), que nous traiterons dans le chapitre suivant, M. lipolyticus (Martin et al., 2003) ou encore M. squalenivorans (Rontani et al., 2003) qui, comme nom l'indique, dgrade activement le squalne.

III. HYDROCARBURES TESTES ET CULTURES

Dans le Tableau III.1 sont rapports l'origine des hydrocarbures tests, leurs degrs de puret ainsi que l'identification en GC/SM des autres composs prsents dans ces chantillons. Aucune purification des composs commerciaux n'a t effectue. Quand ceux synthtiss, une purification sur colonne de silice du produit ractionnel issu de la dernire tape de synthse a t ralise.

94

Tableau III.1. Donnes relatives aux hydrocarbures fournis aux cultures de M.


hydrocarbonoclasticus.
Hydrocarbures n-C19 n-C21 i-C19 i-C20 ai-C19 ai-C20 10-Me-C19 Phenyl-C12 Origine Etat physique Tambiante C Solide C Solide S Liquide S Liquide S Liquide S Liquide S Liquide C Liquide Croissance bactrienne + + + + + + + + % Puret a Autres identifis 99 > 99 96 97 98 99 97 96 aucun aucun i-C18 aucun n-C17, i-C18, ai-C18 et n-C18 i-C19 10-methylne-C19, 10-MeC19:1 1-phenyl-1-nonne, phenyldcane, phenylundcane, phenyltridcane et phenyldodcanone. aucun aucun n-C19:12 nd nd nd nd nd nd

Phenyl-C13 Cyclohexyl-C13 n-C19:1 Pristane Squalane Heptamthylnonane Cyclohexyl-C12 Phenyl-C2 Phenyl-C3

C S C C C C S C C

Liquide Liquide Liquide Liquide Liquide Liquide Liquide Liquide Liquide

+ + + -

99 > 99 99 98 99 98 99 99 98

C: commercial. S: synthse. a : indiqu par le vendeur ou dtermine par GC. b : selon analyse en CG/SM. nd: non dtermin

Dans un premier temps, M. hydrocarbonoclasticus a t cultive sur un milieu contenant de l'actate d'ammonium comme seule source de carbone. La souche a t ensuite transfre une premire fois dans un milieu contenant l'hydrocarbure tudier. Lorsque cette culture atteignait la phase stationnaire de croissance, un inoculum tait prlev et transfr dans un milieu de culture contenant le mme hydrocarbure. La souche tait alors cultive jusqu' ce que la phase stationnaire soit de nouveau atteinte, et la biomasse rcupre par ultracentrifugation et tudie.

95

IV. PROTOCOLE D'EXTRACTION DES LIPIDES et resultats quantitatifs

En gnral lanalyse des lipides de bactries, comprend une extraction avec un solvant organique, gnralement suivie dune saponification pour obtenir les lipides sous forme libre et estrifie. Ensuite, les diffrentes classes de composs sont spares selon leur polarit par chromatographie sur couche mince ou sur colonne puis les produits sont analyss par chromatographie en phase gazeuse et par chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse. Cependant, il est bien connu que de nombreuses bactries, incluant les bactries Gramngatives, contiennent des lipides qui ne sont librs que par mthanolyse basique, tel que les acides gras engags dans les liaisons esters dans les matrices macromolculaires de la membrane bactrienne. Les acides gras et les -hydroxyacides engags dans les liaisons amides, prsents dans les lipopolysaccharides (LPS), ncessitent quant eux une hydrolyse en milieu acide (Goossens et al., 1986, 1989a; Mendoza et al., 1987a; Orgambide et al., 1993; Lattuati et al., 2002; Wakeham, 2003). Un maximum dinformations est obtenu par une squence dextraction et dhydrolyses, qui permet de distinguer entre les lipides facilement extractibles (existant sous forme "libre"), les lipides labiles en milieu basique (engags dans des liaisons esters) et les lipides labiles en milieu acide (incluant les lipides engags dans des liaisons amides). Des protocoles similaires ceux appliqus aux bactries, ont t utiliss pour ltude de la matire organique prsente dans les sdiments, afin d'tablir son tat de dgradation et son origine (Cranwell, 1981b; Zegouagh et al., 1996, 1998; Goossens et al., 1989b; Fukishima et al., 1992a, b; Wakeham et al., 1999).

Nous avons appliqu dans ce travail une procdure analytique qui nous permet de distinguer trois fractions lipidiques: les lipides facilement extractibles (non lis), les lipides dgags par traitement basique de la biomasse bactrienne dj extraite aux solvants (lis par des liaisons esters), et ceux librs par traitement acide du rsidu bactrien (lis par des liaisons amides). La Figure II.1 illustre le protocole gnral dextraction des diffrents types de lipides de M. hydrocarbonoclasticus.

96

Les rsultats quantitatifs concernant les trois fractions lipidiques de M.


hydrocarbonoclasticus en fonction de la source de carbone sont rassembls dans le Tableau

III.2. Les rsultats obtenus par Lattuati et al. (2002) correspondant aux cultures de la mme souche bactrienne sur actate dammonium et sur icosane (n-C20) y figurent galement pour comparaison. Le pourcentage des lipides totaux obtenus par extraction de la biomasse bactrienne de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur hydrocarbures varie de 7,3 % (culture sur i-C20) 17,1 % (culture sur n-nonadec-1-ne) du poids sec de la biomasse. Ces valeurs sont suprieures celle obtenue avec la culture sur milieu contenant lactate dammonium comme source unique de carbone et dnergie (5,2 % de la biomasse sche; Lattuati et al., 2002). De telles variations ont t observes chez d'autres bactries hydrocarbonoclastiques, montrant une augmentation de leur pourcentage lipidique lors de la croissance sur hydrocarbures, compar aux cultures sur substrats solubles (Makula et Finnerty, 1968a; Goutx et al., 1990; Doumenq et al., 1999). Ces variations dans le contenu lipidique total peuvent tre attribues aux diffrences dans ltat physiologique des bactries au moment o les cultures sont arrtes, et/ou ltat liquide ou solide des hydrocarbures la temprature de la culture, ce qui peut influencer leur assimilation par les bactries.

Chacun des diffrents traitements fournit une quantit substantielle de lipides. Les lipides "non lis" constituent la fraction lipidique la plus importante, variant entre 68,6 % (culture sur n-C19) et 84,5 % (culture sur n-C19:1) des lipides totaux, alors que les lipides engags dans des liaisons esters reprsentent toujours la deuxime fraction lipidique la plus importante avec des valeurs comprises entre environ 10 % et 24 % des lipides totaux. Les lipides obtenus par traitement acide, correspondent la fraction la moins abondante avec environ 3 10 % des lipides totaux (moins de 1 % de la biomasse sche).

Dans cette tude, les hydrocarbures utiliss pour raliser les diffrentes cultures prsentent des structures varies, cependant leur nombre datomes de carbone couvre une gamme restreinte (de 18 21 atomes de carbone), ce qui nous oblige considrer les rsultats sur linfluence de la longueur de la chane alkyle sur la composition lipidique avec beaucoup de prcaution. Une tude dtaille de linfluence de la longueur de la chane alkyl des nalcanes sur la composition en acides gras des lipides "non lis" dune autre souche de M.
hydrocarbonoclasticus (617) a par ailleurs t effectue par Doumenq et al. (2001).

97

Tableau III.2. Abondance des diffrentes fractions lipidiques de M. hydrocarbonoclasticus en fonction de la source de carbone.

Pourcentage par rapport la biomasse sche

Pourcentage par rapport aux lipides totaux

Source de carbone Actate dammonium*


n-C19 n-C20 n-C21 i-C19 i-C20 ai-C19 a-iC20
*

Lipides totaux 5,2 12,7 7,8 11,9 12,3 7,3 11,0 10,3 10,2 17,1 8,7 8,1 8,8

"Non lis"# 3,5 8,7 5,6 9,7 10,2 5,5 9,2 8,0 7,9 14,4 6,1 5,9 6,3

Labiles en milieu basique 1,1 3,1 1,5 1,8 1,6 1,1 1,1 1,6 1,5 1,9 1,7 1,6 1,8

Labiles en milieu acide 0,6 0,9 0,7 0,4 0,5 0,7 0,7 0,7 0,8 0,8 0,9 0,6 0,7

"Non lis" 67,3 68,6 75,7 81,2 83,2 75,3 83,6 77,7 77,4 84,5 70,0 73,7 71,9

Labiles en milieu basique 21,2 24,1 20,3 15,4 12,7 15,1 10,0 15,5 14,7 10,8 19,8 19,4 20,4

Labiles en milieu acide 11,5 7,3 9,5 3,4 4,1 9,6 6,4 6,8 7,8 4,7 10,2 6,8 7,7

10-Me-C19
n-nonadec-1-ene

Cyclohexyltridecane Phenyldodecane Phenyltridecane

*: daprs Lattuati et al. (2002). # : aprs limination de l'hydrocarbure utilis comme source de carbone.

98

Les fractions correspondantes aux lipides "libres" sont dans un premier temps soumises une mthanolyse basique afin d'obtenir les esters mthyliques par transestrification. Quand aux fractions contenant les lipides labiles en milieu acide elles ont subi un traitement par le diazomthane pour former les esters mthyliques correspondants. Afin de dterminer la position des groupes hydroxyles dans les alcools gras et les hydroxy acides, chacune des trois fractions lipidiques a subi une trimthylsilylation. La position des doubles liaisons carbone-carbone dans les composs insaturs a t dtermine sur les drivs dimthyl-disulfures. Enfin, l'existence et la position d'une ramification sur les chanes alkyles des acides gras ont t tablies partir des drivs N-acyl pyrrolidides obtenus par raction de la pyrrolidine sur les esters mthyliques. L'identification des composs lipidiques de chaque fraction obtenue partir des cultures sur chaque hydrocarbure, a t ralise en CG/SM par analyse des spectres de masse des drivs dcrits ci-dessus, et par comparaison avec les spectres de masse des composs standards lorsque ceux-ci taient disponibles. Des coinjections en CG avec des standards ont t galement ffctues.
V. identification et distribution des lipides de M. HYDROCARBONOCLASTICUS Cultive sur alcanes normaux (C19 et C21)

V.1. IDENTIFICATION DES LIPIDES EN SPECTROMETRIE DE MASSE

Les lipides extraits des biomasses bactriennes de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur n-C19 et n-C21 contiennent des acides gras saturs et monoinsaturs, des -hydroxy acides et des alcools gras saturs et monoinsaturs. Les spectres de masse de quelques uns des produits les plus importants extraits des cultures ainsi que leurs interprtations sont prsents ci-aprs.

V.1.1. Esters mthyliques d'acides gras normaux saturs

La Figure III.1 montre le spectre de masse de lacide gras satur n-C17:0, lion le plus abondant est m/z 74 obtenu par un mcanisme de rarrangement de type Mc Lafferty: il sagit dun transfert dhydrogne (transfert -H) suivi dune rupture de la liaison carbone carbone par rapport au carbonyle, comme le montre la Figure III.2 (Murphy, 1993).

99

Figure III.1. Spectre de masse par impact lectronique de l'ester mthylique de lacide gras nC17:0.
.+
O CH3O M
+.

(CH2)12CH3 Rearrangement CH3O

.+
O

CH2 m/z 74

Figure III.2. Mcanisme de formation de lion fragment m/z 74.

Les autres ions les plus abondants du spectre sont m/z 87, m/z 143 et m/z 199, qui se forment par des mcanismes de rarrangement, comme le montre la Figure III.3.(Murphy, 1993) en ce qui concerne l'ion m/z 87.
.
+ O H CH3O + OH H

(CH2)10CH3

CH3O

(CH2)10CH3

M+.
+ OH
- CH3(CH2)12CH2.

+ OH CH3O OH CH3O +

CH3O

(CH2)10CH3

m/z 87

Figure III.3. Mcanisme de fragmentation conduisant la formation de lion fragment m/z 87. 100

Deux ions carbomthoxyls sont aussi observs, m/z 255 et m/z 241 correspondant la perte de 29 et 43 u.m.a. partir de lion molculaire. M-29 et M-43. Ils ne correspondent pas la perte dun groupement radicalaire thyle ou propyle de la chane hydrocarbone, mais un mcanisme de rarrangement complexe (Murphy, 1993)(Figure III.4).

5 5

+O

.
CH3O + . O CH3O
2 +. 5 4 3 6 7 3 2

- [CH3-CH2.]
7

+O
2

6 7

(CH2)9CH3
CH3
4

CH3O

(CH2)9CH3

m/z 255

(CH2)9CH3
5 5 6

+O

[CH3(CH2)2.]

+O
6 7

.
CH3O
3 2

(CH2)9CH3

CH3O

CH3
4

m/z 241

(CH2)9CH3

Figure III.4. Mcanismes de fragmentation conduisant la formation des ions m/z 255 (M-29) et m/z 241 (M-43).

Un autre ion de faible abondance, mais qui est toujours prsent dans le spectre de masse des esters mthyliques dacides gras normaux, est lion M-31 reprsent par m/z 253 pour lacide n-C17:0. La formation de cet ion peut tre explique par deux mcanismes de rarrangement (Murphy, 1993) (Figure III.5).

O CH3O (CH2)15-CH3 IE CH3O

.+
O (CH2)15-CH3 . M+

.+
O CH3O M (CH2)15-CH3
+.

O+ (CH2)15-CH3 m/z 253 (M-31)

Figure III.5. Mcanisme de fragmentation conduisant la formation de lion m/z 253 (M-31).

La spectromtrie de masse est incapable de diffrencier entre les acides gras normaux et leurs homologues ramifis du cot du mthyle terminal (exemple: iso et anteiso). 101

Cependant, elle nous permet de distinguer les acides gras ramifis en position dont le rarrangement Mc Lafferty conduit la formation de lion 88 la place du 74 (Figure III.6) et du 101 la place du 87 (Figure III.7).

.+
O CH3O M
+.

(CH2)14CH3 Rearrangement CH3O

.+
O

CH m/z 88

CH3

Figure III.6. Mcanisme de formation de l'ion m/z 88 partir de l'acide 2mthylnondcanoque (mthyl ester).

.
CH3O

+ O H (CH2)12CH3 CH3O

+ OH H

(CH2)12CH3

M+. + OH CH3O m/z 101 OH CH3O +


-CH3(CH2)12CH2
.

+ OH CH3O

(CH2)12CH3

Figure III.7. Mcanisme de formation de l'ion m/z 101 partir de l'acide 2mthylnonadcanoque (mthyl ester).

La Figure III.8 montre le spectre de masse de l'ester mthylique de l'acide gras 2MeC19.

102

Figure III.8. Spectre de masse de l'ester mthylique de l'acide 2Me-C19:0.

V.1.2. Drivs DMDS des esters mthyliques d'acides gras insaturs

La spectromtrie de masse par impact lectronique ne permet pas de prciser la position de la double liaison des acides gras insaturs, du fait quils ne donnent aucune fragmentation privilgie des liaisons vinyliques. Par consquence, nous avons procd la localisation de la position de la double liaison par formation des drivs dimthyles disulfures selon le protocole dcrit par Scribe et al. (1990). Ainsi, lacide insatur n-C17:1 prdominant dans les cultures sur n-C19 et n-C21 correspond aux isomres n-C17:110, n-C17:19 et n-C17:18 pour la culture sur n-C19, et aux isomres n-C17:19 et n-C17:18 pour la culture sur n-C21. Les Figures III.9 et III.10 illustrent respectivement le spectre de masse et le schma ractionnel de formation et de fragmentation du driv DMDS de lester mthylique de lacide gras nC17:18. Ce dernier met en vidence quatre ions facilement identifiables, M+ correspondant
m/z 376, et trois autres ions fragments m/z 217, m/z 185 et m/z 159.

103

Figure III.9. Spectre de masse par impact lectronique du driv DMDS de l'ester mthylique de lacide n-C17:18.
CH3-(CH2)6-CH=CH-(CH2)7-COOCH3
I2, 50C, CH3-S-S-CH3 48 Heures

CH3-(CH2)6-CH S CH3

CH-(CH2)7-COOCH3 S CH3
IE (70ev)

CH3-(CH2)6-CH m/z 159 S+ CH3

CH-(CH2)7-COOCH3 +S CH3
-MeOH

m/z 217

CH-(CH2)6-CH=CO +S CH3 m/z 185

Figure III.10. Schma ractionnel de formation et de fragmentation du driv DMDS de l'ester mthylique de lacide n-C17:18. 104

Lanalyse de ces drivs DMDS par CG/SM prsente un intrt majeur par rapport lanalyse des drivs pyrrolidides en ce qui concerne lidentification structurale des acides gras monoinsaturs. En effet, linterprtation des fragmentations est facilite et les rapports signal/bruit des fragments dterminants sont excellents.

V.1.3. Drivs N-acyl pyrrolidides

La position des groupes mthyles sur les chanes alkyles d'acides gras saturs ramifis a t dtermine grce aux drivs N-acylpyrrolidides obtenus par l'action de la pyrrolidine sur les esters mthyliques. Ces N-acylpyrrolidides sont caractriss en spectromtrie de masse par une srie rgulire d'ions, correspondants aux ruptures simples au niveau de chaque atome de carbone. Quand un ion se trouve en faible intensit dans cette srie, une ramification au niveau de cet atome de carbone est suggre (Anderson, 1978 ; Ayanoglu et al., 1982). Les Figures III.11, III.12, III.13 et III.14 reprsentent respectivement les spectres de masse des drivs N-acylpyrrolidides des acides C17 normal, iso, antiso et ramifi en position 10.

Figure III.11. Spectre de masse du deriv N-acylpyrrolidide de l'acide n-C17:0.

105

Figure III.12. Spectre de masse du deriv N-acylpyrrolidide de l'acide i-C17:0.

Figure III.13. Spectre de masse du deriv N-acylpyrrolidide de l'acide ai-C17:0.

106

Figure III.14. Spectre de masse du driv N-acyl pyrrolidide de l'acide 10-Me-C15:0.

V.1.4. Drivs TMSides alcools gras saturs et insaturs

Les alcools primaires saturs ont t caractriss grce aux spectres de masse par impact lectronique de leurs drivs trimthylsilyls (TMSi) caractriss par deux pics trs intenses m/z 75 [(CH3)2Si=+OH)] et M-15 (M-CH3). Deux autres pics caractristiques m/z 73 et m/z 103 correspondent respectivement aux ions [(CH3)3Si+] et [CH2=O+Si(CH3)3] (Figure III.15)
(CH3)3Si+ m/z 73

(CH3)2Si=+OH m/z 75

[(CH3)2SiO(CH2)nCH3]+ m/z (M-15)

(CH3)3SiO(CH2)nCH3

(CH3)3SiO+ m/z 89

CH2=O+Si(CH3)3 m/z 103

Figure III.15. Principaux fragments du spectre de masse des drivs TMSi des alcools primaires normaux.

107

La Figure III.16 montre le spectre de masse du driv trimthylsilyl de l'alcool primaire satur 19 atomes de carbone prsent dans les lipides "non lis" de la culture sur nC19. L'ion molculaire est dtect en trs faible abondance m/z 356 alors que les pics trs intenses m/z 341 (M-CH3) et m/z 75 permettent d'identifier ce compos.

Figure III.16. Spectre de masse par impact lectronique du driv TMSi de l'alcool
n-19:0, 1-OH.

Les spectres de masse des drivs TMS des alcools insaturs sont caractriss par un pic intense m/z 75 comme pour les alcools saturs et d'un pic de faible intensit m/z M-15 correspondant la perte d'un groupement mthyle de l'ion molculaire. La dtermination de la position de l'insaturation de ces alcools est possible par formation des drivs dimthyldisulfures. La Figure III.17 montre le spectre de masse de l'alcool insatur 21 atomes de carbone dtect dans les lipides "non lis" de la culture sur n-C21. La raction de formation et de fragmentation du driv DMDS de cet alcool trimthylsilyl ainsi que le spectre de masse correspondant sont prsents respectivement sur les Figures III.18 et III.19. 108

Figure III.17. Spectre de masse du driv TMSi de l'alcool insatur n-21:1, 1-OH.
CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)10-CH2-O-Si(CH3)3
I2, 50C, CH3-S-S-CH3 48 Heures

CH3-(CH2)7-CH S CH3

CH-(CH2)10-CH2-O-Si(CH3)3 S CH3
IE (70ev)

CH3-(CH2)7-CH S

CH-(CH2)10-CH2-O-Si(CH3)3 S

m/z 173

CH3

CH3
- HOSi(CH3)3

m/z 303

m/z 213

Figure III.18. Formation et fragmentation du driv dimethyl disulfure du driv TMSi de l'alcool n-21:19, 1-OH.

109

M+

Figure III.19. Spectre de masse du driv TMSi/DMDS de l'alcool insatur n-21:19, 1-OH.

Les spectres de masse par impact lectronique des drivs TMSi des alcools secondaires sont caractriss par un pic m/z 117 [CH3CHO+Si(CH3)3], qui est le pic le plus abondant. Trois autres ions abondants et faciles distinguer sont prsents m/z 73 [(CH3)3Si+], m/z 75 [(CH3)2Si=+OH] et l'ion fragment m/z (M-15) (Alugupalli et Larsson, 1992). Le spectre de masse du driv TMSi de l'alcool secondaire, n-19:0, 2-OH, dtect dans les lipides "non lis" de la culture sur n-C19, est illustr la Figure III.20.

110

[M-Me]+

Figure III.20. Spectre de masse du driv TMSi de l'alcool secondaire n-19:0, 2-OH.
V.I.5. Drivs TMS des esters mthyliques des -hydroxy acides

Les spectres de masse des -hydroxy acides non drivatiss prsentent un ion caractristique m/z 103, obtenu selon un mcanisme de rarrangement. Les Figures III.21 et III.22 montrent respectivement le mcanisme de formation de l'ion 103 et le spectre de masse de l'ester mthylique du n--hydroxy acide C19:0.
.
H CH3O (CH2)12-CH3 CH3O
+

O+

OH

.
HO

(CH2)12-CH3

HO
OH CH3O

OH

CH3O

m/z 103

HO
+

HO

Figure III.21. Mcanisme de rarrangement conduisant la formation de l'ion m/z 103. 111

Figure III.22. Spectre de masse (IE) du -hydroxy acide 19 atomes de carbone. Mais l'ion m/z 103 n'tant pas spcifique des -hydroxy acides, nous avons donc utilis la trimethylsilylation qui permet la dtermination exacte de la position du groupement hydroxyle sur la chane hydrocarbone (Figure III.23). Le spectre de masse du -hydroxy acide C19:0 trimthylsilyl (Figure III.24) prsente deux pics intenses m/z 175 et 385 (MCH3)+. Les deux ions fragments m/z 175 et 327 sont obtenus par ruptures simples (Figure III.24).

112

H (CH3)3SiO ou (CH3)2SiO+=CH2 m/z 89


+

(CH3)3Si+ m/z 73

CH CH2CO2CH3 O+Si(CH3)3 m/z 175

CH3 O CH CH2 CH=CH CO2CH3 O+=Si(CH3)2 m/z 159 -CO


O
+

R CH CH2CO2CH3 OSi(CH3)3

O+Si(CH3)3

(CH3)3SiO+=CH OCH3 m/z 133

CH3 Si(CH3)2 m/z 131

RCHCH2CO2CH3 O=Si(CH3)2 M-15


-CH3OH

RCHCH=C=O O=Si(CH3)2 M-47

RCH=OSi(CH3)3 M-73

Figure III.23. Principaux ions fragments du spectre de masse des -hydroxy mthyl ester trimthylsilyls (Eglinton et Hunneman, 1968).

175 O CH 3O C CH 2 CH (CH 2)15 CH 3

OSi(CH 3)3 327

Figure III.24. Spectre de masse du driv trimthylsilyl du n--hydroxy mthyl ester C19:0.

113

La position de l'insaturation des -hydroxy acides insaturs peut tre dtermine par drivatisation DMDS de cette fraction trimthylsilyle ou non. Les Figures III.25 et III.26 montrent respectivement le spectres de masse du driv DMDS de l'ester mthylique du hydroxy acide n-13:18 avec et sans trimthylsilylation.

Figure III.25. Spectre de masse du driv DMDS de l'ester mthylique du -hydroxy acide n13:18 aprs trimthylsilylation

114

M+

Figure III.26. Spectre de masse du driv DMDS de l'ester mthylique du -hydroxy acide 13:18.
V.1.6. -Mthoxy acides

Certaines fractions lipidiques, notamment celles obtenues par hydrolyse acide de la biomasse bactrienne contiennent galement en faible quantit des -mthoxy acides qui sont vraisemblablement des artfacts comme nous le verrons. La structure chimique, ainsi que le spectre de masse du -mthoxy acide n-C12:O qui est le compos le plus abondant de cette srie sont prsents la Figure III.27. Le spectre de masse montre les ions: [M-CH3]+ m/z 229, [M-CH2CO2CH3]+ m/z 171, [M-(CH3 + CH2-CO2-CH3 + H+] m/z 155. Les ions caractristiques sont observs m/z 75 et m/z 117, ils correspondent aux pics de base et sont forms comme la montre la Figure III.28.

115

CH3 (CH2)8 CH CH2 COOCH3 OCH3

Figure III.27. Spectre de masse du -mthoxy mthyl ester C12:0.


117
OCH3 O CH3-(CH2)8 OCH3 O

+ OCH3 OCH3

-CH2=C=O

CH3-O-CH-OCH 3

+
CH3-O-CH=OCH 3 m/z 75

Figure III.28. Mcanisme de fragmentation du n--methoxy mthyl ester C12:0 conduisant aux ions fragments m/z 75 et m/z 117.

116

V.2. LIPIDES "NON LIES"

Les lipides "non lis" des cultures sur n-C19 et n-C21 sont domins par les acides gras normaux nombre impair datomes de carbone de C13 C21 (Tableaux III.3 et III.4). Ces acides gras normaux saturs et insaturs reprsentent, respectivement, 40,8 et 46,3 % des lipides "non lis" dans le cas de la culture sur n-C19, et, 36,0 et 53,7 % pour la culture sur nC21. Les principaux acides gras saturs identifis sont (en abondance relative) les acides nC17:0 (25,8 % dans le cas de la culture sur n-C19 et 19,6 % sur n-C21), n-C15:0 (7,2 et 8,2 % correspondant respectivement, aux cultures sur n-C19 et n-C21) et lacide palmitique (3,4 et 5,6 % correspondant respectivement aux cultures sur n-C19 et n-C21) (Tableau III.3). Dautres acides gras normaux tels que n-C19:0, n-C18:0, et n-C13:0 ont t galement identifis, mais en faibles quantits. Nous observons galement une faible quantit dacides gras ramifis, exclusivement saturs iso 16, 17, 18 et 19 atomes de carbone (5 % pour la culture sur n-C19 et 0,7 % pour la culture sur n-C21). En outre, les acides gras saturs portant un groupement mthyle en position 10 sont absents dans ces deux cultures alors que la production de ce type de composs a t constate en quantit notable (0,5 6 %) lors de la croissance dune souche de M. hydrocarbonoclasticus galement sur n-alcanes (Doumenq et al., 2001). Les acides n-C17:1 (8, 9 et 10) sont les acides gras insaturs prdominants (plus de 55 % des acides gras insaturs de la fraction "non lie") dans les deux cultures (Tableau III.3). Dautres acides gras monoinsaturs nombre impair datomes de carbone ont t galement identifis, mais en faibles quantits (plusieurs isomres de n-C19:1 et n-C15:1 dans les deux cultures, et n-C21:19 uniquement dans la culture sur n-C21). En ce qui concerne les acides gras insaturs nombre pair datomes de carbone, les acides n-C16:1 et n-C18:1 avec prdominance des isomres 9 ont t galement identifis.

Les lipides "non lis" de ces deux cultures sont donc caractriss par une forte abondance des acides gras normaux 17 atomes de carbone (n-C17:0 et n-C17:1) (Tableaux III.3 et III.4). Ces rsultats se distinguent des rsultats obtenus avec la mme bactrie cultive sur
n-C20, pour laquelle lacide n-C17:0 tait un compos minoritaire dans les lipides "non lis" et

ses analogues insaturs absents (Lattuati et al., 2002). En effet, la culture de M.


hydrocarbonoclasticus sur n-C20 est caractrise par une forte dominance des acides gras

normaux 16 et 18 atomes de carbone (n-C16:0, n-C16:1 et n-C18:19) alors quils ne

117

reprsentent que des composs minoritaires avec les n-alcanes C19 et C21. Une tude rcente sur linfluence de la parit des n-alcanes sur la composition en acides gras "non lis" dune autre souche de M. hydrocarbonoclasticus (617) a conduit des rsultats similaires (Doumenq et al., 2001). Ces rsultats concordent aussi avec les travaux antrieurs sur la dgradation des n-alcanes par des bactries arobies (Mycobacterium vaccae, Candida
lipolytica, Micrococcus cerificans, Acinetobacter sp, Cunninghamella echunilata) pour

lesquelles les cultures sur n-alcanes nombre pair datomes de carbone conduisent essentiellement des acides gras nombre pair datomes de carbone et inversement (Dunlap et Perry, 1967; Makula et Finnerty, 1968a; Hug et Fiechter, 1973; King et Perry, 1975; Rehm et Reif, 1981).

Les alcools primaires saturs et insaturs constituent la deuxime classe lipidique avec 6 % des lipides "non lis" de la bactrie cultive sur n-C19 et 7,4 % pour la culture sur n-C21 (Tableau III.4). Cette classe est caractrise par la prdominance des alcools dont les nombres datomes de carbone sont semblables ceux des alcanes utiliss (> 75 %). Ces alcools reprsentant la premire tape de loxydation des n-alcanes par les bactries nont pas t observs par Doumenq et al.(2001) lors de la culture de M. hydrocarbonoclasticus sur ce type de composs. Ceci pourrait s'expliquer dans leurs cas par un tat de dgradation plus avanc des hydrocarbures fournis la bactrie. Une quantit non ngligeable dalcool secondaire (0,6 % des lipides non lis) provenant de loxydation subterminale a t mise en vidence dans le cas de la culture sur n-C19, alors que seulement quelques traces de son alcool secondaire homologue ont t dtectes dans les lipides "non lis" de la culture sur n-C21. Des alcools primaires normaux de C15 C18, ont t galement identifis en quantits apprciables (2,1 %) dans le cas de la culture sur n-C19 alors que lalcool n-16:0, 1-OH est ltat de traces dans les lipides "non lis" de la culture sur n-C21. Ces rsultats corroborent ceux de la culture sur nC20 (Lattuati et al., 2002) o les alcools primaires satur n-C20:0 et monoinsatur n-C20:1 ont t identifis comme pratiquement les seuls alcools (Tableau III.3). Deux -hydroxy acides 17 et 19 atomes de carbone ont t dtects en faibles quantits dans les lipides "non lis" des cultures sur n-C19 et n-C21 (Tableaux III.3). Ces deux
-hydroxy acides (n-17:0 et n-19:0) reprsentent respectivement 0,3 et 0,6 % des lipides libres

dans le cas de la culture sur n-C19 alors qu'ils ne sont dtects qu' l'tat de traces dans la culture sur n-C21. La prsence de ces -hydroxy acides met en vidence un mcanisme de -

118

oxydation des acides gras dans les voies mtaboliques de dgradation des n-alcanes (Klug et Markovetz, 1971; Rehm et Reiff, 1981; Bertrand et Mille, 1989). Ces rsultats concordent avec ceux de la culture sur n-C20 (Lattuati et al., 2002) o des -hydroxy acides homologues nombre pair d'atomes de carbone saturs et insaturs (16, 18 et 20) ont t identifis. Par contre, les travaux de Doumenq et al.(2001) sur la dgradation des n-alcanes par une autre souche de M. hydrocarbonoclasticus n'ont pas rvl la prsence de -hydroxy acides intermdiaires dans la -oxydation de ces hydrocarbures. Dans cette tude seul le -hydroxy acide n-12:0 a t rapport, il pourrait provenir, comme nous le verrons plus loin d'une hydrolyse des lipopolysaccharides de la bactrie. La Figure III.29 reprsente le courant ionique total en spectromtrie de masse des lipides "non lis" de la culture sur n-C19.

Figure III.29. Courant ionique total des lipides "non lis" de M.hydrocarbonoclasticus cultive sur n-C19 aprs une trimthylsilylation.

119

Tableau III.3. Composition des lipides "non lis"* de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur actate d'ammonium et sur alcanes normaux.
Lipides Acides gras saturs n-13:0 n-14:0 n-15:0 n-16:0 i-16:0 n-17:0 i-17:0 n-18:0 i-18:0 n-19:0 i-19:0 Acides gras insaturs n-14:1 9 n-15:1 9 n-15:1 8 n-15:1 6 n-16:1 9 n-16:1 7 n-16:1 5 n-17:1 10 n-17:1 9 n-17:1 8 n-18:1 9 n-18:1 7 n-18:1 5 n-19:1 12 n-19:1 10 n-19:1 9 n-19:1 8 n-20:1 9 n-21:1 9 n-22:1 9 -hydroxy acides n-12:0, OH n-14:0, OH n-16:0, OH n-16:1 9, OH n-17:0, OH n-18:0, OH n-18:1 9, OH n-19:0, OH n-20:0, OH n-20:1 9, OH Actate n-C19 n-C20 n-C21

3,0 tr 22,4 tr 4,3 10,6 7,3 0,5 44,3 5,5 0,6 0,6 0,6 tr -

0,3 0,1 7,2 3,4 0,4 25,8 1,5 1,5 1,7 2,5 1,4 1,3 0,7 0,1 1,1 1,0 9,6 tr 19,3 5,2 5,1 2,7 0,2 0,3 0,6 -

1,2 0,3 25,3 0,4 1,5 0,5 16,2 8,9 26,6 tr 4,2 0,2 0,1 0,2 0,1 0,4 0,3 0,6 0,3

0,6 0,4 8,2 5,6 0,2 19,6 0,2 1,0 0,3 0,6 2,0 0,7 2,5 0,9 16,5 13,6 9,9 3,8 0,9 0,5 2,4 tr tr -

120

Lipides Alcools n-15:0, 1-OH n-16:0, 1-OH n-17:0, 1-OH n-18:0, 1-OH n-19:0, 1-OH n-19:1, 1-OH n-19:0, 2-OH n-20 :0, 1-OH n-20:1 9, 1-OH n-21:0, 1-OH n-21:1 9, 1-OH n-21:0, 1-OH

Actate

n-C19

n-C20

n-C21

tr -

0,1 0,6 0,9 0,5 3,8 0,1 0,6 -

tr 1,3 10,3 -

tr tr 7,4 tr

* L'ensemble des produits mineurs non identifis dans ces fractions lipidiques ainsi que des produits identifis (mais non rpertoris dans ce tableau car prsents l'tat de trace et pas vraiment significatifs en terme de mtabolisme des hydrocarbures par la bactries et d'influencer sur ces lipides) reprsentant entre 0,2 % et 2,1 % des lipides totaux.

Tableau III.4. Composition globale des lipides "non lis" de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur actate d'ammonium et sur alcanes normaux.
Source de carbone Actate d' ammonium Classes de composs n-alcan-1-ols n-alcan-2-ols Alcools n-acides saturs n-acides insaturs acides ramifies saturs acides -hydroxy acids composs pairs composs impairs composs normaux composes ramifis AG saturs AG insaturs AG n-C16 AG n-C17 AG n-C18
AG: acides gras

n-C19 6.0 0.6 6.6 40.8 46.3 5.0 92.1 0.9 20.6 79.0 94.6 5.0 45.8 46.3 5.5 54.7 11.8

n-C20 11.6 11.6 28.7 56.4 85.1 2.2 98.2 0.7 98.9 28.7 56.4 50.4 0.4 28.1

n-C21 7.4 tr 7.4 36.0 53.7 0.7 90.4 tr 20.8 77.0 97.1 0.7 36.7 53.7 9.0 49.7 10.9

tr tr 29,7 70,0 99,7 tr 99,1 0,6 99,7 29,7 70,0 40,8 tr 54,7

121

V.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE

Les fractions lipidiques obtenues par traitement basique des biomasses bactriennes dj extraites aux solvants contiennent les mmes classes lipidiques que les fractions "non lis" mais dans des proportions diffrentes (Tableau III.6). La Figure III.30 montre le courant ionique total des lipides labiles en milieu basique extraits de la culture sur n-C19.

Figure III.30. Courant ionique total des lipides labiles en milieu basique de
M. hydrocarbonoclasticus cultive sur n-C19.

Les acides gras constituent 31,7 % des lipides labiles en milieu basique de la culture sur n-C21 contre plus du double (approximativement 72 %) dans les cultures sur n-C19 et n-C20 (Tableau III.6). Les acides gras normaux saturs et insaturs se trouvent dans des proportions presque gales dans les cultures sur les deux n-alcanes impairs alors que les saturs sont prdominants dans la culture sur n-C20. Ces acides gras sont caractriss par une forte prdominance de composs normaux nombre impair d'atomes de carbone dans le cas de la 122

culture sur n-C19 (Tableau III.5) (plus de 50 % de la fraction et 70 % des acides gras) alors qu'on assiste une distribution presque quivalente en acides gras pairs et impairs dans la culture sur n-C21. Par comparaison, dans le cas de la culture sur n-C20, l'acide n-C15:0, l'tat de traces, est le seul acide gras nombre impair (Tableau III.5) d'atomes de carbone. De faibles quantits d'acides gras iso C16:0 et C18:0 (respectivement 1,2 et 0,6 %) ont t identifis uniquement dans la culture sur n-C19 alors que les acides gras ramifis sont compltement absents dans les cultures sur n-C21 et n-C20. Contrairement la culture sur n-C20 o les acides gras courtes chanes 10 et 12 atomes de carbone constituent respectivement 17,6 et 37,8 % des lipides labiles en milieu basique, ils ne constituent que des composs minoritaires (< 3 %) dans les deux cultures sur n-alcanes impairs (Tableau III.5). Les -hydroxy acides sont en quantits importantes dans cette fraction lipidique (Tableau III.5), ils prsentent une distribution diffrente de celle observe pour les lipides "non lis" (Tableaux III.3 et III.5). Ils sont caractriss par une forte dominance du -hydroxy acide n-C12:0 (60,2 %, 99,3 % et 85 % des -hydroxy acides totaux de cette fraction isole des cultures sur n-C19, n-C20 et n-C21) et par une faible contribution de n--hydroxy acides 11:0, 13:0 et 13:18 dans les cultures sur n-C19 et n-C21 (Tableau III.5). Cette fraction lipidique contient galement une srie de -mthoxy acides saturs de mme distribution que les -hydroxy acides. La Figure III.31 montre la distribution de ces deux familles de composs dans les lipides lis par liaisons esters de la culture sur n-C19. Bien que certains auteurs considrent les -mthoxy acides comme tant des mtabolites bactriens rels, tels ceux identifis chez Hlicobacter pylori (Inamoto et al., 1993), nombreux sont ceux penser qu'ils ne sont que des artfacts. Ils seraient produits partir des -acyloxy acides prsents dans les lipopolysaccharides au cours de la mthanolyse basique (Mendoza et al., 1987b; Lattuati et al., 2002). Les distributions similaires des mthoxy acides et des -hydroxy acides tablies respectivement partir des ions chromatogrammes m/z 117 et 175 (Figure III.31), suggrent que les -mthoxy acides sont bien, dans notre cas, des produits artfactuels.

123

-hydroxy acides (TMS, mthyl esters)

-mthoxy acides (mthyl esters)

Figure III.31. a) Distribution des -hydroxy acides (TMSi, mthyl esters) et b) des -mthoxy acides dans les lipides lis par liaisons esters de la culture sur n-C19. Deux alcools primaires n-C16:0 et n-C18:0 ont t galement identifis en faibles quantits (0,6 %) dans les lipides labiles en milieu basique des cultures sur n-C19 et n-C21 alors qu'il taient absents dans le cas de la culture sur n-C20. Ces alcools ne peuvent pas provenir d'une extraction incomplte des lipides non lis, sinon on aurait du obtenir galement dans cette fraction les alcools primaires provenant de l'oxydation des alcanes.

124

Tableau III.5. Composition des lipides labiles en milieu basique* de hydrocarbonoclasticus cultive sur actate d'ammonium et sur alcanes normaux. Lipides Actate n-C19 n-C20 n-C21 Acides gras saturs n-10:0 3,5 17,6 n-11:0 1,0 n-12:0 20,3 1,7 37,8 1,8 n-13:0 1,9 3,0 n-14:0 1,8 0,1 1,2 0,3 n-15:0 0,1 5,8 tr n-16:0 7,2 5,6 2,5 6,3 i-16:0 1,2 n-17:0 tr 15,4 5,1 n-18:0 1,4 1,9 1,2 i-18:0 0,6 n-19:0 1,6 n-20:0 0,1 Acides gras insaturs 0,6 n-12:1 7 0,9 0,8 n-13:1 8 13,5 1,7 9,3 3,5 n-14:1 9 0,4 n-14:1 7 0,6 n-14:1 5 0,4 tr n-15:1 9 2,1 tr n-15:1 8 2,1 tr n-15:1 6 2,3 0,7 1,2 0,9 n-16:1 9 2,1 0,3 0,5 0,1 n-16:1 7 0,2 n-16:1 5 6.2 n-17:1 10 3,4 n-17:1 9 10,0 2,9 n-17:1 8 11,6 5,9 0,9 2,4 n-18:1 9 1,4 0,3 n-18:1 7 0,1 tr n-18:1 5 5,6 n-19:1 10 0,1 n-20:1 9 # -hydroxy acids n-10:0, OH 0,2 0,2 n-11:0, OH 3,7 6,7 n-12:0, OH 31,5 16,0 27,9 47,6 n-13:0, OH 6,3 11,7 0,5 n-13:18, OH n-14:0, OH 0,1 tr n-17:0, OH 0,1 Alcools n-16:0, 1-OH 0,3 0,6 n-18:0, 1-OH 0,3 tr

M.

125

Les abondances relatives des -mthoxy acides prsents ont t additionnes respectivement a celles des -hydroxy acides comportant les mmes nombres d'atomes de carbone, partir desquels ils sont drivs. * L'ensemble des produits mineurs non identifis dans ces fractions lipidiques ainsi que des produits identifis (mais non rpertoris dans ce tableau car prsents l'tat de trace et pas vraiment significatifs en terme de mtabolisme des hydrocarbures par la bactries et d'influencer sur ces lipides) reprsentent entre 0,1 % et 1,6 % des lipides totaux.
#

Tableau III.6. Composition globale des lipides labiles en milieu basique de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur actate d'ammonium et sur alcanes normaux.
Source de carbone Actate d' ammonium Classes de composs alcools n-acides saturs n-acides insaturs acides ramifies saturs acides n--hydroxy acides -hydroxy acides -hydroxy 12:0* composs normaux composes ramifis composs pairs composs impairs AG n-C16 AG n-C17 AG n-C18 34,5 32,9 67,4 31,8 31,8 99,0 99,2 99,1 0,1 11,8 tr 14,5 n-C19 0,6 35,0 35,9 1,8 72,7 26,6 26,6 60,2 98,1 1,8 36,3 63,6 6,6 31,6 7,8 n-C20 59,1 12,2 71,3 28,3 28,3 99,3 99,6 99,6 tr 4,2 1,2 n-C21 0,6 17,7 14,0 31,7 66,0 66,0 72,1 98,3 64,7 33,6 7,3 11,4 3,6

AG: acides gras. *: % par rapport aux -hydroxy acides totaux de la prsente fraction.

126

V.4. LIPIDES LABILES EN MILIEU ACIDE

L'analyse par CG/SM des lipides labiles en milieu acide obtenus par hydrolyse acide des rsidus bactriens indique la prsence prdominante de -hydroxy acides. Ces derniers constituent 64,3 % de cette fraction dans le cas de la culture sur n-C19, 84,8 % pour le n-C21 et 98,3 % pour le n-C20. Ils prsentent une forte prdominance du -hydroxy acide n-12:0 (entre 60,3 et 99,3 % des -hydroxy acides) (Tableaux III.7 et III.8). Des quantits importantes de hydroxy acides n-13:0 et, dans une moindre mesure de n-11:0 sont aussi prsentes uniquement dans les cultures sur n-C19 et n-C21 ce qui peut tre expliqu par l'intgration dans les lipopolysaccharides d'hydroxy acides provenant de la dgradation des hydrocarbures.

Les acides gras reprsentent 27,5 %, 1,0 % et 11,5 % des lipides labiles en milieu acide des cultures sur n-C19, n-C20 et n-C21, respectivement (Tableau III.8). Contrairement aux deux fractions prcdentes, les acides gras sont essentiellement normaux saturs nombre pair d'atomes de carbone (C16 et C18) avec prdominance des composs saturs dans les cultures sur n-C19 et n-C20 (Tableau III.7). Selon les travaux de Wilkinson (1988), ces acides ne proviennent pas des LPS, mais plus probablement de lipoprotines qui comportent des parties acyles sans substituant hydroxyle, lies par liaisons amides.

Des alcools normaux, essentiellement nombre pair d'atomes de carbone ont t identifis dans cette fraction pour les cultures sur n-C19 et n-C21. Ils reprsentent respectivement 7,1 et 1,7 % des lipides de cette fraction (Tableau III.8). La prsence d'alcools dans les lipides librs par hydrolyse acide est trs surprenante. Elle a t cependant note lors de l'hydrolyse acide de sdiments lacustres pralablement extraits et saponifis (Goossens et al., 1989b). La seule liaison imaginable, qui par hydrolyse en milieu acide pourrait conduire la formations d'alcools est de type glycosides-O-alkyle, une liaison actal qui pourrait exister dans des biosurfactants produits par la bactrie. Si aucun biosurfactant naturel comportant un groupement n-alkyle de type:
CH2OH O HO O

HO HO

127

n'a t identifi ce jour, d'autres surfactants de type glycosidiques mettant en jeu des actals du type:
CH3

glycoside

CH (CH2)15 COOH

ont t identifis chez des Pseudomonas (Lang, 2002; Holmberg, 2001).

Figure III.32. Courant ionique total des lipides labiles en milieu acide de la culture sur n-C19.

128

Tableau III.7. Composition des lipides labiles en milieu acide de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur actate d'ammonium et sur alcanes normaux.
Lipides Acides gras saturs n-12:0 n-13:0 n-14:0 n-15:0 n-16:0 n-17:0 n-18:0 n-19:0 n-20:0 n-21:0 n-22:0 n-23:0 n-24:0 Acides gras insaturs n-18:1 9 -hydroxy acides# n-10:0, OH n-11:0, OH n-12:0, OH n-13:0, OH n-14:0, OH n-15:0, OH Alcools n-15:0, 1-OH n-16:0, 1-OH n-18:0, 1-OH
#

Actate

n-C19

n-C20

n-C21

tr tr 3,0 1,8 0,8 0,4 93,6 0,1 -

5,2 4,6 7,9 1,4 3,8 0,3 0,4 0,4 0,5 0,9 0,5 1,3 2,7 38,8 22,7 0,1 1,0 3,9 2,2

tr tr 1,0 tr 0,5 97,6 0,2 -

0,6 0,1 1,0 2,1 4,9 0,7 1,8 0,3 8,9 64,1 11,8 0,7 1,0

Les abondances relatives des -mthoxy acides prsents ont t additionnes respectivement celles des -hydroxy acides comportant les mmes nombres d'atomes de carbone, partir desquels ils sont drivs. * L'ensemble des produits mineurs non identifis dans ces fractions lipidiques ainsi que des produits identifis (mais non rpertoris dans ce tableau car prsents l'tat de trace et pas vraiment significatifs en terme de mtabolisme des hydrocarbures par la bactries et d'influencer sur ces lipides) reprsentent entre 0,2 % et 1,9 % des lipides totaux.

129

Tableau III.8. Composition globale des lipides labiles en milieu acide de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur actate d'ammonium et sur alcanes normaux.
Source de carbone Actate d' ammonium Classes de composs alcools n-acides saturs n-acides insaturs acides n--hydroxy acides -hydroxy acides ramifis -hydroxy acids -hydroxy 12:0* composs pair composs impair composs normaux composes ramifis 4,8 0,8 5,6 94,1 94,1 99,4 99,7 99,7 n-C19 7,1 26,2 1,3 27,5 64,3 64,3 60,3 63,9 35,0 98,9 n-C20 1,0 1,0 98,3 98,3 99,3 99,3 99,3 n-C21 1,7 11,5 11,5 84,8 84,8 75,6 74,4 23,6 98,0 -

AG: acides gras. *: % par rapport aux -hydroxy acides totaux de la prsente fraction.

VI. Culture de M. HYDROCARBONOCLASTICUS sur hydrocarbures ramifis

VI.1. IDENTIFICATION DES LIPIDES

Les lipides extraits de M. hydrocarbonclasticus cultive sur hydrocarbures ramifis comprennent les mmes classes de composs que ceux extraits des cultures sur n-alcanes. Comme le montrent les distributions en lipides rapportes dans les Tableaux III.9, III.11 et III.13, les composs ramifis sont cependant plus abondants, et des lipides comportant la fois une ramification et une insaturation ont t dtects. En raison d'un problme de colution sur les colonnes CG, certains isomres n'ont pu tre identifis qu'en mlange. Ainsi dans le cas de la culture sur i-C19, dans les lipides "non lis", les analyses en CG (Figure III.33a) puis en CG/SM indiquent la prsence d'un pic dont le temps de rtention suggre qu'il s'agit d'un ester mthylique insatur dont la chane comporte 17 carbones, et dont la ramification pourrait tre de type iso. Ceci a pu tre clairement tabli par analyse en CG, aprs rduction catalytique du mlange lipidique (Figure III.33b): une augmentation du pourcentage relatif de l'acide i-C17:0 a ainsi t note.

130

(a) Lipides "non lis" de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur i-C19

(b) Lipides "non lis" de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur i-C19 aprs rduction catalytique

Figure III.33. Courant ionique total des lipides "non lis" de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur i-C19 avant (a) et aprs (b) rduction catalytique. De plus l'analyse des spectres de masse des drivs DMDS des lipides de cette fraction montre qu'en fait deux composs i-C17:1 coluent, possdant une insaturation respectivement en position 9, majoritaire, et 7, minoritaire (Figure III.34).

131

i-C17:19
CH3-CH-(CH2)6-CH CH3 S CH3 CH-(CH2)5-COOCH3 S CH3
- MeOH

i-C17:17
CH3-CH-(CH2)4-CH CH3 S CH3 CH-(CH2)7-COOCH3 S CH3
- MeOH

187

189

157

159

217

185

Figure III.34. Spectre de masse des drivs DMDS des esters mthyliques des acides gras iC17:19 et i-C17:17.

VI.2. LIPIDES "NON LIES"

Dans les lipides "non lis", les acides gras sont les constituants les plus abondants, leur abondance relative varient de 84,4 % dans le cas de la culture sur ai-C19 97,5 % dans le cas de celle sur 10-Me-C19 (Tableau III.10). Dans les cultures sur les alcanes iso et antiso des acides gras de parit identique celle des alcanes fournis aux bactries et prsentant la mme substitution iso et antiso ont t identifis dans les lipides "non lis". Les composs dominants sont les acides gras saturs comportant une ramification mthyle: ils constituent de 43,6 % (culture sur i-C19) 61,4 % (culture sur ai-C19) de cette fraction (Tableau III.10). Les acides gras majoritaires sont l'iso- et l'antiso-C17:0 dans les cultures sur les alcanes iso et antiso 19 atomes de carbones, avec respectivement 24,7 % et 35,1 % des lipides "non lis". Par contre, dans les cultures sur iso- et 132

antiso-C20, les acides gras prpondrants sont respectivement l'iso- et l'antiso-C16:0

(respectivement 32,7 % et 20,4 %; Tableau III.9). On distingue aussi les acides gras iso et
antiso C15:0, prsents respectivement dans les cultures sur i-C19 et ai-C19, et les acides gras i-

et ai-C14:0, respectivement dans les cultures sur i-C20 et ai-C20. Une quantit surprenante d'acide gras antiso C17:0 (10,3 %) a t dtecte dans les lipides non lis de la culture sur aiC20, ce qui suggre l'intervention d'un mcanisme autre que la -oxydation dans la dgradation de cet alcane. Par ailleurs, chacune des cultures sur alcanes ramifis iso ou antiso conduit la formation de deux acides gras ramifis de mme nombre d'atomes de carbone que l'alcane utilis. Ainsi les cultures sur i-C19 et i-C20 donnent chacune un acide gras iso et un acide gras ramifi par un groupe mthyle en position 2 (par rapport au groupement carboxylique), respectivement 19 et 20 atomes de carbone. Ces derniers acides sont facilement identifiables grce leur spectres de masse prsentant deux ions intenses: l'ion 88 obtenu par un rarrangement McLafferty (remplaant l'ion 74 dans le cas des n-acides gras; Figure III.6) et l'ion 101 (remplaant l'ion 87 pour les n-acides gras; Figure III.7). Des rsultats similaires sont obtenus avec les cultures sur ai-C19 et ai-C20: chacune de ces cultures donne un acide gras antiso et un acide gras ramifi en position 3, respectivement 19 et 20 atomes de carbone. Les pourcentages des acides gras ramifis en position 2 ou 3 sont infrieurs ceux des acides gras provenant d'une oxydation du ct le moins encombr. Des quantits importantes d'acides gras insaturs iso ont t aussi dtectes dans les cultures sur i-C19 et i-C20 (respectivement, 9,6 % et 11,3 % ; Tableau III.10), dont l'insaturation se trouve essentiellement en position 9 dans la culture sur i-C19, alors que dans la culture sur i-C20 la position de l'insaturation varie entre les positions 6 et 10. Par comparaison, les cultures sur alcanes antiso renferment de plus faibles quantits d'acides gras insaturs antiso (2 % et 8,1 % respectivement dans les cultures sur ai-C19 et ai-C20) compares aux quantits d'acides gras insaturs iso dans les cultures sur les alcanes iso. Les insaturations de ces acides gras antiso sont localises surtout en position 9 et 7 dans la culture sur ai-C19, et surtout en position 9 et 8 dans le cas de l'hydrocarbure ai-C20. En ce qui concerne les acides gras normaux, la distribution est caractrise par un maximum au niveau de l'acide olique (n-C18:19) et ce pour les quatre cultures sur alcanes iso et antiso. L'abondance de cet acide varie entre 8,8 % des lipides "non lis" de la culture sur
ai-C19 et 16,2 % dans le cas de la culture sur ai-C20.

133

Les rsultats obtenus avec la culture sur 10-Me-C19 montrent une composition des lipides "non lis" intermdiaire entre celle des n-alcanes et celle des alcanes ramifis iso et
antiso. En effet, les acides gras ramifis contribuent pour 38,1 % (37,2 saturs et 0,9 %

insaturs) des lipides "non lis", alors que les acides gras normaux contribuent pour 59,4 % (25 % saturs et 34,4 % insaturs) (Tableau III.10). En raison de la symtrie de l'hydrocarbure 10-Me-C19, un seul acide directement driv de cet alcane est form, contrairement aux cultures sur alcanes iso et antiso.

Dans les cinq cultures sur alcanes ramifis, les acides gras insaturs sont en quantits moins importantes que dans les cultures sur n-alcanes. L'acide olique (n-C18:19) est l'acide gras insatur prdominant des lipides "non lis"

Par ailleurs, de faibles quantits d'acides gras mthyls en position 10 ont t dtectes dans les lipides "non lis" des cultures sur ai-C19, i-C20, ai-C20 et 10-Me-C19 : 10-Me-16:0, 10-Me-17:0, 10-Me-18:0, 10-Me-19:0. Ce dernier compos a t identifi uniquement dans la culture sur l'alcane correspondant: il s'agit d'un mtabolite provenant de l'oxydation de l'alcane. Par comparaison, une tude effectue sur une autre souche de
M.

hydrocarbonoclasticus cultive sur n-alcanes de C16 jusqu' C30 (Doumenq et al., 2001) a

montr la prsence de quantits significatives d'acides gras portant un groupe mthyle en position 10 dans chaque culture. Ceci avait conduit les auteurs proposer ces composs comme indicateurs de dgradation des hydrocarbures. Leur prsence non systmatique dans nos cultures ne corrobore pas cette proposition.

Les alcools constituent de 1,4 % (culture sur 10-Me-C19) 10,7 % (culture sur ai-C19) des lipides "non lis"(Tableau III.10). Dans les cultures sur alcanes iso et antiso, deux alcools primaires saturs provenant de l'oxydation des deux groupements mthyles terminaux (1 et ) ont t identifis, l'alcool dont le groupement hydroxyle est le plus loign de la ramification tant prdominant (Tableau III.9). Dans le cas des cultures sur alcanes antiso, l'oxydation subterminale se produit des deux cts donnant ainsi de faibles quantits (0,1 %) ou des traces d'alcools secondaires. Pour les cultures sur alcanes iso, une seule oxydation subterminale est possible cause de la ramification mthyle empchant l'oxydation sur un carbone tertiaire. L'alcool secondaire rsultant est observ dans les cultures sur i-C19 et i-C20, reprsentant respectivement 0,2 et 0,4 % des lipides "non lis". Dans cette dernire culture, un

134

alcool primaire iso insatur (9) 19 atomes de carbone a t galement identifi. La culture sur l'alcane ramifi en milieu de chane, 10-Me-C19, conduit uniquement la formation de deux alcools en C19 en raison de la symtrie de la molcule. L'alcool primaire (10-Me-19:0, 1OH) produit par oxydation terminale reprsente 0,9 % des lipides "non lis", alors que l'alcool secondaire (10-Me-19:0, 2-OH) form par oxydation subterminale n'a t dtect qu' l'tat de traces. Des quantits non ngligeables d'alcools primaires normaux n-C12 n-C22 sont galement prsentes. La prsence de ces derniers composs indpendamment de l'hydrocarbure fourni aux bactries montre que ce sont des produits provenant du mtabolisme normal des bactries (indpendamment de la nature de la source de carbone). Enfin, les lipides "non lis" contiennent pour une faible part (de 0,1 % 3,6 %; Tableau III.10) des -hydroxy acides dans leur trs grande majorit directement drivs des hydrocarbures fournis. Ainsi, parmi ces composs on peut citer les -hydroxy acides i-17:0 (3,1 %) et i-19:0 (0,5 %) dans la culture sur i-C19; i-16:0 (0,1 %), i-18:0 (1,0 %) et i-20:0 (0,2 %) dans la culture sur i-C20 ; ai-15:0 (0,4 %), ai-17:0 (0,7 %) et ai-19:0 (0,5 %) dans la culture sur ai-C19 ; ai-18:0 (< 0,1 %) et ai-20:0 (0,1 %) dans la culture sur ai-C20 ; et, 6-Me15:0 (0,2 %), 8-Me-17:0 (0,1 %) et 10-Me-19:0 (0,2 %) dans le cas de la culture sur 10-MeC19 (Tableau III.9). Tous ces -hydroxy acides ont la mme parit que les hydrocarbures parents ce qui suggre comme nous le verrons plus loin l'intervention d'un mcanisme de oxydation pour leur dgradation. Cependant, des -hydroxy acides de parit diffrentes ont t retrouvs en faibles quantits, notamment dans le cas des cultures sur i-C20, ai-C19 et aiC20 (Tableau II.9). Pour la plupart, il ne proviennent pas d'une oxydation des hydrocarbures trs minoritaires prsents dans les alcanes fournis (Tableau III.1). Leur prsence suggre l'intervention parallle et minoritaire, d'une dgradation par -oxydation.

135

Tableau III.9. Composition des lipides "non lis" de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur alcanes ramifis.
Lipides Acides gras saturs n-10:0 n-12:0 i-12:0 n-13:0 i-13:0 ai-13:0 n-14:0 i-14:0 ai-14:0 4-Me-13:0 n-15:0 i-15:0 ai-15:0 8-Me-14:0 n-16:0 i-16:0 ai-16:0 6-Me-15:0 n-17:0 i-17:0 ai-17:0 10-Me-16:0 5-Me-16:0 n-18:0 i-18:0 ai-18:0 10-Me-17:0 8-Me-17:0 n-19:0 i-19:0 ai-19:0 10-Me-18:0 3-Me-18:0 2-Me-18:0 n-20:0 i-20:0 ai-20:0 10-Me-19:0 3Me-19:0 2-Me-19:0 Acides gras insaturs n-14:1 9 n-14:1 7 ai-14:1 8 n-15:1 8 i-C19 i-C20 ai-C19 ai-C20 10-Me-C19

0,8 tr 0.3 0,1 16,2 2,3 1,8 1,1 27,1 0,2 1,3 0,6 0,8 tr -

0,2 0,2 0,1 0,1 0,2 13,5 2,5 0,1 1,1 32,7 1,1 1,4 0,3 1,1 9,2 0,1 0,3 0,2 -

tr 0,4 tr 1,0 0,4 0,3 0,4 20,1 tr 2,9 0,7 1,1 35,1 0,7 1,7 tr 0,2 0,1 tr 2,8 tr 0,4 0,1 -

0,1 0,2 5,9 0,2 0,1 1,8 2,4 20,4 1,3 0,7 10,3 1,6 1,3 16,2 0,2 0,1 0,3 1,4 0,3 tr -

tr 0,6 tr 2,8 2,6 tr 0,2 0,1 9,7 tr 6,9 10,4 tr 1,1 tr 1,6 23,5 0,1 0,3 tr 2,2 0,6 0,2 0,6 0,1 136

Lipides i-C19 n-15:1 6 n-15:1 4 1,5 n-16:1 9 n-16:1 8 2,7 n-16:1 7 n-16:1 6 n-16:1 5 i-16:1 10 i-16:1 8 i-16:1 6 ai-16:1 9 ai-16:1 8 ai-16:1 6 n-17:1 10 0,3 n-17:1 8 n-17:1 6 6,6 i-17:1 9 1,5 i-17:1 7 ai-17:1 9 ai-17:1 7 ai-17:1 5 17,4 n-18:1 9 0,3 n-18:1 7 0,2 n-18:1 5 i-18:1 10 i-18:1 8 ai-18:1 9 ai-18:1 8 ai-18:1 6 8-Me-17:1 8 n-19:1 10 n-19:1 8 2,4 i-19:1 9 ai-19:1 9 ai-19:1 7 n-20:1 11 0,6 n-20:1 9 i-20:1 9 i-20:1 8 ai-20:1 Acides gras cyclopropaniques 17 7,8 -hydroxy acides n-11:0, OH n-12:0, OH n-13:0, OH -

i-C20 0,8 1,7 0,3 0,7 1,2 1,2 0,7 1,1 tr 11,2 0,2 tr 4,1 2,8 0,8 0,2 0,1 0,3 0,2 -

ai-C19 0,8 tr 0,8 tr 0,7 tr tr 0,6 0,2 0,4 0,8 0,1 8,8 1,1 0,5 0,5 0,6 0,1 -

ai-C20 1,0 0,9 2,5 1.2 0,6 0,2 1,0 tr 0,5 0,3 16,2 0,3 tr 1,4 2,1 0,1 0,4 1,0 tr 0,7

10-Me-C19 0,1 tr 2,0 1,4 0,1 9,5 1,9 16,1 1,8 0,1 0,3 tr 0,3 0,1 -

0,2 0,2 -

1,1 tr -

tr -

tr tr tr

137

Lipides n-13:18, OH n-14:0, OH ai-15:0, OH i-16:0, OH ai-16:0, OH 6-Me-15:0, OH i-17:0, OH ai-17:0, OH n-18:0, OH i-18:0, OH ai-18:0, OH 8-Me-17:0, OH i-19:0, OH ai-19:0, OH i-20:0, OH ai-20:0, OH 10-Me-19:0, OH Alcools n-12:0, 1-OH n-14:0, 1-OH n-15:0, 1-OH ai-15:0, 1-OH n-16:0, 1-OH n-17:0, 1-OH n-18:0, 1-OH i-18:0, 1-OH n-19:0, 1-OH i-19:0, 1-OH i-19:1 9, 1-OH i-19:0, 2-OH ai-19:0, 1-OH ai-19:0, 2-OH 3-Me-18:0, 1-OH 3-Me-18:0, 2-OH 2-Me-18:0, 1-OH n-20 :0, 1-OH i-20:0, 1-OH i-20:0, 2-OH ai-20:0, 1-OH ai-20:0, 2-OH 10-Me-19:0, 1-OH 10-Me-19:0, 2-OH 3-Me-19:0, 1-OH 3-Me-19:0, 2-OH 2-Me-19:0, 1-OH n-22:0, 1-OH

i-C19 3,5 tr 0,6 -

i-C20 tr 0,1 1,0 0,1 0,2 -

ai-C19 0,4 tr 0,7 0,1 0,5 -

ai-C20 tr tr

tr 0,1 tr 0,2 0,2 1,9 0,1 1,0 0,1 -

10-Me-C19 0,1 0,2 0,1 0,2

0,2 0,3 0,2 5,9 1,7 0,2 tr -

0,1 0,1 tr 0,3 tr 0,1 0,1 2,1 0,4 0,9 0,1

tr tr 0,1 0,1 1,0 0,1 7,8 0,1 1,3 0,1 0,1 tr

tr 0,2 tr tr 0,1 0,2 0,9 tr -

* L'ensemble des produits mineurs non identifis dans ces fractions lipidiques ainsi que des produits identifis (mais non rpertoris dans ce tableau car prsents l'tat de trace et pas vraiment

138

significatifs en terme de mtabolisme des hydrocarbures par la bactries et d'influencer sur ces lipides) reprsentent entre 0,5 % et 2,0 % des lipides totaux.

Tableau III.10. Composition globale des lipides "non lis" de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur alcanes ramifis.
Source de carbone i-C19 Classes de composs n-alcan-1-ols alcan-1-ols ramifis alcan-2-ols ramifis Alcools n-acides saturs n-acides insaturs acides ramifies saturs acides ramifies insaturs acides -hydroxy acides composs pairs composs impairs composs normaux composes ramifis AG saturs AG insaturs AG n-C16 AG n-C17 AG n-C18
AG: acides gras

i-C20 0.7 3.4 0.4 4.5 4.0 16.3 60.4 11.3 92.0 1.8 89.5 8.8 21.4 76.9 64.4 27.6 3.9 2.9 12.5

ai-C19 1.3 9.2 0.2 10.7 7.0 14.0 61.4 2.0 84.4 1.7 20.8 77.1 22.3 75.6 68.4 16.0 5.2 2.3 12.1

ai-C20 0.2 3.1 0.2 3.5 5.7 22.3 59.1 8.1 95.2 0.1 77.7 21.1 28.2 70.6 64.8 30.4 5.8 2.3 17.8

10-Me-C19 0.5 0.9 tr 1.4 25.0 34.4 37.2 0.9 97.5 0.6 72.6 26.9 60.0 39.5 62.2 35.3 13.2 21.8 19.6

0.7 6.9 0.2 7.8 13.0 21.1 43.6 9.6 87.3 3.6 35.6 63.1 34.8 63.9 56.6 30.7 5.8 1.3 26.4

139

VI.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE

La composition des lipides obtenus par un traitement basique des biomasses bactriennes dj extraites aux solvants est caractrise par la dominance des -hydroxy acides, except dans le cas de la culture sur 10-Me-C19. La somme des -hydroxy acides varie de 47,9 % (culture sur 10-Me-C19) 65,6 % (culture sur ai-C20) de cette fraction lipidique (Tableaux III.11 et 12) avec une forte contribution des n--hydroxy acides (> 90 %) de C10 C14. Le -hydroxy acide n-C12:0 est le compos prdominant dans cette srie, constituent plus que 65 % des -hydroxy acides (Tableau III.11). Les -hydroxy acides ramifis sont trs minoritaires et parmi eux, ceux comportant plus de quatorze carbones ne sont prsents qu' l'tat de trace. Une relation directe entre la structure de l'hydrocarbure ramifi et celle des hydroxy acides se dgage dans la pluspart des cas. Cependant, les cultures sur les alcanes
antiso contiennent de faibles quantits de -hydroxy acides iso, et la culture sur i-C20

renferme des traces de -hydroxy acides antiso. Les -hydroxy acides prsents dans cette fraction sont essentiellement saturs: entre 82 % (culture sur ai-C19) et 96 % (culture sur 10Me-C19). Les -mthoxy acides sont galement prsents dans cette fraction mais leur origine artfactuelle a t dj discute. La distribution des acides gras dans les lipides labiles en milieu basique varie considrablement en fonction de la structure de l'hydrocarbure. Les acides gras saturs prdominent dans toutes les cultures avec une grande contribution des composs ramifis iso,
antiso et ramifis en milieu de chane (approximativement 2/3 des acides gras saturs), selon

la structure de l'alcane utilis (Tableaux III.11 et III.12). Par contre, la distribution des acides gras insaturs est domine par les composs normaux (n-C18:19 et n-C14:19; Tableau III.11). Dans les deux fractions des lipides "non lis" et labiles en milieu basique de la culture sur ai-C19, de faibles quantits d'acide gras cyclopropane 177,8 ont t dtectes (respectivement 1,1 % et 0,3 %; Tableaux III.11 et III.12). Sa caractrisation a t effectue par comparaison du spectre de masse avec celui d'un standard.

140

Tableau III.11. Composition des lipides labiles hydrocarbonoclasticus cultive sur alcanes ramifis.
Lipides Acides gras saturs n-10:0 n-12:0 n-13:0 i-13:0 ai-13:0 3-Me-12:0 n-14:0 i-14:0 ai-14:0 n-15:0 i-15:0 ai-15:0 n-16:0 i-16:0 ai-16:0 6-Me-15:0 n-17:0 i-17:0 ai-17:0 10-Me-16:0 n-18:0 i-18:0 ai-18:0 10-Me-17:0 8-Me-17:0 i-19:0 ai-19:0 n-20:0 i-20:0 ai-20:0 10-Me-19:0 Acides gras insaturs n-13:1 7 n-13:1 4 i-13:1 7 3-Me-12:1 8 n-14:1 9 n-14:1 7 n-14:1 5 i-14:1 8 n-16:1 9 n-16:1 7 i-16:1 8 i-16:1 6 i-C19 i-C20

en

milieu

basique

de

M.

ai-C19

ai-C20

10-Me-C19

2,4 1,0 6,5 2,6 0,9 0,4 10,6 1,5 0,2 5,1 1,3 1,1 -

0,1 3,0 0,5 0,1 0,3 2,4 2,1 8,3 0,5 0,3 1,1 1,8 tr tr 0,5 0,2 5,5 0,1 tr tr 0,2 0,3 tr 0.1

0,1 4,0 0,4 tr 0,8 0,2 0,1 7,2 2,8 0,1 0,4 13,6 1,6 0,3 0,5 0,2 2,9 1,4 tr 0,5 0,4 -

0,7 0,3 tr tr 0,6 6,3 0,4 0,3 2,4 2,9 0,6 0,4 2,7 0,2 1,7 0,1 2,8 0,2 0,6 0,3 1,7 tr tr -

0,2 2,0 0,1 tr tr 3,4 0,2 3,4 4,9 0,5 13,0 0,6 1,8 1,6 0,8 0,1 0,6 0,2 -

141

Lipides i-C19 ai-16:1 8 ai-16:1 6 n-17:1 10 n-17:1 9 n-17:1 8 2,3 i-17:1 7 ai-17:1 9 ai-17:1 7 6,4 n-18:1 9 0,1 n-18:1 7 i-18:1 10 i-18:1 8 ai-18:1 8 i-19:1 9 ai-19:1 9 ai-19:1 7 Acides gras cyclopropaniques 17 7,8 # -hydroxy acids n-10:0, OH 0,2 n-11:0, OH 0,4 ai-11:0, OH n-12:0, OH 50,6 1,7 n-12:17, OH i-12:0, OH ai-12:0, OH n-13:0, OH 0,3 0,3 n-13:18, OH n-13:16, OH i-13:0, OH 0,6 ai-13:0, OH n-14:0, OH 0,2 1,5 n-14:19, OH n-14:17, OH n-14:15, OH i-14:0, OH ai-14:0, OH ai-15:0, OH i-17:0, OH tr ai-17:0, OH i-19:0, OH tr ai-19:0, OH Alcools n-12:0, 1-OH n-14:0, 1-OH n-15:0, 1-OH ai-15:0, 1-OH -

i-C20 0,2 0,3 3,9 tr 0,8 0,5 0,1 -

ai-C19 tr tr 3,4 1,3 0,3 0,1

ai-C20 0,1 tr tr 5,1 0,1 0,5 -

10-Me-C19 5,9 9,2 -

0,7 3,5 44,5 5,5 0,1 2,1 3,2 tr tr tr 0,4 3,3 0,1 tr tr tr 0,3 0,6 -

0,3 1,2 2,3 tr 36,5 5,6 1,4 1,9 0,1 0,7 1,6 0,3 2,1 tr tr 0,1 tr tr tr 0,3 0,2 tr

0,2 1,3 53,7 2,4 0,6 1,8 1,7 tr tr 0,5 2,7 tr 0,7 0,3 -

0,1 7,1 31,8 0,4 5,6 2,3 tr 0,1 0,5 tr -

142

Lipides n-16:0, 1-OH n-18:0, 1-OH n-18:19, 1-OH i-19:0, 1-OH n-20:0, 1-OH i-20:0, 1-OH 2-Me-19:0, 1-OH ai-20:0, 1-OH
#

i-C19 0,1 0,1 0,3 -

i-C20 0,4 0,1 0,1 0,1 0,1 -

ai-C19 0,4 0,3 0,1 -

ai-C20 0,4 0,1 1,3

10-Me-C19 0,1 0,1 1,2 -

Les abondances relatives des -mthoxy acides prsents ont t additionnes respectivement a celles des -hydroxy acides comportant les mmes nombres d'atomes de carbone, partir desquels ils sont drivs. * L'ensemble des produits mineurs non identifis dans ces fractions lipidiques ainsi que des produits identifis (mais non rpertoris dans ce tableau car prsents l'tat de trace et pas vraiment significatifs en terme de mtabolisme des hydrocarbures par la bactries et d'influencer sur ces lipides) reprsentent entre 1,2 % et 2,1 % des lipides totaux.

Tableau III.12. Composition globale des lipides labiles en milieu basique de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur alcanes ramifis.
Source de carbone i-C19 Classes de composs alcools n-acides saturs n-acides insaturs acides ramifies saturs acides ramifies insaturs acides n--hydroxy acides -hydroxy acides ramifis -hydroxy acides -hydroxy 12:0* composs normaux composes ramifis composs pairs composs impairs AG n-C16 AG n-C17 AG n-C18 0,5 7,9 14,0 18,2 2,3 42,4 55,2 0,6 55,8 90,7 77,3 21,4 76,8 21,9 5,0 0,4 8,0 i-C20 1,7 7,6 11,0 12,9 1,7 33,2 63,3 0,1 63,4 70,2 83,4 14,9 86,8 11,5 2,6 1,0 5,0 ai-C19 1,3 9,7 9,9 22,6 0,4 42,6 51,4 2,4 53,8 67,8 72,3 25,7 66,1 31,9 3,7 0,4 6,3 ai-C20 2,1 6,1 7,2 17,1 0,6 31,0 64,3 1,3 65,6 81,9 78,4 20,3 88,5 10,2 2,4 0,6 6,9 10-Me-C19 1,4 9,1 18,4 19,2 1,8 48,5 47,9 tr 47,9 66,4 76,8 21,0 68,2 29,6 4,2 10,8 9,7

AG: acides gras. *: % par rapport aux -hydroxy acides totaux de la prsente fraction.

143

VI.4. LIPIDES LABILES EN MILIEU ACIDE

Comme dans le cas des cultures sur n-alcanes, les lipides labiles en milieu acide des cultures sur alcanes ramifis sont caractriss par une nette prdominance des -hydroxy acides reprsentant de 78,1 % de cette fraction dans le cas de la culture sur ai-C20 93,4 % dans le cas de la culture sur i-C19 (Tableau III.14). Le compos le plus abondant est encore le
-hydroxy acide n-12:0 (Tableaux III.13 et III.14). Comme dans le cas des lipides labiles en

milieu basique les -hydroxy acides ramifis sont prsents en trs faible quantit l'exception de la culture sur ai-C19. Dans cette dernire les -hydroxy acides antiso contribuent pour 12,7 % de cette fraction (avec notamment 11,9 % d'ai--13:0; Tableau III.13). Par contre, seule une faible quantit de -hydroxy acides antiso a t identifie dans le cas de la culture sur ai-C20 (1,3 % ; Taleau III.13). Dans la culture sur 10-Me-C19, seules des traces de hydroxy acides ramifis ont t identifis; les -hydroxy acides n-11:0 et n-13:0 tant pour leur part des composs abondants (respectivement, 7,3 % et 12,4 % ; Tableau III.13). Les distributions des acides gras dans les lipides labiles en milieu acide sont quant elles assez complexes et varient en fonction de l'hydrocarbure fourni (Tableau III.13).

144

Tableau III.13. Composition des lipides labiles en milieu acide de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur alcanes ramifis.
Lipides Acides gras saturs n-10:0 n-12:0 ai-12:0 n-13:0 ai-13:0 n-14:0 i-14:0 ai-14:0 n-15:0 ai-15:0 n-16:0 i-16:0 ai-16:0 n-17:0 i-17:0 ai-17:0 10-Me-16:0 n-18:0 i-18:0 ai-18:0 n-19:0 ai-19:0 n-20:0 ai-20:0 Acides gras insaturs n-13:1 8 n-14:1 9 n-16:1 9 n-16:1 7 ai-16:1 8 ai-16:1 6 n-17:1 8 n-18:1 9 n-18:1 7 n-18:1 5 n-18:2 i-18:1 10 i-18:1 8 ai-18:1 8 -hydroxy acides# n-10:0, OH n-11:0, OH ai-11:0, OH i-11:0, OH i-C19 i-C20 ai-C19 ai-C20 10-Me-C19

2,3 0,4 0,4 0,2 0,5 0,7 -

tr 0,3 0,1 0,2 3,7 0,2 0,4 tr 2,0 0,3 0,1 0,2 0,1 tr 5,4 0,1 0,2 0,9 0,1 tr 1,0 4,3 tr

0,1 0,8 tr 0,1 0,2 2,4 0,2 1,1 2,2 0,2 1,7 0,2 -

5,4 0,4 0,6 0,1 tr 1,0 3,0 0,1 0,3 1,8 0,3 1,5 0,1 0,2 tr 0,8 tr tr 0,4 1,8 0,2 0,2 0,4 0,1 0,1 0,5 0,3 0,3 0,6 2,8 -

1,8 0,1 0,2 1,0 0,7 tr 0,8 tr 7,3 145

Lipides n-12:0, OH n-12:1 7, OH i-12:0, OH ai-12:0, OH n-13:0, OH n-13:1 8, OH i-13:0, OH ai-13:0, OH n-14:0, OH n-14:1 9, OH i-14:0, OH ai-14:0, OH n-15:0, OH ai-15:0, OH ai-17:0, OH i-19:0, OH ai-19:0, OH i-20:0, OH Alcools n-12:0, 1-OH n-14:0, 1-OH n-16:0, 1-OH n-18:0, 1-OH n-18:1, 1-OH ai-19:0, 1-OH n-20:0, 1-OH i-20:0, 1-OH ai-20:0, 1-OH 2-Me-19:0, 1-OH n-22:01-OH
#

i-C19 87,8 0,4 0,7 1,9 1,0 0,4 tr -

i-C20 68,5 1,1 5,0 0,2 tr 1,7 0,1 tr tr tr

ai-C19 65,5 tr 0,1 0,2 4,6 tr 3,0 11,9 2,2 0,1 tr 0,2 tr 0,2 tr tr -

ai-C20 62,6 3,6 0,7 2,0 2,0 tr tr 0,4 2,8 tr 0,6 -

10-Me-C19 71,0 12,4 tr 0,5 tr -

0,1 0,6 0,4 -

0,1 0,1 1,0 0,6 tr 0,2 0,1 0,2

0,2 0,1 0,8 0,6 0,1 0,2

0,1 0,2 0,1 0,1 tr -

1,0 0,6 0,3 -

Les abondances relatives des -mthoxy acides prsents ont t additionnes respectivement a celles des hydroxy acides comportant les mmes nombres d'atomes de carbone, partir desquels ils sont drivs. * L'ensemble des produits mineurs non identifis dans ces fractions lipidiques ainsi que des produits identifis (mais non rpertoris dans ce tableau car prsents l'tat de trace et pas vraiment significatifs en terme de mtabolisme des hydrocarbures par la bactries et d'influencer sur ces lipides) reprsentent entre 0,7 % et 4,1 % des lipides totaux.

146

Tableau III.14. Composition globale des lipides labiles en milieu acide de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur alcanes ramifis.
Source de carbone i-C19 Classe de compos alcools n-acides saturs n-acides insaturs acides ramifies saturs acides ramifies insaturs acides n--hydroxy acides -hydroxy acides ramifis -hydroxy acids -hydroxy 12:0* composs pair composs impair composs normaux composes ramifis 2,0 2,9 0,4 3,3 91,5 1,9 93,4 94,0 93,0 4,8 96,2 1,6 i-C20 2,3 6,8 6,7 0,7 0,1 14,3 80,5 1,4 81,9 83,6 91,3 7,2 96,0 2,5 ai-C19 2,0 5,8 1,3 7,1 74,3 15,8 90,1 72,7 79,7 17,5 86,3 12,9 ai-C20 0,5 6,9 3,5 8,7 0,8 19,9 76,8 1,3 78,1 80,2 89,7 8,8 83,9 14,6 10-Me-C19 1,9 3,8 0,8 4,6 91,2 tr 91,2 77,9 75,4 22,3 96,3 1,4

AG: acides gras. *: % par rapport aux -hydroxy acides totaux de la prsente fraction.

VI. 5. CONCLUSIONS PARTIELLES SUR L'INFLUENCE DES ALCANES LINEAIRES

VI.5.1. Influence de la parit des alcanes sur la composition lipidique

En considrant uniquement le nombre total d'atomes de carbone des alcanes utiliss sans tenir compte de l'absence ou de la prsence de ramifications, il apparait que la composition lipidique dpend de la parit de l'alcane utilis comme source de carbone. La distribution des lipides "non lis", qui reprsentent la partie lipidique la plus importante, montre que:

* Les alcanes nombre pair d'atomes de carbone (n-C20, i-C20, ai-C20 et 10-Me-C19)

conduisent essentiellement des lipides nombre pair d'atomes de carbone. Inversement, les alcanes nombre impair d'atomes de carbone (n-C19, n-C21, i-C19 et ai-C10) conduisent essentiellement des lipides nombre impair d'atomes de carbone (Tableaux III.4 et III.10). Ces rsultats sont en accord avec les travaux de Doumenq et al. (2001) sur l'influence de la parit des n-alcanes sur la composition en acides gras de M. hydrocarbonoclasticus (souche 617). Diffrentes tudes sur la dgradation des alcanes par des bactries arobies ont conduit au mme rsultat (Dunlap et Perry, 1967; Makula et Finnerty, 1968a; Hug et Fiechter, 1973; King et Perry, 1975; Rehm et Reiff, 1981). Parmi ces bactries on peut citer: Pseudomonas 147

aeruginosa, Micrococcus cerificans, Acinetobacter sp et Mycobacterium vaccae. Des rsultats

similaires ont t galement constats chez des bactries sulfato-rductrices (Desulfobacter sp., Desulfolobus sp. et Dsulfovibrio desulfiricans) (Taylor et Parkes, 1983). Par contre, Aeckersberg et al. (1998) ont observ des rsultats diffrents chez d'autres bactries sulfatorductrices. En effet, chez ces dernires, les acides gras nombre impair d'atomes de carbone sont dominants dans les cultures sur hexadcane et vice versa, les cultures sur heptadcane contiennent essentiellement des acides gras pairs.
* Les cultures sur alcanes pairs sont caractrises par la prdominance d'acides gras

16 et 18 atomes de carbone. Les acides gras saturs ont un maximum 16:0 (n, i ou ai selon l'hydrocarbure) et les insaturs n-18:1 quelque soit la structure de l'hydrocarbure. La culture sur 10-Me-C19 fait exception, avec l'acide 8-Me-17:0 prpondrant et les acides gras 17:0 sont plus abondants que les acides 16:0. L'utilisation d'alcanes nombre impair d'atomes de carbone conduit une diminution du pourcentage des acides gras 16 et 18 atomes de carbone. Cette diminution est compense par une augmentation des pourcentages des acides gras saturs et insaturs 17 atomes de carbone, l'exception des cultures sur i- et ai-C19 pour lesquelles les acides gras 18:1 sont les acides insaturs prdominants. Les Figures III.35 et III.36 montrent respectivement la distribution des acides gras saturs 16:0 et 17:0, et les acides gras insaturs 17:1 et 18:1 (sommes de tous les isomres) en fonction de la source de carbone.
40 16:0 17:0 30

20

10

0
Ac et at e i-C 19 nC1 9 nC2 0 nC2 1 i-C 20 aiC1 9 aiC2 0 10 -M eC 19

Figure III.35. Abondance relative (%) des acides gras saturs 16 et 17 atomes de carbone en fonction de l'alcane test.

148

60 50 40 30 20 10 0
20 10 -M eC 19 Ac et at e ai -C 19 19 20 nC 21 i-C 20 i-C 19 ai -C nC nC

17:1 18:1

Figure III.36. Abondance relative (%) des acides gras insaturs 17 et 18 atomes de carbone en fonction de l'alcane test.

Les lipides labiles en milieu basique sont domins par les acides gras normaux nombre pair d'atomes de carbone en raison, en particulier, de la prsence de grandes quantits de -hydroxy acides n-12:0. La culture sur n-C19 est la seule o les acides impairs dominent la distribution lipidique (Tableau III.6). Les lipides labiles en milieu acide sont trs faiblement influencs par la source de carbone. Ils contiennent essentiellement des composs normaux nombre pair d'atomes de carbone et ce quelque soit la source de carbone (Tableaux III.8 et III.14).

VI.5.2. Influence de la ramification des alcanes sur la composition lipidique

La distribution des lipides "non lis" se trouve fortement influence par la position de la ramification mthyle sur la chane hydrocarbone. Les cultures sur alcanes normaux conduisent essentiellement des composs normaux. Ils constituent entre 94,6 % et 98,9 %: une partie des n-acides gras proviennent de l'oxydation de l'hydrocarbure fournit aux bactries et l'autre partie est synthtise partir des units C2 produites au cours de la dgradation. Inversement, dans les cultures sur alcanes ramifis, les composs ramifis sont majoritaires l'exception de la culture sur 10-Me-C19 o les composs normaux constituent 60 % des lipides "non lis" (Tableaux III.4 et III.10).

149

Les acides gras iso, antiso, et ramifis en milieu de chane sont surtout prsents respectivement dans les cultures sur alcanes iso, antiso et 10-Me-C19 (Figure III.37). Dans les cultures sur n-alcanes, seules de faibles quantits d'acides gras iso sont prsents dans les cultures sur n-C19 et n-C21, alors qu'ils sont absents dans les cultures sur actate d'ammonium et sur n-C20.

n -acides
100 80 60 40 20 0
100 80 60 40 20 0

i -acides

Acetate

10-MeC19

n-C19

n-C20

n-C21

ai-C19

ai-C20

i-C19

i-C20

Acetate

ai -acides
100 100

Autres acides ramifis *

80

80

60

60

40

40

20

20

Acetate

i-C19

i-C20

ai-C19

ai-C20

n-C19

n-C20

n-C21

10-MeC19

Acetate

i-C19

i-C20

ai-C19

ai-C20

n-C19

n-C20

n-C21

Figure III.37. Abondance relative (%) des acides gras normaux et ramifis dans les lipides "non lis" en fonction de l'alcane utilis (*: acides provenant de l'oxydation du ct de la ramification et acides avec un groupement mthyle en milieu de chane).

Dans les cultures sur hydrocarbures ramifis, le pourcentage des acides gras insaturs (normaux + ramifis) est plus faible que dans les cultures sur hydrocarbures normaux. Cette diminution s'accompagne d'une trs forte augmentation des acides gras saturs ramifis (Figure III.38). Cette redistribution au profit de ces acides pourrait tre lie l'homoviscosit membranaire, phnomne permettant aux membranes de consever une certaine fluidit, en incorporant dans les lipides soit des acides chane hydrocarbone courte, soit des acides gras insaturs soit des acides gras ramifis, acides gras ayant des points de fusion plus bas que ceux des acides gras normaux saturs. (Sinensky, 1974; Suutari et Laakso, 1994; Chattopadhyay et Jagannadham, 2003). 150

10-MeC19

10-MeC19

i-C19

i-C20

ai-C19

ai-C20

n-C19

n-C20

n-C21

Figure III.38. Abondance relative (%) des acides gras insaturs (normaux + ramifis) et des acides gras ramifis saturs en fonction de la source de carbone.

La prsence des acides gras ramifis en position 10 (10-Me-16:0, 10-Me-17:0, 10-Me17:0 10-Me-18:0 et 10-Me-19:0) est alatoire. Aucune relation entre la parit des alcanes et la prsence de ces acides gras n'est possible l'exception du 10-Me-19:0 qui est le produit de l'oxydation terminale du 10-Me-C19. L'acide gras 10-Me-16:0 est gnralement considr comme spcifique de Desulfobacter sp (Parkes et al., 1993 ; Guezennec et Fiala-Medioni, 1996 ; Doumenq et al., 1999) il a t dtect dans toutes les cultures de M.
hydrocarbonoclasticus (617) sur hydrocarbures (Doumenq et al., 2001).

Les alcools sont prsents dans les lipides "non lis" de toutes les cultures, leur distribution est trs dpendante de la source de carbone. Cependant de faibles quantits d'alcools normaux ( C18) sont prsentes dans toutes les cultures sur alcanes ramifis. Les alcools ramifis iso, antiso et en milieu de chane sont prsents respectivement dans les cultures sur les alcanes iso, antiso et 10-Me-C19 (Figure III.39). Ces composs proviennent de l'oxydation primordiale en positions terminale et subterminale (si aucun groupe mthyle n'est prsent cette position) des alcanes correspondants. Quatre alcools ramifis sont ainsi forms partir des hydrocarbures anteiso, trois partir des hydrocarbures iso et deux partir du 10-Me-C19.

151

Alcools normaux
14 12 10 8 6 4 2 0 n-C19 n-C20 n-C21 ai-C19 ai-C20 10-Me-C19 i-C19 i-C20 Acetate 14 12 10 8 6 4 2 0 n-C19 n-C20

Alcools iso

n-C21

ai-C19

ai-C20

Alcools antiso
14 12 10 8 6 4 2 0 10-Me-C19 n-C19 n-C20 n-C21 ai-C19 ai-C20 i-C19 i-C20 Acetate 14 12 10 8 6 4 2 0

Autres alcools ramifis*

Figure III.39. Abondance relative (%) des alcools normaux et ramifis dans les lipides "non lis" en fonction de l'alcane utilis (*: alcools provenant de l'oxydation du ct de la ramification et alcools avec un groupement mthyle en milieu de chane). Les -hydroxy acides longues chanes sont prsents en faibles quantits dans les lipides "non lis" des cultures sur hydrocarbures. Seuls ceux correspondant une oxydation du ct le moins encombr de la chane hydrocarbone ont pu tre dtects. Ils sont accompagns de deux trois de leurs homologues infrieurs.

VI.5.3. Voies de dgradation des alcanes linaires par M. hydrocarbonoclasticus

Les distributions des composs prsents dans les lipides "non lis" (Tableaux III.3 et III.9), c'est dire membranaires et ceux provenant de la dgradation des hydrocarbures, fournissent des informations sur le mtabolisme des alcanes linaires chez M.
hydrocarbonoclasticus.

En ce qui concerne les n-alcanes, il apparat, comme cela t propos (Lattuati et al., 2002), que leur dgradation s'effectue essentiellement via une oxydation en alcools primaires, eux mme oxyds vraisemblablement en aldhydes (non dtcts ici), puis en acides, la dgradation se poursuivant via le cycle de -oxydation classique (Figure III.40). Il est probable que les alcools secondaires rsultant d'une oxydation subterminale, dtects en 152

10-Me-C19

n-C19

n-C20

n-C21

ai-C19

Acetate

ai-C20

i-C19

i-C20

10-Me-C19

i-C19

Acetate

i-C20

faibles quantits, sont dgrads via une voie mineure, mettant en jeu les ctones correspondantes issues de leur oxydation, elles mmes oxydes selon un processus de type Bayer-Villiger, en esters. Les alcools primaires qui en drivent seraient leurs tours oxyds en acides gras. Paralllement, les sries insatures pourraient provenir d'une dsaturation des alcools, et des acides (Tableau III.3). Enfin les units actates formes dans le cycle de oxydation sont paralllement reprises dans la synthse de novo des acides gras, conduisant des acides nombre de carbone essentiellement pair, ce recyclage intervenant dans le mtabolisme de tous les alcanes tudis ici.

n-C19 Oxydation terminale Oxydation subterminale


OH

*
OH Alcool n-19:0, 1-OH

Alcool n-19:0, 2-OH O

Bayer-Villiger
CO2H

*
O O

Acide n-19:0

CO2H OH

*
OH Alcool n-17:0, 1-OH

CO2H

*
*: composs dtects dans les lipides cellulaires # : voie mtabolique mineure : voie mtabolique majeure

Acide n-17:0

Oxydations ultrieures

Figure III.40. Voies mtaboliques proposes pour la dgradation des n-alcanes chez M.
hydrocarbonoclasticus (#: membranaires + ceux drivs du mtabolisme prsents dans le

cytoplasme).

La Figure III.41 illustre le processus de dgradation des iso-alcanes chez M.


hydrocarbonoclasticus. Les donnes analytiques (Tableau III.9) montrent que l'oxydation

terminale du ct le moins encombr est favorise, avec formation de l'alcool primaire et de 153

l'acide correspondant. Ce dernier pris dans un cycle de -oxydations conduit la srie d'acides iso de mme parit que l'iso-alcane de dpart. L'oxydation subterminale du ct le moins encombr de l'iso-alcane conduit galement, via une oxydation de type Bayer-Villiger, un acide iso de mme parit que l'alcane. La prsence d'une srie mineure iso de parit inverse, suggre l'intervention d'une -oxydation des acides iso prpondrants. Enfin, l'alcool primaire terminal issu de l'oxydation de l'un des deux mthyles du groupe iso-propyle (voie mineure), serait oxyd en acide. Une -oxydation de celui-ci conduirait un acide gras normal nombre impair d'atomes de carbone partir d'un iso alcane pair (Figure III.41) et inversement un acide gras normal nombre pair d'atomes de carbone partir d'un iso alcane impair.

Dans le cas des antiso alcanes, si l'oxydation terminale en alcool primaire puis en acide gras, pris ensuite dans un cycle de -oxydation, est toujours la voie principale de dgradation, les processus sont pour ce type d'hydrocarbures, plus complexes (Figure III.42). Tout d'abord, si partir d'un anteiso alcane nombre de carbone impair, la srie analogue d'acide nombre pair d'atomes de carbone est trs minoritaire, la situation inverse n'est pas observe partir de l'anteiso alcane C20. Dans ce cas, l'acide anteiso 17:0 reprsente plus de 10 % dans les lipides "non lis": sans tre prpondrante comme la -oxydation, l'oxydation n'est pas dans ce cas une voie trs mineure. Par ailleurs, dans le cas de l'anteisoalcane "impair", les oxydations terminale et subterminale du ct le plus encombr concourent vraisemblablement la formation via des oxydations successives, de l'acide gras
n-15:0. De ce point de vue, l'identification du n-pentadecan-1-ol, en faible quantit, suggre

qu'il s'agirait d'un mtabolite rsultant d'une oxydation de type Bayer-Villiger.

Enfin, pour ce qui concerne l'hydrocarbure ramifi en milieu de chane, le 10-mthylnonadcane, son mtabolisme s'effectue essentiellement via l'alcool primaire correspondant, oxyd en acide, lui mme dgrad via un processus de -oxydation. Comme cela est illustr sur la Figure III.43, la dgradation d'un mtabolite intermdiaire, l'acide 2-mthylundcanoque, par perte d'unit C3, doit conduire l'acide n-nonanoque. Ce dernier pris dans un processus d'longation classique par addition d'unit C2 conduirait l'acide n-17:0, acide "impair" dont le taux lev dans les lipides "non lis" (Tableau III.9), a priori, peut apparatre surprenant. Paralellement, les unit C2 libres dans la dgradation seraient galement reprises dans la synthse de novo conduisant aux acides gras pairs (Figure III.43).

154

i-C20 Oxydation subterminale Oxydation terminale


OH

Oxydation terminale

*
Alcool i-20:0, 2-OH O Alcool i-20:0, 1-OH HO2C CO2H O Acide i-20:0 O HO2C OH OH OH

*
Alcool 2Me-19:0, 1-OH

Bayer-Villiger

*
Acide 2Me-19:0 -oxydation

*
OH -oxydation -oxydation Alcool i-18:0, 1-OH OH CO2H OH CO2H Acide n-17:0 -oxydation

CO2H

Acide n-15:0

CO2H

CO2H Acide i-19:0

Oxydations ultrieures
Acide i-18:0

Figure III.41. Voies mtaboliques proposes pour l'iso-icosane (i-C20) chez M.


Oxydations ultrieures Oxydations ultrieures

hydrocarbonoclasticus (ni les units C2 issues des -oxydations et de la raction de Bayer: voie mtabolique mineure : voie mtabolique majeure

Villiger, ni la synthse de novo partir de ces units ne figurent sur ce schma).

*: composs dtects dans les lipides cellulaires

155

ai-C19

Oxydation subterminale Oxydation terminale


OH OH

Oxydation terminale

Oxydation subterminale

* *
OH

*
OH

Bayer-Villiger O CO2H O OH OH HO2C Acide ai-19:0 HO2C

HO2C

*
O

Bayer-Villiger

O OH

Bayer-Villiger -oxydation -oxydation HO2C OH OH CO2H * OH CO2H HO2C O # O

*
Acide n-15:0

*
OH

CO2H Acide ai-17:0

CO2H

*
Acide ai-18:0

Oxydations ultrieures

Oxydations ultrieures
#
: voie mtabolique importante dans le cas de la dgtadation de l'alcane ai-C 20 conduisant l'acide ai-17:0 *: composs dtects dans les lipides cellulaires : voie mtabolique mineure : voie mtabolique majeure

Figure III.42. Voies mtaboliques proposes pour l'anteiso-nonadcane (ai-C19) chez M.

hydrocarbonoclasticus (ni les units C2 issues des -oxydations et de la raction de Bayer-

Villiger ni la synthse de novo partir de ces units ne figurent sur ce schma).

Oxydations ultrieures

156

10-Me-C19

Oxydation subterminale

Oxydation terminale

OH Alcool 10-Me-19:0, 2-OH O

*
OH Alcool 10-Me-19:0, 1-OH

Bayer-Villiger
O O

CO2H

Acide 10-Me-19:0 CO2H OH

Alcool 8-Me-17:0, 1-OH

OH

CO2H

Acide 8-Me-17:0

CO2H
-oxydation

CO2H OH
*: composs dtects dans les lipides cellulaires : voie mtabolique mineure : voie mtabolique majeure

CO2H

Acide n-9:0

Elongation

CO2H

Acide n-17:0

Figure III.43. Voies mtaboliques proposes pour le 10-Me-nonadcane chez M.


hydrocarbonoclasticus (ni les units C2 issues des -oxydations et de la raction de Bayer-

Villiger ni la synthse de novo partir de ces units ne figurent sur ce schma).

157

VII. CULTURE DE M. HYDROCARBONOCLASTICUS SUR ALCENE: n-NONADEC-1-ENE.

VII.1. IDENTIFICATION DES LIPIDES.

La principale diffrence que l'on note entre les distributions de lipides de M.


hydrocarbonoclasticus cultive sur alcne (Tableau III.15) et alcanes (Tableaux III.3, 5, 7, 9,

11 et 13) concerne la plus grande abondance de composs insaturs, avec l'apparition de composs mono-insaturs en position 1 et de composs di-insaturs comportant galement une insaturation en position -1. Cette double liaison en 1 tmoigne de leur relation directe avec l'hydrocarbure parent. Les Figures III.44, III.45 et III.46 prsentent les spectres de masse et leurs interprtations de trois types de composs spcifiques de la culture sur alcne terminal. Le nondcan-1,2-diol a t identifi grce son spectre de masse prsentant trois ions caractristiques m/z 429 (M-CH3), m/z 103 et m/z 341. Ces deux derniers correspondent aux deux ions obtenus par la rupture simple de la liaison entre les deux carbones porteurs des deux fonctions hydroxyles trimthylsilyles (Figure III.44).

Figure III.44. Spectre de masse du driv di-TMS du nonadcan-1,2-diol.

158

Un -hydroxy acide en C19 a t galement dtect. Pour sa caractrisation, nous avons utilis la trimthylsilylation qui permet l'identification de ce type de compos grce ses ions spcifiques (Figure III.45). La Figure III.46 montre le spectre de masse de l'-hydroxy acide n-19:0 prsentant deux pics intenses m/z 385 et m/z 341 correspondant respectivement M-CH3 et M-59 obtenus par ruptures simples.
H (CH3)3SiO ou (CH3)2SiO+=CH2 m/z 89
+

(CH3)3Si+ m/z 73

CHCO2CH3 O+Si(CH3)3 m/z 161

CH2=CH CH +OSi(CH3)3 m/z 129

R CH2 CH CO2CH3 OSi(CH3)3

RCH +OSi(CH3)3

M-59

RCH2CHCO2CH3
+ O=Si(CH3)2

CH2=O+Si(CH3)3 m/z 103

M-15

Figure III.45. Principaux ions fragments du spectre de masse des -hydroxy methyl ester trimthylsilyl (Eglinton et Hunneman, 1968).

Figure III.46. Spectre de masse du driv TMS de l'-hydroxy acide n-C19:0 (mthyl ester). 159

Par ailleurs, comme le montre la Figure III.47, l'analyse des spectres de masse des drivs DMDS des composs di-insaturs a permis de localiser les deux doubles liaisons.

Figure III.47. Spectre de masse du driv DMDS de l'ester mthylique de l'acide 17:21,8.

VII.2. LIPIDES "NON LIES"

L'analyse par CG et CG/MS/IE des lipides "non lis" de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur nonadc-1-ne indique la prsence prdominante d'acides gras de C14 C19 (Tableau III.15 et Figure III.48). Ils reprsentent plus de 90 % des lipides "non lis". Les acides gras mono-insaturs sont les plus abondants, ils reprsentent 54,5 % des lipides "non lis" suivis par les acides gras saturs et di-insaturs avec approximativement 20 % chacun (Figure III.49). L'analyse des drivs DMDS des lipides "non lis" a montr que la double liaison se trouve essentiellement en 1 dans les acides gras monoinsaturs nombre impair d'atomes de carbone alors qu'elle est surtout en 9 pour ceux nombre pair d'atomes de carbone.

160

Figure III.48. Courant ionique total des lipides "non lis" de M.hydrocarbonoclasticus (dans la zone C13-C19) cultive sur nonadc-1-ne.

161

Lipides "non lis"


Alcools 2,3 % AG saturs 19,7 %

-hydroxy acides 0,5 %

AG mono-insaturs 54,5 % AG di-insaturs 20,5 %

Lipides labiles en milieu basique


AG mono-insaturs 14,2 %

AG di-insaturs 0,7 %

-hydroxy acides 71,9 % (n-12:0; 70,4 %)

AG saturs 11,3

Alcools 0,5 %

Lipides labiles en milieu acide


AG saturs 4,5 %

AG mono-insaturs 0,1 %

Alcools 2,2 %

-hydroxy acides 92,8 % (n-12:0; 92,3 %)

Figure III.49. Distribution des diffrentes classes de composs dans les trois fractions de lipides de M.hydrocarbonoclasticus cultive sur nonadc-1-ne.

162

La prsence des insaturations en 1 et 9 montre l'origine biosynthtique de ces composs: dans le premier cas les acides gras proviennent de l'oxydation de l'alcne par des mcanismes de -oxydation alors que dans le deuxime cas ils sont les produits de la dsaturation d'acides gras rsultant de la synthse de novo. Par contre, l'origine de l'acide n17:12 (Tableau III.15) peut tre explique par l'oxydation par la bactrie du nonadc-2-ne prsent en tant qu'impuret dans le nonadc-1-ne fourni (Tableau III.1). De faibles quantits d'acides gras -insaturs 14, 16 et 18 atomes de carbone (jusqu' 0,1 % des lipides "non lis") ont t galement observes. La prsence de ces trois derniers composs suggre comme nous le verrons plus loin, la possibilit d'un mcanisme d'-oxydation au niveau de la terminaison sature du nonadc-1-ne. Les acides gras di-insaturs sont nombre impair d'atomes de carbone de C15 C19 avec prdominance des acides gras 17:2 (67,8 % des acides gras di-insaturs), possdant une insaturation en 1, la deuxime variant entre les position 8 et 10; l'acide di-insatur prdominant est le n-17:2 1,8 (6,3 % des lipides "non lis"; Tableau III.15). Les acides gras saturs sont pour la plus grande part normaux nombre pair d'atomes de carbone, avec un maximum C16:0 (11,3 % ; Tableau III.15), seules une faible quantit d'acide i-C17:0 et des traces de i-C18:0 ont t dtectes dans cette fraction. Deux sries d'alcools, (a) saturs et uniquement primaires de n-C15 n-C18, et (b) mono-insaturs en 1, de n-C15 n-C19, tous primaires l'exception d'un alcool secondaire subterminal C19, ont t identifis. De plus un alcool primaire en C19, di-insatur dont les positions des insaturations n'ont pas pu tre tablies, et un alcool primaire 19:12, ont t identifis. Si l'origine des alcools C19 peut tre relie l'oxydation des nonadc-1-ne et 2ne, celles des autres alcools est plus problmatique.

L'extraction de l'ion chromatogramme m/z 175 des lipides "non lis" trimthylsilyls a permis la caractrisation de deux -hydroxy acides normaux constituant chacun 0,2 % (Tableau III.15): un -hydroxy acide -insatur 19 atomes de carbone (n-19:11, -OH) et un -hydroxy acide satur 18 atomes de carbone (n-18:0, -OH). Ces deux -hydroxy acides pourraient tre les produits de la -oxydation des acides gras n-19:11 et n-18:0, eux mmes drivant respectivement de l'oxydation du mthyle terminal et de l'insaturation du nonadc-1-ne.

163

VII.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE

Comme dans les cultures sur alcanes, les lipides lis par liaisons esters de la culture sur nonadc-1-ne sont domins par les n--hydroxy acides essentiellement de C10 C14 (Figure III.50) qui reprsentent 71,9 % (Figure III.49). Le -hydroxy acide n-12:0 est le compos le plus abondant avec 50,6 % des lipides (plus de 70 % des -hydroxy acides totaux ; Tableau III.15 et Figure III.49). Cette fraction contient aussi des quantits importantes de hydroxy acides insaturs en 1 nombre impair d'atomes de carbone (10,4 %) et en 2 (5,0 %). Ces derniers composs pourraient provenir de -oxydations successives des acides gras insaturs en 2; quant aux -hydroxy acides insaturs en 1, ils sont des mtabolites de la dgradation du nonadc-1-ne. Les acides gras saturs et mono-insaturs constituent respectivement 11,3 % et 14,2 % des lipides lis par liaisons esters (Figure III.49) alors que les acides gras di-insaturs sont des composs marginaux. Les principaux acides gras identifis correspondent aux acides n-12:0, n-16:0, n-14:19, n-17:11 et n-18:19 (Tableau III.15). Le 1,2-diol 19 atomes de carbone est galement prsent dans cette fraction mais en quantit plus faible que celle trouve dans les lipides "non lis".

VII.4. LIPIDES LABILES EN MILIEU ACIDE

Les lipides labiles en milieu acide sont fortement domins par les -hydroxy acides qui reprsentent 92,8 % de cette fraction avec une forte contribution du -hydroxy acide n12:0 (92,3 % des -hydroxy acides totaux ; Figure III.49). La Figure III.51 montre le courant ionique total des lipides lis par liaisons amides de cette culture. Quelques n--hydroxy acides saturs et monoinsaturs courtes chanes sont aussi prsents (10:0, 11:0, 13:0 et 13:1 ; Tableau III.9). Les acides gras saturs, prsents en faibles quantits (4,6 %), sont essentiellement nombre pair d'atomes de carbone alors que les acides gras insaturs sont pratiquement absents: seul le n-19:19 a t dtect (0,1 %; Tableau III.9).

164

Figure III.50. Courant ionique total des lipides labiles en milieu basique de
M.hydrocarbonoclasticus cultive sur nonadc-1-ne.

165

Figure III.51. Courant ionique total des lipides labiles en milieu acide de
M.hydrocarbonoclasticus cultive sur nonadec-1-ne.

166

Tableau III.15. Composition lipidique de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur n-nonadc-1ene. Lipides "Non lis" Labiles en milieu Labiles en milieu basique acide Acides gras saturs n-10:0 0,3 n-12:0 0,1 4,8 n-13:0 0,1 0,1 n-14:0 1,1 0,6 1,9 n-15:0 2,0 n-16:0 11,3 4,5 0,8 i-17:0 0,4 n-17:0 3,3 0,4 0,9 n-18:0 1,0 0,5 0,7 n-19:0 0,4 n-20:0 0,1 0,2 Acides gras mono-insaturs 0,1 n-11:1 1 tr n-12:1 1 0,3 n-13:1 8 0,9 n-13:1 2 0,2 0,8 n-13:1 1 0,2 3,3 n-14:1 9 tr n-14:1 1 0,6 n-15:1 9 1,7 n-15:1 6 tr n-15:1 2 7,8 tr n-15:1 1 3,5 0,4 n-16:1 9 3,0 0,7 n-16:1 7 0,2 n-16:1 5 tr n-16:1 1 1,9 0,3 n-17:1 8 1,4 0,2 n-17:1 2 18,7 3,4 n-17:1 1 0,6 i-18:1 9 13,8 3,8 n-18:1 9 0,1 tr n-18:1 1 0,1 n-19:1 10 0,1 n-19:1 9 0,4 n-19:1 8 tr tr n-19:1 1 0,3 n-20:1 9 Acides gras di-insaturs 0,3 n-15:2 1,9 1,0 n-15:2 1,8 3,7 0,2 n-17:2 1,10 3,9 n-17:2 1,9 167

Lipides

"Non lis"

6,3 n-17:2 1,8 2,4 n-19:2 1,10 1,7 n-19:2 1,9 0,6 n-19:2 1,8 n-19:2 0,6 -Hydroxy acides saturs# n-10:0, OH n-11:0, OH n-12:0, OH n-13:0, OH n-14:0, OH n-18:0, OH 0,2 n-19:0, OH 0,1 -Hydroxy acids insaturs# n-11:1 2, OH n-12:1 8, OH n-12:1 1, OH n-13:1 8, OH n-13:1 2, OH n-13:1 1, OH n-13:1, OH n-13:2, OH n-17:1 1, OH 0,2 n-19:1 1, OH -Hydroxy acide n-19:0, OH tr Alcools saturs n-15:0, 1-OH 0,1 n-16:0, 1-OH 0,1 n-17:0, 1-OH 0,2 n-18:0, 1-OH 0,1 Alcools insaturs tr n-15:1 1, 1-OH 0,1 n-17:1 1, 1-OH 1,1 n-19:1 1, 1-OH tr n-19:1 1, 2-OH tr n-19:1 2, 1-OH n-19:2, 1-OH 0,4 Diols 19:0, 1, 2 dihydroxy 1,8
#

Labiles en milieu basique 0,3 0,2

Labiles en milieu acide -

0,2 2,1 50,6 1,1 0,2 0,8 0,6 0,6 0,5 4,2 10,1 0,6 0,3 0,3 0,1 0,1 1,1

0,8 2,6 85,7 3,1 0,2 0,4 2,0 0,2 0,3

Les abondances relatives des -mthoxy acides prsents ont t additionnes respectivement celles des hydroxy acides comportant le mme nombre d'atomes de carbone, partir desquels ils sont drivs. * L'ensemble des produits mineurs non identifis dans ces fractions lipidiques ainsi que des produits identifis (mais non rpertoris dans ce tableau car prsents l'tat de trace et pas vraiment significatifs en terme de mtabolisme des hydrocarbures par la bactries et d'influencer sur ces lipides) reprsentent entre 0,0 % et 0,8 % des lipides totaux.

168

VII.5. CONCLUSIONS PARTIELLES SUR LA DEGRADATION DU NONADEC-1-ENE

VII.5.1. Influence sur la composition lipidique

La composition lipidique de M. hydrocarbonoclasticus subit une forte modification lors de sa croissance sur nonadc-1-ne. Par comparaison avec la culture sur actate, les modifications majeures se trouvent essentiellement au niveau des lipides "non lis": apparition de composs mono-insaturs en 1 et de composs di-insaturs (Tableaux III.3 et III.15), essentiellement nombre impair d'atomes de carbone. La prsence d'une srie mineure, insature en position 2 est lie l'existence d'une impuret dans l'hydrocarbure commercial, le nonadc-2-ne. Les lipides labiles en milieu basique se trouvent lgrement influencs par la croissance sur l'alcne: une augmentation des acides gras courtes chanes (n-12:0) et une notable contribution des acides mono-insaturs 1 et di-insaturs. Par contre les lipides lis par liaisons amides ne sont pas sensibles au changement de la source de carbone.

VII.5.2. Voies mtaboliques du n-nonadc-1-ne

Les alcools et le diol identifis dans les lipides "non lis" mettent clairement en vidence les voies mtaboliques de la dgradation de l'alcne par M. hydrocarbonoclasticus (Figure III.52): oxydation du groupement mthyle terminal pour donner l'alcool primaire insatur qui son tour sera oxyd en acide n-19:1, les -oxydations ultrieures conduisent aux composs de la srie insature en 1;
ii)

i)

oxydation subterminale de la terminaison sature de l'alcne conduisant la formation d'un alcool secondaire -insatur qui conduira l'acide n-17:11,
via des oxydations successives, dont une oxydation de type Bayer-Villiger;

iii)

oxydation de la double liaison pour donner vraisemblablement un poxyde (non isol), hydrolys dans une deuxime tape en diol-1,2, oxyd ensuite en
-hydroxy acide et enfin en acide starique (n-18:0) par perte d'une molcule

CO2 suivie d'une oxydation.

169

En considrant les abondances relatives des composs provenant de chaque voie mtabolique, on peut conclure que l'oxydation du groupement mthyle terminal du nonadec1-ne est la voie majeure, en deuxime place vient l'attaque de la double liaison, l'oxydation subterminale tant par contre de moindre importance. Des tudes antrieures sur la dgradation des alcnes par les bactries avaient tabli l'existence de deux mcanismes de dgradation: soit attaque du groupement mthyle terminal soit de la double liaison (Stewart et al., 1960; Van der Linden, 1963; Huybregtse et Van der Linden, 1964; Schwartz et McCoy, 1973; Vaz et al., 1998). Dans cette tude, nous montrons qu'une troisime voie d'attaque des olfines terminales est galement possible, l'importance de chaque voie mtabolique tant dpendante de la souche bactrienne. La distribution des acides issus de l'oxydation des alcools montre qu'ils sont dgrads prfrentiellement selon un mcanisme de -oxydation, et que l'-oxydation est une voie mineure. En effet, les acides gras insaturs en 1 et nombre impair d'atomes de carbone dominent nettement ceux nombre pair d'atomes de carbone.

170

n-C19:1

Oxydation de l'insaturation

Oxydation subterminale

Oxydation mthyl-terminale

OH

HO Bayer-Villiger

HO2C O O

*
Alcool n-19:11, 2-OH

*
OH
Alcool n-19:11, 1-OH

OH

*
O 1,2-diol n-19:0

Acide n-19:11

CO2H -oxydation

OH

CO2H OH

Figure III.52. Voies mtaboliques proposes pour le nonadc-1-ne chez M.


*
Acide n-18:0
Alcool n-17:11, 1-OH

hydrocarbonoclasticus.
*
OH *: composs dtects dans les lipides cellulaires : voie mtabolique mineure : voie mtabolique majeure

HO2C

CO2H
Acide n-17:11

Oxydations ultrieures Oxydations ultrieures

171

VIII. CULTURES DE M. HYDROCARBONOCLASTICUS SUR CYCLOHEXYL- ET PHENYL-ALCANES

VIII.1. IDENTIFICATION DES LIPIDES

Comme on pouvait s'y attendre, la souche de Marinobacter cultive sur cyclohexyltridcane, phnyldodcane et phnyltridcane produit ct des lipides acycliques, des lipides dont les structures ont un lien direct avec celle de l'hydrocarbure fourni: elles comportent soit un noyau cyclohexanique soit un noyau benznique. Les Figures III.53 et III.54 prsentent les spectres de masse et leurs interprtations de deux alcools primaires. La Figure III.55 montre le spectre de masse d'un alcool secondaire en position subterminale. Les spectres de masse des alcools primaires prsentent les mmes ions caractristiques [(M-CH3)+ et (CH3)2Si=+OH) m/z 75] que les alcools normaux primaires, avec la prsence des ions m/z 91 et m/z 83 respectivement dans les alcools provenant des phnylalcanes et du cyclohexyltridcane (Figure III.53 et III.54).

[M HOSiMe3]+

Figure III.53. Spectre de masse (IE) du driv TMS du phnyldodcan-1-ol.

172

[M Me]+

[M HOSiMe3]+

Figure III.54. Spectre de masse (IE) du driv TMS du cyclohexyltridcan-1-ol.

La Figure III.55 montre le spectre de masse de l'alcool secondaire phnyldodcan-2-ol. L'ion le plus abondant correspond m/z 117 [CH3CHOSi(CH3)3]+. Trois autres ions caractristiques m/z 91, m/z 75 et m/z 73 correspondent respectivement aux ions tropylium, [(CH3)2Si=OH]+ et [(CH3)3Si]+. L'ion fragment [M-CH3]+ m/z 339 est aussi observ. Les acides gras phnylalcanoques sont identifiables grce leurs spectres de masse possdant un ion trs intense m/z 91, qui correspond l'ion tropylium trs stable. La Figure III.56 montre le spectre de masse (IE) de l'acide phnyldodcanoique. L'ion molculaire [M+ ] est dtect en faible abondance m/z 290. Les pics observs m/z 74, m/z 87 et m/z 199, sont obtenus par les mmes mcanismes de rarrangement que les acides gras normaux et sont communs tous les acides phnylalcanoques. Un autre ion abondant du spectre m/z 258 correspond [M CH3OH]+.
.

173

[M HOSiMe3]

Figure III.55. Spectre de masse (IE) du driv TMS du phnyldodcan-2-ol.

Figure III.56. Spectre de masse (IE) de l'ester mthylique de l'acide phnyldodcanoque.

174

La spectromtrie de masse (IE) des acides gras cyclohexylalcanoques conduit la formation d'ions identiques ceux issus des acides gras normaux saturs, savoir les ions
m/z 74, m/z 87, m/z 143, m/z 199, [(M-31)+] et [(M-43)+]. Un ion caractristique de ces

composs est l'ion m/z 83 obtenu par une rupture simple entre le premier carbone de la chane alkyle et le cyclohexyle. La Figure III.57 montre le spectre de masse de l'acide cyclohexylalcanoque le plus abondant dans les lipides "non lis" de la culture sur cyclohxyltridcane: l'acide cyclohexylundcanoque.

Figure III.57. Spectre de masse (IE) de l'ester mthylique de l'acide cyclohexylundcanoque. Les spectres de masse des -hydroxy acides cyclohexyl-et phnyl-alcanoques montrent des ions fragments m/z 175 et [M-Me]+. Pour les -hydroxy acides phnylalcanoiques l'ion tropylium correspond au pic le plus intense grce sa grande stabilit (Figure III.58, spectre de masse du driv TMS du -hydroxy acide phnyldodcanoque, mthyl ester) alors que pour les -hydroxy acides cyclohexylalcanoques, l'ion caractristique m/z 83 est toujours prsent mais de faible intensit (Figure III.59, spectre de masse du driv TMS du -hydroxy acide cyclohexyltridcanoque, mthyl ester).

175

Figure III.58. Spectre de masse du driv TMS du -hydroxy acide phnyldodcanoque, mthyl ester.

(M-CH3)+

Figure III.59. Spectre de masse du driv TMS du -hydroxy acide cyclohexyltridcanoque, mthyl ester.

176

VIII.2. LIPIDES "NON LIES"

Les lipides "non lis" des trois cultures sont caractriss par la prdominance des acides gras normaux, essentiellement 16 et 18 atomes de carbone, reprsentant de 53 68 % des lipides "non lis" selon les cultures. Parmi ceux-ci les acides insaturs sont prpondrants reprsentant approximativement 40 % des lipides "non lis" dans chaque culture (Figure III.60). L'analyse par CG/SM des drivs DMDS a montr que la position de l'insaturation varie entre les positions 5 et 9, la contribution de l'acide olique tant importante dans tous les cas (de 29,6 % 34,2 % des lipides "non lis" ; 72 % 87,6 % des acides gras insaturs). Le seul acide gras insatur nombre impair d'atomes de carbone dtect est le n-19:18, constituant 0,4 % des lipides "non lis" de la culture sur phnyltridcane (Tableau III.16). La distribution des acides gras saturs est caractrise par la prdominance des composs nombre pair d'atomes de carbone avec un maximum n-16:0 (acide palmitique) et une trs faible contribution des produits ramifis iso et antiso dans les lipides "non lis" des cultures sur cyclohexyl- (3,1 %) et phenyl-tridcane (1,6 %). Aprs les acides classiques, les acides comportant un groupe cyclohexyle ou phnyle selon l'hydrocarbure fourni aux bactries, constituent une part importante des lipides "non lis" (Figure III.60). La longueur des chanes alkyles de ces acides varie de C9 C13 dans les cultures sur cyclohexyltridcane et phnyltridcane, et de C8 C14 pour la culture sur phenyldodcane (Tableaux III.16 et III.17). Les acides gras "cycliques" dominants possdent respectivement des longueurs de chanes alkyles C11, C13 et C12 (Tableau III.16 et III.17). Les chanes alkyles des acides "cycliques" sont essentiellement de mme parit que les hydrocarbures. La dtection de l'acide phnylttradcanoque dans les lipides "non lis" de la culture sur phnyldodcane suggre l'intervention d'un mcanisme d'longation de la chane alkyle par incorporation d'une unit C2. Cette suggestion est base sur le fait que le phnyldodcane ne contient aucune trace de phnylttradcane.

177

Culture sur cyclohexyltridcane


Alcools 1,1 %
-hydroxy acides 0,3 %

AG cyclohexylalcanoques 44,6 %

AG insaturs 40,5 %

AG saturs 12,9 %

Culture sur phnyldodcane


Alcools 8,1 %
-hydroxy acides 0,5 %

AG phnylalcanoques 25,3 %

AG insaturs 41,0 %

AG saturs 24,1 %

Culture sur phnyltridcane


Alcools 7,6 %
-hydroxy acides 0,7 %

AG phnylalcanoques 23,2 %

AG insaturs 39,0 %

AG saturs 28,9 %

Figure III.60. Abondances relatives (%) des diffrentes classes de lipides "non lis" de M.
hydrocarbonoclasticus cultive sur cyclohexyltridcane et phnylalcanes.

178

Les alcools prsents dans les lipides "non lis", reprsentant de 1,1 % des lipides "non lis" (culture sur cyclohexyltridcane) 8,1 % (culture sur phnydodcane) sont caractriss par une forte prdominance (> 70 %) de l'alcool primaire provenant de l'oxydation du groupement mthyle terminal de la chane alkyle de l'hydrocarbure (Tableau III.16 et III.17). Les alcools secondaires, produits de l'oxydation subterminale des hydrocarbures sont prsents dans les cultures sur phnylalcanes, mais en faibles quantits par rapport leur homologues primaires. Dans la culture sur tridecylcyclohxane, l'alcool secondaire n'a pas t dtect. Les -hydroxy acides prsents dans les lipides "non lis" sont essentiellement des mtabolites de la dgradation des hydrocarbures suivant un mcanisme de -oxydation. Ces composs se trouvent en faibles quantits dans la culture sur cyclohexyltridcane (0,2 % ; Taleau III.17) alors qu'ils sont un peu plus abondants dans le cas des cultures sur phnylalcanes (0,5 % et 0,7 % respectivement dans les cultures sur phnyldodcane et phnyltridcane ; Tableau III.16). Le seul -hydroxy acide linaire identifi dans les lipides "non lis" est le n-12:0 dcel dans la culture sur cyclohexyltridcane.

VIII.3. LIPIDES LABILES EN MILIEU BASIQUE

La distribution des lipides labiles en milieu basique de M. hydrocarbonoclasticus est caractrise par la prpondrance des -hydroxy acides: 64,9 % des lipides de cette fraction dans le cas de la culture sur cyclohexyltridcane et de l'ordre de 48 % dans les cultures sur phnylalcanes (Figure III.61). Dans tous ces extraits, les n--hydroxy acides sont les composs dominants et parmi eux le -n-12:0 (reprsentent plus de 95 % des -hydroxy acides; Figure III.61 et Tableaux III.16 et III.17). Deux -hydroxy acides provenant de la dgradation des hydrocarbures et portant une chane alkyle C7 et C6 ont t observs (0,1 % dans le cas du cyclohexyltridcane; Tableau III.17). Les acides gras saturs sont essentiellement normaux nombre pair d'atomes de carbone, ils constituent

approximativement 30 % dans les cultures sur phnylalcanes et uniquement 17,7 % pour la culture sur cyclohexyltridcane. Le compos majoritaire est l'acide laurique (12-16 % des lipides labiles en milieu basique, Tableaux III.16 et III.17) suivi par l'acide palmitique, dans les trois cultures. Les acides gras insaturs de C14:1 C18:1 ont t galement observs dans les trois cultures, ils reprsentent de 12 15 % des lipides de cette fraction (Figure III.61), l'acide
n-14:19 tant le plus abondant dans tous les cas.

179

Culture sur cyclohexyltridcane

AG insaturs 11,9 %
-hydroxy acides 64,9 % (n-12:0; 95,5 %)

AG saturs 17,7 %

Alcools 0,3 %

AG cyclohexylalcanoques 5,1 %

Culture sur phnyldodcane

AG insaturs 15,2 %

-hydroxy acides 48,4 % (n-12:0; 99,4 %)

AG saturs 29,5 %

Alcools 0,5 %

AG phnylylalcanoque 4,6 %

Culture sur phnyltridcane


AG insaturs 14,5 %
-hydroxy acides 47,8,0 % (n-12:0; 97,3 %)

AG saturs 27,2 %

Alcools 1,0 %

AG phnylylalcanoques 5,9 %

Figure III.61. Abondances relatives (%) des diffrentes classes de lipides labiles en milieu basique de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur cyclohexyltridcane et phnylalcanes.

180

Les acides cyclohexyl- et phnyl-alcanoques sont moins abondants que dans les fractions lipides "non lis". Leurs distributions respectives sont cependant assez proches de celles trouves dans les lipides "non lis".

VIII.4. LIPIDES LABILES EN MILIEU ACIDE

Les lipides labiles en milieu acide des trois cultures sur phnylalcanes et cyclohexyltridcane possdent des distributions assez semblables celles trouves dans le cas des cultures sur les hydrocarbures linaires. Ces lipides sont caractriss par la prdominance des -hydroxy acides de n-C10 n-C14: ils constituent de 54 % (culture sur phnyltridcane) 91,1 % de cette fraction (culture sur cyclohexyltridcane), avec le n-12:0 fortement dominant (Figure III.62 et Tableaux III.16 et III.17). Des homologues suprieurs (C13 et C14) et infrieurs (C10 et C11) ont t identifis, ils sont tous en faible abondance. En plus des hydroxy acides normaux, le -hydroxy acide cyclohexylheptanoque a t galement identifi dans les lipides labiles en milieu basique dans la culture sur cyclohexyltridcane. Par contre aucun -hydroxy acide provenant de la dgradation des phnylalcanes n'a t dtect. Les acides gras identifis dans cette troisime fraction sont relativement plus abondants dans la culture sur phnyltridcane compars aux cultures sur phnyldodcane et

cyclohexyltridcane. Ils reprsentent respectivement 32,1 %, 8,8 % et 4,5 %. Ces composs correspondent surtout aux acides gras normaux, saturs et insaturs. Ils sont caractriss par un maximum n-16:0 et n-18:1 et par la prsence d'une forte dominance paire (Figure III.62 et Tableaux III.16 et III.17). Enfin, les alcools ont t dtects en faibles quantits: de 0,4 % de la fraction pour la culture sur phnyldodcane 5,2 % pour la culture sur phnyltridcane. Pour cette dernire culture, le phnyltridcanol reprsente 1,3 % de la fraction (Tableau III.16); par contre aucun alcool "cyclique" n'a t dtect dans les deux autres cultures.

181

Culture sur cyclohexyltridcane


AG saturs 3,7 %

AG insaturs 0,4 %

Alcools 0,7 %

-hydroxy acides 91,1 % (n-12:0; 96,6 %)

Culture sur phnyldodcane


AG insaturs 1,5 % AG saturs 6,4 % Alcools 0,4 %

-hydroxy acides 87,3 % (n-12:0; 97,0 %)

Culture sur phnyltridcane


AG insaturs 8,9 %
-hydroxy acides 54,0 % (n-12:0; 98,9 %)

AG saturs 16,7 %

AG phnylylalcanoique 2,9 % Alcools 5,2 %

Figure III.62. Abondances relatives (%) des diffrentes classes de lipides labiles en milieu acide de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur cyclohexyltridcane et phnylalcanes.

182

Tableau III.16. Composition lipidique de M.hydrocarbonoclasticus cultive sur phnyldodcane et sur phnyltridcane. Phnyldodcane Phnyltridcane Lipides "Non lis" Labiles en milieu Labiles en milieu "Non lis" Labiles en milieu basique acide basique Acides gras saturs n-8:0 0,6 0,2 n-9:0 0,2 n-10:0 3,4 0,8 n-11:0 0,1 0,1 n-12:0 15,9 0,7 0,1 12,6 n-13:0 0,3 0,3 0,3 n-14:0 0,1 0,4 0,6 1,0 5,1 n-15:0 0,4 tr 0,2 0,1 0,4 i-15:0 0,2 0,3 ai-15:0 1,1 n-16:0 16,4 6,8 2,6 16,6 4,3 i-16:0 0,5 n-17:0 1,1 0,3 0,2 0,3 i-17:0 1,3 n-18:0 5,6 1,8 1,2 6,1 2,3 n-19:0 0,5 0,3 0,3 n-20:0 0,2 1,5 0,4 Acides gras insaturs n-12:1 0,2 7,3 6,4 n-14:1 9 0,2 0,4 n-14:1 7 tr n-14:1 5 2,8 1,0 0,1 2,6 1,0 n-16:1 9 0,6 0,2 1,0 1,6 0,4 n-16:1 7 n-17:1 tr 29,6 6,2 0,1 34,2 6,2 n-18:1 9

Labiles en milieu acide

0,4 0,5 0,8 0,8 0,2 6,5 1,1 4,9 0,5 1,0 -

1,0 1,5 6,0

183

Lipides 6,7 n-18:1 7 0,3 n-18:1 5 n-19:1 8 1,0 n-20:1 9 n-21:1 Acides gras phnylalcanoques Ph-6:0 Ph-8:0 0,2 Ph-9:0 Ph-10:0 6,5 Ph-11:0 Ph-12:0 17,1 Ph-13:0 tr Ph-14:0 1,5 Ph-13:1 # -hydroxy acides n-10:0, OH n-11:0, OH n-12:0, OH n-12:1, OH n-13:0, OH n-14:0, OH n-14:0, OH Acides -hydroxy phnylalcanoques Ph-8:0, OH 0,3 Ph-10:0, OH 0,1 Ph-11:0, OH Ph-12:0, OH 0,1 Ph-13:0, OH Alcools n-14:0, 1-OH 0,1

Phnyldodcane 0,1 -

Phnyltridcane

0,3 0,1 0,4 1,8 84,7 0,4 -

0,2 0,4 0,1 0,2 9,3 12,9 0,7 0,2 0,5 0,1

0,1 4,3 0,7 tr 0,9 0,5 0,2 46,5 0,2 0,4 tr 0,1

0,2 0,2 0,3 2,9 0,1 0,1 53,4 0,1 0,1 0,2 0,2 184

0,4 0,2 0,8 3,0 0,2 48,1 0,2 0,1 tr tr

Lipides

Phnyldodcane

Phnyltridcane

n-15:0, 1-OH n-16:0, 1-OH n-18:0, 1-OH n-19:0, 1-OH Ph-12:0, 2-OH Ph-13:0, 2-OH Ph-12:0, 1-OH Ph-13:0, 1-OH

0,1 0,2 1,0 6,7 -

0,2 0,1 0,2 -

0,2 0,2 -

0,4 0,5 tr 6,6

0,1 0,4 0,3 0,1 tr

1,7 2,0 1,3

Ph: acide phnylalcanoque # Les abondances relatives des -mthoxy acides prsents ont t additionnes respectivement celles des -hydroxy acides comportant le mme nombre d'atomes de carbone, partir desquels sont ils drivs. * L'ensemble des produits mineurs non identifis dans ces fractions lipidiques ainsi que des produits identifis (mais non rpertoris dans ce tableau car prsents l'tat de trace et pas vraiment significatifs en terme de mtabolisme des hydrocarbures par la bactries et d'influencer sur ces lipides) reprsentant entre 0,4 % et 5,7 % des lipides totaux.

185

Tableau III.17. Composition lipidique de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur cyclohexyltridcane.


Lipids "non lis Labiles en milieu basique Labiles en milieu acide

Acides gras saturs n-10:0 n-12:0 n-13:0 n-14:0 0,1 i-15:0 n-15:0 0,1 n-16:0 6,5 i-17:0 1,6 n-17:0 0,5 i-18:0 n-18:0 3,8 i-19:0 n-19:0 0,3 n-20:0 Acides gras insaturs n-14:1 9 2,2 n-16:1 9 2,9 n-16:1 7 0,1 n-16:1 5 33,0 n-18:1 9 2,2 n-18:1 7 0,1 n-18:1 5 Acides cyclohexylalcanoques 6:0 7:0 9:0 2,2 10:0 0,2 11:0 35,3 12:0 0,1 13:0 6,6 13:1 0,2 # -hydroxy acides n-10:0, OH n-11:0, OH n-12:0, OH 0,1 n-12:1, OH n-13:0, OH n-13:1, OH n-14:0, OH n-14:1, OH Cycl 11:0, OH 0,2 Cycl 13:0, OH tr Alcools

0,3 12,8 0,1 0,3 0,4 0,2 2,7 0,2 0,1 0,4 0,1 0,1 10,4 0,2 0,1 0,1 1,0 0,1 0,2 0,1 0,5 tr 3,1 tr 1,2 0,6 0,3 62,0 1,4 0,1 0,1 0,4 -

2,3 0,2 1,1 0,1 0,2 0,2 88,0 0,5 1,3 1,3 -

186

Lipids n-16:0 n-18:0 Cycl 13:0, 1-OH

"non lis"

0,2 0,1 0,8

Labiles en milieu basique 0,1 0,1 0,1

Labiles en milieu acide 0,5 0,2 -

Cycl: acide cyclohexylalcanoque # Les abondances relatives des -mthoxy acides prsents ont t additionnes respectivement celles des hydroxy acides comportant le mme nombre d'atomes de carbone, partir desquels ils sont drivs. * L'ensemble des produits mineurs non identifis dans ces fractions lipidiques ainsi que des produits identifis (mais non rpertoris dans ce tableau car prsents l'tat de trace et pas vraiment significatifs en terme de mtabolisme des hydrocarbures par la bactries et d'influencer sur ces lipides) reprsentent entre 0,5 % et 3,8 % des lipides totaux.

187

VIII.5.

CONCLUSION

PARTIELLE

SUR

LA

DEGRADATION

DES

HYDROCARBURES CYCLIQUES PAR M. hydrocarbonoclasticus

M. hydrocarbonoclasticus est capable de crotre sur trois des hydrocarbures cycliques

tests. Comme il a t mentionn au dbut de ce chapitre, le cyclohexyldodcane n'a pas assur la croissance de la bactrie. En effet, la dgradation des cyclohexylalcanes nombre pair d'atomes de carbone est plus difficile que celle de leurs homologues comportant des chanes alkyles impaires (Fieberge et al., 1980; Rontani et Bonin, 1992). Les organismes capables de crotre sur le cyclohexyldodcane comme source unique de carbone accumulent l'acide cyclohexylactique dans le milieu de culture (Beam et Perry, 1974a). Cet acide est trs rcalcitrant la biodgradation (Davis et Raymond, 1961 ; Beam et Perry, 1974a) cause de la position du groupement carboxylique par rapport au cycle, qui bloque la -oxydation. L'assimilation de ce compos ncessite l'intervention de mcanismes particuliers tels que l'oxydation et l'aromatisation (en passant par l'acide para-hydroxylphnylactique) (Rontani et Bonin, 1992). En gnral, la minralisation complte des cyclohexylalcanes portant des chanes alkyles nombre pair d'atomes de carbone ncessite l'intervention de plusieurs espces bactriennes (Beam et Perry, 1974b ; Feinberg et al., 1980). Nanmoins, l'absence de croissance de M. hydrocarbonoclasticus sur cyclohexyldoccane, ne peut s'expliquer seulement par des difficults dgrader l'acide cyclohexylactique. Les units actates issues des -oxydations situes an avant de cet acide auraient d assurer la croissance de la bactrie. En effet, il apparat que cette bactrie effectue une dgradation essentiellement partielle des phnylalcanes et du cyclohexyltridcane: juste assez pour assurer sa croissance. L'absence de croissance sur l'thylbenzne et sur le propylbenzne (Tableau III.1) confirme cette hypothse. Dans le cas du cyclohexyltridcane, le mtabolite le plus lger dtect est l'acide cyclohexylhexanoque, ce qui a t observ chez plusieurs bactries (Trudgill, 1984; Beam et Perry, 1974a; Dutta et Harayama, 2001).

VIII.5.1. Influence des cyclohexyl- et phnyl-alcanes sur la composition en acides gras de M. hydrocarbonoclasticus

Les lipides "non lis" de M. hydrocarbonoclasticus sont fortement influencs par la croissance des cellules sur hydrocarbures cycliques par rapport la culture sur l'actate d'ammonium. La principale diffrence rside essentiellement dans la prsence d'acides

188

phnyl- ou cyclohexyl-alcanoques. Les units C2 libres lors de la dgradation de ces hydrocarbures sont par la suite utilises pour la synthse de novo des acides gras, essentiellement normaux nombre pair d'atomes de carbone, saturs et insaturs. Les acides gras 16 et 18 atomes de carbone sont les composs les plus abondants. La position 9 des acides gras insaturs se trouve privilgie. Les acides gras normaux impairs ou ramifis sont des composs trs minoritaires. La distribution de ces acides gras (normaux et ramifis) est proche de celle trouve dans les lipides "non lis" de la culture sur actate d'ammonium (Figure III.63).

100%

80% Abondance relative

60%

40%

20%

0% Actate d'ammonium n-AG saturs pairs Cyclohexyltridcane n-AG insaturs pairs Phnyldodcane n-AG impairs phnyltridcane AG ramifis

Figure III.63. Comparaison des distributions des acides gras normaux pairs (saturs et insaturs), impairs et ramifis prsents dans les lipides "non lis" des cultures sur actate, cyclohexyltridcane et phnylalcanes Les acides gras et les -hydroxy acides des lipides labiles en milieu basique prsentent des distributions similaires celles observes dans le cas de la culture sur actate d'ammonium. Dans ces fractions, les mtabolites de dgradation sont moins abondants que dans les lipides "non lis" et ne constituent pas des composs prdominants. Les lipides labiles en milieu acide sont les moins influencs par la source de carbone, l'acide n--hydroxy 12:0 est toujours trs dominant.

189

VIII.5.2. Voies mtaboliques des cyclohexyl- et phnyl-alcanes

La

dgradation

des

phnylalcanes

et

du

cyclohexyltridcane

par

M.

hydrocarbonoclasticus s'effectue de la mme faon que celle des alcanes linaires.

L'oxydation initiale se produit au niveau de la terminaison alkyle, elle est essentiellement monoterminale et trs minoritairement subterminale. L'oxydation terminale conduit la formation de l'alcool primaire cyclohexyltridcan-1-ol ou phnylalcan-1-ol selon

l'hydrocarbure utilis comme source de carbone, puis l'aldhyde (non dtect dans aucune des trois cultures) et l'acide correspondant. La -oxydation de ces acides conduit la formation d'acides dont les chanes alkyles sont de mme parit que celles des hydrocarbures initiaux alors que l'-oxydation (trs minoritaire ici) produit des acides avec des chanes alkyles de parits diffrentes. Aucun -hydroxy acide intermdiaire n'a t dtect dans les extraits lipidiques. L'oxydation de la chane alkyle essentiellement par -oxydation peut se poursuivre pour donner des acides phnylalcanoques et cyclohexylalcanoques courtes chanes. Enfin, dans nos conditions de culture cette bactrie est incapable d'oxyder ces composs au niveau des cycles. Les Figures III.64 et III.65 reprsentent respectivement les voies mtaboliques de dgradation des phnylalcanes et du cyclohexyltridcane, ainsi que les acides obtenus dans chaque cas.

190

CH2-(CH2)n-CH2-CH2-CH3

Oxydation terminale

Oxydation subterminale

CH2-(CH2)n-CH2-CH2-CH2-OH

CH2-(CH2)n-CH2-CH-CH3 OH

CH2-(CH2)n-CH2-CH2-COOH

CH2-(CH2)n-CH2-O-C-CH3 O

CH2-(CH2)n-CH2-OH + CH3COOH

n=8

CH2-(CH2)n-COOH

n=9
Elongation

Acides phnylalcanoques
Acide phnylttradcanoque

n=8

-oxydation -oxydation -oxydation -oxydation

n=9

Chane alkyle paire


-oxydation

-oxydation

-oxydation -oxydation

-oxydation

Chane alkyle impaire

-oxydation

-oxydation

Voie mtabolique majeure Voie mtabolique mineure

Figure III.64. Voies mtaboliques de la dgradation des phnylalcanes en fonction de la parit des chanes alkyles.

191

CH2-(CH2)9-CH2-CH2-CH3

Oxydation terminale

Oxydation subterminale

CH2-(CH2)9-CH2-CH2-CH2-OH

CH2-(CH2)9-CH2-CH-CH3 OH

CH2-(CH2)9-CH2-O-C-CH3 O CH2-(CH2)9-CH2-CH2-COOH

CH2-(CH2)9-CH2-OH + CH3COOH

CH2-(CH2)9-COOH

Acides cyclohexylalcanoques
-oxydation

-oxydation

Chane alkyle paire


-oxydation

-oxydation

-oxydation

Chane alkyle impaire

-oxydation

-oxydation

: Voie mtabolique majeure : Voie mtabolique mineure

Figure III.65. Voies mtaboliques de la dgradation du cyclohexyltridcane.

192

IX. Les hydroxy acides indicateurs de l'activit bactrienne

Un grand nombre d'hydroxy acides (, , et -1) et de di-hydroxy acides ont t identifis dans les sdiments et dans les colonnes d'eau (Eglinton et al., 1968; Volkman et al., 1980; Kawamura et Ishiwatari, 1982; Cardoso et Eglinton, 1983; Mendoza et al., 1987b; Fukishima et al., 1992a,b; Wakeham, 1999; van Dongen, 2000; Wakeham et al., 2003; Keinnen et al., 2003; Garcette-Lepecq et al., 2003 soumis). Parmi ces composs, les - et les
-hydroxy acides ont t retrouvs dans un grand nombre de microorganismes, incluant les

bactries, les levures, les champignons (Ratledge et Wilkinson, 1988) et les microalgues (Matsumoto et Nagashima, 1984; Matsumoto et al., 1988; Volkman et al., 1998). Ces composs sont considrs comme des mtabolites intermdiaires de l'- et la -oxydation microbienne des acides carboxyliques; la -oxydation est plus courante que l-oxydation, bien que cette dernire soit rencontre chez les animaux, les plantes et les bactries (Volkman et al., 1998). A titre d'exemple, Eglinton et al. (1968) ont identifi des -et des -hydroxy acides (de C10 C24) dans des sdiments lagunaires gs de 5000 ans qu'ils ont attribu l'oxydation microbienne des acides gras. La nature et le mode de prsence de ces hydroxy acides dans les chantillons environmentaux (sous forme "libre": extractible par les solvants organiques, ou "lis": obtenus par saponification ou par hydrolyse acide), ainsi que leurs distributions, permet la discrimination entre les hydroxy acides provenant de l'oxydation des acides gras et ceux synthtiss par les microorganismes. Ils peuvent tre galement trs importants dans la dtermination des organismes sources. A titre d'exemple Cranwell (1981a), a montr par une tude strochimique que les -hydroxy acides "non lis" caractriss par une configuration S, prsents dans des sdiments rcents, sont des produits de l'oxydation par les microorganismes. Au contraire, les -hydroxy acides lis, prsentant une dominance des composs de configuration R de C14 C18 sont associs aux lipopolysaccharides des bactries Gram-ngatives. En effet, les tudes strochimiques de Lehninger (1975) sur les mcanismes conduisant la formation des -hydroxy acides ont montr que les composs de configuration S sont des intermdiaires dans les mtabolismes de dgradation alors que les composs de configuration R sont des intermdiaires dans la biosynthse des acides gras. Des tudes plus rcentes sur la composition lipidique de diffrentes bactries Gram-ngatives et sur des chantillons sdimentaires ont suggr que les -hydroxy acides lis par liaisons amides et obtenus par une hydrolyse acide des rsidus de l'extraction aux solvants sont exclusivement

193

d'origine bactrienne (Goossens et al., 1986, 1989b; Wakeham, 1999; Wakeham et al., 2003). Ces derniers composs sont essentiellement normaux, de longueur de chane variant entre C10 et C18, caractriss par une forte prdominance des composs pairs avec gnralement un maximum C14:0. Cette distribution est caractristique des lipopolysaccharides des bactries Gram-ngatives (Wilkinson, 1988; Skerratt et al., 1992; Lattuati et al., 2002; Wakeham et al., 2003). Ces -hydroxy acides lis par liaisons amides sont moins sensibles aux transformations microbiennes et peuvent donc donner des informations sur les organismes sources (Cranwell, 1981a; Kawamura et Ishiwatari, 1984; Goossens et al., 1986; Klock et al., 1988). La procdure analytique utilise dans la prsente tude pour extraire les lipides des biomasses bactriennes de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur diffrents hydrocarbures nous a permis de diffrencier entre: les -hydroxy acides provenant de l'oxydation des hydrocarbures, prsents dans les lipides "non lis";
(ii) (iii)

(i)

les -hydroxy acides engags dans les liaisons esters dans les LPS. les -hydroxy acides engags dans les liaisons amides, prsents dans les LPS.

Les -hydroxy acides prsents dans les lipides "non lis" possdent le mme squelette que l'hydrocarbure utilis comme source de carbone et ne constituent qu'une faible partie de cette fraction. Ces hydroxy acides comportent des chanes alkyles de mme parit que l'hydrocarbure: le -hydroxy acide provenant de l'oxydation du groupement mthyle terminal est gnralement accompagn de ses homologues immdiatement infrieurs comportant 2 et 4 atomes de carbone de moins. Les -hydroxy acides lis par liaisons esters aux lipopolysaccharides constituent une grande part des lipides labiles en milieu basique (de 24,8 71,9 %). La distribution de ces composs est caractrise par une forte prdominance du n-12:0 (> 16 % des lipides de cette fraction et > 59 % des -hydroxy acides prsents) qui est

accompagn de ses homologues suprieurs (n--13:0 et n--14:0) et infrieurs (n--10:0 et n-11:0). Les -hydroxy acides obtenus par hydrolyse acide constituent la plus grande partie

des lipides labiles en milieu acide et sont caractriss par une forte prdominance de n--12:0 (> 38,8 % des lipides de cette fraction et > 59 % des -hydroxy acides prsents). Les homologues suprieurs (n--13:0 et n--14:0) et infrieurs (n--10:0 et n--11:0) de ce 194

dernier compos sont galement prsents mais en faibles quantits. Ces hydroxy acides obtenus probablement par synthse cellulaire se trouvent engags dans des liaisons amides aux units polysaccharidiques membranaires. L'incorporation des -hydroxy acides provenant de l'oxydation des hydrocarbures aux LPS de M. hydrocarbonoclasticus dpend de la structure chimique de ces sources de carbone. En effet, on remarque la prsence dans les lipides labiles en milieu basique et labiles en milieu acide des -hydroxy acides normaux, iso et anteiso essentiellement de C11 C14 respectivement dans les cultures sur alcanes normaux,
iso et anteiso, mais leur pourcentage varie en fonction de l'alcane. Aucun -hydroxy acide

comportant un groupement phnyle, cyclohexyle ou une ramification en milieu de chane n'a t identifi dans la fraction labile en milieu acide respectivement dans les cultures sur phnylalcanes, cylohexyltridcane et 10-Me-C19. De faibles quantits de -hydroxy acides provenant de l'oxydation de l'hydrocarbure ont t uniquement identifis dans les lipides labiles en milieu basique des cultures sur phnylalcanes. Il apparat donc que, la dtection de -hydroxy acides "longs" dans les lipides "non lis" des sdiments et des colonnes d'eau puisse tre utilise comme indicateur de l'activit bactriologique et donc signaler la possibilit d'une pollution par les hydrocarbures. Par contre la prsence de -hydroxy acides "lis" courts de C10 C14, est une indication de la prsence de bactries Gram-ngatives, avec dans le cas de M. hydrocarbonoclasticus, une forte prdominance du n--12:0.

195

X. CONCLUSION

Cette tude montre que M. hydrocarbonoclasticus est capable de mtaboliser une grande varit d'hydrocarbures incluant des alcanes normaux, ramifis, des phnyl- et cyclohexyl-alcanes ou encore des alcnes. L'analyse CG/SM des lipides bactriens produits a mis en vidence un grand nombre de composs pouvant tre classs en trois types principaux: alcools, acides et -hydroxy acides. L'identification de nombreux intermdiaires dans le processus mtabolique de chaque hydrocarbure a permis de proposer non seulement une voie principale de dgradation via l'oxydation en alcool primaire par hydroxylation du groupement mthyle terminal le moins encombr, puis en acide pris ensuite dans un cycle de -oxydation, mais aussi des voies secondaires en fonction de la structure de l'hydrocarbure. Il s'agit en particulier (i) de l'oxydation subterminale en alcool secondaire suivie d'une raction de type Bayer-Villiger, et oxydation ultrieure de l'alcool qui en rsulte l'acide, (ii) de l'-oxydation notamment dans le cas des composs possdant un groupement mthyle en , ou encore (iii) de l'poxidation des olfines terminales. Aucune attaque directe des groupements phnyle ou cyclohexyle n'a en revanche t dtecte, et les cyclohexylalcanes chane hydrocarbone comportant un nombre pair d'atomes de carbone, comme le cyclohexyldodcane, ou les hydrocarbures polyramifis comme le pristane se sont rvls rcalcitrants la dgradation par M.
hydrocarbonoclasticus.

Cette tude a galement montr que M. hydrocarbonoclasticus peut modifier de faon trs importante sa composition en lipides membranaires. En effet, alors que sur un substrat simple comme l'actate d'ammonium ou sur un milieu nutritif complexe, les acides C16:0, C16:1 et C18:1 sont dominants, sur hydrocarbures, la distribution est trs fortement remanie, avec des proportions significatives ou mme trs importantes d'acides gras, iso, anteiso, ramifis en milieu de chanes, insaturs en position terminale ou comportant des groupes phnyle ou cyclohexyle en , selon l'hydrocarbure fourni. Ainsi, dans ce cas sur hydrocarbures iso et
anteiso, le profil en acides gras est assez similaire celui d'un grand nombre de bactries

Gram-positives. Par consquence, les -hydroxy acides contenus dans les lipopolysaccharides de la membrane extrieure sont beaucoup moins sensibles au changement de la structure des hydrocarbures. En effet, le -hydroxy acide n-12:0, spcifique des LPS de M.
hydrocarbonoclsticus est toujours dominant, et quasiment exclusif dans certains cas. Il

196

apparat de plus que seuls des -hydroxy acides dont la chane hydrocarbone comporte un carbone en plus ou en moins, ou dans une moindre mesure une ramification de type iso ou
anteiso, ou encore une double liaison terminale puisses tre incorpors dans les LPS. Par

ailleurs, ces -hydroxy acides prsents dans les LPS comportant un nombre d'atome de carbone compris entre 10 et 14, donc beaucoup plus faible que celui des -hydroxy acides directement issus de la dgradation des hydrocarbures. Cette diffrence pourrat permettre de distinguer dans les sdiments ou dans les colonnes d'eau les -hydroxy acides propres aux bactries Gram-ngatives. Afin de savoir si ces conclusions sont gnralisables, l'tude de quelques autres bactries hydrocarbonoclastes parat ncessaire.

197

CHAPITRE IV

Influence de la source de carbone sur la composition lipidique de bactries Gram-ngatives, Marinobacter aquaeolei, Acinetobacter calcoaceticus et Pseudomonas oleovorans. Distribution des hydroxy acides de la membrane extrieure.

198

I. INTRODUCTION

Aprs avoir tudi l'influence de la structure des hydrocarbures sur la composition lipidique de Marinobacter hydrocarbonoclasticus, nous avons voulu savoir si nos rsultats taient ou non gnralisables sur d'autres bactries. Pour cela trois espces Gram-ngatives ont t selectionnes. Il s'agit de Marinobacter aquaeolei et Acinetobacter calcoaceticus, deux bactries dgradant les n-alcanes de C10 C24 et Pseudomonas oleovorans, une bactrie pouvant utiliser des n-alcanes et des n-alcnes de C6 C12. Chacune de ces trois bactries a t cultive sur l'actate d'ammonium, un alcane normal et un alcane ramifi comme source unique de carbone et d'nergie. Le n-nonadcane et le 2-mthyloctadcane ont t choisis pour cultiver M. aquaeolei et A. calcoaceticus alors que pour P. oleovorans, nous avons utilis le n-octane et le 2-mthylheptane. Les cultures sur hydrocarbures ont t ralises en suivant le mme protocole exprimental que dans le cas de M. hydrocarbonoclasticus. Dans ce quatrime chapitre, aprs une description des caractristiques physiologiques et biochimiques des trois bactries tudies, nous exposons et discutons les donnes analytiques recueillies. Les donnes concernant M. aquaeolei seront compares celle obtenues pour M. hydrocarbonoclasticus dans la perspective de dgager des tendances dans le genre Marinobacter. Enfin, nous essaierons de dterminer quelle est l'influence des hydrocarbures comportant des chanes aliphatiques sur la distribution des -hydroxy acides de ces quatre bactries Gram-ngatives.

II. PRESENTATION DES BACTERIES ETUDIEES

II.1.

CARACTERISTIQUES

PHYSIOLOGIQUES

ET

BIOCHIMIQUES

DE

Marinobacter aquaeolei

La bactrie Marinobacter aquaeolei a t isole lors d'une tude microbiologique dans un champ ptrolier en mer, situ proximit de la ville ctire Ving Tau au sud du Vietnam (Huu et al., 1999). Il s'agit d'une bactrie Gram-ngative, en forme de btonnet, anarobie facultative, capable d'utiliser le n-hexadcane, le pristane et divers constituants du ptrole brut comme source unique de carbone et d'nergie: elle peut oxyder 41 % des hydrocarbures saturs, 52 % des hydrocarbures aromatiques et 20 % des asphaltnes en 7 jours 30 C.

199

M. aquaeolei peut crotre dans des milieux de culture dont la concentration en NaCl

peut atteindre 3,4 M, avec un optimum de croissance 0,85 M. Elle peut tolrer des variations de temprature de 13 50 C et de pH de 5 10; les valeurs optimales de croissance sont respectivement 30 C et pH 7,3. La croissance peut avoir lieu en anarobiose en prsence de nitrate sur succinate, citrate ou actate, alors que le glucose n'assure pas la croissance dans de telles conditions. Cette bactrie peut utiliser par exemple les composs suivants comme source unique de carbone et d'nergie: le DL-lactate, l'actate, le citrate, le glutamate, le butyrate et certains acides amins. La capacit de cette bactrie utiliser une large gamme de sucres, d'acides organiques et d'acides amins comme source unique de carbone, ainsi que d'autres composs pouvant se trouver dans le milieu marin et la possibilit de crotre dans des milieux de salinits variables expliquent le caractre ubiquiste de cette bactrie dans le milieu marin. Le nom de
Marinobacter aquaeolei a t adopt en raison des similarits physiologiques et

phnotypiques avec Marinobacter hydrocarbonoclasticus (Gauthier et al., 1992), et de son potentiel dgrader les hydrocarbures en milieu aquatique (aquaeolei: "aqua" eau et oleum ptrole). Les principales diffrences entre ces deux espces se manifestent essentiellement par des taux diffrents de Guanine-Cytosine dans l'ADN et un taux d'hybridation ADN-ADN infrieur 65 % justifiant lui seul la cration d'une nouvelle espce (Huu et al., 1999). En ce qui concerne la distribution des acides gras totaux, elle est assez voisine de celle rencontre chez M. hydrocarbonoclasticus, avec cependant une proportion d'acide olique plus faible, compense par une proportion plus leve d'acide palmitolique. A notre connaissance le mtabolisme d'hydrocarbures par M. aquaeolei n'avait jusqu'ici pas t tudi.

II.2. CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES D'Acinetobacter calcoaceticus

Acinetobacter calcoaceticus initialement nomme Micrococcus cerificans a t isole

pour la premire fois par Beijerinck (1911). Elle a t par la suite classe comme
Pseudomonas calcoaceticus, pour tre enfin caractrise sous le nom d'Acinetobacter calcoaceticus (Baumann et al., 1968).

Cette bactrie Gram-ngative, strictement arobie est capable de crotre dans un milieu de culture minral avec l'actate comme source unique de carbone et l'ammoniaque ou le nitrate comme source d'azote. Elle peut galement utiliser une grande varit de composs organiques comme source unique de carbone; parmi ces composs on peut citer: les 200

hydrocarbures, les acides gras, les acides amins, les sucres (pentoses) et les composs aromatiques. Par contre, elle est incapable de crotre par exemple en prsence de mthanol, formate ou glycrol (Bouvet et Grimont, 1986; Baumann et al., 1968). Les valeurs optimales de temprature et de pH pour la croissance de cette bactrie sont respectivement 30 C et pH 6,8. Cette bactrie est capable de crotre sur le ptrole brut et il a t montr qu'elle dgrade plus facilement les alcanes (jusqu' C33) que les composs aromatiques et les asphaltnes (Pines et Gutnick, 1986; Marin et al., 1995, 1996; Lal et Khanna, 1996). Par exemple, la souche Acinetobacter calcoaceticus S30 peut dgrader en 15 jours 29 % du ptrole brut de Gujarat (Inde) dont les alcanes ont t six fois plus dgrads que les aromatiques. Les bactries du genre Acinetobacter sont gnralement rencontres dans les sites contamins par le ptrole et elles ont t largement utilises pour l'tude de l'oxydation des n-alcanes (Asperger et Kleber, 1991). A. calcoaceticus prsente la particularit rare, chez les bactries, de synthtiser et d'accumuler des cires, esters d'acides gras et d'alcools gras, notamment du palmitate de palmityle (C16-C16), dans les milieux carencs en azote (Fixter et al., 1986). Cette proprit est largement rpandue dans le genre Acinetobacter (Makula et al., 1975; Bryn et Jantzen, 1977, Ishige et al., 2002), et elle se manifeste notamment lors de la croissance sur n-alcanes. La biodgradation des n-alcanes chez les bactries du genre Acinetobacter a t trs tudie depuis plus de 20 ans. Cependant ce jour les voies mtaboliques ne sont pas totalement claircies en raison de l'intervention d'un nombre trs important d'enzymes. Si la voie classique via la formation d'un alcool primaire et loxydation en acide se manifeste chez la souche S30 d'A. calcoaceticus (Lal et Khanna, 1996), l'intervention d'une dioxygnase conduisant la formation d'un hydroperoxyde serait privilgie chez la souche M-1 d'Acinetobacter sp. (Sakai et al., 1996). Ce peroxyde voluerait ensuite vers un aldhyde, donc sans la formation d'un alcool comme intermdiaire, cet aldhyde tant ensuite oxyd en acide. Par contre chez la souche HO1-N, le peroxyde serait d'abord rduit en alcool avant d'tre oxyd en aldhyde (Finnerty, 1990a, b).

II.3.

CARACTERISTIQUES

PHYSIOLOGIQUES

ET

BIOCHIMIQUES

DE

Pseudomonas oleovorans

Pseudomonas oleovorans a t isole pour la premire fois par Lee et Chandler en

1941. Il s'agit d'une bactrie Gram-ngative, strictement arobie, capable d'oxyder les 201

composs aliphatiques: elle peut crotre dans un milieu de culture contenant un n-alcane ou un
n-alcne de C6 C12 comme source unique de carbone et d'nergie (Baptist et al., 1963;

Nieder et Shapiro, 1975). Elle peut galement poxyder les alcnes terminaux des taux trs levs (Schwartz et McCoy, 1973; May et al., 1972). Les conditions optimales de croissance se situent 30 C et pH 6,8. Un des aspects du mtabolisme de P. oleovorans, comme de nombreuses
Pseudomonas, dans des conditions de carence d'azote ou de nutriments et en prsence d'un

excs de la source de carbone, consiste synthtiser et accumuler comme produit de rserve, des poly--hydroxyalcanoates (butyrate essentiellement) (Anderson et Daws, 1990; Diard et al., 2002). Ces polyesters biodgradables peuvent tre utiliss dans des applications mdicales ou industrielles en raison de leurs proprits physico-chimiques (Anderson et Dawes, 1990; Madison et Huismann, 1999).

La voie mtabolique des n-alcanes chez P. oleovorans est bien tablie. L'oxygne molculaire est introduit par une monooxygnase pour donner un alcool primaire (Ueda et al., 1972; Batipst et al., 1963). L'alcool produit est ensuite dshydrogn en aldhyde. Celui-ci est successivement pris en charge par une aldhyde dshydrognase et une acyl-CoA synthtase pour donner un driv acyl-CoA intgrant alors le mtabolisme (van Beilen et al., 1994). L'enzyme responsable de l'hydroxylation est galement capable d'poxyder la double liaison des n-alcnes terminaux (May et Abott, 1973).

III. RESULTATS QUANTITATIfs

Pour tudier l'influence de la source de carbone sur la composition lipidique de M.


aquaeolei et A. calcoaceticus par comparaison avec M. hydrocarbonoclasticus, chacune de

ces deux bactries a t cultive sur un substrat soluble: l'actate d'ammonium, un alcane normal: n-C19 et un alcane ramifi: i-C19. Les cultures sur ces hydrocarbures ont t ralises en suivant la mme procdure que pour M. hydrocarbonoclasticus. Les biomasses bactriennes sches, rcupres par ultracentrifugation suivie d'une lyophilisation ont t extraites en suivant la mme procdure analytique, reprsente la Figure II.1 du chapitre II. Les rsultats quantitatifs concernant les trois fractions lipidiques ("non lis", labiles en milieu basique et labiles en milieu acide) obtenues par extractions successives des biomasses bactriennes de M. aquaeolei et A. calcoaceticus en fonction de la

202

source de carbone sont runies dans le Tableau IV.1. Les rsultats relatifs M.
hydrocarbonoclasticus y figurent galement pour comparaison.

Le pourcentages des lipides totaux des cultures sur n-C19 et i-C19 constituent respectivement 7,0 et 6,1 % des biomasses bactriennes sches dans le cas de M. aquaeolei et, 7,1 et 14,4 % dans les cas d'A. calcoaceticus. Ces valeurs sont suprieures celles obtenues avec les cultures sur actate d'ammonium: 5,3 % dans le cas de M. aquaeolei et 2,8 % dans le cas d'A. calcoaceticus. Ces variations concordent avec les rsultats obtenus pour M.
hydrocarbonoclasticus cultive sur diffrents types d'hydrocarbures (Tableau III.1) ainsi

qu'avec des tudes antrieures sur la variation des lipides totaux des bactries hydrocarbonoclastes lors du passage d'une culture sur un substrat simple et soluble des cultures sur hydrocarbures (Makula et Finnerty, 1968a; Goutx et al., 1990; Doumenq et al., 1999). Chez les quatre bactries, les lipides "non lis" constituent toujours la fraction lipidique prdominante quelque soit la nature de la source de carbone (ils constituent entre 49,3 % et 83,2 % des lipides totaux, Tableau IV.1), suivis des lipides labiles en milieu basique avec des valeurs comprises entre 12,7 et 45,8 % des lipides totaux. Les lipides labiles en milieu acide reprsentent de 3,8 % 15,7 % des lipides totaux. La structure chimique des composs prsents dans chaque fraction a t dtermine par analyse en CG/SM des drivs TMSi, DMDS et N-acylpyrrolidides. La structure de certains composs a t confirme par coinjections avec des standards et dans certains cas par comparaison avec les lipides d'Escherichia coli dont la composition est bien connue.

203

Tableau IV.1. Abondance des diffrentes fractions lipidiques de M. aquaeolei, A. calcoaceticus et P. oleovorans en fonction de la source de

carbone. Comparaison avec les rsultats obtenus avec M. hydrocarbonoclasticus


Pourcentage par rapport la biomasse sche BACTERIE Pourcentage par rapport aux lipides totaux

Source de carbone

Lipides totaux

"Non lis" 3,5 8,7 10,2 3.8 4.7 4.6 2,1 5,2 7,1 * * *

OH--labiles 1,1 3,1 1,6 1.3 1.7 1.2 0,4 1,6 6,6 * * *

H+-labiles 0,6 0,9 0,5 0.2 0.6 0.3 0,3 0,3 0,7 * * *

"Non lis" 67,3 68,6 83,2 71.7 67.1 75.4 75,0 73,2 49,3 73,6 59,1 61,4

OH--labiles 21,2 24,1 12,7 24.5 24.3 19.7 14,3 22,5 45,8 16,2 27,3 22,9

H+-labiles 11,5 7,3 4,1 3.8 8.6 4.9 10,7 4,2 4,9 10,2 13,6 15,7

M. hydrocarbonoclasticus

Actate d'ammonium
n-C19 i-C19

5,2 12,7 12,3 5,3 7,0 6,1 2,8 7,1 14,4 * * *

Actated'ammonium
M. aquaeolei

n-C19 i-C19

Actate d'ammonium
A. calcoaceticus

n-C19 i-C19

Actate d'ammonium
P. oleovorans

n-C8

2-Me-C7

*: ces pourcentages n'ont pas pu tre dtermins en raison de la prsence de quantits importantes de sel avec les biomasses bactriennes.

204

IV. IDENTIFICATION DES LIPIDES

Les lipides extraits des biomasses bactriennes cultives sur les trois sources de carbone testes (actate d'ammonium, hydrocarbure normal et hydrocarbure ramifi), contiennent les mmes classes de composs que M. hydrocarbonoclasticus cultive sur ces mmes substrats. Les principales diffrences que l'on peut noter en comparant les distributions des lipides de M. hydrocarbonoclasticus (Tableaux III.3, III.4 et III.5) avec celles de M. aquaeolei (Tableau IV.5) et d'A. calcoaceticus (Tableau IV.6) concernent respectivement l'apparition de quantits apprciables d'acides gras saturs comportant deux ramifications mthyles et d'-hydroxy acides. La dtermination du nombre et des positions des ramifications a t effectue grce aux drivs N-acylpyrrolidides obtenus par l'action de la pyrrolidine sur les esters mthyliques. Les Figures IV.1 et IV. 2 reprsentent respectivement les spectres de masse des drivs N-acylpyrrolidides du mthylester des acides gras 8,15-Me2-C16:0 et 10,15-Me2-C16:0, ainsi que leurs interprtations

Figure IV.1. Spectre de masse du driv N-acylpyrrolidide du mthyl ester de l'acide gras 8,15-Me2-C16:0.

205

Figure IV.2. Spectre de masse du driv N-acylpyrrolidide du mthyl ester de l'acide gras 10,15-Me2-C16:0. Des -hydroxy acides ont t dtects chez A. calcoaceticus dans les lipides labiles en milieu basique et ceux labiles en milieu acide. Ces composs ont t caractriss grce leurs drivs trimthylsilyls qui prsentent des coupures spcifiques en spectromtrie de masse (Figure III.42). Les Figures IV.3 et IV.4 montrent les spectres de masse des drivs TMSi des deux -hydroxy acides (mthyl esters) les plus abondants: -OH, n-11:0 et -OH, n-12:0.

Les lipides d'A. calcoaceticus cultive sur n-nonadcane sont caractriss par la prsence d'-mthyl--hydroxy acides. Les spectres de masse des drivs TMSi de ces composs prsentent des ions caractristiques permettant leur identification (Figure IV.5). Les Figures IV.6 et IV.7 prsentent respectivement les spectres de masse des mthyl--hydroxy mthyl esters trimthylsilyls 13 et 14 atomes de carbone. Dans chaque spectre on distingue deux pics intenses m/z 189 et m/z M-15. Le pic m/z 189 correspond au fragment rsultant de la coupure de la liaison C-C. A notre connaissance ce type de composs n'avait t identifi ce jour que dans les lipopolysaccharides de Bordetella
pertussis (Haeffner et al., 1977)

206

(M-59)+

OSi(C H 3 ) 3 COO CH 3

229

(M-CH3)+

Figure IV.3. Spectre de masse du driv TMSi de l'-hydroxy acide n-C11:0 (mthyl ester).

(M-59)+

243
COOCH3 OSi(CH3)3

(M-CH3)+

Figure IV.4. Spectre de masse du driv TMSi de l'-hydroxy acide n-C12:0 (mthyl ester).

207

(CH3)3Si+ m/z 75

CH3 CH=C-CO2CH3
+ O=Si(CH3)2

CH3 R-CH-CH-CO2CH3 OSi(CH3)3

CH3 CH-CH-CO2CH3 O+Si(CH3)3 m/z 189

m/z 173

CH3 R-CH-CH-CO2CH3
+ O=Si(CH3)2

M-15

Figure IV.5. Principaux ions fragments en spectromtrie de masse des drivs silyls des mthyl--hydroxy acides (methyl ester).

189

(M-CH3)+

OSi(CH3)3 COOCH3
229

CH3

Figure IV.6. Spectre de masse du driv TMSi de l'acide 2-mthyl-3-hydroxy-dodcanoque (mthyl ester).

208

243

CH3 COOCH3 OSi(CH3)3


189

(M-CH3)+

Figure IV.7. Spectre de masse du driv TMSi de l'acide 2-mthyl-3-hydroxy tridcanoque (mthyl ester).

V. DISTRIBUTION DES LIPIDES DE M. AQUAEOLEI EN FONCTION DE LA SOURCE DE CARBONE et comparaisons avec M. HYDROCARBONOCLASTICUS

V.1. RESULTATS

Les lipides extraits de M. aquaeolei cultive sur actate d'ammonium, n-C19 et i-C19 contiennent les mmes familles de composs que M. hydrocarbonoclasticus, savoir des acides gras saturs et monoinsaturs, des hydroxy acides et des alcools saturs et monoinsaturs. La distribution de ces diffrentes familles dans les trois fractions lipidiques en fonction de la source de carbone est rsume dans les tableaux IV.2, IV.3 et IV.4. Les rsultats relatifs M. hydrocarbonoclasticus y figurent galement pour comparaison. Les rsultats quantitatifs dtaills relatifs chaque famille de compos sont rassembls dans le tableau IV.5.

209

V.1.1. Cultures sur actate d'ammonium

V.1.1.1. Lipides "non lis"

Les lipides "non lis" de M. aquaeolei cultive sur actate d'ammonium comme source unique de carbone et d'nergie sont caractriss par la prsence prdominante des acides gras saturs et insaturs, essentiellement normaux nombre pair d'atomes de carbone de C12 C20 (plus de 98 % des lipides "non lis", tableau IV.2). Ces acides gras normaux saturs et insaturs reprsentent, respectivement, 40,5 et 55,8 % des lipides de cette fraction (Tableau IV.2). Les acides gras saturs les plus abondants sont les mmes que dans les lipides "non lis" de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur le mme substrat (Lattuati et al., 2002). Ils s'agit (en abondance relative) des acides n-C16:0 (31,6 %), n-C14:0 (4,6 %) et n-C18:0 (3,9 %). Des acides gras normaux nombre impair d'atomes de carbone (C15, C17 et C19; Tableau IV.5) ont t galement identifis en faible quantit (0,3 %) alors qu'ils ne reprsentaient que des traces dans le cas de M. hydrocarbonoclasticus. Cette fraction est galement caractrise par la prsence de quantits non ngligeables d'acides gras ramifis essentiellement en position 10 (2,0 % des lipides "non lis"; Tableau IV.5), alors que ces composs sont totalement absents dans cas de M. hydrocarbonoclasticus. Quatre acides gras ramifis en position 10 ont t identifis: deux nombre impair d'atomes de carbone 10-Me-C16:0 et 10-Me-C18:0 reprsentant respectivement 1,7 et 0,3 %, et deux nombre pair d'atomes de carbone 10-Me-C15:0 et 10Me-C17:0 prsents l'tats de traces. Par comparaison l'analyse des lipides de M. aquaeolei par Huu et al. (1999) avait rvl uniquement la prsence de deux acides gras ramifis en milieu de chane: 10-Me-C16:0 et 10-Me-C17:0. Les acides gras insaturs prsents dans les lipides "non lis" sont caractriss par une distribution simple avec prdominance des composs n-C16:1 et n-C18:1 (plus de 98 % des acides gras insaturs) dont les positions d'insaturations se trouvent essentiellement en 9 et
7 comme chez M. hydrocarbonoclasticus. Nous observons galement une trs faible

quantit d'acides gras insaturs nombre impair d'atomes de carbone (essentiellement nC17:18, Tableau IV.5) dans les lipides de M. aquaeolei alors qu'ils taient absents chez M.
hydrocarbonoclasticus.

Les alcools (0,7 %) et les -hydroxy acides (traces) sont des constituants mineurs des lipides "non lis" de
M. aquaeolei

cultive

sur

actate;

comme

chez

M.

hydrocarbonoclasticus.

210

Tableau IV.2. Composition des lipides "non lis" de M.hydrocarbonoclasticus, M. aquaeolei et A. calcoaceticus en fonction de la source de carbone.
M. hydrocarbonoclasticus M. aquaeolei A. calcoaceticus

Source de carbone Lipides n-alcan-1-ols n-alcan-2-ols alcan-1-ols ramifis alcan-2-ols ramifis Alcools n-acides saturs n-acides insaturs Acides ramifis saturs Acides ramifis insaturs Acides hydroxy acides Composs pairs Composs impairs Composs normaux Composs ramifis AG saturs AG insaturs cis AG insaturs trans AG insaturs AG-C16 AG-C17 AG-C18 AG: acides gras.

Actate d' ammonium tr tr 29,7 70,0 99,7 tr 99,1 0,6 97,7 29,7 70,0 70,0 40,8 tr 54,7

n-C19

i-C19

6,0 0,6 6,6 40,8 46,3 5,0 92,1 0,9 20,6 79,0 94,6 5,0 45,8 46,3 46,3 5,9 56,2 13,5

0,7 6,9 0,2 7,8 13,0 21,1 43,6 9,6 87,3 3,6 35,6 63,1 34,8 63,9 56,6 30,7 30,7 7,5 33,6 26,9

Actate d' ammonium 0,7 0,7 40,5 55,8 2,0 98,3 tr 96,1 2,6 96,7 2,0 42,5 55,8 55,8 58,3 2,0 32,3

n-C19

i-C19

1,2 tr 1,2 46,0 44,1 6,5 96,6 0,1 20,7 77,2 91,9 6,5 52,5 44,1 44,1 12,8 55,5 7,4

0,5 0,7 tr 1,2 7,3 20,4 52,4 16,4 96,5 0,3 35,3 62,7 28,4 69,5 59,7 36,8 36,8 11,9 48,0 21,8

Actate d' ammonium 3,5 3,5 37,4 57,8 95,3 0,9 98,5 1,1 99,6 37,4 57,8 57,8 60,8 0,5 32,8

n-C19

i-C19

3,0 0,2 3,2 35,6 59,8 95,4 0,6 9,9 89,3 99,2 tr 35,6 59,4 0,4 59,8 3,3 68,2 5,7

0,3 0,4 0,7 2,4 1,7 55,2 38,1 97,4 1,4 14,3 85,2 5,8 93,7 57,6 39,5 0,3 39,8 10,0 46,7 2,6

211

Tableau IV.3. Composition des lipides labiles en milieu basique de M.hydrocarbonoclasticus, M. aquaeolei et A. calcoaceticus en fonction de la source de carbone.
M. hydrocarbonoclasticus M. aquaeolei A. calcoaceticus

Source de carbone Lipides Alcools n-acides saturs n-acides insaturs Acides ramifis saturs Acides ramifis insaturs Acides
n--hydroxy acides -hydroxy acides ramifis -hydroxy acides hydroxy acides -hydroxy 12:0*

Composs pairs Composs impairs Composs normaux Composs ramifis AG saturs AG insaturs AG-C16 AG-C17 AG-C18 AG: acides gras. *: % par rapport aux -hydroxy acides totaux de la prsente fraction.

Actate d' ammonium 34,5 34,1 68,6 30,6 30,6 99,0 99,1 0,1 99,2 34,5 34,1 11,8 tr 14,5

n-C19

i-C19

0,6 35,0 35,9 1,8 72,7 26,6 26,6 60,2 36,3 63,6 98,1 1,8 36,8 35,9 7,8 31,6 8,4

0,5 7,9 14,0 18,2 2,3 42,4 55,2 0,6 55,8 91,0 76,8 21,9 77,3 21,4 26,1 16,3 5,9 13,3 8,0

Actate d' ammonium 0,5 36,2 19,1 0,9 56,2 42,5 42,5 98,6 97,8 1,3 98,3 0,9 37,1 19,1 24,8 0,9 10,6

n-C19

i-C19

0,3 25,2 13,6 2,2 41,0 56,9 56,9 63,3 48,7 50,6 96,0 2,2 27,4 13,6 7,5 20,5 2,2

0,1 19,7 10,3 14,8 2,5 47,3 49,5 2,0 51,5 92,0 81,3 18,4 79,7 19,3 34,5 12,8 6,0 9,6 3,9

Actate d' ammonium 14,0 40,2 10,5 50,7 20,4 13,9 34,3 95,1 97,7 1,3 99,0 40,2 10,5 11,9 tr 9,8

n-C19

i-C19

1,0 34,1 12,6 46,7 31,6 19,7 51,3 71,5 62,7 36,3 99,0 34,1 12,6 1,1 11,8 1,5

0,5 12,0 2,3 13,5 9,8 37,6 30,8 27,3 58,1 94,8 72,9 23,5 73,1 23,3 25,5 12,1 7,3 11,5 -

212

Tableau IV.4. Composition des lipides labiles en milieu acide de M.hydrocarbonoclasticus, M. aquaeolei et A. calcoaceticus en fonction de la source de carbone.
M. hydrocarbonoclasticus M. aquaeolei A. calcoaceticus

Source de carbone Lipides Alcools n-acides saturs n-acides insaturs Acides ramifis saturs Acides ramifis insaturs Acides
n--hydroxy acides -hydroxy acides ramifis -hydroxy acides -hydroxy acides hydroxy acides -hydroxy 12:0* -hydroxy 14:0*

Composs pairs Composs impairs Composs normaux Composs ramifis AG saturs AG insaturs AG: acides gras. *: % par rapport aux -hydroxy acides totaux de la prsente fraction.

Actate d' ammonium 4,8 0,8 5,6 94,1 94,1 99,4 0,1 99,7 99,7 4,8 0,8

n-C19

i-C19

7,1 26,2 1,3 27,5 64,3 64,3 60,3 0,3 63,9 35,0 98,9 26,2 1,3

2,0 2,9 0,4 3,3 91,5 1,9 93,4 94,0 1,1 93,0 4,8 96,2 1,6 2,9 0,4

Actate d' ammonium 1,3 5,4 0,7 tr 6,1 91,6 91,6 99,0 0,7 98,2 0,8 99,0 tr 5,4 0,7

n-C19

i-C19

1,1 20,7 1,7 0,6 23,0 73,4 73,4 71,4 69,9 25,6 94,9 0,6 21,3 1,7

1,8 8,2 6,3 19,2 3,2 36,9 56,7 2,2 59,9 94,7 73,4 24,2 73,0 24,6 27,4 9,5

Actate d' ammonium 36,1 8,8 1,6 10,4 50,4 2,4 52,8 34,5 61,3 96,7 2,6 99,3 8,8 1,6

n-C19

i-C19

0,3 1,3 1,3 93,8 0,9 94,7 54,6 14,9 67,7 28,6 96,3 1,3 -

0,5 1,5 1,5 95,9 tr 95,9 37,9 54,0 90,2 7,7 97,9 1,5 -

213

Tableau IV.5. Composition lipidique de Marinobacter aquaeolei en fonction de la source de carbone.


Lipides Acides gras saturs n-10:0 i-11:0 n-11:0 i-12:0 n-12:0 i-13:0 n-13:0 i-14:0 n-14:0 i-15:0 n-15:0 6,13-Me2-14:0 10,13-Me2-14:0 10-Me-15:0 i-16:0 n-16:0 10-Me-16:0 i-17:0 n-17:0 8,15-Me2-16:0 10,15-Me2-16:0 10-Me-17:0 i-18:0 n-18:0 10-Me-18:0 i-19:0 n-19:0 10,17-Me2-18:0 i-20:0 n-20:0 Actate dammonium "Non lis" OH--labiles H+-labiles tr 4,6 tr 0,1 tr 31,6 1,7 0,1 tr 3,9 0,3 0,1 0,1 tr tr 14,1 tr 3,7 tr 0,2 tr 17,3 0,8 tr 0,1 0,8 0,1 tr tr tr tr 1,1 tr 0,3 2,6 tr 0,3 1,0 tr 0,1 "Non lis" 1,3 0,3 0,1 10,4 1,6 3,0 1,0 29,6 3,5 0,4 0,3 1,0 n-C19 OH--labiles 0,1 1,7 1,8 4,0 0,1 0,1 0,1 0,7 0,1 3,9 0,1 13,4 1,2 0,1 tr tr tr H+-labiles 0,2 0,3 4,0 0,2 5,1 tr 3,8 0,2 3,2 0,4 3,5 0,1 0,3 "Non lis" 0,3 0,2 9,5 0,1 0,2 0,2 1,5 5,5 tr 33,5 tr 1,5 3,0 0,7 1,2 2,0 0,3 i-C19 OH--labiles tr 0,1 0,1 0,3 15,8 2,1 0,3 0,5 0,1 0,5 0,2 2,8 2,2 6,6 0,5 0,2 0,5 1,6 0,1 tr H+-labiles 0,2 0,3 0,2 5,2 0,1 0,5 4,7 1,6 9,1 0,5 0,8 0,1 0,3 2,5 1,2 0,1 -

214

Lipides Acides gras insaturs n-13:1 8 n-14:1 9 n-14:1 7 n-14:1 5 i-15:1 8 n-15:1 10 n-15:1 9 n-15:1 8 n-15:1 6 n-16:1 9 n-16:1 7 n-16:1 5 i-17:1 9 i-17:1 7 n-17:1 10 n-17:1 9 n-17:1 8 n-17:1 7 i-18:1 8 n-18:1 9 n-18:1 7 i-19:1 9 n-19:1 10 n-19:1 9 n-19:1 8 -hydroxy acides n-10:0, OH i-11:0, OH n-11:0, OH n-12:1, OH

Actate dammonium "Non lis" OH--labiles H+-labiles 0,1 tr tr 17,7 8,7 0,3 0,2 25,0 3,4 0,1 1,5 0,3 7,1 0,4 tr tr 9,3 0,5 0,5 0,1 tr 0,2 tr 0,4 0,1 0,1 0,1 -

"Non lis" 0,3 0,3 2,4 2,6 5,6 2,3 0,3 4,5 2,1 17,8 0,5 3,4 0,1 1,0 0,4 0,5 tr -

n-C19 OH--labiles 1,3 0,1 0,1 0,5 0,6 1,8 0,8 0,2 5,8 1,2 0,8 0,1 0,3 tr 11,2 0,1

H+-labiles 0,7 0,3 0,1 0,5 0,1 tr 13,9 -

"Non lis" 3,2 1,6 0,1 2,9 11,5 0,1 tr 15,3 0,1 2,0 tr tr -

i-C19 OH--labiles 0,4 5,2 0,3 tr 0,1 0,5 0,3 0,2 0,3 1,9 0,3 0,2 3,0 tr 0,1 0,4 tr 0,6 0,3

H+-labiles 1,1 0,5 0,4 2,8 0,1 4,5 0,1 0,2 0,5 -

215

Lipides n-12:0, OH i-13:0, OH n-13:1 8, OH n-13:1, OH n-13:0, OH n-14:0, OH i-15:0, OH n-16:0, OH i-17:0, OH n-17:0, OH n-18:0, OH i-19:0, OH n-19:0, OH Alcools n-16:0, 1-OH n-18:0, 1-OH 2Me-18:0, 1-OH i-19:1, 1-OH i-19:0, 1-OH i-19:0, 2-OH n-19:110, 1-OH n-19:19, 1-OH n-19:18, 1-OH n-19:0, 1-OH n-19:0, 2-OH n-20:0, 1-OH
#

Actate dammonium "Non lis" OH--labiles H+-labiles tr tr 0,5 0,2 41,9 tr 0,3 0,2 tr tr 90,7 0,1 0,6 tr 0,9 0,4 tr

"Non lis" tr tr 0,1 0,1 0,1 0,1 0,3 tr 0,6 tr -

n-C19 OH--labiles 36,0 2,0 0,2 7,4 tr 0,1 0,1 0,1 tr

H+-labiles 52,4 0,3 6,8 tr tr 1,0 tr 0,1

"Non lis" 0,2 0,1 0,3 0,2 tr 0,6 0,1 tr -

i-C19 OH--labiles 47,4 2,0 0,1 tr 0,2 0,5 tr tr tr 0,1 tr 0,1 tr tr

H+-labiles 55,8 2,2 0,2 1,0 0,8 tr -

Les abondances relatives des -mthoxy acides prsents ont t additionnes aux -hydroxy acides comportant les mmes nombres d'atomes de carbone, dont ils sont drivs. * L'ensemble des produits mineurs non identifis dans ces fractions lipidiques ainsi que des produits identifis (mais non rpertoris dans ce tableau car prsents l'tat de trace et pas vraiment significatifs en terme de mtabolisme des hydrocarbures par la bactries et d'influence sur ces lipides) reprsentent seulement entre 0,2 % et 2,3 % des lipides totaux.

216

En rsum, chez les deux espces de Marinobacter que nous avons cultives sur actate, les principaux composs sont par ordre de grandeur dcroissante les acides gras: 16:0 > 18:1 > 16:19 > 16:17, M. aquaeolei 18:1 > 16:0 > 16:19 > 16:17, M. hydrocarbonoclasticus Chez M. aquaeolei, les plus fortes proportions d'acide palmitique (31,6 % contre 22,4 %) et d'acide 16:19 (17,7 % contre 10,6 %) sont contrebalances par une prsence moindre d'acide olique (25,0 % contre 44,3 %).

V.1.1.2. Lipides labiles en milieu basique

La composition des lipides labiles en milieu basique de M. aquaeolei cultive sur actate d'ammonium prsente des similitudes avec celle de M. hydrocarbonoclasticus cultive sur le mme substrat. La distribution de ces lipides est caractrise par la prdominance des acides gras saturs et insaturs (au total 56,2 %) et des quantits importantes de -hydroxy acides constituant 42,5 % de cette fraction (Tableau IV.3). Ces deux classes de composs correspondent respectivement 68,6 et 30,6 % des lipides labiles en milieu basique de M.
hydrocarbonoclasticus.

Les acides gras saturs sont nettement plus abondants que les insaturs. Ils reprsentent respectivement 36,2 et 19,1 % chez M. aquaeolei alors qu'ils sont dans des proportions presque gales dans le cas de cas de M. hydrocarbonoclasticus. Dans ces deux bactries, la distribution des acides gras est caractrise par une forte prdominance de composs normaux nombre pair d'atomes de carbone. Les acides gras n-C12:0 et n-C16:0 sont les plus abondants (Tableau IV.5). Seuls deux acides gras ramifis ont t observs: 10-MeC16:0 et 10-Me-C18:0, respectivement 0,8 et 0,1 % des lipides labiles en milieu basique. Les acides n-C16:1 et n-C18:1 (9 et dans une moindre mesure 7) sont les acides gras insaturs prdominants (plus de 90 % des acides gras insaturs)(Tableau IV.5 et IV.6) alors qu'ils ne reprsentent qu'approximativement 50 % dans le cas de M. hydrocarbonoclasticus. Cette dernire bactrie se caractrise par des proportions importantes d'acides gras insaturs courtes chanes n-12:1 et n-14:1 (Tableau III.4, Lattuati et al., 2002). Les -hydroxy acides reprsentent une partie importante des lipides labiles en milieu basique. Ils sont essentiellement normaux nombre pair d'atomes de carbone, caractriss par une forte prdominance du n--12:0 (plus de 98 % des -hydroxy acides, Tableau IV.3). Des
-mthoxy acides ont t galement identifis dans cette fraction, mais en raison de leur

217

origine artfactuelle (voir chapitre III), leur pourcentage a t inclus avec celui des -hydroxy acides.

V.1.1.3. Lipides labiles en milieu acide

Comme dans le cas de M. hydrocarbonoclasticus, les lipides obtenus par hydrolyse acide des rsidus des biomasses bactriennes de M. aquaeolei prsentent une forte abondance en -hydroxy acides, ces composs constituant 91,6 % de cette fraction contre 94,1 % chez M.
hydrocarbonoclasticus (Tableau IV.4). Le n--12:0 est le compos prdominant cette srie

(99,0 %; Tableau IV.4), comme pour M. hydrocarbonoclasticus; les homologues infrieurs (n-10:0 et n-11:0) et suprieurs (n-13:0 et n-14:0) sont des composs trs mineurs. Les acides gras sont galement prsents dans cette fraction, mais constituent des composs de moindre importance compars aux deux fractions prcdentes: 6,1 % (Tableau IV.4). Les acides n-16:1 et n-18:1 sont les seuls acides gras insaturs prsents dans les lipides labiles en milieu acide de M. aqueolei (Tableau IV.5). Les alcools constituent 1,3 % de la fraction labile en milieu acide, alors qu'ils taient compltement absents dans la mme fraction chez M. hydrocarbonoclasticus.

V.1.2. Cultures sur n-nonadcane

Les lipides de M. aquaeolei cultive sur n-nonadcane contiennent les mmes classes de composs que chez la bactrie cultive sur actate d'ammonium. Les distributions de ces lipides sont rapportes dans le tableau IV.5.

V.1.2.1. Lipides "non lis"

Les lipides "non lis" de M. aquaeolei cultive sur n-C19 sont domins par les acides gras, constituant plus de 96 % de cette fraction (Tableau IV.2). Les acides gras saturs et insaturs principaux sont les composs normaux nombre impair d'atomes de carbone de C13 C19 (Tableaux IV.2 et IV.5). Les acides gras normaux saturs et insaturs sont dans des proportions presque gales (approximativement 45 % chacun; Tableau IV.2). Les principaux acides gras saturs identifis sont (en abondance relative) les acides n-C17:0 (29,6 %) et n-C15:0 (10,4 %). D'autres acides gras normaux tels que n-C13:0, n-C16:0 et n-C19:0 sont galement

218

prsents. En ce qui concerne les acides gras ramifis, ils reprsentent 6,5 %: on observe essentiellement des composs ramifis en position 10. Contrairement la culture sur actate d'ammonium les acides 10-Me-C15:0 et 10-Me-C17:0 sont plus abondants que leur homologues chane principale paire. Les acides gras insaturs sont domins par les acides n-C17:1 (au total 24,9 %) dont l'insaturation se trouve par ordre d'importance dcroissance en 8, 10, 9, comme chez M.
hydrocarbonoclasticus. Deux autres sries d'acides gras insaturs nombre impair d'atomes

de carbone sont galement prsents: n-C15:1 (5,6 %) et n-C19:1 (1,9 %). En ce qui concerne les acides gras normaux nombre pair d'atomes de carbone, les acides n-C16:1 et n-C18:1 (9 prdominants) sont prsents en plus faibles quantits que dans le cas de la culture sur actate d'ammonium (8,2 et 3,5 % contre 26,7 et 28,4 % respectivement).

Les alcools saturs et insaturs sont des produits mineurs: 1,2 % des lipides "non lis". Les principaux composs sont ceux drivant directement du n-nonadcane. Comme chez M.
hydrocarbonoclasticus, l'alcool satur primaire n-19:0,1-OH est prdominant (0,6 %), suivi

du compos monoinsatur n-19:1,1-OH (0,4 %). L'analyse par spectromtrie de masse des adduits DMDS de ces derniers composs, coluant en CG, montre galement la prsence de trois isomres, par ordre d'importance dcroissante: 9, 10 et 8. Des traces d'alcool secondaire n-19:0,2-OH ont t aussi dtectes. Enfin, quatre -hydroxy acides ont t identifis: n-19:0 (0,1 %), n-17:0, n-12;0 et n11:0, ces trois derniers l'tat de traces. Seuls les -hydroxy acides n-19:0 et n-17:0 avaient t dtects chez M. hydrocarbonoclasticus.

V.1.2.2. Lipides labiles en milieu basique

Les lipides labiles en milieu basique de M. aquaeolei cultive sur n-nonadcane contiennent les mmes classes de composs que les fractions "non lis", avec cependant une distribution plus complexe. Les acides gras et les -hydroxy acides normaux sont les constituants les plus abondants: ils constituent respectivement 41,0 et 56,9 % de cette fraction (Tableau IV.3), alors que dans le cas de M. hydrocarbonoclasticus les acides gras sont les composs prdominants (72,7 %; Tableau III.6).

219

La distribution des -hydroxy acides est caractrise par une forte contribution du n-12:0 (63,3 % des -hydroxy acides prsents; Tableau IV.3). Des quantits apprciables de ses homologues suprieurs et infrieurs -OH-11 (11,2 %) et -OH-13 (9,6 %, saturs + insaturs) ont t galement dtectes (Tableau IV.5). Leur prsence suggre qu'ils sont des mtabolites de la dgradation du n-nonadcane. Un autre mtabolite de la dgradation du nnonadcane a t identifi l'tats de traces: il s'agit du n--19:0. Ces rsultats sont similaires avec ceux obtenus dans le cas de M. hydrocarbonoclasticus o l'hydroxy acide prdominant est n--12:0 (60,2 % des -hydroxy acides de cette fraction; tableau IV.3), accompagn de quantits importantes de ses deux homologues infrieur et suprieur 11 et 13 atomes de carbone (Tableau III.4).

Parmi les acides gras, les saturs sont prdominants (27,4 %: 25,2 % normaux et 2,2 % ramifis; Tableau IV.3). Ils reprsentent environ le double de leur homologues insaturs (13,6 %; Tableau IV.3), alors qu'ils taient dans des proportions presque gales dans le cas de M.
hydrocarbonoclasticus. Les acides gras normaux saturs sont essentiellement nombre

impair d'atomes de carbone. Les acides gras courtes chanes 10, 11 et 12 atomes de carbone sont des composs minoritaires (< 5 %), l'acide n-C17:0 tant le compos le plus abondant (Tableau IV.5). Les acides gras insaturs sont en grande partie nombre impair d'atomes de carbone; les composs n-17:1 (9 et 8) sont prdominants (7 % des lipides de cette fraction, Tableau IV.5) comme chez M. hydrocarbonoclasticus (insaturation en position 8 et 10).

V.1.2.3. Lipides labiles en milieu acide

Comme dans le cas des cultures de M. hydrocarbonoclasticus sur alcanes normaux, les lipides labiles en milieu acide de M. aquaeolei cultive sur n-nonadcane sont caractriss par la prdominance des -hydroxy acides chane courte (73,4 % de cette fraction, Tableau IV.4). Le compos le plus abondant est le n--12:0, constituant 52,4 % (Tableau IV.5). Les hydroxy acides nombre impair d'atomes de carbone sont aussi prsents en quantits importantes: le n--11:0 et n--13:0 contribuent respectivement pour 13,9 et 6,8 % de cette fraction (Tableau IV.5).

220

Par ailleurs, les acides gras constituent 23,0 % des lipides labiles en milieu acide (Tableau IV.4). La distribution de ces acides est caractrise par la prdominance des composs saturs (plus de 90 % des acides gras de cette fraction). Ils sont essentiellement normaux nombre pair d'atomes de carbone de n-C10:0 n-C20:0, les composs les plus abondants comportent 14, 16 et 18 atomes de carbone.

Enfin, les alcools sont des composs minoritaires dans cette fraction (1,1 %; Tableau IV.4). Ils prsentent une distribution similaire celle observe chez M. hydrocarbonoclasticus cultive sur le mme substrat: une prdominance des composs pairs essentiellement 18 atomes de Carbone (Tableaux IV.5 et III.5).

V.1.3. Culture sur iso-nonadcane

V.1.3.1. Lipides "non lis"

L'analyse par CG et CG/SM des lipides "non lis" de M. aquaeolei cultive sur i-C19, montre la prdominance des acides gras de C12 C20 (Tableaux IV.5), reprsentant plus de 96 % de cette fraction. Les acides gras ramifis sont les composs les plus abondants avec 68,8 % (52,4 % saturs et 16,4 % insaturs; Tableau IV.2). Ces acides sont essentiellement iso nombre impair d'atomes de carbone. Les acides gras normaux sont prsents en moindre quantit (27,7 %) par comparaison aux cultures sur actate d'ammonium et n-C19. Le compos majoritaire des acides gras saturs ramifis est l'iso-C17:0 (33,5 %; Tableau IV.5). Deux autres acides gras iso ont t identifis en quantits importantes: il s'agit des acides i-C15:0 et i-C19:0. Une quantit apprciable d'acides gras portant deux ramifications mthyles (5,2 %; Tableau IV.5) est prsente: il s'agit des 10,13-Me2-14:0, 8,15-Me2-16:0, 10,15-Me2-16:0 et 10,17-Me2-18:0; les composs portant une ramification mthyle en position 10 sont ici minoritaires par rapport la culture sur n-C19. Les acides gras ramifis insaturs sont prs de deux fois plus abondants dans les lipides "non lis" de M. aquaeolei que de M. hydrocarbonoclasticus (Tableau IV.2). Les acides gras ramifis insaturs les plus abondants chez ces deux bactries sont: i-C19:1 (9) et i-C17:1 (9 et 7). De faibles quantits d'acides gras saturs iso nombre pair d'atomes de carbone (2,2 %) sont galement prsentes.

221

En ce qui concerne les acides gras normaux, la distribution chez M. aquaeolei est caractrise par un maximum au niveau de l'acide olique (n-C18:19) tout comme M.
hydrocarbonoclasticus.

Les alcools constituent 1,2 % des lipides "non lis" de M. aquaeolei (Tableau IV.2). Quatre alcools 19 atomes de carbones ont t identifis (Tableau IV.5): i-19:0,1-OH; i19:1,1-OH; i-19:0,2-OH et 2-Me-18:0,1-OH. Enfin, seuls deux -hydroxy acides ont t identifis: i--19:0 (0,1 %) et n--12:0 (0,2 %) (Tableau IV.5).

V.1.3.2. Lipides labiles en milieu basique

Comme dans le cas des cultures sur actate d'ammonium et sur n-C19, les lipides labiles en milieu basique sont caractriss par la prpondrance des -hydroxy acides: 51,5 %, avec une forte contribution du n--12:0 (reprsentant plus de 90 % des -hydroxy acides de cette fraction; Tableau IV.3). Les homologues infrieurs et suprieurs sont prsents mais en faibles quantits. De plus une srie de -hydroxy acides iso, nombre impair d'atomes de carbone a t identifie. Son compos principal est l'i--OH-13:0 (2,0 %; Tableau IV.5). Les acides gras saturs sont plus abondants que leurs homologues insaturs (34,5 %: 19,7 % normaux et 14,8 % ramifis; Tableau IV.3). Les acides gras saturs les plus abondants sont n-C12:0 et i-C17:0, 15,8 et 6,6 % respectivement (Tableau IV.5). Parmi les acides gras insaturs, les composs principaux sont n-C14:19 et n-C18:19. Les alcools prsents dans cette fraction sont peu nombreux et en faible quantit, ils sont normaux nombre pair d'atomes de carbone.

V.1.3.3. Lipides labiles en milieu acide

Comme dans les cultures sur actate d'ammonium et sur n-C19, les lipides labiles en milieu acide de M. aquaeolei cultive sur i-C19 sont caractriss par la prdominance des hydroxy acides (59,0 % de cette fraction, Tableau IV.4). Le n--12:0 est le compos le plus abondant dans de cas de M. aquaeolei (94,7 % des -hydroxy acides de cette fraction;

222

Tableau IV.4) comme chez M. hydrocarbonoclasticus (94 %). Les autres -hydroxy acides sont ses homologues infrieurs n-10 et n-11, et suprieurs n-13, et l'iso-13:0.

Les acides gras labiles en milieu acide constituent 36,9 % de cette fraction (Tableau IV.4). Leur distribution est trs complexe: les acides gras saturs sont les plus abondants (approximativement 75 % des acides gras de cette fraction), les composs ramifis sont essentiellement iso impair caractriss par de fortes contributions des acides 17 et 15 atomes de carbone; les acides gras normaux saturs sont essentiellement pairs (n-C16:0 et n-C18:0 sont les deux composs les plus abondants; Tableau IV.5). Ces acides gras qui sont des composs minoritaires dans la fraction lipidique quivalente de M. hydrocarbonoclasticus ne parviennent pas d'une extraction incomplte des lipides labiles en milieu basique. En effet, le
n-C12:0, l'acide gras majoritaire labile en milieu basique, n'a pas t dtect dans cette fraction.

Des alcools ont t aussi dtects dans cette fraction leur distribution est similaire celle de M. hydrocarbonoclasticus: ils sont normaux, 16 et 18 atomes de carbone.

223

V.2. DISCUSSION

V.2.1. Influence de la nature de la source de carbone sur la composition lipidique

Les compositions lipidiques des deux espces de Marinobacter offrent de nombreuses similitudes: la structure des lipides, notamment des acides gras, dpend fortement de celle du substrat. Dans les deux cas, une source de carbone nombre de carbone pair induit la formation d'acides gras nombre pair d'atomes de carbone, essentiellement C16 et C18. Le contraire est observ dans le cas d'un substrat nombre d'atomes de carbone impair, comme les alcanes n-C19 et i-C19. On peut cependant noter une plus grande abondance des composs C18 par rapport au C16 chez M. hydrocarbonoclasticus, alors que l'inverse se manifeste chez
M. aquaeolei.

La principale diffrence entre les deux espces concerne les composs ramifis en milieu de chane. Alors que leur prsence est alatoire chez M. hydrocarbonoclasticus, ils sont toujours prsents chez M. aquaeolei. Chez cette dernire leur structure varie en fonction du substrat. Lors de la culture sur actate d'ammonium, les deux acides mthyls principaux dtects ont une chane alkyle comportant un nombre d'atomes de carbone pair: 10-Me-16:0 et 10-Me-18:0, dans la culture sur n-C19, ces deux acides, s'ajoutent deux composs dont la chane principale comporte un nombre impair d'atomes de carbone: 10-Me-15:0 et 10-Me17:0. Enfin, dans la culture sur i-C19, tous ces composs mono-mthyls ont quasiment disparu au profit d'acides gras dimthyls comportant un mthyle en position subterminale (iso) et un en milieu de chane en position 10: 10,13-Me2-14:0, 10,15-Me2-16:0 et 10,17-Me218:0, en position 8: 8,15-Me2-14:0 ou en position 6: 6,13-Me2-14:0. La structure de ces composs suggre qu'ils drivent d'acides gras monoinsaturs normaux pour les acides monomthyls, ou monoinsaturs iso pour les acides dimthyls, par mthylation d'une insaturation, la S-adenosylmthionine agissant probablement comme donneur de groupement mthyle. L'intervention d'une telle raction a t dmontre pour la biosynthse de l'acide tuberculostarique (10-Me-18:0) chez Mycobacterium tuberculosis (Fulco, 1983). La prsence des acides mthyls en position 10 chez M. aquaeolei confirme qu'ils ne sont pas spcifiques des bactries du genre Desulfovibrio (Parkes et al., 1993; Doumenq et al., 1999, 2000) ou Mycobacterium (Brennan, 1988).

224

V.2.2. Variation de la composition en -hydroxy acides

L'influence de la source de carbone sur la structure des -hydroxy acides de M.


aquaeolei est trs similaire celle rvle dans le cas de M. hydrocarbonoclasticus aussi bien

en ce qui concerne ceux drivant du mtabolisme des hydrocarbures que ceux lis aux LPS. Ces derniers, de trs loin les plus abondants, sont domins par le -hydroxy acide n--OH12:0. Ceci suggre pour le lipide A des LPS des deux espces de Marinobacter, une structure telle que celle prsente dans la Figure IV.8, certains groupements hydroxyles des chanes alkyles tant estrifis par des acides gras saturs. Une proportion apprciable de -hydroxy acides normaux nombre de carbone impair, est accepte dans les LPS lorsque la bactrie est cultive sur C19, jusqu' 21 % dans le cas des -hydroxy acides lis par liaison amide. Par comparaison seule une faible proportion de -hydroxy acide iso peuvent tre inclus dans les LPS.
O

H2O3PO O HO

O
3'

2'

HO NH O O HO
3 2

NH O

O-PO3H2

O HO

HO

-C12 -C12 -C12 -C12

Figure IV.8. Structure simplifie du lipide A des deux espces de Marinobacter.

V.2.3. Mtabolisme des hydrocarbures

Au vu des rsultats des analyses des lipides non lis de M. aquaeolei, il apparat que la dgradation des hydrocarbures s'effectue comme chez M. hydrocarbonoclasticus: oxydation terminale en alcools, puis en acides, suivie d'une -oxydation. L'oxydation subterminale en alcool secondaire, tout comme l'oxydation terminale du ct de la terminaison striquement encombre sont des voies minoritaires.

225

VI. DISTRIBUTION DES LIPIDES D'A. CALCOACETICUS EN FONCTION DE LA SOURCE DE CARBONE ET COMPARAISON AVEC M. HYDROCARBONOCLASTICUS

VI.1. Rsultats

Comme nous l'avons vu au dbut de ce chapitre, une des principales caractristiques d'A. calcoaceticus du point de vue de la composition lipidique est la prsence d'-hydroxy acides en quantit substantielle, alors qu'un seul de ces composs a t trouv l'tat de trace dans une culture de M. hydrocarbonoclasticus. L'analyse dtaille des lipides isols des cultures sur actate, n-nonadcane et iso-nonadcane a rvl plusieurs autres diffrences.

VI.1.1. Culture sur actate

VI.1.1.1. Lipides "non lis"

Comme chez les deux espces de Marinobacter cultives sur le mme substrat, les acides gras reprsentent plus de 95 % des lipides "non lis" (Tableau IV.2). De mme les acides palmitique (16:0) et olique (18:19) sont les acides prpondrants (34,8 % et 30,5 %, respectivement; Tableau IV.6); viennent ensuite les acides gras monoinsaturs 16:17 (palmitolique) et 16:19, dont les proportions sont inverses par rapport M. aquaeolei (ici 20,2 et 5,2 % respectivement). Aucun acide gras chane hydrocarbone ramifie n'a t dtect. Au total les acides gras insaturs taient dominants (57,8 %) par rapport aux saturs (37,4 %) (Tableau IV.2). De plus seuls trois acides gras nombre impair d'atomes de carbone ont t identifis , n-15:0 (0,5 %), n-17:0 (0,1 %) et n-17:18 (0,4 %) (Tableau IV.6). Une srie d'une dizaine d'alcools allant de C12 C18, reprsentaient au total 3,5 % des lipides extractibles (Tableau IV.2), les principaux tant les composs 16:0, 1-OH (1,2 %) et 18:1, 1-OH (1,0 %). Enfin, une trs faible quantit de -hydroxy acides a t dcele ( 1 %), essentiellement l'acide n--OH-12:0 (0,9 %; Tableau IV.6).

226

Tableau IV.6. Composition lipidique d'Acinetobacter calcoaceticus en fonction de la source de carbone.


Lipides Acides gras saturs n-10:0 n-11:0 n-12:0 n-13:0 n-14:0 i-15:0 n-15:0 i-16:0 n-16:0 i-17:0 n-17:0 i-18:0 n-18:0 2Me-18:0 i-19:0 n-19:0 Acides gras insaturs n-11:1 8 n-12:1 9 n-13:1 10 i-15:1 9 n-15:1 10 n-15:1 9 n-15:1 8 n-15:1 6 n-16:1 9 n-16:1 8 n-16:1 7 n-16:1 6 i-17:1 9 Actate dammonium "Non lis" 0,2 0,4 0,5 34,8 0,1 1,4 5,2 tr 20,2 0,6 OH--labiles 1,2 24,5 2,3 0,7 9,4 tr 2,1 0,3 0,3 2,2 H+-labiles 0,3 tr 1,4 0,1 0,2 5,6 0,3 0,9 0,2 "Non lis" 0,2 tr 8,1 2,8 tr 23,1 0,3 1,1 0,2 0,1 tr 0,6 0,1 0,4 n-C19 OH--labiles 5,3 7,1 12,6 0,6 0,2 2,9 1,1 4,1 0,1 0,1 0,1 0,3 2,2 tr tr 0,1 tr tr tr H+-labiles 0,6 tr 0,4 0,1 0,2 "Non lis" tr 5,9 5,9 2,4 41,1 1,1 tr 1,2 0.5 1,7 3,0 i-C19 OH--labiles 8,4 tr 2,5 1,2 3,8 9,8 2,3 0,7 H+-labiles 1,5 -

227

Lipides i-17:1 8 i-17:1 7 c i-17:1 7 t n-17:1 10 n-17:1 9 n-17:1 8 c n-17:1 8 t n-17:1 7 n-17:1 6 n-17:1 5 i-18:1 8 c i-18:1 8 t n-18:1 9 c n-18:1 9 t n-18:1 7 i-19:1 9 n-19:1 10 n-19:1 9 n-19:1 8 n-19:1 7 -hydroxy acides n-10:0, OH n-11:0, OH n-12:0, OH i-13:0, OH n-13:0, OH n-14:1, OH n-14:0, OH n-15:0, OH n-16:0, OH n-18:0, OH n-19:0, OH

Actate dammonium "Non lis" OH--labiles H+-labiles 0,4 30,5 7,4 1,4 0,3 0,9 tr 0,9 tr tr tr 0,2 tr 19,4 0,3 0,5 tr 17,4 2,1 30,9 tr -

"Non lis" 2,2 23,0 17,7 0,4 0,7 0,9 0,2 5,4 5,7 1,7 0,2 0,3 tr tr 0,5 tr 0,1

n-C19 OH--labiles 3,7 4,0 tr 1,4 tr 0,8 tr 0,5 5,9 22,6 2,3 0,3 tr tr

i-C19 H+-labiles 1,5 51,3 26,8 14,0 0,2 tr -

"Non lis" OH--labiles


0,4 2,0 0,2 1,4 0,1 30,5 0,9 tr 0,7 0,3 8,1 0,4 29,2 tr 0,6 0,6 -

H+-labiles 36,4 6,4 51,8 1,3 -

228

Lipides

-Me-n-13:0, OH -Me-n-14:0, OH -Me-n-15:0, OH -hydroxy acides


n-10:0, OH n-11:0, OH n-12:0, OH n-13:0, OH Alcools n-12:0, 1-OH n-14:0, 1-OH n-15:0, 1-OH n-16:1 9, 1-OH n-16:1 7, 1-OH n-16:0, 1-OH n-17:0, 1-OH n-18:19, 1-OH n-18:17, 1-OH n-18:0, 1-OH 2-Me-18:0, 1-OH i-19:0, 1-OH n-19:19, 1-OH n-19:0, 1-OH n-19:0, 2-OH n-20:0, 1-OH
#

Actate dammonium "Non lis" OH--labiles H+-labiles 0,1 0,1 0,1 0,4 0,1 1,2 tr 1,0 0,1 0,4 tr tr 13,9 0,1 0,3 4,9 5,0 0,8 2,6 0,3 tr 2,4 0,3 0,6 12,4 14,2 1,5 6,8 0,3

"Non lis" tr 0,1 0,1 0,1 0,1 1,1 1,5 0,2 -

n-C19 OH--labiles tr 0,4 1,2 17,0 1,1 0,3 0,4 tr 0,2 0,1 tr tr

i-C19 H+-labiles tr tr tr tr tr 0,9 tr0,1 tr 0,1 0,1 -

"Non lis" OH--labiles


0,5 0,2 0,1 0,1 0,3 tr 26,9 0,4 0,3 0,2 tr -

H+-labiles tr 0,5 tr -

Les abondances relatives des -mthoxy acides prsents ont t additionnes respectivement aux -hydroxy acides comportant les mmes nombres d'atomes de carbone, partir desquels sont drivs. * L'ensemble des produits mineurs non identifis dans ces fractions lipidiques ainsi que des produits identifis (mais non rpertoris dans ce tableau car prsents l'tat de trace et pas vraiment significatifs en terme de mtabolisme des hydrocarbures par la bactries et d'influencer sur ces lipides) reprsentant entre 0,3 % et 3,6 % des lipides totaux. c: cis, t: trans

229

VI.1.1.2. Lipides labiles en milieu basique

Dans cette fraction, les acides voient leur part diminuer 50,7 % (Tableau IV.3). On assiste une forte diminution des acides insaturs 16:1 et 18:1, et satur 16:0, en partie au profit de l'acide laurique 12:0 (24,5 %) alors que celui ci n'tait qu'un compos trs mineur dans la fraction prcdente. Les hydroxy acides constituent 34,3 % des lipides labiles en milieu basique, se rpartissant en drivs (20,4 %) et (13,9 %) (Tableau IV.3). Le compos n-12:0 correspond la quasi totalit des -hydroxy acides et environ 95 % des -hydroxy acides (Tableau IV.3 et IV.6). Dans le cas des -hydroxy acides, des traces de n-10:0 ont t dcles, et dans celui des de faibles proportions de n-10:0, n-13:0 et n-14:0ont t observes. Quant aux alcools, ils reprsentaient 14,0 % des lipides labiles en milieu basique (Tableau IV.3). Ce taux assez surprenant par sa forte valeur compare aux autres bactries, correspond 2 % des lipides totaux. De mme, le taux des alcools de la fraction extractible prcdente (lipides "non lis") correspond 3,5 % de la fraction et 2,6 % des lipides totaux. Les alcools prpondrants sont n-16:0, 1-OH (4,9 %), n-18:19, 1-OH (5,0 %) et n-18:0, 1OH (2,6 %).

VI.1.1.3. Lipides labiles en milieu acide

Les acides gras ne reprsentent que 10,4 % des lipides dans cette fraction, ils sont essentiellement saturs (8,8 %) et pairs, de C10 C18 (Tableaux IV.4 et IV.6). L'-hydroxy acide n-12:0 est ici un compos mineur (2,4 %). Par contre, les -hydroxy acides totalisent 50,4 % des lipides labiles en milieu acide. Ils se partagent essentiellement en drivs n-14:0 (30,9 %) et n-12:0 (17,4 %) aux quels s'ajoute un driv n-13:0 minoritaire (2,1 %). La proportion d'alcools est ici inhabituelle: 36,1 % des lipides labiles en milieu acide, soit 3,9 % des lipides totaux. Au total la somme des pourcentages des alcools, par rapport aux lipides totaux atteint 8,5 %. Les alcools principaux de cette fraction sont toujours n-16:0, 1OH (12,4 %), n-18:19, 1-OH (14,2 %) et n-18:0, 1-OH (6,8 %).

230

VI.1.2. Culture sur n-nonadcane

VI.1.2.1. Lipides "non lis"

Les proportions d'une part des acides par rapport aux lipides de cette fraction, et d'autre part des saturs par rapport aux insaturs, sont trs voisines de celles observes dans les lipides "non lis" de la culture sur actate; de plus il s'agit uniquement de composs normaux (Tableau IV.2). Le changement de substrat entrane une modification de la parit des acides: les acides nombre de carbones pair, n-14 n-18 (saturs + insaturs) totalisent 5,2 % des lipides, alors que ceux impairs en totalisent 90,2 %. Les acides gras 17 carbones reprsentent 68, 2 % des lipides contre environ 55 % chez les deux espces de Marinobacter (Tableau IV.2). Trois composs se dtachent: n-17:0 (23,1 %), n-17:19 (23,0 %) et n17:18 (17,7 %). Chacune des sries d'acides n-C15 et n-C19 (saturs + insaturs) participent pour 9 % aux lipides "non lis". Quelques -hydroxy acides ont t identifis dont les -OH-n-19:0 et -OH-n-12:0 (respectivement 0,1 et 0,5 % des lipides "non lis"; Tableau IV.6). La proportion d'alcool est similaire celle observe lors de la culture sur actate (Tableau IV.2). Les composs principaux sont ceux drivant de l'oxydation du n-nonadcane, c'est dire n-19:0, 1-OH (1,5 %), n-19:0, 2-OH (0,2 %) et n-19:19, 1-OH (1,1 %) (Tableau IV.6)

VI.1.2.2. Lipides labiles en milieu basique

Les acides saturs, reprsentant 34,1 % des lipides labiles en milieu basique sont essentiellement courte chane: n-10:0, n-11:0 et n-12:0 (respectivement 5,3 %, 7,1 % et 12,6 %; Tableau IV.6). Parmi les acides insaturs (12,6 %; Tableau IV.3), les composs nombre de carbone impair dominent, dont n-17:18 (4 %) et 7 (3,7 %). Les hydroxy acides, relativement plus abondants que dans la culture sur actate (51,3 % des lipides labiles en milieu basique contre 34,3 %), ont une distribution assez semblable. Comme diffrence on peut noter cependant une augmentation des proportions d'hydroxy acides nombre impair d'atomes de carbone (11 et 13) aussi bien que . Les et -hydroxy acides n-12:0 sont les composs largement prpondrants (respectivement 17,0 et 22,6 % des

231

lipides labiles en milieu basique; Tableau IV.6); ils reprsentent 86 % et 71,5 % des - et hydroxy acides, respectivement. La proportion d'alcools chute considrablement par rapport la fraction labile en milieu basique de la culture sur actate d'ammonium (1 % contre 14 %, Tableau IV.3), les principaux tant les alcools primaires n-16:0, n-18:19 et n-18:0.

VI.1.2.3. Lipides labiles en milieu acide

La part des acides gras devient marginale (1,3 %), ce sont les composs saturs, normaux 14, 16, 17 et 18 carbones. En ce qui concerne les -hydroxy acides; l'-hydroxy n12:0 ne reprsente que 0,9 % des lipides labiles en milieu acide. La proportion des -hydroxy acides atteint 93,8 %, essentiellement rpartis entre les drivs n-12:0 (51,3 %), n-13:0 (26,8 %) et n-14:0 (14 %). Une srie de trois -hydroxy acides, -mthyls, allant de n-12:0 n14:0 a t tentativement identifie. Ces composs rarement identifis chez les microorganismes (Haeffner et al., 1977), n'taient cependant prsents qu' l'tat de traces. Les alcools quant eux n'occupent qu'une place marginale (0,3 %).

VI.1.3. Culture sur iso-nonadcane

VI.1.3.1. Lipides "non lis"

La proportion d'acides gras atteint prs de 97 %, comme chez M. aquaeolei cultive sur le mme substrat (Tableau IV.2). Le fait remarquable est la prpondrance massive des composs ramifis par rapport aux composs normaux. En effet, les acides gras ramifis reprsentent prs de 96 % des acides gras, contre 70 % chez M. aquaeolei et 61 % chez M.
hydrocarbonoclasticus cultives sur le mme iso-alcane. Deux composs dominent: chez les

saturs, i-17:0 (41,1 % des lipides extractibles) et chez les insaturs, l'acide i-19:19 (30,5 %) (Tableau IV.6). Parmi les acides gras normaux, seul l'acide palmitique a t dtect en quantit apprciable (2,4 %). Par ailleurs, aucun -hydroxy acide (ni , d'ailleurs) driv de l'oxydation de l'isononadcane n'a t identifi. Seuls les - et -hydroxy acides n-12:0 taient prsents (respectivement 0,5 et 0,9 % des lipides extractibles). Quant aux alcools leur proportion chutait 0,7 %; ils comprenaient deux alcools primaires drivs de l'oxydation de l'iso-

232

nonadcane chacune des deux extrmits: i-19:0, 1-OH (0,3 %) et 2-Me-18:0, 1-OH (0,1 %), et deux alcools normaux n-16:0, 1-OH et n-18:0, 1-OH (0,2 % et 0,1 % respectivement).

VI.1.3.2. Lipides labiles en milieu basique

Par rapport aux lipides "non lis" la part relative des acides gras normaux augmente (14,3 %) par rapport celle des ramifis (23,3 %) (Tableau IV.3). Les premiers sont reprsents essentiellement par les acides laurique (8,4 %) et palmitique (3,8 %), et les seconds par les acides i-17:0 (9,8 %) et i-19:19 (8,1 %) (Tableau IV.6). Les hydroxy acides (58,1 %) sont plus abondants que dans les mmes fractions lipidiques des cultures sur actate et n-nonadcane (Tableau IV.3). Dans la rpartition entre drivs et , la proportion des premiers (46,9 % des hydroxy acides labiles en milieu basique) est voisine de ce qu'elle tait dans le cas de la culture sur actate (40,5 %). Les hydroxy acides n-12:0 reprsentent 98 % des drivs , et 95 % des drivs . Aucun hydroxy acides iso n'a t dcel.

VI.1.3.3. Lipides labiles en milieu acide

Les proportions entre alcools, acides et hydroxy acides dans les lipides labiles en milieu acide de la culture sur alcane i-C19 sont les mmes que dans le cas de la culture sur nC19. Les -hydroxy acides sont trs prpondrants (95,9 %; Tableau IV.4), avec par ordre dcroissant: n-14:0 (51,8 %), n-12:0 (36,4 %) et n-13:0 (6,4 %), c'est dire une distribution trs diffrente de celle observe dans le cas de la culture sur n-C19 (Tableau IV.6). Les acides et les alcools sont trs minoritaires (1,5 et 0,5 % des lipides labiles en milieu acide, respectivement).
VI.2. Discussion

VI.2.1. Influence de la nature de la source de carbone sur la composition lipidique

L'influence de la source de carbone sur la composition en acides gras d'A.


calcoaceticus est beaucoup plus marque que chez les deux espces de Marinobacter, tant du

point de vue de la parit que de la ramification. En effet, sur n-C19, environ 90 % des lipides "non lis" ont un nombre impair d'atomes de carbone, contre environ 1 % lors de la culture 233

sur actate, et sur i-C19 plus de 90 % de lipides sont de type iso. Cette trs forte proportion de lipides iso, est typique de certaines bactries Gram-positives (O'Leary et Wilkinson, 1988; Kaneda, 1991). Une telle variation dans la composition lipidique des membranes cellulaires montre qu'il faut tre prudent lorsque de tels composs sont utiliss des fins taxonomiques.

VI.2.2. Influence de la source de carbone sur la composition en alcools

Deux types d'alcools peuvent tre considrs chez A calcoaceticus. Les alcools gras nombre d'atomes de carbone pair, essentiellement C16 et C18, et ceux nombre impair, c'est dire C19. Comme nous l'avons vu lors de la prsentation de cette bactrie, une de ses caractristiques est la synthse et l'accumulation d'esters d'acides gras et d'alcools gras essentiellement en C16 et C18 (Fixter et al., 1986). En raison de leur faible polarit, ces esters sont extraits au chloroforme/mthanol et leurs parties acides gras et alcools gras se retrouvent donc dans la fraction des lipides "non lis". L'origine des alcools gras prsents en trs fortes proportions dans la culture sur actate dans les lipides labiles en milieu basique et labiles en milieu acide (respectivement 14 et 36 %), est beaucoup plus incertaine. Dans le cas des alcools prsents dans les lipides labiles en milieu basique, une extraction incomplte au chloroforme/mthanol pourrait tre avance. Une telle hypothse est difficilement envisageable dans le cas des alcools labiles en milieu acide. A notre connaissance, seule une liaison de type "glycoside-liaison ether", en position 1 d'une partie sucre, pourrait tre avance (Voir chapitre III). Cependant l'existence de tels composs si tant est qu'elle se vrifie, ne permet pas d'expliquer la forte chute des proportions d'alcools C16 et C18 pour les lipides labiles en milieu basique et en milieu acide dans les cultures d'A. calcoaceticus sur hydrocarbures. En ce qui concerne les alcools C19 normaux et ramifis, ils drivent de l'oxydation des hydrocarbures n-C19 et i-C19, respectivement.

VI.2.3. Variation de la composition en hydroxy acides

A. calcoaceticus prsente le profil en hydroxy acides le plus complexe de toute notre

tude. En effet, lors du traitement basique de la biomasse obtenue lors de la culture sur actate, un mlange d'- et de -hydroxy acides 12:0, dans un rapport / de 2/3 est obtenu. Ces deux acides estrifient dans les lipides A des LPS les fonctions OH en position 3 et 3' des dimres de glucosamine. Par ailleurs, l'hydrolyse acide des fonctions amides situes aux 234

positions 2 et 2' libre un mlange de -hydroxy acides 12:0 et 14:0, approximativement dans un rapport 2/3. Cette distribution est concordante avec celle trouve par Goossens et al (1989a) pour une autre souche, mais elle diffre de celle tablie par Wollenweber et al.(1984) qui n'ont pas dtect de -hydroxy acide 14:0. La Figure IV.9 prsente une des structures possibles du lipide A d'A. calcoaceticus. En plus de ces hydroxy acides prpondrants, quelques autres, mineurs, sont galement prsents. Le remplacement de l'actate par les hydrocarbures n-C19 et i-C19 a peu d'influence sur la distribution des hydroxy acides librs en milieu basique: les - et -hydroxy acides 12:0 sont toujours dominants. On peut cependant noter une augmentation de la proportion des hydroxy acides nombre d'atomes de carbone impairs (11:0 et 13:0), et l'apparition d'hydroxy acides galement nombre d'atomes impairs (11:0 et 13:0) dans le cas de la culture sur n-C19. Par comparaison les -hydroxy acides lis par liaisons amides apparaissent beaucoup moins spcifiques. En effet, dans la culture sur n-C19, une grande proportion de hydroxy acide 13:0 a t identifie, dans les lipides labiles en milieu acide. Il apparat donc que la spcificit vis vis des longueurs de chanes des -hydroxy acides dpend de la nature de la liaison, ester ou amide.

O H2O3PO O O O O O
3' 2'

HO O O O O
3

O
2

NH O HO

NH O HO

O-PO3H2

-C12 -C12 C12 -C14 C12 -C12

Figure IV.9. Une des structures possibles du lipide A d'A. calcoaceticus.

235

VI.2.4. Mtabolisme des hydrocarbures

L'identification des alcools C19 suggre fortement que le mtabolisme des hydrocarbures procde chez cette souche d'A. calcoaceticus selon la voie classique d'oxydation en alcool primaire au moyen d'hydroxylases suivie d'une oxydation en acides gras puis par -oxydations successives, et non par l'oxydation au moyen de dioxygnases (Sakai et al., 1996). L'oxydation en alcool du ct le moins encombr est privilgie, et l'oxydation subterminale est une voie minoritaire par rapport l'oxydation terminale.

VII. INFLUENCE DE LA SOURCE DE CARBONE SUR LA COMPOSITION LIPIDIQUE DE PSEUDOMONAS OLEOVORANS 59.11T

VII.1. RESULTATS

P. oleovorans dgradant les alcanes et les alcnes chanes courtes (de C6 C12) a t

slectionne pour tendre cette tude. Elle a t cultive sur le mme substrat soluble que les prcdentes bactries, savoir l'actate d'ammonium, ainsi que sur deux alcanes n-C8 et 2Me-C7) comme source unique de carbone et d'nergie. Les cultures sur ces deux alcanes ont t effectues en suivant le mme protocole utilis pour M. hydrocarbonoclasticus, M.
aquaeolei et A. calcoaceticus. Les biomasses bactriennes sches rcupres des milieux de

culture par ultracentrifugation suivie d'une lyophilisation ont t extraites en suivant la procdure analytique reprsente la Figure II.1. L'identification des composs lipidiques prsents dans chaque fraction ("non lis", labiles en milieu basique et labiles en milieu acide) obtenue partir des cultures sur chaque source de carbone, a t ralise en CG/SM par analyse des spectres de masse des drivs TMSi, DMDS et N-acylpyrrolidides. La structure de certains composs a t dtermine par comparaison avec les spectres de masse des composs standards notamment les acides gras comportant un cyclopropane dans la chane aliphatique. Des coinjections en CG avec des standards ont t galement effectues. Les lipides extraits des biomasses bactriennes de P. oleovorans cultive sur actate d'ammonium, n-C8 et 2-Me-C7 contiennent les mmes classes de composs que les lipides de
M. hydrocarbonoclasticus cultive sur actate d'ammonium et sur alcanes. Ces lipides

comprenaient des acides gras normaux et ramifis, des alcools et des -hydroxy acides. Le

236

Tableau IV.7 montre la distribution des ces composs dans chaque fraction pour les trois cultures.

VII.1.1. Culture sur actate d'ammonium

VII.1.1.1. Lipides "non lis"

Les acides gras largement prdominants (97,6 %) se rpartissent en composs normaux saturs (18,3 %), normaux insaturs (73,3 %) et cyclopropaniques (6,0 %) (Figure IV.10). Leurs distributions sont relativement simples. En effet, l'acide palmitique (15,7 %) domine largement les saturs, et l'acide cis-vaccnique, 18:17c (55,6 %) les insaturs. Ce dernier est accompagn par l'acide palmitolique, 16:17c (12,3 %), ainsi que par leurs isomres respectifs trans, 18:17t (2,3 %) et 16:17t (3,1 %) (Tableau IV.7). Deux acides cyclopropaniques, 177,8 et 197,8 sont prsents (respectivement 4,8 et 1,2 %; Tableau IV.7). Une trs faible quantit de -hydroxy acide n-12:0 a t dcele (0,1 %) ainsi que des quantits plus substantielles d'alcools primaires nombre de carbone pair de C12 C18 (1,6 % au total).

VII.1.1.2. Lipides labiles en milieu basique

La distribution dans cette fraction diffre de la prcdente essentiellement par une chute importante de la proportion des acides gras insaturs (12,3 %) compense par un fort taux d'acide laurique (32,7 %) et de -hydroxy acides (38,6 %) (Figure IV.11, Tableau IV.7). L'acide -hydroxy-n-10:0 est largement dominant (plus de 93 % des -hydroxy acides), il est accompagn du -hydroxy acide n-12:0.

VII.1.1.3. Lipides labiles en milieu acide

Les -hydroxy acides reprsentent 91,5 % des lipides labiles en milieu acide; plus de 98 % il s'agit du -hydroxy-n-12:0 (Figure IV.12), accompagn de quantits mineures de ses homologues infrieurs n-10:0 et n-11:0 et suprieurs n-13:0 et n-14:0 (Tableau IV.7). Les acides gras normaux saturs et les alcools correspondent respectivement 4,7 % et 1,9 % de cette fraction lipidique. 237

Culture sur actate d'ammonium


AG cyclopropaniques 6,0 % Alcools 1,6 %
-hydroxy acides 0,1%

AG normaux saturs 18,3 %

AG normaux insaturs 73,3 %

Culture sur n-C8


AG cyclopropaniques 3,6 %

Alcools 7,5 % AG ramifis saturs 3,3 %

AG normaux saturs 44,6 % AG normaux insaturs 37,7 %

Culture sur i-C8


-hydroxy acides 0,3 % Alcools 7,5 % AG cyclopropaniques 2,1 %

AG ramifis saturs 0,8 % AG normaux insaturs 27,9 % AG normaux saturs 56,2 %

Figure IV.10. Abondances relatives des diffrentes classes de lipides "non lis" de P.
oleovorans cultive sur Actate d'ammonium, n-C8 et i-C8.

238

Culture sur actate d'ammonium


AG cyclopropaniques 0,7 % Alcools 0,9 % -hydroxy acides 38,6

AG normaux saturs 47,1 %

AG normaux insaturs 12,3 %

Culture sur n-C8


-hydroxy acides 2,8

Alcools 1,0 %

AG cyclopropaniques 1,4 %

AG ramifis saturs 12,0 % AG normaux saturs 41,8 % AG normaux insaturs 35,5 %

Culture sur i-C8


Alcools 5,0 % AG cyclopropaniques 3,5 %

-hydroxy acides 7,3 %

AG normaux saturs 40,2 % AG normaux insaturs 43,7 %

Figure IV.11. Abondances relatives des diffrentes classes de lipides labiles en milieu basique de P. oleovorans cultive sur Actate d'ammonium, n-C8 et i-C8. 239

Culture sur actate d'ammonium


AG normaux saturs 4,7 % Alcools 1,9 % AG normaux insaturs 0,6 %

-hydroxy acides 91,5 n--12:0 98,4 %

Culture sur n-C8


AG cyclopropaniques 3,2 % Alcools 5,0 % AG normaux saturs 19,8 %

AG normaux insaturs 1,7 %

-hydroxy acides 68,7 % n--12:0 92,9 %

AG ramifis saturs 1,2 %

Culture sur i-C8

Alcools 7,1 %

AG normaux saturs 25,2 % AG normaux insaturs 0,6 %

-hydroxy acides 64,6 % n--12:0 94,4 %

AG ramifis saturs 0,6 %

Figure IV.12. Abondances relatives des diffrentes classes de lipides labiles en milieu acide de P. oleovorans cultive sur Actate d'ammonium, n-C8 et i-C8. 240

Tableau IV.7. Composition lipidique de Pseudomonas oleovorans en fonction de la source de carbone.


Lipides Acides gras saturs n-12:0 n-13:0 i-14:0 n-14:0 i-15:0 ai-15:0 n-15:0 i-16:0 n-16:0 i-17:0 ai-17:0 n-17:0 n-18:0 n-19:0 n-20:0 Acides gras insaturs n-12:1 7 n-14:1 7 n-15:1 10 n-15:1 9 n-16:1 10 n-16:1 9 n-16:1 7 c n-16:1 7 t n-17:1 10 n-17:1 9 c n-17:1 9 t n-17:1 8 c n-17:1 8 t Actate dammonium "Non lis" OH--labiles H+-labiles 0,1 tr 0,4 tr 15,7 0,1 1,8 0,2 12,3 3,1 32,7 0,2 0,7 11,8 0,6 1,1 tr 0,2 0,8 1,5 0,7 0,2 0,3 2,2 tr 0,2 1,3 0,2 0,3 "Non lis" 1,6 0,1 0,1 2,0 1,0 1,7 2,4 0,5 27,9 1,1 9,0 0,5 0,3 6,6 0,3 tr n-C8 OH--labiles 16,2 0,1 0,4 0,7 2,8 6,4 0,7 1,8 22,0 0,2 0,4 0,4 1,7 tr tr 0,7 1,4 0,7 6,5 3,4 0,2 0,1 H+-labiles 0,1 2,5 0,1 0,3 0,5 0,8 9,8 0,8 5,1 0,5 0,5 0,3 tr "Non lis" 2,2 5,8 0,2 5,4 0,5 27,3 0,1 7,9 6,9 0,6 0,1 0,2 0,6 1,0 1,7 0,1 7,3 0,4 7,0 0,6 2-Me-C7 OH--labiles 0,7 tr 2,8 23,7 8,5 4,1 0,2 0,2 1,1 1,5 9,6 2,4 5,1 tr 7,9 0,2 H+-labiles 0,6 2,4 0,1 0,1 1,6 14,8 0,1 0,3 1,6 3,8 0,2 0,2 -

241

n-18:1 9 c Lipides n-18:1 9 t n-18:1 7 c n-18:1 7 t n-19:1 10 n-19:1 9 Acides gras cyclopropaniques 177,8 197,8 -hydroxy acides n-10:0, OH n-11:0, OH n-12:0, OH n-13:0, OH n-14:0, OH Alcools n-12:0, 1-OH n-14:0, 1-OH n-16:0, 1-OH n-18:0, 1-OH
#

0,2 Actate dammonium "Non lis" OH--labiles H+-labiles 55,6 2,3 8,5 0,4 0.3 0.3 -

21,5 "Non lis" 8,3 0,7 -

4,7 n-C8 OH -labiles 0,1 15,2 2,5 -

H+-labiles 1,4 tr -

5,9 "Non lis" 0,4 1,4 tr 0,8 0,5

3,2 2-Me-C7 OH--labiles 11,5 0,3 0,9 -

H+-labiles 0,6 -

4,8 1,2 0,1 0,1 0,1 0,8 0,6

0,5 0,2 36,0 2,6 0,1 0,1 0,4 0,3

0,4 0,3 90,0 0,4 0,4 0,1 0,1 1,0 0,7

2,4 1,2 tr 0,1 0,2 5,3 1,9

1,0 0,4 2,4 tr 0,4 tr 0,1 0,6 0,3

2,1 1,1 3,7 0,6 63,8 0,6 0,1 0,2 3,1 1,6

1,5 0,6 0,3 0,3 0,7 5,0 1,5

2,6 0,9 0,3 tr 7,0 tr tr 1,3 3,7

0,8 tr 61,0 0,2 2,6 0,4 0,9 4,0 1,8

Les abondances relatives des -mthoxy acides prsents ont t additionnes respectivement aux -hydroxy acides comportant les mmes nombres d'atomes de carbone, partir desquels sont drivs.

* L'ensemble des produits mineurs non identifis dans ces fractions lipidiques ainsi que des produits identifis (mais non rpertoris dans ce tableau car prsents l'tat de trace et pas vraiment significatifs en terme de mtabolisme des hydrocarbures par la bactries et d'influencer sur ces lipides) reprsentant entre 0,2 % et 5,4 % des lipides totaux.
c: cis, t: trans

242

VII.1.2. Culture sur n-octane

VII.1.2.1. Lipides "non lis"

Le n-octane affecte profondment la rpartition entre les types de lipides: forte augmentation des acides gras normaux saturs (de 18,3 % 44,6 %) et des alcools (de 1,6 7,5 %), apparition d'acides chanes ramifies par des groupes mthyles (3,3 %), et corrlativement baisse de la proportion des acides gras cyclopropaniques (de 6 3,6 %) et des acides normaux insaturs (de 73,3 37,7 %) (Figure IV.10). Parmi les principales modifications observes entre culture sur actate et culture sur noctane on peut citer (Tableau IV.7):
* augmentation de la teneur en acide palmitique (de 15,7 27,9 %) et starique (de1,8 9 %); * diminution des pourcentages de l'acide cis-vaccnique 18:17cis (de 55,6 8,3 %), en

partie au profit de l'acide olique (qui passe de 0 21,5 %) et diminution de l'acide palmitolique n-16:17cis de (12,3 6,6 %); Par ailleurs, l'acide -hydroxy-n-12:0 est dtect l'tat de trace, et les alcools sont principalement constitus d'alcools primaires 16:0 (5,3 %) et 18:0 (1,9 %).

VII.1.2.2. Lipides labiles en milieu basique

Par rapport la culture sur actate d'ammonium on observe (Figure IV.11 et Tableau IV.7):
* une diminution du pourcentage total d'acides gras normaux saturs, de 47,1 41,6 %. Cette

lgre variation cache une profonde modification de la rpartition, le taux d'acide laurique tant divis par deux (16,2 % contre 32,7 %), celui de l'acide palmitique voluant en sens inverse (22,0 contre 11,8 %);
* une augmentation du pourcentage total d'acides gras insaturs (de 12,3 35,5 %), dont les

composs 18:1 et 16:1, aussi bien cis que trans;


* une forte baisse du pourcentage des -hydroxy acides (2,8 % contre 38,6 %);

* l'apparition d'acides gras ramifis saturs (12 %)

243

VII.1.2.3. Lipides labiles en milieu acide

Le changement de substrat, actate

n-octane, se manifeste essentiellement par une

augmentation des acides gras normaux saturs (4,7 19,8 %) et des alcools (de 1,9 5 %). Corrlativement, la proportion de -hydroxy acides diminue de 91,5 68,7 %. La distribution de ces drivs demeure cependant inchange. On note l'apparition d'une faible quantit d'acides gras ramifis saturs (1,2 %).

VII.1.3. Culture sur 2-mthylheptane

VII.1.3.1. Lipides "non lis"

Par rapport la culture sur n-octane on observe: * une plus grande abondance d'acide gras normaux saturs (56,2 % contre 44,6 %); * corrlativement une diminution de l'abondance des acides gras normaux insaturs (27,9 % contre 37,7 %); * une diminution du pourcentage des acides non normaux, aussi bien cyclopropaniques (2,1 % contre 3,6 %) que iso et antisos (0,8 % contre 3,3 %). Parmi les acides gras normaux, les composs nombre de carbone impair voient leurs pourcentage augmenter fortement. Au total les acides saturs n-15:0 + n-17:0 reprsentent 13,3 % des lipides "non lis", contre 3,5 % dans le cas de la culture sur n-octane, et les acides insaturs n-15:1 et n-17:1 totalisent 16,1 % alors que seules des traces de n-17:1 avaient t dtectes dans ce dernier cas. Par ailleurs, la rpartition des alcools se trouve quasiment inchange.

VII.1.3.2. Lipides labiles en milieu basique

La rpartition entre types de lipides est peu modifie par rapport la culture sur noctane (Figure IV.11 et Tableau IV.7), si l'on excepte la disparition des acides gras saturs ramifis iso et anteiso. Chez les acides saturs et insaturs, une plus forte abondance des composs normaux nombre impair d'atomes de carbone est ici aussi note (respectivement 11,5 et 15,2 % contre 1,1 et 0,3 %). Cependant l'absence d'acides gras ramifis est surprenante, surtout si l'on rfre leurs taux de 12,0 % dans la mme fraction lipidique de la culture sur n-octane. 244

Toujours en comparant les cultures sur les deux hydrocarbures, une inversion de la rpartition des -hydroxy acides n-10:0 et n-12:0 apparat. Dans le cas prsent le compos chane plus longue est prpondrant.

VII.1.3.3. Lipides labiles en milieu acide

Le changement d'hydrocarbure n'apporte pas de modification majeure dans la rpartition ni par types de lipides (sauf l'absence des acides gras cyclopropaniques qui taint observs en faible quantit dans le cas du n-C8) ni par composs (Figure IV.12 et Tableau IV.7). Ceci est notamment le cas des -hydroxy acides dont le compos largement prpondrant est le -hydroxy-n-12:0.

VII.2. DISCUSSION

VII.2.1. Influence de la source de carbone sur la composition lipidique

Le remplacement dans le milieu de culture d'une source de carbone soluble comme l'actate d'ammonium par un hydrocarbure entrane une profonde modification de la composition lipidique de P. oleovorans. Un tel remaniement lipidique a t dj rapport chez cette bactrie (Chen et al., 1995 a,b). Les auteurs ont tudi les lipides membranaires extraits par un mlange chloroforme/mthanol 1:2, v/v, ce qui correspond donc aux lipides que nous avons appels "non lis". Ils ont not que le n-octane induisait la formation d'une plus grande quantit d'acide 18:1, au dpend des acides 16:1, de mme ils notaient une plus grande abondance d'acides mono-insaturs trans. Le rsultat de ces changements s'est traduit par une augmentation de la temprature de transition des lipides membranaire d'environ 20 C. En effet, les acides gras longs et les acides gras insaturs trans possdent des points de fusion suprieurs respectivement aux acides chane hydrocarbone plus courte et aux acides gras insaturs cis. L'effet de la conversion des acides gras insaturs cis en trans est similaire la substitution des acides gras insaturs cis par des acides gras saturs, ils conduit une diminution de la fluidit membranaire (Cronan et Gelmann, 1975; Diefenbach et al., 1992). Cette augmentation de la temprature de fusion compense les effets fluidifiants du n-octane sur la membrane (Lohner, 1991).

245

Dans notre tude les rsultats que nous avons obtenus sont diffrents de ceux de Chen et al. (1995 a,b). En effet, nous observons une forte baisse du pourcentage d'acides 18:1cis: de 55 28 %, qui s'opre essentiellement au profit des acides gras normaux saturs. Il apparat donc que la prsente souche de P. oleovorans privilgie la synthse d'acides gras saturs pour rpondre l'augmentation de la fluidit lie la prsence de n-octane. Naturellement plus riche en acide gras insaturs 16:1, la souche tudie par Chen et collaborateurs (1995 a,b), favorisait la synthse d'acides gras plus longue chane, ainsi que l'isomrisation cis-trans des acides gras monoinsaturs.

Si maintenant nous revenons aux rsultats obtenus avec M. hydrocarbonoclasticus (Lattuati et al., 2002), le passage d'un milieu sur actate d'ammonium un milieu sur nicosane (solide temprature ambiante) se traduisait par une baisse du pourcentage d'acide olique (point de fusion 16 C) en partie au profit d'acides 16:1 (point de fusion environ 4C). Dans ce cas il est vraisemblablement que le contact avec l'hydrocarbure n-C20 diminue la fluidit membranaire. Pour la rtablir, la bactrie serait conduite synthtiser et incorporer dans sa membrane des acides gras chanes plus courtes. Le manque de fluidit des hydrocarbures longues chanes, tout comme la grande fluidit des hydrocarbures chanes courtes, agirait donc sur la composition des acides gras des membranes bactriennes, mais en sens oppos. Dans le cas de M. aquaeolei et A. calcoaceticus ces effets sont plus difficiles tablir en raison de l'utilisation d'hydrocarbures nombre impair d'atomes de carbone.

Par ailleurs, un des faits notables observ lors du passage de l'actate d'ammonium aux hydrocarbures, en particulier au n-octane concerne l'acide cis-vaccnique (18:17). Cet acide considr comme marqueur bactrien (Cranwell, 1978; Perry et al., 1979; Gillan et Sandstrom, 1985) reprsente plus de 55 % des lipides "non lis" de la culture sur actate, mais seulement 8,3 et 1,4 % de ceux des cultures sur n-octane et 2-mthylheptane, respectivement. Dans le cas de la culture sur n-octane, cette diminution s'opre en partie au profit de l'acide olique, absent dans la culture sur actate.

246

VII.2.2. Variation de la composition en -hydroxy acides

Comme chez de nombreuses bactries Gram-ngatives (Wilkinson, 1988), chez P.


oleovorans les -hydroxy acides lis par liaison ester sont diffrents de ceux lis par liaison

amide dans les lipopolysaccharides: ce sont respectivement les -hydroxy acides n--10:0 et
n--12:0. Comme nous l'avons vu dans le premier chapitre, les lipides A des

lipopolysaccharides comportent quatre acides, gnralement des -hydroxy acides, directement lis au dimre de N-actylglucosamine, et deux acides, gnralement des acides gras saturs, estrifis aux -hydroxy acides. Les rsultats des analyses des lipides labiles en milieu basique et labiles en milieu acide de P. oleovorans cultive sur actate d'ammonium suggrent la prsence aux positions 3 et 3' d'acide -hydroxy dcanoque (libr lors de l'hydrolyse basique) et aux positions 2 et 2' d'acide -hydroxy dodcanoque (libr lors de l'hydrolyse acide). Par ailleurs, l'hydrolyse basique produit en plus de l'acide -hydroxy-n-10:0, une quantit presque quivalente d'acide laurique (36 % et 32,7 %, respectivement). Ceci suggre que deux groupes hydroxyles des quatre -hydroxy acides sont estrifis par l'acide laurique comme nous le proposons dans la Figure IV.13.

O H2O3PO O O O O O O O
3' 2'

HO NH O O HO
3 2

O NH O HO

O-PO3H2

-C10 -C10 C12 C12 -C12 -C12

Figure IV.13. Une des structures possibles du lipide A de P. oleovorans.

247

Lors de la culture sur n-octane la proportion de -hydroxy acides libre en milieu basique chute dramatiquement, suggrant que les positions 3 et 3' sont maintenant estrifies majoritairement par des acides gras saturs. Cependant, la nature de ces acides gras saturs du lipide A est difficile tablir partir des variations observes dans la distribution des acides gras saturs totaux. Comme dans le cas des lipides membranaires, la prsence de n-octane tend augmenter la fluidit de la partie lipophile des LPS. Les variations observes dans la composition en -hydroxy acides pourraient tre galement un moyen de maintenir la fluidit des membranes. Dans ce point de vue, il est intressant de rapprocher nos rsultats de ceux obtenus dans le cas de P. syringae (Kumar et al., 2002). Ces auteurs ont not qu'une augmentation de la temprature de culture de cette bactrie originaire de l'Antarctique de 4 C 22 C, introduisait une forte diminution de la teneur en hydroxy acides (Kumar et al., 2002), leur proportion par rapport aux acides des LPS passe de 72 45 %. Enfin, il apparat que la structure de l'alcane fourni n'a aucune incidence sur celles des
-hydroxy acides. Aucun -hydroxy acides ramifis n'a t identifi dans la culture sur 2-

mthylheptane, ni dans les lipides labiles en milieu basique, ni dans ceux labiles en milieu acide.

VII.2.3. Mtabolisme des alcanes courts par P. oleovorans

Les composs identifis dans les trois fractions lipidiques de P. oleovorans cultive sur alcanes ne permettent pas de proposer une voie mtabolique pour la dgradation du n-C8 et i-C8 par cette bactrie. En effet, aucun mtabolite de l'oxydation de ces derniers composs n'a pu tre identifi. Nanmoins, ceci peut essentiellement traduire une perte de ces composs au cours des extractions et/ou de l'limination des solvants. Cependant, des tudes antrieures sur la dgradation des alcanes courts (C6-C12) par cette bactrie ont montr que ces composs sont oxyds an alcools primaires qui sont leur tour oxyds en aldhydes puis en acides alcanoques (Thijsse et Van Der Linden, 1961, 1963; Nieder et Shapiro, 1975; Yuste et al., 1998).

248

VIII. CONCLUSION

Les analyses des lipides de M. aquaeolei et A. calcoaceticus cultives sur actate d'ammonium, n-nonadcane et i-nonadcane et leurs comparaisons avec celles dcrites dans le chapitre prcdent sur M. hydrocarbonoclasticus nous ont permis de mettre en vidence l'influence de la source de carbone sur la distribution des acides gras des LPS prsents dans les membranes externes. Nous avons pu montrer que chez ces trois bactries, la nature de la source de carbone peut influencer dans une large mesure la distribution de ces acides gras: substitution d'acides gras nombre pair d'atomes de carbone par des acides nombre impair d'atomes de carbone, substitution d'acides normaux par des acides ramifis. Par comparaison, les hydroxy acides des LPS, ou selon les genres bactriens, sont beaucoup moins susceptibles d'tre interchangs par des composs de structures diffrentes: si des composs chaines normales nombre impair d'atomes de carbone sont incorpors dans les LPS un taux apprciable les ramifications de type iso ne sont que trs faiblement tolres. Enfin, avec P. oleovorans cultive sur actate, n-octane et 2-mthyl heptane nous avons pu montrer que l'effet fluidifiant des hydrocarbures chane courte se manifeste aussi bien sur la distribution des acides gras membranaires que sur la composition en -hydroxy acides des LPS. Les -hydroxy acides prsents dans les lipides labiles en milieu basique des quatre bactries tudies sont essentiellement normaux pairs de C10 C14, le compos prdominant dpendant de l'espce bactrienne. Les -hydroxy acides issus de la dgradation des alcanes sont prsents mais constituent des composs de moindre importance. La Figure IV.14 illustre la distribution relative des -hydroxy acides des LPS, labiles en milieu basique.

249

FigureIV.14. Comparaison des distributions des -hydroxy acides dans les lipides labiles en milieu basique de M. hydrocarbonoclasticus, M. aquaeolei, A. calcoaceticus et P. oleovorans en fonction de la source de carbone. Les -hydroxy acides lis par liaisons amides aux lipopolysaccharides sont les constituants les plus abondants des lipides labiles en milieu acide. Ces composs sont essentiellement normaux nombre pair d'atomes de carbone. La nature du -hydroxy acide prdominant dpend galement de l'espce bactrienne: il s'agit du n--12:0 dans le cas de M.
hydrocarbonoclasticus, M. aquaeolei et P. oleovorans alors que dans le cas d'A. calcoaceticus

les compos n-12:0 et n-14:0 sont les plus abondants (Figure IV.15). Pour M.
hydrocarbonoclasticus, M. aquaeolei et A. calcoacticus, les -hydroxy acides normaux

impair 11 et 13 atomes de carbone et le i--13:0 ont t identifis en quantits apprciables respectivement dans les cultures sur n-C19 et i-C19.

250

Figure IV.15. Comparaison des distributions des -hydroxy acides dans les lipides labiles en milieu acide de M. hydrocarbonoclasticus, M. aquaeolei, A. calcoaceticus et P. oleovorans en fonction de la source de carbone.

251

Conclusion gnrale

252

CONCLUSION GENERALE

En dbutant ce travail de recherche, notre objectif consistait tudier la composition lipidique de quatre bactries hydrocarbonoclastes Gram-ngatives cultives sur des hydrocarbures de structures diffrentes, dans le but de prciser l'influence de ces composs notamment sur la distribution en acides gras et en hydroxy acides et de dterminer quelles taient leurs voies mtaboliques. Nous cherchons galement savoir dans quelle mesure les hydroxy acides pouvaient servir de marqueurs de ces activits mtaboliques.

La

premire

partie

de

notre

travail

de

recherche

montr

que

M.

hydrocarbonoclasticus est capable de mtaboliser une grande varit d'hydrocarbures

comportant des chanes alkyles: alcanes normaux, mono-ramifis, des phnyl- et des cyclohexyl-alcanes ou encore des alcnes terminaux. La souche cultive s'est avre cependant incapable d'utiliser les hydrocarbures polyramifis de type isoprnodes tels que le pristane et le squalane, les cyclohexyl-alcanes chane hydrocarbone comportant un nombre pair d'atomes de carbone comme le cyclohexyldodcane et les phnyl-alcanes chanes hydrocarbones courtes (ethyl-benzne et propyl-benzne). La prsence de nombreux mtabolites dans les lipides "non lis" a permis de prciser les voies mtaboliques. L'oxydation de l'hydrocarbure en alcool primaire par hydroxylation du groupement mthyle terminal le moins encombr, puis en acide entrant ensuite dans un cycle de -oxydation est la voie principale de dgradation. Des voies de dgradation secondaires en fonction de la structure de l'hydrocarbure ont t aussi mises en vidence. Il s'agit en particulier (i) de l'oxydation subterminale en alcool secondaire suivie d'une raction de type Bayer-Villiger, et oxydation ultrieure de l'alcool qui en rsulte en acide, (ii) de l'-oxydation notamment dans le cas des composs possdant un groupement mthyle en , ou encore (iii) de l'poxidation des olfines terminales. Aucune attaque directe des groupements phnyl ou cyclohexyl n'a en revanche t dtecte. L'analyse qualitative et quantitative des trois fractions lipidiques de cette bactrie a montr que la fraction "non lie" est la plus influence par la nature de l'hydrocarbure utilis comme source de carbone. En effet, la parit des lipides (Cpair ou Cimpair dominant) suit celle de l'hydrocarbure fourni. Des quantits importantes d'acides gras iso et antiso ont t aussi identifies respectivement dans les cultures sur alcanes ramifis iso et antiso. Dans ces deux cas les distributions en acides gras taient plus proches de celles observes chez les bactries Gram-positives que chez les Gram-ngatives. Par ailleurs, l'utilisation d'un alcne terminal, 253

des phnyl- et cyclohexyl-alcanes s'accompagne de l'incorporation dans les lipides membranaires de quantits significatives des acides correspondants. Les lipides labiles en milieux basique et acide se caractrisent quant eux par une forte contribution de -hydroxy acides provenant de l'hydrolyse des LPS. Le -n-12:0 est toujours dominant, et quasiment exclusif dans certains cas. L'homologue infrieur et suprieur de ce dernier compos ont t galement identifis mais en plus faibles quantits. Des hydroxy acides comportant une ramification mthyle en position iso ou antiso, ou encore une double liaison terminale selon l'hydrocarbure utilis peuvent tre incorpors dans les LPS dans une faible proportion. Par ailleurs, seuls de trs faibles pourcentages de -hydroxy acides phnyl- ou cyclohexyl-alcanoques ont t incorpors dans les LPS. Il apparat que chez M.
hydrocarbonoclasticus les -hydroxy acides des LPS, comportent un nombre d'atomes de

carbone compris entre 10 et 14, c'est dire bien infrieure celui des -hydroxy acides issus de la dgradation des hydrocarbures.

Afin de savoir si les rsultats obtenus avec M. hydrocarbonoclasticus taient gnralisables d'autres bactries Gram-ngatives., nous avons tudi dans la seconde partie de ce travail l'influence de la source de carbone sur la composition lipidique de trois autres espces: M. aquaeolei, A. calcoaceticus et P. oleovorans. Les deux premires bactries ont t cultives sur l'actate d'ammonium et les alcanes n-C19 et i-C19, et la troisime sur le mme substrat soluble et deux hydrocarbures chanes courtes n-C8 et 2-Me-C7. Les rsultats obtenus avec M. aquaeolei et A. calcoaceticus corroborent ceux obtenus avec M. hydrocarbonoclasticus, il s'agit notamment de la parit des lipides qui suit celle des substrats ou de l'influence de la ramification iso qui se retrouve chez la plupart des lipides. La distribution des hydroxy acides des LPS ( ou selon le genre bactrien) est trs faiblement influence par la nature de la source de carbone, seules de faibles quantits de -hydroxy acides issus de la dgradation des alcanes ont t notes. Dans le but de maintenir une fluidit membranaire optimale, P. oleovorans cultive sur hydrocarbures courts effectue non seulement une redistribution de ses acides gras membranaires mais aussi des -hydroxy acides des LPS: synthse d'acides gras saturs et diminution de la proportion des -hydroxy acides lis par liaisons esters.

Par ailleurs, les rsultats obtenus dans la deuxime partie de notre travail de recherche montrent que les hydroxy acides ( ou ) des LPS de ces trois bactries Gram-ngatives 254

comportent un nombre d'atomes de carbone compris entre 10 et 14 dpendant de l'espce bactrienne. La prsence d'une ramification sur l'hydrocarbure mtabolis n'a de plus que peu d'influence sur la structure des hydroxy acides des LPS.

Il apparat donc que chez les bactries Gram-ngatives l'utilisation des hydrocarbures de types aliphatiques modifie faiblement la nature des hydroxy acides engags dans les LPS membranaires. Les hydroxy acides extractibles aux solvants sont quant eux le reflet direct du mtabolisme bactrien et peuvent donc tre la signature en milieu naturel d'une ventuelle pollution par les hydrocarbures, ou tout du moins de la dgradation des hydrocarbures et lipides naturellement prsents dans les sdiments ou les colonnes d'eau.

Jusqu' prsent il tait admis que seules de trs mineures modifications dans la structure des hydroxy acides taient tolres par les bactries pour qu'ils puissent tre intgrs dans les LPS membranaires: elles concernaient uniquement la longueur des chanes acyles (Williams et al., 1991). Nos rsultats montrent que d'autres modifications peuvent tres tolres: il s'agit de la prsence de ramifications de type iso et anteiso ou encore d'insaturations. Une tude exhaustive des lipides A des LPS isols de cultures de bactries sur hydrocarbures pourrait permettre de prciser la structure de telles entits lipidiques.

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277

Annexes

278

ANNEXE 1: SYNTHESE DES ALCANES RAMIFIES

La synthse des alcanes ramifis (iso, antiso et ramifis en milieu de chane) a t effectue en trois tapes. La premire consiste prparer le ractif ncessaire la raction de Wittig, savoir l'alkylidnetriphnylphosphorane. Celui ci est obtenu par action du butyl lithium sur le bromure d'alkyltriphnylphosphonium correspondant, comme le montre la figure suivante:
C4H9Li Solvant THF, 67 C, 48 h

(C6H5)3-P-CH2-R Br

(C6H5)3-P=CH-R

La deuxime tape est celle de la synthse de lolfine obtenue par la raction entre lalkylidnetriphnylphosphorane et une ctone. Le bilan de cette raction est le suivant : R O (C6H5)-P=CH-R + R'-C-R''
67 C, 72 h

CH R'-C-R'' + (C6H5)3PO

Aprs extraction de lolfine du milieu ractionnel, une rduction catalytique est ncessaire pour obtenir l'alcane dsir:

R CH R'-C-R''
H2 (20 bars), Rh sur C (5 %) heptane, 70C, 24 h

R CH2 R'-CH-R''

Les figures 1 et 2, montrent les spectres de masse du 10-mthylne-nonadcane (obtenu par raction entre le mthylidene triphenylphosphorane et la nonadecan-10-one) et du 10mthyl-nonadcane obtenu par rduction catalytique de ce dernier.

279

: 10-mthylne-nonadcane
+H
Mc Lafferty

168

M+.

Figure A.1. Spectre de masse du 10-mthylne-nonadcane.

: 10-mthyl-nonadcane
-H
154

Figure A.2. Spectre de masse du 10-mthyl-nonadcane.

280

ANNEXE 2: SPECTRES DE MASSE DES HYDROCARBURES SYNTHETISES

i-C19:

Figure A.3. Spectre de masse du 2-mthyl-octadcane (i-C19).

i-C20 :

M+.

Figure A.4. Spectre de masse du 2-mthyl-nonadcane (i-C20).

281

ai-C19:

Figure A.5. Spectre de masse du 3-mthyl-octadcane (ai-C19).

ai-C20:

M+.

Figure A.6. Spectre de masse du 3-mthyl-nonadcane (ai-C20).

282

83

Figure A.7. Spectre de masse du cyclohexyldodecane.

83

Figure A.8. Spectre de masse du cyclohexyltridcane.

283

Rsum

Les principaux objectifs de ce travail de recherche taient (i) l'tude de la composition lipidique de quatre bactries Gram-ngatives hydrocarbonoclastes Marinobacter hydrocarbonoclasticus, Marinobacter aquaeolei, Acinetobacter calcoaceticus et Pseudomonas oleovorans en fonction de la source de carbone, (ii) la dtermination des diffrents voies mtaboliques de dgradation des hydrocarbures comportant une chane alkyle et (iii) mieux connatre la composition en -hydroxy acides lipopolysaccharidiques de leurs membranes extrieures. La premire partie de ce travail prsente une description qualitative et quantitative des lipides "non lis", labiles en milieu basique et labiles en milieu acide de M. hydrocarbonoclasticus en fonction de l'hydrocarbure (alcanes normaux et ramifis, phnyl et cyclohexyl-alcanes, et 1-alcne) utilis comme source unique de carbone et d'nergie. Ces rsultats ont montr que la structure chimique des lipides identifis suit celle de l'hydrocarbure fourni: apparition de proportions significatives et dans certains cas trs importantes d'acides gras issus de la dgradation de ces composs. Les -hydroxy acides des LPS sont moins sensibles au changement de la structure de l'hydrocarbure. Le n--12:0 est toujours dominant alors que les -hydroxy acides provenant de la dgradation des hydrocarbures peuvent tre incorpors aux LPS mais ne constituent que des composs mineurs. La prsence d'intermdiaires mtaboliques de chaque hydrocarbure dans les lipides "non lis" a permis la dtermination des diffrents voies mtaboliques de dgradation. La deuxime partie de ce travail porte sur la composition lipidique des bactries M. aqueolei, A. calcoaceticus et P. oleovorans en fonction de la source de carbone (actate ou alcane). Cette partie a montr le degrs de variabilit des acides gras chez les bactries Gramngatives M. aquaeolei et A. calcoaceticus: substitution des acides gras normaux pairs par des acides gras de mme parit et mme squelette que l'alcane utilis. Chez P. oleovorans l'utilisation d'alcanes courts se manifeste aussi bien sur la distribution des acides gras membranaire que sur la composition en -hydroxy acides des LPS. Enfin, les -hydroxy acides issus des quatre bactries tudies sont essentiellement normaux pairs de C10 C14 dont le compos prdominant est dpendant de l'espce bactrienne.

Abstract

The major aims of this study was to derive information on the effect of the carbon source on the lipid composition of the hydrocarbonoclastic Gram-negative bacteria Marinobacter hydrocarbonoclasticus, Marinobacter aquaeolei, Acinetobacter calcoaceticus and Pseudomonas oleovorans, establish the metabolic pathways of hydrocarbon degradation and to have to a better knowledge on the lipopolysaccharide -hydroxy acids of their external membrane. The first part of the work presents a qualitative and quantitative description of unbound, OH- labile and H+ labile lipids of M. hydrocarbonoclasticus as a function of the hydrocarbon structure used for growth (normal and branched alkanes, phenyl- and cyclohexyl-alkanes and a terminal olefin). The obtained results showed that the chemical structures of the lipids strongly correlated those of the fed hydrocarbons: appearance of significant and in some cases very important proportions of fatty acids derived from the degradation of these compounds. -hydroxy acids of the LPS are less sensitive to the change of the hydrocarbon structure. -n-12:0 is always dominant, the -hydroxy acids derived from the hydrocarbons can be incorporation to the LPS but constituted minor compounds.

284